CN1238519C

CN1238519C - 核苷化合物的生产方法

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Publication number: CN1238519C
Application number: CNB018194834A
Authority: CN
Inventors: 安乐城正; 池田一郎; 高桥克幸; 伊藤洁; 浅野保; 肉丸诚也; 中村武史; 石桥大树; 长原清辉; 福入靖
Original assignee: Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc; Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2000-11-06
Filing date: 2001-11-06
Publication date: 2006-01-25
Anticipated expiration: 2021-11-06
Also published as: EP1338654B1; EP1338654A4; EP1925675A1; DE60136209D1; US20040219646A1; DE60141258D1; KR20030059225A; CN1476484A; KR100468979B1; EP1925675B1; EP1338654A1; WO2002036800A1

Abstract

在戊糖-1-磷酸与核酸碱基或核酸碱基类似物在金属阳离子存在的情况下，在含水反应介质中反应时，将这些组分中的至少一种加入到所述含水反应介质中的时间和方法是变化的；因此，即使当上述组分的用量使得反应混合物变得高度粘性化或者当使用上述组分但不使用上述添加时间和添加方法的变化而使反应混合物被固化的时候，也可以以高产率有效地生产核苷化合物，而不会引起反应混合物的高粘性或者固化作用。这样，可以提供一种用于生产核苷化合物的方法，其包括在核苷磷酸化酶活性存在的情况下，将戊糖-1-磷酸与核酸碱基或核酸碱基类似物进行反应这一步骤，该方法提高了核苷化合物的转化率，并且具有广泛的适用性。

Description

核苷化合物的生产方法

技术领域

本发明涉及使用核苷磷酸化酶来生产核苷化合物的方法。多种核苷及其类似化合物被用作抗病毒药物、抗肿瘤药物、反义药物等的原材料，或者被用作这些药物中的组分。

背景技术

核苷磷酸化酶是这样一种酶的通称，这些酶在磷酸存在时引起核苷的N-糖苷键的磷酸解作用，而且，在核糖核苷的情况下，催化由下面的反应式表示的反应：

核苷磷酸化酶主要分为嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶，它们广泛地存在于生物界，并且存在于哺乳动物类、鸟类、鱼类等的组织中，以及酵母和细菌中。上面的酶反应是可逆的，而且迄今为止，已经知道了利用逆反应的多种核苷化合物的合成。

例如，已知从2’-脱氧核糖1-磷酸和核酸碱基(胸腺嘧啶、腺嘌呤、或者鸟嘌呤)来生产胸苷(JP-A-01-104190)、2’-脱氧腺苷(JP-A-11-137290)或者2’-脱氧鸟苷(JP-A-11-137290)的方法。另外，在Agric.Biol.Chem.，Vol.50(1)，pp.121-126(1986)中报道了一种技术，其包括下面的步骤：通过在磷酸存在条件下的反应，使用衍生于产气肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶，将肌苷分解成核糖1-磷酸和次黄嘌呤，和由核糖1-磷酸生产作为抗病毒制剂的三氮唑核苷，所述的核糖1-磷酸是在衍生自产气肠杆菌的相同嘌呤核苷磷酸化酶存在的条件下，通过离子交换树脂和1，2，4-三唑-3-氨甲酰分离出来的。

但是，由于在酶存在的条件下，通过使用上述的逆反应从来自戊糖-1-磷酸或其盐和核酸碱基来生产核苷化合物的反应是平衡状态的反应，因此该反应的不足之处是转化率低。

发明内容

本发明所要达到的目的，是提供一种在核苷化合物工业生产中使反应以高转化率进行的简单方法，和一种有助于降低原材料成本和提高生产率的方法。

因此，本发明的目的是提供一种用于核苷化合物生产的、简单且广泛适用的方法，其包括下列步骤：在核苷磷酸化酶活性存在的情况下，将戊糖-1-磷酸与核酸碱基或者核酸碱基类似物反应，其中的核苷化合物被以高转化率产生。

为实现上述目的，本发明的发明者作了大量的研究工作。结果，本发明的发明者发现，当允许能够与磷酸根离子形成微溶于水的盐的金属阳离子存在于反应混合物中的情况下，作为反应副产品形成的磷酸根离子，被沉淀成微溶于水的盐并且从反应体系中去除，结果，反应平衡移向核苷化合物合成的方向，而且反应的转化率提高。

本发明的发明者还发现：当允许能够与磷酸根离子形成微溶于水的盐的金属阳离子以戊糖-1-磷酸的盐的形式存在于反应混合物中的情况下，可以获得与加入能够与磷酸根离子形成微溶于水的盐的金属阳离子或其盐时的相同效果。

本发明的发明者还发现：在核苷磷酸化酶存在的情况下，在通过戊糖-1-磷酸的磷酸基团和核酸碱基或核酸碱基类似物之间的交换反应来生产核苷化合物的方法中，当将通常具有低溶解度和低反应性的核酸碱基类似物以碱金属水溶液的形式引入到反应体系中的时候，反应过程中底物浓度可以变得很高，因此可以以高转化率获得核苷化合物。

同样还发现：关于核苷化合物的生产，当将含有包括锂离子或者镁离子的金属阳离子的金属阳离子盐的水溶液用作碱金属水溶液的时候，反应所形成的磷酸是不溶解的磷酸锂或者磷酸镁形式；因此，酶反应平衡指向核苷化合物合成；这样，以用传统工艺无法完成的高选择性和高产量得到了核苷化合物。

同样还发现：当将微溶于水的金属阳离子盐例如氢氧化镁或其类似物，具体用作能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子时，可以实现多种优点。例如，由于反应混合物的盐浓度没有增加，所以防止了由反应混合物中盐浓度的增加所引起的反应速度的降低。由于可以在反应之前，以一个部分(全部量)加入这种金属阳离子的碱，所以反应操作要比加入镁的水溶液更为简单。显著提高了所得到反应混合物的过滤效率。

本发明的发明者还发现：当将氢氧化镁用作金属阳离子的盐的时候，作为反应副产品形成的微溶于水的磷酸盐(磷酸镁)，其晶体的大小和形状相对地适合于反应混合物的过滤，这样使得在反应完成以后，可以快速过滤反应混合物。

为了在工业上生产核苷化合物，必须增加容积效率和纯化过程中的回收，因此，需要在反应混合物中以高浓度积累所生产的核苷。如上，当允许金属阳离子在反应混合物中出现以使其与磷酸根离子(其随反应进行而产生)反应，以将所产生的物质作为不溶于水的盐沉淀下来的时候，并且当增加各个组分的量以获得高核苷化合物浓度的时候，反应混合物的pH随着磷酸与金属阳离子反应的进行和产生的微溶于水的盐的沉淀而降低，太低的pH导致低的反应转化率。这种因反应混合物pH降低引起的低反应转化率，被认为是归因于诸如所形成的核苷化合物分解和酶活性部分丧失。

在这种情况下，优选对反应混合物的pH进行控制，以保持所需的反应转化率。但是，当增加初始(在反应开始)进料量以获得高浓度核苷化合物的时候，存在这样的情况：反应混合物的粘性随着反应的进行升高并且反应混合物引起均匀固化。这种反应混合物的粘性增加和固化作用使对上述所需pH的控制很难。另外，反应混合物的粘性增加需要用于混合和捏合反应混合物的额外动力，这就引起设备上的麻烦。

本发明的发明者发现，当使用在反应混合物中获得高浓度核苷化合物所必需的进料量的时候，可以通过在反应开始后的特定时间，加入部分或者全部进料量的至少一种选自下列物质的组分，来防止反应混合物的高粘性和固化作用：戊糖-1-磷酸、核酸碱基或者核酸碱基类似物、和金属阳离子。

