DE60021875T2

DE60021875T2 - Verfahren zur herstellung von nukleosid-verbindung

Info

Publication number: DE60021875T2
Application number: DE60021875T
Authority: DE
Inventors: Seiya Nikumaru; Takeshi Nakamura
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1999-05-13
Filing date: 2000-05-15
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2020-05-16
Also published as: KR20020006046A; EP1179598A4; DE60021875D1; CN1361827A; EP1179598A1; CA2373189A1; ATE301723T1; WO2000070074A1; EP1179598B1

Description

TECHNISCHES GEBIET:
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Nukleosidverbindung unter Verwendung einer Nukleosidphosphorylase. Eine Vielzahl von Nukleosiden und ihrer Analoga werden als Ausgangsmaterialien zur Synthese oder Arzneimittelformulierung bei der Herstellung eines antiviralen Mittels, Krebsmittels oder Antisensibilisierungsmittels verwendet.
STAND DER TECHNIK:
Der Ausdruck "Nukleosidphosphorylase" ist ein generischer Name für Enzyme, die bei der Phosphorolyse einer N-Glycosidbindung in einem Nukleosid in Gegenwart von Phosphorsäure involviert sind. Als Beispiel der Verwendung von Ribonukleosid katalysiert es eine Umsetzung, dargestellt durch die folgende Formel: Ribonukleosid + Phosphorsäure (Phosphat) → Nukleinsäurebase + Ribose-1-phosphat
Die Enzyme, die allgemein in Purinnukleosidphosphorylasen und Pyrimidinnukleosidphosphorylasen klassifiziert werden, sind in der lebenden Welt weit verbreitet; z.B. sind sie in Geweben eines Säugers, Vogels oder Fisches; Hefen; und Bakterien vorhanden. Die Enzymreaktion ist reversibel und die Synthese verschiedener Nukleosidverbindungen unter Verwendung der Umkehrreaktion ist seit mehreren Jahren bekannt.
Es ist z.B. ein Verfahren zur Herstellung von Thymidin JP-A-01-104190), 2'-Desoxyadenosin (JP-A-11-137290) oder 2'-Desoxyguanosin (JP-A-11-137290) aus 2'-Desoxyribose-1-phosphat und einer Nukleinsäurebase (Thymin, Adenin bzw. Guanin) bekannt. Ausserdem beschreibt Agric. Biol. Chem., Bd. 50(1), Seiten 121–126 (1986) eine Technik zur Herstellung von Ribavirin als antivirales Mittel bei der Zersetzung von Inosin zu Ribose-1-phosphat und Hypoxanthin als eine Reaktion unter Verwendung einer Purinnukleosidphosphorylase, erhalten aus Enterobacter aerogenes in Gegenwart von Phosphorsäure, und die Umsetzung von Ribose-1-phosphat, isoliert durch ein Ionenaustauscherharz, und 1,2,4-Triazol-3-carboxamid, ebenfalls unter Verwendung von Purinnukleosidphosphorylase, erhalten aus Enterobacter aerogenes.
Da die Umsetzung zur Bildung der Nukleosidverbindung aus einem Pentose-1-phosphat oder seinem Salz und einer Nukleinsäurebase durch die Umkehrreaktion unter Verwendung des Enzyms eine Gleichgewichtsreaktion ist, bestand jedoch der technische Nachteil, dass die Umwandlungsrate nicht verbessert werden konnte.
Wenn ein Nukleosid industriell hergestellt wird, ist es wesentlich, diese Umsetzung mit einer höheren Umwandlungsrate durchzuführen, um die Rohmaterialkosten zu vermindern und die Reinheit des so erhaltenen Produkts zu verbessern.
Deshalb ist eine Aufgabe dieser Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens, das breiter anwendbar ist, zur Herstellung einer Nukleosidverbindung, umfassend den Schritt der Umsetzung eines Pentose-1-phosphats mit einer Nukleinsäurebase oder seinem Analogon in Gegenwart von Nukleosidphosphorylaseaktivität in die Nukleosidverbindung mit einer verbesserten Umwandlungsrate durch die Reaktion.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG:
Nach intensiver Forschung zur Lösung dieser Probleme haben wir gefunden, dass die Umwandlungsrate durch die Gegenwart eines Metallkations, das mit einem Phosphation ein wasserunlösliches Salz bilden kann, in der Reaktionslösung verbessert werden kann, da sich das Reaktionsgleichgewicht in die Richtung der Synthese der Nukleosidverbindung durch Entfernen des Phosphations, als Nebenprodukt der Umsetzung, aus dem Reaktionssystem als wasserunlöslicher Salzniederschlag verschiebt.
Wir haben ferner gefunden, dass durch die Gegenwart des Metallions, das das wasserunlösliche Salz mit Phosphorsäure in Form eines Pentose-1-Phosphatsalzes in der Reaktionslösung bilden kann, verglichen mit der obigen Addition des Metallkations oder seines Salzes, das mit Phosphorsäure ein wasserunlösliches Salz in der Reaktionslösung bilden kann, beinahe die gleiche Wirkung erzielt werden kann.
Diese Erfindung basiert auf diesen Erkenntnissen.
Insbesondere umfasst ein erfindungsgemässes Verfahren zur Herstellung einer Nukleosidverbindung einen Schritt des Umsetzens von Pentose-1-phosphat mit einer Nukleinsäurebase oder seinem Analogon in Gegenwart von Nukleosidphosphorylaseaktivität in einem wässrigen Reaktionsmedium zur Bildung der Nukleosidverbindung, das gekennzeichnet ist durch die Gegenwart eines Metallkations, das mit einem Phosphation ein wasserunlösliches Salz bilden kann, in dem wässrigen Reaktionsmedium.
