JP4192408B2 - ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法に関する。ヌクレオシド−５’−燐酸エステルは、調味料、医薬並びにそれらの原料等として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオシドを酵素的に燐酸化してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを製造する方法として、種々の方法が知られている。中でも、副産物が少なく、かつ、効率のよいヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法として、酸性フォスファターゼをpH3.0〜5.5の条件下でヌクレオシド並びにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）から成る群より選択される燐酸供与体に作用させてヌクレオシド−５’−燐酸エステルを製造する方法が開発されている（WO96/37603、特開平10-201481）。また、これらの方法において、好ましい酸性フォスファターゼとして、燐酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ（WO96/37603）、あるいは、ヌクレオシドに対する親和性が上昇し及び／又は温度安定性が向上した変異型フォスファターゼ（特開平10-201481）が提案されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記の方法においては、基質（原料）として各種ヌクレオシドが利用可能であるが、難溶性のヌクレオシドを基質とする際、易溶性のヌクレオシドに比べて反応収率が低下するという問題があった。
【０００４】
本発明は、上記観点からなされたものであり、ヌクレオシドまたはその前駆体、特に難溶性のヌクレオシドまたはその前駆体を原料として、酵素的にヌクレオシド−５’−燐酸エステルを効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
難溶性のヌクレオシドであっても、有機溶剤、硼酸あるいはジメチルスルホキシドのような界面活性剤を反応系に添加することによって、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生成収率を向上させることができる場合がある（WO96/37603、特開平10-201481）。しかし、一般的に有機溶剤や界面活性剤などにより酵素の失活が誘発される恐れがあり、好ましくない場合も少なくないと考えられる。そこで本発明者は、種々検討を行った結果、ヌクレオシド結晶を微細化することによって、反応系へのヌクレオシドの供給速度を向上させることができ、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生成収率を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００６】
（１）ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を物理的処理により粉砕し、粉砕したヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸供与体と反応させ、ヌクレオシドを燐酸化してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成せしめることを特徴とするヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
（２）ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を、比表面積が０．４ｍ2／ｇ以上となるように物理的処理により粉砕する（１）のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
（３）前記酵素が酸性フォスファターゼである（１）又は（２）のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
（４）前記酸性フォスファターゼは、ヌクレオシドに対する親和性が上昇した酸性フォスファターゼである（３）のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
（５）前記反応をｐＨ３．０〜５．５の条件下で行う（３）又は（４）のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
（６）前記ヌクレオシドがグアノシンである（１）〜（５）のいずれか一項に記載のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
（７）比表面積が０．４ｍ2／ｇ以上であるヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸供与体と反応させ、ヌクレオシドを燐酸化してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成せしめることを特徴とするヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法においては、ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を物理的処理により粉砕し、粉砕したヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸供与体と反応させ、ヌクレオシドを燐酸化してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成せしめる。ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶の物理的処理による粉砕は、例えば、ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を水中でスラリーとし、一般的に用いられている粉砕機（例えばスイスWAB社製DYNO-MILL等）を用いて粉砕することによって行うことができる。このような処理によって、微細化された結晶のスラリーが得られる。
【０００８】
本発明においては、ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を粉砕することによって、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する反応の効率を高めることができる。したがって、前記反応効率が向上する限り、粉砕の程度は特に問わないが、好ましくは、粉砕後の結晶の比表面積が０．４ｍ2／ｇ以上、より好ましくは０．８ｍ2／ｇ以上となるように粉砕することが望ましい。比表面積の上限は特に制限されないが、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生成効率の向上は結晶の比表面積が一定以上になると頭打ちになるので、通常は１ｍ2／ｇ程度で十分であると考えられる。
【０００９】
粉砕によって微細化された結晶の平均粒径は、例えば、stokesの抵抗則に基づく沈降法に従い、沈降式粒度分布測定装置（例えば、島津製作所(株)遠心沈降式粒度分布測定装置SA-CP3）を用いて測定することができる。また、こうして測定される平均粒径に基づいて、微結晶の比表面積を計算することができる。