基于上述发现而完成的本发明，包括下面的实施方案：

[1]一种核苷化合物生产方法，其包括在核苷磷酸化酶活性存在的情况下、在能够与磷酸根离子形成微溶于水的盐的金属阳离子存在的情况下，将戊糖-1-磷酸与核酸碱基或核酸碱基类似物在含水反应介质中反应，该方法的特征在于，反应开始后将选自戊糖-1-磷酸、核酸碱基或者核酸碱基类似物、和金属阳离子中的至少一种组分，在反应当中加入到含水反应介质中。

[2]根据上述[1]的核苷化合物生产方法，其中的戊糖-1-磷酸是核糖-1-磷酸或者2-脱氧核糖-1-磷酸。

[3]根据上述[1]或[2]的核苷化合物生产方法，其中能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子是至少一种选自钙离子、钡离子、铝离子、锂离子和镁离子的金属阳离子。

[4]根据上述[3]的核苷化合物生产方法，其中能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子，是与至少一种选自氯离子、硝酸根离子、碳酸根离子、硫酸根离子、乙酸根离子和氢氧根离子的阴离子，以金属盐的形式加入到含水反应介质中的。

[5]根据上述[3]的核苷化合物生产方法，其中能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子，是以戊糖-1-磷酸的盐的形式加入到含水反应介质中的。

[6]根据上述[1]的核苷化合物生产方法，其中从反应开始到反应结束至少一种组分向含水反应介质中的加入是以两个或多个部分或者连续地和逐渐地加入的。

[7]根据上述[1]或者[6]的核苷化合物生产方法，其特征在于，当将戊糖-1-磷酸、核酸碱基或者核酸碱基类似物和金属阳离子这三种组分以一个部分加入的时候，这三种组分的量引起反应混合物的粘性增加或者固化作用，但是通过从反应开始到反应完成以一部分或者几部分加入至少一种组分的部分或者全部的量，可以防止粘性增加或者固化作用。

[8]根据上述[1]-[7]中任何一项的核苷化合物生产方法，其特征在于核酸碱基或者核酸碱基类似物是以碱性水溶液的形式加入的。

[9]根据上述[8]的核苷化合物生产方法，其特征在于其中溶解有核酸碱基或者核酸碱基类似物的碱性水溶液，是含有氢氧化锂、碳酸锂和碳酸氢锂中至少一种物质的溶液。

[10]一种核苷化合物生产方法，其包括在核苷磷酸化酶活性和在能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子的盐存在的情况下，将戊糖-1-磷酸与核酸碱基或核酸碱基类似物在含水反应介质中反应，在没有pH调节的情况下生产核苷化合物，该方法的特征在于所述的金属阳离子的盐是微溶于水的盐。

[11]根据上述[10]的核苷化合物生产方法，其中金属阳离子的盐是至少一种选自氢氧化镁、氧化镁、碳酸镁和碱式碳酸镁的盐。

[12]根据上述[11]的核苷化合物生产方法，其特征在于所述的含水反应介质在反应过程中的pH范围是7.5-10.0。

[13]根据上述[11]的核苷化合物生产方法，其特征在于这样一个步骤：过滤通过所述反应获得的反应混合物，来去除出现在反应混合物中的不溶物质以获得含有核苷化合物的滤出液。

实施本发明的最佳实施方案

在本发明中，戊糖-1-磷酸是这样的一种化合物，其中磷酸结合到多羟基醛或者多羟基酮或其衍生物的1-位以形成酯键。作为其代表性实例，可以提及的有核糖1-磷酸，2’-脱氧核糖1-磷酸，2’，3’-二脱氧核糖1-磷酸和阿拉伯糖1-磷酸。但是，戊糖-1-磷酸并不限于此。

关于多羟基醛或者多羟基酮，作为天然产物可以提及的有：戊醛糖例如D-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，L-来苏糖，D-核糖等等；戊酮糖例如D-木酮糖，L-木酮糖，D-核酮糖等等；和脱氧糖例如D-2-脱氧核糖，D-2，3-二脱氧核糖等等。但是，多羟基醛或者多羟基酮并不限于此。

戊糖-1-磷酸可以通过例如在核苷磷酸化酶存在下的核苷化合物的磷酸解作用(J.Biol.Chem.Vol.184，437，1950)或者端基异构体选择性的化学合成而产生。

本发明中使用的核酸碱基是含有氮原子的杂环化合物，该化合物是化合物例如DNA、RNA、或者类似物的结构元素，并且是选自嘧啶、嘌呤和碱基类似物的天然或者非天然的核酸碱基。该碱基可以被卤素原子、烷基、卤烷基、烯基、卤烯基、炔基、氨基、烷氨基、羟基、羟氨基、氨氧基、烷氧基、巯基、烷巯基、芳基、芳氧基或者氰基所取代。

作为取代基的卤素原子例如氯、氟、碘和溴。1-7个碳原子的烷基作为烷基的实例例如甲基、乙基、丙基等等。1-7个碳原子的卤烷基作为卤烷基的实例例如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、溴甲基、溴乙基等等。2-7个碳原子的烯基作为烯基的实例例如乙烯基、丙烯基等等。2-7个碳原子的卤烯基作为卤烯基的实例例如溴乙烯基、氯乙烯基等等、2-7个碳原子的炔基作为炔基的实例例如乙炔基、丙炔基等等。含有1-7个碳原子烷基的烷氨基作为烷氨基的实例例如甲氨基、乙氨基等等。1-7个碳原子的烷氧基作为烷氧基的实例例如甲氧基、乙氧基等等。含有1-7个碳原子烷基的烷巯基作为烷巯基的实例例如甲巯基、乙巯基等等。苯基作为芳基的实例；含有1-5个碳原子的烷基的烷基苯基，例如甲基苯基、乙基苯基等等；含有1-5个碳原子的烷氧基的烷氧基苯基，例如甲氧基苯基、乙氧基苯基等等；含有1-5个碳原子的烷基氨基的烷基氨基苯基，例如二甲基氨基苯基、二乙基氨基苯基等等；卤素苯基例如氯苯基、溴苯基等等；等等。

具有嘧啶骨架的核酸碱基的具体实例，可以提及的有，胞嘧啶、尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)、5-乙基胞嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-氟甲基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-三氟胞嘧啶、5-三氟尿嘧啶、5-乙烯基胞嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、5-氯乙烯基尿嘧啶、5-乙炔基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、嘧啶-2-酮(pyrimidin-2-one)、4-羟基氨基-嘧啶-2-酮、4-氨氧基嘧啶-2-酮、4-甲氧基嘧啶-2-酮、4-乙酰氧基嘧啶-2-酮、4-氟嘧啶-2-酮和5-氟嘧啶-2-酮。

具有嘌呤骨架的核酸碱基的具体实例，可以提及的有嘌呤、6-氨基嘌呤(腺嘌呤)、6-羟基嘌呤、6-氟嘌呤、6-氯嘌呤、6-甲基氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、6-三氟甲基氨基嘌呤、6-苯甲酰氨基嘌呤、6-乙酰基氨基嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-氨氧基嘌呤、6-甲氧基嘌呤、6-乙酰氧基嘌呤、6-苯酰氧基嘌呤、6-甲基嘌呤、6-乙基嘌呤、6-三氟甲基嘌呤、6-苯基嘌呤、6-氰基嘌呤、6-甲基氰基嘌呤、6-氨基嘌呤-1-氧化物、6-羟基嘌呤-1-氧化物、2-氨基-6-羟基嘌呤(鸟嘌呤)、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基-6-碘嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氰基嘌呤、2-氨基-6-甲基氰基嘌呤、2-氨基-6-羟基氨基嘌呤、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氨基-6-苯酰氧基嘌呤、2-氨基-6-乙酰氧基嘌呤、2-氨基-6-甲基嘌呤、2-氨基-6-环丙基氨基甲基嘌呤、2-氨基-6-苯基嘌呤、2-氨基-8-溴嘌呤、6-氰基嘌呤、6-氨基-2-氯嘌呤(2-氯腺嘌呤)和6-氨基-2-氟嘌呤(2-氟腺嘌呤)。