Ribose-1-phosphat oder 2'-Desoxyribose-1-phosphat können in diesem Herstellungsverfahren als Pentose-1-phosphat verwendet werden.
Als Metallkation, das mit Phosphorsäure ein wasserunlösliches Salz bilden kann, kann mindestens eines, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Calcium-, Barium- und Aluminiumionen, verwendet werden.
Das Metallkation, das mit Phosphorsäure ein wasserunlösliches Salz bilden kann, kann zu dem wässrigen Reaktionsmittel als Metallsalz mit mindestens einem Anion, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chlorid-, Nitrid-, Carbonat-, Sulfat- und Acetationen, zugegeben werden.
Das Metallkation, das mit Phosphorsäure ein wasserunlösliches Salz bilden kann, kann als Pentose-1-Phosphatsalz in dem wässrigen Reaktionsmedium vorhanden sein.
Gemäss dieser Erfindung kann die ReaktionsAusbeute bei der Synthese der Nukleosidverbindung aus dem Pentose-1-phosphat und der Nukleinsäurebase oder Ihrem Analogon unter Verwendung der Enzymaktivität der Nukleosidphosphorylase in Gegenwart des Metallkations, das mit Phosphorsäure ein wasserunlösliches Salz bilden kann, signifikant verbessert werden und deshalb kann ein effektives Verfahren zur Herstellung der Nukleosidverbindung bereitgestellt werden.
BESTE WEISE ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG:
Der hier verwendete Ausdruck "Pentose-1-phosphat" betrifft ein Polyhydroxyaldehyd oder Polyhydroxyketon oder deren Derivat, an das eine Phosphatgruppe in der ersten Position, Position 1, über eine Esterverknüpfung befestigt ist.
Typische Beispiele hierfür schliessen Ribose-1-phosphat, 2'-Desoxyribose-1-phosphat, 2',3'-Didesoxyribose-1-phosphat und Arabinose-1-phosphat ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Beispiele eines Polyhydroxyaldehyds oder Polyhydroxyketons schliessen hier Aldopentosen, wie D-Arabinose, L-Arabinose, D-Xylose, L-Lyxose und D-Ribose; Ketopentosen, wie D-Xylulose, L-Xylulose und D-Ribulose; und Desoxysaccharide, wie D-2-Desoxyribose und D-2,3-Didesoxyribose, als solche aus einer natürlichen Quelle ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Ein solches Pentose-1-phosphat kann durch ein bekanntes Verfahren hergestellt werden, einschliesslich der Phosphorolyse einer Nukleosidverbindung unter Verwendung der Aktivität einer Nukleosidphosphorylase, wie in J. Biol. Chem., Bd. 184, 437 (1950) beschrieben; und einer anomer-selektiven chemischen Synthese.
Eine erfindungsgemäss verwendete Nukleinsäurebase oder ihr Analogon ist eine stickstoffhaltige heterocyclische Verbindung, die ein Element zur chemischen strukturellen Bildung von DNA oder RNA ist, einschliesslich natürlicher oder künstlicher Nukleinsäurebasen oder ihrer Analoga, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pyrimidin, Purin und Nukleinsäurebase-Analoga.
Eine solche Nukleinsäurebase oder ihre Analoga können mit (einem) Halogenatom(en) oder einer Alkylgruppe, einer Halogenalkylgruppe, einer Alkenylgruppe, einer Halogenalkenylgruppe, einer Alkinylgruppe, einer Aminogruppe, einer Alkylaminogruppe, einer Hydroxygruppe, einer Hydroxyaminogruppe, einer Aminooxygruppe, einer Alkoxygruppe, einer Mercaptogruppe, einer Alkylmercaptogruppe, einer Arylgruppe, einer Aryloxygruppe oder einer Cyanogruppe substituiert sein.
Beispiele des Halogenatoms als Substituent schliessen Chlor-, Fluor-, Iod- und Bromatome ein.
Beispiele der Alkylgruppe schliessen eine Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, wie eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe und eine Propylgruppe, ein.
Beispiele der Halogenalkylgruppe schliessen diejenigen mit einer Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, wie eine Fluormethylgruppe, eine Difluormethylgruppe, eine Trifluormethylgruppe, eine Brommethylgruppe und eine Bromethylgruppe, ein.
Beispiele der Alkenylgruppe schliessen diejenigen mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, wie eine Vinylgruppe und eine Alkylgruppe, ein.
Beispiele der Halogenalkenylgruppe schliessen diejenigen mit einer Alkenylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, wie eine Bromvinylgruppe und eine Chlorvinylgruppe, ein.
Beispiele der Alkinylgruppe schliessen diejenigen mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, wie eine Ethinylgruppe und eine Propinylgruppe, ein.
Beispiele der Alkylaminogruppe schliessen diejenigen mit einer Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, wie eine Methylaminogruppe und eine Ethylaminogruppe, ein.
Beispiele der Alkoxygruppe schliessen diejenigen mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, wie eine Methoxygruppe und eine Ethoxygruppe, ein.
Beispiele der Alkylmercaptogruppe schliessen diejenigen mit einer Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, wie eine Methylmercaptogruppe und eine Ethylmercaptogruppe, ein.