【００１０】
粉砕するヌクレオシドまたはその前駆体の結晶は、精製されたものであってもよく、ヌクレオシドまたはその前駆体を産生する微生物の培養液中に蓄積する結晶スラリーをそのまま用いてもよい。
【００１１】
本発明に用いる酵素としては、ヌクレオシドまたはその前駆体への、燐酸供与体からの燐酸基の転移によりヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する反応を触媒するものであれば制限はない。
【００１２】
酵素の由来は特に制限されず、微生物、植物又は動物等に由来する酵素を用いることができるが、微生物に由来するものが好ましい。また、酵素は、微生物の野生株又は変異株から調製したものであってもよく、遺伝子工学的手法を用いて作製された形質転換株から調製したものであってもよい。さらに、酵素を産生する微生物の菌体を含む培養物、該培養物から分離・回収した菌体、該菌体を固定化処理、アセトン処理、凍結乾燥処理等した菌体処理物を使用することもできる。
【００１３】
本発明に用いる好ましい酵素として、酸性フォスファターゼ（EC 3.1.3.2）が挙げられる。酸性ホスファターゼとしては、微生物に由来するものが好ましく、特に好適な例として、モルガネラ属、エシェリヒア属、プロビデンシア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属又はセラチア属に属する細菌が、当該酵素活性を有しており、これら細菌に由来する酵素がある。そのような細菌の代表例として以下のような菌株を挙げることができる。
【００１４】
モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii） NCIMB 10466
モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii） IFO 3168
モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii） IFO 3848
エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae） JCM 1650
エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae） ATCC 33429
エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae） ATCC 33430
プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii） ATCC 29851
プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii） ATCC 33672
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes） IFO 12010
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes） IFO 13534
クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella planticola） IFO 14939
クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella planticola） IAM 1133
セラチア・フィカリア（Serratia ficaria） IAM 13540
セラチア・ マルセセンス（Serratia marcescens） IAM 12143
【００１５】
より好ましくは、ヌクレオシドに対する親和性が上昇した酸性フォスファターゼ（特開平10-201481参照）が挙げられる。このような酸性フォスファターゼとして具体的には、後記参考例１記載のエシェリヒア・ブラッタエ由来変異型酸性フォスファターゼ、エンテロバクター・アエロゲネス由来新規変異型酸性フォスファターゼ、及び、特開平10-201481号公報記載の各種変異型酸性フォスファターゼが挙げられる。
【００１６】
また、酸性フォスファターゼは、本来、燐酸エステルを酸性条件下で加水分解する反応を触媒する酵素であり、燐酸転移反応により生成するヌクレオシド−５’−燐酸エステルを分解するヌクレオチダーゼ活性を有しているが、ヌクレオチダーゼ活性（燐酸エステル加水分解活性）が低下した変異型酸性フォスファターゼ（WO96/37603参照）も、本発明に好適に使用することができる。
さらに、温度安定性の向上した酸性フォスファターゼ、又は、ヌクレオシドに対する親和性が上昇し、かつ、温度安定性の向上した酸性フォスファターゼ（特開平10-201481）も、本発明に好適に用いることができる。
【００１７】
本発明においては、微細化されたヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を用いる以外は、通常のヌクレオシドまたはその前駆体を酵素的に燐酸化してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成せしめる方法と同様にして燐酸化反応を行うことができる。
【００１８】
酵素として酸性フォスファターゼを用いる場合は、燐酸化反応をpH3.0から5.5の範囲の弱酸性に調製することが好ましい。
【００１９】
本発明に用いるヌクレオシドまたはその前駆体としては、プリンヌクレオシド類として、イノシン、グアノシン、アデノシン、キサントシン、プリンリボシド、６−メトキシプリンリボシド、２，６−ジアミノプリンリボシド、６−フルオロプリンリボシド、６−チオプリンリボシド、２−アミノ−６−チオプリンリボシド、メルカプトグアノシン等、ピリミジンヌクレオシド類として、ウリジン、シチジン、５−アミノウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ブロモウリジン、６−アザウリジン等が挙げられる。燐酸化反応によりこれらの天然型ヌクレオシド及び非天然型ヌクレオシドの５’位が特異的に燐酸化され、それぞれ対応するヌクレオシド−５’−燐酸エステルが生成する。
【００２０】
本発明においては、上記のようなヌクレオシドまたはその前駆体のうち、溶解度の低いもの、例えばグアノシン、イノシン、アデノシン等、特にグアノシン、アデノシン等のような難溶性のヌクレオシドを用いた場合、特に高い効果が期待できる。これらヌクレオチド等の製造法は、公知の方法を用いることができ、例えばグアノシンは特公昭５７−１４１６０号公報、イノシンは特公昭５７−２２５５８号公報、特公昭６２−３７９５９号公報、アデノシンは特公平４−５２１１８号公報記載の方法を採用できる。
【００２１】
反応液に添加するヌクレオシドまたはその前駆体の濃度は１〜20g/dlが望ましい。水に難溶性のヌクレオシドまたはその前駆体を使用する場合には、それらの結晶を粉砕して微細化することに加えて、硼酸あるいはジメチルスルホキシドのような界面活性剤を反応液に添加すると、さらに反応収率が向上する場合がある。
【００２２】
