ES2199330T3 - Metodo para producir ester nucleosido-5'-fosfato. - Google Patents
Metodo para producir ester nucleosido-5'-fosfato.Info
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Abstract
UN METODO PARA LA PRODUCCION DE ESTER NUCLEOSIDO 5 FOSFATO IMPLICA LA FOSFORILACION BIOQUIMICA DEL NUCLEOSIDO. EL ESTER NUCLEOSIDO 5 FOSFATO SE PRODUCE PERMITIENDO QUE UNA FOSFATASA ACIDA, ESPECIALMENTE UNA FOSFATASA ACIDA QUE TIENE UNA AFINIDAD AUMENTADA PARA UN NUCLEOSIDO Y/O UNA ESTABILIDAD TERMICA AUMENTADA, ACTUE A PH ENTRE 3,0 Y 5,5 SOBRE UN NUCLEOSIDO Y UN DONANTE DE GRUPOS FOSFATOS. EL DONANTE DE GRUPOS FOSFATO PUEDE SELECCIONARSE ENTRE EL ACIDO POLIFOSFORICO O UNA SAL DE EL, EL ACIDO FENILFOSFORICO O UNA SAL DE EL Y EL CARBAMIL FOSFATO O UNA SAL DE EL. EL ESTER NUCLEOSIDO 5 FOSFATO RESULTANTE PUEDE RECOGERSE A CONTINUACION. PARA CATALIZAR LA REACCION PUEDE EMPLEARSE UN MICROORGANISMO TRANSFORMADO CON UN GEN QUE CODIFIQUE UNA PROTEINA QUE TENGA ACTIVIDAD FOSFATASA ACIDA, COMO ALTERNATIVA AL USO DE FOSFATASA ACIDA AISLADA.
Description
Método para producir éster
nucleósido-5'-fosfato.
La presente invención se refiere a un método para
producir éster
nucleósido-5'-fosfato. La presente
invención también se refiere a una fosfatasa ácida nueva, un gen
que codifica la fosfatasa ácida, un DNA recombinante que contiene el
gen, y un microorganismo que hospeda el DNA recombinante que son
útiles para producir el éster
nucleósido-5'-fosfato. El éster
nucleósido-5'-fosfato es útil como
ingrediente, producto farmacéutico o materia prima para producir
dichas sustancias.
Se conocen métodos de fosforilación bioquímica de
un nucleósido para producir éster
nucleósido-5'-fosfato utilizando los
siguientes donantes de grupos fosfato, incluyendo un método que
utiliza ácido p-nitrofenilfosfórico (Publicación de
Patente Japonesa Nº 39-29.858), un método que
utiliza ácido fosfórico inorgánico (Publicación de Patente Japonesa
Nº 42-1.186), un método que utiliza ácido
polifosfórico (Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº
53-56.390), un método que utiliza ácido
acetilfosfórico (Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº
56-82.098) y un método que utiliza adenosín
trifosfato (ATP) (Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº
63-230.094). Sin embargo estos métodos no han sido
satisfactorios para producir éster
nucleósido-5'-fosfato eficazmente y
de forma económica porque los sustratos que deben utilizarse son
caros o porque se producen productos secundarios en la
reacción.
Por lo tanto, los inventores han desarrollado un
método para producir eficazmente éster
nucleósido-5'-fosfato sin producir
como subproductos los isómeros 2'- y 3'-nucleótido,
permitiendo que las células de un microorganismo específico actúen
en condiciones acídicas sobre un nucleósido y un donante de grupo
fosfato elegido entre el grupo que consta de ácido polifosfórico o
una de sus sales, ácido fenilfosfórico o una de sus sales y
carbamilfosfato o una de sus sales (Patente japonesa abierta a
inspección pública Nº 7-231.793).
Sin embargo, incluso este método ha tenido los
siguientes inconvenientes. Principalmente, por ejemplo, una parte
del sustrato se degrada durante la reacción debido a la actividad
degradante del nucleósido que desafortunadamente existe en pequeña
cantidad en la células del microorganismo que se debe utilizar.
Además, si la reacción continúa, el éster
nucleósido-5'-fosfato producido y
acumulado se degrada. Por lo tanto, se producen productos
secundarios en la disolución de reacción, y ha sido imposible
obtener un rendimiento suficiente. Además, la reacción no se puede
realizar si el sustrato se añade en una concentración elevada
debido a la pequeña actividad de transfosforilación por célula
microbiana.
En una forma de realización, la presente
invención proporciona adecuadamente un método para producir de forma
económica y eficaz éster
nucleósido-5'-fosfato. Según otras
formas de realización de la presente invención se proporcionan una
enzima, un gen que codifica la enzima, un DNA recombinante que
contiene el gen y un microorganismo que hospeda el DNA
recombinante, que son útiles para el método para producir éster
nucleósido-5'-fosfato.
Como resultado de varias investigaciones
realizadas por los inventores con el fin de desarrollar un método
para producir éster
nucleósido-5'-fosfato que sea más
eficaz que los métodos convencionales, se ha encontrado que el éster
nucleósido-5'-fosfato puede
producirse eficazmente con un alto rendimiento haciendo que una
fosfatasa ácida purificada a partir de un extracto libre de células
de un microorganismo actúe en condiciones de pH de 3,0 a 5,5 sobre
un nucleósido y un donante de grupo fosfato elegido entre el grupo
que consta de ácido polifosfórico o una de sus sales, ácido
fenilfosfórico o una de sus sales y carbamilfosfato o una de sus
sales. Además, los inventores han logrado obtener genes de tipo
salvaje que codifican las fosfatasas ácidas de varias bacterias y
genes que codifican las fosfatasas ácidas que tienen una afinidad
por el nucleósido aumentada en comparación con la fosfatasa ácida de
tipo salvaje, introduciendo una mutación en una fosfatasa ácida
derivada de una bacteria que pertenece al género esterichia.
Además, los inventores han encontrado que la productividad del éster
nucleósido-5'-fosfato puede
mejorarse de forma notable expresando el gen en una gran cantidad
según técnicas de ingeniería.
Además los inventores han intentado preparar una
fosfatasa ácida mutante con estabilidad térmica aumentada, con el
propósito de realizar una reacción de transferencia de fosfato
utilizando la fosfatasa ácida a una temperatura más elevada para
obtener una producción mucho más eficaz de
nucleósido-5'-fosfato, debido a que
la velocidad de reacción se aumenta y la concentración del receptor
de fosfato en la disolución de reacción puede ser superior. Luego
los inventores han logrado la preparación de una fosfatasa ácida
mutante que tiene estabilidad térmica aumentada con respecto a las
fosfatasas ácidas mutantes descritas en el ejemplo 19 y puede
emplearse en una reacción a una temperatura superior, y se ha
completado la invención.
A saber, la presente invención proporciona un
método para producir éster
nucleósido-5'-fosfato que comprende
las etapas de permitir que una fosfatasa ácida tenga afinidad por
un nucleósido aumentada y/o estabilidad térmica aumentada para
actuar en condiciones de pH de 3,0 a 5,5 sobre un nucleósido y un
donante de grupo fosfato, preferiblemente elegido entre el grupo
que consta de ácido polifosfórico o una de sus sales, ácido
fenilfosfórico o una de sus sales, ácido acetilfosfórico o una de
sus sales y carbamilfosfato o una de sus sales, para producir éster
nucleósido-5'-fosfato, y
recogerlo.
La expresión ``fosfatasa ácida que tiene afinidad
por el nucleósido aumentada'' incluye aquellas fosfatasas ácidas
cuya afinidad por el nucleósido es superior en comparación con la
fosfatasa ácida del tipo salvaje. Las fosfatasas ácidas preferidas
tienen una constante de Michaelis, Km, para la transfosforilación
del nucleósido, que está por debajo de 100 mM.
La expresión ``fosfatasa ácida que tiene
estabilidad térmica aumentada'' incluye aquellas fosfatasas ácidas
que conservan más actividad residual después del tratamiento a
temperatura elevada que la correspondiente fosfatasa ácida del tipo
salvaje.
Preferiblemente, la fosfatasa ácida conserva más
actividad que la de tipo salvaje después de mantenerse a 50ºC
durante 30 minutos a pH 7,0. De forma particular, preferiblemente la
fosfatasa ácida no presenta esencialmente disminución de la
actividad después de un tratamiento durante 30 minutos a 50ºC y pH
7.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un método para producir éster
nucleósido-5'-fosfato que comprende
las etapas de permitir que un microorganismo actúe en unas
condiciones de pH de 3,0 a 5,5 sobre un nucleósido y un donante de
grupo fosfato para producir éster
nucleósido-5'-fosfato y recogerlo,
en el que el microorganismo se transforma con un DNA recombinante
que comprende un gen que codifica una fosfatasa ácida que tiene
afinidad por el nucleósido mejorada y/o estabilidad térmica
aumentada.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona fosfatasas ácidas mutantes que tienen afinidad por un
nucleósido aumentada y/o estabilidad térmica aumentada, genes que
codifican las fosfatasas ácidas, DNA recombinantes que contienen los
genes y microorganismos que hospedan el DNA recombinante.
A continuación se describen formas de realización
de la invención, a modo de ejemplo únicamente y con referencia a las
figuras adjuntas, de las que:
La figura 1 ilustra la relación entre el pH de
reacción y la cantidad producida de ácido
5'-inosínico en una reacción realizada utilizando
una enzima derivada de morganella morganii.
La figura 2 ilustra la relación entre el pH de
reacción y la cantidad producida de ácido
5'-inosínico en una reacción realizada utilizando
una enzima derivada de escherichia blattae.
La figura 3 ilustra un mapa de enzimas de
restricción de un fragmento de DNA cromosómico de morganella
morganii que contiene un gen que codifica una fosfatasa
ácida.
La figura 4 ilustra la cantidad producida de
ácido 5'-inosínico en una reacción realizada
utilizando una cepa que hospeda el gen de fosfatasa derivado de
morganella morganii.
La figura 5 ilustra un mapa de enzimas de
restricción de un fragmento de DNA cromosómico de escherichia
blattae que contiene un gen que codifica una fosfatasa
ácida.
La figura 6 ilustra un diagrama que muestra la
cantidad producida de ácido 5'-inosínico en una
reacción realizada utilizando una cepa que hospeda el gen de
fosfatasa ácida derivado de escherichia blattae.
La figura 7 ilustra la cantidad producida de
ácido 5'-inosínico en reacciones realizadas
utilizando una cepa que hospeda el gen de fosfatasa ácida del tipo
salvaje y una cepa que hospeda el gen de fosfatasa ácida mutante
derivado de escherichia blattae respectivamente.
La figura 8 ilustra la cantidad producida de
ácido 5'-inosínico en una reacción realizada
utilizando una capa que hospeda el nuevo gen de fosfatasa mutante
derivado de escherichia blattae.
La figura 9 ilustra un mapa de enzimas de
restricción de un fragmento de DNA cromosómico derivado de
enterobacter aerogenes que contiene el gen que codifica la
fosfatasa ácida.
La figura 10 ilustra un mapa de enzimas de
restricción de un fragmento de DNA cromosómico derivado de
klebsiella planticola que contiene el gen que codifica la
fosfatasa ácida.
La figura 11 ilustra un mapa de enzimas de
restricción de un fragmento de DNA cromosómico derivado de
serratia ficaria que contiene el gen que codifica la
fosfatasa ácida.
La figura 12 ilustra secuencias de aminoácidos
expresadas en código de una letra deducidas de las secuencias de
nucleótidos de fosfatasas ácidas derivadas de morganella
morganii, escherichia blattae, providencia stuartii, enterobacter
aerogenes, klebsiella planticola y serratia ficaria.
Estas secuencias de aminoácidos se ilustran en las secuencias SEQ
ID NOs: 4, 8, 22, 24, 26 y 28 en el listado de secuencias en código
de tres letras. En la figura, los restos aminoácidos que son comunes
en todas las secuencias de aminoácidos se marcan con un * debajo de
la secuencia.
La figura 13 ilustra la estabilidad térmica de la
actividad de la fosfatasa ácida en la disolución de extracto libre
de células preparada a partir de una cepa que hospeda el nuevo gen
de fosfatasa mutante derivado de escherichia blattae.
La fosfatasa ácida que se va a utilizar en la
presente invención cataliza la reacción para producir éster
nucleósido-5'-fosfato por
transferencia del grupo fosfato al nucleósido a partir del donante
del grupo fosfato, por ejemplo elegido entre el grupo que consta de
ácido polifosfórico o una de sus sales, ácido fenilfosfórico o una
de sus sales y carbamilfosfato o una de sus sales, en condiciones
de pH de 3,0 a 5,5. Tal fosfatasa ácida incluye preferiblemente las
derivadas de microorganismos. En un modo de realización
especialmente preferido, la presente invención utiliza una enzima
derivada de una bacteria que pertenece a los géneros morganella,
escherichia, providencia, enterobacter, klebsiella o
serratia. Ejemplos representativos de tales bacterias
incluyen las siguientes cepas bacterianas:
Morganella morganii NCIMB 10466
Morganella morganii IFO 3168
Morganella morganii IFO 3848
Escherichia blattae JCM 1650
Escherichia blattae ATCC 33429
Escherichia blattae ATCC 3230
Providencia stuartii ATCC 29851
Providencia stuartii ATCC 33672
Enterobacter aerogenes IFO 12010
Enterobacter aerogenes IFO 13534
Klebsiella planticola IFO 14939
Klebsiella planticola IAM 1133
Serratia ficaria IAM 13540
Serratia marcescens IAM 12143
Se señala que la fosfatasa ácida (EC 3.1.3.2) es
originariamente una enzima que cataliza una reacción para hidrolizar
el éster fosfato en condiciones acídicas, y tiene actividad
nucleotidasa para degradar el éster
nucleósido-5'-fosfato producido por
la reacción de transfosforilación (de aquí en adelante la actividad
nucleotidasa se denomina ``actividad fosfomonoesterasa''). Con el
fin de obtener el éster
nucleósido-5'-fosfato con un alto
rendimiento, es adecuado utilizar la fosfatasa ácida mutante en la
que la afinidad por un nucleósido en la reacción de
transfosforilación sobre el nucleósido está aumentada en
comparación con la fosfatasa ácida de tipo salvaje producida por la
bacteria como se ha descrito anteriormente (de aquí en adelante
denominada simplemente ``fosfatasa ácida mutante'', si es
necesario). Preferiblemente se utiliza la fosfatasa ácida mutante
que tiene un valor de Km por debajo de 100.
La fosfatasa ácida mutante se puede obtener
mediante la expresión de un gen mutante obtenido mutando
directamente un gen que codifica una fosfatasa ácida como se ha
descrito anteriormente. Alternativamente, la fosfatasa ácida mutante
puede obtenerse también tratando un microorganismo que produce una
fosfatasa ácida con irradiación de luz ultravioleta o con un agente
mutante generalmente utilizado para la mutación artificial tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG), y cultivando un microorganismo mutado para producir una
fosfatasa ácida mutante que tenga afinidad por un nucleósido
aumentada y/o estabilidad térmica aumentada.
Se puede obtener una proteína que tiene actividad
fosfatasa ácida a partir de microorganismos como se ha descrito
anteriormente cultivando la cepa microbiana que tiene la actividad
en un medio apropiado, recogiendo las células microbianas
proliferadas, rompiendo las células microbianas para preparar un
extracto libre de células y purificando adecuadamente la proteína a
partir de él.
El medio para cultivar el microorganismo no se
limita específicamente, por lo que puede disponerse un medio común
que contiene una fuente común de carbono, una fuente de nitrógeno,
iones inorgánicos, y opcionalmente una fuente de nutrientes
orgánicos. La fuente de carbono que puede ser utilizada
adecuadamente incluye, por ejemplo, sacáridos, tales como glucosa y
sacarosa, alcoholes tales como glicerol y ácidos orgánicos. La
fuente de nitrógeno que puede utilizarse incluye, por ejemplo,
amoníaco gaseoso, amoníaco acuoso y sales de amonio. Los iones
inorgánicos que pueden utilizarse adecuadamente si es necesario
incluyen, por ejemplo, ion magnesio, ion fosfato, ion potasio, ion
hierro e ion manganeso. La fuente de nutrientes orgánicos que puede
utilizarse adecuadamente incluye, por ejemplo, vitaminas y
aminoácidos así como aquellas que las contienen, tales como
extracto de levaduras, peptona, extracto de carne, agua empleada
para remojar el maíz, hidrosilato de caseína e hidrosilato de
semillas de soja.
Las condiciones de cultivo tampoco se limitan
específicamente. Los microorganismos se pueden cultivar, por
ejemplo, en condiciones aeróbicas durante aproximadamente 12 a 48
horas controlando adecuadamente el pH y la temperatura con
intervalos de pH de 5 a 8 y de temperatura de 25 a 40ºC.
La células microbianas proliferadas se pueden
recoger a partir de un líquido de cultivo, por ejemplo, por
centrifugación. El extracto libre de células se prepara a partir de
las células microbianas recogidas utilizando un método convencional.
A saber, el extracto libre de células se obtiene rompiendo las
células microbianas mediante un método tal como tratamiento con
ultrasonidos, molino dyno y prensa francesa, y eliminando
los residuos celulares por centrifugación.
La fosfatasa ácida se purifica a partir del
extracto libre de células utilizando una combinación adecuada de
técnicas utilizadas generalmente para purificación de enzimas,
tales como fraccionamiento del sulfato amónico, cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de
afinidad, cromatografía de filtración en gel y purificación
isoeléctrica. En lo que respecta a la precipitación, no es
necesariamente indispensable purificar completamente la fosfatasa
ácida. Es suficiente lograr la eliminación de contaminantes tales
como la enzima que participa en la degradación del nucleósido como
sustrato.
Un fragmento de DNA que contiene un gen
estructural que codifica la proteína que tiene la actividad
fosfatasa ácida, puede clonarse a partir de, por ejemplo, células
del microorganismo que tiene la actividad enzimática. El método de
clonación incluye, por ejemplo, un método en el que una biblioteca
de expresión del gen cromosómico se investiga utilizando la
actividad enzimática como índice, un método en el que se prepara un
anticuerpo contra la proteína para investigar una biblioteca de
expresión del gen cromosómico, un método en el que se analiza una
secuencia de aminoácidos, tal como una secuencia
N-terminal de la proteína purificada, en función de
la cual se prepara una sonda para investigar una biblioteca
génica.
Específicamente, los genes que codifican la
fosfatasa ácida de morganella morganii, escherichia blattae,
providencia stuartii, enterobacter aerogenes, klebsiella
planticola, serratia ficaria o serratia marcescens
descritas anteriormente pueden clonarse preparando una biblioteca
de expresión del gen cromosómico de cada uno de los microorganismos
e investigando la biblioteca utilizando la actividad fosfatasa como
índice.
