DE69721213T2

DE69721213T2 - Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-5'-Phosphat Estern

Info

Publication number: DE69721213T2
Application number: DE69721213T
Authority: DE
Inventors: Yasuhiro Kawasaki-shi Mihara; Takashi Utagawa; Hideaki Yamada; Yasuhisa Asano
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1996-11-21
Filing date: 1997-11-20
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2017-11-21
Also published as: BR9705813A; US6355472B2; DE69721213D1; US20020004590A1; EP0857788A2; ES2199330T3; KR100458970B1; EP0857788B1; US6207435B1; CN1117870C; EP0857788A3; JPH10201481A; BR9705813B1; JP4304727B2; KR19980042777A; CN1184157A; US6015697A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Nucleosid-5'-phosphatesters. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine neue saure Phosphatase, ein für diese saure Phosphatase codierendes Gen, eine das Gen enthaltende DNA und einen Mikroorganismus, der die rekombinante DNA enthält, welche zur Herstellung eines Nucleosid-5'phosphatesters verwendbar sind. Nucleosid-5'-phosphatester sind geeignet als Würzmittel, als Arzneimittel und als Ausgangsmaterial zur Herstellung von solchen Substanzen.
Verfahren für die biochemische Phosphorylierung eines Nucleosids unter Bildung von Nucleosid-5'-phosphatester unter Verwendung der nachstehenden Phosphatgruppen-Donoren sind bekannt, einschließlich ein Verfahren, bei dem p-Nitrophenylphosphorsäure verwendet wird (japanische Patentveröffentlichung NR. 39-29858), ein Verfahren, bei dem anorganische Phosphorsäure verwendet wird (japanische Patentveröffentlichung NR. 42-1186), ein Verfahren, bei dem Polyphosphorsäure eingesetzt wird (offengelegte japanische Patentanmeldung NR. 53-56390), ein Verfahren, bei dem Acetylphosphorsäure verwendet wird (japanische offengelegte Patentanmeldung 56-82098) und ein Verfahren, bei dem Adenosintriphosphat (ATP) verwendet wird (offengelegte japanische Patentanmeldung NR. 63-2300949). Diese Verfahren sind jedoch nicht zufriedenstellend zur effizienten und preisgünstigen Herstellung von Nucleosid-5'-phosphatestern, weil die zu verwendenden Substrate teuer sind oder weil bei der Reaktion Nebenprodukte gebildet werden.
Die Erfinder haben daher ein Verfahren für die effiziente Herstellung von Nucleosid-5'-phosphatestern ohne dass 2'-, 3'-Nucloetid-Isomere als Nebenprodukte gebildet werden, entwickelt, bei dem man Zellen eines spezifischen Mikroorganismus unter sauren Bedingungen auf ein Nucleosid und einen Phosphatgruppen-Donor, der aus der aus Polyphosphorsäure oder einem Salz dieser, Phenylphosphorsäure oder einem Salz dieser und Carbamylphosphat oder einem Salz davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist, einwirken lässt (offengelegte japanische Patentanmeldung NR. 7-231793).
Jedoch selbst diese Methode hat die nachstehenden Nachteile. So wird beispielsweise ein Teil des Substrats während der Reaktion durch eine Nucleosid-abbauende Aktivität abgebaut, die ungünstigerweise in einer geringen Menge in den Zellen des zu verwendenden Mikroorganismus vorhanden ist. Wenn die Reaktion fortgesetzt wird, wird außerdem der gebildete und angereicherte Nucleosid-5'-phosphatester abgebaut. Daher werden in der Reaktionslösung Nebenprodukte gebildet und es war unmöglich, eine ausreichend hohe Ausbeute zu erzielen. Außerdem kann die Reaktion nicht durchgeführt werden, wenn das Substrat in hoher Konzentration zugesetzt wird, weil die Transphosphorylierungs-Aktivität pro Mikrobenzelle niedrig ist.
Gemäß einer Ausführungsform wird gemäß der Erfindung wünschenswerter Weise ein Verfahren zur preisgünstigen und effizienten Produktion eines Nucleosid-5'-phosphatesters zur Verfügung gestellt. Gemäß anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden ein Enzym, ein für das Enzym codierendes Gen, eine das Gen enthaltende rekombinante DNA und ein Mikroorganismus, der die rekombinante DNA trägt, zur Verfügung gestellt, die geeignet für das Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-5'-phosphatester sind.
Als Ergebnis von verschiedenen Untersuchungen durch die vorliegenden Erfinder, um ein Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-5'-phosphatestern zu entwickeln, das wirksamer ist als die üblichen Verfahren, wurde gefunden, dass Nucleosid-5'-phosphatester wirksam in hoher Ausbeute hergestellt werden können, indem man eine saure Phosphatase, die aus einem zellfreien Extrakt eines Mikroorganismus isoliert wurde, unter der Bedingunge eines pH-Werts von 3,0 bis 5,5 auf ein Nucleosid und einen Phosphatgruppen-Donor einwirken lässt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyphosphorsäure oder einem Salz dieser, Phenylphosphorsäure oder einem Salz dieser und Carbamylphosphat oder einem Salz davon besteht. Außerdem haben die vorliegenden Erfinder erfolgreich Wildtyp-Gene aus verschiedenen Bakterien, die für saure Phosphatasen codieren, und Gene erhalten, die für saure Phosphatasen mit erhöhter Affinität für das Nucleosid im Vergleich mit den sauren Phosphatasen des Wildtyps codieren, indem eine Mutation in eine saure Phosphatase eingeführt wurde, die von einem Bakterium des Genus Eschericia abgeleitet ist. Darüber hinaus wurde erfindungsgemäß gefunden, dass die Produktivität von Nucleosid-5'-phosphatestern merklich verbessert werden kann, indem das Gen in einer großen Menge mit Hilfe von Methoden der Gentechnologie exprimiert wird.
Erfindungsgemäß wurde darüber hinaus versucht, eine Mutante der sauren Phosphatase mit erhöhter Temperaturbeständigkeit mit der Absicht herzustellen, dass die Durchführung einer Phosphat-Übertragungsreaktion unter Verwendung der sauren Phosphatase bei einer höheren Temperatur zu einer effektiveren Herstellung von Nucleosid-5'-phosphaten führt, weil die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht wird und die Konzentration des Phosphatempfängers in der Reaktionslösung erhöht werden kann. Die Erfinder haben mit Erfolg eine Mutante der sauren Phosphatase hergestellt, die erhöhte Temperaturbeständigkeit gegenüber den in Beispiel 19 beschriebenen Mutanten von saurer Phosphatase hat und die in einer Reaktion bei hoher Temperatur angewendet werden kann, so dass die vorliegende Erfindung fertiggestellt wurde.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung eines Nucleosid-5'-phosphatesters zur Verfügung gestellt, welches die Stufen umfasst, in denen eine saure Phosphatase mit einer erhöhten Affinität für ein Nucleosid und/oder einer erhöhten Temperaturbeständigkeit unter der Bedingung eines pH-Werts von 3,0 bis 5,5 auf ein Nucleosid und einen Phosphatgruppen-Donor, der vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyphosphorsäure oder einem Salz davon, Phenylphosphorsäure oder einem Salz davon, Acetylphosphorsäure oder einem Salz davon und Carbamylphosphat oder einem Salz davon besteht, zur Einwirkung gebracht wird, um einen Nucleosid-5'-phosphatester herzustellen und dieser gewonnen wird.
Die Bezeichnung "saure Phosphatase mit einer erhöhten Affinität für ein Nucleosid" schließt solche sauren Phosphatasen ein, die eine höhere Affinität für ein Nucleosid haben als die saure Phosphatase des Wild-Typs. Bevorzugte saure Phosphatasen haben eine Michaelis-Konstante, Km, für die Transphosphorylisierung des Nucleosids, die unter 100 mM liegt.
Der Ausdruck "saure Phosphatase mit erhöhter Temperaturbeständigkeit" schließt solche sauren Phosphatasen ein, die nach der Behandlung bei erhöhter Temperatur mehr verbliebene Aktivität aufweisen als eine entsprechende Phosphatase des Wild-Typs. Vorzugsweise behält die saure Phosphatase mehr Aktivität bei als der Wild-Typ, nachdem sie 30 Minuten lang bei einem pH-Wert von 7, 0 bei 50°C gehalten wurde. Besonders bevorzugt ist, dass die saure Phosphatase im wesentlichen keinen Aktivitätsabfall bei der 30-minütigen Behandlung bei einem pH-Wert von 7,0 und 50°C zeigt.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Nucleosid-5' phosphatesters zur Verfügung gestellt, welches Stufen umfasst, in denen ein Mikroorganismus unter der Bedingung eines pH-Werts von 3,0 bis 5,5 auf ein Nucleosid und einen Phosphatgruppen-Donor zur Einwirkung gebracht wird, um einen Nucleosid-5'-phosphatester herzustellen, und dieser gewonnen wird, wobei der Mikroorganismus mit einer rekombinanten DNA transformiert ist, die ein Gen enthält, welches für eine saure Phosphatase mit erhöhter Affinität für das Nucleosid und/oder erhöhter Temperaturbeständigkeit codiert.
Gemäß einem anderen Aspekt werden erfindungsgemäß Mutanten einer sauren Phosphatase mit erhöhter Affinität für ein Nucleosid und/oder erhöhter Temperaturbeständigkeit, Gene, die für diese sauren Phosphatasen codieren, diese Gene enthaltende rekombinante DNAs und Mikroorganismen, welche die rekombinante DNA tragen, zur Verfügung gestellt.
Ausführungsformen der Erfindung sind nachstehend lediglich anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beschrieben, in denen
1 den Zusammenhang zwischen dem pH der Reaktion und der gebildeten Menge von 5'-Inosinsäure in einer Reaktion, die unter Verwendung eines von Morganella morganii abgeleiteten Enzyms durchgeführt wird, veranschaulicht,
2 verdeutlicht den Zusammenhang zwischen dem pH der Reaktion und der gebildeten Menge von 5'-Inosinsäure in einer Reaktion, die unter Verwendung eines von Escherichia blattae abgeleiteten Enzyms durchgeführt wurde,
3 veranschaulicht eine Restriktionskarte eines chromosomalen DNA-Fragments von Morganella morganii, das ein für saure Phosphatase codierendes Gen enthält,
4 veranschaulicht die gebildete Menge von 5'-Inosinsäure bei einer Reaktion, die unter Verwendung eines Stammes durchgeführt wurde, der das von Morganella morganii abgeleitete Phosphatase-Gen enthält,
5 verdeutlicht eine Restriktionskarte eines chromosomalen DNA-Fragments von Escherichia blattae, welches ein für eine saure Phosphatase codierendes Gen enthält.
6 zeigt eine Kurve, welche die Menge von 5'-Inosinsäure zeigt, die in einer Reaktion gebildet wurde, die unter Verwendung eines Stammes durchgeführt wurde, der das von Escherichica blattae abgeleitete saure Phosphatase-Gen enthält,
7 veranschaulicht die gebildete Menge von 5'-Inosinsäure in Reaktionen, die unter Verwendung eines Stammes, der das saure Phosphatase-Gen des Wild-Typs enthält, und eines Stammes, der die Mutante des sauren Phosphatase-Gens enthält, welches von Escherichia blattae abgeleitet ist, durchgeführt wurden.
8 veranschaulicht die gebildete Menge von 5'-Inosinsäure in einer Reaktion, die unter Verwendung eines Stammes durchgeführt wurde, der die neue Mutante des Phosphatase-Gens, abgeleitet von Escherichia blattae, enthält.
9 veranschaulicht eine Restriktionskarte eines chromosomalen DNA-Fragments, das von Enterobacter aerogenes abgeleitet ist und das das für eine saure Phosphatase codierende Gen enthält. 10 veranschaulicht eine Restriktionskarte eines chromosomalen DNA-Fragments, welches von Klebsiella planticola abgeleitet ist und welches das für saure Phosphatase codierende Gen enthält.
11 veranschaulicht eine, Restriktionskarte eines chromosomalen DNA-Fragments, das von Serratia ficaria abgeleitet ist, welches das für saure Phosphatase codierende Gen enthät.
12 veranschaulicht Aminosäuresequenzen, in dem Ein buchstabencode, die von den Nucleotidsequenzen von sauren Phosphatasen abgeleitet wurden, welche von Moranella morganii, Escherichia blattae, Providencia stuartii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella planticola und Serratia ficaria stammen.
Diese Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID NR. 4, 8, 22, 24, 26 und 28 der Sequenzliste im Dreibuchstaben-Code angegeben. In der Figur sind die Aminosäurereste, die allen Aminosäuresequenzen gemeinsam sind, mit * unterhalb der Sequenz bezeichnet.
13 veranschaulicht die Kurve der Temperaturbeständigkeit der Aktivität der sauren Phosphatase in der zellfreien Extraktlösung, die aus einem Stamm erhalten wurde, welcher die neue Mutante des Phosphatase-Gens, abgeleitet von Escherichia blattae, enthält.
(1) Herstellung von saurer Phosphatase
Die erfindungsgemäß zu verwendende saure Phosphatase katalysiert die Reaktion der Bildung von Nucleosid-5'-phosphatester durch eine Phosphatgruppen-Übertragung auf das Nucleosid von einem Phosphatgruppen-Donor, der beispielsweise aus der aus Polyphosphorsäure oder einem Salz davon, Phenylphosphorsäure oder einem Salz davon, Acetylphosphorsäure oder einem Salz davon und Carbamylphosphat oder einem Salz davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist, bei einem pH-Wert von 3,0 bis 5,5. Zu solchen sauren Phosphatasen gehören vorzugsweise solche, die von Mikroorganismen stammen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein Enzym verwendet, das von einem Bakterium des Genus Morganella, Escherichia, Providencia, Enterobacter, Klebsiella oder Serratia abgeleitet ist. Repräsentative Beispiele für ein solches Bakterium umfassen die folgenden Bakterienstämme.
Morganella morganii NCIMB 10466
Morganella morganii IFO 3168
Morganella morganii IFO 3848
Escherichia blattae JCM 1650
Escherichia blattae ATCC 33429
Escherichia blattae ATCC 33430
Providencia stuartii ATCC 29851
Providencia stuartii ATCC 33672
Enterobacter Aerogenes IFO 12010
Enterobacter aerogenes IFO 13534
Klebsiella planticola IFO 14939
Klebsiella planticola IAM 1133
Serratia ficaria IAM 13540
Serratia marcescens IAM 12143
Es ist festzuhalten, dass saure Phosphatase (EC 3.1.3.2) ursprünglich ein Enzym ist, welches die Reaktion der Hydrolyse eines Phosphatesters unter sauren Bedingungen katalysiert und dieses Enzym hat eine Nucleotidaseaktivität, wobei ein durch die Transphosporylierungsreaktion gebildeter Nucleotid-Phosphatester zersetzt wird (nachstehend wird die Nucleotidaseaktivität als "Phosphomonoesterase-Aktivität" bezeichnet. Um Nucleosid-5'-phosphatester in hoher Ausbeute zu erhalten, ist es wünschenswert, dass eine Mutante der sauren Phosphatase verwendet wird, deren Affinität für ein Nucleosid in der Transphosphorylierungsreaktion auf das Nucleosid erhöht ist im Vergleich mit der sauren Phosphatase des Wild-Typs, welche durch die vorstehend beschriebenen Bakterien produziert wird (nachstehend wird diese erforderlichenfalls als "saure Phosphatase-Mutante" bezeichnet). Vorzugsweise wird eine saure Phosphatase-Mutante verwendet, die einen Km-Wert unter 100 hat.
Die Mutante der sauren Phosphase kann erhalten werden, indem eine Gen-Mutante exprimiert wird, die durch direktes Mutieren eines für eine saure Phosphatase codierendes Gen in der nachstehend beschriebenen Weise erhalten wird. Alternativ kann die Mutante der sauren Phosphatase auch erhalten werden, indem ein Mikroorganismus, der eine saure Phosphatase produziert, mit Ultraviolettlicht bestrahlt oder mit einem mutationsauslösenden Mitteln behandelt wird, welches gewöhnlich zur künstlichen Mutation verwendet wird, wie N-Methyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidin (NTG) und der mutierte Mikroorganismus gezüchtet wird, wobei eine Mutante der sauren Phosphatase gebildet wird, die erhöhte Affinität für ein Nucleosid und/oder erhöhte Temperaturbeständigkeit besitzt.
Ein Protein mit der Aktivität von saurer Phosphatase kann aus den vorstehend beschriebenen Mikroorganismen durch Züchten des Mikrobenstamms, der die Aktivität aufweist, in einem geeigneten Medium, Gewinnen der gewachsenen Mikrobenzellen, Aufbrechen der Mikrobenzellen zur Herstellung eines zellfreien Extrakts und geeignete Reinigung des daraus erhaltenen Proteins, hergestellt werden.
Das Medium zum Züchten des Mikroorganismus ist nicht speziell beschränkt, wofür ein übliches Medium zugänglich sein kann, das eine übliche Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und gegebenenfalls eine organische Nahrungsquelle enthält. Die in geeigneter Weise zu verwendende Kohlenstoffquelle umfasst beispielsweise Saccharide, wie Glucose und Saccharose, Alkohole, wie Glycerin und organische Säuren. Die zu verwendende Stickstoffquelle umfasst beispielsweise gasförmiges Ammoniak, wässriges Ammoniak und Ammoniumsalze. Die erforderlichenfalls zu verwendenden anorganischen Ionen umfassen beispielsweise Magnesiumionen, Phosphationen, Kaliumionen, Eisenionen und Manganionen. Zu geeigneten, verwendbaren organischen Nährstoffen gehören beispielsweise Vitamine und Aminosäuren sowie diese enthaltende Materialien, wie Hefeextrat, Pepton, Fleichextrakt, Maisquellwasser, Kaseinhydrolysat und Sojabohnenhydrolysat.
Die Züchtungsbedingungen sind ebenfalls nicht spezifisch begrenzt. So kann der Mikroorganismus beispielsweise unter aeroben Bedingungen während etwa 12 bis 48 Stunden gezüchtet werden, während der pH-Wert und die Temperatur in geeigneter Weise in Bereichen von pH 5 bis 8 und Temperaturen von 25 bis 40°C eingestellt werden.
Die gezüchteten Mikrobenzellen können beispielsweise durch Zentrifugieren aus der Kulturflüssigkeit gewonnen werden. Der zellfreie Extrakt wird aus den gewonnenen Mikrobenzellen unter Verwendung einer üblichen Methode hergestellt. So wird der zellfreie Extrakt erhalten, indem die Mikrobenzellen mit Hilfe einer Methode, wie Behandlung mit Ultraschall, einer Dyno- Mühle und French-Presse zerbrochen werden und die Zellbruchstücke durch Zentrifugieren entfernt werden.
Die saure Phosphatase wird aus dem zellfreien Extrakt unter Verwendung einer geeigneten Kombination von Methoden gewonnen und gereinigt, die normalerweise zur Enzymreinigung verwendet werden, wie die Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie und isoelektrische Reinigung. Eine Ausfällung ist nicht notwendigerweise unerlässlich, um die saure Phosphatase vollständig zu reinigen. Es ist ausreichend, die Entfernung von Verunreinigungen, wie einem Enzym, das am Abbau des Nucleosids als Substrat teilnimmt, zu erreichen.
(2) Herstellung des Gens für saure Phosphatase
Ein DNA-Fragment, welches ein für das Protein mit der Aktivität von saurer Phosphatase codiert, kann beispielsweise ausgehend von Zellen eines Mikroorganismus kloniert werden, der diese enzymatische Aktivität hat. Die Klonierungsmethode umfasst beispielsweise eine Methode, bei der eine chromosomale Genexpressionsbibiliothek unter Verwendung der Enzym-Aktivität als Index abgesucht (gescreent) wird, eine Methode, bei der ein Antikörper gegen das Protein hergestellt wird, um das Screening einer chromosomalen Genexpressionsbibliothek durchzuführen und eine Methode, bei der eine Aminosäuresequenz, die eine N-terminale Sequenz des gereinigten Proteins analysiert wird und auf dieser Basis eine Sonde hergestellt wird, um eine Genbibliothek zu screenen. Speziell das für die saure Phosphatase der vortehend beschriebenen Morganella morganii, Escherichia blattae, Providencia stuartii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella planticola, Serratia ficaria oder Serratia marcescens codierende Gen kann geklont werden, indem eine chromosomale Genexpressionsbibliothek jedes der Mikroorganismen hergestellt wird und die Bibliothek unter Verwendung der Phosphataseaktivität als Indes gescreent wird.
Eine chromosomale Genexpressionsbibliothek kann hergestellt werden, indem zuerst chromosomale DNA aus Morganella morganii oder Escherichia blattae hergestellt wird, diese mit Hilfe eines geeigneten Restriktionsenzyms partiell abgebaut wird, danach mit einem Vektor ligiert wird, der in Escherichia coli autonom replizierbar ist, und Escherichia coli mit der erhaltenen rekombinanten DNA transformiert wird. Eine große Vielzahl von Restriktionsenzymen kann zum Verdauen von chromosomaler DNA durch Einstellen der Dauer der Verdauungsreaktion verwendet werden, um den Grad der Verdauung einzustellen. Zum Klonen des Gens kann ein beliebiger Vektor verwendet werden, vorausgesetzt, dass er in Escherichia coli autonom replizierbar ist. Es ist möglich, beispielsweise pUC19, pUC118, pHSG298, pBR322 und pBluescript II zu verwenden.
Der Vektor kann mit dem DNA-Fragment ligiert werden, welches das für die saure Phosphatase codierende Gen enthält, um die rekombinante DNA herzustellen, indem zuerst der Vektor mit dem gleichen Restriktionsenzym, das zum Verdauen der chromosomalen DNA verwendet wurde, oder mit einem Restriktionsenzym verdaut wird, welches ein Restriktionsende erzeugt, das komplimentär zu dem Restriktionsende des chromosomalen DNA-Fragments ist, und dieses mit dem DNA-Fragment unter Verwendung einer Ligase, wie T4-DNA-Ligase ligiert wird. Als Wirtsorganismus für die hergestellte rekombinante DNA kann jeder beliebige Mikrobenstamm verwendet werden, vorausgesetzt, dass er für die Replikation des Vektors geeignet ist. So ist es beispielsweise möglich, Mikroorganismenstämme von Escherichia coli zu verwenden, wie HB101, JM109 und DHS.
Die so erhaltenen Transformanten werden auf einem Agarmedium gezüchtet, um Kolonien auszubilden. Wenn danach eine p-Nitrophenylphosphorsäure enthaltende Reaktionslösung auf die Oberfläche des Mediums gegossen wird, um eine Reaktion durchzuführen, dann setzt ein Stamm, der die Phosphataseaktivität exprimiert, p-Nitrophenol frei und zeigt eine Gelbfärbung. Ein Transformant, der ein DNA-Fragment trägt, welches das für die erfindungsgemäße saure Phosphatase codierende Gen enthält, kann selektiert werden, indem die vorstehend beschriebene Reaktion unter sauren Bedingungen durchgeführt wird und der Transformant selektiert wird, indem die Farbentwicklung als Indikator verwendet wird.
Danach wird die rekombinante DNA aus dem selektierten Transformanten gewonnen, um die Struktur des DNA-Fragments zu analysieren, welches das für die saure Phosphatase codierende Gen, das mit dem Vektor ligiert ist, enthält. Eine Nucleotidsequenz des für die saure Phosphatase codierenden Gens ist in SEQ ID NR. 2 der Sequenzliste für den Fall eines von Morganella morganii NCIMB 10466 abgeleiteten Gens, in SEQ ID NR. 6 in der Sequenzliste im Fall eines von Escherichia blattae JCM 1650 abgeleiteten Gens, in SEQ ID NR. 21 in der Sequenzliste im Fall eines von Providencia stuartii ATCC 29851 abgeleiteten Gens, in SEQ ID NR. 23 in der Sequenzliste im Fall eines von Enterobacter aerogenes IFO 12010 abgeleiteten Gens, in SEQ ID NR. 25 in der Sequenzliste im Fall eines von Klebsiella planticola IFO 14939 abgeleiteten Gens bzw. in SEQ ID NR. 27 in der Sequenzliste im Fall eines von Serratia ficaria IAM 13540 abgeleiteten Gens gezeigt.
Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der sauren Phosphatasen, die von den vorstehenden Genen codiert werden, sind in SEQ ID NR. 4, 8, 22, 24, 26 und 28 veranschaulicht.