また、本発明に用いる燐酸供与体としては、酵素反応によりヌクレオシドまたはその前駆体へ燐酸基を転移してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成し得るものであれば特に制限されないが、具体的には、ポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）、アセチル燐酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）等が挙げられる。ポリ燐酸（塩）としては、ピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサメタ燐酸もしくはそれらの混合物、又はそれらのナトリウム塩、カリウム塩もしくはそれらの塩混合物などが、フェニル燐酸（塩）としては、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリウム、Ｏ，Ｏ−ジフェニル燐酸無水物もしくはそれらの混合物などが、カルバミル燐酸（塩）としては、カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウムもしくはそれらの混合物などが使用可能である。燐酸供与体の使用濃度は、燐酸受容体であるヌクレオシドまたはその前駆体の濃度によって決定される。通常、ヌクレオシドまたはその前駆体の１〜５倍量が望ましい。
【００２３】
反応は通常、温度20〜60℃、好ましくは30〜40℃で、pH3.5〜6.5、好ましくはpH3.5〜5.5の弱酸性側が好結果を与える。反応には静置又は撹はんのいずれの方法も採用し得る。反応時間は、使用する酵素の活性、基質濃度などの条件によって異なるが、１〜100時間である。
【００２４】
このようにして生成したヌクレオシド−５’−燐酸エステルを反応終了混合物より採取分離するには、合成吸着樹脂を用いる方法や沈殿剤を用いる方法、その他通常の採取分離方法が採用できる。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００２６】
【参考例１】
エシェリヒア・ブラッタエ由来変異型酸性フォスファターゼ遺伝子の取得
エシェリヒア・ブラッタエJCM1650由来野生型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpEPI305（WO96/37603参照）を用い、このプラスミドDNAに遺伝子工学的手法により部位特異的変異を導入し、変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を作製した（特開平10-201481参照）。
【００２７】
pEPI305はエシェリヒア・ブラッタエJCM1650に由来する野生型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含む、制限酵素ClaIと制限酵素BamHIで切り出される2.4Kbpの大きさのDNA断片を、ClaI及びBamHIで切断したpBluescript KS(+)（ストラタジーン社製）に結合したプラスミドDNAである。pEPI305をエシェリヒア・コリ JM109に保持させた株は、AJ13144と命名され、平成８年２月23日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託され、受託番号FERM BP-5423が付与されている。
【００２８】
DNA合成装置（アプライドバイオシステム社製モデル394）を用いてホスホアミダイト法にて配列番号１及び配列番号２に示すオリゴヌクレオチドMUT300及びMUT370をそれぞれ合成した。
【００２９】
鋳型としてpEPI305 1ng、プライマーとしてM13プライマーRV（宝酒造社製）およびMUT370オリゴヌクレオチド各2.5μmolおよびタックDNAポリメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットをdATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム50mMおよび塩化マグネシウム 1.5mMを含む100mM トリス−塩酸緩衝液（pH8.3）100μlに添加し、94℃を30秒、55℃を2分、72℃を3分のサイクルを25回繰り返すＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応はサーマルサイクラーPJ2000型（宝酒造社製）を用いて行った。また別に、鋳型としてプラスミドDNA pEPI305 1ng、プライマーとしてM13プライマーM3（宝酒造社製）およびMUT300オリゴヌクレオチド各2.5μmolを用いて同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれの反応液をマイクロスピンカラムS-400（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過により精製し、プライマーを除去した。
【００３０】
それぞれのＰＣＲ反応液1μlをdATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム 50mMおよび塩化マグネシウム 1.5mMを含む100mM トリス−塩酸緩衝液（pH8.3）95μlに添加し、94℃で10分加熱後、60分間かけて37℃まで冷却した後、37℃で15分保温しヘテロ二本鎖を形成させた。これにタックDNAポリメラーゼ2.5ユニットを添加して72℃で3分反応を行い、ヘテロ二本鎖を完成させた。次に、この反応液にM13プライマーRVおよびM13プライマーM3各2.5μmolを添加して、94℃を30秒、55℃を2分、72℃を3分のサイクルを10回繰り返すＰＣＲ反応を行った。
【００３１】
2回目のＰＣＲ反応の生成物をClaIとBamHIで切断後フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。このDNA断片をClaIとBamHIで切断したpBluescript KS(+)に結合し、得られたプラスミドDNAを用いて常法によりエシェリヒア・コリJM109（宝酒造製）を形質転換した。これを100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にプレーティングし、形質転換体を得た。 形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換されていることを確認した。塩基配列の決定は Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit （アプライドバイオケミカル社製）を用い、サンガーらの方法（J. Mol. Biol., 143, 161（1980））に従って行った。
【００３２】
このようにして、成熟蛋白質の６３番目のロイシン残基（CTG）がグルタミン残基（C*AG）に、６５番目のアラニン残基（GCG）がグルタミン残基（*C*AG）に、６６番目のグルタミン酸残基（GAA）がアラニン残基（G*CA）に、６９番目のアスパラギン残基（AAC）がアスパラギン酸残基（*GAC）に、７１番目のセリン残基（AGC）がアラニン残基（*G*CC）に、７２番目のセリン残基（AGT）がアラニン残基（*G*CT）に、７４番目のグリシン残基（GGG）がアスパラギン酸残基（*G*A*T）に、１３５番目のスレオニン残基（ACC）がリジン残基（*A*A*A）に、１３６番目のグルタミン酸残基（GAG）がアスパラギン酸残基（GA*C）に、１５３番目のイソロイシン残基（ATC）がスレオニン残基（A*CC）にそれぞれ置換した、変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作製した。この変異型遺伝子を含むプラスミドをpEPI370と命名した。