A saber, se puede preparar una biblioteca de
expresión del gen cromosómico preparando en primer lugar DNA
cromosómico a partir de morganella morganii o escherichia
blattae, degradándolo parcialmente con una enzima de restricción
adecuada, uniéndolo posteriormente con un vector replicable
autónomamente en la escherichia coli, y transformado la
escherichia coli con el DNA recombinante obtenido. Se puede
emplear una gran variedad de enzimas de restricción para la
digestión del DNA cromosómico ajustando el tiempo de la reacción de
digestión para ajustar el grado de digestión. Se puede utilizar
cualquier vector para clonar el gen con la condición de que sea
replicable autónomamente en la escherichia coli. Es posible
utilizar, por ejemplo, pUC19, pUC118, pHSG298, pBR322 y pBluescript
II.
El vector puede ligarse con el fragmento de DNA
que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida para preparar el
DNA recombinante realizando previamente la digestión del vector
con la misma enzima de restricción que se ha utilizado para la
digestión del DNA cromosómico, o con una enzima de restricción que
genera una hebra separada complementaria con una hebra separada del
fragmento de DNA cromosómico, y ligándolo con el fragmento de DNA
utilizando una ligasa, tal como la DNA ligasa T4. Cualquier cepa
microbiana puede utilizarse como receptor para el DNA recombinante
preparado con la condición de que sea apropiado para la replicación
del vector. Es posible utilizar, por ejemplo, cepas microbianas de
escherichia coli, tales como HB101, JM109 y DH5.
Las transformantes obtenidas de este modo se
hacen crecer en un medio de agar para formar sus colonias. Después
de esto, cuando se vierte una disolución de reacción que contiene
ácido p-nitrofenilfosfórico sobre una superficie del
medio para realizar la reacción, entonces una cepa que ha
expresado la actividad fosfatasa, libera
p-nitrofenol y presenta color amarillo. Se puede
elegir una transformante que hospeda un fragmento de DNA que
contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida objetivo realizando
la reacción descrita anteriormente en condiciones acídicas, y
eligiendo la transformante utilizando el desarrollo del color como
índice.
Después de esto, el DNA recombinante se recupera
a partir de la transformante elegida para analizar la estructura del
fragmento de DNA que contiene el gen que codifica la fosfatasa
ácida ligada con el vector. Una secuencia de nucleótidos del gen
que codifica la fosfatasa ácida se muestra en la secuencia SEQ ID
NO: 2 del listado de secuencias en el caso de un gen derivado de
morganella morganii NCIMB 10466, la secuencia SEQ ID NO: 6
del listado de secuencias en al caso de un gen derivado de
escherichia blattae JCM 1650, la secuencia SEQ ID NO: 21 del
listado de secuencias en el caso de un gen derivado de
providencia stuartii ATCC 29851, la secuencia SEQ ID NO: 23
del listado de secuencias en al caso de un gen derivado de
enterobacter aerogenes IFO 12010, la secuencia SEQ ID NO: 25
del listado de secuencias en al caso de un gen derivado de
klebsiella planticola IFO 14939 o la secuencia SEQ ID NO: 27
del listado de secuencias en al caso de un gen derivado de
serratia ficaria IAM 13540.
Las secuencias de aminoácidos deducidas de las
fosfatasas ácidas codificadas por los genes anteriores se ilustran
en las secuencias SEQ ID NOs: 4, 8, 22, 24, 26 y 28.
Para la presente invención, se utilizan
preferiblemente variantes de las fosfatasas ácidas codificadas por
los genes anteriores que tienen la afinidad por el nucleósido
aumentada y/o estabilidad térmica aumentada. También se utiliza
preferiblemente para la presente invención una fosfatasa ácida que
comprende una secuencia de aminoácidos que es esencialmente
idéntica a una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las
fosfatasas ácidas codificadas por los genes anteriores. La expresión
``esencialmente idéntica'' significa que las secuencias de
aminoácidos de las fosfatasas ácidas pueden presentar sustitución,
deleción, inserción o transición de uno o varios restos de
aminoácidos sin perder la actividad para producir éster
nucleósido-5'-fosfato (de aquí en
adelante denominada ``actividad de transfosforilación'').
Preferiblemente, las variantes tienen una constante de Michaelis,
Km, por debajo de 100ºC como se ha descrito anteriormente y no
presentan esencialmente pérdida de actividad cuando se mantienen a
50ºC y pH 7 durante 30 minutos.
La fosfatasa ácida del tipo salvaje obtenida como
se ha descrito anteriormente tiene actividad fosfomonoesterasa. Por
lo tanto, la actividad fosfomonoesterasa puede servir como factor
para producir la degradación subsecuente del producto a medida que
el tiempo de reacción transcurre en la producción del éster
nucleósido-5'-fosfato, lo que
resulta en una disminución del rendimiento de la reacción. Con el
fin de superar tal circunstancia, es ventajoso producir una
mutación artificial en el gen que codifica la fosfatasa ácida de
manera que la afinidad por un nucleósido se aumente.
La realización posterior de una reacción de
transferencia de fosfato por la fosfatasa ácida a una temperatura
superior lleva a una producción mucho más efectiva del
nucleósido-5'-fosfato porque la
velocidad de reacción aumenta y la concentración de un receptor de
fosfato en la disolución de reacción puede ser superior. Para este
fin es ventajoso producir una mutación artificial en el gen que
codifica la fosfatasa ácida de manera que la estabilidad térmica
aumente.
Los métodos de mutagénesis dirigida para producir
la mutación objetivo en un lugar objetivo del DNA incluyen, por
ejemplo, un método que utiliza PRC [Higuchi, R. 61, en PCR
Technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton Press (1989); Carter,
P. Meth. in Enzymol. 154, 382 (1987) y un método que
utiliza un fago (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in
Enzymol. 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al. Meth. in
Enzymol. 154, 367 (1987)].
La fosfatasa ácida mutante que tiene la afinidad
por el nucleósido aumentada se ejemplifica por la fosfatasa ácida
que comprende una secuencia de aminoácidos que es esencialmente
idéntica a la secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo que
consta de las secuencias ilustradas por las secuencias SEQ ID NOs:
4, 8, 22, 24, 26 y 28 del listado de secuencias, y tiene una
mutación que aumenta la afinidad por el nucleósido en comparación
con la fosfatasa ácida del tipo salvaje. Concretamente, la fosfatasa
ácida mutante se ejemplifica, para la enzima derivada de
escherichia blattae JCM 1650, con una en la que el resto 74º
glicina y/o el resto 153º isoleucina se sustituye por otro resto
aminoácido en una secuencia de aminoácidos ilustrada en la secuencia
SEQ ID Nº: 8 en el listado de secuencias. En los ejemplos descritos
a continuación, un gen que codifica la fosfatasa ácida mutante se
ilustra como ejemplo en el que el resto 74º glicina se sustituye
con un resto ácido aspártico, y el resto 153º isoleucina se
sustituye con un resto treonina.
Mutaciones adicionales elegidas entre el grupo
que consta de sustituciones del resto 63º leucina, el resto 65º
alanina, el resto 66º ácido glutámico, el resto 69º asparagina, el
resto 71º serina, el resto 72º serina, el resto 85º serina, el
resto 92º alanina, el resto 94º alanina, el resto 116º ácido
aspártico, el resto 130º serina, el resto 135º treonina y/o el resto
136º ácido glutámico por otro aminoácido en la secuencia SEQ ID NO:
8 del listado de secuencias, aumentan adicionalmente la afinidad por
el nucleósido de la fosfatasa ácida.
La fosfatasa ácida mutante que tiene la
estabilidad térmica aumentada se ejemplifica por la fosfatasa ácida
que comprende una secuencia de aminoácidos que es esencialmente
idéntica a una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo que
consta de las secuencias ilustradas en las secuencias SEQ ID NOs: 4,
8, 22, 24, 26 y 28 del listado de secuencias, y tiene una mutación
que aumenta la estabilidad térmica de la fosfatasa ácida del tipo
salvaje. Concretamente, la fosfatasa ácida mutante se ejemplifica,
para la enzima derivada de escherichia blattae JCM 1650, por
una en la que el resto 104º ácido glutámico y/o el resto 151º
treonina se sustituye por otro resto aminoácido en la secuencia de
aminoácidos ilustrada en la secuencia SEQ ID NO: 8 del listado de
secuencias. En los ejemplos descritos a continuación, un gen que
codifica la fosfatasa ácida mutante se ilustra como un ejemplo en el
que el resto 104º ácido glutámico se sustituye con un resto glicina,
y el resto 151º treonina se sustituye por un resto alanina.
Por lo tanto, el nucleótido puede sustituirse en
un lugar específico del gen de tipo salvaje según el método de
mutagénesis dirigida descrito anteriormente, de manera que estas
fosfatasas ácidas mutantes se codifiquen. La mutación para aumentar
la afinidad por el nucleósido es adecuadamente un tipo de mutación
por la que la actividad para producir éster
nucleósido-5'-fosfato no disminuye
esencialmente en comparación con la fosfatasa ácida del tipo
salvaje. Sin embargo, incluso en el caso en el que la actividad
para producir éster
nucleósido-5'-fosfato disminuya,
será suficiente si el grado de disminución de la actividad
fosfomonoesterasa es mayor que la de la actividad para producir
éster nucleósido-5'-fosfato, con el
resultado que la relación entre la actividad fosfomonoesterasa y la
actividad para producir éster
nucleósido-5'-fosfato de la
fosfatasa ácida mutante disminuye en comparación con la de la
fosfatasa ácida del tipo salvaje. Como en el caso del grado de
aumento en la afinidad por el nucleósido, el valor de Km para el
nucleósido en la reacción de transfosforilación es preferiblemente
inferior a 100.
La mutación que aumenta la estabilidad térmica
significa una que tiene más actividad residual después de un
tratamiento térmico que la que tiene la fosfatasa ácida del tipo
salvaje. El grado de aumento de la estabilidad térmica es
preferiblemente el que no produce disminución en la actividad con el
tratamiento a pH 7,0, 50ºC, 30 minutos.
Como se ilustra a continuación en los modos de
realización, la secuencia de aminoácidos de la fosfatasa ácida de
escherichia blattae JCM 1650 es altamente homóloga con la de
morganella morganii NCIMB 10466, y el resto 72º glicina, el
resto 102º ácido glutámico, el resto 149º treonina y el resto 151º
isoleucina en la secuencia de aminoácidos ilustrada por la secuencia
SEQ ID NO: 4 corresponde al resto 74º glicina, el resto 104º ácido
glutámico, el resto 151º treonina y el resto 153º isoleucina en la
secuencia de aminoácidos ilustrada por la secuencia SEQ ID NO: 8
respectivamente. Adicionalmente, además de la escherichia
blattae JCM 1650, las secuencias de aminoácidos de las
fosfatasas ácidas derivadas de microorganismos tales como de
providencia stuartii ATCC 29851, enterobacter
aerogenes IFO 12010, klebsiella planticola IFO 14939 y
serratia ficaria IAM 13450 tienen una gran homología con la
de morganella morganii NCIMB 10466, y las secuencias de
aminoácidos de estas fosfatasas ácidas incluyen restos de
aminoácidos cada uno de los cuales se corresponden con el resto 72º
glicina, el resto 102º ácido glutámico, el resto 149º treonina y el
resto 151º isoleucina en una secuencia de aminoácidos ilustrada por
la secuencia SEQ ID Nº: 4, respectivamente. Por lo tanto, los genes
que codifican las fosfatasas ácidas mutantes derivadas de estos
microorganismos pueden obtenerse como se ha descrito anteriormente.
El resto 92º glicina, el resto 122º ácido glutámico, el resto 169º
treonina y el resto 171º isoleucina en la secuencia de aminoácidos
de la fosfatasa ácida derivada de la providencia stuartii
ATCC 29851, enterobacter aerogenes IFO 12010 o klebsiella
planticola IFO 14939 ilustradas en las secuencias SEQ ID NO:
22, 24 ó 26, y el resto 88º glicina, el resto 118º ácido glutámico,
el resto 165º treonina y el resto 167º isoleucina en la secuencia
de aminoácidos de la fosfatasa ácida derivada de la serratia
ficaria IAM 13450 ilustrada en la secuencia SEQ ID NO: 28
respectivamente corresponden al resto 72º glicina, el resto 102º
ácido glutámico, el resto 149º treonina y el resto 151º isoleucina
en la secuencia de aminoácidos ilustrada en la secuencia SEQ ID NO:
4.
El resultado de la comparación de las secuencias
de aminoácidos de la fosfatasa ácida anterior se ilustra en la
figura 12. Basándose en la figura 12, se decide cual resto
aminoácido de una fosfatasa ácida corresponde con otro resto
aminoácido de otra fosfatasa ácida.
Se puede obtener un microorganismo recombinante
para expresar la actividad fosfatasa ácida a un alto nivel
introduciendo el fragmento de DNA que contiene el gen que codifica
la proteína que tiene la actividad fosfatasa ácida obtenido como se
ha descrito anteriormente en células de un huésped después de
recombinar el fragmento de DNA de nuevo con un vector apropiado. En
tal procedimiento, la fosfatasa ácida del tipo salvaje se expresa
utilizando el gen que codifica la fosfatasa ácida de tipo salvaje,
mientras que la fosfatasa ácida mutante se expresa utilizando el gen
que codifica la fosfatasa ácida mutante.
El huésped incluye las cepas microbianas de
escherichia coli, tales como HB101, JM109 y DH5 descritas
anteriormente. Además de estas cepas, se puede utilizar cualquier
bacteria como huésped con la condición de que el origen de
replicación de DNA recombinante construido y el gen de la fosfatasa
ácida realicen sus funciones, el DNA recombinante sea replicable y
el gen de la fosfatasa ácida sea expresable. Uno de los huéspedes
más preferidos es la escherichia coli JM109.
El vector para incorporar el gen que codifica la
fosfatasa ácida en éste no se limita específicamente, con la
condición de que sea replicable en el huésped. Cuando se utiliza
escherichia coli como huésped, el vector puede ejemplificarse
mediante plásmidos replicables autónomamente en esta bacteria. Por
ejemplo, es posible utilizar plásmidos del tipo ColE1, plásmidos
del tipo p15A, plásmidos del tipo factor R y plásmidos del tipo
fago. Tales plásmidos incluyen específicamente, por ejemplo, el
pBR322 (Gene, 2, 95 (1997), pUC19 (Gene, 33, 103
(1985), el pU119 (Methods in Enzymology, 153, 3 (1987), el
pACYC184 (J. Bacteriol., 134, 1141 (1978) y el pSC101
(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70, 3.240 (1973).
Cuando el fragmento de DNA que contiene el gen
que codifica la fosfatasa ácida contiene un promotor que es
funcional en el huésped, el fragmento de DNA puede unirse con el
vector tal como es. Cuando el fragmento de DNA no contiene tal
promotor, otro promotor que actúe en el microorganismo huésped, tal
como lac, trp y PL, puede unirse en una posición más arriba del
gen. Incluso cuando el fragmento de DNA contiene el promotor, el
promotor puede sustituirse por otro promotor con el fin de expresar
eficazmente el gen que codifica la fosfatasa ácida.
No hay limitación especial para el método para
introducir en el huésped el DNA recombinante construido uniendo el
vector con el fragmento de DNA que contiene el gen que codifica la
fosfatasa ácida. El DNA recombinante puede introducirse en el
huésped utilizando un método convencional. Cuando se utiliza
escherichia coli como huésped, es posible utilizar, por
ejemplo, el método del cloruro de calcio [J. Mol. Biol. 53,
159 (1970)], el método de Hanahan [J. Mol. Biol., 166, 557
(1983)], un método por SEM [Gene, 96, 23 (1990)] el método
de Chung et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86,
2.172 (1989)] y electroporación [Nucleic Acids Res., 16,
6.127 (1988)].
El gen de la fosfatasa ácida puede insertarse en
el DNA vector replicable autónomamente, el cual puede introducirse
en el huésped de manera que es hospedado por el huésped como DNA
extracromosómico como se ha descrito anteriormente.
Alternativamente, el gen de la fosfatasa ácida puede incorporarse en
un cromosoma del microorganismo huésped conforme a un método que
utiliza transducción, transposón (Biotechnol., 1, 417 (1983),
fago Mu (Patente japonesa abierta a inspección pública Nº
2-109.985) o recombinación homóloga[Experiments
in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)].
La transformante obtenida como se ha descrito
anteriormente, en la que se ha introducido el DNA recombinante que
contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida, es capaz de
expresar la actividad fosfatasa ácida a un alto nivel en sus células
cultivándolas en un medio apropiado que contiene una fuente de
carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos y opcionalmente
una fuente de nutrientes orgánicos. La fuente de carbono que puede
ser utilizada adecuadamente incluye, por ejemplo, carbohidratos
tales como glucosa, alcoholes tales como glicerol, y ácidos
orgánicos. La fuente de nitrógeno que puede utilizarse incluye, por
ejemplo, amoníaco gaseoso, amoníaco acuoso y sales de amonio. Los
iones inorgánicos que pueden ser utilizados adecuadamente si es
necesario incluyen, por ejemplo, ion magnesio, ion fosfato, ion
potasio, ion hierro e ion manganeso. La fuente de nutrientes
orgánicos que puede ser utilizada adecuadamente incluye, por
ejemplo, vitaminas y aminoácidos así como aquellas que las
contienen, tales como extracto de levadura, peptona, extracto de
carne, agua empleada para remojar el maíz, hidrosilato de caseína e
hidrosilato de semillas de soja. La cantidad de expresión de la
actividad fosfatasa ácida puede aumentarse añadiendo al medio un
agente inductor de expresión que depende de un promotor tal como
IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido).
Las condiciones de cultivo tampoco están
específicamente limitadas. El cultivo se puede realizar, por
ejemplo, en condiciones aerobias durante aproximadamente 12 a 48
horas controlando el pH y la temperatura adecuadamente, en
intervalos de pH de 5 a 8 y de temperatura de 25 a 40ºC.
Después de esto, las células microbianas se
recogen del cultivo, y se obtiene un extracto libre de células por
ruptura, a partir del cual se puede purificar la fosfatasa ácida.
La purificación se realiza utilizando una combinación apropiada de
técnicas empleadas generalmente para la purificación de enzimas,
tales como las descritas en el apartado 1) anterior. En lo que se
refiere a la purificación, no es necesariamente indispensable
purificar completamente la fosfatasa ácida. Es suficiente lograr la
eliminación de contaminantes tales como la enzima que participa en
la degradación del nucleósido como sustrato.