Varianten der sauren Phosphatase, die durch die vorstehend angegebenen Gene codiert werden und erhöhte Affinität für ein Nucleosid und/oder erhöhte Temperaturbeständigkeit haben, werden vorzugsweise für die Zwecke der Erfindung eingesetzt. Saure Phosphatase, die eine Aminosäuresequenz enthält, welche in wesentlichen identisch mit der Aminosäuresequenz einer der durch die vorstehenden Gene codierten sauren Phosphatasen ist, wird für die vorliegende Erfindung ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Der Ausdruck "im wesentlichen identisch" bedeutet, dass die Aminosäuresequenzen der sauren Phosphatasen eine Substitution, Deletion, Insertion oder den Austausch von einem oder mehreren Aminosäureresten aufweisen können, ohne dass die Aktivität zur Herstellung von Nucleosid-5'-phosphatestern (nachstehend als "Transphosphorylierungsaktivität" bezeichnet) zu verlieren. Vorzugsweise haben die Varianten eine Michaelis-Konstante Km von weniger als 100°C, wie vorstehend diskutiert wurde, und erleiden im wesentlichen keinen Verlust der Aktivität, wenn sie 30 Minuten lang bei 50°C und pH 7 gehalten werden.
(3) Herstellung eines Gens, das für eine Mutante der sauren Phosphatase codiert
Die wie oben beschrieben erhaltene saure Phosphatase des Wild-Typs hat Phosphomonoesteraseaktivität. Daher kann die Phosphomonoesteraseaktivität einen Faktor darstellen, der bei der Herstellung von Nucleosid-5'-phosphatester im Verlauf der Reaktionszeit die begleitende Zersetzung des Produkts verursacht, wodurch eine Verminderung der Reaktionsausbeute verursacht wird. Um diesen Umstand zu überwinden, ist es vorteilhaft, eine künstliche Mutation des für die saure Phosphatase codierenden Gens zu verursachen, so dass die Affinität für ein Nucleosid erhöht wird
Außerdem führt die Durchführung der Phosphat-Ubertragungsreaktion durch die saure Phosphatase bei einer höheren Temperatur zu einer wirksameren Produktion von Nucleosid-5'-Phosphat, weil die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht wird und die Konzentration des Phosphatempfängers in der Reaktionslösung erhöht werden kann. Zu diesem Zweck ist es vorteilhaft, eine künstliche Mutation des für die saure Phosphatase codierenden Gens zu verursachen, so dass die Temperaturbeständigkeit erhöht wird.
Zu Methoden für die gerichtete Mutagenese zur Erzeugung einer gewünschten Mutation an einer bestimmten Stelle der DNA gehören beispielsweise eine Methode unter Verwendung von PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)) und eine Methode unter Verwendung eines Phagen (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)) .
Beispielhaft für die Mutante der sauren Phosphatase, die erhöhte Affinität für das Nucleosid hat, ist die saure Phosphatase, die eine Aminosäuresequenz hat, welche im wesentlichen identisch mit einer Aminosäuresequenz ist, die aus der Gruppe der SEQ ID NR. 4, 8, 22, 24, 26 und 28 in der Sequenzliste dargestellten Sequenzen ausgewählt ist und eine Mutation hat, welche die Affinität für das Nucleosid im Vergleich mit der sauren Phosphatase des Wild-Typs erhöht. Konkrete Beispiele für die Mutante der sauren Phosphatase im Fall des von Escherichia blattae JCM 1650 abgeleiteten Enzyms ist eine solche, in der der 74. Glycinrest und/oder der 153. Isoleucinrest in der in SEQ ID NR. 8 in der Sequenzliste dargestellten Aminosäuresequenz durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist. In den nachstehend beschriebenen Beispielen wird ein Gen, das für eine Mutante der sauren Phosphatase codiert, in der der 74. Glycinrest durch einen Asparaginsäurerest ersetzt ist und der 153. Isoleucinrest durch einen Threoninrest ersetzt ist, als Beispiel verdeutlicht.
Weitere Mutationen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Substitutionen des 63. Leucinrests, des 65. Allaninrests, des 66. Glutaminsäurerests, des 69. Asparaginrests, des 71. Serinrests, des 72. Serinrests, des 85. Serinrests, des 92. Alaninrests, des 94. Alaninrests, des 116. Asparaginsäurerests, des 130. Serinrests, des 135. Threoninrests und/oder des 136. Glutaminsäurerests durch eine andere Aminosäure in SEQ ID NR. 8 besteht, erhöhen die Affinität der sauren Phosphatase für das Nucleosid weiter.
Beispiele für Mutanten der sauren Phosphatase, die eine erhöhte Temperaturbeständigkeit haben „ sind saure Phosphatasen, die eine Aminosäuresequenz besitzen, die im wesentlichen identisch mit der Aminosäuresequenz ist, die aus der Gruppe der SEQ ID NR. 4, 8, 22, 24, 26 und 28 in der Sequenzliste ausgewählt ist und eine Mutation hat, welche die Temperaturbeständigkeit von saurer Phosphatase des Wild-Typs erhöht. Ein konkretes Beispiel für die Mutante der sauren Phosphatase im Fall des von Escherichia blattae JCM 1650 abgeleiteten Enzyms ist eine solche, in der der 104. Glutaminsäurerest und/oder der 151. Threoninrest in einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 8 in der Sequenzliste dargestellt ist, durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist. In den nachstehend beschriebenen Beispielen ist ein Gen, das für eine Mutante der sauren Phosphatase codiert, als Beispiel angegeben, in welcher der 104. Glutaminsäurerest durch einen Glycinrest ersetzt ist und der 151. Threoninrest durch einen Alaninrest ersetzt ist.
Das Nucleosid kann daher an der festgelegten Stelle des Wild-Typ-Gens mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Methode der gerichteten Mutagenese substituiert werden, so dass diese Mutanten der sauren Phosphatasen codiert werden. Die Mutation zum Erhöhen der Affinität für das Nucleosid ist in wünschenswerter Weise eine Art der Mutation, bei der die Aktivität zur Herstellung eines Nucleosid-5'-phosphatesters im Vergleich mit der sauren Phosphatase des Wild-Typs nicht wesentlich erniedrigt wird. Jedoch selbst im Fall, dass die Aktivität zur Herstellung eines Nucleosid-5'-phosphatesters vermindert wird, ist ausreichend, wenn der Grad der Verminderung der Phosphormonoesterase-Aktivität besser ist als der der Aktivität zur Herstellung eine Nucleosid-5'-phosphatesters, so dass im Ergebnis das Verhältnis der Phosphormonoesterase-Aktivität zu der Aktivität zur Herstellung von Nucleosid-5'-phosphatester der Mutante der sauren Phosphatase im Vergleich mit der sauren Phosphatase des Wild-Typs vermindert ist. Im Hinblick auf den Grad der Erhöhung der Affinität für das Nucleosid ist vorzugsweise der Km-Wert gegenüber dem Nucleosid in der Transphosphorylierungsreaktion weniger als 100.
Die Mutation, welche die Temperaturbeständigkeit erhöht, bedeutet eine Mutation, die nach einer Temperaturbehandlung mehr restliche Aktivität besitzt als die saure Phosphatase des Wild-Typs. Der Grad der Erhohung der Temperaturbeständigkeit ist vorzugsweise derart, dass bei einer Behandlung während 30 Minuten bei einem pH von 7,0 und einer Temperatur von 50°C keine Verminderung der Aktivität verursacht wird.
Wie nachstehend in den Ausführungsformen erläutert wird, ist die Aminosäuresequenz der sauren Phosphatase von Escherichia blattae JCM 1650 zu der von Morganella morganii NCIMB 10466 stark homolog und der 72. Glycinrest, dar 102.
Glutaminsäurerest, der 149. Threoninrest und der 151. Isoleucinrest in der in SEQ ID NR. 4 dargestellten Aminosäuresequenz entsprechen dem 74. Glycinrest, dem 104. Glutaminsäurerest, dem 151. Threoninrest und dem 153. Isoleucinrest in der in SEQ ID NR. 8 dargestellten Aminosäuresequenz. Außer Escherichia blattae JCM 1650 haben außerdem die Aminosäuresequenzen der sauren Phosphatasen, die von Mikroorganismen, wie Providencia stuartii ATCC 29851, Enterobacter aerogenes IFO 12010, Klebsiella planticola IFO 14939 und Serratia ficaria IAM 13450 abgeleitet sind, hohe Homologie mit der von Morganella morganii NCIMB 10466, und die Aminosäuresequenzen dieser sauren Phosphatasen enthalten Aminosäurereste, die jeweils dem 72. Glycinrest, dem 102. Glutaminsäurerest, dem 149. Threoninrest und dem 151. Isoleucinrest in der in SEQ ID NR. 4 dargestellten Aminosäuresequenz entsprechen. Daher können Gene, die für Mutanten der sauren Phosphatasen codieren, welche von diesen Mikroorganismen abgeleitet sind, in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten werden. Der 92. Glycinrest, der 122. Glutaminsäurerest, der 169. Threoninrest und der 171. Isoleucinrest in der Aminosäuresequenz der von Providencia stuartii ATCC 29851, Enterobacter aerogenes IFO 12010 oder Klebsiella planticola IFO 14939 abgeleiteten sauren Phosphatasen, die in SEQ ID NR. 22, 24 oder 26 dargestellt sind, und der 88. Glycinrest, der 118. Glutaminsäurerest, der 165. Threoninrest und der 167. Isoleucinrest in der Aminosäuresequenz der von Serratia ficaria IAM 13450 abgeleiteten sauren Phosphatase, die in SEQ ID NR. 28 dargestellt ist, entsprechen jeweils dem 72. Glycinrest, dem 102. Glutaminsäurerest, dem 149. Threoninrest und dem 151. Isoleucinrest in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR. 4 dargestellt ist.
Das Ergebnis eines Vergleiches der Aminosäuresequenzen der vorstehend beschriebenen sauren Phosphatasen ist in 12 verdeutlicht.
Auf Basis von 12 wird festgestellt, welcher Aminosäurerest einer sauren Phosphatase einem anderen Aminosäurerest einer anderen sauren Phosphatase entspricht.
(4) Einführen des sauren Phosphatase-Gens in einen Wirtsorganismus
Ein rekombinanter Mikroorganismus für die Expression der sauren Phosphataseaktivität in einem hohen Grad kann erhalten werden, indem das DNA-Fragment, welches das für das Protein mit der Aktivität saurer Phosphatase codierende Gen, das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, in Zellen eines Wirtsorganismus eingebracht wird, nachdem das DNA-Fragment wieder mit einem geeigneten Vektor rekombiniert worden ist. Bei einem solchen Verfahren wird saure Phosphatase des Wild-Typs exprimiert, indem das für Wild-Typ saure Phosphatase des Wild-Typs codierende Gen verwendet wird, während eine Mutante der sauren Phosphatase exprimiert wird, wenn das für die Mutante der sauren Phosphatase codierende Gen verwendet wird.
Zu Wirtsorganismen gehören Mikrobenstämme von Escherichia coli, wie HB101, JM109 und DHS, die oben beschrieben wurden. Außer diesen Stämmen können alle Bakterien als Wirt verwendet werden, vorausgesetzt, dass ein Replikations-Startpunkt der konstruierten rekombinanten DNA und das saure Phosphatase-Gen ihre Funktion erfüllen, die rekombinante DNA replizierbar ist und das Gen für die saure Phosphatase exprimiert werden kann. Einer der am stärksten bevorzugten Wirtsorganismen ist Escherichia coli JM109.
Der Vektor zum Einbringen des für die saure Phosphatase codierenden Gens in den Wirtsorganismus ist nicht spezifisch beschränkt, vorausgesetzt, dass er in dem Wirtsorganismus repliziert werden kann. Wenn Escherichia coli als Wirtsorganismus verwendet wird, können Beispiele für den Vektor Plasmide sein, die in diesem Bakterium autonom replizierbar sind. So ist es beispielsweise möglich, Plasmide des. ColEl-Typs, Plasmide des p15A-Typs, Plasmide des R-Faktor-Typs und Plasmide des Phagentyps zu verwenden. Zu derartigen Plasmiden gehören speziell beispielsweise pBR322 (Gene, 2, 95 (1977), pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)), pUC119 (Methods in Enzymology, 153, 3 (1987)), pACYC184 (J. Bacteriol., 134, 1141 (1978)), und pSC101 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70, 3240 (1973)).
Wenn das DNA-Fragment, welches das für die saure Phosphatase codierende Gen enthält, einen Promotor enthält, der in dem Wirtsorganismus funktionell ist, kann das DNA-Fragment wie es ist mit dem Vektor ligiert werden. Wenn das DNA-Fragment keinen solchen Promotor enthält, kann ein anderer Promotor, der in dem Wirtsmikroorganismus wirksam ist, wie lac, trp und PL, an einer Stelle stromaufwärts von dem Gen ligiert werden. Selbst wenn das DNA-Fragment den Promotor enthält, kann der Promotor durch einen anderen Promotor ersetzt werden, um das für die saure Phosphatase codierende Gen wirksam zu exprimieren.
Das Verfahren zum Einführen der rekombinanten DNA, die durch Ligieren des Vektors mit einem DNA-Fragment, welches das für die saure Phosphatase codierende Gen enthält, konstruiert wurde, in den Wirtsorganismus, ist nicht speziell beschränkt. Die rekombinante DNA kann mit Hilfe einer üblichen Methode in den Wirtsorganismus eingeführt werden. Wenn als Wirt Escherichia coli verwendet wird, ist es möglich, beispielsweise die Calciumchlorid-Methode (J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), die Methode von Hanahan (J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)), die SEM-Methode (Gene, 96, 23 (1990)), die Methode nach Chung et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 2172 (1989)) und Elektroporation (Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)) angewendet werden.
Das saure Phosphatase-Gen kann in die autonom replizierbare Vektor-DNA eingefügt werden, welche in den Wirtsorganismus eingeschleust werden kann, so dass sie als extrachromosomale DNA, wie oben beschrieben, durch den Wirtsorganismus beherbergt wird. Alternativ kann das saure Phosphatase-Gen in das Chromosom des Wirts-Mikroorganismus mit Hilfe einer Methode eingefügt werden, bei der die Transduktion, ein Transposon (Biotechnol., 1, 417 (1983)), Mu-Phage (japanisches offengelegtes Patent NR. 2-109985) oder die homologe Rekombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)) anzuwenden.
(5) Expression des Gens für die saure Phosphatase durch den rekombinanten Mikroorganismus
Der wie vorstehend beschrieben erhaltene Transformant, in den die rekombinante DNA, die das für die saure Phosphatase codierende Gen enthält, eingeführt worden ist, hat die Fähigkeit, die saure Phosphataseaktivität in seinen Zellen in hohem Maß zu exprimieren, wenn er in einem geeigneten Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und gegebenenfalls einen organischen Nährstoff enthält, gezüchtet wird. Zu geeigneten verwendbaren Kohlenstoffquellen gehören beispielsweise Kohlehydrate, wie Glucose, Alkohole wie Glycerin und organische Säuren. Die zu verwendende Stickstoffquelle umfasst beispielsweise gasförmiges Ammoniak, wässriges Ammoniak und Ammoniumsalze. Die erforderlichenfalls verwendeten anorganischen Ionen umfassen beispielsweise Magnesiumionen, Phosphationen, Kaliumionen, Eisenionen und Manganionen. Die entsprechend verwendete organische Nährstoffquelle umfasst beispielsweise Vitamine und Aminosäuren sowie Materialien, die diese enthalten, wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat und Sojabohnenhydrolysat. Der Grad der Expression der sauren Phosphataseaktivität kann erhöht werden, indem zu dem Medium ein die Expression induzierendes Mittel, das von einem Promotor abhängt, wie IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) zugesetzt wird.
Die Kultivierungsbedingungen sind ebenfalls nicht spezifisch begrenzt. Die Kultivierung kann beispielsweise unter aeroben Bedingungen während etwa 12 bis 48 Stunden durchgeführt werden, während der pH-Wert und die Temperatur in geeigneter Weise innerhalb von Bereichen von pH 5 bis 8 und Temperaturen von 25 bis 40°C kontrolliert werden.
Danach werden die Mikrobenzellen aus der Kultur gewonnen und durch Aufbrechen wird ein zellfreier Extrakt erhalten, aus den die saure Phosphatase gewonnen und gereinigt werden kann. Die Reinigung erfolgt unter Verwendung einer geeigneten Kombination von Methoden, die üblicherweise zur Enzymreinigung verwendet werden, wie den Methoden, die in dem vorstehenden Punkt (1) beschrieben wurden. Bei der Reinigung ist es nicht unbedingt erforderlich, die saure Phosphatase völlig zu reinigen. Es genügt, die Verunreinigungen zu entfernen, wie Enzyme, die am Abbau des Nucleosids als Substrat teilnehmen.
(6) Herstellung von Nucleosid-5'-phosphatestern Nucleosid-5'-phosphatester können in einen Reaktionsgemisch hergestellt werden, indem man die wie vorstehend erhaltene saure Phosphatase, die erhöhte Affinität für das Nucleosid und/oder erhöhte Temperaturbeständigkeit hat, wie die Mutante der sauren Phosphatase, die durch Exprimieren des Gens in großer Menge mit Hilfe der Methode der Gentechnologie, die in Punkt (5) beschrieben wurde, erhalten wurde, in Kontakt mit einem Nucleosid und mit einem Phosphatgruppen-Donor, der aus der Gruppe der Polyphosphorsäure oder einem Salz davon, Phenylphosphorsäure oder einem Salz davon, Acetylphosphorsäure oder einem Salz davon und Carbamylphosphat oder einem Salz davon, ausgewählt ist, in Kontakt bringt und deren Reaktion verursacht. Um bei dieser Reaktion eine hohe Produktivität zu erzielen, ist es wichtig, dass der pH-Wert der Reaktionslösung so eingestellt wird, dass er in einem schwach sauren Bereich von 3,0 bis 5,5 ist.
Wenn das für die saure Phosphatase codierende Gen mit Hilfe der Methode der Gentechnologie in großer Menge exprimiert wird, speziell dann, wenn das für die Mutante der sauren Phosphatase, die erhöhte Affinität für das Nucleosid besitzt, codierende Gen in großer Menge exprimiert wird, ist es auch möglich, Nucleosid-5'-phosphatester preisgünstig und effizient herzustellen, indem eine Kultur verwendet wird, welche die Mikrobenzellen des Transformanten enthält, die Mikrobenzellen aus der Kultur abgetrennt und gewonnen werden oder ein Produkt verwendet wird, das aus den Mikrobenzellen beispielweise durch eine Behandlung zur Immobilisierung, eine Aceton-Behandlung oder eine Gefriertrocknung erhalten wurde, anstelle der gereinigten sauren Phosphatase verwendet wird.
Die zu verwendenen Nucleoside umfassen beispielsweise Purinnucleoside, wie Inosin, Guanosin, Adenosin, Xanthosin, Purin-Ribosid, 6-Methoxypurin-Ribosid, 2,6-Diaminopurin-Ribosid, 6-Fluorpurin-Ribosid, 6-Thiopurin-Ribosid, 2-Amino-6-thiopurin-Ribosid und Mercaptoguanosin, und Pyrimidin-Nucleoside, wie Uridin, Cytidin, 5-Aminouridin, 5-Hydroxyuridin, 5-Bromuridin und 6-Azauridin. Als Ergebnis der Reaktion werden diese natürlichen Nucleoside und nicht natürlichen Nucleoside spezifisch in ihren 5'-Positionen phosphoryliert und es werden die entsprechenden Nucleosid-5'-phosphatester hergestellt.
Es ist wünschenswert, dass das Nucleosid der Reaktionslösung in einer Konzentration von 1 bis 20 g/dl zugesetzt wird. Bei Verwendung eines Nucleosids, welches in Wasser kaum löslich ist, kann die Reaktionsausbeute verbessert werden, wenn Borsäure oder ein oberflächenaktives Mittel, wie Dimethylsulfoxid, zugesetzt wird.
Wenn das Nucleosid durch Fermentation hergestellt wird, kann das Fermentationsmedium als solches nach der Fermentation zu der Reaktionsflüssigkeit der Phosporylierung gegeben werden.
Wenn das Medium ein Element enthält, welches den Nucleosid-5'-phosphatester zersetzt, wird vorzugsweise eine Reinigungsstufe angewendet, so dass dieses Element entfernt wird.
Zu verwendbaren Phosphatgruppen-Donoren gehören Polyphosphorsäure oder Salze davon, einschließlich beispielsweise Pyrophosphorsäure, Tripolyphosphorsäure, Trimethaphosphorsäure, Tetrametaphosphorsäure, Hexametaphosphorsäure, Gemische davon, Natriumsalze davon, Kaliumsalze davon und Gemische dieser Salze. Zu geeigneten Phenylphosphorsäuren oder deren Salzen gehören beispielsweise Dinatriumphenylphosphar, Dikaliumphenylphosphat, O,O-Diphenylphosphorsäureanhydrid und Gemische davon. Zu geeigneten Carbamylphosphaten oder Salzen davon gehören beispielsweise Dinatriumcarbamylphosphat, Dikaliumcarbamylphosphat, Diammoniumcarbamylphosphat, Dilithiumcarbamylphosphat und Gemische davon. Geeignete Acetylphosphorsäuren oder deren Salze umfassen beispielsweise Lithium-Kalium-Acetylphosphat. Die Konzentration, in der der Phosphatgruppen-Donor verwendet wird, hängt von der Konzentration des Nucleosids als Phosphatgruppen-Akzeptor ab. Der Phosphatgruppen-Donor wird gewöhnlich in einer Menge verwendet, die das 1- bis 5-fache der des Nucleosids ist.
Ein bevorzugtes Ergebnis der Reaktion wird gewöhnlich bei einer Temperatur von 20 bis 60°C, vorzugsweise 30 bis 40°C bei einem pH auf der schwach sauren Seite von 3,5 bis 6,5, vorzugsweise 4,0 bis 5,0, erzielt. Wenn die Mutante der sauren Phosphatase mit einer erhöhten Temperaturbeständigkeit verwendet wird, beträgt die Reaktionstemperatur 20 bis 70°C, vorzugsweise 30 bis 60°C. Die Reaktion kann unter Anwendung jeder beliebigen stationären Methode und Methode unter Rühren durchgeführt werden. Die Reaktionsdauer schwankt in Abhängigkeit von den Bedingungen, wie der Aktivität des zu verwendenden Enzyms und der Konzentration des Substrats, beträgt jedoch 1 bis 100 Stunden.
Der so hergestellte Nucleosid-5'-phosphatester kann nach Beendigung der Reaktion aus dem Gemisch abgetrennt und gewonnen werden, indem eine Methode unter Verwendung eines synthetischen Harzes zur Adsorption, eine Methode der Anwendung eines Fällungsmittels und andere übliche Methoden zum Gewinnen und Abtrennen angewendet werden.
BEISPIELE
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nachstehend unter Bezugnahme auf Beispiele speziell erläutert, die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Die Transphosphorylierungsaktivität wurde unter folgenden Bedingungen unter Verwendung von Inosin als Substrat gemessen. Die Reaktion wurde bei einem pH von 5,0 bei 40°C während 10 Minuten in einer Reaktionslösung (1 ml) durchgeführt, die 40 μmol/ml Inosin, 100 μmol/ml Natriumpyrophosphat, 100 μmol/ml Natriumacetat-Puffer (pH 5,0) und ein Enzym enthielt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 200 μl 2 n Chlorwasserstoffsäure unterbrochen. Danach wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt. Die 5'-Inosinsäure, die durch die Transphosphorylierungsreaktion produziert worden war, wurde dann quantitativ bestimmt. Die Menge des Enzyms, die zur Herstellung von 1 μmol 5'-Inosinsäure pro 1 Minute unter diesen Standard-Reaktionsbedingungen benötigt wurde, wurde als 1 Einheit definiert.
Die Phosphormonosterase-Aktivität wurde unter Verwendung von 5'-Inosinsäure als Substrat unter folgenden Bedingungen gemessen. Die Reaktion wurde bei 30°C während 10 Minuten in einer Reaktionslösung (1 ml) durchgeführt, die 10 μmol/ml 5'-Inosinsäure, 100 μmol/ml MES/NaOH-Puffer (pH 6,0) und ein Enzym enthielt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 200 μl 2 n Chlorwasserstoffsäure unterbrochen. Danach wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt. Das durch die hydrolytische Reaktion gebildete Inosin wurde dann quantitativ bestimmt. Die Menge des Enzyms, die zur Produktion von 1 μmol Inosin pro 1 Minute unter diesen Standard-Reaktionsbedingungen benötigt wurde, wurde als 1 Einheit definiert.