【００３３】
【実施例１】
エシェリヒア・ブラッタエ由来変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた５’−グアニル酸の生産
＜１＞酸性フォスファターゼを含む菌体の調製
参考例１記載のプラスミドpEPI370を保持するエシェリヒア・コリJM109/pEPI370をＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養後、培養液から遠心分離により集菌し、菌体を取得した。
【００３４】
＜２＞ヌクレオシドスラリーの粉砕
グアノシン結晶を水中でスラリーとし、粉砕機（スイスWAB社製DYNO-MILL）により結晶の粉砕処理を行った。この際、粉砕時間などの条件を変更して様々な粒経の結晶を取得した。グアノシン結晶は単位重量あたりの比表面積は0.2m2/gであったものが、粉砕後0.4m2/g以上に増加し、結晶の微細化が可能であった（表１）。なお、グアノシン結晶の比表面積はstokesの抵抗則に基づく沈降法に従い、沈降式粒度分布測定装置（島津製作所(株)遠心沈降式粒度分布測定装置SA-CP3）で測定した平均粒経をもとに算出した。
【００３５】
＜３＞５’−グアニル酸の生産
次に酸性ピロ燐酸29.3g、およびグアノシンの未粉砕結晶又は粉砕結晶のスラリー7.5g(グアノシン含量として)を水溶液中で混合して苛性ソーダでpH4.5付近に調整後、上記菌体を100mg添加して最終液量が100mlとなるように調製し、30℃で40時間反応を行い、生成した５’−グアニル酸の量を測定した。
【００３６】
グアノシン結晶の比表面積と最大蓄積時点での蓄積および収率を表１及び図１に、反応経時収率変化を図２に示した。その結果、粉砕結晶を基質とした場合、未粉砕結晶を基質とした場合に比べ、良好に燐酸化反応が進行し、５’−グアニル酸生成収率で14％以上、燐酸収率で1.4%以上、成績が向上した。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【実施例２】
エシェリヒア・ブラッタエ由来変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた各種ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産
＜１＞酸性フォスファターゼを含む菌体の調製
実施例１と同様に、エシェリヒア・コリJM109/pEPI370をＬ培地に接種し、37℃で16時間培養後、培養液から遠心分離により集菌し、菌体を取得した。
【００３９】
＜２＞ヌクレオシドスラリーの粉砕
ヌクレオシド結晶を水中でスラリーとし、粉砕機（スイスWAB社製DYNO-MILL）により結晶の粉砕処理を行った。ヌクレオシド結晶は単位重量あたりの比表面積は0.2m2/gであったものが、粉砕後0.4m2/g以上に増加し、結晶の微細化が可能であった。なお、比表面積はstokesの抵抗則に基づく沈降法に従い沈降式粒度分布測定装置（島津製作所(株)遠心沈降式粒度分布測定装置SA-CP3）で測定した平
均粒経をもとに算出した。
【００４０】
＜３＞ヌクレオチドの生産
次に、酸性ピロ燐酸29.3g、および、イノシンもしくはアデノシンの未粉砕結晶又はこれらのヌクレオシドの粉砕結晶のスラリー5g(ヌクレオシド含量として)を水溶液中で混合して苛性ソーダでpH4.5付近に調整後、上記菌体を100mg添加して最終液量が100mlとなるように調製後、30℃で24時間反応を行い、生成したヌクレオチドの量を測定した。最大蓄積時点での蓄積を表２に示した。その結果、粉砕したヌクレオシドスラリーを基質とした場合、未粉砕結晶を基質とした場合に比べ良好に燐酸化反応が進行し、ヌクレオチド生成量の向上が認められた。
【００４１】
【表２】
【００４２】
【実施例３】
エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来新規変異型酸性フォスファターゼ遺伝子の作製
エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来野生型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子に、遺伝子工学的手法によって部位特異的変異を導入し、ヌクレオシドに対する親和性が向上した変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を作製した。
【００４３】
特開平10-201481号公報の実施例２４記載の方法にて取得したエンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来野生型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpENP110より、野生型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含む、制限酵素SalIと制限酵素KpnIで切り出される1.6kbpの大きさのDNA断片を切り出し、SalI及びKpnIで切断したpUC19（酒造社製）に結合し、このプラスミドをpENP120と命名した。
【００４４】
DNA合成装置（アプライドバイオシステム社製モデル394）を用いてホスホアミダイト法にて配列表に示す配列のオリゴヌクレオチドMUT110（配列番号３）、MUT120（配列番号４）、MUT130（配列番号５）、MUT140（配列番号６）、MUT150（配列番号７）を合成した。
【００４５】
鋳型としてpENP120 1ng、プライマーとしてM13プライマーM4（宝酒造社製）およびMUT110オリゴヌクレオチド各2.5μmol、およびタックDNAポリメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットを、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム 50mMおよび塩化マグネシウム 1.5mMを含む100mM トリス−塩酸緩衝液（pH8.3）100μlに添加し、94℃を30秒、55℃を2分、72℃を3分のサイクルを25回繰り返すＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応はサーマルサイクラーPJ2000型（宝酒造社製）を用いて行った。また別に、鋳型としてプラスミドDNA pENP120 1ng、プライマーとしてM13プライマーRV（宝酒造社製）およびMUT6プライマー（宝酒造社製）各2.5μmolを用いて同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれの反応液をマイクロスピンカラムS-400（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過により精製し、プライマーを除去した。
【００４６】