Beispiele der Arylgruppe schliessen eine Phenylgruppe; eine Alkylphenylgruppe mit (einer) Alkylgruppe(n) mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie eine Methylphenylgruppe und eine Ethylphenylgruppe; eine Alkoxyphenylgruppe mit (einer) Alkoxygruppe(n) mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie eine Methoxyphenylgruppe und eine Ethoxyphenylgruppe; eine Alkylaminophenylgruppe mit (einer) Alkylaminogruppe(n) mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie eine Dimethylaminophenylgruppe und eine Diethylaminophenylgruppe; und eine Halogenphenylgruppe, wie eine Chlorphenylgruppe und eine Bromphenylgruppe, ein.
Beispiele der Pyrimidinverbindung schliessen Cytosin, Uracil, 5-Fluorcytosin, 5-Fluoruracil, 5-Chlorcytosin, 5-Chloruracil, 5-Bromcytosin, 5-Bromuracil, 5-Iodcytosin, 5-Ioduracil, 5-Methylcytosin, 5-Methyluracil(thymin), 5-Ethylcytosin, 5-Ethyluracil, 5-Fluormethylcytosin, 5-Fluoruracil, 5-Trifluorcytosin, 5-Trifluoruracil, 5-Vinyluracil, 5-Bromvinyluracil, 5-Chlorvinyluracil, 5-Ethinylcytosin, 5-Ethinyluracil, 5-Propinyluracil, Pyrimidin-2-on, 4-Hydroxyaminopyrimidin-2-on, 4-Aminoxypyrimidin-2-on, 4-Methoxypyrimidin-2-on, 4-Acetoxypyrimidin-2-on, 4-Fluorpyrimidin-2-on und 5-Fluorpyrimidin-2-on ein.
Beispiele der Purinverbindung schliessen Purin, 6-Aminopurin(adenin), 6-Hydroxypurin, 6-Fluorpurin, 6-Chlorpurin, 6-Methylaminopurin, 6-Dimethylaminopurin, 6-Trifluormethylaminopurin, 6-Benzoylaminopurin, 6-Acetylaminopurin, 6-Hydroxyaminopurin, 6-Aminoxypurin, 6-Methoxypurin, 6-Acetoxypurin, 6-Benzoyloxypurin, 6-Methylpurin, 6-Ethylpurin, 6-Trifluormethylpurin, 6-Phenylpurin, 6-Mercaptopurin, 6-Methylmercaptopurin, 6-Aminopurin-1-oxid, 6-Hydroxypurin-1-oxid, 2-Amino-6-hydroxypurin(guanin), 2,6-Diaminopurin, 2-Amino-6-chlorpurin, 2-Amino-6-iodpurin, 2-Aminopurin, 2-Amino-6-mercaptopurin, 2-Amino-6-methylmercaptopurin, 2-Amino-6-hydroxyaminopurin, 2-Amino-6-methoxypurin, 2-Amino-6-benzoyloxypurin, 2-Amino-6-acetoxypurin, 2-Amino-6-methylpurin, 2-Amino-6-cyclopropylaminomethylpurin, 2-Amino-6-phenylpurin, 2-Amino-8-brompurin, 6-Cyanopurin, 6-Amino-2-chlorpurin(2-chloradenin) und 6-Amino-2-fluorpurin(2-fluoradenin) ein.
Beispiele eines Nukleinsäurebase-Analogons schliessen 6-Amino-3-desazapurin, 6-Amino-8-azapurin, 2-Amino-6-hydroxy-8-azapurin, 6-Amino-7-desazapurin, 6-Amino-1-desazapurin und 6-Amino-2-azapurin ein.
In dieser Erfindung betrifft eine Nukleosidverbindung das obige Polyhydroxyaldehyd oder Polyhydroxyketon, an das die Pyrimidinverbindung, die Purinverbindung oder das Nukleinsäurebase-Analog in Position 1 über eine N-Glycosidverknüpfung befestigt ist. Beispiele schliessen Thymidin, Desoxythymidin, Desoxyuridin, Desoxyguanosin, Desoxyadenosin, Didesoxyadenosin, Trifluorthymidin, Ribavirin, Orotidin, Uracilarabinosid, Adeninarabinosid, 2-Methyl-adeninarabinosid, 2-Chlor-hypoxanthinarabinosid, Thioguaninarabinosid, 2,6-Diaminopurinarabinosid, Cytosinarabinosid, Guaninarabinosid, Thyminarabinosid, Enocitabin, Gemcitabin, Azidothymidin, Idoxuridin, Didesoxyadenosin, Didesoxyinosin, Didesoxycytidin, Didehydrodesoxythymidin, Thiadidesoxycytidin, Sorivudin, 5-Methyluridin, Virazol, Thioinosin, Tegafur, Doxifluridin, Bredinin, Nebularin, Allopurinol, 5-Fluoruracil, 2'-Aminouridin, 2'-Aminoadenosin, 2'-Aminoguanidin und 2-Chlor-2'-aminoinosin ein.
Nukleosidphosphorylase ist ein generischer Name für Enzyme, die eine N-Glycosidbindung in einem Nukleosid in Gegenwart von Phosphorsäure phosphorolysieren können, und ihre Umkehrreaktion kann durch Verwendung dieser Enzymaktivität auf diese Erfindung angewendet werden. Ein in der Umsetzung verwendetes Enzym kann jeden Typs oder jeden Ursprungs sein, solange es die Aktivität zur Bildung einer gewünschten Nukleosidverbindung aus einem entsprechenden Pentose-1-phosphat und einer Nukleinsäurebase oder seinem Analogon besitzt. Die Enzyme können allgemein in zwei Typen, Purin- und Pyrimidintypen, eingeordnet werden. Bekannte Beispiele eines Enzyms vom Purintyp schliessen Purinnukleosidphosphorylase (EC2.4.2.1) und Guanosinphosphorylase (EC2.4.2.15) ein. Beispiele eines Enzyms vom Pyrimidintyp schliessen Pyrimidinnukleosidphosphorylase (EC2.4.2.2), Uridinphosphorylase (EC2.4.2.3), Thymidinphosphorylase (EC2.4.2.4) und Desoxyuridinphosphorylase (EC2.4.2.23) ein.
