CN106702497B - 用于孕妇外周血中游离dna检测的试剂盒及建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于孕妇外周血中游离DNA检测的试剂盒及建库方法。本发明的孕妇外周血中游离DNA检测的文库构建方法及试剂盒可用于孕妇外周血中游离DNA检测，例如产前诊断。所述构建测序用DNA文库的方法包括将平末端DNA片段中的至少一部分进行单3'端加A，得到单3'端加A的DNA片段的步骤；和将步骤B‑1中得到的单3'端加A的DNA片段进行平末端连接的步骤。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于孕妇外周血中游离DNA检测的试剂盒及建库方法。
背景技术
血中游离DNA即循环脱氧核糖核酸(circulating DNA)，是循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。1948年Mandel和Metais首次发现血中存在细胞外核苷酸。早期由于检查技术的限制，相关临床应用在近年才得到了长足的发展。1994年，在肿瘤病人的血液中检测到RAS基因的突变，1997年香港中文大学卢煜明(Dennis Lo)教授等发现孕妇血浆中存在游离的胎儿DNA。
目前认为血中游离DNA的来源与凋亡、坏死和细胞主动分泌DNA有关。正常生理情况下，巨噬细胞会清除凋亡和坏死细胞，因此健康人血中游离DNA浓度很低。在恶性肿瘤、剧烈运动或体内存在验证等情况下，巨噬细胞不能有效清除凋亡和坏死的细胞，细胞内的DNA被释放至血中。多种病理状态下血中游离DNA的水平和组成会发生改变。肿瘤患者外周血中游离DNA水平高于正常人且可具有肿瘤细胞DNA的特征。血中游离DNA定性定量分析已开始应用于肿瘤的早期诊断、个体化治疗和预后判断等。此外，孕妇血中存在胎儿DNA，检测母体血浆中胎儿游离DNA获取胎儿遗传信息，用于产前诊断，与有创产前相比，具有无创、无痛、安全等优势。
2014年国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准了基于二代测序的无创产前检测临床应用的试剂盒，无创产前诊断技术已经日趋成熟，但是，高通量基因检测在推广方面还面临经济性难题。暂时只在产前血清学筛查高危、中等风险的孕妇中有较高的应用率。因此，不仅需要在测序检查的质量控制、检测效率方面做技术改进，成本优化，降低消费者负担，也是本领域亟待解决的技术问题。
一般而言，二代DNA测序使用包含用于测序的双链DNA的测序用DNA文库来进行。所述用于测序的双链DNA中，单个的待测序DNA片段被插入在5'序列与3'序列之间，所述5'序列与3'序列分别包含与测序引物匹配的碱基序列。由于二代DNA测序技术的限制，所述单个的待测序DNA片段的长度通常为约10bp～500bp。
在使用上述测序用DNA文库进行的二代DNA测序中，需要对每个包含单个的待测序DNA片段的用于测序的双链DNA分别读取数据，即，一个测序流程中只能获得一个待测序DNA片段的数据，尽管现有的测序仪已经可以从双链DNA的两端同时读取数据。使用这种传统的测序用DNA文库进行测序，测序试剂用量大、测序用时长，因而测序成本高、测序效率低。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种构建用于孕妇外周血中游离DNA检测的二代测序DNA文库的方法以及用于孕妇外周血中游离DNA检测的试剂盒，其中，使用采用该方法构建的二代测序DNA文库进行测序能够减少测序试剂用量、缩短测序用时，因而能够降低测序成本、提高测序效率。
本发明的发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现：通过在传统的构建二代测序用DNA文库的方法中，将双3'端加A的步骤变更为单3'端加A的步骤并增加平末端连接步骤，就能够在用于测序的双链DNA的5'序列与3'序列之间插入至少两个以上的待测序DNA片段，这样就能够在测序步骤中从所述双链DNA的两端同时读取两个待测序DNA片段的数据，从而能够减少测序试剂用量、缩短测序用时。
即，基于上述认识的本发明包括：
1.一种构建用于孕妇外周血中游离DNA检测的二代测序用DNA文库的方法，其包括：