Inosin und 5'-Inosinsäure wurden mit Hilfe der Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) unter den folgenden Bedingungen bestimmt.

Kolonne:	Cosmosil 5C18-AR (4,6 × 150 mm) (hergestellt von Nacalai Tesque);
Mobile Phase:	5 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 2,8)/Methanol = 95/5;
Fließrate:	1,0 ml/min.;
Temperatur:	Raumtemperatur;
Nachweis:	UV, 245 nm.

Im übrigen wurden in der Reaktion zur Herstellung von Nucleosid-5'-phosphatestern unter Verwendung von anderen Nucleosiden als Inosin als Ausgangsmaterialien die Nucleoside als Ausgangsmaterialien und die gebildeten Nucleosid-5'-phosphatester in der vorstehend beschriebenen Weise durch HPLC bestimmt.
Beispiel 1: Reinigung und Charakterisierung von saurer Phosphatase, die von Morganella morganii abgeleitet ist
Ein Nährmedium (pH 7,0, 50 ml), das 1 g/dl Pepton, 0,5 g/dl Hefeextrakt und 1 g/dl Natriumchlorid enthielt, wurde in Sakaguchi-Kolben (500 ml) gegeben und 20 Minuten bei 120°C sterilisiert. Eine Schrägkultur von Morganella morganii NCIMB 10466 wurde einmal mit Hilfe einer Platinöse in jeden der Kolben eingeimpft und dann bei 30°C während 16 Stunden unter Schütteln kultiviert. Mikrobenzellen (etwa 3.000 g), die durch Zentrifugieren aus der Kultur gewonnen wurden, wurden in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer (1 1, pH 7,0) suspendiert. Eine Ultraschallbehandlung wurde bei 4°C während 20 Minuten durchgeführt, um die Mikrobenzellen zu zerbrechen. Die behandelte Suspension wurde zentrifugiert, um die unlösliche Fraktion zu entfernen. Dabei wurde ein zellfreier Extrakt hergestellt. Zu dem zellfreien Extrakt wurde Ammoniumsulfat zugesetzt, so dass eine 30%ige Sättigung erreicht wurde. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt und dann wurde weiterhin Ammoniumsulfat zu dem Überstand gegeben, bis 60% Sättigung erreicht war. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer gelöst.
Diese rohe Enzymlosung wurde vier Mal gegen 5 1 100 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) dialysiert und wurde dann auf eine DEAE-Toyopeal 650M-Kolonne (⌀ 4,1 × 22 cm) aufgegeben, mit 20 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) äquilibriert war, wonach mit 800 ml 20 nM Kaliumphosphat-Puffer gewaschen wurde (pH 7,0). Die Transphosphorylierungsaktivität wurde in einer Fraktion gefunden, die die Kolonne passierte, und diese Fraktion wurde daher gewonnen.
Die Fraktion wurde mit Ammoniumsulfat versetzt, so dass eine 35%ige Sättigung erreicht wurde, dann an einer Butyl-Toyopeal-Kolonne (⌀ 3,1 × 26 cm) adsorbiert, die mit 20 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) äquilibriert war, der Ammoniumsulfat in 35%iger Sättigung enthielt. Die Elution erfolgte unter Verwendung eines linearen Konzentrationsgradienten von 35% Sättigung bis 20% Sättigung mit Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0).
Aktive Fraktionen wurden gewonnen und gegen 1 1 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) dialysiert, wonach sie auf eine Hydroxylapatit-Kolonne (Durchmesser 5 × 6,5 cm) aufgebracht wurden, die mit 50 mM Kaliumphosphat-Puffer äquilibriert war (pH 7,0). Die Elution erfolgte unter Anwendung eines linearen Konzentrationsgradienten von 50 mM bis 300 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0).
Die aktiven Fraktionen wurden gewonnen und durch Ultrafiltration konzentriert. Diese Enzymlösung wurde auf eine HiLoad TM 16/60 Superdex 200-Kolonne (hergestellt von Pharmacia) aufgebracht. Die Elution erfolgte in einer Fließrate von 1,0 ml/Minute unter Verwendung eines 50 mM Kaliumphosphat-Puffers, der 100 mM Natriumchlorid enthielt.
Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren wurde das Enzym, welches Transphosphorylierungsaktivität zeigte, aus dem zellfreien Extrakt etwa 550-fach gereinigt bei einer Gewinnungsrate von etwa 10%. Die spezifische Aktivität und das Gewinnungsverhältnis dieses Reinigungsverfahrens sind in Tabelle 1 gezeigt. Diese Enzymprobe war bei der Elektrophorese an SDS-Polyacrylamidgel homogen.
Tabelle 1
Das gereinigte Enzym hatte folgende Eigenschaften.

(1) Wirkung: Eine Phosphatgruppe wird von einem Phosphatgruppen-Donor, wie einer Polyphosphorsäure, auf ein Nucleosid übertragen und es wird ein Nucleosid-5'-phosphatester gebildet. Umgekehrt besitzt dieses Enzym auch Aktivität für die Hydrolyse des Phosphatesters.
(2) Substratspezifität: Substrate, die bei der Transphosphorylierungsreaktion als Phosphatgruppen-Donor dienen, umfassen beispielsweise Pyrophosphorsäure, Tripolyphosphorsäure, Trimetaphosphorsäure, Tetrametaphosphorsäure, Hexametaphosphorsäure, Dinatriumphenylphosphat, Dikaliumphenylphosphat, O,O-Diphenylphosphorsäureanhydrid, Dinatriumcarbamylphosphat, Dikaliumcarbamylphosphat, Diammoniumcarbamylphosphat und Dilithiumcarbamylphosphat. Substrate, die als Phosphatgruppenakzeptor dienen, umfassen beispielsweise Purinribosid, Inosin, Guanosin, Adenosin, Xanthosin, Uridin und Cytidin. Andererseits gehören zu Substraten, welche der Einwirkung in der Reaktion zur Hydrolyse des Phosphatesters unterliegen, beispielsweise anorganische Phosphorsäuren, wie Pyrophosphorsaure, Tripolyphosphorsäure, Trimetaphosphorsäure, Tetrametaphosphorsäure, Hexametaphosphorsäure, Phosphatester, wie Dinatriumphenylphosphat, Dikaliumphenylphosphat, O,O-Diphenylphosphorsäureanhydrid, Dinatriumcarbamylphosphat, Dikaliumcarbamylphosphat, Diammoniumcarbamylphosphat und Dilithiumcarbamylphosphat, und 5'-Nucleotide, wie 5'-Purinribotid, 5'-Inosinsäure, 5'-Guanylsäure, 5'-Adenylsäure, 5'-Xanthylsäure, 5'-Uridylsäure und 5'-Cytidylsäure.
(3) Optimaler pH: 5,2 (Transphosphorylierungsreaktion), 6.5 (Phosphatester-Hydrolysereaktion).
(4) pH-Stabilität: pH 3,0 bis 12,0 (Behandlung bei 30°C während 60 Minuten.
(5) Optimale Temperatur: Etwa 35°C.
(6) Temperaturbeständigkeit: Beständig bis 30°C (Behandlung bei pH 7,0 während 30 Minuten).
(7) Effekt der Zugabe von Metallionen und Inhibitor: Dieses Enzym zeigt keine Aktivierung seiner Aktivität durch die Zugabe eines Metallions. Die Aktivität wird inhibiert durch Ag²⁺, Pb²⁺, Hg²⁺ und Cu²⁺. Die Aktivität wird außerdem durch Iodessigsäure inhibiert.
(8) Molekulargewicht: Gemäß der Hochleistungs-Flüssigchromatographie (TSKgel G-3000SW, hergestellt von Toyo Soda) ist das berechnete Molekulargewicht etwa 190.000.
(9) Molekulargewicht der Untereinheit: Gemäß der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese beträgt das errechnete Molekulargewicht der Untereinheit etwa 25.000.