In dieser Erfindung kann die Nukleosidphosphorylaseaktivität durch Verwendung eines Mikroorganismus mit Enzymaktivität auf ein Reaktionssystem in einem wässrigen Reaktionsmedium oder in Kontakt mit einem wässrigen Reaktionsmedium angewendet werden. Ein solcher Mikroorganismus kann ohne Einschränkungen jeder Mikroorganismus sein, der mindestens eine Nukleosidphosphorylase, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Purinnukleosidphosphorylase (EC2.4.2.1), Guanosinphosphorylase (EC2.4.2.15), Pyrimidinnukleosidphosphorylase (EC2.4.2.2), Uridinphosphorylase (EC2.4.2.3), Thymidinphosphorylase (EC2.4.2.4) und Desoxyuridinphosphorylase (EC2.4.2.23), exprimiert.
Bevorzugte Beispiele eines solchen Mikroorganismus schliessen Stämme ein, die zu den folgenden Genera gehören: Nocardia, Mikrobacterium, Corynebacterium, Brevibacterium, Cellulomonas, Flavobacterium, Kluyvere, Micobacterium, Haemophilus, Micoplana, Protaminobacter, Candida, Saccharomyces, Bacillus, thermophile Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, Hafnia, Proteus, Vibrio, Staphylococcus, Propionibacterium, Sartina, Planococcus, Escherichia, Kurthia, Rhodococcus, Acinetobacter, Xanthobacter, Streptomyces, Rhizobium, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Aeromonas, Citrobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Arthrobacter und Pseudonocardia.
Kürzliche Fortschritte in der Molekularbiologie und Gentechnik haben die Herstellung von gentechnischen rekombinanten Stämmen ermöglicht und relativ erleichtert durch Erhalt eines Gens für eine Nukleosidphosphorylase aus obigem Stamm durch die Analyse der molekularbiologischen Eigenschaften, der Aminosäuresequenz usw. des Proteins in dem Stamm; Erzeugen eines rekombinanten Plasmids, in das das Gen und eine regulatorische Region für ihre Expression insertiert wird; und Einführen des Plasmids in einen gegebenen Wirt zum Erhalt des rekombinanten Stamms zum Exprimieren des Proteins durch den rekombinanten Stamm. Angesichts des letzten technischen Niveaus kann ein solcher gentechnischer rekombinanter Stamm, erhalten durch Einführen des Gens für eine Nukleosidphosphorylase in einen gewünschten Wirt, in den Mikroorganismus eingeführt werden, der die Phosphorylase gemäss der vorliegenden Erfindung exprimieren kann.
Eine regulatorische Region, die hier zum Exprimieren notwendig ist, kann eine Promotorsequenz (kann eine Operatorsequenz, die die Transkription kontrolliert, einschliessen), eine Ribosom-Bindungssequenz (SD-Sequenz), eine Transkriptionsterminierungssequenz oder dergleichen sein. Beispiele einer Promotorsequenz schliessen ein: ein trp-Operator in einem Tryptophanoperon, erhalten aus E. coli; ein lac-Promotor in einem Lactoseoperon; ein P_L-Promotor und ein P_R-Promotor, erhalten aus einer lambda-Phage; ein Gluconatsynthasepromotor (gnt), erhalten aus Bacillus subtilis; ein Alkaliproteasepromotor (apr); ein neutralen Proteasepromotor (npr); und ein α-Amylasepromotor (amy). Eine einmalige modifizierte und gestaltete Sequenz, wie ein tac-Promotor, kann verwendet werden. Eine Ribosom-Bindungssequenz kann z.B. eine Sequenz, erhalten aus E. coli oder Bacillus subtilis, sein, aber es kann jede Sequenz verwendet werden, solange sie in einem bestimmten Wirt, wie E. coli und Bacillus subtilis, fungieren kann. Beispielsweise kann man eine durch DNA-Synthese gebildete Konsenssequenz verwenden, d.h. eine Sequenz mit mehr als 4 aufeinanderfolgenden Basen, die zur 3'-terminalen Region in 16S-Ribosom-RNA komplementär sind. Eine Transkriptionsterminierungssequenz ist nicht immer notwendig, sondern es kann ein ρ-Faktorunabhängiger Terminator, wie ein Lipoproteinterminator oder trp-Operonterminator, verwendet werden. Wünschenswerterweise können diese regulatorischen Regionen eines rekombinanten Plasmids wie folgt sequentiell ausgerichtet werden: stromaufwärts eines 5'-Terminus, eine Promotorsequenz, eine Ribosom-Bindungssequenz, ein Nukleosidphosphorylase-Codierungsgen und eine Transkriptionsterminierungssequenz.
Als konkrete Beispiele eines Plasmids können hier pBR 322, pUC18, Bluescript II SK(+), pKK223-3 und pSC101 mit einer autonom replizierbaren Region in E. coli; pUB110, pTZ4, pC194, p11, ϕ1 und ϕ105 mit einer autonom replizierbaren Region in Bacillus subtilis als Vektor verwendet werden. Als Beispiele eines Plasmids, das in zwei oder mehr Wirten autonom replizierbar ist, können pHV14, TRp7, YEp7 und pBS7 als Vektor verwendet werden.