El éster
nucleósido-5'-fosfato se puede
producir en una mezcla de reacción permitiendo que la fosfatasa
ácida obtenida como se ha descrito anteriormente, y que tiene
afinidad por el nucleósido aumentada y/o estabilidad térmica
aumentada, tal como la fosfatasa ácida mutante obtenida expresando
el gen en una gran cantidad de acuerdo con la técnica de ingeniería
genética como se ha descrito en el apartado 5), entre en contacto y
produzca la reacción de un nucleósido con un donante de grupo
fosfato elegido entre el grupo que consta de ácido polifosfórico o
una de sus sales, ácido fenilfosfórico o una de sus sales, ácido
acetilfosfórico o una de sus sales y carbamilfosfato o una de sus
sales. Con el fin de obtener una productividad elevada en esta
reacción es importante ajustar el pH de la disolución de reacción
para que sea débilmente acídica en un intervalo de 3,0 a 5,5.
Cuando el gen que codifica la fosfatasa ácida se
expresa en una gran cantidad mediante la técnica de ingeniería
genética, especialmente cuando el gen que codifica la fosfatasa
ácida mutante que tiene la afinidad por el nucleósido aumentada se
expresa en una gran cantidad, entonces es posible también producir
el éster nucleósido-5'-fosfato de
manera económica y eficaz utilizando un cultivo que contiene células
microbianas de la transformante, las células microbianas separadas
y recogidas del cultivo, o un producto obtenido de las células
microbianas conforme a, por ejemplo, un tratamiento inmovilizador,
un tratamiento de acetona o un tratamiento de liofilización, en
lugar de la fosfatasa ácida purificada.
El nucleósido que debe ser utilizado incluye, por
ejemplo, nucleósidos de purina, tales como inosina, guanosina,
adenosina, xantosina, purina ribósida,
6-metoxipurina ribósida,
2,6-diaminopurina ribósida,
6-fluoropurina ribósida, 6-tiopurina
ribósida,
2-amino-6-tiopurina
ribósida y mercaptoguanosina; y nucleósidos de pirimidina tales
como uridina, histidina, 5-aminouridina,
5-hidroxiuridina, 5-bromoutidina y
6-azauridina. Como resultado de la reacción, estos
nucleósidos de tipo natural y nucleósidos de tipo no natural se
fosforilan específicamente en sus posiciones 5', y se producen los
correspondientes ésteres
nucleósido-5'-fosfato
respectivamente.
El nucleósido se añade adecuadamente a la
disolución de reacción a una concentración de 1 a 20 g/dL. En el
caso de utilizar un nucleósido que sea escasamente soluble en agua,
el rendimiento de la reacción puede aumentarse añadiendo ácido
bórico o un tensioactivo tal como dimetilsulfóxido.
Cuando se produce el nucleósido por fermentación,
el medio de fermentación después de la propia fermentación puede
añadirse al líquido de la reacción de fosforilación.
Cuando se incluye en el medio un elemento que
descompone el éster
nucleósido-5'-fosfato, se emplea
preferiblemente una etapa de purificación de manera que se elimine
dicho elemento.
En lo que respecta al donante de grupo fosfato
que debe utilizarse, aquellos utilizables como ácido polifosfórico o
una de sus sales incluyen, por ejemplo, ácido pirofosfórico, ácido
tripolifosfórico, ácido trimetafosfórico, ácido tetrametafosfórico,
ácido hexametafosfórico, sus mezclas, sus sales sódicas, sus sales
potásicas y mezclas de estas sales. Aquellos utilizables como ácido
fenilfosfórico o una de sus sales incluyen, por ejemplo,
fenilfosfato de disodio, fenilfosfato de dipotasio, anhídrido del
ácido O,O-difenilfosfórico, y sus mezclas.
Aquellos utilizables como carbamilfosfato o una de sus sales
incluyen, por ejemplo, carbamilfosfato de disodio, carbamilfosfato
de dipotasio, carbamilfosfato de diamonio, carbamilfosfato de
dilitio, y sus mezclas. Aquellos utilizables como ácido
acetilfosfórico o una de sus sales incluyen, por ejemplo,
acetilfosfato de litio y potasio. La concentración a la que el
donante de grupo fosfato se utiliza está determinada por la
concentración del nucleósido como aceptor de grupo fosfato. El
donante de grupo fosfato se utiliza generalmente en una cantidad que
es de 1 a 5 veces la del nucleósido.
Se obtiene un resultado preferido en la reacción
generalmente a una temperatura de 20 a 60ºC, preferiblemente de 30 a
40ºC, a un pH en una zona ligeramente ácida de 3,5 a 6,5,
preferiblemente de 4,0 a 5,0. La temperatura de reacción cuando se
utiliza la fosfatasa ácida mutante con la estabilidad térmica
aumentada es 20 a 70ºC, preferiblemente de 30 a 60ºC. La reacción
puede realizarse adoptando uno cualquiera de los métodos
estacionarios y métodos con agitación. El tiempo de reacción se
prolonga dependiendo de las condiciones tal como la actividad de la
enzima que se va a utilizar y de la concentración del sustrato, sin
embargo, es de 1 a 100 horas.
El éster
nucleósido-5'-fosfato producido de
este modo puede recogerse y ser separado de una mezcla después de la
finalización de la reacción adoptando un método para utilizar una
resina sintética para adsorción, un método para utilizar un agente
de precipitación, y otros métodos convencionales de recogida y
separación.
Los modos de realización de la presente invención
se explicarán específicamente a continuación con referencia a los
ejemplos, sin embargo, la presente invención no se limita a estos
ejemplos.
La actividad de transfosforilación se midió en
las condiciones siguientes utilizando inosina como sustrato. La
reacción se realizó a pH 5,0 a 30ºC durante 10 minutos en una
disolución de reacción (1 mL) que contiene 40 \mumoles/mL de
inosina, 100 \mumoles/mL de pirofosfato de sodio, 100
\mumoles/mL de una disolución tampón de acetato de sodio (pH 5,0)
y una enzima. La reacción se detuvo añadiendo 200 \muL de ácido
clorhídrico 2N. Después de esto, los precipitados se eliminaron por
centrifugación. Luego, el ácido 5'-inosínico
producido por la reacción de transfosforilación se midió
cuantitativamente. Una cantidad de enzima para producir 1 \mumol
de ácido 5'-inosínico por 1 minuto en las
condiciones estándar de reacción se definió como 1 unidad.
La actividad fosfomonoesterasa se midió en las
siguientes condiciones utilizando ácido 5'-inosínico
como sustrato. La reacción se realizó a 30ºC durante 10 minutos en
una disolución de reacción (1 mL) que contenía 10 \mumoles/mL de
ácido 5'-inosínico, 100 \mumoles/mL de una
disolución tampón de MES/NaOH (pH 6,0) y una enzima. La reacción se
detuvo añadiendo 200 mL de ácido clorhídrico 2N. Después de esto,
los precipitados se eliminaron por centrifugación. Luego, la inosina
producida por la reacción hidrolítica se midió cuantitativamente.
Una cantidad de enzima para producir 1 \mumol de inosina por 1
minuto en estas condiciones estándar de reacción se definió como 1
unidad.
La inosina y el ácido
5'-inosínico se analizaron en las condiciones
siguientes mediante cromatografía de líquidos de alta resolución
(HPLC):
Columna: | Cosmosil 5C18-AR (4,6 x 150 mm) (producida por nacalai tesque); |
Fase móvil: | disolución tampón de fosfato de potasio 5 mM (pH 2,8)/metanol = 95/5; |
Caudal: | 1,0 mL/min; |
Temperatura: | temperatura ambiente; |
Detección: | UV 245 nm, |
Incidentalmente, en la reacción para producir
ésteres nucleósido-5'-fosfato
utilizando nucleósidos distintos de la inosina como materia prima,
los nucleósidos como materia prima y los ésteres
nucleósido-5'-fosfato producidos se
analizaron por HPLC como se ha descrito anteriormente.
Un medio nutriente (pH 7,0, 50 mL) que contenía 1
g/dL de peptona, 0,5 g/dL de extracto de levadura y 1 g/dL de
cloruro de sodio se vertió en matraces de Sakaguchi (500 mL) que se
esterilizaron a 120ºC durante 20 minutos. Un cultivo inclinado de
morganella morganii NCIMB 10466 se inoculó en cada uno de los
matraces una vez con un asa de extensión de platino, el cual se
incubó a 30ºC durante 16 horas con agitación. Las células
microbianas (aproximadamente 3,000 g), que se recogieron del
cultivo por centrifugación, se pusieron en suspensión en una
disolución tampón de fosfato de sodio 100 mM (1 L, pH 7,0). Se
realizó un tratamiento por ultrasonidos a 4ºC durante 20 minutos
para romper las células microbianas. La suspensión tratada se
centrifugó para eliminar su fracción insoluble. Se preparó de este
modo un extracto libre de células.
Se añadió sulfato de amonio al extracto libre de
células de manera que se obtuvo un 30% de saturación. El precipitado
que aparece se eliminó por centrifugación, y luego se añadió
adicionalmente sulfato de amonio al sobrenadante de manera que se
obtuvo un 60% de saturación. El precipitado que aparece se recogió
por centrifugación y se disolvió en una disolución tampón de
fosfato de potasio 100 mM.
Esta disolución enzimática bruta se dializó
cuatro veces frente a 5 L de una disolución tampón de fosfato de
potasio 100 mM (pH 7,0) y luego se aplicó a una columna
DEAE-Toyopeal 650M (\phi 4,1 x 22 cm) equilibrada
con disolución tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0), seguido
por lavado con 800 mL de una disolución tampón de fosfato de
potasio 20 mM (pH 7,0). La actividad de transfosforilación se
encontró en una fracción que pasó a través de la columna y por lo
tanto la fracción se recuperó.
Se añadió sulfato de amonio a la fracción activa
de manera que se obtuvo 35% de saturación, la cual se adsorbió en
una columna de butil-Toyopeal (\phi 3,1 x 26 cm)
equilibrada con una disolución tampón de fosfato de potasio 20 mM
(pH 7,0) que contenía sulfato de amonio con 35% de saturación. La
elución se realizó utilizando un gradiente lineal de concentración
de 35% de saturación a 20% de saturación en una disolución tampón
de fosfato de potasio (pH 7,0).
Las fracciones activas se recogieron y se
dializaron frente a 1 L de disolución tampón de fosfato de potasio
50 mM (pH 7,0), seguido por aplicación a una columna de
hidroxiapatita (\phi 5 x 6,5 cm) equilibrada con una disolución
tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,0). La elución se realizó
utilizando un gradiente lineal de concentración de 50 mM a 300 mM de
disolución tampón de fosfato de potasio (pH 7,0).
Las fracciones activas se recogieron y se
concentraron por ultrafiltración. Esta disolución enzimática se
aplicó en una columna HiLoad TM 16/60 Superdex 200 (producida por
Pharmacia). La elución se realizó con un caudal de 1,0 mL/minuto
utilizando una disolución tampón de fosfato de potasio 50 mM que
contenía cloruro de sodio 100 mM.
Conforme al procedimiento descrito anteriormente,
la enzima que presenta actividad de transfosforilación se purificó a
partir del extracto libre de células consecuentemente
aproximadamente 550 veces a una relación de recuperación de
aproximadamente 10%. La actividad específica y la relación de
recuperación en este procedimiento de purificación se muestran en
la tabla 1. Esta muestra de enzima fue homogénea por electroforesis
en gel de SDS-poliacrilamida.
Recuperación por | Actividad | Proteína total | Actividad | Relación |
etapas | total | (mg) | específica | (%) |
(unidad) | (unidad/mg) | |||
1. Extracto libre de | 597 | 127.200 | 0,005 | 100 |
células | ||||
2. Fraccionamiento | 568 | 122.210 | 0,005 | 95 |
del sulfato de amonio | ||||
(30 al 60%) | ||||
3. DEAE-Toyopearl | 517 | 36.498 | 0,014 | 87 |
4. Butil-Toyopearl | 394 | 1.121 | 0,351 | 66 |
5. Hidroxiapatita | 112 | 50 | 2,244 | 19 |
6. Superdex 200 | 63 | 24 | 2,60 | 10 |
La enzima purificada presentó las siguientes
propiedades:
- (1)
- Acción: el grupo fosfato se transfiere de un donante de grupo fosfato, tal como ácido polifosfórico, al nucleósido, y se produce el éster nucleósido-5'-fosfato. Inversamente, esta enzima también presenta actividad para hidrolizar el éster fosfato.
- (2)
- Especificidad de sustrato: los compuestos que sirven como donantes de grupo fosfato en la reacción de transfosforilación incluyen, por ejemplo, ácido pirofosfórico, ácido tripolifosfórico, ácido trimetafosfórico, ácido tetrametafosfórico, ácido hexametafosfórico, fenilfosfato de disodio, fenilfosfato de dipotasio, anhídrido del ácido O,O-difenilfosfórico, carbamilfosfato de disodio, carbamilfosfato de dipotasio, carbamilfosfato de diamonio, carbamilfosfato de dilitio. Los compuestos que sirven como aceptor del grupo fosfato incluyen, por ejemplo, purina ribósida, inosina, guanosina, adenosina, xantosina, uridina y citidina. Por otra parte, los compuestos que experimentan la acción en la reacción hidrolítica del éster fosfato incluyen, por ejemplo, ácido fosfórico inorgánico, tales como ácido pirofosfórico, ácido tripolifosfórico, ácido trimetafosfórico, ácido tetrametafosfórico, ácido hexametafosfórico; éster fosfato, tal como fenilfosfato de disodio, fenilfosfato de dipotasio, anhídrido del ácido O,O-difenilfosfórico, carbamilfosfato de disodio, carbamilfosfato de dipotasio, carbamilfosfato de diamonio y carbamilfosfato de dilitio; y 5'-nucleótidos, tales como 5'-purina ribósida, ácido 5'-inosínico, ácido 5'-guanílico, ácido 5'-adenílico, ácido 5'-xantílico, ácido 5'-uridílico y ácido 5'-citidílico.
- (3)
- pH óptimo: 5,2 (reacción de transfosforilación), 6,5 (reacción hidrolítica del éster fosfato).
- (4)
- Estabilidad del pH: pH 3,0 a 12,0 (tratamiento a 30ºC durante 60 minutos).
- (5)
- Temperatura óptima: 35ºC aproximadamente.
- (6)
- Estabilidad térmica: estable hasta 30ºC (tratamiento a pH 7,0 durante 30 minutos).
- (7)
- Efecto de la adición de un ion metálico e inhibidor: esta enzima no presenta fenómenos de activación relacionados con su actividad por adición de ningún ion metálico. La actividad es inhibida por Ag^{2+}, Pb^{2+}, Hg^{2+} y Cu^{2+}. La actividad también es inhibida por el ácido yodoacético.
- (8)
- Peso molecular: el peso molecular calculado es aproximadamente 190.000 conforme a cromatografía de líquidos de alta resolución (TSK gel G-3000SW, producido por Toyo Soda)
- (9)
- Peso molecular de la subunidad: el peso molecular calculado de la subunidad es 25.000 conforme con electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
Esta enzima presenta no sólo actividad para
transferir el grupo fosfato al nucleósido, sino también actividad
para hidrolizar reversiblemente el éster fosfato. Además, esta
enzima presenta actividad hidrolítica del éster fosfato (actividad
fosfomonoesterasa) que es mayor que la actividad de
transfosforilación en no menos de 20 veces. Otras propiedades
coinciden bien con las de una fosfatasa ácida conocida producida
por una bacteria perteneciente al género morganella
[Microbiology, 140, 1.341-1.350 (1994)].
Consecuentemente, se ha demostrado que esta enzima es una fosfatasa
ácida.
Se disolvieron pirofosfato de sodio (10 g/dL) e
inosina (2 g/dL) en disoluciones tampones de acetato de sodio que
tenían cada una de ellas un pH de 5,5, 5,0, 4,5, 4,0 y 3,5, a lo
que se añadió la muestra de enzima descrita anteriormente de manera
que se obtuvo una concentración de 50 unidades/dL. La mezcla de
reacción se incubó a 30ºC durante 6 horas, manteniendo cada pH, y
se midió la cantidad de ácido 5'- inosínico producido a lo largo del
tiempo. El ácido inosínico producido contenía solamente ácido
5'-inosínico. No se observó en absoluto producción
secundaria de ácido 2'-inosínico ni de ácido
3'-inosínico. El resultado se muestra en la figura
1. La velocidad de producción de ácido 5'-inosínico
fue máxima a pH 5,0. Sin embargo, la cantidad máxima acumulada de
ácido 5'-inosínico fue mayor a menor pH. La
condición de reacción a pH 4,0 fue más eficiente para la producción
de ácido 5'-inosínico, en la que el ácido
5'-inosínico se produjo y se acumuló en una cantidad
de 2,60 g/dL realizando la reacción durante 3 horas.
Se disolvieron pirofosfato de sodio (10 g/dL) e
inosina, guanosina, uridina o citidina (2 g/dL), como aceptores del
grupo fosfato, en una disolución tampón de acetato de sodio (pH
4,0) a lo que se añadió la muestra de enzima preparada en el
ejemplo 1 de manera que su concentración fue de 50 unidades/dL. La
mezcla de reacción se incubó a 30ºC durante 3 horas manteniendo el
pH a 4,0. La cantidad de nucleósido-5'-éster
producida por la reacción se muestra en la tabla 2.
El nucleótido producido contenía sólo
nucleósido-5'-éster. No se observó en absoluto
producción secundaria de nucleósido-2'-éster ni de
nucleósido-3'-éster.
Donante de grupo fosfato | Producto | Cantidad producida (g/dL) |
Inosina | Ácido 5'-inosínico | 2,60 |
Guanosina | Ácido 5'-guanílico | 1,90 |
Uridina | Ácido 5'-uridílico | 1,30 |
Citidina | Ácido 5'-citidílico | 0,98 |
Se disolvieron inosina (2 g/dL) y tripolifosfato
de sodio, polifosfato de sodio (nombre comercial: Polygon P,
producido por Chiyoda Chemical), fenilfosfato de disodio, o
carbamilfosfato de disodio (10 g/dL), como donantes de grupo
fosfato, en una disolución tampón de acetato de sodio (pH 4,0) a la
que se añadió la muestra de la enzima preparada en el ejemplo 1 de
manera que su concentración fue de 50 unidades/dL. La mezcla de
reacción se incubó a 30ºC durante 3 horas manteniendo el pH a 4,0.
La cantidad de ácido 5'-inosínico producido por la
reacción se muestra en la tabla 3.