步骤A：将希望进行测序的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段，所述希望进行测序的DNA片段是孕妇外周血中的游离DNA；
步骤B-1：将平末端DNA片段中的至少一部分进行单3'端加A，得到单3'端加A的DNA片段；和
步骤B-2：将步骤B-1中得到的单3'端加A的DNA片段进行平末端连接。
2.根据项1所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其还包括：
在所述步骤B-2之后或与所述步骤B-2同时进行的步骤C：将所述步骤B-2中的所述平末端连接的产物加接头，得到加接头DNA片段；和
在所述步骤C之后进行的步骤D：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。
3.根据项1或2所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其还包括：
在所述步骤D之后进行的步骤E：对所述扩增产物进行片段选择。
4.根据项1～3中任一项所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其还包括：
在所述步骤E之后进行的步骤F：对经过片段选择后的扩增产物进行纯化。
5.根据项1～4中任一项所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其还包括：
在所述步骤C之后进行的步骤C1：对所述加接头DNA片段进行片段选择；且在所述步骤D中将经过片段选择的加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。
6.根据项1～5中任一项所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其中，选择出包含至少两个以上的希望进行测序的DNA片段的扩增产物。
7.一种用于孕妇外周血中游离DNA检测的二代测序用DNA文库，其中，包含至少两个以上希望进行测序的DNA片段的双链DNA占全部双链DNA的至少10mol％。
8.根据项7所述的二代测序用DNA文库，其是采用项1-6中任一项所述的构建二代测序用DNA文库的方法构建的。
9.一种用于孕妇外周血中游离DNA检测的试剂盒，其包含具有3'端加A功能的DNA聚合酶，且所述DNA聚合酶的量少于常规的用于构建的二代测序DNA文库的试剂盒中包含的该酶的量。
10.根据项9所述的试剂盒，其中，所述具有3'端加A功能的DNA聚合酶是缺失3'端到5'端外切酶活性的Klenow酶片段。
发明效果
采用构建二代测序用DNA文库的方法构建的二代测序用DNA文库所包含的用于测序的双链DNA中，5'序列与3'序列之间允许插入至少两个以上的待测序DNA片段，这使得在采用双端测序模式的情况下，能够在一个测序流程中同时从用于测序的双链DNA的两端读取数据，从而能够减少测序试剂用量、缩短测序用时，因而能够降低测序成本、提高测序效率。同时，单3'端加A技术节省了构建文库使用的试剂，降低了构建DNA文库及测序的成本。
附图说明
图1是本发明的文库构建流程与传统文库构建流程的对比说明图；
图2是实施例2采用安捷伦2100生物分析仪检测DNA文库片段大小结果示意图；
图3是实施例3的双端测序碱基分布图；
图4是实施例3的单端测序碱基分布图；
图5是实施例3的双端测序质量分布图；
图6是实施例3的单端测序质量分布图。
发明的具体实施方式
首先，在一个方面中，本发明提供一种构建用于孕妇外周血中游离DNA检测的二代测序用DNA文库的方法(本发明的构建二代测序用DNA文库的方法)，其包括：
步骤A：将希望进行测序的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段，所述希望进行测序的DNA片段是孕妇外周血中的游离DNA；
步骤B-1：将平末端DNA片段进行单3'端加A，得到单3'端加A的DNA片段；和
步骤B-2：将步骤B-1中得到的单3'端加A的DNA片段进行平末端连接。
如图1的右图所示，在传统的构建二代测序用DNA文库的方法中，是将经过末端修复而得到的平末端DNA片段进行双3'端加A，而本发明的构建二代测序用DNA文库的方法与传统不同的是：将经过末端修复而得到的平末端DNA片段进行单3'端加A，从而得到单3'端加A的DNA片段，而且，本发明的构建二代测序用DNA文库的方法中还将得到的单3'端加A的DNA片段进行平末端连接。通过上述步骤，可以使进行平末端连接而得到的包含至少两个希望进行测序的DNA片段的DNA片段在后续步骤中作为一个整体插入到用于测序的双链DNA的5'序列与3'序列之间。