Dieses Enzym zeigt nicht nur Aktivität für die Übertragung , einer Phosphatgruppe auf ein Nucleosid, sondern auch die gegensätzliche Aktivität für die Hydrolyse des Phosphatesters. Außerdem zeigt dieses Enzym eine hydrolytische Aktivität für Phosphatester (Phosphomonoesteraseaktivität), die nicht weniger als das 20-fache der Transphosphorylierungs-Aktivität beträgt. Andere Eigenschaften sind in guter Übereinstimmung mit denen einer bekannten sauren Phosphatase, die durch ein Bakterium des Genus Morganella produziert wird (Microbiology, 140, S. 1341–1350 (1994)).
Es wurde somit klargestellt, dass dieses Enzym eine saure Phosphatase ist.
10 g/dl Natriumpyrophosphat und 2 g/dl Inosin wurden in Natriumacetat-Puffern gelöst, die jeweils einen pH-Wert von 5,5, 5,0, 4,5, 4,0 bzw. 3,5 hatten, zu denen die vorstehend beschriebene Enzymprobe zugesetzt wurde, so dass eine Konzentration von 50 Einheiten/dl erhalten wurde. Das Reaktionsgemische wurde 6 Stunden bei 30°C inkubiert, während der pH-Wert jeweils aufrecht erhalten wurde, und die Menge der gebildeten 5'-Inosinsäure wurde im Verlauf der Zeit gemessen. Die produzierte Inosinsäure enthielt nur 5'-Inosinsäure. Es wurde keinerlei Bildung von 2'-Inosinsäure und 3'-Inosinsäure als Nebenprodukt beobachtet. Das Ergebnis ist in 1 gezeigt. Die Geschwindigkeit der Bildung von 5'-Inosinsäure hatte ein Maximum bei pH 5,0. Jedoch die höchste angereicherte Menge an 5'-Inosinsäure war bei einem niedrigeren pH höher. Die Reaktionsbedingung eines pH-Werts von 4,0 war am wirksamsten für die Produktion von 5'-Inosinsäure, wobei 5'-Inosinsäure in einer Menge von 2,60 g/dl gebildet und angereichert wurde, indem die Reaktion während 3 Stunden durchgeführt wurde.
Beispiel 2: Phosphorylierungsreaktion von verschiedenen Nucleosiden durch eine Probe der sauren Phosphatase, die vorn Morganella morganii abgeleitet ist
10 g/dl Natriumpyrophosphat und 2 g/dl Inosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin als Phosphatgruppen-Akzeptor wurden in Natriumacetat-Puffer (pH 4,0) gelöst, zu dem die in Beispiel 1 hergestellte Enzymprobe zugesetzt wurde, so dass ihre Konzentration 50 Einheiten/dl betrug. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei 30°C inkubiert, während der pH bei 4,0 gehalten wurde. Die Menge des durch die Reaktion gebildeten Nucleosid-5'-esters ist in Tabelle 2 gezeigt.
Das gebildete Nucleotid enthielt nur Nucleosid-5'-ester. Es wurde keinerlei Bildung von Nucleosid-2'-ester und Nucleosid-3'-ester als Nebenprodukt beobachtet.
Tabelle 2
Beispiel 3: Produktion von 5'-Inosinsäure aus verschiedenen Phosphatverbindungen als Phosphatgruppen-Donoren durch eine Probe der sauren Phosphatase von Morganella morganii
Inosin (2 g/dl) und Natriumtripolyphosphat, Natriumpolyphosphat (Handelsname: Polygon P, hergestellt von Chiyoda Chemical), Dinatriumphenylphosphat oder Dinatriumcarbamylphosphat (10 g/dl) als Phosphatgruppen-Donor wurden in einem Natriumacetat-Puffer (pH 4,0) gelöst, wozu die in Beispiel 1 hergestellte Enzymprobe zugesetzt wurde, so dass ihre Konzentration 50 Einheiten/dl betrug. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei 30°C inkubiert, während der pH bei 4,0 gehalten wurde. Die durch die Reaktion gebildete Menge an 5'-Inosinsäure ist in Tabelle 3 gezeigt.
5'-Inosinsäure wurde bei Verwendung jedes der Phosphatgruppen-Donoren wirksam gebildet und angereichert.
Jedoch war die angereicherte Menge an 5'-Inosinsäure am höchsten, wenn Natriumpolyphosphat als Phosphatgruppen-Donor verwendet wurde.
Tabelle 3

Phosphatgruppen-Donor Gebildete 5'-Inosinsäure (g/dl)

Natriumtripolyphosphat 2,10

Natriumpolyphosphat 2,72

Dinatriumphenylphosphat 2,33

Dinatriumcarbamylphosphat 2,54
Beispiel 4: Reinigung und Charakterisierung der von Escherichia blattae abgeleiteten sauren Phosphatase
Ein Nährmedium (pH 7,0, 50 ml), das 1 g/dl Pepton, 0,5 g/dl Hefeextrakt und 1 g/dl Natriumchlorid enthielt, wurde in Sakaguchi-Kolben (500 ml) gegossen, die bei 120°C während 20 Minuten sterilisiert wurden. Eine Schrägkultur von Escherichia blattae JCM 1650 wurde einmal mit einer Platinöse in jeden der Kolben eingeimpft und dann 16 Stunden unter Schütteln bei 30°C kultiviert. Die Mikrobenzellen wurden durch Zentrifugieren aus der Kultur gewonnen. Die Mikrobenzellen (etwa 3.300 g) wurden in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer (11, pH 7,0) suspendiert. Eine Ultraschallbehandlung wurde 20 Minuten bei 4°C durchgeführt, um die Mikrobenzellen zu zerbrechen. Die behandelte Lösung wurde zentrifugiert, um deren unlösliche Fraktion zu entfernen. Dabei wurde ein zellfreier Extrakt hergestellt.
Zu dem zellfreien Extrakt wurde Ammoniumsulfat gegeben, so dass 30% Sättigung erreicht wurde. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt und dann wurde weiterhin Ammoniumsulfat dem Überstand zugesetzt, so dass 60% Sättigung erreicht wurde. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer gelöst.
Diese rohe Enzymlösung wurde 4 Mal gegen 5 1 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und wurde dann auf eine DEAE-TOYOPEAL 650M-Kolonne aufgegeben (⌀ 6,2 × 35 cm), die mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert worden war, wonach mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen wurde. Die Transphosphorylierungsaktivität wurde in einer Fraktion aufgefunden, welche die Kolonne passierte, und daher wurde diese Fraktion gewonnen.
Zu der aktiven Fraktion wurde Ammoniumsulfat gegeben, so dass 35% Sättigung erreicht wurde, und diese Fraktion wurde dann auf eine Butyl-Toyopeal-Kolonne aufgegeben (⌀ 5,0 × 22,5 cm), die mit 20 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0), der Ammoniumsulfat bis zu 35% Sättigung enthielt, äquilibriert war. Die Elution erfolgte unter Verwendung eines linearen Konzentrationsgradienten von 35% Sättigung bis 20% Sättigung eines Kaliumphosphat-Puffers (pH 7,0).
Aktive Fraktionen wurden gewonnen und gegen 1 Liter 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert, wonach sie auf eine Hydroxylapatit-Kolonne (⌀ 3,0 × 7,0 cm) aufgegeben wurden, die mit 100 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) äquilibriert war. Die Elution erfolgte unter Verwendung eines linearen Konzentrationsgradienten von 50 mM bis 100 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) wobei aktive Fraktionen gewonnen wurden.
Diese Enzymlösung wurde gegen 1 1 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,0) dialyisiert, wonach sie auf eine CM-Toyopearl-Kolonne (⌀ 2,0 × 14,0 cm) aufgebracht wurde, die mit 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,0) äquilibriert war. Die Elution erfolgte unter Anwendung eines linearen Konzentrationsgradienten in Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,0), der 0 mM bis 300 mM Kaliumchlorid enthielt. Die aus der Kolonne eluierten aktiven Fraktionen wurden gewonnen. Nach der vorstehend beschriebenen Verfahrensweise wurde das Transphosphorylierungsaktivität aufweisende Enzym aus dem zellfreien Extrakt gewonnen und auf etwa das 600-fache gereinigt. Das Gewinnungsverhältnis betrug etwa 16%. Die spezifische Aktivität und das Gewinnungsverhältnis bei diesem Reinigungsverfahren sind in Tabelle 4 gezeigt. Die Enzymprobe war homogen bei der Elektrophorese an SDS-Polyacrylamidgel.
Tabelle 4
Das gereinigte Enzym hatte die folgenden Eigenschaft.

(1) Wirkung: Eine Phosphatgruppe wird von einem Phosphatgruppen-Donor, wie einer Polyphosphorsäure, auf ein Nucleosid übertragen, und ein Nucleosid-5'-phosphatester wird hergestellt. Umgekehrt zeigt dieses Enzym auch Aktivität für die Hydrolyse des Phosphatesters.
(2) Substratspezifität: Zu Phosphatgruppen-Donoren in der Transphosphorylierungsreaktion gehören beispielsweise Pyrophosphorsäure, Tripolyphosphorsäure, Trimetaphosphorsäure, Tetrametaphosphorsäure, Hexametaphosphorsäure, Dinatriumphenylphosphat, Dikaliumphenylphosphat, O,O-Diphenylphosphorsäureanhydrid, Dinatriumcarbamylphosphat, Dikaliumcarbamylphosphat, Diammoniumcarbamylphosphat und Dilithiumcarbamylphosphat. Geeignete Phosphatgruppen-Akzeptoren umfassen beispielsweise Purinribosid, Inosin, Guanosin, Adenosin, Xanthosin, Uridin und Cytidin. Andererseits gehören zu Verbindungen, welche der Einwirkung in der Phosphatester-Hydrolysereaktion unterliegen, beispielsweise anorganische Phosphorsäuren, wie Pyrophosphorsäure, Tripolyphosphorsäure, Trimetaphosphorsäure, Tetrametaphosphorsäure, Hexametaphosphorsäure, Phosphatester, wie Dinatriumphenylphosphat, Dikaliumphenylphosphat, O,O-Diphenylphosphorsäureanhydrid, Dinatriumcarbamylphosphat, Dikaliumcarbamylphosphat, Diammoniumcarbamylphosphat und Dilithiumcarbamylphosphat, und 5'-Nucleotide, wie 5'-Purinribotid, 5'-Inosinsäure, 5'-Guanylsäure,-5'-Adenylsäure, 5'- Xanthylsäure, 5'-Uridylsäure und 5'-Cytidylsäure.
(3) Optimaler pH: 5,2 (Transphosphorylierungsreaktion), 6,5 (Hydrolysereaktion des Phosphatesters).
(4) pH-Stabilität: pH 3,5 bis 12,0 (Behandlung bei 30°C während 60 Minuten).
(5) Optimale Temperatur: Etwa 35°C.
(6) Temperaturstabilität: Beständig bis 40°C (Behandlung bei pH 7,0 während 30 Minuten).
(7) Wirkung des Zusatzes von Metallion und Inhibitor: Dieses Enzym zeigt keine Aktivierung seiner Aktivität durch Zugabe irgend eines Metallions. Die Aktivität wird durch Fe²⁺, Ag²⁺, Pb²⁺, Hg²⁺ und Cu²⁺ inhibiert. Die Aktivität wird außerdem durch Iodessigsäure inhibiert.
(8) Molekulargewicht: Das errechnete Molekulargewicht ist etwa 188.000 gemäß Hochleistungs-Flüssigchromatographie (TSKgel G-3000SW, hergestellt von Toyo Soda).
(9) Molekulargewicht der Untereinheit: Das berechnete Molekulargewicht der Untereinheit ist etwa 24.500 gemäß der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

Dieses Enzym zeigt nicht nur Aktivität für die Übertragung von Phosphatgruppen auf Nucleoside, sondern auch die umgekehrte Aktivität zur Hydrolyse von Phosphatestern in gleicher Weise, wie das Enzym, das aus dem zellfreien Extrakt von Morganella morganii NCIMB 10466 gewonnen und gereinigt wurde. Außerdem zeigt dieses Enzym eine hydrolytische Aktivität gegenüber Phosphatester (Phosphomonoesteraseaktivität), die nicht . weniger als das 30-fache der Transphosphorylisierungsaktivität ist. Es wurde damit klargestellt, dass dieses Enzym eine saure Phosphatase ist.
Natriumpyrophosphat (15 g/dl) und Inosin (3g/dl) wurden in Natriumacetat-Pufferlösungen gelöst, die jeweils pH-Werte von 5,5, 5,0, 4,5, 4,0 bzw. 3,5 hatten. Die vorstehend beschriebene Enzymprobe wurde zu diesen gegeben, so dass eine Konzentration von 50 Einheiten/dl erhalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 6 Stunden bei 30°C inkubiert, während jeweils der pH-Wert aufrecht erhalten wurde und die Menge der gebildeten 5'-Inosinsäure wurde im Verlauf der Zeit gemessen. Die gebildete Inosinsäure enthielt nur 5'-Inosinsäure. Es wurde keine Bildung von 2'-Inosinsäure und 3'-Insosinsäure als Nebenprodukt beobachtet. Das Ergebnis ist in 2 gezeigt. Die Bildungsgeschwindigkeit der 5'-Inosinsäure hatte bei pH 5,0 ein Maximum. Jedoch war die maximale angereicherte Menge an 5'-Inosinsäure bei einem niedrigeren pH-Wert höher. Die Reaktionsbedingung von pH 4,0 war zur Herstellung von 5'-Inosinsäure am wirksamsten. 5'-Inosinsäure wurde in einer Menge von 1,56 g/dl gebildet und angereichert, wenn die Reaktion bei 30°C und einem pH-Wert von 4,0 während 3 Stunden durchgeführt wurde.
Beispiel 5: Phosphorylierungsreaktion von verschiedenen Nucleosiden durch eine Probe der sauren Phosphatase, die von Escherichia blattae abgeleitet ist
Natriumpyrophosphat (15 g/dl) und Inosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin (3g/dl) wurden in Natriumacetat-Puffer (pH 4,0) gelöst, wozu die in Beispiel 4 hergestellte Enzymprobe zugefügt wurde, so dass deren Konzentration 50 Einheiten/dl betrug. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei 35°C inkubiert, während der pH-Wert bei 4,0 gehalten wurde. Die Menge des gebildeten Nucleosid-5'-esters ist in Tabelle 5 gezeigt.
Das gebildete Nucleotid enthielt nur Nucleosid-5'-ester. Es wurde keinerlei Bildung von Nucleosid-2'-ester und Nucleosid-3'-ester als Nebenprodukte beobachtet.
Tabelle 5
Beispiel 6: Produktion von 5'-Inosinsäure aus verschiedenen Phosphatverbindungen als Phosphatgruppen-Donoren durch eine Probe der sauren Phosphatase, die von Escherichia blattae abgeleitet ist
Inosin (2 g/dl) und Natriumtripolyphosphat, Natriumpolyphosphat (Handelsname: Polygon P, hergestellt von Chiyoda Chemical), Dinatriumphenylphosphat oder Dinatriumcarbamylphosphat (10 g/dl) als Phosphatgruppen-Donor wurde in Natriumacetat-Puffer (pH 4,0) gelöst. Dazu wurde die in Beispiel 4 hergestellte Enzymprobe zugegeben, so dass ihre Konzentration 50 Einheiten/dl betrug. Das Reaktiosgemisch wurde 3 Stunden bei 35°C inkubiert, während der pH bei 4,0 gehalten wurde. Die Menge der gebildeten 5'-Inosinsäure ist in Tabelle 6 gezeigt.
5'-Inosinsäure wurde bei Verwendung jedes der Phosphatgruppen-Donoren wirksam gebildet und angereichert. Jedoch war die angereicherte Menge an 5'-Inosinsäure am höchsten, wenn Natriumpolyphosphat als Phosphatgruppen-Donor verwendet wurde.
Tabelle 6

Phosphatgruppen-Donor Gebildete 5'-Inosinsäure (g/dl)

Natriumtripolyphosphat 1,20

Natriumpolyphosphat 1,79

Dinatriumphenylphosphat 1,50

Dinatriumcarbamylphosphat 1,53
Beispiel 7: Isolierung des für saure Phosphatase codierenden Gens aus dem Chromosom von Morganella morganii
(1) Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die saure Phosphatase, die aus dem zellfreien Extrakt von Morganella morganii NCIMB 10466 nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode gewonnen und gereinigt wurde, wurde an einer DITC-Membran (hergestellt von Milligen/Biosearch) adsorbiert und die N-terminale Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung eines Prosequencer 6625 (hergestellt von Milligen/Biosearch) bestimmt. Die N-terminale Aminosäuresequenz, die 20 Reste enthält, wurde bestimmt und ist in SEQ ID NR. 1 in der Sequenzliste gezeigt.
(2) Isolierung eines DNA-Fragments, welches das für saure Phosphatase codierende Gen enthält
Chromosomale DNA wurde aus einer Kultur von Mikrobenzellen von Morganella morganii NCIMB 10466 nach der Methode von Murray und Thomson (Nucl. Acid Res., 4321, 8 (1980)) extrahiert. Die chromosomale DNA wurde mit Hilfe des Restriktionsenzyms Sau3AI partiell abgebaut. Danach wurden DNA-Fragmente von 3 bis 6 kbp mit Hilfe der Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugierung fraktioniert. Ein Plasmidvektor pUC118 (hergestellt von Takara Shuzo) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut, und dann mit den partiell abgebauten chromosomalen DNA-Fragmenten ligiert. Die DNA-Ligierung erfolgte unter Verwendung eines DNA-Ligations-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) gemäß einer angegebenen Methode. Danach wurde Escherichia coli JM109 (hergestellt von Takara Shuzo) mit dem erhaltenen DNA-Gemisch nach einer üblichen Methode transformiert. Die Transformanten wurden auf einem L-Agarmedium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen und wurden zur Herstellung einer Genbibliothek gezüchtet.
Eine Reaktionslösung, die 4 mM p-Nitrophenylphosphorsäure und 100 mM MES/NaOH-Puffer (pH 6,5) enthielt, wurde auf die Oberfläche des Agarmediums, auf dem die Transformanten gezüchtet wurden, gegossen und die Temperatur wurde 15 Minuten lang bei 30°C gehalten. Stämme, welche die Phosphataseaktivität exprimierten, setzten p-Nitrophenol frei und zeigten eine Gelbfärbung. Unter Verwendung dieser Erscheinung als Indikator wurden daher Transformanten selektiert. Als Ergebnis der Selektion einer Gen-Expressionsbibliothek, die etwa 20.000 Transformantenstämme umfasste, wurden 30 Transformantenstämme erhalten, welche Phosphataseaktivität exprimierten.
Die Transformanten (30 Stämme), welche die Phosphataseaktivität exprimiert hatten, wurden der Isolierung von einzelnen Kolonien unterworfen. Einzelne Kolonien wurden auf ein L-Medium (2,5 ml), das 100μg/ml Ampicillin enthielt, aufgeimpft und wurden 16 Stunden bei 37°C kultiviert. Natriumacetat-Puffer (100 mM, pH 5,0, 50 μl), der Inosin (2 g/dl) und Natriumpyrophosphat (10 g/dl) enthielt, wurde zu den aus der Kultur gewonnen Mikrobenzellen gegeben und das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunde bei 30°C inkubiert. Die Produktion von 5'-Inosinsäure wurde durch HPLC-Analyse bestimmt, so dass Mikrobenstämme mit Transphosphorylierungsaktivität selektiert wurden. Als Ergebnis wurden erfolgreich 5 Stämme von Transformanten erhalten, die Transphosphorylierungsaktivität zeigten und von denen angenommen wurde, dass sie ein DNA-Fragment tragen, welches das gewünschte Gen für saure Phosphatase enthält.
Beispiel 8: Bestimmung der Nucleotidsequenz eines Gens für saure Phosphatase, das von Morganella morganii NCIMB 10466 abgeleitet ist
Das eingefügte DNA-Fragment wurde analysiert, indem ein Plasmid mit Hilfe einer Methode der alkahischen Lyse (Molecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook, E. F. Fritsch aund T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, S. 25 (1989)) aus einem Stamm der Transformanten hergestellt wurde, von dem angenommen wurde, dass er das DNA-Fragment beherbergt., welches das in Beispiel 7 erhaltene, von Morganelle morganii NCIMB 10466 abgeleitete Gen für saure Phosphatase enthält.
Dieses Plasmid wurde als pMPI501 bezeichnet. 3 zeigt die ermittelte Restriktionsenzym-Karte des insertierten DNA- Fragments.
Die Region des sauren Phosphatase-Gens wurde durch Subklonen weiter spezifiziert. Als Ergebnis wird angenommen, dass dieses Gen für saure Phosphatase in einem Fragment einer Größe von 1,2 Kbp enthalten war, das durch die Restriktionsenzyme HindIII und EcoRI ausgeschnitten wurde. Um die Nucleotidsequenz zu bestimmen, wurde Plasmid DNA konstruiert, in der das Fragment von 1,2 kbp mit pUC118 ligiert wurde, welches mit HindIII und EcoRI gespalten worden war.
Escherichia coli JM109 (hergestellt von Takara Shuzo) wurde nach einer üblichen Methode mit dieser als pMPI505 bezeichneten Plasmid-DNA transformiert und wurde dann auf ein L-Agarmedium ausgestrichen, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, um einen Transformanten zu erhalten.
Das Plasmid wurde aus dem Transformanten von Escherichia coli JM109 (hergestellt von Takara Shuzo), der pMPI505 beherbergte, mit Hilfe der alkalischen Lysemethode extrahiert, um die Nucleotidsequenz zu bestimmen. Die Nucleotidsequenz wurde mit Hilfe einer Methode von Sanger (J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)) bestimmt, indem ein Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (hergestellt von Applied Biochemical) verwendet wurde. Die Nucleotidsequenz eines bestimmten offenen Leserahmens ist in SEQ ID No. 2 in der Sequenzliste gezeigt. Die Aminosäuresequenz des Proteins, die von der Nucleotidsequenz abgeleitet ist, ist in SEQ ID NR. 3 in der Sequenzliste gezeigt. Eine Teilsequenz, die vollständig mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten Enzyms übereinstimmte, wurde in der Aminosäuresequenz gefunden. Der N-Terminus des gereinigten Enzyms beginnt mit dem 21. Alaninrest der in SEQ ID NR. 3 gezeigten Sequenz. Es wird daher angenommen, dass die in SEQ ID NR. 3 gezeigte Aminosäuresequenz die eines Vorläuferproteins ist und dass ein Peptid, welches den Bereich von dem ersten Methioninrest bis zum dem 20. Alaninrest umfasst, nach der Translation eliminiert wird. Die somit abgeleitete Aminosäuresequenz des reifen Proteins ist in SEQ ID NR. 4 in der Sequenzliste gezeigt. Das Molekulargewicht des reifen Proteins, das aus der Aminosäuresequenz bestimmt wurde, wird zu 24,9 Kilodalton berechnet, was in guter Übereinstimmung mit dem Ergebnis der SDS-PAGE des gereinigten Enzyms ist. In Übereinstimmung mit den vorstehend beschriebenen Ergebnissen und wegen der Tatsache, dass ein Transformant, der ein Plasmid, welches dieses Fragment enthält, beherbergte, Transphosphorylierungsaktivität zeigte, wurde festgelegt, dass dieser offene Leseraster der Bereich war, der für die angestrebte saure Phosphatase codiert.
Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz wurden jeweils mit bekannten Sequenzen auf Homologie verglichen. Dazu wurden EMBL- und SWISS-PROT-Datenbanken verwendet. Als Ergebnis wurde gefunden, dass die in SEQ ID NR. 2 in der Sequenzliste gezeigte Nucleotidsequenz mit der Nucleotidsequenz eines bekannten, von Morganella morganii abgeleiteten sauren Phosphatase-Gens übereinstimmt (Thaller, M. C. et al., Microbiology, 140, 1341 (1994)), mit der Ausnahme, dass in der letzteren folgende Unterschiede existieren: Das 54. G ist A, das 72. G ist A, das 276. T ist G, das 378. T ist C, das 420. G ist T, das 525. C ist G, das 529. C ist T und das 531. G ist A und dass die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR. 4 in der Sequenzliste gezeigt ist, die gleiche wie die des von Morganella morganii abgeleiteten sauren Phosphatase-Gens ist. Das Gen, das für das Protein codiert, welches die in SEQ ID NR. 4 in der Sequenzliste gezeigte Aminosäuresequenz enthält, ist das Gen für saure Phosphatase von Morganella morganii NCIMB 10466.
Das Vorläuferprotein enthält 249 Aminosäuren und das von dieser Sequenz abgeleitete Molekulargewicht des Proteins ist 27,0 Kilodalton.
Der Stamm von Escherichia coli JM109, der mit dem Plasmid pMPI505 transformiert ist, wurde als AJ13143 bezeichnet, und wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (Postadresse: 305, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan) am 23. Februar 1996 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags international hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer FERM BP-5422 erhalten.
Beispiel 9: Amplifikation der Aktivität durch Expression des von Morganella morganii NCIMB 10466 abgeleiteten Gens für saure Phosphatase
Das in Beispiel 8 konstruierte Escherichia coli JM109/mPI505 wurde auf ein L-Medium (50 ml) aufgeimpft, das 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt, und wurde 16 Stunden lang bei 37°C kultiviert. Die Mikrobenzellen wurden aus dieser Kultur durch Zentrifugieren gewonnen und wurden einmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Mikrobenzellen wurden in 100 mM Kaliumphosphatpuffer (5 ml, pH 7,2) suspendiert und wurden durch eine Behandlung mit Ultraschall während 20 Minuten bei 4°C aufgebrochen. Die behandelte Lösung wurde zum Entfernen einer unlöslichen Fraktion zentrifugiert, wobei ein zellfreier Extrakt hergestellt wurde.
Die Transphosphorylierungsaktivität des erhaltenen zellfreien Extrakts wurde bestimmt, wobei als Vergleich zellfreie Extrakte verwendet wurden, die aus den Bildtyp-Stämmen von Morganella morganii und Escherichia coli JM109, die mit dem Plasmid pUC118 in gleicher Weise, wie vorstehend beschrieben, transformiert worden waren. Das Ergebnis ist in Tabelle 7 gezeigt. In Escherichia coli JM109/pUC118 wurde keine Transphosphorylierungsaktivität festgestellt. Die Transphosphorylierungsaktivität war auch in dem Wildtyp-Stamm von Morganella morganii niedrig. Andererseits zeigte Escherichia coli JM109/pMPI505 eine hohe Transphosphorylierungsaktivität, die, angegeben als spezifische Aktivität, das 150-fache der des Wildtyp-Stamms von Morganella morganii betrug. Durch das Ergebnis wurde gezeigt, dass das eingeschleuste DNA-Fragment ermöglicht, dass Escherichia coli saure Phosphatase in hohem Ausmaß exprimiert.
Tabelle 7