Ein gegebener Wirt kann hier typischerweise Escherichia coli, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, sein, ist aber nicht hierauf beschränkt, aber andere Stämme, wie Bacillus sp., einschliesslich Bacillus subtilis, sowie Hefen und Actinomyces, können verwendet werden.
Die Nukleosidphosphorylase oder der Mikroorganismus, der seine Aktivität exprimieren kann, kann erfindungsgemäss ein kommerziell erhältliches Enzym, ein Mikroorganismusstamm, der seine Aktivität exprimieren kann, ein verarbeitetes Material des Stamms oder ein immobilisiertes Produkt davon sein. Ein verarbeitetes Material des Stamms können z.B. Aceton-getrocknete Zellen oder bakterielle Debris, hergestellt durch ein geeignetes Verfahren, wie mechanische Zerstörung, Ultraschallzersetzung, Einfrieren und Auftauen, unter Druck setzen und den Druck wieder aufheben, osmotische Druckverfahren, Autolyse, Zellwandzersetzung und Tensidbehandlung, sein. Falls erforderlich, kann der Stamm weiter durch Ammoniumsulfatfällung, Acetonfällung und Säulenchromatografie gereinigt werden.
Erfindungsgemäss kann ein Metallkation, das mit einem Phosphation ein wasserunlösliches Salz bilden kann, ohne Einschränkung jedes Metallkation sein, das mit einem Phosphation ein wasserunlösliches Salz als Nebenprodukt in der Fällungsreaktion bilden kann. Beispiele solcher Metallkationen schliessen Calcium-, Magnesium-, Barium-, Eisen-, Kobalt-, Nickel-, Kupfer-, Silber-, Molybdän-, Blei-, Zink- und Lithiumionen ein. Unter diesen sind industriell universelle und sichere Metallionen, die die Umsetzung nicht beeinträchtigen, z.B. Calcium-, Barium- und Aluminiumionen, besonders bevorzugt.
Das Metallkation, das erfindungsgemäss mit einem Phosphation ein wasserunlösliches Salz bilden kann, kann/können als Salz(e) von (einem) Metallkation(en), das/die mit einem Phosphation (ein) wasserunlösliche(s) Salz(e) bilden kann/können, mit mindestens einem Anion, ausgewählt aus Chlorid-, Nitrid-, Carbonat-, Sulfonat- und Acetationen, zu der Reaktionslösung gegeben werden. Beispiele eines solchen Salzes schliessen Calciumchlorid, Calciumnitrid, Calciumcarbonat, Calciumsulfat, Calciumacetat, Bariumchlorid, Bariumnitrid, Bariumcarbonat, Bariumsulfat, Bariumacetat, Aluminiumchlorid, Aluminiumnitrid, Aluminiumcarbonat, Aluminiumsulfat und Aluminiumacetat ein.
Erfindungsgemäss kann ein Metallkation als Salz mit einem Pentose-1-phosphat in der Reaktionslösung vorhanden sein. Konkrete Beispiele eines solchen Salzes schliessen Ribose-1-phosphat-Calciumsalz, 2-Desoxyribose-1-phosphat-Calciumsalz, 2-Didesoxyribose-1-phosphat-Calciumsalz, Arabinose-1-phosphat-Calciumsalz, Ribose-1-phosphat-Bariumsalz, 2-Desoxyribose-1-phosphat-Bariumsalz, 2,3-Didesoxyribose-1-phosphat-Bariumsalz, Arabinose-1-phosphat-Bariumsalz, Ribose-1-phosphat-Aluminiumsalz, 2-Desoxyribose-1-phosphat-Aluminiumsalz, 2,3-Didesoxyribose-1-phosphat-Aluminiumsalz und Arabinose-1-phosphat-Aluminiumsalz ein.
Ein wässriges Reaktionsmedium, das eine Reaktionslösung ausmacht, die erfindungsgemäss verwendet wird, ist ein Reaktionsmedium, das hauptsächlich Wasser umfasst. Jedes solche Medium kann verwendet werden, solange es Phosphationen aus dem Reaktionssystem als unlöslichen Salzniederschlag durch Umsetzen mit einem Metallkation entfernt, während die gewünschte Umsetzung unter Verwendung von Enzymaktivität in dieser Erfindung fortschreitet. Beispiele eines solchen wässrigen Reaktionsmediums schliessen Wasser und wässriges Reaktionsmedium, hergestellt durch Zugabe eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels, wie einem Niederalkohol, Aceton und Dimethylsulfoxid, zu Wasser ein. Wenn ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel verwendet wird, kann das Verhältnis von wasserlöslichem organischen Lösungsmittel zu Wasser beispielsweise 0,1 bis 70 Gew.% betragen. Zur Sicherstellung der Reaktionsstabilität kann eine Reaktionslösung, umfassend das wässrige Reaktionsmedium, als Puffer hergestellt werden. Bekannte Puffer, die für die erfindungsgemässe Enzymreaktion verwendet werden können, können als Puffer verwendet werden.