上述平末端DNA片段的单3'端加A可以通过任何本领域技术人员已知的方法来实现，例如，可以通过使用具有上述功能的DNA聚合酶(例如缺失3'端到5'端外切酶活性的Klenow片段)来进行。本领域技术人员可以在常规的双3'端加A的酶反应的基础上，通过减少酶用量、降低反应温度、和/或缩短反应时间容易地实现单3'端加A。
上述单3'端加A的DNA片段的平末端连接可以通过任何本领域技术人员已知的方法来实现，例如，可以通过使用具有平末端连接功能的DNA连接酶(例如T4DNA连接酶、T3DNA连接酶)来进行。
优选地，本发明的构建二代测序用DNA文库的方法还包括：
在所述步骤B之前进行的步骤A：将希望进行测序的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；
在所述步骤B-2之后或与所述步骤B-2同时进行的步骤C：将所述步骤B-2的平末端连接产物加接头，得到加接头DNA片段；和
在所述步骤C之后进行的步骤D：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。
上述步骤A、C、D均可采用本技术领域的常规方法来进行。需要说明的是，由于步骤B-2和步骤C均可通过使用一些DNA连接酶(例如T4DNA连接酶、T3DNA连接酶)来进行，所以可以使用上述DNA连接酶(例如T4DNA连接酶、T3DNA连接酶)将步骤B-2和步骤C同时进行。
步骤A中的“希望进行测序的DNA片段”是孕妇外周血中的游离DNA，从孕妇外周血中纯化游离DNA的方法是本领域技术人员已知的。对于步骤A中的“希望进行测序的DNA片段”的大小没有特殊限制，从测序仪可接受的角度来看，优选是100～1000bp左右、更优选是300～800bp左右的DNA片段。
优选地，本发明的构建二代测序用DNA文库的方法还包括在所述步骤D之后进行的步骤E：对所述扩增产物进行片段选择。
优选地，在所述步骤C之后进行的步骤C1：对所述加接头DNA片段进行片段选择；且在所述步骤D中将经过片段选择的加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。
该步骤C1和E中优选选择出插入了至少两个以上的希望进行测序的DNA片段的扩增产物(即尽量去除只插入了一个希望进行测序的DNA片段的、或未插入希望进行测序的DNA片段的扩增产物)。
上述片段选择可以采用本技术领域的常规方法来进行，例如可以通过使用磁珠来进行。在通过使用磁珠进行片段选择的情况下，可以例如根据要选择出的扩增产物的大小调整磁珠的用量，从而获得目的扩增产物。
优选地，在本发明的构建二代测序用DNA文库的方法的各个步骤之间例如步骤A与步骤B-1之间、步骤B-1与步骤C之间、步骤C与步骤C1之间、步骤C(或C1)与步骤D之间、步骤D与步骤E之间，和/或在步骤E之后可以加入对DNA片段进行纯化的步骤。
该纯化步骤可以采用本技术领域的常规方法来进行，例如可以通过使用纯化磁珠来进行。
本发明的构建二代测序用DNA文库的方法与传统方法的显著区别在于其追求将至少两个以上的希望进行测序的DNA片段整合在一个用于测序的双链DNA中，而传统方法则要避免这种情况。
因此，在一个方面中，本发明提供一种二代测序用DNA文库(本发明的二代测序用DNA文库)，其中，包含至少两个以上希望进行测序的DNA片段的双链DNA占全部双链DNA的比例显著高于传统的二代测序用DNA文库，该比例可以为例如至少10mol％，优选至少20mol％，更优选至少30mol％，更优选至少40mol％，更优选至少50mol％，更优选至少60mol％，更优选至少70mol％，更优选至少80mol％，更优选至少90mol％。
本发明的二代测序用DNA文库可以采用例如本发明的构建二代测序用DNA文库的方法来构建。
此外，在另一个方面中，本发明提供一种用于孕妇外周血中游离DNA检测的试剂盒，其包含具有3'端加A功能的DNA聚合酶，且所述DNA聚合酶的量少于常规的用于构建的二代测序DNA文库的试剂盒中包含的该酶的量。所述具有3'端加A功能的DNA聚合酶可以是例如缺失3'端到5'端外切酶活性的Klenow酶片段。