Mikroorganismenstamm Transphosphorylierungsaktivität (Einheiten/mg)

Morganella morganii NCIMB 10466 0,008

Escherichia coli JM109/pUC118 nicht gefunden

Escherichia coli JM109/pMPI505 1,250
Beispiel 11: Isolierung des für saure Phosphatase Codierenden Gens aus dem Chromosom von Escherichia blattae
(1) Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die aus dem zellfreien Extrakt von Escherichia blattae JCM 1650 erhaltene und gereinigte saure Phosphatase wurde an einer DITC-Membran (hergestellt von Milligen/Biosearch) adsorbiert und ihre N-terminale Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung eines Prosequenzers 6625 (hergestellt von Milligen/Biosearch)' bestimmt. Es wurde eine N-terminale Aminosäuresequenz gefunden, welche die in SEQ ID NR. 8 in der Sequenzliste gezeigten 15 Reste enthielt.
(2) Isolierung des DNA-Fragments, welches das für saure Phosphatase codierende Gen enthält
Chromosiomale DNA wurde nach der Methode von Murray und Thomson (Nucl. Acid Res., 4321, 8 (1980)) aus den gezüchteten Zellen von Escherichia blattae JCM 1650 extrahiert. Die chromosomale DNA wurde mit Sau3AI partiell abgebaut. Danach wurden DNA-Fragmente von 3 bis 6 kbp mit Hilfe der Saccharose-Dichtgradienten-Zentrifugation fraktioniert. Ein Plasmidvektor pUC118 (hergestellt von Takara Shuzo) wurde mit BamHI verdaut und mit den partiell abgebauten chromosomalen DNA-Fragmenten ligiert. Die DNA-Ligierung erfolgte unter Verwendung eines DNA-Ligations-Kits (hergestellt von Takara. Shuzo) nach einer angegebenen Methode. Danach wurde Escherichia coli JM 109 (hergestellt von Takara Shuzo) mit Hilfe einer üblichen Methode mit dem erhaltenen DNA-Gemisch transformiert. Die Transformanten wurden auf ein L-Agarmedium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen und wurden gezüchtet, wobei eine Genbibliothek hergestellt wurde.
Eine Reaktionslösung, die 4 mM p-Nitrophenylphosphorsäure und 100 mM MES/NaOH-Puffer (pH 6,5) enthielt, wurde auf die Oberfläche des Agarmediums, auf dem die Transformanten gewachsen waren, gegossen und die Temperatur wurde 15 Minuten bei 30°C gehalten. Stämme, welche die Phosphataseaktivität exprimieten, setzten p-Nitrophenol frei und zeigten eine Gelbfärbung. Unter Ausnutzung dieser Erscheinung als Indikator wurden daher Transformanten selektiert. Als Ergebnis des Screenens einer chromosomalen Genexpressionsbibliothek, die etwa 8.000 Transformantentstämme enthielt, wurden 14 Transformantenstämme erhalten, welche Phosphataseaktivität exprimiert hatten.
Die Transformanten (14 Stämme), welche die Phosphataseaktivität exprimierten, wurden einer Einzelkolonie-Isolierung unterworfen. Einzelne Kolonien wurden auf ein L-Medium (2,5 ml), das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, geimpft und wurden 16 Stunden bei 37°C kultiviert. Natriumacetat-Puffer (100 mM, pH 5,0, 50 μl), der Inosin (2 g/dl) und Natriumpyrophosphat (10 g/dl) enthielt, wurde zu den aus der Kulturflüssigkeit gewonnenen Mikrobenzellen gegeben, um die Reaktion während 16 Stunden bei 30°C durchzuführen. Die Produktion von 5'-Inosinsäure wurde durch HPLC-Analyse nachgewiesen, wobei Stämme selektiert wurden, welche Transphosphorylierungsaktivität hatten. Als Ergebnis wurden erfolgreich 3 Stämme von Transformanten erhalten, welche Transphosphorylierungsaktivität zeigten und von welchen angenommen wurde, dass sie das DNA-Fragment beherbergten, welches das gewünschte saure Phosphatase-Gen enthält.
Beispiel 12: Bestimmung der Nucleotidsequenz des Gens für saure Phosphatase, das von Escherichia blattae JCM 1650 abgeleitet ist Das insertierte DNA-Fragment wurde analysiert, indem mit Hilfe der Alkali-Lysemethode ein Plasmid aus einem Stamm der Transformanten extrahiert wurde, von dem angenommen wurde, dass er das saure Phosphatase-Gen, abgeleitet von Escherichia blattae JCM 1650, das in Beispiel 11 erhalten wurde, beherbergte. Dieses Plasmid wurde als pEPI301 bezeichnet. Die 5 zeigt die Restriktionsenzym-Karte, die für das insertierte DNA-Fragment bestimmt wurde.
Die Region des Gens für saure Phosphatase wurde durch Subklonieren weiter spezifiziert. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass dieses saure Phosphatase-Gen in einem Fragment einer Größe von 2,4 Kbp vorlag, das durch die Restriktionsenzyme ClaI und BamHI ausgeschnitten wurde. Um die Nucleotidsequenz zu bestimmen, wurde daher Plasmid DNA konstruiert, in welcher das Fragment mit pBluescript KS (+) (hergestellt von Stratagene) ligiert wurde, welches mit ClaI und BamHI geschnitten worden war. Escherichia coli JM109 (hergestellt von Takara Shuzo) wurde mit der als pEPI305 bezeichneten Plasmid-DNA nach einer üblichen Methode transformiert und dann auf einem L-Agarmedium ausgestrichen, welches 100 μg/ml Ampicillin enthielt, um einen Transformanten herzustellen.
Das Plasmid wurde aus dem Transformanten von Escherichia coli JM109 (hergestellt von Takara Shuzo), der pEPI305 beherbergte, durch Alkali-Lyse extrahiert, um die Nucleotidsequenz zu bestimmen. Eine Nucleotidsequenz mit dem bestimmten offenen Leseraster ist in SEQ ID NR. 6 in der Sequenzliste gezeigt. Die Aminosäuresequenz des Proteins, die von der Nucleotidsequenz abgeleitet wurde, ist in SEQ ID NR. 7 in der Sequenzliste dargestellt. Eine Teilsequenz, die völlig mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten Enzyms übereinstimmte, wurde in der Aminosäuresequenz aufgefunden. Das N-Ende des gereinigten Enzyms startet mit dem 19. Leucinrest der in SEQ ID NR. 7 gezeigten Sequenz. Es wird daher angenommen, dass die in SEQ ID NR. 7 gezeigte Aminosäuresequenz die eines Vorläuferproteins ist und dass ein Peptid, welches den Bereich von dem ersten Methioninrest bis zu dem 18. Alaninrest umfasst, nach der Translation eliminiert wird. Die so abgeleitete Aminosäuresequenz des reifen Proteins ist in SEQ ID NR. 8 in der Sequenzliste gezeigt. Das geschätzte Molekulargewicht des reifen Proteins wird somit zu 25,1 Kilodalton errechnet, was gut mit dem Ergebnis der SDS-PAGE für das gereinigte Enzym übereinstimmt. Mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Ergebnisse und wegen der Tatsache, dass der Transformant, der das dieses Fragment enthaltende Plasmid beherbergte, Transphosphorylierungsaktivität zeigte, wurde festgelegt, dass dieses offene Leseraster die Region ist, welche für die gewünschte saure Phosphatase codiert.
Das Gen, welches für das Protein codiert, das die in SEQ ID NR. 8 in der Sequenzliste gezeigte Aminosäuresequenz hat, ist das Gen für saure Phosphatase von Escherichia blattae JCM 1650.
Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz wurden jeweils mit bekannten Sequenzen verglichen, um Homologie festzustellen. Dabei wurden Datenbanken von EMBL und SWISS-PROT verwendet. Als Ergebnis wurde gefunden, dass das in SEQ ID NR. 8 gezeigte Protein und die für dieses codierende DNA neu sind. Ein Vorläuferprotein, das durch dieses Gen codiert wird, umfasst 249 Aminosäuren und das Molekulargewicht des Proteins, das von dieser Sequenz abgeleitet wurde, ist 27,0 Kilodalton.
Die Aminosäuresequenz wurde auf Homologie mit bekannten Sequenzen verglichen. Im Ergebnis zeigte dieses Protein einen hohen Grad der Homologie mit der sauren Phosphatase von Providencia stuartii (77,1%), mit der sauren Phosphatase von Morganella morganii gemäß Beispiel 8 (77,1%) und mit der sauren Phosphatase von Salmonella typhimurium (44,3%).
Der Stamm von Escherichia coli JM109, der mit dem Plasmid pEPI305 transformiert ist, wurde als AJ13144 bezeichnet und wurde am 23. Februar 1996 in dem National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (postal code: 305, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) unter den Bedingungen des Budapester Vertrags international hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer FERM BP-5423 erhalten.
Beispiel 13' Amplifikation der Aktivität durch Expression des Gens für saure Phosphatase, das von Escherichia blattae JCM 1650 abgeleitet ist
Das in Beispiel 12 konstruierte Escherichia coli JM109/pEPI305 wurde in ein L-Medium (50 ml), das 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt, eingeimpft und 16 Stunden lang bei 37°C kultiviert. Die Mikrobenzellen wurden durch Zentrifugieren aus der Kultur gewonnen und einmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Mikrobenzellen wurden in 100 mM Kaliumphosphatpuffer (5 ml, pH 7,2) suspendiert und durch Behandlung mit Ultraschall bei 4°C während 20 Minuten aufgebrochen. Die behandelte Lösung wurde zentrifugiert, um eine unlösliche Fraktion zu entfernen, wobei ein zellfreier Extrakt erhalten wurde.
Die Transphosphorylierungsaktivität des erhaltenen zellfreien Extrakts wurde in gleicher Weise, wie vorstehend beschrieben ist, bestimmt, wobei als Vergleichsproben zellfreie Extrakte verwendet wurden, die von den Wildtyp-Stämmen von Escherichia blattae und Escherichia coli JM109, die mit dem Plasmid pBluescript KS(+) wie oben beschrieben transformiert sind, verwendet wurden. Das Ergebnis ist in Tabelle 8 gezeigt. In Escherichia coli JM109/pBluescript KS(+) wurde keine Transphosphorylierungsaktivität gefunden. Auch in dem Stamm von Escherichia blattae des Wildtyps war die Transphosphorylierungsaktivität niedrig. Andererseits zeigte Escherichia coli JM109/pEPI305 eine hohe Transphosphorylierungsaktivität, die das 120-fache, als spezifische Aktivität, der des Wildtyp-Stamms von Escherichia blattae betrug. Durch dieses Ergebnis wurde gezeigt, dass das eingeschleuste DNA-Fragment ermöglicht, dass Escherichia coli die saure Phosphatase in einem hohen Grad exprimiert.

Tabelle 8

Mikroorganismen-Stamm	Transphosphorylierungs-Aktivität (Einheiten/mg)
Escherichia blattae JCM 1650	0,002
Escherichia coli JM109/bBluescript	KS(+) nicht nachgewiesen
Escherichia coli JM109/pEPI305	0,264