Erfindungsgemäss kann die Umsetzung zur Herstellung einer Nukleosidverbindung unter Bedingungen, wie geeigneter pH und Temperatur in Abhängigkeit vom Zielnukleosid, einem Pentose-1-phosphat und einer Nukleinsäurebase oder ihrem Analogon als Substrate, einer Nukleosidphosphorylase oder einem Mikroorganismus, der die Aktivität des Enzyms zeigt, oder einer von verschiedenen Zubereitungen des Mikroorganismus als Reaktionskatalysator, und Art und Eigenschaften eines Metallsalzes, das zur Eliminierung von Phosphorsäure aus dem Reaktionssystem zugegeben wird, durchgeführt werden. Die Umsetzung kann im allgemeinen bei einem pH im Bereich von 5 bis 10 und einer Temperatur im Bereich von 10 bis 60°C durchgeführt werden. Falls der pH nicht innerhalb des Kontrollbereichs liegt, nimmt die Reaktionsumwandlungsrate möglicherweise aufgrund von beispielsweise schlechter Stabilität des Zielprodukts oder Substrats, Abnahme der Enzymaktivität und Versagen beim Bilden des wasserunlöslichen Salzes mit Phosphorsäure ab. Falls sich der pH während der Umsetzung verändert, kann, falls notwendig, eine Säure, wie Salzsäure und Schwefelsäure, oder eine Base, wie Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid, zu einem geeigneten Zeitpunkt zugegeben werden. Die Konzentrationen eines Pentose-1-phosphats und einer Nukleinsäurebase oder ihres Analogons sind geeigneterweise ca. 0,1 bis 1.000 mM. Das molare Verhältnis zwischen diesen, d.h. das molare Verhältnis einer Nukleinsäurebase oder ihres Analogs zu Pentose-1-phosphat oder dessen Salzen, kann 0,1 bis 10, vorzugsweise 0,95 oder weniger, unter Berücksichtigung der Reaktionsumwandlungsrate sein. Wenn zwei oder mehrere Nukleinsäurebasen oder ihre Analoga als Mischung verwendet werden, können die obige Konzentration und die Molverhältnisse für die gesamte verwendete Menge ausgewählt werden.
Ein zuzugebendes Metallkation, das mit Phosphorsäure ein wasserunlösliches Salz bilden kann, kann in einem Molverhältnis von 0,1 bis 10, vorzugsweise 0,5 bis 5, zu einem in der Umsetzung verwendeten Pentose-1-phosphat zugegeben werden. In einer Reaktion mit einer höheren Konzentration werden möglicherweise eine Nukleinsäurebase oder ihr Analogon als Substrat oder ein Nukleosid als Produkt nicht vollständig in der Reaktionslösung gelöst. Diese Erfindung kann auch auf einen solchen Fall angewendet werden. Wenn eine Mischung von zwei oder mehreren Materialien als Metallkation verwendet wird, kann das obige molare Verhältnis für die gesamte verwendete Menge ausgewählt werden.
Eine so hergestellte Nukleosidverbindung kann aus der Reaktionslösung durch ein übliches Verfahren, wie Konzentration, Kristallisation, Auflösung, Elektrodialyse und Adsorption und Desorption unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes oder Aktivkohle isoliert werden.
BEISPIELE
Diese Erfindung wird unter Bezugnahme auf Beispiele und Vergleichsbeispiele erläutert, ohne sie zu beschränken.
Analytisches Verfahren:
Alle hergestellten Nukleosidverbindungen wurden durch Hochdruck-Flüssigchromatografie unter den folgenden Analysebedingungen bewertet.

Säule: YMC-Pack ODS-A312 150 × 6,0 mm I.D. (YMC Co., Ltd.) Säulentemperatur: 40°C Pumpenfliessrate: 0,75 ml/min Detektion: UV 260 nm Eluent: 10 mM Phosphorsäure:Acetonitril = 95:5 (V/V)

BEISPIEL 1
1 ml einer Reaktionsmischung, bestehend aus 2,5 mM 2'-Desoxyribose-1-phosphat-Di(monocyclohexylammonium)salz (Sigma), 2,5 mM Adenin (Wako Pure Chemicals, Extra Pure), 12 Einheiten/ml Purinnukleosidphosphorylase (Funakoshi), 10 mM Calciumchlorid (Wako Pure Chemicals, Extra Pure) und 10 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 7,4) wurden 24 Stunden bei 30°C umgesetzt. Am Ende der Umsetzung hatte sich ein weisser Niederschlag gebildet. Nach Verdünnen wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigten die Bildung von 2,40 mM Desoxyadenosin in einer Ausbeute von 96,0 %.
VERGLEICHSBEISPIEL 1
Eine Umsetzung wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, ausser dass Calciumchlorid nicht zugegeben wurde. Am Ende der Umsetzung wurde kein Niederschlag beobachtet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigten die Bildung von 2,01 mM Desoxyadenosin in einer Ausbeute von 80,4 %.
BEISPIEL 2
Eine Umsetzung wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, ausser dass die Calciumchloridkonzentration 2,5 mM betrug. Am Ende der Umsetzung hatte sich ein weisser Niederschlag gebildet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigten die Bildung von 2,27 mM Desoxyadenosin in einer Ausbeute von 90,8 %.
BEISPIEL 3
Eine Umsetzung wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, ausser dass Aluminiumchlorid anstelle von Calciumchlorid zugegeben wurde. Am Ende der Umsetzung hatte sich ein weisser Niederschlag gebildet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigten die Bildung von 2,31 mM Desoxyadenosin in einer Ausbeute von 93,3 %.
BEISPIEL 4
Eine Umsetzung wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, ausser dass Bariumchlorid anstelle von Calciumchlorid zugegeben wurde. Am Ende der Umsetzung hatte sich ein weisser Niederschlag gebildet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigten die Bildung von 2,31 mM Desoxyadenosin in einer Ausbeute von 92,4 %.
BEISPIEL 5
Eine Umsetzung wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, ausser dass die Bariumchloridkonzentration 2,5 mM betrug. Am Ende der Umsetzung hatte sich ein weisser Niederschlag gebildet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Bildung von 2,27 mM Desoxyadenosin in einer Ausbeute von 90,2 %.