此外，在另一个方面中，本发明提供一种测序方法(本发明的测序方法)，其中，以本发明的二代测序用DNA文库作为对象进行测序。
除了以发明的二代测序用DNA文库作为对象之外，本发明的测序方法可以采用本技术领域的常规方法来进行。优选地，本发明的测序方法可以采用双端测序，例如利用Illumina平台(例如HiSeq2500或NextSeq500)进行的双端测序。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解，此处所描述的实施例是用于解释本发明，而非用于限定本发明。
实施例1采用本发明的方法构建二代测序用DNA文库
(1)希望进行测序的DNA片段的准备
利用TIANGEN公司的DNA提取试剂盒提取孕妇血浆中的游离DNA，步骤如下：
a.取600μL血浆到2.0mLEP管中。加入10μL蛋白酶K，涡旋混匀；
b.加入600μL缓冲液GB和6μLCarrier RNA，涡旋混匀，12000rpm离心30秒。56℃水浴10分钟。室温静置5分钟，2000rpm离心10秒；
c.加入200μL冰冻无水乙醇，上下颠倒6次。室温静置5分钟，2000rpm离心10秒。
d.将步骤d中的溶液转移750μL支吸附柱中，10000rp离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管里，重复该步骤。
e.向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，10000rpm离心30秒。
f.向吸附柱中加入500μL缓冲液PW，10000rpm离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管里。重复该步骤。
g.将吸附柱12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱在室温中晾干5分钟。
h.将吸附柱转移至新的EP管中，向吸附膜中间加入50μL缓冲液TB，室温静置5分钟。12000rpm离心2分钟，得到游离DNA片段。
这些游离DNA片段是一些约300bp的DNA片段与一些约180bp的DNA片段的混合物，这些双链DNA片段中的一些是平末端的，另一些包含3′或5′突出末端。
(2)进行末端修复，得到平末端的DNA片段
A.反应体系如下：
B.在PCR仪孵育30分钟，温度20℃；
C.用磁珠对反应后产物进行纯化，用19.5μL的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱，得到平末端DNA片段。
(3)对平末端DNA片段进行单3'端加A处理
反应体系如下：
在PCR仪孵育30分钟，温度37℃。
(4)特异性接头(Adapter)连接，纯化；
为了能够在PCR中进行特异性扩增，需要在(3)中得到的单3'端加A片段两端加上特异性接头(Adapter)，连接反应所需接头序列在使用时需等比例混合。接头序列如下：
接头序列1：5'P-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3'
接头序列2：5'P-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
A.反应体系如下：
B.在PCR仪孵育15分钟，温度20℃。
C.纯化—用磁珠对反应后产物进行纯化，用19μL的洗脱缓冲液EB(ElutionBuffer)洗脱，得到两端加接头的DNA片段。
需要说明的是，在该步骤中将(3)中得到的单3'端加A片段进行了平末端连接。
(5)对两端连接接头的DNA片段进行PCR扩增、纯化
对两端加接头的DNA片段进行PCR扩增，一方面在PCR的过程中将DNA片段两端添加上与测序引物匹配的碱基序列，另一方面保证DNA片段有足够的总量用来进行接下来的测序。
PCR扩增中所用到的引物序列：
PCR引物1：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
PCR引物2：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
A.反应体系如下：
B.加样之后放到PCR中，94℃保持2分钟；(94℃15秒；62℃30秒；72℃30秒)17个循环；然后72℃保持10分钟；最后将样本保持在4℃保存。