El ácido 5'-inosínico se produjo
y se acumuló eficazmente utilizando cualquiera de los donantes de
grupo fosfato. Sin embargo, la cantidad de ácido
5'-inosínico acumulada cuando se usó polifosfato de
sodio como donante de grupo fosfato fue la más alta.
Donante de grupo fosfato | Ácido 5'-inosínico producido (g/dL) |
Tripolifosfato de sodio | 2,10 |
Polifosfato de sodio | 2,72 |
Fenilfosfato de disodio | 2,33 |
Carbamilfosfato de disodio | 2,54 |
Un medio nutriente (pH 7,0, 50 mL) que contenía 1
g/dL de peptona, 0,5 g/dL de extracto de levadura y 1 g/dL de
cloruro de sodio se vertió en matraces de Sakaguchi (500 mL) que se
esterilizaron a 120ºC durante 20 minutos. Un cultivo inclinado de
escherichia blattae JCM1650 se inoculó en cada uno de los
matraces una vez con un asa de extensión de platino, el cual se
cultivó a 30ºC durante 16 horas con agitación. Las células
microbianas se recogieron del cultivo por centrifugación. Las
células microbianas (3,300 g aproximadamente) se pusieron en
suspensión en una disolución tampón de fosfato de sodio 100 mM (1 L,
pH 7,0). Se realizó un tratamiento por ultrasonidos a 4ºC durante
20 minutos para romper las células microbianas. La suspensión
tratada se centrífugo para eliminar su fracción insoluble. Se
preparó de este modo un extracto libre de células.
Se añadió sulfato de amonio al extracto libre de
células de manera que se obtuvo un 30% de saturación. El precipitado
que apareció se eliminó por centrifugación, y luego se añadió
adicionalmente sulfato de amonio al sobrenadante de manera que se
obtuvo un 60% de saturación. El precipitado que apareció se recogió
por centrifugación y se disolvió en una disolución tampón de
fosfato de potasio 100 mM.
Esta disolución enzimática bruta se dializó
cuatro veces frente a 5 L de una disolución tampón de fosfato de
potasio 100 mM (pH 7,0) y luego se aplicó a una columna
DEAE-Toyopeal 650M (\phi 6,2 x 35 cm) equilibrada
con disolución tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0), seguido
por lavado con 800 mL de una disolución tampón de fosfato de
potasio 20 mM (pH 7,0). La actividad de transfosforilación se
encontró en una fracción que pasó a través de la columna y por lo
tanto la fracción se recogió.
Se añadió sulfato de amonio a la fracción activa
de manera que se obtuvo 35% de saturación, lo que se aplicó a una
columna de butil-Toyopeal (\phi 5,0 x 22,5 cm)
equilibrada con una disolución tampón de fosfato de potasio 20 mM
(pH 7,0) que contenía sulfato de amonio con 35% de saturación. La
elución se realizó utilizando un gradiente lineal de concentración
de 35% de saturación a 20% de saturación en una disolución tampón
de fosfato de potasio (pH 7,0).
Las fracciones activas se recogieron y se
dializaron frente a 1 L de disolución tampón de fosfato de potasio
100 mM (pH 7,0), seguido por aplicación a una columna de
hidroxiapatita (\phi 3,0 x 7,0 cm) equilibrada con una disolución
tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0). La elución se realizó
utilizando un gradiente lineal de concentración de 50 mM a 100 mM de
disolución tampón de fosfato de potasio (pH 7,0) y se recogieron
las fracciones activas.
Esta disolución enzimática se dializó frente a 1
L de disolución tampón de fosfato de potasio 10 mM (pH 6,0). La
elución se realizó utilizando un gradiente lineal de concentración
en una disolución tampón de fosfato de potasio (pH 6,0) que
contenía de cloruro de potasio de 0 mM a 300 mM. Se recogieron las
fracciones activas eluídas de la columna.
Conforme al procedimiento descrito anteriormente,
la enzima que presentaba actividad de transfosforilación se purificó
a partir del extracto libre de células consecuentemente
aproximadamente 600 veces a una relación de recuperación de
aproximadamente 16%. La actividad específica y la relación de
recuperación en este procedimiento de purificación se muestran en
la tabla 4. Esta muestra de enzima fue homogénea por electroforesis
en gel de SDS-poliacrilamida.
Recuperación por | Actividad | Proteína | Actividad | Relación |
etapas | total | total (mg) | específica | (%) |
(unidad) | (unidad/mg) | |||
1. Extracto libre de | 365 | 160.650 | 0,002 | 100 |
células | ||||
2. Fraccionamiento | 340 | 138.895 | 0,002 | 93 |
del sulfato de amonio | ||||
(30 al 60%) | ||||
3. DEAE-Toyopearl | 318 | 30.440 | 0,010 | 87 |
4. Butil-Toyopearl | 232 | 661 | 0,347 | 63 |
5. Hidroxiapatita | 96 | 96 | 1,000 | 26 |
6. Superdex 200 | 59 | 43 | 1,365 | 16 |
La enzima purificada presentó las siguientes
propiedades:
- (1)
- Acción: el grupo fosfato se transfiere de un donante de grupo fosfato tal como ácido polifosfórico al nucleósido, y se produce el éster nucleósido-5'-fosfato. Inversamente, esta enzima también presenta actividad para hidrolizar el éster fosfato.
- (2)
- Especificidad de sustrato: los compuestos que sirven como donantes de grupo fosfato en la reacción de transfosforilación incluyen, por ejemplo, ácido pirofosfórico, ácido tripolifosfórico, ácido trimetafosfórico, ácido tetrametafosfórico, ácido hexametafosfórico, fenilfosfato de disodio, fenilfosfato de dipotasio, anhídrido del ácido O,O-difenilfosfórico, carbamilfosfato de disodio, carbamilfosfato de dipotasio, carbamilfosfato de diamonio y carbamilfosfato de dilitio. Los compuestos que sirven como aceptor del grupo fosfato incluyen, por ejemplo, purina ribósida, inosina, guanosina, adenosina, xantosina, uridina y citidina. Por otra parte, los compuestos que experimentan la acción en la reacción hidrolítica del éster fosfato incluyen, por ejemplo, ácido fosfórico inorgánico, tales como ácido pirofosfórico, ácido tripolifosfórico, ácido trimetafosfórico, ácido tetrametafosfórico, ácido hexametafosfórico; éster fosfato, tal como fenilfosfato de disodio, fenilfosfato de dipotasio, anhídrido del ácido O,O-difenilfosfórico, carbamilfosfato de disodio, carbamilfosfato de dipotasio, carbamilfosfato de diamonio y carbamilfosfato de dilitio; y 5'-nucleótidos, tales como 5'-purina ribósida, ácido 5'-inosínico, ácido 5'-guanílico, ácido 5'-adenílico, ácido 5'-xantílico, ácido 5'-uridílico y ácido 5'-citidílico.
- (3)
- pH óptimo: 5,2 (reacción de transfosforilación), 6,5 (reacción hidrolítica del éster fosfato).
- (4)
- Estabilidad del pH: pH 3,5 a 12,0 (tratamiento a 30ºC durante 60 minutos)
- (5)
- Temperatura óptima: 35ºC aproximadamente.
- (6)
- Estabilidad térmica: estable hasta 40ºC (tratamiento a pH 7,0 durante 30 minutos)
- (7)
- Efecto de la adición de un ion metálico e inhibidor: Esta enzima no presenta fenómenos de activación relacionados con su actividad por adición de ningún ion metálico. La actividad es inhibida por Fe^{2+}, Ag^{2+}, Pb^{2+}, Hg^{2+} y Cu^{2+}. La actividad también es inhibida por el ácido yodoacético.
- (8)
- Peso molecular: el peso molecular calculado es aproximadamente 188.000 conforme a cromatografía de líquidos de alta resolución (TSK gel G-3000SW, producido por Toyo Soda)
- (9)
- Peso molecular de la subunidad: el peso molecular calculado de la subunidad es 24.500 conforme con electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
Esta enzima presenta no sólo actividad para
transferir el grupo fosfato al nucleósido, sino también actividad
para hidrolizar reversiblemente el éster fosfato, de la misma forma
que la enzima purificada a partir del extracto libre de células de
morganella morganii NCIMB 10466. Además, esta enzima presenta
actividad hidrolítica del éster fosfato (actividad
fosfomonoesterasa) que es mayor que la actividad de
transfosforilación en no menos de 30 veces. Consecuentemente, se ha
demostrado que esta enzima es una fosfatasa ácida.
Se disolvieron pirofosfato de sodio (15 g/dL) e
inosina (3 g/dL) en disoluciones tampones de acetato de sodio que
tenían cada una de ellas un pH de 5,5, 5,0, 4,5, 4,0 y 3,5, a las
que se añadió la muestra de enzima descrita anteriormente de manera
que se obtuvo una concentración de 50 unidades/dL. La mezcla de
reacción se incubó a 30ºC durante 6 horas, manteniendo cada pH, y se
midió la cantidad de ácido 5'-inosínico producido a
lo largo del tiempo. El ácido inosínico producido contenía
solamente ácido 5'-inosínico. No se observó en
absoluto producción secundaria de ácido
2'-inosínico ni de ácido
3'-inosínico. El resultado se muestra en la figura
2. La velocidad de producción de ácido 5'-inosínico
fue máxima a pH 5,0. Sin embargo, la cantidad máxima acumulada de
ácido 5'-inosínico fue mayor a menor pH. La
condición de reacción a pH 4,0 fue la más eficiente para la
producción de ácido 5'-inosínico. El ácido
5'-inosínico se produjo y se acumuló en una cantidad
de 1,56 g/dL realizando la reacción a 30ºC y pH 4,0 durante 3
horas.
Se disuelven pirofosfato de sodio (15 g/dL) e
inosina, guanosina, uridina o citidina (3 g/dL) en una disolución
tampón de acetato de sodio (pH 4,0) a lo que se añadió la muestra
de enzima preparada en el ejemplo 4 de manera que su concentración
fue de 50 unidades/dL. La mezcla de reacción se incubó a 35ºC
durante 3 horas manteniendo el pH a 4,0. La cantidad de
nucleósido-5'-éster se muestra en la tabla 5.
El nucleótido producido contenía sólo
nucleósido-5'-éster. No se observó en absoluto
producción secundaria de nucleósido-2'-éster ni de
nucleósido-3'-éster.
Donante de grupo fosfato | Producto | Cantidad producida (g/dL) |
Inosina | Ácido 5'-inosínico | 1,56 |
Guanosina | Ácido 5'-guanílico | 1,05 |
Uridina | Ácido 5'-uridílico | 1,87 |
Citidina | Ácido 5'-citidílico | 1,22 |
Se disolvieron inosina (2 g/dL) y tripolifosfato
de sodio, polifosfato de sodio (nombre comercial: Polygon P,
producido por Chiyoda Chemical), fenilfosfato de disodio, o
carbamilfosfato de disodio (10 g/dL), como donantes de grupo
fosfato, en una disolución tampón de acetato de sodio (pH 4,0) a la
que se añadió la muestra de la enzima preparada en el ejemplo 4 de
manera que su concentración fuera de 50 unidades/dL. La mezcla de
reacción se incubó a 35ºC durante 3 horas manteniendo el pH a 4,0.
La cantidad de ácido 5'-inosínico producido se
muestra en la Tabla 6.
El ácido 5'-inosínico se produjo
y se acumuló eficazmente utilizando cualquiera de los donantes de
grupo fosfato. Sin embargo, la cantidad de ácido
5'-inosínico acumulada cuando se usó polifosfato de
sodio como donante de grupo fosfato fue la más alta.
Donante de grupo fosfato | Ácido 5'-inosínico producido (g/dL) |
Tripolifosfato de sodio | 1,20 |
Polifosfato de sodio | 1,79 |
Fenilfosfato de disodio | 1,50 |
Carbamilfosfato de disodio | 1,53 |
La fosfatasa ácida purificada a partir del
extracto libre de células de morganella morganii NCIMB 10466
según el método descrito en el ejemplo 1 se adsorbió en una
membrana DITC (producida por Milligen/Biosearch), y su secuencia de
aminoácidos N-terminal se determinó utilizando un
Prosequencer 6625 (producido por Milligen/Biosearch). Se determinó
la secuencia de aminoácidos N-terminal que
comprende 20 restos mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 1 en el
listado de secuencias.
Se extrajo el DNA cromosómico a partir de células
microbianas cultivadas de morganella morganii NCIMB 10466
según el método de Murray y Thomson [Nucl. Acid. Res.,
4.321, 8 (1980)]. El DNA cromosómico se degradó parcialmente con la
enzima de restricción Sau3Al. Después de esto, fragmentos de DNA de
3 a 6 kbp se fraccionaron mediante centrifugación con gradiente de
densidad de sacarosa. Se realizó la digestión de un vector plásmido
pUC118 (producido por Takara Shuzo) con la enzima de restricción
BamHI, que se ligó con los fragmentos de DNA cromosómico
parcialmente degradado. La ligadura del DNA se realizó utilizando
un kit de ligadura de DNA (producido por Takara Shuzo) se
acuerdo con un método diseñado. Después de esto, la escherichia
coli JM109 (producida por Takara Shuzo) se transformó con una
mezcla de DNA obtenida según un método convencional. Las
transformantes se dispusieron en placas sobre un medio de L de agar
que contenía 100 \mug/mL de ampicilina, y se hicieron crecer para
preparar una biblioteca de genes.
Una disolución de reacción que contenía ácido
p-nitrofenilfosfórico 4 mM y una disolución tampón
de MES 100 mM/NaOH (pH 6,5) se vertió sobre la superficie del medio
de agar sobre el que se habían hecho crecer las transformantes, y se
mantuvo la temperatura a 30ºC durante 15 minutos. Las cepas que
habían expresado la actividad fosfatasa liberaron
p-nitrofenol y presentaron un color amarillo.
Consecuentemente, las transformantes se eligieron utilizando este
fenómeno como índice. Como resultado de la investigación de una
biblioteca de expresión génica que comprendía aproximadamente
20.000 cepas de transformantes, se obtuvieron 30 cepas de
transformantes que habían expresado la actividad fosfatasa.
Las transformantes (30 cepas) que habían
expresado la actividad fosfatasa se sometieron a aislamiento en
colonias aisladas. Las colonias aisladas se inocularon en un medio
L (2,5 mL) que contenía 100 \mug/mL de ampicilina, y se cultivaron
a 37ºC durante 16 horas. Se añadió una disolución tampón de acetato
de sodio (100 mM, pH 5,0, 50 \muL) que contenía inosina (2 g/dL)
y pirofosfato de sodio (10 g/dL) a las células microbianas
recogidas del cultivo, y la mezcla de reacción se incubó a 30ºC
durante 16 horas. La producción de ácido
5'-inosínico se detectó mediante análisis por HPLC
para elegir las cepas microbianas que tenían actividad de
transfosforilación. Como resultado, se lograron obtener 5 cepas de
transformantes que presentaban actividad de transfosforilación y
que se suponía que hospedaban el fragmento de DNA que contenía el
gen de la fosfatasa ácida objetivo.
El fragmento de DNA insertado se analizó
preparando un plásmido según un método de lisis alcalina
[Molecular Cloning 2ª Ed. (J. Sambrook, E. F. Fritsch y T.
Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pág. 25 (1989)] a
partir de una cepa de las transformantes que se suponía que
hospedaba el fragmento de DNA que contenía el gen de la fosfatasa
ácida derivado de morganella morganii NCIMB 10466 obtenida
en el ejemplo 7. Este plásmido se denominó pMPI501. La figura 3
muestra un mapa de enzima de restricción determinado del fragmento
de DNA insertado.
La región del gen de la fosfatasa ácida se
especificó posteriormente por subclonación. Como resultado se
sugirió que este gen de fosfatasa ácida estaba contenido en un
fragmento que tenía un tamaño de 1,2 Kbp escindido mediante enzimas
de restricción HindIII y EcoRI. Por lo tanto, con el fin de
determinar la secuencia de nucleótidos, se construyo un DNA
plásmido en el que el fragmento de 1,2 kbp se ligó con pUC118 que
había sido sometido a digestión con HindIII y EcoRI. La
escherichia coli JM109 (producida por Takara Shuzo) se
transformó con este DNA plásmido, denominado pMPI505, de acuerdo con
un método convencional, que se situó en placas sobre un medio L de
agar que contenía 100 \mug/mL de ampicilina para obtener una
transformante.
El plásmido se extrajo según el método de lisis
alcalina de la transformante a partir de escherichia coli
JM109 (producida por Takara Shuzo) que hospedaba el pMPI505 para
determinar la secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos
se determinó según el método de Sanger [J. Mol. Biol., 143,
161 (1980)] utilizando un kit TaqDyeDeoxy Terminator Cycle
Sequencing (producido por Applied Biochemical). Una secuencia de
nucleótidos de un marco de lectura abierto determinado se muestra en
la secuencia SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias. Una secuencia
de aminoácidos de la proteína deducida a partir de la secuencia de
nucleótidos se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 3 del listado de
secuencias. Una secuencia parcial, que fue totalmente coincidente
con la secuencia de aminoácidos N-terminal de la
enzima purificada, se encontró en la secuencia de aminoácidos. La
N-terminal de la enzima purificada comienza con el
resto 21º alanina de la secuencia mostrada en la secuencia SEQ ID
NO: 3. Consecuentemente, se supone que la secuencia de aminoácidos
mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 3 es la de una proteína
precursora, y que se elimina un péptido que comprende una cadena
desde el resto 1º metionina al resto 20º alanina después de la
traducción. Una secuencia de aminoácidos de una proteína madura
deducida de este modo se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 4 en el
listado de secuencias. Se calcula que el peso molecular de la
proteína madura calculado a partir de la secuencia de aminoácidos
es 24,9 kilodaltons, que coincide bien con el resultado de
SDS-PAGE para la enzima purificada. Conforme a los
resultados descritos anteriormente, y debido al hecho de que la
transformante que hospeda el plásmido que contiene este fragmento
presentaban actividad de transfosforilación, se identificó que este
marco de lectura abierto era la región que codifica la fosfatasa
ácida objetivo.