Beispiel 14: Herstellung von 5'-Inosinsäure aus Inosin unter Verwendung eines Stammes, der das aus Escherichia blattae JCM 1650 abgeleitete saure Phosphatase-Gen beherbergt
Natriumpyrophosphat (12 g/dl) und Inosin (6 g/dl) wurden in 100 mM Natriumacetat-Puffer (pH 4,0) gelöst, zu dem dann die vorstehend beschriebenen Mikrobenzellen von Escherichia coli JM109/pEPI305 gegeben wurden, wobei eine Zellkonzentration von 200 mg/dl, angegeben als Trockengewicht der Mikrobenzellen, erreicht wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Stunden bei 35°C inkubiert, während der pH-Wert bei 4,0 gehalten wurde, und die Menge der gebildeten 5'-Inosinsäure wurde im Verlauf der Zeit gemessen. Die gebildete Inosinsäure enthielt nur 5'-Inosinsäure. Es wurde keinerlei Bildung von 2'-Inosinsaure und 3'-Inosinsäure als Nebenprodukte beobachtet. Das Ergebnis ist in 6 gezeigt. 5'-Inosinsäure wurde in der Reaktion zur Bildung von 5'-Inosinsäure aus Pyrophosphat und Inosin unter Verwendung dieses Mikroorganismus in kurzer Zeit äußerst effizient gebildet und angereichert.
Beispiel 15: Herstellung eines Gens, das saure Phosphatase mit verminderter Phosphomonoesterase-Aktivität codiert ,
Wie in Beispielen 13 und 14 beschrieben wurde, exprimiert der Stamm, der das von Escherichia blattae abgeleitete Gen für saure Phosphatase beherbergt, eine beträchtliche Menge an saurer Phosphatase und bei der Reaktion zur Bildung von 5'-Inosinsäure aus Pyrophosphat und Inosin unter Verwendung dieses Mikroorganismus wird 5'-Inosinsäure extrem wirksam in kurzer Dauer gebildet und angereichert. Es zeigte sich jedoch, dass die angereicherte Menge an 5'-Inosinsäure einen bestimmten Grad nicht überschreitet, weil die gebildete 5'-Inosinsäure durch die Phosphomonoesterase-Aktivität, welche die saure Phosphatase selbst besitzt, abgebaut wird. Es wurde daher angestrebt, das Enzym zu verbessern, indem mit Hilfe der gerichteten Mutagenese-Methode unter Verwendung von PCR eine Mutation in das saure Phosphatase-Gen eingeführt wird, das von dem in Beispiel 11 klonierten Escherichia blattae abgeleitet ist.
Die in SEQ ID NR. 9, 10 und 11 in der Sequenzliste gezeigten Oligonucleotide MUT310 und MUT320 wurden mit Hilfe der Phosphoamidit-Methode mit Hilfe eines DNA-Synthesizers (Modell 394, hergestellt von Applied Biosystems) synthetisiert.
Das in Beispiel 12 hergestellte Plasmid pEPI305 (1 ng) als Matrize, M13-Primer RV (hergestellt von Takara Shuzo) und das Oligonucleotid MUT310 (jeweils 2,5 μmol) als Primer und Taq-DNA-Polymerase (2,5 Einheiten, hergestellt von Takara Shuzo) wurden zu 100 nM Tris-HCl-Puffer (pH 8,3, 100 μl) gegeben, der dATP, dCTP, dGTP, dTTP (jeweils 200 μM), Kaliumchlorid (50 mM) und Magnesiumchlorid (1,5 mM) enthielt, gegeben, wobei eine PCR-Reaktion durchgeführt wurde, in der ein Zyklus aus Perioden von 30 Sekunden bei 94°C, 2 Minuten bei 55°C und 3 Minuten bei 72°C 25 mal wiederholt wurde. Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der Vorrichtung Thermal Cycler Typ PJ2000 (hergestellt von Takara Shuzo) durchgeführt. Außerdem wurde eine PCR-Reaktion in gleicher Weise, wie oben beschrieben ist, unter Verwendung von Plasmid pEPI305 (1 ng) als Matrize und von M3-Primer Me (hergestellt von Takara Shuzo) und dem Oligonucleotid MUT300 (jeweils 2,5 μmol) als Primer durchgeführt. Jede der Reaktionslösungen wurde durch Gelfiltration gereinigt, um die Primer zu entfernen, wofür eine Microspin-Kolonne S-400 (hergestellt von Pharmacia) verwendet wurde.
Jedes der PCR-Reaktionsprodukte (1 μl) wurde in 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,3, 95 μl) gegeben, der dATP, dCTP, dGTP, dTTP (jeweils 200 μM), 50 mM Kaliumchlorid und 1,5 mM Magnesiumchlorid enthielt und es wurde 10 Minuten auf 94°C erhitzt, wonach über 60 Minuten auf 37°C abgekühlt wurde. Danach wurde die Temperatur 15 Minuten bei 37°C gehalten, um eine Heteroduplex zu bilden. Dazu wurde Taq DNA-Polymerase (2,5 Einheiten) zugesetzt, um eine Reaktion während 3 Minuten bei 72°C durchzuführen, so dass die Heteroduplex vervollständigt wurde. Danach wurden zu dieser Reaktionslösung M13-Primer RV und M13-Primer M3 (jeweils 2,5 μmol) gegeben, um eine PCR-Reaktion durchzuführen, in der ein Zyklus aus Perioden von 30 Sekunden bei 94°C, 2 Minuten bei 55°C und 3 Minuten bei 72°C 10 Mal wiederholt wurde.
Das Produkt der zweiten PCR-Reaktion wurde mit ClaI und BamHI verdaut, wonach die Extraktion mit Phenol/Chloroform und die Fällung mit Ethanol erfolgte. Dieses DNA-Fragment wurde mit pBluescript KS(+) ligiert, welches mit ClaI und BamHI verdaut worden war. Escherichia coli JM109 (hergestellt von Takara Shuzo) wurde nach einer üblichen Methode mit der erhaltenen Plasmid-DNA transformiert und auf ein L-Agarmedium gestrichen, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, um einen Transformanten zu erhalten.
Das Plasmid wurde aus dem Transformanten durch Alkali-Lyse extrahiert, um die Nucleotidsequenz zu bestimmen, wobei bestätigt wurde, dass das bestimmte Nucleotid substituiert war. Somit wurde eine Gen-Mutante, die für eine mutierte Phosphatase codierte, hergestellt, in der der 74. Glycinrest (GGG) des reifen Proteins durch einen Asparaginsäurerest (G*A*T) ersetzt war. Das Plasmid, das diese Gen-Mutante enthielt, wurde als pEPI310 bezeichnet.
Nach der vorstehend beschriebenen Verfahrensweise wurde unter Verwendung von pEPI305 als Matrize und der Ologonucleotide MUT300 und MUT320 als Primer eine Gen-Mutante, die für eine Phosphatase-Mutante codierte, hergestellt, in der der 153. Isoleucinrest (ATC) des reifen Proteins durch einen Threoninrest (A*CC) ersetzt war. Das dieses mutierte Gen enthaltende Plasmid wurde als pEPI320 bezeichnet. Außerdem wurde nach der gleichen Verfahrensweise, die vorstehend beschrieben ist, durch Verwendung von pEPI310 als Matrize und der Oligonucleotide MUT300 und MUT320 eine Gen-Mutante, die für eine Phosphatase-Mutante codierte, hergestellt, in der der 74. Glycinrest (GGG) des reifen Proteins durch einen Asparaginsäurerest (G*A*T) ersetzt war und der 153. Isoleucinrest (ATC) des reifen Proteins durch einen Threoninrest (A*CC) ersetzt war. Das Plasmid, das diese Gen-Mutante enthielt, wurde als pEPI330 bezeichnet.
Escherichia coli JM108/pEPI310, Escherichia coli JM109/pEPI320 und Escherichia coli JM109/pEPI330, in welche die Plasmide eingeführt worden waren, welche die jeweiligen saure Phosphatase-Genmutanten enthielten, und Escherichia coli JM109/pEPI305, in das das Plasmid eingeführt worden war, welches das saure Phosphatase-Gen des Wildtyps enthielt, wurden in ein L-Medium (50 ml) eingeimpft, welches 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt, und die Stämme wurden 16 Stunden bei 37°C kultiviert. Die Mikroorganismenzellen wurden aus ihrer Kultur gewonnen und wurden einmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Mikroorganismenzellen wurden in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer (5 ml, pH 7,0) suspendiert und durch eine Ultraschall-Behandlung, die 20 Minuten bei 4°C durchgeführt wurde, aufgebrochen. Die behandelten Lösungen wurden zentrifugiert, um unlösliche Fraktionen zu entfernen, und dabei wurden zellfreie Extrakte hergestellt. Die Phosphormonoesterase-Aktivität und die Transphosphorylierungs-Aktivität der erhaltenen zellfreien Extrakte wurden bei pH 4,0 gemessen und mit der Aktivität des Wildstammes verglichen.
Tabelle 9 zeigt das Ergebnis der Messung der Phosphomonoesterase-Aktivität und Transphosphorylierungs-Aktivität der sauren Phosphatase des Wildtyps und der sauren Phosphatasen mit erniedrigter Phosphomonoesterase-Aktivität. Es wird gezeigt, dass sowohl die Phosphomonoesterase-Aktivitäten als auch die Transphosphorylierungs-Aktivitäten der sauren Phosphatasen mit erniedrigter Phosphomonoesterase-Aktivität im Vergleich mit denen der sauren Phosphatase des Wildtyps erniedrigt sind und dass der Grad der Erniedrigung der Phosphomonoesterase-Aktivitäten größer ist als der der Transphosphorylierungs-Aktivitäten, so dass das Verhältnis von Phosphomonoesterase-Aktivität zu Transphosphorylierungs-Aktivität der Mutante der sauren Phosphatase im Vergleich mit der sauren Phosphatase des Wildtyps erniedrigt ist.
Tabelle 9
Beispiel 16: Herstellung von 5'-Inosinsäure aus Inosin unter Verwendung von Stämmen, die ein Gen beherbergen, welches für saure Phosphatase mit verminderter Phosphomonoesterase-Aktivität codiert.
Escherichia coli JM109/pEPI310, Escherichia coli JM109/pEPI320 und Escherichia coli JM109/pEPI330, in welche die Plasmide eingeschleust worden waren, welche die für saure Phosphatasen mit erniedrigter Phosphomonoesterase-Aktivität codierenden Gene enthielten, und Escherichia coli JM109/pEPI305, in den das Plasmid eingeführt worden war, welches das saure Phosphatase-Gen des Wildtyps enthielt, wurden in ein L-Medium (50 ml) eingeimpft, das 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt und wurden 16 Stunden bei 37°C kultiviert. Natriumpyrophosphat (12 g/dl) und Inosin (6 g/dl) wurden in Natriumacetat-Puffer (pH 4,0) gelöst und zu dieser Lösung wurden Mikrobenzellen jedes der durch die vorstehend beschriebene Kultivierung erhaltenen Stämme von Escherichia coli gegeben, so dass eine Zellkonzentration von 200 mg/dl, angegeben als Trockengewicht der Mikrobenzellen, erreicht wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 32 Stunden bei 35°C inkubiert, während der pH bei 4,0 gehalten. wurde, und die Menge der gebildeten 5'-Insosinsäure wurde im Verlauf der Zeit gemessen. Das Ergebnis ist in 8 gezeigt.
In 7 zeigt die Ordinate die Konzentration der 5'-Inosinsäure (mg/dl) an und die Abszisse gibt die Reaktionsdauer (b) an. Der Fortschritt der Reaktion ist durch ausgefüllte Kreise für Escherichia coli JM109/pEPI305, durch ausgefüllte Dreiecke für Escherichia coli JM109/pEPI310, durch leere Kreise für Escherichia coli JM109/pEPI320 und durch leere Quadrate für Escherichia coli JM109/pEPI330 angegeben, wobei unter Verwendung der Zellen der jeweiligen Stämme gemessen wurde.
Die Abbaugeschwindigkeit der gebildeten 5'-Inosinsäure war bei der Reaktion zur Bildung von 5'-Inosinsäure aus Inosin unter Verwendung der Stämme, welche die saure Phosphatase mit verminderter Phosphomonoesterase-Aktivität produzierten, vermindert. Als Ergebnis wurde die Ausbeute und die angereicherte Menge an 5'-Inosinsäure erhöht. Die größte Anreicherung von 5'-Inosinsäure wurde bei Verwendung von Escherichia coli JM109/pEPI330 als Stamm, der das die saure Phosphatase mit verminderter Phosphomonoesteraseaktivität codierende Gen beherbergte, erzielt, in der der 74. Glycinrest und der 153. Isoleucinrest durch einen Asparaginsäurerest bzw. duch einen Threoninrest ersetzt waren.
Beispiel 17: Herstellung von verschiedenen Nucleosid-5'-phosphatestern unter Verwendung der Stämme, welche ein Gen beherbergen, das saure Phosphatase mit erniedrigter Phosphomonoesteraseaktivität codiert
Escherichia coli JM109/pEPI330, in welches das Plasmid eingeschleust worden war, welches das für saure Phospatase mit erniedrigter Phosphomonoesteraseaktivität codierende Gen enthielt, wurde in ein L-Medium (50 ml), das 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt, geimpft und wurde 16 Stunden bei 37°C kultiviert.
Natriumpyrophosphat (12 g/dl) und Inosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin (6g/dl) als Phosphatgruppenakzetor wurden in 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 4,0) gelöst und dazu wurden die vorstehend beschriebenen Mikrobenzellen gegeben, so dass eine Zellkonzentration von 200 mg/dl, berechnet als Trockengewicht der Zellen, erreicht wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 32 Stunden bei 35°C inkubiert, während der pH bei 4,0 gehalten wurde. Die Mengen der gebildeten Nucleosid-5'-phosphatester sind in Tabelle 10 gezeigt. Die produzierten Nucleotide enthielten nur Nucleotid-5'-phosphatester. Es wurde keinerlei Bildung von Nucleosid-2'-phosphatestern und Nucleosid-3'-Phophatestern als Nebenprodukte beobachtet.
Tabelle 10
Beispiel 18: Herstellung von 5'-Inosinsäure aus verschiedenen Phosphatverbindungen als Phosphatgruppen-Donoren unter Verwendung der Stämme, die ein Gen, das saure Phosphatase mit erniedrigter Phosphomonoesteraseaktivität codiert, beherbergen
Escherichia coli JM109/pEPI330, in welches das Plasmid eingeführt worden war, welches eine Mutante des Gens für saure Phosphatase enthielt, wurde in ein L-Medium (50 ml) eingeimpft, das 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt, und 16. Stunden lang bei 37°C kultiviert.
Inosin (6 g/dl) und Natriumtripolyphosphat, Natriumpolyphosphat (Handelsname: Polygon P, hergestellt von Chiyoda .
Chemical), Dinatriumphenylphosphat oder Dinatriumcarbamylphosphat (12 g/dl) als Phosphatgruppen-Donor wurden in 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 4,0) gelöst, und dazu wurden die vorstehend beschriebenen Mikroorganismenzellen zugesetzt, bis eine Zellkonzentration von 200 mg/dl, umgerechnet auf das Trockengewicht der Zellen, erhalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 32 Stunden bei 35°C inkubiert, während der pH bei 4,0 gehalten wurde. Die Menge der gebildeten 5'-Inosinsäure ist in Tabelle 11 gezeigt. 5'-Inosinsäure wurde unter Verwendung jedes der Phosphatgruppen-Donoren wirksam produziert und angereichert. Jedoch war die angereicherte Menge 5'-Inosinsäure am höchsten, wenn Polyphosphorsäure als Phosphatgruppen-Donor verwendet wurde.
Tabelle 11

Phosphatgruppen-Donor Gebildete 5'-Inosinsäure (g/dl)