作为碱基类似物的具体实例，可以提及的有，6-氨基-3-去氮杂嘌呤(deazapurine)、6-氨基-8-氮杂嘌呤、2-氨基-6-羟基-8-氮杂嘌呤、6-氨基-7-去氮杂嘌呤、6-氨基-1-去氮杂嘌呤和6-氨基-2-氮杂嘌呤。

在本发明中，核苷化合物是这样的化合物，其中的具有嘧啶骨架的核酸碱基、具有嘌呤骨架的核酸碱基、或者碱基类似物结合到上述多羟基醛或者多羟基酮或其衍生物的1-位以形成N-糖苷键。作为具体实例，可以提及的有胸苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧鸟苷、脱氧腺苷、二脱氧腺苷、三氟胸苷、三氮唑核苷、乳清酸核苷、尿嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基-腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯-次黄嘌呤阿拉伯糖苷、硫鸟嘌呤阿拉伯糖苷、2，6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、鸟嘌呤阿拉伯糖苷、胸腺嘧啶阿拉伯糖苷、依诺他滨(enocitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、叠氮基胸苷、碘苷、二脱氧腺苷、二脱氧肌苷、二脱氧胞苷、二脱氢脱氧胸苷、硫代二脱氧胞苷、山梨苷(sorbidine)、5-甲基-尿苷、吡唑、硫肌苷、喃氟啶(tegafur)、脱氧氟尿苷(doxyfluridine)、布雷青霉素、云翳菌素(nebularin)、别嘌呤醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2’-氨基尿苷、2’-氨基腺苷、2’-氨基鸟苷和2-氯-2’-氨基肌苷。

在本发明中，核苷磷酸化酶是这样一种酶的通称，这些酶在磷酸存在时引起核苷化合物的N-糖苷键的磷酸解作用。在本发明中，可以利用逆反应。在反应中使用的酶可以是任何种类和任何来源的酶，只要其具有能够从相应的戊糖-1-磷酸和核酸碱基或者核酸碱基类似物形成所需的核苷化合物。此酶主要分为嘌呤类型和嘧啶类型。作为已知的嘌呤类型的酶，可以提及的有，例如嘌呤核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.1)和尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.15)；关于已知的嘧啶类型的酶，可以提及的有，例如嘧啶核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.2)，尿嘧啶磷酸化酶(EC 2.4.2.3)，胸苷磷酸化酶(EC 2.4.2.4)和脱氧尿苷磷酸化酶(EC 2.4.2.23)。

在本发明中，对于具有核苷磷酸化酶活性的微生物没有特殊的限制，只要该微生物表达至少一种选自嘌呤核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.1)、鸟苷磷酸化酶(EC 2.4.2.15)、嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC 2.4.2.4)和脱氧尿苷磷酸化酶(EC 2.4.2.23)的核苷磷酸化酶。

作为这种微生物的优选具体实例，可以提及的微生物菌株包括诺卡氏菌属(Norcardia genus)、微杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、纤维杆菌属、Flabobacterium genus(夫拉伯细菌菌属)、Kluyvere genus(卡鲁伊维尔菌属)、分支杆菌属、嗜血杆菌属、Mycoplana genus(麦考普拉那菌属)、精蛋白杆菌属、念珠菌属、酵母属、芽孢杆菌属、嗜热杆菌属、微球菌属、哈夫尼菌属(Hafnia genus)、变性杆菌属、弧菌属、葡萄球菌属(Staphyrococcusgenus)、丙酸菌属、八叠球菌属、扁平球菌属(Planococcus genus)、埃希氏杆菌属、库特菌属、红球菌属、不动杆菌属、黄菌属(Xanthobactergenus)、链霉菌属、根瘤菌属、沙门氏菌属、克雷白菌属、肠杆菌属、欧文菌属、气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、无色菌属、土壤杆菌属、节杆菌属和假诺卡氏菌属(Pseudonocardia genus)。

基于新近分子生物学和遗传工程的进展，通过检查上述微生物菌株的核苷磷酸化酶的分子生物学性质、氨基酸序列等，使得从微生物菌株中提取该蛋白的基因、构建其中插入有该基因和该基因表达所必需的调控区的重组质粒、将质粒引入特定载体、以及生产其中表达有所述蛋白的重组体细胞，成为可能甚至相对容易。鉴于这种技术标准，甚至通过将核苷磷酸化酶基因引入到特定宿主而获得的重组体细胞也被包含在本发明使用的微生物中，在所述的微生物中表达磷酸化酶。

此处所定义的调控区包括：包含用于转录调控的操纵子序列的启动子序列、核糖体结合序列(SD序列)和用于转录形成的序列。启动子的具体实例包括来自色氨酸操纵子的trp启动子、来自乳糖操纵子的lac启动子、来自λ噬菌体的PL启动子和PR启动子、B.subtilis的葡萄糖酸合成酶(gnt)启动子、碱性蛋白酶启动子(aprs)、中性蛋白酶启动子(nprs)和α-淀粉酶启动子(amys)。也可以使用被个别设计和修饰的启动子例如tac启动子。关于核糖体结合序列，尽管可以提及来源于大肠杆菌或者枯草杆菌的序列，但是只要这些序列可以在大肠杆菌或者枯草杆菌宿主中具有其功能，对它们没有特殊的限制。可以合成并使用在互补于16S核糖体RNA的3’末端区域的序列中的、由4或更多个核苷酸组成的共有序列。转录终止序列并不总是必需的，但是可以使用那些独立于ρ因子的转录终止序列，例如脂蛋白终止子、trp操纵子终止子。关于这些调控序列的排列顺序，优选以此顺序排列：启动子、核糖体结合序列、编码所述核苷磷酸化酶的基因、和转录终止序列。

关于此处提及的具体质粒，pBR322、pUC18、Bluescript II SK(+)、pKK223-3、pSC101这几种中的每一种，都具有一个能够使其在大肠杆菌中自我复制的区域；pUB110、pTZ4、pC194、ρ-11、φ-1和φ-105这几种中的每一种，都具有一个能够使其在枯草杆菌中自我复制的区域。作为能够在两种不同宿主中自我复制的质粒的实例，可以将pHV14、YEp7和pBS7用作载体。

关于此处提及的具体宿主，如以后实施例中所使用的那样，可以将大肠杆菌引作一个代表性实例。但是宿主并不限于此，其包括其它微生物菌株例如杆菌属细胞(例如枯草杆菌)、酵母、放线菌类等等。

在本发明中，关于核苷磷酸化酶或者具有此酶活性的微生物，可以使用商品酶、具有酶活性的微生物细胞、通过细胞处理获得的产物、及其固定的产品。通过细胞处理获得的产物是例如丙酮干燥的细胞或者通过机械破坏、超声破坏、冻化、压力减压处理、渗透处理、自体溶解、细胞壁分解、表面活性剂处理或者类似方法制备的分解产物。如果必要，可以通过硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、或者柱层析法来纯化该产品。

在本发明中，能够与磷酸根离子形成微溶于水的盐的金属阳离子，可以是任何金属阳离子，只要其能够与磷酸根离子形成微溶于水的盐，磷酸根离子在反应中作为副产品生成。象这样的金属阳离子，可以提及的例如钠、钾、钙、镁、铝、钡、钴、镍、铜、银、钼、铅、锌、锂等等。其中，特别优选的金属盐是那些具有广泛工业适用性和高安全性、并且对反应没有反作用的金属盐。关于其实例，可以提及的有，镁、钙离子、钡离子和铝离子。只要不损害本发明的效果，可以将两种或者多种金属阳离子结合使用。