La secuencia de nucleótidos y la secuencia de
aminoácidos se compararon por homología respectivamente con
secuencias conocidas. Se utilizaron las bases de datos de EMBL y de
SWISS-PROT. Como resultado, se ha demostrado que la
secuencia de nucleótidos mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 2 del
listado de secuencias es coincidente con la secuencia de nucleótidos
de un gen de la fosfatasa ácida conocido derivado de morganella
morganii [Thaller, M. C. et al., Microbiology,
140, 1.341 (1994)], excepto que el 54º G es A, el 72º G es A, el
276º T es G, el 378º T es C, el 420º G es T, el 525º C es G, el 529º
C es T, y el 531º G es A en el último, y que la secuencia de
aminoácidos mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 4 en el listado de
secuencias es la misma que la del gen de la fosfatasa ácida derivado
de la morganella morganii. A saber, el gen que codifica la
proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la
secuencia SEQ ID NO: 4 en el listado de secuencias es el gen de la
fosfatasa ácida de la morganella morganii NCIMB 10466.
La proteína precursora comprende 249 aminoácidos,
y el peso molecular de la proteína deducida a partir de su secuencia
es 27,0 kilodaltons.
La cepa de escherichia coli JM109
transformada por un plásmido pMPI505 se ha denominado AJ13143, que
ha sido registrada internacionalmente el 23 de Febrero de 1996 en
el National Institute of Bioscience and Human Technology de la
Agency of Industrial Science and Technology (código postal: 305,
1-3, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón)
de acuerdo con lo estipulado por el Tratado de Budapest, y se le ha
otorgado el número de registro FERM BP-5422.
Se inoculó escherichia coli JM109/pMPI505
construida en el ejemplo 8 en un medio L (50 mL) que contenía 100
\mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se cultivó a 37ºC durante
16 horas. Las células microbianas se recogieron de su cultivo por
centrifugación y se lavaron una vez con suero fisiológico salino.
Las células microbianas se pusieron en suspensión en una disolución
tampón de fosfato de potasio 100 mM (5 mL, pH 7,2) y se rompieron
mediante un tratamiento con ultrasonidos realizado a 4ºC durante 20
minutos. La disolución tratada se centrifugó para eliminar la
fracción insoluble y se preparó de este modo un extracto libre de
células.
La actividad de transfosforilación del extracto
libre de células obtenido se midió utilizando los controles de
extractos libres de células preparados a partir de la cepa de tipo
salvaje de morganella morganii y escherichia coli
JM109 transformada con el plásmido pUC118 de la misma manera que la
descrita anteriormente. El resultado se muestra en la figura 7. No
se detectó actividad de transfosforilación en la escherichia
coli JM109/pUC118. La actividad de transfosforilación fue
también pequeña en la cepa de tipo salvaje de morganella
morganii. Por otra parte, la escherichia coli
JM109/pMPI505 presentó una actividad de transfosforilación elevada
que fue 150 veces más alta en actividad específica que la cepa de
tipo salvaje de morganella morganii. De acuerdo con el
resultado, se ha demostrado que el fragmento de DNA introducido
permite que la escherichia coli exprese la fosfatasa ácida
en un alto nivel.
Cepa microbiana | Actividad de transfosforilación (unidad/mg) |
Morganella morganii NCIMB 10466 | 0.008 |
Escherichia coli JM 109/pUC118 | no detectado |
Escherichia coli JM 109/pMPI505 | 1.250 |
La fosfatasa ácida purificada del extracto libre
de células de escherichia blattae JCM 1650 se adsorbió en
una membrana DITC (producida por Milligen/Biosearch), y su
secuencia de aminoácidos N-terminal se determinó
utilizando un Prosequencer 6625 (producido por Milligen/Biosearch).
Se determinó la secuencia de aminoácidos N-terminal
que comprende 15 restos mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 8 en el
listado de secuencias.
\newpage
Se extrajo el DNA cromosómico de células
microbianas cultivadas de escherichia blattae JCM 1650 de
acuerdo con el método de Murray y Thomson [Nucl. Acid. Res.,
4.321, 8 (1980)]. El DNA cromosómico se degradó parcialmente con
Sau3Al. Después de esto, fragmentos de DNA de 3 a 6 kbp se
fraccionaron mediante centrifugación con gradiente de densidad de
sacarosa. Se realizó la digestión de un vector plásmido pUC118
(producido por Takara Shuzo) con BamHI, que se ligó con los
fragmentos de DNA cromosómico parcialmente degradados. La ligadura
del DNA se realizó utilizando un kit de ligadura de DNA
(producido por Takara Shuzo) según un método diseñado. Después de
esto, la escherichia coli JM109 (producida por Takara Shuzo)
se transformó con una mezcla de DNA obtenida según un método
convencional. Las transformantes se dispusieron en placas sobre un
medio de L agar que contenía 100 g/mL de ampicilina, y se hicieron
crecer para preparar una biblioteca génica.
Una disolución de reacción que contenía ácido
p-nitrofenilfosfórico 4 mM y una disolución tampón
de MES 100 mM/NaOH (pH 6,5) se vertió sobre la superficie del medio
de agar sobre el que se habían hecho crecer las transformantes, y se
mantuvo la temperatura a 30ºC durante 15 minutos. Las cepas que
habían expresado la actividad fosfatasa liberaron
p-nitrofenol y presentaron un color amarillo.
Consecuentemente, las transformantes se eligieron utilizando este
fenómeno como índice. Como resultado de la investigación de una
biblioteca de expresión génica que comprendía aproximadamente 8.000
cepas de transformantes, se obtuvieron 14 cepas de transformantes
que habían expresado la actividad fosfatasa.
Las transformantes (14 cepas) que habían
expresado la actividad fosfatasa se sometieron a aislamiento en
colonias aisladas. Las colonias aisladas se inocularon en un medio
L (2,5 mL) que contenía 100 \mug/mL de ampicilina, y se cultivaron
a 37ºC durante 16 horas. Se añadió una disolución tampón de acetato
de sodio (100 mM, pH 5,0, 50 \muL) que contenía inosina (2 g/dL)
y pirofosfato de sodio (10 g/dL) a las células microbianas
recogidas de los líquidos de cultivo para realizar la reacción a
30ºC durante 16 horas. La producción de ácido
5'-inosínico se detectó mediante análisis por HPLC
para elegir las cepas microbianas que tenían actividad de
transfosforilación. Como resultado, se lograron obtener 3 cepas de
transformantes que presentaban actividad de transfosforilación y
que se suponía que hospedaban el fragmento de DNA que contenía el
gen de la fosfatasa ácida objetivo.
Se analizó el fragmento de DNA insertado
extrayendo un plásmido de acuerdo con el método de lisis alcalina a
partir de una cepa de las transformantes que se suponía que
hospedaba el fragmento de DNA que contenía el gen de la fosfatasa
ácida derivado de la escherichia blattae JCM 1650 obtenida
en el ejemplo 11. Este plásmido se denominó pEPI301. La figura 5
muestra un mapa de enzima de restricción determinado del fragmento
de DNA insertado.
La región del gen de la fosfatasa ácida se
especificó posteriormente por subclonación. Como resultado se
sugirió que este gen de la fosfatasa ácida estaba contenido en un
fragmento que tenía un tamaño de 2,4 Kbp escindido mediante enzimas
de restricción ClaI y BamHI. Por lo tanto, con el fin de determinar
la secuencia de nucleótidos, se construyo un DNA plásmido en el que
el fragmento se unió con pBluescript KS (+) (producido por
Stratagene) que había sido sometido a digestión con ClaI y BamHI.
Se transformó la escherichia coli JM109 (producida por Takara
Shuzo) con el DNA plásmido denominado pEPI305 según un método
convencional, que se situó en placas sobre un medio L de agar que
contenía 100 \mug/mL de ampicilina para obtener una
transformante.
El plásmido se extrajo según el método de lisis
alcalina de la transformante de escherichia coli JM109
(producida por Takara Shuzo) que hospedaba el pEPI305 para
determinar la secuencia de nucleótidos. Una secuencia de nucleótidos
de un marco de lectura abierto determinado se muestra en la
secuencia SEQ ID NO: 6 del listado de secuencias. Una secuencia de
aminoácidos de la proteína deducida a partir de la secuencia de
nucleótidos se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 7 del listado de
secuencias. Una secuencia parcial, que fue totalmente coincidente
con la secuencia de aminoácidos N-terminal de la
enzima purificada, se encontró en la secuencia de aminoácidos. La
N-terminal de la enzima purificada comienza con el
resto 19º leucina de la secuencia mostrada en la secuencia SEQ ID
NO: 7. Consecuentemente, se supone que la secuencia de aminoácidos
mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 7 es la de una proteína
precursora, y que se elimina un péptido que comprende una cadena
desde el resto 1º metionina hasta el resto 18º alanina después de
la traducción. Una secuencia de aminoácidos de una proteína madura
deducida de este modo se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 8 en el
listado de secuencias. Consecuentemente, se calcula que el peso
molecular aproximado de la proteína madura es 25,1 kilodaltons, que
coincide bien con los resultados por SDS-PAGE para
la enzima purificada. De acuerdo con los resultados descritos
anteriormente, y debido al hecho de que la transformante que
hospeda el plásmido que contiene este fragmento presentaba actividad
de transfosforilación, se identificó que este marco de lectura
abierto era la región que codifica la fosfatasa ácida objetivo.
A saber, el gen que codifica la proteína que
comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia SEQ
ID NO: 8 en el listado de secuencias es el gen de la fosfatasa
ácida de la escherichia blattae JCM 1650.
La secuencia de nucleótidos y la secuencia de
aminoácidos se compararon por homología respectivamente con
secuencias conocidas. Se utilizaron las bases de datos de EMBL y de
SWISS-PROT. Como resultado, se ha demostrado que la
proteína mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 8 y el DNA que la
codifica son nuevas. Una proteína precursora codificada por este gen
comprende 249 aminoácidos, y el peso molecular de la proteína
deducido de su secuencia es 27,0 kilodaltons.
La secuencia de aminoácidos se comparó por
homología con secuencias conocidas respectivamente. Como resultado,
esta proteína presentó un alto grado de homología con la fosfatasa
ácida de la providencia stuartii (77,1%), con la fosfatasa
ácida de la morganella morganii del ejemplo 8 (77,1%) y con
la fosfatasa ácida de la salmonella typhimurium (44,3%).
La cepa de escherichia coli JM109
transformada por un plásmido pEPI305 se ha denominado AJ13144, que
ha sido registrada internacionalmente el 23 de Febrero de 1996 en
el National Institute of Bioscience and Human Technology de la
Agency of Industrial Science and Technology (código postal: 305,
1-3, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón)
de acuerdo con lo estipulado por el Tratado de Budapest, y se le ha
otorgado el número de registro FERM BP-5423.
Se inoculó escherichia coli JM109/pEPI305
construida en el ejemplo 12 en un medio L (50 mL) que contenía 100
\mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se cultivó a 37ºC durante
16 horas. Las células microbianas se recogieron de su cultivo por
centrifugación y se lavaron una vez con suero fisiológico salino.
Las células microbianas se pusieron en suspensión en una disolución
tampón de fosfato de potasio 100 mM (5 mL, pH 7,2) y se rompieron
mediante un tratamiento de ultrasonidos realizado a 4ºC durante 20
minutos. La disolución tratada se centrifugó para eliminar la
fracción insoluble y se preparó de este modo un extracto libre de
células.
La actividad de transfosforilación del extracto
libre de células obtenido se midió utilizando controles de
extractos libres de células preparados a partir de la cepa de tipo
salvaje de escherichia blattae y escherichia coli
JM109 transformada con el plásmido pBluescript KS (+) de la misma
manera que la descrita anteriormente. El resultado se muestra en la
tabla 8. La actividad de transfosforilación no se detectó en la
escherichia coli JM109/pBluescript KS(+). La actividad de
transfosforilación fue también pequeña en la cepa de tipo salvaje
de la escherichia blattae. Por otra parte, la escherichia
coli JM109/pEPI305 exhibió una actividad de transfosforilación
elevada que fue 120 veces más alta en actividad específica que la
cepa de tipo salvaje de escherichia blattae. De acuerdo con
el resultado, se ha demostrado que el fragmento de DNA introducido
permite que la escherichia coli exprese la fosfatasa ácida
en un alto nivel.
Cepa microbiana | Actividad de transfosforilación (unidad/mg) |
Escherichia blattae JCM 1650 | 0,002 |
Escherichia coli JM 109/pBluescript KS (+) | no detectado |
Escherichia coli JM 109/pEPI305 | 0,264 |
Se disolvieron pirofosfato de sodio (12 g/dL) e
inosina (6 g/dL) en una disolución tampón de acetato de sodio 100
mM (pH 4,0), a la que se añadieron células microbianas de
escherichia coli JM109/pEPI305 descritas anteriormente para
dar una concentración de células de 200 mg/dL expresado en peso
seco de las células microbianas. La mezcla de reacción se incubó a
35ºC durante 10 horas manteniendo el pH a 4,0 y la cantidad de
ácido inosínico producido se midió a lo largo del tiempo. El ácido
inosínico producido contenía sólo ácido
5'-inosínico. No se observó en absoluto producción
secundaria de ácido 2'-inosínico ni de ácido
3'-inosínico. El resultado se muestra en la figura
6. El ácido 5'-inosínico se produjo y se acumuló de
forma extremadamente eficaz en un periodo corto de tiempo en la
reacción para producir ácido 5'-inosínico a partir
de pirofosfato e inosina utilizando este microorganismo.
Como se ha descrito en los ejemplos 13 y 14,la
cepa que hospeda el gen de la fosfatasa ácida derivado de
escherichia blattae expresa una cantidad considerable de la
fosfatasa ácida, y el ácido 5'-inosínico se produce
y se acumula de forma extremadamente eficaz en un período de tiempo
corto en la reacción para producir ácido
5'-inosínico a partir de pirofosfato e inosina
utilizando este microorganismo. Sin embargo, se ha demostrado que
la cantidad acumulada de ácido 5'-inosínico no
excede un cierto grado porque el ácido 5'-inosínico
experimenta una degradación debido a la actividad fosfomonoesterasa
que presenta la propia fosfatasa ácida. Por lo tanto se procuró
mejorar la enzima introduciendo una mutación en el gen de la
fosfatasa ácida derivado de la escherichia blattae clonada
en el ejemplo 11, según el método de mutagénesis dirigida
utilizando PCR.
Los oligonucleótidos MUT300, MUT310 y MUT320
mostrados en las secuencias SEQ ID NO: 9, 10 y 11 en el listado de
secuencias se sintetizaron respectivamente según el método de
fosfoamidita utilizando un sintetizador de DNA (Modelo 394
producido por Applied Biosystems).
Se añadieron plásmido pEPI305 (1 ng) como
plantilla preparada en el ejemplo 12, M13 primer RV (producido por
Takara Shuzo) y el oligonucleótido MUT310 (2,5 \mumoles de cada
uno de ellos) como iniciadores, y Taq DNA-polimerasa
(2,5 unidades, producida por Takara Shuzo) a una disolución tampón
de Tris-HCl 100 mM (pH 8,3, 100 \muL) que
contenía dATP, dCTP, dGTP, dTTP (cada uno de ellos 200 \muM),
cloruro de potasio (50 mM) y cloruro de magnesio (1,5 mM), para
realizar una reacción PCR en la que se repetía 25 veces un ciclo
que comprendía periodos de 30 segundos a 94ºC, 2 minutos a 55ºC y 3
minutos a 72ºC. La reacción PCR se realizó utilizando un ciclador
térmico tipo PJ2000 (producido por Takara Shuzo). Además se realizó
una reacción PCR de la misma manera que la descrita anteriormente
utilizando plásmido pEPI305 (1 ng) como plantilla, M13 primer M3
(producido por Takara Shuzo) y oligonucleótido MUT300 (2,5
\mumoles de cada uno) como iniciadores. Cada una de las
disoluciones de reacción se purificó por filtración en gel para
eliminar los iniciadores utilizando una columna Microspin
S-400 (producida por Pharmacia).
Cada uno de los productos de la reacción PCR (1
\muL) se añadió a una disolución tampón de
Tris-HCl 100 mM (pH 8,3, 95 \muL) que contenía
dATP, dCTP, dGTP, dTTP (cada uno 200 \muM), cloruro de potasio
(50 mM) y cloruro de magnesio (1,5 mM), y se calentó a 94ºC durante
10 minutos, seguido por enfriamiento a 37ºC durante 60 minutos.
Después de esto, la temperatura se mantuvo a 37ºC durante 15 minutos
para formar un heteroduplex. La Taq DNA polimerasa (2,5 unidades)
se añadió a ello para realizar la reacción a 72ºC durante 3 minutos
de manera que se completara el heteroduplex. Después de esto se
añadieron M13 primer RV y M13 primer M3 (2,5 \mumoles de cada uno)
a esta disolución de reacción para realizar una reacción PCR en la
que se repitió 10 veces un ciclo que comprendía periodos de 30
segundos a 94ºC, 2 minutos a 55ºC, y 3 minutos a 72ºC.
Se realizó la digestión del producto de la
segunda reacción PCR con ClaI y BamHI seguido por extracción con
fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Este fragmento de DNA
se unió con pBluescript KS(+) al que se había realizado una
digestión con ClaI y BamHI. La escherichia coli JM109
(producida por Takara Shuzo) se transformó como el DNA plásmido
obtenido según un método convencional, la cual se colocó en placas
sobre un medio L de agar que contenía 100 \mug/mL de ampicilina
para obtener una transformante.
El plásmido se extrajo a partir de la
transformante según el método de lisis alcalina para determinar la
secuencia de nucleótidos, confirmando que el nucleótido objetivo
había sido sustituido. Por lo tanto, se preparó un gen mutante que
codifica una fosfatasa mutante en el que el resto 74º glicina (GGG)
de la proteína madura se sustituyó con un resto ácido aspártico
(G*A*T). El plásmido que contenía este gen mutante se denominó
pEPI310.
Se preparó un gen mutante que codifica una
fosfatasa mutante en el que el resto 153º isoleucina (ATC) de la
proteína madura se sustituyó con un resto treonina (A*CC), según el
mismo procedimiento que el descrito anteriormente, utilizando
pEPI305 como plantilla, y los oligonucleótidos MUT300 y MUT320 como
iniciadores. El plásmido que contenía este gen mutante se denominó
pEPI320. A continuación, se preparó un gen mutante que codifica una
fosfatasa mutante en el que el resto 74º glicina (GGG) de la
proteína madura se sustituyó por un resto ácido aspártico (G*A*T) y
el resto 153º isoleucina de la proteína madura se sustituyó por un
resto treonina (A*CC), según el mismo procedimiento descrito
anteriormente utilizando pEPI310 como plantilla, y los
oligonucleótidos MUT300 y MUT320 como iniciadores. El plásmido que
contenía este gen mutante se denominó pEPI330.