Natriumtripolyphosphat 5,96

Natriumpolyphosphat 8,84

Dinatriumphenylphosphat 7,60

Dinatriumcarbamylphosphat 7,73
Beispiel 19: Untersuchung der Produktion einer von E. blattae JCM1650 abgeleiteten neuen Mutante des Gens für saure Phosphatase und enzymologische Eigenschaften des mutierten Gens für saure Phosphatase
In Beispielen 19 bis 22 wurde die Transphosphorylierungsaktivität gegenüber einem Nucleosid unter folgenden Bedingungen gemessen. Die Reaktion wurde 10 Minuten bei 30°C und einem pH von 4,0 durchgeführt, wobei 1 ml einer Reaktionslösung verwendet wurde, die 40μmol/ml Inosin, 100 μmol/ml Natriumpyrophosphat, 100 μml/ml eines Natriumacetatpuffers (pH 4,0) und eines Enzyms enthielt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 200 μl einer 2n Chlorwasserstoffsäure beendet. Danach wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt und die Menge der durch die Transphosphorylierung gebildeten 5'-Inosinsäure wurde unter den vorstehend angegebenen Bedingungen bestimmt. Die Menge des Enzyms, mit dem 1 μmol Inosinsäure unter diesen Standardreaktionsbedingungen produziert werden, wurde als eine Einheit definiert.
Außerdem wurde die Transphosphorylierungsaktivität gemessen, indem die Inosinkonzentration unter den Reaktionsbedingungen der vorstehend erwähnten Zusammensetzung von 10 auf 100 μmol/ml verändert wurde und die Ratenkonstante von Inosin in der Transphosphorylierungsaktivität wurde unter Verwendung des Hanes-Woolf-Plots (Biochem. J. 26, 1406 (1932)) bestimmt.
Wie nachstehend beschrieben wird, wurde die detaillierte Analyse für die Enzym-Mutante durchgeführt, mit der die Produktivität des Nucleosid-5'-phosphatesters gemäß der Beschreibung in Beispiel 15 verbessert wird. Dabei wurde gefunden, dass die Affinität der Enzym-Mutante für das Nucleosid im Vergleich mit der des Wildtyp-Enzyms um das 2-fache verbessert war. Die Erfinder nahmen daher an, dass die Produktivität des Nucleosid-5'-phosphatesters durch Erhöhung der Affinität für ein Nucleosid in dem vorstehend erwähnte Enzym verbessert würde und sie modifizierten daher das Enzym weiter mit Hilfe einer gentechnologischen Methode.
Plasmid pEPI305, das für die saure Phosphatase des Wildtyps codierende Gen, abgeleitet von E. blattae, das in Beispiel 15 beschrieben ist, wurde verwendet und eine gerichtete Mutation wurde in diese Plasmid-DNA durch eine Methode der Gentechnologie eingeführt, um ein Gen herzustellen, welches eine saure Phosphatase-Mutante codiert. pEPI305 ist eine Plasmid-DNA, die gebildet wird, indem ein DNA-Fragment von 2,4 Kbp, das mit den Restriktions-Endonucleasen ClaI und BamHI geschnitten wurde und ein Gen enthält, das eine von E. blattae JCM1650 abgeleitete saure Phosphatase des Wildtyps codiert, an pBluescript KS(+) (vertrieben von Stratagene), das mit ClaI und BamHI geschnitten worden war, gebunden wurde. Die Basensequenz des die saure Phosphatase codierenden Gens ist durch SEQ ID NR. 6 in der Sequenzliste dargestellt. Außerdem ist die Aminosäuresequenz eines Vorläuferproteins, das aus dieser Basensequenz abgeleitet wurde, durch SEQ ID NR. 7 in der Sequenzliste dargestellt. Aus den analytischen Ergebnissen des gereinigten Enzyms (in Beispiel 4 beschrieben) wird geschlossen, dass die Aminosäuresequenz des reifen Proteins durch SEQ ID NR. 8 in der Sequenzliste dargestellt ist.
Die Oligonucleotide MUT300 (SEQ ID NR. 9 in der Sequenzliste), MUT310 (SEQ ID NR. 10 in der Sequenzliste), MUT320 (SEQ ID NR. 11 in der Sequenzlist), MUT330 (SEQ ID NR. 12 in der Sequenzliste), MUT340 (SEQ ID Nr. 13 in der Sequenzliste), MUT350 (SEQ ID NR. 14 in der Sequenzliste), MUT360 (SEQ ID NR. 15 in der Sequenzliste), MUT 370 (SEQ ID NR. 16 in der Sequenzliste), MUT380 (SEQ ID NR. 17 in der Sequenzliste) und MUT390 (SEQ ID NR. 18 in der Sequenzliste), welche die in der Sequenzliste gezeigten Sequenzen haben, wurden mit Hilfe der Phosphoamidit-Methode unter Verwendung eines DNA-Synthesizers (Modell 394, vertrieben von Applied Biosystem) synthetisiert.
Ein Nanogramm pEPI305 als Matrize, 2,5 μmol M13-Primer RV (vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd.), 2,5 μmol des Oligonucleotids MUT310 und 2,5 Einheiten tac DNA-Polymerase (vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden zu 100 μl eines Tris-Hydrochloridpuffers (pH 8,3) gegeben, der 200 μM dATP, 200 μM dCTP, 200 μM dGTP, 200 μM dTTP, 50 mM Kaliumchlorid und 1,5 mM Magnesiumchlorid enthielt. PCR wurde durchgeführt, wobei eine dreiteilige Stufe, das heißt 30 Sekunden bei 94°C, 2 Minuten bei 55°C und 3 Minuten bei 72°C 25 Mal wiederholt wurde. Für diese Reaktion wurde eine Wärmezyklen-Vorrichtung, Modell PJ2000 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet. Gesondert wurde PCR in gleicher Weise unter Verwendung von 1 ng der Plasmid-DNA pEPI305 als Matrize, 2,5 μmol M13 Primer M3 (erhalten von Takara Shuzo Co., Ltd.) als Primer und 2,5 μmol des Oligonucleotids MUT300 durchgeführt. Jede der Reaktionslösungen wurde durch Gelfiltration unter Verwendung einer Mikrospin-Kolonne S-400 (vertrieben von Pharmacia) gereinigt, um den Primer zu entfernen.
Ein μl jeder der PCR-Lösungen wurde zu 95 μl eines 100 mM Tris-Hydrochlorid-Puffers (pH 8,3) gegeben, der 200 μM dATP, 200 μM dCTP, 200 μM dGTP, 200 μM dTTP, 50 mM Kaliumchlorid und 1,5 mM Magnesiumchlorid enthielt. Das Gemisch wurde 10 Minuten auf 94°C erhitzt, dann über 60 Minuten hinweg auf 37°C abgekühlt und 15 Minuten bei 37°C erwärmt, um eine Heteroduplex zu bilden. Dazu wurden 2,5 Einheiten tac DNA-Polymerase zugesetzt und die Reaktion wurde 3 Minuten bei 72°C durchgeführt, um die Heteroduplex zu vervollständigen. Anschließend wurden 2,5 μmol M13 Primer RV und 2,5 μmol M13 Primer M3 zu der Reaktionslösung gegeben und PCR wurde unter Anwendung eines dreistufigen Verfahrens durchgeführt, wobei ein Wärmezyklus von 30 Sekunden bei 94°C, 2 Minuten bei 55°C und 3 Minuten bei 72°C 10 Mal wiederholt wurde.
Das zweite PCR-Produkt wurde mit ClAI und BamHI geschnitten, dann mit einem Gemisch von Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Dieses DNA-Fragment wurde an pBluescript KS (+), das mit ClaI und BamHI gespalten worden war, gebunden. E. coli JM109 (vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde in üblicher Weise unter Verwendung der resultierenden Plasmid DNA transformiert. Das Gemisch wurde auf einem L-Agarmedium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen, um einen Transformanten zu erhalten. Aus dem Transformanten wurde durch die Methode der alkalischen Bakteriolyse ein Plasmid hergestellt, die Basensequenz wurde bestimmt und es wurde festgestellt, dass die gewünschte Base substituiert war. Die Bestimmung der Basensequenz wurde mit Hilfe der Methode von Sanger et al. (J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)) unter Verwendung eines Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (vertrieben von Applied Biochemical) durchgeführt. Auf diese Weise wurde eine Genmutante hergestellt, welche eine mutierte Phosphatase codierte, in der der 74. Glycinrest (GGG) des reifen Proteins durch einen Asparaginsäurerest (G*A*T) ersetzt war. Das diese Genmutante enthaltende Plasmid wurde als pEPI310 bezeichnet (Beispiel 15).
Die vorstehend angegebene Verfahrensweise wurde wiederholt, wobei als Matrize das Plasmid verwendet wurde, in welches die Mutation eingeführt worden war, um eine gerichtete Mutation kumulativ einzuführen. Ein Plasmid wurde von dem Transformanten durch die Methode der alkalischen Bakteriolyse erhalten, die Basensequenz wurde bestimmt und es wurde festgestellt, dass die gewünschte Base substituiert war. Die resultierenden Genmutanten, welche die Phosphatase-Mutanten codieren und die Mutationsstellen sind in Tabelle 12 gezeigt.
Der Aminosäurerest an der Mutationsstelle zeigt einen Aminosäurerest in der Aminosäuresequenz des reifen Proteins an, das durch SEQ ID NR. 8 in der Sequenzliste dargestellt ist.
Tabelle 12
Jeder der Stämme E. coli JM109/pEPI330, E. coli JM109/pEIP340, E. coli JM109/pEEPI350, E. coli JM109/pEPI360, E. coli JM109/pEPI370, E. coli JM109/EPI380, E. coli JM109/pEPI390 und E. coli JM109/pEPI400, in die jeweils ein Plasmid eingeführt wurde, welches das mutierte Gen für saure Phosphatase enthält, und E. coli JM109/pEPI305, in das ein Plasmid eingeführt ist, welches das saure Phosphatase-Gen des Wildtyps enthält, wurde in 50 ml eines L-Mediums, das 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt, eingeimpft und 16 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden aus 2 1 der Kulturlösung jedes der Stämme durch Zentrifugieren gewonnen und einmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden in 50 ml eines 100 mM Phosphatpuffers (pH 7,0) suspendiert und 20 Minuten bei 4°C mit Ultraschall behandelt, um die Zellen zu zerbrechen. Die so behandelte Lösung wurde zentrifugiert, um unlösliche Fraktionen zu entfernen und einen zellfreien Extrakt zu erhalten. Jede der sauren Phosphatasen wurde aus jedem der zellfreien Extrakte mit Hilfe der in Beispiel 4 beschriebenen Methode gereinigt. Jedes der Enzymprodukte war bei der SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese einheitlich.
Die Ratenkonstante von Inosin bei der Transphosphorylierung mit Hilfe der gereinigten Mutanten von sauren Phosphatasen und der sauren Phosphatase des Wildtyps wurden gemessen und die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt. Es wurde gefunden, dass die Enzym-Mutante, die in E. coli JM109/pEPI330 exprimiert wurde, und welche die in Beispiel 15 beschriebene, verbesserte Produktivität für den Nucleosid-5'-phosphatester hatte, einen erniedrigten Wert Vmax hat, jedoch einen stark verminderten Km-Wert gegenüber Inosin zeigt, was eine erhöhte Affinität für Inosin bedeutet, die das Zweifache oder mehr der des Wildtyp-Enzyms beträgt, das in E. coli JM109/pEPI305 exprimiert wurde. Dies lässt folgern, dass die Produktivität für den Nucleosid-5'-phosphatester dieser Enzymmutante stark verbessert war, nicht nur, weil eine Verminderung der Nucleotidaseaktivität, sondern auch weil eine Verbesserung der Affinität für das Nucleosid, die ein wesentlicher Faktor ist, erzielt wurde. Es wurde daher erwartet, dass der Anstieg der Affinität für das Nucleosid zu einer Verbesserung der Produktivität führt. Die neuen Enzym-Mutanten, die in E. coli JM109 exprimiert werden, in welches das in diesem Beispiel hergestellte neu mutierte Enzym-Gen eingeführt wurde, zeigten eine Affinität für Inosin, die stärker verbessert war als die von E. coli JM 109/pEPI330, das in Beispiel 15 beschrieben ist. Es wurde daher erwartet, dass die Produktivität des Nucleosid-5'-phosphatesters verbessert war. Außerdem verbesserte die in E. coli JM109/pEPI380 exprimierte Enzym-Mutante nicht nur die Affinität für Inosin, sondern erhöhte auch den Wert von Vmax im Vergleich mit dem Wildtyp-Enzym. Darüber hinaus wurde erwartet, dass die Produktivität des Nucleosid-5'-phosphatesters verbessert wurde.
Tabelle 13
Beispiel 20
Produktion von 5'-Inosinsäure unter Verwendung eine Stammes, der das Gen für eine neue Mutante der sauren Phosphatase enthält
Jedes von E. coli JM109/pEPI330, E. coli JM109/pEPI340, E. coli JM109/pEPI360, E. coli JM109/pEPI370 und E. coli JM109/pEPI380, in die jeweils das Plasmid eingeschleust worden war, welches das Gen für die saure Phosphatase-Mutante enthielt, wurde in 50 ml eines L-Mediums, das 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt, eingeimpft und 16 Stunden bei 37°C inkubiert.
15 g/dl Pyrophosphorsäure und 8 g/dl Inosin wurden in einem Acetatpuffer (pH 4,0) gelöst. Zu der Lösung wurde der Stamm E. coli JM109, in den die vorstehend erwähnte Mutante und das Gen für saure Phosphatase des Wildtyps eingeführt worden waren, gegeben, so dass die Konzentration 200 mg/dl, angegeben als Trockengewicht der Zellen, erreichte. Die Reaktion wurde 32 Stunden bei 35°C durchgeführt, während der pH-Wert bei 4,0 gehalten wurde, und die Menge an 5'-Inosinsäure, die im Verlauf der Zeit gebildet wurde, wurde gemessen. Die gebildete Inosinsäure war nur 5'-Inosinsäure, und es wurde keinerlei Bildung von 2'-Inosinsäure und 3'-Inosinsäure als Nebenprodukte beobachtet. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.
Das in Beispiel 15 beschriebene E. coli JM109/pEPI330 zeigte eine Anreicherung von 5'-Inosinsäure in großer Menge. Obwohl noch Substrat zurückblieb, wurde die Bildung von 5'-Inosinsäure unterbrochen, als die Menge der angereicherten 5'-Inosinsäure 7,5 g/dl erreichte, und es fand kein weiterer Anstieg der Menge an 5'-Inosinsäure statt. Im Gegensatz dazu produzierten die Stämme, welche das neue mutierte Gen für saure Phosphatase enthielten, eine große angereicherte Menge an 5'-Inosinsäure. Speziell bei der Reaktion unter Verwendung von E. coli JM109/pEPI370 und E. coli JM109/pEPI380 wurde eine größere Menge an 5'-Inosinsäure angereichert. Außerdem war die Reaktionsrate hoch, was zeigte, dass die Produktivität für 5'-Inosinsäure weiter stark verbessert wurde. Besonders in E. coli JM109/pEPI380 war die Reaktionsrate hoch und es wurde eine sehr hohe Reaktivität erreicht.
Beispiel 21
Herstellung von verschiedenen Nucleosid-5'-phosphatestern unter Verwendung eines Stammes, der das Gen für eine neue saure Phosphatase-Mutante enthielt
E. coli JM109/pEPI380, in welches das Plasmid eingeschleust war, welches das Gen für die neue mutierte saure Phosphatase enthielt, wurde in 50 ml eines L-Mediums, das 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt, eingeimpft und 16 Stunden bei 37°C inkubiert.
Pyrophosphorsäure (15 g/dl) und 8 g/dl Inosin, Guanin, Uridin oder Cytidin als Phosphatakzeptor wurden in einem 100 mM Acetatpufer (pH 4,5) gelöst. Dazu wurde der vorstehend verwendete Stamm zugesetzt, so dass die Konzentration 100 mg/dl, angegeben als Trockengewicht der Zellen, erreichte. Die Reaktion wurde 12 Stunden bei 35°C durchgeführt, während der pH bei 4,0 gehalten wurde. Die Menge des gebildeten Nucleosid-5'-phosphatesters ist in Tabelle 4 gezeigt. Die Phosphorylierung schritt mit jedem der Nucleoside gut fort, wobei die entsprechenden Nucleosid-5'-phosphatester gebildet und angereichert wurden. Das gebildete Nucleosid war nur der Nucleosid-5'-phosphatester und es wurde keinerlei Bildung eines Nucleosid-2'-phosphatesters oder eines Nucleosid-3'-phosphatesters als Nebenprodukt beobachtet.
Tabelle 14
Beispiel 22
Herstellung von 5'-Inosinsäure unter Verwendung eines ein neues Gen für saure Phosphatase enthaltenden Stammes und von verschiedenen Phosphorsäureverbindungen als Phosphatdonor
E. coli JM107/pEPI380, in welches das Plasmid eingeführt worden war, welches das Gen für die neue Mutante von saurer Phosphatase enthielt, wurde in 50 ml L-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt, eingeimpft und 16 Stunden bei 37°C inkubiert.
Inosin (6 g/dl) und 15 g/dl eines Tripolyphosphats, eines Polyphosphats ("Polygon P", Handelsname für ein Produkt der Chioda Kagaku K. K.), Dinatriumphenylacetat oder Dinatriumcarbamylphosphat wurden in einem 100 mM Acetatpuffer (pH 4,0) gelöst. Dazu wurde der vorstehend angegebene Stamm gegeben, so dass die Konzentration 100 mg/dl, als Trockengewicht der Zellen, erreichte. Die Reaktion wurde 12 Stunden bei 35°C , durchgeführt, während der pH-Wert bei 4,0 gehalten wurde. Die Menge der gebildeten 5'-Inosinsäure ist in Tabelle 15 gezeigt.
5'-Inosinsäure wurde mit jedem der Phosphatdonoren in guter Wirksamkeit gebildet und angereichert. Insbesondere bei Verwendung eines Polyphosphats als Phosphatdonor wurde 5'-Inosinsäure in der größten Menge angereichert.
Tabelle 15
Beispiel 23
Isolierung des von dem Chromosom von Providencia stuartii abgeleiteten Gens für saure Phosphatase und Bestimmung der Nucleotidsequenz des Gens
Die Oligonucleotide PRP1 und PRP2, welche die in SEQ ID NR. 19 bzw. 20 in der Sequenzliste gezeigten Nucleotidsequenzen haben, wurden synthetisiert. Diese Oligonucleotide sind für die Amplifikation eines für saure Phosphatase von Providencia stuartii codierenden Gens auf Basis der bekannten Nucleotidsequenz des für saure Phosphatase codierenden Gens von Providencia stuartii (Datenbank von EMBL, Hinterlegungsnummer X64820) bestimmt.
Chromosomale DNA wurde aus kultivierten Mikrobenzellen von , Providencia stuartii ATCC 29851 nach einer Methode von Murray und Thomson (Nucl. Acid Res., 4321, 8 (1980)) extrahiert. Die chromosomale DNA (0,1 ng) als Matrize, die Oligonucleotide PRP1 und PRP2 (jeweils 2,5 μmol) als Primer und Taq DNA-Polymerase (2,5 Einheiten, hergestellt von Takara Shuzo) wurden zu 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,3, 100 μl) gegeben, der dATP, dCTP, dGTP, dTTP (jeweils 200 μM), Kaliumchlorid (50 mM) und Magnesiumchlorid (1,5 mM) enthielt, um eine PCR-Reaktion durchzuführen, in der ein Zyklus von Zeitabschnitten von 30 Sekunden bei 94°C, 2 Minuten bei 55°C und 3 Minuten bei 72°C 30 Mal wiederholt wurde. Die Reaktionslösung wurde der Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen, wonach das amplifizierte DNA-Fragment von etwa 1 kbp mit Hilfe von Glaspulver (hergestellt von Takara Shuzo) gewonnen wurde. Das Genfragment wurde mit BamHI verdaut, und mit pUC118 ligiert, das mit BamHI verdaut worden war. Das in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltene Plasmid wurde als pPRP100 bezeichnet.
Die Phosphomonoesterase-Aktivität und die Transphosphorylierungsaktivität von Escherichia coli JM109/pPRP100, eines Transformanten, in den pPRP100 eingeschleust worden war, wurde gemessen. Als Ergebnis zeigte der Stamm eine Aktivität für die Transphosphorylisierung eines Nucleosids sowie Phosphomonoesterase-Aktivität.
Das Plasmid wurde aus dem Transformanten von Escherichia coli JM109/pPRP100 mit Hilfe der Methode der alkalischen Lyse extrahiert, um die Nucleotidsequenz zu bestimmen. Die Nucleotidsequenz eines festgestellten offenen Leserasters und die Aminosäuresequenz des Proteins, die von der Nucleotidsequenz abgeleitet wurde, sind in SEQ ID NR. 21 und 22 in der Sequenzliste gezeigt. Die Nucleotidsequenz des offenen Leserasters stimmt vollständig mit der Nucleotidsequenz des bekannten Gens für saure Phosphatase vo Providencia stuartii überein.
Beispiel 24' Isolierung der Gene für saure Phosphatase, die von den Chromosomen von Enterobacter aerogenes, Klebsiella planticola und Serratia ficaria abgeleitet sind, und Bestimmung der Nucleotidsequenzen der Gene
Chromosomale DNA wurde aus den kultivierten Mikrobenzellen von Enterobacter aerogenes IFO 12010, Klebsiella planticola IFO 14939 und Serratia ficaria IAM 13540 mit Hilfe der Methode von Murray und Thomson (Nucl. Acid Res., 4321, 8 (1980)) extrahiert. Nach der in Beispiel 7 (2) beschriebenen Methode wurde dann eine chromosomale Genexpressions-Bibliothek konstruiert, die etwa 20.000 Transformanten von Escherichia coli JM109 umfasste, und diese wurde nach Transformanten abgesucht, welche Transphosphorylierungsaktivität zeigten. Es wurde angenommen, dass jeder dieser Transformanten das von jedem der ursprünglichen Stämme abgeleitete Gen für saure Phosphatase beherbergt.
Plasmid-DNA wurde aus einem der Transformanten von Escherichia coli, von dem angenommen wurde, dass er das Gen für saure Phosphatase, abgeleitet von Enterobacter aerogenes IFO 12010 enthält, mit Hilfe der Methode der alkalischen Lyse extrahiert und die insertierte DNA des Plasmids wurde analysiert. Das obige Plasmid wurde als pENP100 bezeichnet. Die Restriktionsenzym-Karte der von Enterobacter aerogenes IFO 12010 abgeleiteten insertierten DNA ist in 9 gezeigt.
Die Region des Gens für saure Phosphatase wurde durch Subklonieren spezifiziert, wobei infolge dessen angenommen wurde, dass das Gen für saure Phosphatase in dem Fragment von 1,6 kbp enthalten ist, welches durch die Restriktionsenzyme SalI und KpnI ausgeschnitten wurde. Dann wurde das SalI-KpnI-Fragment mit pUC118 ligiert, welches mit SalI und KpnI verdaut worden war, um ein Plasmid zu konstruieren. Das resultierende Plasmid wurde als pENP110 bezeichnet.
Nach der vorstehend beschriebenen Verfahrensweise wurde Plasmid-DNA mit Hilfe der Methode der alkalischen Lyse aus einem der Transformanten von Escherichia coli extrahiert, von dem angenommen wurde, dass er das Gen für saure Phosphatase, abgeleitet von Klebsiella planticola IFO 14939, enthielt, und die in das Plasmid insertierte DNA wurde analysiert. Das obige Plasmid wurde als pKLP100 bezeichnet. Die Restriktionsenzym-Karte der von Klebsiella planticola IFO 14939 abgeleiteten insertierten DNA ist in 10 gezeigt.
Als Ergebnis der Festlegung der Region des Gens für saure Phosphatase durch Subklonieren wurde angenommen, dass das Gen für saure Phosphatase in dem 2,2 kbp-Fragment enthalten ist, welches durch die Restriktionsenzyme KpnI und EcoRI ausgeschnitten wurde. Dann wurde das KpnI-EcoRI-Fragment mit pUC118 ligiert, welches mit KpnI und EcoRI verdaut worden war, um ein Plasmid zu konstruieren. Das resultierende Plasmid wurde als pKLP110 bezeichnet.
In entsprechender Weise wurde Plasmid-DNA aus einem der Transformanten von Escherichia coli, von dem angenommen wurde, dass er das saure Phosphatase-Gen, abgeleitet von Serratia ficaria IAM 13540, enthielt, mit Hilfe der Methode der alkalischen Lyse extrahiert und insertierte DNA des Plasmids wurde analysiert. Das obige Plasmid wurde als pSEP100 bezeichnet. Eine Restriktionsenzym-Karte der von Serratia ficaria IAM 13540 abgeleiteten insertierten DNA ist in 11 gezeigt.
Die Region des Gens für saure Phosphatase wurde durch Subklonieren festgestellt, woraus gefolgert wurde, dass das Gen für saure Phosphatase in einem 1,4 kbp-Fragment enthalten ist, welches durch das Restriktionsenzym HindIII ausgeschnitten wird. Dann wurde das HindIII-Fragment mit pUC118 ligiert, welches mit HindIII verdaut worden war, um ein Plasmid zu konstruieren. Das resultierende Plasmid wurde als SEP110 bezeichnet.
Danach wurden Plasmid-DNAs aus den Transformanten Escherichia coli JM109/pENP110, Escherichia coli JM109/pKLP110 und Escherichia coli JM109/pSEP110, in die pENP110, pKLP110 und pSEP110 eingeschleust worden war, mit Hilfe der Methode der alkalischen Lyse extrahiert. Die Nukleotidsequenzen der Insertionen dieser Plasmide wurden mit Hilfe der in Beispiel 8 beschriebenen Methode bestimmt. Die bestimmten Nukleotidsequenzen der offenen Leseraster der Inserts sind in SEQ ID NR. 23 für Enterobacter aerogenes IFO 12010, in SEQ ID NR. 25 für Klebsiella planticola IFO 14939 und in SEQ ID NR. 27 für Serratia ficaria IAM 13540 gezeigt. Außerdem sind die abgeleiteten Aminosäuresequenzen in SEQ ID Nr. 24, 26 und 28 gezeigt. Wegen der Tatsache, dass die Transformanten, welche die diese Fragmente enthaltenden Plasmide beherbergen, Transposphorylierungsaktivität zeigten, wurde festgestellt, dass diese offenen Leseraster die Gene für die angestrebte saure Phosphatase waren.
Die Nukleotidsequenzen und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden jeweils mit bekannten Sequenzen auf Homologie verglichen. Dabei wurden die Datenbanken von EMBL und SWISS-PROT verwendet. Als Ergebnis wurde gefunden, dass die in SEQ ID NR. 23, 25 und 27 in der Sequenzliste dargestellten Gene neue Gene sind. Es wird angenommen, dass das Protein, das durch das von Enterobacter aerogenes IFO 12010 abgeleitete Gen codiert wird, 248 Aminosäurereste umfasst, das Protein, das durch das von Klebsiella planticola IFO 14939 abgeleitete Gen codiert wird, 248 Aminosäurereste enthält und das Protein, welches durch das von Serratia ficaria IAM 13540 abgeleitete Gen codiert wird, 244 Aminosäurereste enthält. Es ist möglich, dass diese Proteine Vorläuferproteine sein können, wie die sauren Phosphatasen, die von Morganella morganii und Escherichia blattae abgeleitet sind.
Die von den Nukleotidsequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind in 12 in dem Einbuchstabencode zusammen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz der sauren Phosphatase aus Morganella morganii NCIMB 10466, erhalten in Beispiel 8, der von Escherichia blattae JCM 1650, erhalten in Beispiel 12 und der bekannten Aminosäuresequenz der sauren Phosphatase von Providencia stuartii (EMBL, Hinterlegungsnummer X64820) gezeigt. Aminosäurereste, die allen der Aminosäuresequenzen gemeinsam sind, sind unter den in 12 gezeigten Sequenzen mit Sternen bezeichnet.
Wie in 12 gezeigt ist, sind die von sechs Stämmen hergeleiteten sauren Phosphatasen miteinander hoch homolog und allen der Aminosäuresequenzen sind 130 Aminosäurereste gemeinsam. Es wird somit angenommen, dass diese sauren Phosphatasen ähnliche Funktionen haben.
Beispiel 25: Amplifikation der Aktivität durch Expression des Gens für saure Phosphatase, das von Enterobacter aerogenes, Klebsiella planticola und Serratia ficaria abgeleitet ist
Escherichia coli JM109/pPRP100, das in Beispiel 23 konstruiert wurde, Escherichia coli JM109/pENP110, Escherichia coli JM109/pKLP110 und Escherichia coli JM109/pSEP110, konstruiert in Beispiel 24, wurden in ein L-Medium (50 ml) eingeimpft, das 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt, und 16 Stunden lang bei 37°C kultiviert. Die Mikrobenzellen wurden aus diesen Kulturen durch Zentrifugieren gewonnen und wurden einmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Mikrobenzellen wurden in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer (5 ml, pH 7,0) suspendiert und mit Hilfe einer Ultraschallbehandlung, die während 20 Minuten bei 4°C durchgeführt wurde, aufgebrochen. Die behandelten Lösungen wurden zentrifugiert, um eine unlösliche Fraktion zu entfernen, wobei zellfreie Extrakte hergestellt wurden.
Die Transphosphorylierungsaktivitäten der erhaltenen zellfreien Extrakte wurde gemessen, wobei als Kontrollproben zellfreie Extrakte verwendet wurden, die aus Providencia stuartii ATCC 29851, Enterobacter aerogenes IFO 12010, Klebsiella planticola IFO 14939, Serratia ficaria IAM 13450 und Escherichia coli JM109, die mit dem Plasmid pUC118 in der vorstehend beschriebenen Weise transformiert waren, hergestellt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt. Die Transphosphorylierungsaktivitäten waren in allen der Wildtyp-Stämme niedrig. Eine Transphosphorylierungsaktivität wurde bei Escherichia coli JM109/pUC118 nicht festgestellt. Andererseits zeigten die Transformanten von Escherichia coli JM109, in welche die Gene für saure Phosphatase eingeführt worden waren, hohe Transphosphorylierungaktivitäten im Vergleich mit den Wildtyp-Stämmen. Das Ergebnis zeigte, dass jedes der eingeführten DNA-Fragmente ermöglicht, dass Escherichia coli die saure Phosphatase in einer hohen Menge exprimiert.