在本发明中，可以以金属与至少一种选自氯离子、硝酸根离子、碳酸根离子、硫酸根离子、乙酸根离子和氢氧根离子的阴离子的金属盐的形式，将能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子加入到反应混合物中。关于具体的实例，可以提及的有氯化钙、硝酸钙、碳酸钙、硫酸钙、乙酸钙、氯化钡、硝酸钡、碳酸钡、硫酸钡、乙酸钡、氯化铝、硝酸铝、碳酸铝、硫酸铝、乙酸铝、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钾、碳酸钾、氢氧化钾、碳酸氢锂、碳酸锂、氢氧化锂和氢氧化镁。

在本发明中，还可以使所述的金属阳离子以戊糖-1-磷酸的盐的形式存在于反应混合物中。关于具体的实例，可以提及的有核糖-1-磷酸的钙盐、2-脱氧核糖-1-磷酸的钙盐、2，3-二脱氧核糖-1-磷酸的钙盐、阿拉伯糖-1-磷酸的钙盐、核糖-1-磷酸的钡盐、2-二脱氧核糖-1-磷酸的钡盐、2，3-二脱氧核糖-1-磷酸的钡盐、阿拉伯糖-1-磷酸的钡盐、核糖-1-磷酸的铝盐、2-脱氧核糖-1-磷酸的铝盐、2，3-二脱氧核糖-1-磷酸的铝盐和阿拉伯糖-1-磷酸的铝盐。

当将能够与磷酸根离子形成微溶于水的盐的金属阳离子的盐，放入核酸碱基或者核酸碱基类似物的水溶液中的时候，加入到该水溶液中的金属阳离子的量是0.5-20摩尔、优选1-4摩尔每摩尔核酸碱基或者核酸碱基类似物。

当金属阳离子的盐被放入核酸碱基或者核酸碱基类似物的水溶液中和被加入到反应介质中的时候，可以将所述的水溶液以一个部分加入到反应介质中以引起反应，或者可以将其连续地加入到反应介质中以引起反应。在这里，“连续地加入”表示：核酸碱基或者核酸碱基类似物被溶于或者悬浮于金属阳离子盐的水溶液中，并且将其以两部分或更多部分或者连续地经1分钟-24小时、优选经30分钟-24小时加入到反应体系中。

顺便提及，当同一时间混合反应所需组分的时候，可能会出现反应混合物的固化等，这取决于所述组分的用量。在这种情况下，可以通过在反应开始以后，将至少一种选自(1)戊糖-1-磷酸、(2)核酸碱基或者核酸碱基类似物、和(3)金属阳离子的组分在反应中间加入到含水反应介质中，来可以防止所述固化的问题。在这里，“反应开始”表明一种状态，在此状态中，已经在核苷磷酸化酶活性存在的情况下，加入了至少部分添加量的戊糖-1-磷酸和核酸碱基或核酸碱基类似物。

反应开始后被加入的每种组分，可以如上所述在同一时间加入，或者以两部分或者更多部分分批加入、或者连续地加入、或者以分批加入和连续加入的组合形式加入。当反应开始后所加入的组分超过一种时，可以以部分形式加入至少一种选自上述三种组分的组分。即，当反应开始后所加入的组分超过一种的时候，可以为每种个体组分选择合适的添加方法。

当将金属阳离子盐的水溶液与核酸碱基或者核酸碱基类似物以混合的形式使用时，金属阳离子盐的水溶液的用量，要使得金属阳离子的量成为0.5-20摩尔、优选1-4摩尔每摩尔核酸碱基或者核酸碱基类似物。

当能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子的盐，本身微溶于水的时候，可以在反应开始之前将到反应结束时加入的全部量加入到含水反应介质中，而且可以不必控制反应混合物的pH；因此，将这样的盐用作本发明中使用的金属阳离子盐是合适的。关于这样的金属阳离子盐的代表性实例，可以提及的有各种金属阳离子的氢氧化物，特别是氢氧化镁。

本发明方法中使用的含水反应介质可以是任何这样的反应介质，该介质主要由水组成，而且，使用酶活性的反应靠该介质而继续进行而且金属阳离子的添加作用靠该介质而体现出来，所述的使用酶活性的反应是本发明的目的。象这样的含水反应介质，可以提及水或者通过将溶于水的有机溶剂加入水中而获得的含水反应介质。可以将低碳醇(例如：甲醇和乙醇)、丙酮、二甲基亚砜及其混合物作为所述有机溶剂的例子。对于所用溶剂的量，没有特别的限制，其数量可以是能够使反应顺利进行时的量。相对于水，所述有机溶剂的量可以优选0.1％-70％重量。为了保证反应的稳定性，可以将使用该含水反应介质的反应混合物用作缓冲液。对于这样的缓冲液，可以使用可被用于本发明酶反应的已知缓冲液。

在本发明核苷化合物的合成反应中，可以对反应条件例如合适的pH、温度等进行选择，这取决于下列物质的种类和特性：作为底物的戊糖-1-磷酸和核酸碱基、作为反应催化剂的核苷磷酸化酶或者具有该酶活性的微生物、和用于将磷酸从反应体系中去除的金属盐。通常，pH的可选范围为5-11、优选7.5-10.0、更优选8.0-10；温度的可选范围是从冰点到80℃，优选10-60℃。当pH处于控制范围以外的时候，可能会由于下列原因引起转化率的降低：目的产物或者底物的稳定性、酶活性的降低、没有与磷酸形成微溶于水的盐等等。当在反应中出现pH变化的时候，如果需要，可以加入酸例如盐酸、硫酸或者类似物，或者加入碱例如氢氧化钠、氢氧化钾或者类似物。不必说，当使用微溶于水的金属阳离子盐，特别是金属阳离子氢氧化物的时候，对反应混合物的pH调控可能是不必要的。

适当地，反应中所用的戊糖-1-磷酸和核酸碱基的浓度是大约0.1-1,000mM。两者的摩尔比是这样的：核酸碱基的量是0.1-10摩尔每摩尔戊糖-1-磷酸或其盐。考虑到反应的转化率，该量优选为0.95摩尔或者更低。

反应时间取决于原材料、含水溶剂的种类和反应温度而不同，为1分钟-78小时，优选30分钟-24小时。

能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属盐，以下面的量加入：0.1-10摩尔、优选0.5-5摩尔每摩尔反应中使用的戊糖-1-磷酸。虽然，在高浓度下的反应中，作为底物的核酸碱基和作为产物的核苷化合物可以在没有被完全溶解的情况下出现在反应混合物中，但是本发明即使在这种情况下也适用。

在本发明中，为了将至少一种选自戊糖-1-磷酸或其盐、能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子或其盐、和核酸碱基的组分加入反应介质而使反应混合物不出现固化作用，可以提及下面的方法作为代表性的方法。顺便提及，本发明并不限于下面的方法，只要反应混合物不出现固化作用，对下面物质的加入时间以及次数没有特别的限制，所述物质是至少一种选自戊糖-1-磷酸或其盐、能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子或其盐、和核酸碱基的组分。

1、一种包括下列步骤的方法：将戊糖-1-磷酸或其盐和核酸碱基或其类似物以一个部分进料，以启动反应，将核苷化合物积累到适当的浓度，和随后以一个部分加入能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子或其盐。在这种情况下，所积累的核苷化合物的适当的浓度是优选10mM或者更高，更优选30mM或者更高。