BEISPIEL 6
2-Desoxyribose-1-phosphat-Bariumsalz wurde wie in Journal of Biological Chemistry, Bd. 184, Seiten 449–459 (1950) beschrieben hergestellt. 1 ml einer Reaktionsmischung, bestehend aus 2,5 mM 2-Desoxyribose-1-phosphat-Bariumsalz, 2,5 mM Adenin (Wako Pure Chemicals, Extra Pure), 12 Einheiten/ml Purinnukleosidphosphorylase (Funakoshi), 10 mM Calciumchlorid (Wako Pure Chemicals, Extra Pure) und 10 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 7,4), wurde 24 Stunden bei 30°C umgesetzt. Am Ende der Umsetzung hatte sich ein weisser Niederschlag gebildet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigten die Bildung von 2,40 mM Desoxyadenosin in einer Ausbeute von 91,1 %.
BEISPIEL 7
1 ml einer Reaktionsmischung, bestehend aus 2,5 mM 2-Desoxyribose-1-phosphat-Di(monocyclohexylammonium)salz (Sigma), 2,5 mM Thymin (Wako Pure Chemicals, Extra Pure), 12 Einheiten/ml Thymidinphosphorylase (Sigma), 10 mM Calciumnitrat (Wako Pure Chemicals, Extra Pure) und 10 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 7,4), wurde 24 Stunden bei 30°C umgesetzt. Am Ende der Umsetzung hatte sich ein weisser Niederschlag gebildet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Bildung von 2,28 mM Thymidin in einer Ausbeute von 91,2 %.
VERGLEICHSBEISPIEL 2
Eine Umsetzung wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt, ausser dass kein Calciumnitrat zugegeben wurde. Am Ende der Umsetzung wurde kein Niederschlag beobachtet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Bildung von 1,88 mM Thymidin in einer Ausbeute von 75,2 %.
BEISPIEL 8
1 ml einer Reaktionsmischung, bestehend aus 2,5 mM Ribose-1-phosphat-Cyclohexylammoniumsalz (Sigma), 2,5 mM 2,6-Diaminopurin (Aldrich), 12 Einheiten/ml Purinnukleosidphosphorylase (Funakoshi), 10 mM Calciumchlorid (Wako Pure Chemicals, Extra Pure) und 10 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 7,4), wurde 24 Stunden bei 30°C umgesetzt. Am Ende der Umsetzung hatte sich ein weisser Niederschlag gebildet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Bildung von 1,9 mM 2,6-Diaminopurinribosid in einer Ausbeute von 77,6 %.
VERGLEICHSBEISPIEL 3
Eine Umsetzung wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt, ausser dass kein Calciumchlorid zugegeben wurde. Am Ende der Umsetzung wurde kein Niederschlag beobachtet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Bildung von 1,54 mM 2,6-Diaminopurinribosid in einer Ausbeute von 61,6 %.
BEISPIEL 9
E. coli-Chromosomen-DNA wurde wie folgt hergestellt.
50 ml eines LB-Mediums wurden mit Escherichia coli K-12/XL-10-Stamm (Stratagene Inc.) inokuliert und bei 37°C über Nacht kultiviert. Nach Sammeln wurde das Bakterium mit einer Lyselösung, enthaltend 1 mg/ml Lysozym, lysiert. Die Lyselösung wurde mit Phenol behandelt und DNA wurde wie üblich durch Ethanolfällung gefällt. Der DNA-Niederschlag wurde mit einem Glasstab gesammelt und zur Herstellung der gewünschten DNA für PCR gewaschen.
Oligonukleotide von SEQ ID No. 1 und 2 (hergestellt durch einen Auftragshersteller; Hokkaido System Science Co., Ltd.), gestaltet auf Basis der Sequenz eines bekannten deoD-Gens in Escherichia coli (GenBank-Zugangsnummer AE000508 mit einer Codierungsregion der Basenzahlen 11531 bis 12250), wurden als Primer für PCR verwendet. Diese Primer haben Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen für EcoRI und HindIII nahe 5'- bzw. 3'-Enden.
SEQ ID NO. 1: GTGAATTCAC AAAAAGGATA AAACA ATG GC
SEQ ID NO. 2: TCGAAGCTTG CGAAACACAA TTA CTC TTT
Unter Verwendung von 0,1 ml einer PCR-Reaktionslösung, enthaltend 6 ng/μl der obigen E. coli-Chromosomen-DNA, die vollständig durch das Restriktionsenzym HindIII verdaut war, und die Primer (jeweils bei 3 μM), wurde PCR mit 30 Zyklen durchgeführt unter den Bedingungen der Denaturierung: 96°C, 1 min; Annealen: 55°C, 1 min; Elongation: 74°C, 1 min pro Zyklus.
Das obige Reaktionsprodukt und ein Plasmid pUC18 (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden durch EcoRI und HindIII verdaut und unter Verwendung von Ligation-High (Toyobo Co., Ltd.) ligiert. Das so erhaltene rekombinante Plasmid wurde zum Transformieren von Escherichia coli DH5α verwendet. Der transformierte Stamm wurde in einem LB-Agarmedium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin und X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid), zur Bereitstellung eines Am-resistenten Transformanden als weisse Kolonie kultiviert.
Ein Plasmid wurde vom so erhaltenen Transformanden extrahiert und das Plasmid, worin ein gewünschtes DNA-Fragment insertiert worden war, wurde als pUC-PNP73 bezeichnet. Der so erhaltene Transformand wurde als Escherichia coli MT-10905 bezeichnet.