La escherichia coli JM109/pEPI310,
escherichia coli JM109/pEPI320 y escherichia coli
JM109/pEPI330, en las que se habían introducido los plásmidos que
contenían los respectivos genes de la fosfatasa ácida mutante, y la
escherichia coli JM109/pEPI305, en la que se había
introducido el plásmido que contenía el gen de la fosfatasa ácida
de tipo salvaje, se inocularon en un medio L (50 mL) que contenía
100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se cultivaron a 37ºC
durante 16 horas. Las células microbianas se recogieron de su
cultivo y se lavaron una vez con disolución salina fisiológica. Las
células microbianas se pusieron en suspensión en una disolución
tampón de fosfato de potasio 100 mM (5 mL, pH 7,0), y se rompieron
mediante un tratamiento con ultrasonidos realizado a 4ºC durante 20
minutos. Las disoluciones tratadas se centrifugaron para eliminar
las fracciones insolubles, y de este modo se prepararon extractos
libres de células. Las actividades fosfomonoesterasa y las
actividades de transfosforilación de los extractos libres de
células se midieron a pH 4,0, y se compararon con la actividad de la
cepa salvaje.
La tabla 9 muestra el resultado de la medida de
las actividades fosfomonoesterasa y de las actividades de
transfosforilación de la fosfatasa ácida de tipo salvaje y de las
fosfatasas ácidas con actividad fosfomonoesterasa disminuida.
Muestra que tanto las actividades fosfomonoesterasa como las
actividades de transfosforilación de las fosfatasas ácidas con
actividad fosfomonoesterasa disminuida, han disminuido en
comparación con la fosfatasa ácida de tipo salvaje, y que los
grados de disminución de las actividades fosfomonoesterasa son
mayores que los de las actividades de transfosforilación, con el
resultado que la relación entre la actividad fosfomonoesterasa y la
actividad de transfosforilación de la fosfatasa ácida mutante
disminuye en comparación con la fosfatasa ácida de tipo
salvaje.
Plásmido | Actividad fosfomonoesterasa | Actividad de transfosforilación | Relación^{(1)} |
(unidad/mg) | (unidad/mg) | (valor relativo) | |
pEPI305 | 2,38 | 0,132 | 18,03 (100) |
pEPI310 | 0,26 | 0,019 | 13,68 (76) |
pEPI320 | 0,88 | 0,123 | 7,15 (39) |
pEPI330 | 0,42 | 0,070 | 6,00 (33) |
^{(1)} Relación entre las actividades fosfomonoesterasa y las actividades para producir éster nucleó- | |||
sido-5'-fosfato. |
La escherichia coli JM109/pEPI310,
escherichia coli JM109/pEPI320 y escherichia coli
JM109/pEPI330 en las que se han introducido los plásmidos que
contienen los genes que codifican las fosfatasas ácidas con
actividad fosfomonoesterasa disminuida, y la escherichia
coli JM109/pEPI305 en la que se ha introducido el plásmido que
contiene el gen de la fosfatasa ácida de tipo salvaje, se inocularon
en un medio L (50 mL) que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1
mM de IPTG, y se cultivaron a 37ºC durante 16 horas.
Se disolvieron pirofosfato de sodio (12 g/dL) e
inosina (6 g/dL) en una disolución tampón de acetato de sodio (pH
4,0) a la que se añadieron las células microbianas de cada una de
las cepas de escherichia coli obtenidas mediante los cultivos
descritos anteriormente, para obtener una concentración de 200
mg/dL expresada en peso seco de las células microbianas. La mezcla
de reacción se incubó a 35ºC durante 32 horas manteniendo el pH a
4,0, y la cantidad de ácido 5'-inosínico producido
se midió a lo largo del tiempo. El resultado se muestra en la
figura 8.
En la figura 7, el eje de ordenadas indica la
concentración de ácido 5'-inosínico (mg/dL) y el
eje de abscisas indica el tiempo de reacción (h). El avance de la
reacción, medido utilizando las cepas de las células respectivas, se
indica por los círculos sólidos para la escherichia coli
JM109/pEPI305, triángulos sólidos para la escherichia coli
JM109/pEPI310, círculos vacíos para la escherichia coli
JM109/pEPI320 y cuadrados vacíos para la escherichia coli
JM109/pEPI330.
La velocidad de degradación del ácido
5'-inosínico producido disminuyó en la reacción para
producir ácido 5'-inosínico a partir de inosina
utilizando las cepas que hospedan la fosfatasa ácida con actividad
fosfomonoestearasa disminuida. Como resultado, el rendimiento y la
cantidad acumulada de ácido 5'-inosínico aumentó.
La acumulación más alta de ácido 5'-inosínico se
obtuvo para la escherichia coli JM109/pEPI330 como cepa que
hospeda el gen que codifica la fosfatasa ácida con actividad
fosfomonoestearasa disminuida en la que el resto 74º glicina y el
resto 153º isoleucina se sustituyeron por el resto ácido aspártico y
el resto treonina respectivamente.
La escherichia coli JM109/pEPI330 en la
que se ha introducido el plásmido que contiene el gen que codifica
la fosfatasa ácida con actividad fosfomonoestearasa disminuida se
inoculó en un medio L (50 mL) que contenía 100 mg/mL de ampicilina
y 1 mM de IPTG, y se cultivó a 37ºC durante 16 horas.
Se disolvieron pirofosfato de sodio (12 g/dL), e
inosina, guanosina, uridina o citidina (6 g/dL) como aceptores de
grupo fosfato, en una disolución tampón de acetato de sodio 100 mM
(pH 4,0), a lo que se añadieron las células microbianas descritas
anteriormente para obtener una concentración de células de 200 mg/dL
expresada en peso seco de las células. La mezcla de reacción se
incubó a 35ºC durante 32 horas manteniendo el pH a 4,0. Las
cantidades de éster
nucleósido-5'-fosfato producidas se
muestran en la tabla 10. El nucleótido producido contenía sólo
nucleósido-5'-ester fosfato. No se
observó en absoluto producción secundaria de éster
nucleósido-2'-fosfato ni de éster
nucleósido-3'-fosfato.
Nucleósido | Producto | Cantidad producida (g/dL) |
Inosina | Ácido 5'-inosínico | 7,45 |
Guanosina | Ácido 5'-guanílico | 4,77 |
Uridina | Ácido 5'-uridílico | 8,93 |
Citidina | Ácido 5'-citidílico | 6,60 |
Se inoculó escherichia coli JM109/pEPI330
en la que se ha introducido el plásmido que contiene el gen de la
fosfatasa ácida mutante en un medio L (50 mL) que contenía 100
\mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se cultivó a 37ºC durante
16 horas.
Se disolvieron inosina (6 g/dL), y tripolifosfato
de sodio, polifosfato de sodio (nombre comercial: Polygon P,
producido por Chiyoda Chemical), fenilfosfato de disodio o
carbamilfosfato de disodio (12 g/dL) como donantes de grupo fosfato,
en una disolución tampón de acetato de sodio 100 mM (pH 4,0), a lo
que se añadieron las células microbianas descritas anteriormente
para dar una concentración de 200 mg/dL, expresada en peso seco de
las células. La mezcla de reacción se incubó a 35ºC durante 32 horas
manteniendo el pH a 4,0. La cantidad de ácido
5'-inosínico producida se muestra en la tabla 11.
El ácido 5'-inosínico se produjo y se acumuló
eficazmente utilizando cualquiera de los donantes de grupo fosfato.
Sin embargo, la cantidad acumulada de ácido
5'-inosínico cuando se utilizó ácido polifosfórico
como donante de grupo fosfato fue la más elevada.
Donante grupo fosfato | Ácido 5'-inosínico producido (g/dL) |
Tripolifosfato de sodio | 5,96 |
Polifosfato de sodio | 8,84 |
Fenilfosfato de disodio | 7,80 |
Carbamilfosfato de disodio | 7,73 |
En los ejemplos 19 a 22, la actividad de
transfosforilación a un nucleósido se midió utilizando las
siguientes condiciones. La reacción se realizó a 30ºC y a un pH de
4,0 durante 10 minutos utilizando 1 mL de una disolución de reacción
que contenía 40 \mumoles/mL de inosina, 100 \mumoles/mL de
pirofosfato de sodio, 100 \mumoles/mL de una disolución tampón de
acetato de sodio (pH 4,0) y una enzima. Esta reacción se terminó
mediante la adición de 200 \muL de ácido clorhídrico 2N. Luego, se
eliminó el precipitado por centrifugación, y la cantidad de ácido
5'-inosínico formado mediante la transfosforilación
se determinó en las condiciones mencionadas anteriormente. La
cantidad de la enzima con la que se produce 1 \mumol de ácido
inosínico en estas condiciones estándar de reacción se definió como
1 unidad.
Posteriormente, la actividad de
transfosforilación se midió variando la concentración de inosina de
10 a 100 mmoles/mL bajo las condiciones de reacción de la
composición mencionada anteriormente, y la constante de velocidad de
la inosina en la actividad de transfosforilación se determinó
utilizando la gráfica de Haens-Woolf [Biochem.
J., 26, 1.406 (1932)].
Como se describe a continuación, el análisis
detallado se realizó con respecto a la enzima mutante con la que se
aumenta la productividad del éster
nucleósido-5'-fosfato descrita en el
ejemplo 15. Consecuentemente, se encontró que la afinidad por el
nucleósido de la enzima mutante se mejoró en 2 veces, en comparación
con la de la enzima de tipo salvaje. Por lo tanto, los inventores
consideraron que la productividad del éster
nucleósido-5'-fosfato mejoraría
aumentando la afinidad por el nucleósido de la enzima mencionada
anteriormente, y modificaron posteriormente la enzima mediante el
método de ingeniería genética.
\newpage
Se utilizó el plásmido pEPI305 que contiene el
gen que codifica la fosfatasa ácida de tipo salvaje derivada de la
E. Blattae descrita en el ejemplo 15, y la mutación dirigida
se introdujo en este DNA plásmido por el método de ingeniería
genética para producir un gen que codifica la fosfatasa ácida
mutante. El pEPI305 es un DNA plásmido formado enlazando un
fragmento de DNA de 2,4 Kbp escindido con endonucleasas de
restricción ClaI y BamHI y que contienen un gen que codifica una
fosfatasa ácida de tipo salvaje derivada de la E. Blattae
JCM1650, con pBluescript KS(+) (proporcionado por Stratagene)
escindido con ClaI y BamHI. Esta secuencia base del gen que codifica
la fosfatasa ácida se representa por la secuencia SEQ ID NO: 6 en
el listado de secuencias. Adicionalmente, la secuencia de
aminoácidos de una proteína precursora anticipada a partir de esta
secuencia de bases se representa en la secuencia SEQ ID NO: 7 en el
listado de secuencias. A partir de los resultados analíticos de la
enzima purificada (descrita en el ejemplo 4), se supone que la
secuencia de aminoácidos de la proteína de maduración está
representada por la secuencia SEQ ID NO: 8 en el listado de
secuencias.
Los oligonucleótidos MUT300 (SEQ ID NO: 9 en el
listado de secuencias), MUT310 (SEQ ID NO: 10 en el listado de
secuencias), MUT320 (SEQ ID NO: 11 en el listado de secuencias),
MUT330 (SEQ ID NO: 12 en el listado de secuencias), MUT340 (SEQ ID
NO: 13 en el listado de secuencias), MUT350 (SEQ ID NO: 14 en el
listado de secuencias), MUT360 (SEQ ID NO: 15 en el listado de
secuencias), MUT370 (SEQ ID Nº: 16 en el listado de secuencias),
MUT380 (SEQ ID NO: 17 en el listado de secuencias) y MUT390 (SEQ ID
NO: 18 en el listado de secuencias) que tienen las secuencias
mostradas en el listado de secuencias, se sintetizaron por el método
de la fosfoamidita utilizando un sintetizador de DNA (Modelo 394
proporcionado por Applied Biosystem).
Se añadieron un nanogramo de pEPI305 como
plantilla, 2,5 \mumoles de M13 Primer RV (proporcionado por Takara
Shuzo Co., Ltd.), 2,5 \mumoles del oligonucleótido MUT310 y 2,5
unidades de tac DNA polimerasa (proporcionada por Takara Shuzo Co.
Ltd.) a 100 \muL de una disolución tampón de
Tris-hidrocloruro (pH 8,3) que contenía 200 \muM
de dATP, 200 \muM de dCTP, 200 \muM de dGTP, 200 \muM de dTTP,
50 mM de cloruro de potasio y 1,5 mM de cloruro de magnesio. Se
realizó la PCR en la que se repitió 25 veces una etapa en tres
partes, a saber, a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 2
minutos y a 72ºC durante 3 minutos. En esta reacción se utilizó un
ciclador térmico modelo PJ2000 (proporcionado por Takara Shuzo Co.,
Ltd.) Separadamente se realizó una PCR de forma análoga, utilizando
1 ng de DNA plásmido pEPI305 como plantilla, 2,5 \mumoles de M13
Primer M3 (proporcionado por Takara Shuzo Co., Ltd) como iniciador
y 2,5 \mumoles de oligonucleótido MUT300. Cada una de las
disoluciones de reacción se purificó por filtración en gel
utilizando una columna microspin S-400
(proporcionada por Pharmacia) para eliminar el iniciador.
Se añadió un microlitro de cada una de las
disoluciones de PCR a 95 mL de una disolución tampón de
tris-clorhidrato 100 mM (pH 8,3) que contenía 200
\muM de dATP, 200 \muM de dCTP, 200 \muM de dGTP, 200 \muM
de dTTP, 50 mM de cloruro de potasio y 1,5 mM de cloruro de
magnesio. La mezcla se calentó a 94ºC durante 10 minutos y luego se
enfrió a 37ºC a lo largo de 60 minutos, y se calentó a 37ºC durante
15 minutos para formar un heteroduplex. A esto se añadieron 2,5
unidades de tac DNA polimerasa y se realizó la reacción a 72ºC
durante 3 minutos para completar el heteroduplex. A continuación,
se añadieron 2,5 \mumoles de M13 Primer RV y 2,5 \mumoles de
M13 Primer M3 a la disolución de reacción, y se realizó una PCR en
la que se repitió 10 veces una etapa en tres partes, a saber: a 94ºC
durante 30 segundos, a 55ºC durante 2 minutos y a 72ºC durante 3
minutos.
El segundo producto de PCR se escindió con ClaI y
BamHI, luego se extrajo con una mezcla de fenol y cloroformo, y se
precipitó con etanol. Este fragmento de DNA se ligó con pBluescript
KS(+) escindido con ClaI y BamHI,. La escherichia coli JM109
(suministrada por Takara Shuzo Co., Ltd.) se transformó de la forma
habitual utilizando el DNA plásmido resultante. Este se colocó en
placas sobre un medio L de agar que contenía 100 \mug/mL de
ampicilina para obtener una transformante. Se preparó un plásmido a
partir de la transformante mediante un método de bacteriolisis
alcalina, la secuencia de bases se determinó y se identificó que la
base deseada estaba sustituida. La determinación de la secuencia de
bases se realizó por el método de Sanger et al. [J. Mol.
Biol. 143, 161 (1980)] utilizando el kit Taq DyeDeoxy
Terminator Cycle Sequencing (suministrado por Applied Biochemical).
De esta forma, se produjo el gen mutante que codifica la fosfatasa
mutante en la que el resto 74º glicina (GGG) de la proteína de
maduración se sustituyó por el resto ácido aspártico (G*A*T). Este
plásmido que contiene el gen mutante se denominó pEPI310 (ejemplo
15).
El procedimiento mencionado anteriormente se
repitió utilizando el plásmido que tiene la mutación introducida en
él como plantilla para introducir de forma acumulativa la mutación
dirigida. Se produjo un plásmido a partir de la transformante
mediante el método de bacteriolisis alcalina, se determinó la
secuencia de bases, y se identificó que la base deseada se había
sustituido. Los genes mutantes resultantes que codifican la
fosfatasa mutante y los lugares de mutación se muestran en la tabla
12. El resto aminoácido en el lugar de mutación indica un resto
aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la proteína madura
representada por la secuencia SEQ ID NO: 8 en el listado de
secuencias.
Cada una de las escherichia coli
JM109/pEPI330, escherichia coli JM109/pEPI340,
escherichia coli JM109/
pEPI350, escherichia coli JM109/pEPI360, escherichia coli JM109/pEPI370, escherichia coli JM109/pEPI380, escherichia coli JM109/pEPI390 y escherichia coli JM109/pEPI400 en cada una de las que se había introducido el plásmido que contiene el gen de la fosfatasa ácida mutante, y la escherichia coli JM109/pEPI305 en la que se ha introducido el plásmido que contiene el gen de la fosfatasa ácida de tipo salvaje, se inocularon en 50 mL de un medio L que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se incubaron a 37ºC durante 16 horas. Las células se recogieron de 2 L de la disolución de cultivo de cada una de las cepas por centrifugación, y se lavaron una vez con una disolución salina fisiológica. Las células se pusieron en suspensión en 50 mL de una disolución tampón de fosfato 100 mM (pH 7,0), y se trataron con ultrasonidos a 4ºC durante 20 minutos para romper las células. La disolución tratada de esta forma se centrífugo para eliminar las fracciones insolubles y preparar un extracto libre de células. Cada una de las fosfatasas ácidas se purificaron a partir de cada uno de los extractos libres de células mediante el método descrito en el ejemplo 4. Cada uno de los productos enzimáticos se uniformizaron en la electroforesis por SDS-poliacrilamida.
pEPI350, escherichia coli JM109/pEPI360, escherichia coli JM109/pEPI370, escherichia coli JM109/pEPI380, escherichia coli JM109/pEPI390 y escherichia coli JM109/pEPI400 en cada una de las que se había introducido el plásmido que contiene el gen de la fosfatasa ácida mutante, y la escherichia coli JM109/pEPI305 en la que se ha introducido el plásmido que contiene el gen de la fosfatasa ácida de tipo salvaje, se inocularon en 50 mL de un medio L que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se incubaron a 37ºC durante 16 horas. Las células se recogieron de 2 L de la disolución de cultivo de cada una de las cepas por centrifugación, y se lavaron una vez con una disolución salina fisiológica. Las células se pusieron en suspensión en 50 mL de una disolución tampón de fosfato 100 mM (pH 7,0), y se trataron con ultrasonidos a 4ºC durante 20 minutos para romper las células. La disolución tratada de esta forma se centrífugo para eliminar las fracciones insolubles y preparar un extracto libre de células. Cada una de las fosfatasas ácidas se purificaron a partir de cada uno de los extractos libres de células mediante el método descrito en el ejemplo 4. Cada uno de los productos enzimáticos se uniformizaron en la electroforesis por SDS-poliacrilamida.