Tabelle 16

Mikroorganismenstamm	Transphosphorylierungsaktivität (Einheiten/mg)
Providencia stuartii ATCC 29851	0,005
Enterobacter aerogenes IFO 12010	0,002
Klebsiella planticola IFO 14939	0,002
Serratia ficaria IAM 13450	0,001
Escherichia coli JM109/pUC118	nicht festgestellt
Escherichia coli JM109/pPRP100	0,833
Escherichia coli JM109/pENP110	0,301
Escherichia coli JM109/pKLP110	0,253
Escherichia coli JM109/pSEP110	0,123

Beispiel 26
Herstellung eines mutierten Gens für saure Phosphatase mit verbesserter Temperaturbeständigkeit
Wie in Beispielen 20, 21 und 22 beschrieben ist, exprimierte der in Beispiel 19 hergestellte Stamm, der das von E. blattae abgeleitete mutierte Gen für saure Phosphatase enthielt, eine beträchtliche Menge an saurer Phosphatase. Bei der Herstellung von 5'-Inosinsäure aus Pyrophosphorsäure und Inosin unter Verwendung dieses Stammes wurde 5'-Inosinsäure in hoher Ausbeute gebildet und angereichert. Die optimale Reaktionstemperatur dieser sauren Phosphatase war 35°C. Wenn jedoch diese Reaktion bei höherer Temperatur durchgeführt wurde, erhöhte sich die Reaktionsrate, und die Reaktion wurde durchgeführt, nachdem die Nucleosidkonzentration des Phosphatakzeptors in der Reaktionslösung erhöht worden war. Es wurde daher angenommen, dass der Nucleosid-5'-phosphatester.
wirksamer während einer kürzeren Dauer produziert werden könnte. Daher wurde die Temperaturbeständigikeit des Enzyms verbessert, indem durch gerichtete Mutation mit Hilfe von PCR eine Mutation in das in Beispiel 19 klonierte, von E. blattae abgeleitete Gen für saure Phosphatase eingeführt wurde.
Plasmid pEPI380, welches das Gen enthielt, das die von E. blattae JCM1650 abgeleitete mutierte saure Phosphatase, die in Beispiel 19 beschrieben ist, enthielt, wurde verwendet und durch gerichtete Mutation wurde in diese Plasmid-DNA mit Hilfe einer gentechnologischen Methode eine Mutation eingeführt, wobei das Gen hergestellt wurde, welches die Mutante der sauren Phosphatase mit erhöhter Temperaturbeständigkeit produziert. pEPI380 ist eine Plasmid-DNA, die erhalten wird, indem ein DNA-Fragment von 2,4 Kbp, welches das für die saure Phosphatase-Mutante codierende Gen, abgeleitet von E. blattae JCM1650 enthält und mit den Restriktionsendonucleasen ClaI und BamHI verdaut wurde, an pBluescript K5(+)(vertrieben von Stratagene) gebunden wird, welches mit ClaI und BamHI verdaut worden war. Die Aminosäuresequenz des reifen Proteins, die aus der Basensequenz des die saure Phosphatase codierenden Gens abgeleitet ist, besteht, wie angenommen wurde, aus den in Tabelle 12 in Beispiel 19 gezeigten 11 Aminosäureresten in der Sequenz, die durch SEQ ID NR. 8 in der Sequenzliste dargestellt ist.
Die Oligonucleotide MUT300 (SEQ ID NR. 9 in der Seqenzliste), MUT400 (SEQ ID NR. 29 in der Sequenzliste) und MUT410 (SEQ ID NR. 30 in der Sequenzliste), welche die in der Sequenztabelle gezeigten Sequenzen haben, wurden mit Hilfe der Phosphoamidit-Methode unter Verwendung eines DNA-Synthesizers (Modell 394, vertrieben von Applied Biosystem) synthetisiert.
Ein mutiertes Gen, das eine Phosphatase-Mutante codiert, in welcher der 104. Glutaminsäurerest (GAG) des reifen Proteins durch einen Glycinrest (GG*T*) ersetzt ist, wurde mit Hilfe der PCR-Methode wie in Beispiel 15 unter Verwendung des in Beispiel 19 beschriebenen pEPI380 als Matrize und MUT300 und MUT410 als Primer zur Einführung der Mutation hergestellt. Dieses die Genmutante enthaltende Plasmid wurde als pEPI410 bezeichnet. In entsprechender Weise wurde eine Genmutante, die eine Phosphatase-Mutante codiert, in welcher der 151. Threoninrest (ACC) durch einen Alaninrest (G*CC) ersetzt war, unter Verwendung von pEPI380 als Matrize und der Oligonucleotide MUT300, MUT310 und MUT420 als Primer zur Einführung einer Mutation hergestellt. Dieses das mutierte Gen enthaltende Plasmid wurde als pEPI420 bezeichnet.
Ein Plasmid wurde aus dem Transformanten von E. coli JM109, in welchen die Plasmide pEPI410 und pEPI420, die das mutierte Phospatase-Gen enthielten, eingeführt waren, mit Hilfe der Methode der alkalischen Bactertiolyse hergestellt und die Basensequenz wurde bestimmt, wobei festgestellt wurde, dass die gewünschte Base substituiert war.
Jeder der Stämme E. coli JM109/pEPI410 und E. coli JM109/pEPI420, in welche das in diesem Beispiel produzierte mutierte Gen für saure Phosphatase eingeführt war, und E. coli JM109/pEPI380, das in Beispiel 19 beschrieben ist, wurde in 50 ml eines L-Mediums, das 100 μg/ml Ampicillin und 1mM IPTG enthielt, eingeimpft und 16 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden aus 50 ml der Kulturlösung jedes der Stämme gewonnen und einmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Diese Zellen wurden in 5 ml eines 100 mM Phosphatpuffers (pH 7,0) suspendiert und 20 Minuten bei 4°C mit Ultraschall behandelt, um die Zellen zu zerkleinern. Die so behandelte Lösung wurde zentrifugiert, um unlösliche Fraktionen zu entfernen und einen zellfreien Extrakt herzustellen.
Der aus jedem der Stämme erhaltene zellfreie Extrakt wurde 30 Minuten lang bei einem pH-Wert von 7,0 auf Temperaturen im Bereich von 0°C bis 80°C erhitzt. Nach Beendigung des Erwärmens wurde die Transphosphorylierung unter den Standard-Reaktionsbedingungen eines pH-Werts von 4,0 und 30°C durch geführt, indem die bei verschiedenen Temperaturen behandelten zellfreien Extrakte verwendet wurden, und die Restaktivität wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. Das in E. coli JM109/pEPI380 exprimierte mutierte Enzym, welches in Beispiel 19 beschrieben ist, war bei 30-minütiger Behandlung bei 40°C stabil, eine Verminderung der Aktivität wurde jedoch bei höheren Temperaturen beobachtet. Im Gegensatz dazu hatte die neue Enzym-Mutante, die in E. coli JM109/pEPI410 und E. coli JM109/pEPI420 exprimiert wurde, in welche das neue mutierte Gen, das in diesem Beispiel hergestellt worden war, eingeführt war, verbesserte Temperaturbeständigkeit und es wurde selbst bei einer Behandlung während 30 Minuten bei 50°C keine Verminderung der Aktivität beobachtet. Es wurde daher angenommen, dass bei Herstellung eines Nucleosid-5'phosphatesters unter Verwendung dieser Stämme bei hoher Temperatur die Produktivität weiter verbessert wird.
Beispiel 27
Herstellung von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure unter Verwendung eines Stammes, der ein Gen für eine mutierte saure Phosphatase mit verbesserter Temperaturbeständigkeit enthält
Jeder der Stämme E. coli JM109/pEPI410 und E. coli JM109/pEPI420, in welche das mutierte saure Phosphatase-Gen eingeschleust worden war, und das in Beispiel 19 beschriebene E. coli JM109/pEPI380 wurde in 50 ml eines L-Mediums, das 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthielt, eingeimpft und 16 Stunden bei 37°C inkubiert.
Pyrophosphorsäure (15 g/dl) und 8 g/dl Inosin oder Guanosin wurden in einem Acetatpuffer (pH 4,0) gelöst. Dazu wurde der Stamm E. coli JM109, in welchen jede Mutante des Gens für ' saure Phosphatase eingeführt worden war, zugesetzt, so dass die Konzentration 100 mg/dl, als Trockengewicht der Zellen, erreichte. Die Reaktion wurde 9 Stunden bei 50°C durchgeführt, während der pH-Wert bei 4,0 gehalten wurde, und die Menge der gebildeten 5'-Inosinsäure oder 5'-Guanylsäure wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 gezeigt. Der gebildete Nucleosid-Phosphatester war nur ein Nucleosid-5'-phosphatester und es wurde keinerlei Bildung eines Nucleosid-2'-phosphatesters oder eines Nucleosid-3'-phosphatesters als Nebenprodukt beobachtet. Die Reaktion wurde zum Vergleich auch 12 Stunden bei 35°C unter Verwendung von E. coli JM109/pEPI380 durchgeführt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 17 gezeigt.
Wie in Beispiel 21 beschrieben ist, wurde unter Verwendung von E. coli JM109/pEPI380 der Nucleosid-5'-phosphatester wirksam gebildet und angereichert. Wenn im Gegensatz dazu die Reaktion unter Verwendung von E. coli JM109/pEPI410 und E. coli JM109/pEPI420, in welche das in Beispiel 26 gebildete neue mutierte Gen für saure Phosphatase eingeführt worden war, das von E. blattae abgeleitet ist, durchgeführt wurde, wurde die gleiche Menge an 5'-Inosinsäure oder 5'-Guanylsäure in kürzerer Zeit gebildet und angereichert. Daher konnte der Nucleosid-5'-phosphatester effizienter hergestellt werden. Speziell dann, wenn E. coli JM109/pEPI420 verwendet wurde, wurde nicht nur die Reaktionsdauer verkürzt, sondern es wurden auch 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure in größeren Mengen angereichert und es zeigte sich eine ziemlich hohe Produktivität.
Tabelle 17
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Nucleosid-5'-phosphatesters, welches die Stufen der Einwirkung einer sauren Phosphatase unter der Bedingung eines pH-Werts von 3,0 bis 5,5 auf ein Nucleosid und einen Phosphatgruppen-Donor zur Herstellung eines Nucleosid-5'-phosphatesters und dessen Gewinnung umfasst, wobei die saure Phosphatase eine Aminosäuresequenz hat, die im wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, die aus der aus SEQ ID Nr 4, 8, 22, 24, 26 und 28 bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und die saure Phosphatase eine Mutation oder Mutationen hat, welche die Affinität für das Nucleosid und/oder die Temperaturbeständigkeit, verglichen mit der Aminosäuresequenz, die aus der aus SEQ ID Nr. 4, 8, 22, 24, 26 und 28 bestehenden Gruppe ausgewählt ist, erhöht, und wobei die saure Phosphatase eine Aminosäuresequenz hat, die verschieden ist von (a) der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4, die nur am 72. Glycinrest und/oder dem 151. Isoleucinrest mutiert ist, (b) der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 8, die nur am
Glycinrest und/oder am 153. Isoleucinrest mutiert ist, (c) der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 22, 24 oder 26, die nur am 92. Glycinrest und/oder am 171. Isoleucinrest mutiert ist, und (d) der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 28, die nur am 88. Glycinrest und/oder am 167. Isoleucinrest mutiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Nucleosid-5'-phosphatesters, welches die Stufen der Einwirkung eines Microorganismus unter der Bedingung eines pH-Werts von 3,0 bis 5,5 auf ein Nucleosid und einen Phosphatgruppen-Donor zur Herstellung eines Nucleosid-5'-phosphatesters und dessen Gewinnung umfasst, wobei der Mikroorganismus mit einer rekombinanten DNA transformiert ist, die ein für eine saure Phosphatase kodierendes Gen enthält, das in Anspruch 1 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Km-Wert für das Nucleosid weniger als 100 beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die saure Phosphatase mehr Aktivität als der Wildtyp beibehält, nachdem sie 30 Minuten bei einem pH von 7,0 bei 50°C gehalten wurde.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei die saure Phosphatase, die erhöhte Affinität für das Nucleosid hat, von einem Bakterium abgeleitet ist, das dem Genus Escherichia, dem Genus Morganella, dem Genus Providencia, dem Genus Enterobacter, the Genus Klebsiella oder dem Genus Serratia angehört.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei die Mutation aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Substitutionen des 63. Leucinrests, des 65. Alaninrests, des 66. Glutaminsäurerests, des 69. Asparaginrests, des 71. Serinrests, des 72. Serinrests, des 74. Glycinrests, des 85. Serinrests, des 92. Alaninrests, des 94. Alaninrests, des 104. Glutaminsäurerests, des 116. Asparaginsäurerests, des 130. Serinrests, des 135. Threoninrests, des 136. Glutaminsäurerests, des 151. Threoninrests und/oder des 153. Isoleucinrests durch eine andere Aminsäure in SEQ ID Nr. 8 besteht.
Verfahren nach einem vorhergehenden Patentanspruch, wobei die saure Phosphatase eine Aminosäuresequenz hat, die im wesentlichen identisch mit der Aminosäursequenz von SEQ ID Nr. 8 ist und die durch eine Substitution des 74. Glycinrests und/oder des 153. Isoleucinrests mutiert ist und weitere Mutationen aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Substitutionen des 63. Leucinrests, des 65. Alaninrests, des 66. Glutaminsäurerests, des 69. Asparaginrests, des
Serinrests, des 72. Serinrests, des 85. Serinrests, des 92. Alaninrests, des 94. Alaninrests, des 104. Glutaminsäurerests, des 116. Asparaginsäurerests, des 130. Serinrests, des 135. Threoninrests, des 136. Glutaminsäurerests und/oder des 151. Threoninrests besteht.
Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei der
Leucinrest durch einen Glutaminrest substituiert ist, der 65. Alaninrest durch einen Glutaminrest substituiert ist, der 66. Glutaminsäurerest durch einen Alaninrest substituiert ist, der 69. Asparaginrest durch einen Asparaginsäurerest substituiert ist, der 71. Serinrest durch einen Alaninrest substituiert ist, der 72. Serinrest durch einen Alaninrest substituiert ist, der 74. Glycinrest durch einen Asparaginsäurerest substituiert ist, der 85. Serinrest durch einen Tyrosinrest substituiert ist, der 92. Alaninrest durch einen Serinrest substituiert ist, der 94. Alaninrest durch einen Glutaminsäurerest substituiert ist, der 104. Glutaminsäurerest durch einen Glycinrest substituiert ist, der 116. Asparaginsäurerest durch einen Glutaminsäurerest substituiert ist, der 130. Serinrest durch einen Glutaminsäurerest substituiert ist, der 135. Threoninrest durch einen Lysinrest substituiert ist, der 136. Glutaminsäurerest durch einen Asparaginsäurerest substituiert ist, der 151. Threoninrest durch einen Alaninrest und/oder der 153. Isoleucinrest durch einen Threoninrest substituiert ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Patentanspruch, wobei die saure Phosphatase verbesserte Temperaturbeständigkeit hat und aus der Gruppe der folgenden ausgewählt ist: (a) einer sauren Phosphatase mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4 ist und eine Mutation, die eine Substitution des 102. Glutaminsäurerests ist und/oder eine Mutation aufweist, die eine Substitution des 149. Threoninrests ist, (b) einer sauren Phosphatase, die eine Aminosäuresequenz hat, die im wesentlichen identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 8 ist und eine Mutation, die eine Substitution des 104. Glutaminsäurerests ist und/oder eine Mutation aufweist, die eine Substitution des 151. Threoninrests ist, (c) einer sauren Phosphatase, die eine Aminosäuresequenz hat, die im wesentlichen identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 22, 24 oder 26 ist, und eine Mutation, die eine Substitution des 122. Glutaminsäurerests ist und/oder eine Mutation aufweist, die eine Substitution des 169. Threoninrests ist, und (d) einer sauren Phosphatase, die eine Aminosäuresequenz hat, die im wesentlichen identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 28 ist, und eine Mutation, die eine Substitution des 118. Glutaminsäurerests ist und/oder eine Mutation aufweist, die eine Substitution des
Threoninrests ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Glutaminsäurerest durch einen Glycinrest und/oder der Threoninrest durch einen Alaninrest substituiert ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Patentanspruch, wobei der Phosphatgruppen-Donor aus der aus Polyphosphorsäure oder einem Salz davon, Phenylphosphorsäure oder einem Salz davon, Acetylphosphorsäure oder einem Salz davon und Carbamylphosphat oder einem Salz davon bestehenden Gruppen ausgewählt ist.
Mutant einer sauren Phosphatase definiert in einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 10.
Gen, das für die in Anspruch 12 definierte saure Phosphatase kodiert.
Rekombinante DNA, die das in Anspruch 13 definierte Gen enthält.
Mikroorganismus, der die in Anspruch 14 definierte rekombinante DNA trägt.