それぞれのＰＣＲ反応液1μlを、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム50mMおよび塩化マグネシウム 1.5mMを含む100mM トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.3）95μlに添加し、94℃で10分加熱後、60分間かけて37℃まで冷却した後、37℃で15分保温しヘテロ二本鎖を形成させた。これにタックDNAポリメラーゼ2.5ユニットを添加して72℃で3分反応を行い、ヘテロ二本鎖を完成させた。次に、この反応液にM13プライマーRVおよびM13プライマーM3各2.5μmolを添加して、94℃を30秒、55℃を2分、72℃を3分のサイクルを10回繰り返すＰＣＲ反応を行った。
【００４７】
2回目のＰＣＲ反応の生成物をSalI及びEcoRIで切断後フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。このDNA断片をSalI及びEcoRIで切断したpUC19に結合し、得られたプラスミドDNAを用いて常法によりエシェリヒア・コリJM109（宝酒造製）を形質転換した。これを100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にプレーティングし、形質転換体を得た。形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換されていることを確認した。塩基配列の決定は Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用い、サンガーらの方法（J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)）に従って行った。このようにしてプロ蛋白質の92番目のグリシン残基（GGC）がアスパラギン酸残基（G*A*C）に置換した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作製した。この変異型遺伝子を含むプラスミドをpENP130と命名した。
【００４８】
変異を導入したプラスミドを鋳型として同様の操作を繰り返し、累加的に部位特異的変異を導入した。形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換されていることを確認した。作製した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子と変異部位を表３に示した。なお変異部位のアミノ酸残基はシグナルペプチドが切断される前のプロ蛋白質のアミノ酸配列中のアミノ酸残基を示している。
【００４９】
【表３】
【００５０】
変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109/pENP170、および野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109/pENP120を、アンピシリン100μg/mlおよびIPTG 1mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。それぞれの菌の培養液2Lから遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で1回洗浄した。菌体を50mlの100mM燐酸バッファー（pH7.0）に懸濁し、4℃で20分間超音波処理を行い菌体を破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。それぞれの無細胞抽出液を用いて燐酸転移反応におけるイノシンに対するKm値を測定した。
【００５１】
ヌクレオシドへの燐酸転移活性の測定は、イノシンを基質として、次の条件で行った。イノシン40μmol/ml、ピロ燐酸ナトリウム100μmol/ml、酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）100μmol/ml及び酵素を含む反応液（1ml）でpH4.0、30℃で10分反応を行った。2N塩酸200μlを添加して反応を停止した後、遠心分離により沈澱を除き、燐酸転移反応により生成した５’−イノシン酸を定量した。この標準反応条件にて1分間に1μmolの５’−イノシン酸を生成する酵素量を１unitと定めた。なお、イノシン及び５’−イノシン酸は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、下記の条件にて分析した。
【００５２】
カラム：Cosmosil 5C18-AR （4.6×150mm）〔ナカライテスク社製品〕
移動相：5mM 燐酸カリウムバッファー（pH 2.8）／メタノール＝95／5
流速：1.0ml/min
温度：室温
検出：ＵＶ245nm
【００５３】
上記の組成の反応条件においてイノシン濃度を10から100μmol/mlまで変化させて燐酸転移活性を測定し、Hanes-Woolfプロット（Biochem.J., 26,1406 (1932)）により燐酸転移反応におけるイノシンの速度定数を求めた。
【００５４】
エシェリヒア・コリ JM109/pEPI305で発現している野生型酵素のKm値は200mMと算出された。一方、本実施例で作製したエシェリヒア・コリ JM109/pEPI330で発現している変異型酵素のKm値は40mMと算出され、新たに構築したエンテロバクター・アエロゲネス由来変異型酸性フォスファターゼは、イノシンに対するKm値が大きく低下し、イノシンに対する親和性が向上していることが明らかになった。
【００５５】
【実施例４】
エンテロバクター・アエロゲネス由来変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた５’−グアニル酸の生産
＜１＞酸性フォスファターゼを含む菌体の調製
実施例３で取得したエンテロバクター・アエロゲネス由来変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を導入したエシェリヒア・コリ JM109/pENP170を、IPTG 1mMを含むL培地50mlに接種し、37℃で１６時間培養後、培養液から遠心分離により集菌し、菌体を取得した。
【００５６】
＜２＞グアノシン結晶スラリーの粉砕
グアノシン結晶を水中でスラリーとし、粉砕機（スイスWAB社製DYNO-MILL）により結晶の粉砕処理を行った。グアノシン結晶は、単位重量あたりの比表面積は0.2m2/gであったものが、粉砕後0.4m2/g以上に増加し、結晶の微細化が可能であった。なお、比表面積はstokesの抵抗則に基づく沈降法に従い沈降式粒度分布測定装置（島津製作所(株)遠心沈降式粒度分布測定装置SA-CP3）で測定した平均粒経をもとに算出した。
【００５７】
＜３＞グアノシンの燐酸化
次に酸性ピロ燐酸29.3g、およびグアノシンの未粉砕結晶又は粉砕結晶のスラリー7.5g(グアノシン含量として)を水溶液中で混合して苛性ソーダでpH4.5付近に調整後、上記菌体を100mg添加して最終液量が100mlとなるように調製し、30℃で40時間反応を行い、生成した５’−グアニル酸量を測定した。最大蓄積時の反応成績を表４に示した。グアノシンの粉砕結晶を基質とした場合、未粉砕結晶を基質とした場合に比べ良好に燐酸化反応が進行し、５’−グアニル酸収率が19％向上した。
【００５８】
【表４】
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、ヌクレオシドまたはその前駆体、特に難溶性のヌクレオシドまたはその前駆体を原料として、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを酵素反応により効率よく製造することができる。