Se midió la constante de velocidad de la inosina
en la transfosforilación de la fosfatasa ácida mutante purificada y
de la fosfatasa ácida de tipo salvaje, y los resultados se muestran
en la tabla 13. Se encontró que la enzima mutante expresada en la
E. Coli JM109/pEPI330 que tiene productividad mejorada del
éster nucleósido-5'-fosfato como se
ha descrito en el ejemplo 15, tiene la V_{max} disminuida pero el
valor de Km de la inosina disminuido de manera importante, lo que
significa una afinidad por la inosina aumentada en dos veces o más
en comparación con la enzima de tipo salvaje expresada en la E.
coli JM109/pEPI305. Esto sugirió que la productividad del éster
nucleósido-5'-fosfato de esta
enzima mutante se mejoró de manera importante no sólo por la
disminución en la actividad nucleotidasa, sino también por la mejora
de la afinidad por el nucleósido que fue un factor importante.
Consecuentemente, se esperaba que el aumento en la afinidad por el
nucleósido condujera a la mejora de la productividad.
Las nuevas enzimas mutantes expresadas en la
E. coli JM109 en la que se ha introducido el nuevo gen de la
enzima mutante producido en este ejemplo presentaron una afinidad
por la inosina que fue más mejorada que la de la E. coli
JM109/pEPI330 descrita en el ejemplo 15. Por lo tanto, se esperaba
que la productividad del éster
nucleósido-5'-fosfato hubiera
mejorado. Además, la enzima mutante expresada en la E. coli
JM109/pEPI380 no solo mejoró la afinidad por la inosina, sino que
también aumentó el valor de la V_{max} en comparación con la
enzima de tipo salvaje. Aún más, se esperaba que la productividad
del nucleósido-5'-fosfato hubiera
mejorado.
Cepa de la enzima | Km (mM) | V_{max} (unidad/mg) |
E. Coli JM 109/pEPI305 | 202 | 1,83 |
E. Coli JM 109/pEPI305 | 109 | 1,39 |
E. Coli JM 109/pEPI305 | 85 | 1,03 |
E. Coli JM 109/pEPI305 | 85 | 0,93 |
E. Coli JM 109/pEPI305 | 55 | 1,33 |
E. Coli JM 109/pEPI305 | 42 | 1,15 |
E. Coli JM 109/pEPI305 | 42 | 2,60 |
E. Coli JM 109/pEPI305 | 42 | 2,58 |
E. Coli JM 109/pEPI305 | 43 | 2,11 |
Cada una de las escherichia coli
JM109/pEPI330, escherichia coli JM109/pEPI340,
escherichia coli JM109/
pEPI360, escherichia coli JM109/pEPI370 y escherichia coli JM109/pEPI380, en cada una de las que se había introducido el plásmido que contiene el gen de la fosfatasa ácida mutante se inocularon en 50 mL de un medio L que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se incubaron a 37ºC durante 16 horas.
pEPI360, escherichia coli JM109/pEPI370 y escherichia coli JM109/pEPI380, en cada una de las que se había introducido el plásmido que contiene el gen de la fosfatasa ácida mutante se inocularon en 50 mL de un medio L que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se incubaron a 37ºC durante 16 horas.
Se disolvieron ácido pirofosfórico (15 g/dL) y 8
g/dL de inosina en una disolución tampón de acetato (pH 4,0). A
esta disolución se le añadió la cepa de E. coli JM109 en la
que se habían introducido los genes de la fosfatasa ácida mutante y
de tipo salvaje mencionadas anteriormente, de forma que la
concentración alcanzada fue de 200 mg/dL, expresada en peso seco de
las células. La reacción se realizó a 35ºC durante 32 horas
manteniendo el pH a 4,0, y se midió la cantidad de ácido
5'-inosínico formado a lo largo del tiempo. El
ácido inosínico formado era sólo ácido 5'-inosínico,
y no se observó en absoluto formación de ácido
2'-inosínico ni de ácido
3'-inosínico como subproductos. Los resultados se
muestran en la figura 8.
La E. coli JM109/pEPI330 descrita en el
ejemplo 15 mostró la acumulación de ácido
5'-inosínico en gran cantidad. Aunque todavía
quedaba sustrato, la formación de ácido
5'-inosínico se detuvo cuando la cantidad de ácido
5'-inosínico acumulado alcanzó la cantidad de 7,5
g/dL, y la cantidad de ácido 5'-inosínico no aumentó
más. Por el contrario, la cepas que contienen el nuevo gen de la
fosfatasa ácida mutante proporcionaron una gran cantidad de ácido
5'-inosínico acumulado. Especialmente, las
reacciones que utilizan la E. coli JM109/pEPI370 y la E.
coli JM109/pEPI380, proporcionaron la cantidad acumulada más
grande de ácido 5'-inosínico. Además, la velocidad
de reacción fue elevada, mostrando que la productividad del ácido
5'-inosínico se mejoró además de forma importante.
Particularmente, en la E. coli JM109/pEPI380, la velocidad de
reacción fue alta, y mostró una reactividad bastante elevada.
Se inoculó E. coli JM109/pEPI380 en la que
se había introducido el plásmido que contiene el nuevo gen de la
fosfatasa ácida mutante en 50 mL de un medio L que contenía 100
\mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se incubó a 37ºC durante
16 horas.
Se disolvieron ácido pirofosfórico (15 g/dL) y 8
g/dL de inosina, guanina, uridina o citidina como aceptores de
fosfato en una disolución tampón de acetato 100 mM (pH 4,5). A esto
se le añadió la cepa mencionada anteriormente, de forma que la
concentración alcanzada fue de 100 mg/dL, expresada en peso seco de
las células. La reacción se realizó a 35ºC durante 12 horas
manteniendo el pH a 4,0. La cantidad de éster
nucleósido-5'-fosfato formado se
muestra en la tabla 14. La fosforilación se produjo bien con
cualquiera de los nucleósidos para formar y acumular los
correspondientes ésteres
nucleósido-5'-fosfato. El nucleótido
formado fue sólo éster
nucleósido-5'-fosfato, y no se
observó en absoluto la formación de éster
nucleósido-2'-fosfato ni de éster
nucleósido-3'-fosfato como
subproductos.
Nucleósido | Producto | Cantidad producida (g/dL) |
Inosina | Ácido 5'-inosínico | 12,05 |
Guanosina | Ácido 5'-guanílico | 5,78 |
Uridina | Ácido 5'-uridílico | 13,28 |
Citidina | Ácido 5'-citidílico | 10,65 |
Se inoculó E. coli JM109/pEPI380 en la que
se ha introducido el plásmido que contiene el nuevo gen de la
fosfatasa ácida mutante en 50 mL de un medio L que contenía 100
\mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se cultivó a 37ºC durante
16 horas.
Se disolvieron inosina (6 g/dL), y 15 g/dL de un
tripolifosfato, un polifosfato (Polygon P, nombre comercial de un
producto de Chiyoda Kagaku K. K.), fenilacetato de disodio o
carbamilfosfato de disodio, en una disolución tampón de acetato 100
mM (pH 4,0). A esto se le añadió la cepa mencionada anteriormente
de manera que se alcanza una concentración de 100 mg/dL, expresada
en peso seco de las células. La reacción se realizó a 35ºC durante
12 horas manteniendo el pH a 4,0. La cantidad de ácido
5'-inosínico formado se muestra en la tabla 15. El
ácido 5'-inosínico se formó y se acumuló con buena
eficacia con cualquiera de los donantes de fosfato. Especialmente,
cuando se utilizó un polifosfato como donante de fosfato el ácido
5'-inosínico se acumuló en la cantidad más
elevada.
Donante de fosfato | Ácido 5'-inosínico formado (g/dL) |
Tripolifosfato de sodio | 10,84 |
Polifosfato de sodio | 13,35 |
Fenilfosfato de disodio | 12,84 |
Carbamilfosfato de disodio | 12,42 |
Acetilfosfato de potasio y litio | 10,65 |
Se sintetizaron los oligonucleótidos PRP1 y PRP2,
que tienen las secuencias de nucleótidos ilustradas en las
secuencias SEQ ID NO: 19 y 20 respectivamente en el listado de
secuencias. Estos oligonucleótidos se diseñan para amplificar el gen
que codifica la fosfatasa ácida de la providencia stuartii
en función de la secuencia de nucleótidos conocida del gen que
codifica la fosfatasa ácida de la providencia stuartii (Base
de datos del EMBL, número de inventario X64820).
Se extrajo DNA cromosómico de células microbianas
cultivadas de providencia stuartii ATCC 29851 según el método
de Murray y Thomson [Nucl. Acid. Res. 4.321, 8 (1980)]. Se
añadieron el DNA cromosómico (0,1 ng) como plantilla, los
oligonucleótidos PRP1 y PRP2 (2,5 \mumoles de cada uno) como
iniciadores y Taq DNA polimerasa (2,5 unidades, producida por
Takara Shuzo) a una disolución tampón de Tris-HCl
100 mM (pH 8,3, 100 \muL) que contenía dATP, dCTP, dGTP, dTTP
(cada uno de ellos 200 \muM), cloruro de potasio (50 mM) y
cloruro de magnesio (1,5 mM), para realizar una reacción PCR en la
que se repetía 30 veces un ciclo que comprendía periodos de 30
segundos a 94ºC, 2 minutos a 55ºC y 3 minutos a 72ºC. La disolución
de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa, seguida
por recuperación del fragmento de DNA amplificado de
aproximadamente 1 kbp mediante polvos de vidrio (fabricado por
Takara Shuzo). Se realizó la digestión del fragmento de gen con
BamHI, que se ligó con pUC118 y que había sido sometido a digestión
con BamHI. El plásmido obtenido como se ha descrito anteriormente,
se denominó pPRP100.
Se midieron la actividad fosfomonoesterasa y la
actividad de transfosforilación de la escherichia coli
JM109/
pPRP100, una transformante en la que se introdujo el pPRP100. Como resultado, la cepa presentó actividad de transfosforilación del nucleósido, así como actividad fosfomonoestearasa.
pPRP100, una transformante en la que se introdujo el pPRP100. Como resultado, la cepa presentó actividad de transfosforilación del nucleósido, así como actividad fosfomonoestearasa.
El plásmido se extrajo según el método de lisis
alcalina a partir de la transformante de escherichia coli
JM109/
pPRP100 para determinar la secuencia de nucleótidos. Una secuencia de nucleótidos de un marco de lectura abierto determinado y una secuencia de aminoácidos de la proteína deducida a partir de la secuencia de nucleótidos se muestran en las secuencias SEQ ID NO: 21 y 22 del listado de secuencias. La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto es completamente coincidente con la secuencia de nucleótidos del gen conocido de la fosfatasa ácida de providencia stuartii.
pPRP100 para determinar la secuencia de nucleótidos. Una secuencia de nucleótidos de un marco de lectura abierto determinado y una secuencia de aminoácidos de la proteína deducida a partir de la secuencia de nucleótidos se muestran en las secuencias SEQ ID NO: 21 y 22 del listado de secuencias. La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto es completamente coincidente con la secuencia de nucleótidos del gen conocido de la fosfatasa ácida de providencia stuartii.
Se extrajo DNA cromosómico de células microbianas
cultivadas de enterobacter aerogenes IFO 12010, klebsiella
planticola IFO 14939, y serratia ficaria IAM 13540 según
el método de Murray y Thomson [Nucl. Acid. Res. 4.321, 8
(1980)]. Luego, según el método descrito en el ejemplo 7 (2), se
construyó una biblioteca de expresión del gen cromosómico que
comprendía aproximadamente 20.000 transformantes de escherichia
coli JM109 y se investigó para obtener transformantes que
mostraran actividad de transfosforilación. Se consideró que cada una
de estas transformantes hospedaba el gen de la fosfatasa ácida
derivado de cada una de las cepas originales.
El DNA plásmido se extrajo a partir de una de las
transformantes de escherichia coli que se consideró que
tenía el gen de la fosfatasa ácida derivado de la enterobacter
aerogenes IFO 12010 según un método de lisis alcalina y se
analizó el DNA insertado del plásmido. El plásmido anterior se
denominó pENP100. Un mapa de enzimas de restricción del DNA
insertado derivado de la enterobacter aerogenes IFO 12010 se
muestra en la figura 9.
Como resultado de especificar la región del gen
de la fosfatasa ácida mediante subclonación, se sugirió que el gen
de la fosfatasa ácida está contenido en el fragmento de 1,6 kbp
escindido por las enzimas de restricción Sall y Kpnl para construir
el plásmido. El plásmido resultante se denominó pENP110.
Según el procedimiento descrito anteriormente, el
DNA plásmido se extrajo de una de las transformantes de
escherichia coli que se consideró que tenía el gen de
fosfatasa ácida derivado de klebsiella planticola IFO 14939
según un método de lisis alcalina y se analizó el DNA insertado del
plásmido. El plásmido anterior se denominó pKL100. Un mapa de
enzimas de restricción del DNA insertado derivado de klebsiella
planticola IFO 14939 se muestra en la figura 10.
Como resultado de especificar la región del gen
de la fosfatasa ácida mediante subclonación, se sugirió que el gen
de la fosfatasa ácida está contenido en el fragmento de 2,2 kbp
escindido mediante las enzimas de restricción Kpnl y EcoRI. Luego,
el fragmento Kpnl-EcoRI se ligó con el pUC118 que se
sometió a digestión con Kpnl y EcoRI para construir un plásmido. El
plásmido resultante se denominó pKL110.
Similarmente, se extrajo el DNA plásmido de una
de las transformantes de escherichia coli que se consideró
que tenía el gen de la fosfatasa ácida derivado de la serratia
ficaria IAM 13540 según un método de lisis alcalina y se analizó
el DNA insertado del plásmido. El plásmido anterior se denominó
pSEP100. Un mapa de enzimas de restricción del DNA insertado
derivado de la serratia ficaria IAM 13540 se muestra en la
figura 11.
Como resultado de especificar la región del gen
de la fosfatasa ácida mediante subclonación, se sugirió que el gen
de la fosfatasa ácida está contenido en el fragmento de 1,4 kbp
escindido mediante enzimas de restricción HindIII. Luego, el
fragmento HindIII se ligó con el pUC118 que se sometió a digestión
con HindIII para construir un plásmido. El plásmido resultante se
denominó pSEP110.
Luego, los DNA plásmidos se extrajeron a partir
de las transformantes, escherichia coli JM109/pENP110,
escherichia coli JM109/pKLP110 y escherichia coli
JM109/pSEP110, en las que se habían introducido pNEP110, pKLP110 y
pSEP110 respectivamente, según un método de lisis alcalina. Las
secuencias de nucleótidos de los insertos de estos plásmidos se
determinaron según un el método descrito en el ejemplo 8. Las
secuencias de nucleótidos determinadas de los marcos de lectura
abiertos de los insertos se muestran en la secuencia SEQ ID NO: 23
para la enterobacter aerogenes IFO 12010, en la secuencia
SEQ ID NO: 25 para la klebsiella planticola IFO 14939 y en
la secuencia SEQ ID NO: 27 para la serratia ficaria IAM
13540. Adicionalmente, las secuencias de aminoácidos deducidas se
muestran en las secuencias SEQ ID NO: 24, 26 y 28 respectivamente.
Debido al hecho de que las transformantes que hospedan los
plásmidos que contienen estos fragmentos presentaron actividad de
transfosforilación, se identificó que estos marcos de lectura
abiertos eran los genes de la fosfatasa ácida objetivos.
Las secuencias de nucleótidos y las secuencias de
aminoácidos deducidas se compararon por homología respectivamente
con secuencias conocidas. Se utilizaron las bases de datos EMBL y
SWISS-PROT. Como resultado, se ha demostrado que los
genes ilustrados en las secuencias SEQ ID NO: 23, 25 y 27 en el
listado de secuencias son genes nuevos. Se supuso que la proteína
codificada por el gen derivado de la enterobacter aerogenes
IFO 12010 comprende 248 restos aminoácidos, la proteína codificada
por el gen derivado de la klebsiella planticola IFO 14939
comprende 248 restos aminoácidos y que la proteína codificada por el
gen derivado de la serratia ficaria IAM 13540 comprende 244
restos aminoácidos. Hay una posibilidad de que estas proteínas
puedan ser proteínas precursoras como las fosfatasas ácidas
derivadas de la morganella morganii y la escherichia
blattae.
Las secuencias de aminoácidos deducidas de las
secuencias de nucleótidos se muestran en la figura 12 en
nomenclatura de una letra, junto con la secuencia de aminoácido
deducida de la fosfatasa ácida derivada de la morganella
morganii NCIMB 10466 obtenida en el ejemplo 8, la de la
escherichia blattae JCM1650 obtenida en el ejemplo 12 y la
secuencia de aminoácidos conocida de la fosfatasa ácida de la
providencia stuartii (EMBL número de inventario X64820). Los
restos aminoácidos comunes entre todas las secuencias de
aminoácidos se indican con asteriscos debajo de las secuencias en
la figura 12.
Como se muestra en la figura 12, las secuencias
de aminoácidos de las fosfatasas ácidas derivadas de seis cepas son
muy homogéneas entre ellas y 130 restos aminoácidos son comunes
entre todas las secuencias de aminoácidos. Por lo tanto, se supone
que estas fosfatasas ácidas tienen funciones similares.
Se inocularon escherichia coli
JM109/pPRP100 construida en el ejemplo 23, escherichia coli
JM109/pENP110, escherichia coli JM109/pKLP110 y
escherichia coli JM109/pSEP110 construidas en el ejemplo 24
en un medio L (50 mL) que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1
mM de IPTG, y se cultivaron a 37ºC durante 16 horas. Las células
microbianas se recogieron de estos cultivos por centrifugación, y se
lavaron una vez con suero fisiológico salino. Las células
microbianas se pusieron en suspensión en una disolución tampón de
fosfato de potasio 100 mM (5 mL, pH 7,0), y se rompieron mediante
un tratamiento por ultrasonidos realizado a 4ºC durante 20 minutos.
Las disoluciones tratadas se centrifugaron para eliminar la fracción
insoluble, y de esta forma se prepararon extractos libres de
células.
Las actividades de transfosforilación de los
extractos libres de células obtenidos se midieron utilizando
controles de extractos libres de células preparados a partir de
providencia stuartii ATCC 29851, enterobacter
aerogenes IFO 12010, klebsiella planticola IFO 14939,
serratia ficaria IAM 13540 y escherichia coli JM109
transformadas con el plásmido pUC118 de la misma manera que se ha
descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 16.