用磁珠对加接头反应得到的产物进行片段选择纯化(步骤如下述)，用一定量的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱，从而完成了测序用DNA文库制备，将该测序用DNA文库保存在适当环境备用。
a.室温中将AmPure磁珠平衡30分钟。
b.根据待纯化的样本数量，取相同数量的1.5mL EP管标记为EP管。
c.将a中平衡好的磁珠，涡旋混匀，并向b中的1.5mL EP管中分装32.5μL磁珠。
d.将PCR产物c中磁珠混合，吹打混匀，室温静置5分钟。移到磁力架上静止3分钟，弃上清。
e.将d中的1.5mL EP管转移至磁力架上，静置3分钟，弃上清。
f.向1.5mL EP管中加入300μL70％乙醇，反复吹打3～6次，弃上清。重复本步骤。吸净乙醇，室温晾干5分钟。
g.将1.5mL EP管从磁力架上移至EP管架上，向每个EP管中加入52μL洗脱液，反复吹打15～20次。室温5分钟，移到磁力架上，静止1分钟。
h.上清即为经片段选择纯化后得到的文库DNA，将上清转移至新的EP管中，用于直接测序或存放于-20℃冰箱中。
实施例2检测二代测序用DNA文库的质量
将实施例1构建的DNA文库采用安捷伦2100生物分析仪检测文库的片段大小。
使用安捷伦2100生物分析仪检测文库，能够了解构建的文库片段是否符合上述文库质量标准，检测结果见图2，从图2中可以了解，
①主要有480bp±10％和660bp±10％两种不同大小的片段；
②480bp±10％的片段所占比例约为50％～70％，660bp±10％的片段所占比例约为30％～50％。
说明实施例1得到的DNA文库构建合格。
实施例3利用Illumina NextSeq500对二代测序用DNA文库进行测序
将实施例1构建完成的二代测序用DNA文库分别进行单端测序和双端测序，测序所使用的试剂为NextSeqTM500High Output v2Kit，测序结果如图3～6所示。
从图3和图4的碱基分布图能够了解到：以上述二代测序用DNA文库作为对象分别进行单端测序与双端测序所得结果基本一致。
从图5和图6的质量分布图能够了解到：质量曲线平滑，无落点。
还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
工业实用性
以采用本发明的构建二代测序用DNA文库的方法构建的用于孕妇外周血中游离DNA检测的二代测序用DNA文库进行测序，能够降低测序成本、提高测序效率。
Claims (3)
1.一种构建用于孕妇外周血中游离DNA检测的二代测序用DNA文库的方法，所述二代测序用DNA文库用于双端测序，其包括：
步骤A：将希望进行测序的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段，所述希望进行测序的DNA片段是孕妇外周血中的游离DNA；
步骤B-1：将平末端DNA片段中的至少一部分进行单3'端加A，得到单3'端加A的DNA片段；步骤B-2：将步骤B-1中得到的单3'端加A的DNA片段进行平末端连接；
在所述步骤B-2之后或与所述步骤B-2同时进行的步骤C：将所述步骤B-2中的所述平末端连接的产物加接头，得到加接头DNA片段；和
在所述步骤C之后进行的步骤D：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物；
在所述步骤D之后进行的步骤E：对所述扩增产物进行片段选择，选择出包含至少两个以上的希望进行测序的DNA片段的扩增产物，去除只插入了一个希望进行测序的DNA片段的或未插入希望进行测序的DNA片段的扩增产物；
所述二代测序用DNA文库中，包含至少两个以上希望进行测序的DNA片段的双链DNA占全部双链DNA的至少50mol％。
2.根据权利要求1所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其还包括：
在所述步骤E之后进行的步骤F：对经过片段选择后的扩增产物进行纯化。
3.根据权利要求1所述的构建二代测序用DNA文库的方法，其还包括：
在所述步骤C之后进行的步骤C1：对所述加接头DNA片段进行片段选择；且在所述步骤D中将经过片段选择的加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。
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