【００６０】
【配列表】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 グアノシン結晶の比表面積と５’−グアニル酸の収率との関係を示す図。
【図２】 ５’−グアニル酸の収率の反応経時変化を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法に関する。ヌクレオシド−５’−燐酸エステルは、調味料、医薬並びにそれらの原料等として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオシドを酵素的に燐酸化してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを製造する方法として、種々の方法が知られている。中でも、副産物が少なく、かつ、効率のよいヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法として、酸性フォスファターゼをpH3.0〜5.5の条件下でヌクレオシド並びにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）から成る群より選択される燐酸供与体に作用させてヌクレオシド−５’−燐酸エステルを製造する方法が開発されている（WO96/37603、特開平10-201481）。また、これらの方法において、好ましい酸性フォスファターゼとして、燐酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ（WO96/37603）、あるいは、ヌクレオシドに対する親和性が上昇し及び／又は温度安定性が向上した変異型フォスファターゼ（特開平10-201481）が提案されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記の方法においては、基質（原料）として各種ヌクレオシドが利用可能であるが、難溶性のヌクレオシドを基質とする際、易溶性のヌクレオシドに比べて反応収率が低下するという問題があった。
【０００４】
本発明は、上記観点からなされたものであり、ヌクレオシドまたはその前駆体、特に難溶性のヌクレオシドまたはその前駆体を原料として、酵素的にヌクレオシド−５’−燐酸エステルを効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
難溶性のヌクレオシドであっても、有機溶剤、硼酸あるいはジメチルスルホキシドのような界面活性剤を反応系に添加することによって、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生成収率を向上させることができる場合がある（WO96/37603、特開平10-201481）。しかし、一般的に有機溶剤や界面活性剤などにより酵素の失活が誘発される恐れがあり、好ましくない場合も少なくないと考えられる。そこで本発明者は、種々検討を行った結果、ヌクレオシド結晶を微細化することによって、反応系へのヌクレオシドの供給速度を向上させることができ、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生成収率を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００６】
（１）ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を物理的処理により粉砕し、粉砕したヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸供与体と反応させ、ヌクレオシドを燐酸化してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成せしめることを特徴とするヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
（２）ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を、比表面積が０．４ｍ2／ｇ以上となるように物理的処理により粉砕する（１）のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
（３）前記酵素が酸性フォスファターゼである（１）又は（２）のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
（４）前記酸性フォスファターゼは、ヌクレオシドに対する親和性が上昇した酸性フォスファターゼである（３）のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
（５）前記反応をｐＨ３．０〜５．５の条件下で行う（３）又は（４）のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
（６）前記ヌクレオシドがグアノシンである（１）〜（５）のいずれか一項に記載のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
（７）比表面積が０．４ｍ2／ｇ以上であるヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸供与体と反応させ、ヌクレオシドを燐酸化してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成せしめることを特徴とするヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法においては、ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を物理的処理により粉砕し、粉砕したヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸供与体と反応させ、ヌクレオシドを燐酸化してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成せしめる。ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶の物理的処理による粉砕は、例えば、ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を水中でスラリーとし、一般的に用いられている粉砕機（例えばスイスWAB社製DYNO-MILL等）を用いて粉砕することによって行うことができる。このような処理によって、微細化された結晶のスラリーが得られる。
【０００８】
本発明においては、ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を粉砕することによって、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する反応の効率を高めることができる。したがって、前記反応効率が向上する限り、粉砕の程度は特に問わないが、好ましくは、粉砕後の結晶の比表面積が０．４ｍ2／ｇ以上、より好ましくは０．８ｍ2／ｇ以上となるように粉砕することが望ましい。比表面積の上限は特に制限されないが、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生成効率の向上は結晶の比表面積が一定以上になると頭打ちになるので、通常は１ｍ2／ｇ程度で十分であると考えられる。