2、一种包括下列步骤的方法：将戊糖-1-磷酸或其盐和核酸碱基或其类似物以一个部分进料，以启动反应，随后逐步地或者连续地加入能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子或其盐，以使其与所积累的核苷化合物的浓度相匹配。在这种情况下，当核苷化合物的量累积到优选10mM或者更高、更优选30mM或者更高的时候，开始加入所述的金属阳离子。

3、一种包括下列步骤的方法：将戊糖-1-磷酸或其盐和能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子或其盐以一个部分加入，随后逐步地或者连续地加入核酸碱基或者其类似物，以使得反应混合物不出现固化作用。在这种情况下，最初加入的核酸碱基或其类似物的量优选是30mM或者更低，更优选10mM或者更低。

4、一种包括下列步骤的方法：将核酸碱基或其类似物和能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子或其盐以一个部分加入，随后逐步地或者连续地加入戊糖-1-磷酸或其盐，以使得反应混合物不出现固化作用。在这种情况下，最初加入的戊糖-1-磷酸或其盐的量优选是30mM或者更低，更优选10mM或者更低。

5、一种包括下列步骤的方法：将戊糖-1-磷酸或其盐、能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子或其盐、和核酸碱基或其类似物逐步地或者连续地加入到酶溶液中。在这种情况下，反应开始时的戊糖-1-磷酸或其盐或者核酸碱基或其类似物的量，优选是30mM或者更低，更优选10mM或者更低。

可以使用常规方法例如浓缩、结晶、溶解、电渗析、通过离子交换树脂或活性炭的吸附和解吸作用等等，来分离如此从反应混合物中生产出来的核苷化合物。

实施例

通过实施例和比较实施例将本发明描述如下。但是，本发明决不被这些

实施例等所限制。

(分析法)

用高效液相色谱法来定量确定所有的核苷化合物。分析条件如下。

柱： YMC-Pack ODS-A312 150×6.0mm(I.D.)(YMC Co.，

Ltd.)

柱温度： 40℃

泵流率： 0.75ml/min

检测： UV260nm

洗出液： 10mM磷酸/乙腈＝95/5(V/V)

实施例1

将1ml由下列物质组成的反应混合物在30℃下反应24小时：2.5mM2’-脱氧核糖1-磷酸的二(单环己基铵)盐(SIGMA产品)、2.5mM腺嘌呤(WakoPure化学工业有限公司的产品，特级化学制品)、12单位/ml的嘌呤核苷磷酸化酶(Funakoshi产品)、10mM的氯化钙(Wako Pure化学工业有限公司的产品，特级化学制品)和10mM的Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)。在反应完成后，出现白色沉淀。对该反应混合物进行稀释和分析，其显示生成了2.40mM的脱氧腺苷。反应产率是96.0％。

比较实施例1

除了不加入氯化钙，以于实施例1相同的方式和条件进行反应。在反应结束以后，没有沉淀形成。对反应混合物进行稀释和分析，其显示生成了2.01mM的脱氧腺苷。反应产率是84.0％。

实施例2

除了将氯化钙的浓度变成2.5mM，以于实施例1相同的方式和条件进行反应。在反应结束以后，出现白色沉淀。对反应混合物进行稀释和分析，其显示生成了2.27mM的脱氧腺苷。反应产率是90.8％。

实施例3

除了用氯化铝代替氯化钙加入，以于实施例1相同的方式和条件进行反应。在反应结束以后，出现白色沉淀。对反应混合物进行稀释和分析，其显示生成了2.31mM的脱氧腺苷。反应产率是93.3％。

实施例4

除了用氯化钡代替氯化钙加入，以于实施例1相同的方式和条件进行反应。在反应结束以后，出现白色沉淀。对反应混合物进行稀释和分析，其显示生成了2.31mM的脱氧腺苷。反应产率是92.4％。

实施例5

除了将氯化钡的浓度变成2.5mM，以于实施例4相同的方式和条件进行反应。在反应结束以后，出现白色沉淀。对反应混合物进行稀释和分析，其显示生成了2.27mM的脱氧腺苷。反应产率是90.2％。

实施例6

依照描述于Journal ofBiological Chemistry，Vol.184，449-459页，1950中的方法来生产2-脱氧核糖1-磷酸的钡盐。将由下列物质组成的反应混合物(1ml)在30℃下反应24小时：2.5mM 2-脱氧核糖1-磷酸的钡盐、2.5mM腺嘌呤(Wako Pure化学工业有限公司的产品，特级化学制品)、12单位/ml的嘌呤核苷磷酸化酶(Funakoshi产品)、10mM的氯化钙(Wako Pure化学工业有限公司的产品，特级化学制品)和10mM的Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)。在反应完成后，出现白色沉淀。对该反应混合物进行稀释和分析，其显示生成了2.40mM的脱氧腺苷。反应产率是91.1％。

实施例7

将由下列物质组成的反应混合物(1ml)在30℃下反应24小时：2.5mM 2’-脱氧核糖-1-磷酸的二(单环己基铵)盐(SIGMA产品)、2.5mM胸腺嘧啶(Wako Pure化学工业有限公司的产品，特级化学制品)、12单位/ml的胸苷磷酸化酶(SIGMA产品)、10mM的硝酸钙(Wako Pure化学工业有限公司的产品，特级化学制品)和10mM的Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)。在反应完成后，出现白色沉淀。对该反应混合物进行稀释和分析，其显示生成了2.28mM的脱氧腺苷。反应产率是91.2％。

比较实施例2

除了不加入硝酸钙，以于实施例7相同的方式和条件进行反应。在反应结束以后，没有沉淀形成。对反应混合物进行稀释和分析，其显示生成了1.88mM的胸苷。反应产率是75.2％。

实施例8

将由下列物质组成的反应混合物(1ml)在30℃下反应24小时：2.5mM核糖-1-磷酸的环己基铵盐(SIGMA产品)、2.5mM的2，6-二氨基嘌呤(Aldrich产品)、12单位/ml的嘌呤核苷磷酸化酶(Funakoshi产品)、10mM的氯化钙(Wako Pure化学工业有限公司的产品，特级化学制品)和10mM的Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)。在反应完成后，出现白色沉淀。对该反应混合物进行稀释和分析，其显示生成了1.94mM的2，6-二氨基嘌呤核苷。反应产率是77.6％。

比较实施例3

除了不加入氯化钙，以于实施例8相同的方式和条件进行反应。在反应结束以后，没有沉淀形成。对反应混合物进行稀释和分析，其显示生成了1.54mM的2，6-二氨基嘌呤核苷。反应产率是61.6％。

实施例9

如下产生大肠杆菌的染色体DNA。将大肠杆菌K-12/XL-10菌株(Stratagene Co.)接种在50ml的LB培养基中在37℃培养过夜。收集所得到的细胞，并且使用用于溶菌的、含有1mg/ml溶菌酶的溶液来对所收集的细胞进行溶菌作用。将所得到的溶液进行酚处理，并随后通过常规方法进行乙醇处理以沉淀DNA。通过将DNA沉淀缠绕在玻璃棒上来将其回收、清洗并用于PCR。

将两种具有下面序列No.1和2所示的碱基序列的寡核苷酸作为PCR的引物，对它们的设计基于已知的大肠杆菌deoD基因的碱基序列[基因库序列No.AE000508(编码区：碱基Nos.11531-12250)](委托北海道系统科学K.K.合成所述的寡核苷酸)

序列No.1：gtgaattcac aaaaaggata aaacaatggc

序列No.2：tcgaagcttg cgaaacacaa ttactcttt

这些引物分别在5’末端和3’末端附近具有EcoR I和Hind III限制性内切酶识别序列。

使用限制性内切酶Hind III将如上得到的大肠杆菌染色体DNA完全消化。对含有6ng/μl被消化的DNA和3μm每种上述引物的0.1ml PCR混合物进行30个反应循环(每个循环组成如下，变性：96℃下1分钟，退火：55℃下1分钟，延伸反应：74℃下1分钟)。