Escherichia coli MT-10905 wurde durch Schütteln über Nacht bei 37°C in 100 ml eines LB-Mediums, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, kultiviert. Das Kulturmedium wurde zum Sammeln der Zellen bei 13.000 U/min 10 Minuten zentrifugiert. Die Zellen wurden in 10 ml 10 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 8,0) suspendiert und zum Erhalt eines als Enzymquelle zu verwendenden Homogenisats mit Ultraschall behandelt.
1 ml einer Reaktionsmischung, bestehend aus 10 mM 2'-Desoxyribose-1-phosphat-Di(monocyclohexylammonium)salz (Sigma), 10 mM Adenin (Wako Pure Chemicals, Extra Pure), 20 mM Calciumchlorid, 100 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 8,0) und 20 Einheiten/ml der oben beschriebenen Purinnukleosidphosphorylase, wurde 20 Stunden bei 50°C umgesetzt.
Am Ende der Umsetzung hatte sich ein weisser Niederschlag gebildet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Bildung von 9,6 mM Desoxyadenosin in einer Ausbeute von 96,0 %.
VERGLEICHSBEISPIEL 4
Eine Umsetzung wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt, ausser dass kein Calciumchlorid zugegeben wurde. Am Ende der Umsetzung wurde kein Niederschlag beobachtet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Bildung von 7,9 mM Desoxyadenosin in einer Ausbeute von 79 %.
BEISPIEL 10
1 ml einer Reaktionsmischung, bestehend aus 10 mM 2'-Desoxyribose-1-phosphat-Di(monocyclohexylammonium)salz (Sigma), 10 mM Guanin (Wako Pure Chemicals, Extra Pure), 20 mM Calciumchlorid, 10 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 8,0) und 20 Einheiten/ml der wie in Beispiel 9 beschrieben hergestellten Purinnukleosidphosphorylase, wurden 20 Stunden bei 50°C umgesetzt.
Am Ende der Umsetzung hatte sich ein weisser Niederschlag gebildet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Bildung von 8,0 mM Desoxyguanosin in einer Ausbeute von 80,0 %.
VERGLEICHSBEISPIEL 5
Eine Umsetzung wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt, ausser dass kein Calciumchlorid zugegeben wurde. Am Ende der Umsetzung wurde kein Niederschlag beobachtet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Bildung von 5,1 mM Desoxyguanosin in einer Ausbeute von 51 %.
BEISPIEL 11
1 ml einer Reaktionsmischung, bestehend aus 10 mM 2'-Desoxyribose-1-phosphat-Di(monocyclohexylammonium)salz (Sigma), 10 mM Thymin (Wako Pure Chemicals, Extra Pure), 20 mM Calciumchlorid, 100 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 8,0) und 20 Einheiten/ml Thymidinphosphorylase, wurde 20 Stunden bei 50°C umgesetzt.
Am Ende der Umsetzung hatte sich ein weisser Niederschlag gebildet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Bildung von 9,0 mM Thymidin in einer Ausbeute von 90,0 %.
VERGLEICHSBEISPIEL 6
Eine Umsetzung wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 11 beschrieben durchgeführt, ausser dass Calciumchlorid zugegeben wurde. Am Ende der Umsetzung wurde kein Niederschlag beobachtet. Nach Verdünnung wurde die Reaktionsmischung analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Bildung von 7,0 mM Thymidin in einer Ausbeute von 70 %.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT:
Erfindungsgemäss kann bei der Herstellung einer Nukleosidverbindung aus einem Pentose-1-phosphat und einer Nukleinsäurebase unter Verwendung von Nukleosidphosphorylase oder eines Mikroorganismus, der die Aktivität des Enzyms zeigt, ein Metallsalz, das mit Phosphorsäure ein wasserunlösliches Salz bilden kann, zum Eliminieren von Phosphorsäure als Nebenprodukt aus dem Reaktionssystem zugegeben werden. Diese Zugabe führt zu einer verbesserten Ausbeute, die gemäss dem Verfahrensstand der Technik nicht erzielt wurde. Hinsichtlich der industriellen Praxis führt diese Erfindung zu einer beträchtlichen Verminderung der Kosten und ist deshalb ziemlich signifikant.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Nukleosidverbindung, umfassend den Schritt des Umsetzens eines Pentose-1-phosphats mit einer Nukleinsäurebase oder einem Analogon der Nukleinsäurebase in Gegenwart von Nukleosidphosphorylaseaktivität in einem wässrigen Reaktionsmedium zur Bildung der Nukleosidverbindung, dadurch gekennzeichnet, dass ein Metallkation, das mit einem Phosphation ein wasserunlösliches Salz bilden kann, im wässrigen Reaktionsmedium als Metallsalz mit einem oder mehr als einem Anion, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chlorid-, Nitrid-, Carbonat-, Sulfat- und Acetationen, vorhanden ist.
Verfahren zur Herstellung einer Nukleosidverbindung gemäss Anspruch 1, worin das Pentose-1-phosphat Ribose-1-phosphat oder 2-Desoxyribose-1-phosphat ist.
Verfahren zur Herstellung einer Nukleosidverbindung gemäss Anspruch 1 oder 2, worin das Metallkation, das mit einem Phosphorsäureion ein wasserunlösliches Salz bilden kann, ein Ion oder mehr als ein Ion ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Calcium-, Barium- und Aluminiumionen.
Verfahren zur Herstellung einer Nukleosidverbindung gemäss Anspruch 3, worin das Metallkation, das mit einem Phosphorsäureion ein wasserunlösliches Salz bilden kann, als ein Pentose-1-Phosphatsalz im wässrigen Reaktionsmedium vorhanden ist.