【０００９】
粉砕によって微細化された結晶の平均粒径は、例えば、stokesの抵抗則に基づく沈降法に従い、沈降式粒度分布測定装置（例えば、島津製作所(株)遠心沈降式粒度分布測定装置SA-CP3）を用いて測定することができる。また、こうして測定される平均粒径に基づいて、微結晶の比表面積を計算することができる。
【００１０】
粉砕するヌクレオシドまたはその前駆体の結晶は、精製されたものであってもよく、ヌクレオシドまたはその前駆体を産生する微生物の培養液中に蓄積する結晶スラリーをそのまま用いてもよい。
【００１１】
本発明に用いる酵素としては、ヌクレオシドまたはその前駆体への、燐酸供与体からの燐酸基の転移によりヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する反応を触媒するものであれば制限はない。
【００１２】
酵素の由来は特に制限されず、微生物、植物又は動物等に由来する酵素を用いることができるが、微生物に由来するものが好ましい。また、酵素は、微生物の野生株又は変異株から調製したものであってもよく、遺伝子工学的手法を用いて作製された形質転換株から調製したものであってもよい。さらに、酵素を産生する微生物の菌体を含む培養物、該培養物から分離・回収した菌体、該菌体を固定化処理、アセトン処理、凍結乾燥処理等した菌体処理物を使用することもできる。
【００１３】
本発明に用いる好ましい酵素として、酸性フォスファターゼ（EC 3.1.3.2）が挙げられる。酸性ホスファターゼとしては、微生物に由来するものが好ましく、特に好適な例として、モルガネラ属、エシェリヒア属、プロビデンシア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属又はセラチア属に属する細菌が、当該酵素活性を有しており、これら細菌に由来する酵素がある。そのような細菌の代表例として以下のような菌株を挙げることができる。
【００１４】
モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii） NCIMB 10466
モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii） IFO 3168
モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii） IFO 3848
エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae） JCM 1650
エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae） ATCC 33429
エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae） ATCC 33430
プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii） ATCC 29851
プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii） ATCC 33672
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes） IFO 12010
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes） IFO 13534
クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella planticola） IFO 14939
クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella planticola） IAM 1133
セラチア・フィカリア（Serratia ficaria） IAM 13540
セラチア・ マルセセンス（Serratia marcescens） IAM 12143
【００１５】
より好ましくは、ヌクレオシドに対する親和性が上昇した酸性フォスファターゼ（特開平10-201481参照）が挙げられる。このような酸性フォスファターゼとして具体的には、後記参考例１記載のエシェリヒア・ブラッタエ由来変異型酸性フォスファターゼ、エンテロバクター・アエロゲネス由来新規変異型酸性フォスファターゼ、及び、特開平10-201481号公報記載の各種変異型酸性フォスファターゼが挙げられる。
【００１６】
また、酸性フォスファターゼは、本来、燐酸エステルを酸性条件下で加水分解する反応を触媒する酵素であり、燐酸転移反応により生成するヌクレオシド−５’−燐酸エステルを分解するヌクレオチダーゼ活性を有しているが、ヌクレオチダーゼ活性（燐酸エステル加水分解活性）が低下した変異型酸性フォスファターゼ（WO96/37603参照）も、本発明に好適に使用することができる。
さらに、温度安定性の向上した酸性フォスファターゼ、又は、ヌクレオシドに対する親和性が上昇し、かつ、温度安定性の向上した酸性フォスファターゼ（特開平10-201481）も、本発明に好適に用いることができる。
【００１７】
本発明においては、微細化されたヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を用いる以外は、通常のヌクレオシドまたはその前駆体を酵素的に燐酸化してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成せしめる方法と同様にして燐酸化反応を行うことができる。
【００１８】
酵素として酸性フォスファターゼを用いる場合は、燐酸化反応をpH3.0から5.5の範囲の弱酸性に調製することが好ましい。
【００１９】
本発明に用いるヌクレオシドまたはその前駆体としては、プリンヌクレオシド類として、イノシン、グアノシン、アデノシン、キサントシン、プリンリボシド、６−メトキシプリンリボシド、２，６−ジアミノプリンリボシド、６−フルオロプリンリボシド、６−チオプリンリボシド、２−アミノ−６−チオプリンリボシド、メルカプトグアノシン等、ピリミジンヌクレオシド類として、ウリジン、シチジン、５−アミノウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ブロモウリジン、６−アザウリジン等が挙げられる。燐酸化反応によりこれらの天然型ヌクレオシド及び非天然型ヌクレオシドの５’位が特異的に燐酸化され、それぞれ対応するヌクレオシド−５’−燐酸エステルが生成する。
【００２０】
本発明においては、上記のようなヌクレオシドまたはその前駆体のうち、溶解度の低いもの、例えばグアノシン、イノシン、アデノシン等、特にグアノシン、アデノシン等のような難溶性のヌクレオシドを用いた場合、特に高い効果が期待できる。これらヌクレオチド等の製造法は、公知の方法を用いることができ、例えばグアノシンは特公昭５７−１４１６０号公報、イノシンは特公昭５７−２２５５８号公報、特公昭６２−３７９５９号公報、アデノシンは特公平４−５２１１８号公報記載の方法を採用できる。
【００２１】
反応液に添加するヌクレオシドまたはその前駆体の濃度は１〜20g/dlが望ましい。水に難溶性のヌクレオシドまたはその前駆体を使用する場合には、それらの結晶を粉砕して微細化することに加えて、硼酸あるいはジメチルスルホキシドのような界面活性剤を反応液に添加すると、さらに反応収率が向上する場合がある。