用EcoR I和Hind III消化反应产物和质粒pUC18(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，并使用Ligation High(TOYOBO CO..，LTD.)进行连接以获得重组体质粒，并且，使用该重组体质粒来转化大肠杆菌DH5α。在LB琼脂培养基上培养转化的菌株以得到形成白色集落的Am-抗性转化菌株，其中所述的LB琼脂培养基含有50μg/ml的氨苄青霉素(Am)和X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。

将插入有目的DNA片段的质粒从如此获得的转化菌株中提取出来，并将其命名为pUC-PNP73。如此获得的转化菌株被命名为大肠杆菌MT-10905。

在37℃，将大肠杆菌MT-10905在含有50μg/ml Am的LB培养基上振摇培养过夜。将所得到的培养混合物在13,000rpm离心10分钟以收集细胞。将细胞悬浮在10ml的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中并用超声波破坏。将所得到的产物用作酶源。

将由下列物质组成的反应混合物(1.0ml)在50℃下反应20小时：100mM2’-脱氧核糖1-磷酸的二(单环己基铵)盐(SIGMA产品)、1O-80mM腺嘌呤(Wako Pure化学工业有限公司的产品，特级化学制品)、100mM的Tris-盐酸缓冲液(pH8.O)和20单位/ml的如上获得的嘌呤核苷磷酸化酶。反应开始8小时后，加入氯化钙使其量成为150mM。将结果列于表1中。

表1(实施例9)

腺嘌呤浓度(mM)	反应混合物的状态	脱氧腺苷的浓度(mM)
腺嘌呤浓度(mM)	反应混合物的状态	脱氧腺苷的浓度(mM)	10	液体	10
20	液体	18	10	液体	10
20	液体	18	40	液体	38
60	液体	56	40	液体	38
60	液体	56	80	液体	79

比较实施例4

将氯化钙与酶源同时加入，以于实施例9相同的方式进行反应。将结果列于表2中。

表2(比较实施例4)

腺嘌呤浓度(mM)	反应混合物的状态	脱氧腺苷的浓度(mM)
腺嘌呤浓度(mM)	反应混合物的状态	脱氧腺苷的浓度(mM)	10	液体	10
20	固化	19	10	液体	10
20	固化	19	40	固化	39
60	固化	58	40	固化	39
60	固化	58	80	固化	78

比较实施例5

除了不加入缓冲溶液，对腺嘌呤(80mM)进行与实施例9相同的反应。将结果列于表3中。

表3(比较实施例5)

腺嘌呤浓度(mM)	反应混合物的状态	脱氧腺苷的浓度(mM)
腺嘌呤浓度(mM)	反应混合物的状态	脱氧腺苷的浓度(mM)	80	固化	29

实施例10

将由下列物质组成的反应混合物(1.0ml)在50℃下反应20小时：100mM2’-脱氧核糖1-磷酸的二(单环己基铵)盐(SIGMA产品)、10-80mM胸腺嘧啶(Wako Pure化学工业有限公司的产品，特级化学制品)、100mM的Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)和20单位/ml的胸苷磷酸化酶。反应开始8小时后，加入氯化钙使其量成为150mM。将结果列于表4中。

表4(实施例10)

胸腺嘧啶浓度(mM)	反应混合物的状态	胸苷的浓度(mM)
胸腺嘧啶浓度(mM)	反应混合物的状态	胸苷的浓度(mM)	10	液体	9
20	液体	19	10	液体	9
20	液体	19	40	液体	38
60	液体	59	40	液体	38
60	液体	59	80	液体	78

比较实施例6

将氯化钙与酶源同时加入，以于实施例10相同的方式进行反应。将结果列于表5中。

表5(比较实施例6)

胸腺嘧啶浓度(mM)	反应混合物的状态	胸苷的浓度(mM)
胸腺嘧啶浓度(mM)	反应混合物的状态	胸苷的浓度(mM)	10	液体	10
20	固化	19	10	液体	10
20	固化	19	40	固化	38
60	固化	58	40	固化	38
60	固化	58	80	固化	79

比较实施例7

除了不加入缓冲溶液，对80mM的腺嘌呤进行与实施例9相同的反应。将结果列于表6中。

表6(比较实施例7)

胸腺嘧啶浓度(mM)	反应混合物的状态	胸苷的浓度(mM)
胸腺嘧啶浓度(mM)	反应混合物的状态	胸苷的浓度(mM)	80	固化	29

实施例11

将由下列物质组成的反应混合物(0.5ml)保持在50℃：200mM胸腺嘧啶(Wako Pure化学工业有限公司的产品，特级化学制品)、200mM的Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)和20单位/ml的胸苷磷酸化酶(SIGMA产品)。在加入酶溶液以后的每个小时，以5个部分(每部分0.1ml，总计0.5ml)加入含有200mM 2’-脱氧核糖1-磷酸的二(单环己基铵)盐(SIGMA产品)的溶液。结果，反应混合物保持为液态。

比较实施例8

除了在不存在Tris-盐酸缓冲液的情况下，将0.5ml含有200mM 2’-脱氧核糖1-磷酸的二(单环己基铵)盐(SIGMA产品)的溶液与酶源同时加入，以于实施例11相同的方式进行反应。结果，反应混合物被固化。

实施例12

将由下列物质组成的反应混合物(0.5ml)保持在50℃：200mM 2’-脱氧核糖1-磷酸的二(单环己基铵)盐(SIGMA产品)、200mM的Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)、20单位/ml的胸苷磷酸化酶(SIGMA产品)和150mM氯化钙。以5个部分(每部分0.1ml，总计0.5ml)在每个小时加入含有200mM胸腺嘧啶(Wako Pure化学工业有限公司的产品，特级化学制品)的溶液。结果，反应混合物保持为液态。

比较实施例9

除了在不存在Tris-盐酸缓冲液的情况下，将0.5ml200mM的胸腺嘧啶溶液与酶源同时加入，以与实施例12相同的方式进行反应。结果，反应混合物被固化。

通过高效液相色谱法，在下面的分析条件下，定量分析在下面实施例中生产的所有核苷化合物。

柱： YMC-Pack ODS-A514 300×6.0mm(I.D.)(YMC Co.，

Ltd.)

柱温度： 40℃

泵流率： 1ml/min

检测： UV 254nm

洗出液：为将pH调节到3.5，将磷酸加入到含有20mM乙酸铵的

水溶液中(2,700ml)；加入甲醇(300ml)；进行混

合和脱气。

内标物：烟酸

参考实施例1

2-脱氧核糖1-磷酸的二(铵)盐的合成

将2-脱氧核糖1-磷酸的二(单环己基铵)盐(1 g，2.42mmol，SIGMA产品)悬浮在甲醇(10g)中。在50℃向里面吹入氨气(0.62g，36.5mmol)并搅拌2小时。将所得到的反应物质在30℃过滤，随后用甲醇(5g)清洗两次并将其干燥，以获得目的物2’-脱氧核糖1-磷酸(0.57g)，产率为95％。

¹H-NMR(D₂O，270MHz)d5.56(s，1H)，4.03(m，2H)，3.52(dd，J＝3.3，12.2 Hz，1H)，3.41(dd，J＝5.3，12.2Hz，1H)，2.17(m，1H)，1.87(d，J＝13.9 Hz，1H)，MS(APCI)m/z213(M-H)

实施例13

2’-脱氧鸟苷的合成(1)