Las actividades de transfosforilación fueron bajas en todas las
cepas de tipo salvaje. La actividad de transfosforilación no se
detectó en la escherichia coli JM109/pUC118. Por otra parte,
las transformantes de la escherichia coli JM109 en las que
se introdujeron los genes de la fosfatasa ácida exhibieron
actividades de transfosforilación elevadas en comparación con las
cepas de tipo salvaje. Según el resultado, se ha demostrado que
cada uno de los fragmentos de DNA introducidos permiten que la
escherichia coli exprese la fosfatasa ácida a un nivel
elevado.
Cepa microbiana | Actividad de transfosforilación (unidades/mg) |
Providencia stuartii ATCC 29851 | 0,005 |
Enterobacter aerogenes IFO 12010 | 0,002 |
Klebsiella planticola IFO 14939 | 0,002 |
Serratia ficaria IAM 13450 | 0,001 |
Escherichia coli JM109/pUC118 | no detectado |
Escherichia coli JM109/pPRP100 | 0,833 |
Escherichia coli JM109/pENP110 | 0,301 |
Escherichia coli JM109/pKLP110 | 0,253 |
Escherichia coli JM109/pSEP110 | 0,123 |
Como se ha descrito en los ejemplos 20, 21 y 22
la cepa que contiene el gen de la fosfatasa ácida mutante derivada
de la E. blattae producida en el ejemplo 19 expresó una
cantidad considerable de la fosfatasa ácida. En la producción del
ácido 5'-inosínico a partir de ácido pirofosfórico
e inosina utilizando esta cepa, el ácido
5'-inosínico se formó y se acumuló con un alto
rendimiento de conversión. La temperatura de reacción óptima de
esta fosfatasa ácida fue 35ºC. Sin embargo, cuando esta reacción se
realizó a temperatura más alta, la velocidad de la reacción aumentó
y la reacción se realizó aumentando la concentración de nucleósido
del aceptor de fosfato en la disolución de reacción.
Consecuentemente, se esperaba que el éster
nucleósido-5'-fosfato se podría
producir más eficazmente durante un período de tiempo más corto.
Así, la estabilidad térmica de la enzima se mejoró introduciendo la
mutación en el gen de la fosfatasa ácida derivado de la E.
blattae clonado en el ejemplo 19 por el método de mutación
dirigida utilizando PCR.
Se utilizó el plásmido pEPI380 que contiene el
gen que codifica la fosfatasa ácida mutante derivada de la E.
blattae JCM1650 descrito en el ejemplo 19, y la mutación
dirigida se introdujo en este DNA plásmido mediante un método de
ingeniería genética para producir el gen que codifica la fosfatasa
ácida mutante que tiene la estabilidad térmica aumentada. El
pEPI380 es un DNA plásmido obtenido enlazando un fragmento de DNA de
2,4 Kbp que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida mutante
derivada de E. blattae JCM1650 y escindida con endonucleasas
de restricción C1al y BamHI a pBluescript KS(+) (suministrado por
Stratagene) escindido con C1al y BamHI. Se supone que la secuencia
de aminoácidos de la proteína madura anticipada a partir de la
secuencia de bases del gen que codifica la fosfatasa ácida son los
11 restos aminoácidos mostrados en la tabla 12 en el ejemplo 19, en
la secuencia representada por la secuencia SEQ ID NO: 8 en el
listado de secuencias.
Los oligonucleótidos MUT300 (SEQ ID NO: 9 en el
listado de secuencias), MUT400 (SEQ ID NO: 29 en el listado de
secuencias) y MUT410 (SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias) que
tienen las secuencias mostradas en la tabla de secuencias se
sintetizaron por el método de la fosfoamidita utilizando un
sintetizador de DNA (Modelo 394 suministrado por Applied
Biosystem).
Se produjo un gen mutante que codifica la
fosfatasa mutante en la que el resto 104º ácido glutámico (GAG) de
una proteína de maduración se sustituyó con un resto glicina
(GG*T*) por el método con PCR, como en el ejemplo 15, utilizando el
pEPI380 descrito en el ejemplo 19 como plantilla y MUT300 y MUT410
como iniciadores para introducir la mutación. El plásmido que
contiene el gen mutante se denominó pEPI410. Similarmente, se
produjo un gen mutante que codifica una fosfatasa mutante en el que
el resto 151º treonina (ACC) se sustituyó por un resto alanina
(G*CC) utilizando pEPI380 como plantilla y los oligonucleótidos
MUT300, MUT310 y MUT420 como iniciadores para introducir la
mutación. Este plásmido que contiene el gen mutante se denominó
pEPI420.
Se produjo un plásmido a partir de la
transformante de E. coli JM109 en la que se habían
introducido los plásmidos pEPI410 y pEPI420 que contienen el gen de
la fosfatasa mutante mediante el método de bacteriolisis alcalina,
se determinó la secuencia de bases y se identificó que se había
sustituido la base deseada.
Se inocularon cada una de las E. coli
JM109/pEPI410 y E. coli JM109/pEPI420 en las que se había
introducido el gen de la fosfatasa ácida mutante como se han
producido en este ejemplo y E. coli JM109/pEPI380 descrita en
el ejemplo 19 en 50 mL de un medio L que contenía 100 \mug/mL de
ampicilina y 1 mM de IPTG, y se incubaron a 37ºC durante 16 horas.
Las células se recogieron de 50 mL de la disolución de cultivo de
cada una de las cepas, y se lavaron una vez con una disolución de
suero salino fisiológico. Estas células se prepararon en suspensión
en 5 mL de una disolución tampón de fosfato 100 mM (pH 7,0), y se
trataron con ultrasonidos a 4ºC durante 20 minutos para moler las
células. La disolución así tratada se centrifugó para eliminar las
fracciones insolubles y preparar un extracto libre de células.
El extracto libre de células formado a partir de
cada una de las cepas se calentó a temperaturas que iban de 0ºC a
80ºC con un pH de 7,0 durante 30 minutos. Después de finalizar el
calentamiento, se realizó la transfosforilación en las condiciones
de reacción estándar de pH de 4,0 y 30ºC utilizando los extractos
libres de células tratados a varias temperaturas, y se midió la
actividad residual. Los resultados se muestran en la figura 13. La
enzima mutante expresada en la E. coli JM109/pEPI380
descrita en el ejemplo 19 fue estable en el tratamiento a 40ºC
durante 30 minutos, pero la disminución en la actividad se observó
a temperaturas más altas. Por el contrario, la nueva enzima mutante
expresada en la E. coli JM109/pEPI410 y E. coli
JM109/pEPI420, en las que se había introducido el nuevo gen de la
enzima mutante como se ha producido en este ejemplo, mejoraron la
estabilidad térmica, y la disminución de la actividad no se observó
incluso durante el tratamiento a 50ºC durante 30 minutos. Se
esperaba por lo tanto que cuando se produjera un éster
nucleósido-5'-fosfato utilizando
estas cepas a alta temperatura, la productividad fuera
adicionalmente mejorada.
Se inocularon cada una de las E. coli
JM109/pEPI410 y E. coli JM109/pEPI420 en las que se había
introducido el gen de la fosfatasa ácida mutante y E. coli
JM109/pEPI380 descrita en el ejemplo 19 en 50 mL de un medio L que
contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se incubaron
a 37ºC durante 16 horas.
Se disolvieron ácido pirofosfórico (15 g/dL) y 8
g/dL de inosina o guanosina en un tampón de acetato (pH 4,0). A
esto se le añadió la cepa de E. coli JM109 en la que se
había introducido cada gen de la fosfatasa ácida mutante de manera
que se alcanzara una concentración de 100 mg/dL expresada en peso
seco de las células. La reacción se realizó a 50ºC durante 9 horas
mientras se mantenía el pH a 4,0 y se midió la cantidad de ácido
5'-inosínico y de ácido 5'-guanílico
formados. Los resultados se muestran en la tabla 17. El éster
nucleósido fosfato formado fue solo un éster
nucleósido-5'-fosfato, y no se
observó en absoluto la formación de éster
nucleósido-2'-fosfato ni de éster
nucleósido-3'-fosfato como productos
secundarios. La reacción se realizó también a 35ºC durante 12 horas
utilizando la cepa de E. coli JM109/pEPI380 como control.
Los resultados se muestran también en la tabla 17.
Como se ha descrito en el ejemplo 21, el éster
nucleósido-5'-fosfato se formó y se
acumuló eficazmente con E. coli JM109/pEPI380. Por el
contrario, cuando la reacción se realizó utilizando E. coli
JM109/pEPI410 y E. coli JM109/pEPI420 en las que se había
introducido el nuevo de la fosfatasa ácida mutante derivado de la
E. blattae como se produjo en el ejemplo 26, se formaron y se
acumularon ácido 5'-inosínico o ácido
5'-guanílico en la misma cantidad durante un período
de tiempo más corto. Por lo tanto, el éster
nucleósido-5'-fosfato se podría
producir más eficazmente. Especialmente cuando se utilizó E.
coli JM109/pEPI420 no solo se acortó el tiempo de reacción,
sino que también los ácidos 5'-inosínico y
5'-guanílico se acumularon en cantidades más
grandes, y se demostró una productividad bastante elevada.
Cepa | Temperatura | Tiempo de | Cantidad de ác. | Cantidad de ác. |
de reacción | reacción | 5'-inosínico | 5'-guanílico | |
(ºC) | (h) | formado (g/dL) | formado (g/dL) | |
E. Coli | 30 | 12 | 12,05 | 5,78 |
JM109/pEPI380 | ||||
E. Coli | 50 | 9 | 11,85 | 5,80 |
JM109/pEPI410 | ||||
E. Coli | 50 | 9 | 12,60 | 6,11 |
JM109/pEPI420 |
INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Ajinomoto Co., Inc.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Nº 15-1, Kyobashi 1-chome, Chuo-ku
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Tokio
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Japón
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 104 Japón
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método para producir éster nucleósido-5'-fosfato
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 30
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEÍBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- CLASE DE MEDIO: disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: Patentin edición 1.0, Versión 1.25 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip1.000000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: 97309365.1
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 1
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO DE PROTEÍNA: N-terminal
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: morganella morganii
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: NCIMB 10466
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 2
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 720 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: morganella morganii
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: NCIMB 10466
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1...747
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sig...péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1...60
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mat...péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 61...747
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 3
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 249 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: morganella morganii
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: NCIMB 10466
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 4
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 229 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: morganella morganii
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: NCIMB 10466
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 5
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO DE PROTEÍNA: N-terminal
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: escherichia blattae
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: JCM 1650
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 6
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 750 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: escherichia blattae
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: JCM 1650
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1...747
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sig...péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1...54
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mat...péptido
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 55...747
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 7
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 249 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: escherichia blattae
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: JCM 1650
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 8
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 231 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: escherichia blattae
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: JCM 1650
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 9
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCTCGAGGTC GACGGTATATCG
\hfill20
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 10
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: sí
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATTCGCCACATGGCCACTGC T
\hfill21
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 11
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTAGCCCAGCC GGTAGAGGTA TG
\hfill22
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 12
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTGCATCTGCC TGCGCCTGCT TAC
\hfill23
\newpage
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 13
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAACGCGCCGT AGAAAGCATT
\hfill20
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 14
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGTCCTGGTCT TTGGTATTAC A
\hfill21
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 15
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCACATCGCCA GCGGCCAGGT CTGCAT
\hfill26
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 16
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCATATAGTG TTCTTTCGCG C
\hfill21
\newpage
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 17
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATTACAGGTT TCGACCCCAT AA
\hfill22
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 18
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTGATGCATGT CCGGGCTGTC TTTTT
\hfill25
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 19
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: sí
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTGGATCCTG TGGCTATCAT CACCT
\hfill25
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 20
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTGGATCCGA CGCGATTTTA CCATA
\hfill25
\newpage
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 21
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 747 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: providencia stuartii
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: ATCC 29851
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1...744
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 22
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 248 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: providencia stuartii
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: ATCC 29851
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 23
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 744 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: enterobacter aerogenes
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: IFO 12010
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1...744
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 24
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 248 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: enterobacter aerogenes
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: IFO 12010
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 25
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 747 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: klebsiella planticola
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: IFO 14939
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1...747
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 26
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 248 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: klebsiella planticola
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: IFO 14939
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 27
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 735 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: serratia ficaria
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: IAM 13540
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1...732
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 28
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 244 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: serratia ficaria
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: IAM 13540
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 29
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCCGGCGTCA CCAATCATAT T
\hfill21
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 30
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCCGGTAGAG GCATGCCCGG A
\hfill21
Claims (15)
1. Un método para producir éster
nucleósido-5'-fosfato que comprende
las etapas de permitir que una fosfatasa ácida actúe en condiciones
de pH de 3,0 a 5,5 sobre un nucleósido y un donante de grupo
fosfato para producir éster
nucleósido-5'-fosfato, y
recogerlo,
en el que la fosfatasa ácida tiene una secuencia
de aminoácidos que es esencialmente idéntica a una secuencia de
aminoácidos elegida entre el grupo que consta de las secuencias SEQ
ID NOs: 4, 8, 22, 24, 26 y 28, y dicha fosfatasa ácida tiene una
mutación o mutaciones que aumenta la afinidad por el nucleósido y/o
la estabilidad térmica con respecto a dicha secuencia de
aminoácidos elegida entre el grupo que consta de las secuencias SEQ
ID NOs: 4, 8, 22, 24, 26 y 28,
y en el que la fosfatasa ácida tiene una
secuencia de aminoácidos que es distinta de:
- i.
- la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, mutada sólo en el resto 72º glicina y/o el resto 151º isoleucina;
- ii.
- la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, mutada sólo en el resto 74º glicina y/o el resto 153º isoleucina;
- iii.
- las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs: 22, 24 ó 26 mutadas sólo en el resto 92º glicina y/o el resto 171º isoleucina; y
- iv.
- la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28, mutada sólo en el resto 88º glicina y/o el resto 167º isoleucina;
2. Un método para producir éster
nucleósido-5'-fosfato que comprende
las etapas de permitir que un microorganismo actúe en condiciones de
pH de 3,0 a 5,5 sobre un nucleósido y un donante de grupo fosfato
para producir éster
nucleósido-5'-fosfato, y recogerlo,
en el que el microorganismo se transforma con un DNA recombinante
que comprende un gen que codifica una fosfatasa ácida según la
reivindicación 1.
3. El método según las reivindicaciones 1 y 2, en
el que el valor de Km para el nucleósido es inferior a 100.
4. El método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la fosfatasa ácida conserva
más actividad que la del tipo salvaje después de haberse mantenido
a 50ºC durante 30 minutos a pH 7,0.
5. El método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la fosfatasa ácida que tiene
una afinidad por el nucleósido aumentada se deriva de una bacteria
que pertenece al género escherichia, al género
morganella, al género providencia, al género
enterobacter, al género klebsiella o al género
serratia.
6. El método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicha mutación se elige
entre el grupo que consta de las sustituciones del resto 63º
leucina, el resto 65º alanina, el resto 66º ácido glutámico, el
resto 69º asparagina, el resto 71º serina, el resto 72º serina, el
resto 74º glicina, el resto 85º serina, el resto 92º alanina, el
resto 94º alanina, el resto 104º ácido glutámico, el resto 116º
ácido aspártico, el resto 130º serina, el resto 135º treonina, el
resto 136º ácido glutámico, el resto 151º treonina y/o el resto
153º isoleucina con otro aminoácido en la secuencia SEQ ID NO:
8.
7. El método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la fosfatasa ácida tiene una
secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 y que está mutada mediante una
sustitución del resto 74º glicina y/o el resto 153º isoleucina, y
adicionalmente comprende mutaciones elegidas entre el grupo que
consta de sustituciones del resto 63º leucina, el resto 65º
alanina, el resto 66º ácido glutámico, el resto 69º asparagina, el
resto 71º serina, el resto 72º serina, el resto 85º serina, el resto
92º alanina, el resto 94º alanina, el resto 104º ácido glutámico,
el resto 116º ácido aspártico, el resto 130º serina, el resto 135º
treonina, el resto 136º ácido glutámico y/o el resto 151º
treonina.
8. El método según la reivindicación 6 o la
reivindicación 7, en el que el resto 63º leucina se sustituye con un
resto glutamina, el resto 65º alanina se sustituye con un resto
glutamina, el resto 66º ácido glutámico se sustituye con un resto
alanina, el resto 69º asparagina se sustituye con un resto ácido
aspártico, el resto 71º serina se sustituye con un resto alanina,
el resto 72º serina se sustituye con un resto alanina, el resto 74º
glicina se sustituye con un resto ácido aspártico, el resto 85º
serina se sustituye con un resto tirosina, el resto 92º alanina se
sustituye con un resto serina, el resto 94º alanina se sustituye
con un resto ácido glutámico, el resto 104º ácido glutámico se
sustituye con un resto glicina, el resto 116º ácido aspártico se
sustituye con un resto ácido glutámico, el resto 130º serina se
sustituye con un resto ácido glutámico, el resto 135º treonina se
sustituye con un resto lisina, el resto 136º ácido glutámico se
sustituye con un resto ácido aspártico, el resto 151º treonina se
sustituye con un resto alanina y/o el resto 153º isoleucina se
sustituye con un resto treonina.
9. El método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la fosfatasa ácida tiene
estabilidad térmica mejorada y se elige entre el grupo que consta
de:
\newpage
- (a)
- una fosfatasa ácida que tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 y que tiene una mutación que es una sustitución del resto 102º ácido glutámico y/o una mutación que es una sustitución del resto 149º treonina;
- (b)
- una fosfatasa ácida que tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 y que tiene una mutación que es una sustitución del resto 104º ácido glutámico y/o una mutación que es una sustitución del resto 151º treonina;
- (c)
- una fosfatasa ácida que tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs: 22, 24 ó 26 y que tiene una mutación que es una sustitución del resto 122º ácido glutámico y/o una mutación que es una sustitución del resto 169º treonina; y
- (d)
- una fosfatasa ácida que tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28 y que tiene una mutación que es una sustitución del resto 118º ácido glutámico y/o una mutación que es una sustitución del resto 165º treonina.
10. El método según la reivindicación 9, en el
que dicho resto ácido glutámico se sustituye con un resto glicina
y/o dicho resto treonina se sustituye con un resto alanina.
11. El método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicho donante de grupo
fosfato se elige entre el grupo que consta de ácido polifosfórico o
una de sus sales, ácido fenilfosfórico o una de sus sales, ácido
acetilfosfórico o una de sus sales y carbamilfosfato o una de sus
sales.
12. Una fosfatasa ácida mutante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 10.
13. Un gen que codifica la fosfatasa ácida según
la reivindicación 12.
14. Un DNA recombinante que comprende el gen
según la reivindicación 13.
15. Un microorganismo que hospeda el DNA
recombinante según la reivindicación 14.
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