将2-脱氧核糖1-磷酸的二(单环己基铵)盐(3.32g，7.72mmol，SIGMA产品)溶解在水(47.1g)中。向其中加入在实施例9中获得的酶溶液(0.1ml)。在50℃，在1小时内将下面的溶液逐滴加入到所得到的反应混合物中：通过将鸟嘌呤(1g，6.62mmol)溶解在4.02wt.％氢氧化钠水溶液(16.45g，16.5mmol)中而得到的溶液。将所得到的反应物在相同的温度下反应2小时。随后，用HPLC分析反应物。结果，得到了目的物2’-脱氧鸟苷，反应产率为80％。

实施例14

2’-脱氧鸟苷的合成(2)

将在参考实施例1中所获得的2-脱氧核糖1-磷酸的二(铵)盐(2.07g，7.72mmol)溶解在水(47.1g)中。向其中加入在实施例9中获得的酶溶液(0.1ml)。在50℃，在1小时内将下面的溶液逐滴加入到所得到的反应混合物中：通过将鸟嘌呤(1g，6.62mmol)溶解在4.02wt.％氢氧化钠水溶液(16.45g，16.5mmol)中而得到的溶液。将所得到的反应物在相同的温度下反应2小时。随后，用HPLC分析反应物。结果，得到了目的物2’-脱氧鸟苷，反应产率为81％。

实施例15

2’-脱氧鸟苷的合成(3)

将在参考实施例1中所获得的2-脱氧核糖1-磷酸的二(铵)盐(2.07g，7.72mmol)溶解在水(47.1g)中。向其中加入在实施例9中获得的酶溶液(0.1ml)。在50℃，在1小时内将下面的溶液逐滴加入到所得到的反应混合物中：通过将鸟嘌呤(1g，6.62mmol)溶解在5.6wt.％氢氧化钾水溶液(16.45g，16.5mmol)中而得到的溶液。将所得到的反应物在相同的温度下反应2小时。随后，用HPLC分析反应物。结果，得到了目的物2’-脱氧鸟苷，反应产率为79％。

实施例16

2’-脱氧鸟苷的合成(4)

将在参考实施例1中所获得的2-脱氧核糖1-磷酸的二(铵)盐(2.07g，7.72mmol)溶解在水(47.1g)中。向其中加入在实施例9中获得的酶溶液(0.1ml)。在50℃，在1小时内将下面的溶液逐滴加入到所得到的反应混合物中：通过将鸟嘌呤(1g，6.62mmol)溶解在2.4wt.％氢氧化锂水溶液(16.45g，16.5mmol)中而得到的溶液。将所得到的反应物在相同的温度下反应2小时。随后，用HPLC分析反应物。结果，得到了目的物2’-脱氧鸟苷，反应产率为96％。

实施例17

2’-脱氧腺苷的合成

将在参考实施例1中所获得的2-脱氧核糖1-磷酸的二(铵)盐(2.0g，7.72mmol)溶解在水(30g)中。向其中加入在实施例9中获得的酶溶液(0.05ml)。在50℃，在1小时内将下面的溶液逐滴加入到所得到的反应混合物中：通过将腺嘌呤(0.89g，6.62mmol)溶解在2.4wt.％氢氧化锂水溶液(16.45g，16.5mmol)中而得到的溶液。将所得到的反应物在相同的温度下反应2小时。随后，用HPLC分析反应物。结果，得到了目的物2’-脱氧腺苷，反应产率为98％。

实施例18

2’-脱氧腺苷的合成

向纯水(13g)中加入2-脱氧核糖1-磷酸的二(铵)盐(1.67g，6.7mmol)、腺嘌呤(0.87g，6.4mmol)和氢氧化镁(0.59g，10.1mmol)。向所得到的反应物中加入0.05ml的酶溶液，伴随着搅拌，反应在45℃下进行3小时。反应产率是98％。将所得到的反应物加热到70℃以溶解形成的2’-脱氧腺苷；随后使用5A的滤纸，通过过滤来去除由反应形成的不能溶解的磷酸镁，而后用水(5g)冲洗；从反应物中得到了清澈的滤液(18.2g)，产率是99％。过滤速度是1,000kg/m³/hr并且损失到滤渣中的2’-脱氧腺苷的比率是1％。将如上获得的滤液在5℃晶化2小时。过滤所得到的结晶、用水(5g)清洗、并真空下干燥以获得目的物2’脱氧腺苷(1.6g)，其产率为93％。

比较实施例10

2’-脱氧腺苷的合成

将2-脱氧核糖1-磷酸的二(铵)盐(1.67g，6.7mmol)、腺嘌呤(0.87g，6.4mmol)和0.05ml的酶溶液悬浮在纯水(13g)中。在45℃，在2小时内，同时逐滴加入一水氯化钙(1.48g)的水溶液(3.7g)和4％的氢氧化钠水溶液(20.1g)。在逐滴加入结束以后，反应物在相同的温度下反应3小时，反应产率是97％。将所得到的反应物加热到70℃以溶解形成的2’-脱氧腺苷；随后使用5A的滤纸，通过过滤来去除由反应形成的不能溶解的磷酸钙，而后用水(5g)冲洗；从反应物中得到了清澈的滤液(28.2g)，产率是85％。过滤速度是50kg/m³/hr并且损失到滤渣中的2’-脱氧腺苷的比率是15％。将如上获得的滤液在5℃晶化2小时。过滤所得到的结晶、用水(5g)清洗、并真空下干燥以获得目的物2’脱氧腺苷(1.3g)，其产率为75％。

实施例19

2’-脱氧腺苷的合成

向纯水(13g)中加入2-脱氧核糖1-磷酸的二(铵)盐(1.67g，6.7mmol)、腺嘌呤(0.87g，6.4mmol)和氢氧化镁(0.59g，10.1mmol)。向所得到的反应物中加入在实施例9中获得的酶溶液(0.05ml)，伴随着搅拌，使反应在45℃下进行3小时。3小时后，用HPLC对反应物进行分析，其显示形成了目的物2’-脱氧腺苷，反应产率是98％。反应过程中的pH是8-10。

实施例20

2’-脱氧鸟苷的合成

向纯水(15g)中加入2-脱氧核糖1-磷酸的二(铵)盐(1.67g，6.7mmol)、鸟嘌呤(0.92g，6.1mmol)和氢氧化镁(0.59g，10.1mmol)。向所得到的反应物中加入在实施例9中获得的酶溶液(0.2ml)，伴随着搅拌，使反应在50℃下进行6小时。6小时后，用HPLC对反应物进行分析，其显示形成了目的物2’-脱氧鸟苷，反应产率是98％。反应过程中的pH是8-10。

实施例21

2’-脱氧腺苷的合成

向纯水(13g)中加入2-脱氧核糖1-磷酸的二(铵)盐(1.67g，6.7mmol)、腺嘌呤(0.87g，6.4mmol)和氢氧化镁(0.59g，10.1mmol)。向所得到的反应物中加入在实施例9中获得的酶溶液(0.05ml)，伴随着搅拌，使反应在45℃下进行3小时，同时使用乙酸将pH控制在8.5。3小时后，用HPLC对反应物进行分析，其显示形成了目的物2’-脱氧腺苷，反应产率是98％。

比较实施例11

2’-脱氧腺苷的合成

向纯水(13g)中加入2-脱氧核糖1-磷酸的二(铵)盐(1.67g，6.7mmol)、腺嘌呤(0.87g，6.4mmol)和六水氯化镁(2.05g，10.1mmol)。向所得到的反应物中加入在实施例9中获得的酶溶液(0.05ml)，伴随着搅拌，使反应在45℃下进行3小时。3小时后，用HPLC对反应物进行分析，其显示形成了目的物2’-脱氧腺苷，反应产率是65％。反应过程中的pH是6-7.5。

比较实施例12

2’-脱氧鸟苷的合成

向纯水(15g)中加入2-脱氧核糖1-磷酸的二(铵)盐(1.67g，6.7mmol)、鸟嘌呤(0.92g，6.1mmol)和六水氯化镁(2.05g，10.1mmol)。向所得到的反应物中加入在实施例9中获得的酶溶液(0.2ml)，伴随着搅拌，使反应在50℃下进行3小时。3小时后，用HPLC对反应物进行分析，其显示形成了目的物2’-脱氧鸟苷，反应产率是65％。反应过程中的pH是6-7.5。

比较实施例13

2’-脱氧腺苷的合成

以于实施例21相同的方式进行反应，同时在反应过程中用乙酸、氨水或者NaOH来控制pH。在下面的表7中显示了产率。从结果中可以看出，在低于7.5的pH和高于10.5的pH，都会发生产量减少。

表7通过pH变化的产率改变

反应中的pH	7.2	8.0	9.0	9.5	10.6
反应中的pH	7.2	8.0	9.0	9.5	10.6	反应产率	83	99	99	99	22

比较实施例14

2’-脱氧腺苷的合成

以于实施例19或者比较实施例11相同的方式进行反应，在反应过程中用氨水将pH控制在9.0，其中改变所加入的纯水的量。在下面的表8中显示了通过改变纯水添加量的反应产率变化。从该表中可以看出：当使用氯化物盐的时候，除非将其以低浓度使用，否则由于所形成的氯化铵的影响，反应产率没有增加。

表8

镁盐	氯化镁			氢氧化镁
镁盐	氯化镁			氢氧化镁			纯水的加入量	30g	20g	13g	30g	20g	13g
反应产率	98	90	80	99	99	98	纯水的加入量	30g	20g	13g	30g	20g	13g

工业适用性

在本发明中，在使用核苷磷酸化酶或者含有该酶活性的微生物从戊糖-1-磷酸和核酸碱基来生产核苷化合物的过程中，加入一种能与磷酸形成微溶于水的盐的金属盐；这样，作为副产物而产生的磷酸就被移出反应系统并且可以获得通过使用现有技术无法获得的高反应产率。另外，以高产率有效地生产核苷化合物而同时又不引起反应混合物的高粘性或者固化作用是可能的。有了这些优点，本发明在工业应用中大大降低了生产成本，并具有很大的意义。

当将核酸碱基或者核酸碱基类似物通过溶于碱性水溶液(如氢氧化锂或者类似水溶液)而进行使用的时候，反应程序是简单的。

作为能够与磷酸根离子形成微溶于水的盐的金属阳离子的盐，当使用氢氧化镁的时候，有许多例如下述的优点，这是因为氢氧化镁在水中具有低的溶解度。

(1)、在反应过程中，反应混合物的pH基本没有变化；因此，防止了酶的失活作用(使用除了氢氧化镁以外的可溶于水的金属阳离子盐，会导致在反应过程中反应混合物的pH向碱性一侧稍许移动)。

(2)、反应混合物的盐浓度没有与反应相关的增加；因此，防止了由盐浓度增加引起的反应障碍，另外，高浓度的反应是可能的。

(3)、在反应前，可以以一个部分将金属阳离子加入。另外，将镁离子作为金属阳离子使用，显著提高了反应完成后在反应混合物过滤步骤中的过滤速度，这在工业应用中十分有用。

序列表

<110>三井化学株式会社

<120>核苷化合物的生产方法

<130>MTC01P254

<160>2

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作E.coli K-12的嘌呤核苷磷酸化酶克隆的PCR引物的寡核苷酸

<400>1

gtgaattcac aaaaaggata aaacaatggc 30

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作克隆E.coli K-12的嘌呤核苷磷酸化酶的PCR引物的寡核苷酸

<400>2

tcgaagcttg cgaaacacaa ttactcttt 29

Claims

1、一种核苷化合物生产方法，其包括在核苷磷酸化酶活性存在的情况下、在能够与磷酸根离子形成微溶于水的盐的金属阳离子存在的情况下，将戊糖-1-磷酸与核酸碱基或核酸碱基类似物在含水反应介质中反应，该方法的特征在于，所述反应开始以后，将选自戊糖-1-磷酸、核酸碱基或者核酸碱基类似物、和金属阳离子中的至少一种组分，在反应中间加入到含水反应介质中，

其中，所述的核酸碱基类似物选自：6-氨基-3-去氮杂嘌呤、6-氨基-8-氮杂嘌呤、2-氨基-6-羟基-8-氮杂嘌呤、6-氨基-7-去氮杂嘌呤、6-氨基-1-去氮杂嘌呤和6-氨基-2-氮杂嘌呤，

能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子是至少一种选自钙离子、钡离子、铝离子、锂离子和镁离子的金属阳离子，且

反应开始表明一种状态，在此状态中，已经在核苷磷酸化酶活性存在的情况下，加入了至少部分添加量的戊糖-1-磷酸和核酸碱基或核酸碱基类似物。

2、根据权利要求1的核苷化合物生产方法，其中的戊糖-1-磷酸是核糖-1-磷酸或者2-脱氧核糖-1-磷酸。

3、根据权利要求1的核苷化合物生产方法，其中能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子，是与至少一种选自氯离子、硝酸根离子、碳酸根离子、硫酸根离子、乙酸根离子和氢氧根离子的阴离子，以金属盐的形式加入到含水反应介质中的。

4、根据权利要求1的核苷化合物生产方法，其中能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子，是以戊糖-1-磷酸的盐的形式加入到含水反应介质中的。

5、根据权利要求1的核苷化合物生产方法，其中从反应开始到反应结束的将至少一种组分加入到含水反应介质中，是以两个或多个部分或者连续地和逐渐地加入的。

6、根据权利要求1的核苷化合物生产方法，其特征在于，当将戊糖-1-磷酸、核酸碱基或者核酸碱基类似物和金属阳离子这三种组分以一个部分加入的时候，这三种组分的量引起反应混合物的粘性增加或者固化作用，但是通过从反应开始到反应完成以一部分或者几部分加入至少一种组分的部分或者全部的量，可以防止粘性增加或者固化作用。

7、根据权利要求5的核苷化合物生产方法，其特征在于，当将戊糖-1-磷酸、核酸碱基或者核酸碱基类似物和金属阳离子这三种组分以一个部分加入的时候，这三种组分的量引起反应混合物的粘性增加或者固化作用，但是通过从反应开始到反应完成以一部分或者几部分加入至少一种组分的部分或者全部的量，可以防止粘性增加或者固化作用。

8、根据权利要求1-7中任何一项的核苷化合物生产方法，其特征在于核酸碱基或者核酸碱基类似物是以碱性水溶液的形式加入的。

9、根据权利要求8的核苷化合物生产方法，其特征在于其中溶解有核酸碱基或者核酸碱基类似物的碱性水溶液，是含有氢氧化锂、碳酸锂和碳酸氢锂中至少一种物质的溶液。

10、一种核苷化合物生产方法，其包括在核苷磷酸化酶活性和在能够与磷酸形成微溶于水的盐的金属阳离子的盐存在的情况下，将戊糖-1-磷酸与核酸碱基或核酸碱基类似物在含水反应介质中反应，在没有pH调节的情况下生产核苷化合物，该方法的特征在于所述的金属阳离子的盐是微溶于水的盐，

金属阳离子的盐是至少一种选自氢氧化镁、氧化镁、碳酸镁和碱式碳酸镁的盐。

11、根据权利要求10的核苷化合物生产方法，其特征在于所述的含水反应介质在反应过程中的pH范围是7.5-10.0。

12、根据上述10的核苷化合物生产方法，其特征在于这样一个步骤：过滤通过所述反应获得的反应混合物，来去除出现在反应混合物中的不溶物质以获得含有核苷化合物的滤出液。