【００２２】
また、本発明に用いる燐酸供与体としては、酵素反応によりヌクレオシドまたはその前駆体へ燐酸基を転移してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成し得るものであれば特に制限されないが、具体的には、ポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）、アセチル燐酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）等が挙げられる。ポリ燐酸（塩）としては、ピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサメタ燐酸もしくはそれらの混合物、又はそれらのナトリウム塩、カリウム塩もしくはそれらの塩混合物などが、フェニル燐酸（塩）としては、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリウム、Ｏ，Ｏ−ジフェニル燐酸無水物もしくはそれらの混合物などが、カルバミル燐酸（塩）としては、カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウムもしくはそれらの混合物などが使用可能である。燐酸供与体の使用濃度は、燐酸受容体であるヌクレオシドまたはその前駆体の濃度によって決定される。通常、ヌクレオシドまたはその前駆体の１〜５倍量が望ましい。
【００２３】
反応は通常、温度20〜60℃、好ましくは30〜40℃で、pH3.5〜6.5、好ましくはpH3.5〜5.5の弱酸性側が好結果を与える。反応には静置又は撹はんのいずれの方法も採用し得る。反応時間は、使用する酵素の活性、基質濃度などの条件によって異なるが、１〜100時間である。
【００２４】
このようにして生成したヌクレオシド−５’−燐酸エステルを反応終了混合物より採取分離するには、合成吸着樹脂を用いる方法や沈殿剤を用いる方法、その他通常の採取分離方法が採用できる。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００２６】
【参考例１】
エシェリヒア・ブラッタエ由来変異型酸性フォスファターゼ遺伝子の取得
エシェリヒア・ブラッタエJCM1650由来野生型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpEPI305（WO96/37603参照）を用い、このプラスミドDNAに遺伝子工学的手法により部位特異的変異を導入し、変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を作製した（特開平10-201481参照）。
【００２７】
pEPI305はエシェリヒア・ブラッタエJCM1650に由来する野生型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含む、制限酵素ClaIと制限酵素BamHIで切り出される2.4Kbpの大きさのDNA断片を、ClaI及びBamHIで切断したpBluescript KS(+)（ストラタジーン社製）に結合したプラスミドDNAである。pEPI305をエシェリヒア・コリ JM109に保持させた株は、AJ13144と命名され、平成８年２月23日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託され、受託番号FERM BP-5423が付与されている。
【００２８】
DNA合成装置（アプライドバイオシステム社製モデル394）を用いてホスホアミダイト法にて配列番号１及び配列番号２に示すオリゴヌクレオチドMUT300及びMUT370をそれぞれ合成した。
【００２９】
鋳型としてpEPI305 1ng、プライマーとしてM13プライマーRV（宝酒造社製）およびMUT370オリゴヌクレオチド各2.5μmolおよびタックDNAポリメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットをdATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム50mMおよび塩化マグネシウム 1.5mMを含む100mM トリス−塩酸緩衝液（pH8.3）100μlに添加し、94℃を30秒、55℃を2分、72℃を3分のサイクルを25回繰り返すＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応はサーマルサイクラーPJ2000型（宝酒造社製）を用いて行った。また別に、鋳型としてプラスミドDNA pEPI305 1ng、プライマーとしてM13プライマーM3（宝酒造社製）およびMUT300オリゴヌクレオチド各2.5μmolを用いて同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれの反応液をマイクロスピンカラムS-400（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過により精製し、プライマーを除去した。
【００３０】
それぞれのＰＣＲ反応液1μlをdATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム 50mMおよび塩化マグネシウム 1.5mMを含む100mM トリス−塩酸緩衝液（pH8.3）95μlに添加し、94℃で10分加熱後、60分間かけて37℃まで冷却した後、37℃で15分保温しヘテロ二本鎖を形成させた。これにタックDNAポリメラーゼ2.5ユニットを添加して72℃で3分反応を行い、ヘテロ二本鎖を完成させた。次に、この反応液にM13プライマーRVおよびM13プライマーM3各2.5μmolを添加して、94℃を30秒、55℃を2分、72℃を3分のサイクルを10回繰り返すＰＣＲ反応を行った。
【００３１】
2回目のＰＣＲ反応の生成物をClaIとBamHIで切断後フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。このDNA断片をClaIとBamHIで切断したpBluescript KS(+)に結合し、得られたプラスミドDNAを用いて常法によりエシェリヒア・コリJM109（宝酒造製）を形質転換した。これを100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にプレーティングし、形質転換体を得た。 形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換されていることを確認した。塩基配列の決定は Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit （アプライドバイオケミカル社製）を用い、サンガーらの方法（J. Mol. Biol., 143, 161（1980））に従って行った。
【００３２】
このようにして、成熟蛋白質の６３番目のロイシン残基（CTG）がグルタミン残基（C*AG）に、６５番目のアラニン残基（GCG）がグルタミン残基（*C*AG）に、６６番目のグルタミン酸残基（GAA）がアラニン残基（G*CA）に、６９番目のアスパラギン残基（AAC）がアスパラギン酸残基（*GAC）に、７１番目のセリン残基（AGC）がアラニン残基（*G*CC）に、７２番目のセリン残基（AGT）がアラニン残基（*G*CT）に、７４番目のグリシン残基（GGG）がアスパラギン酸残基（*G*A*T）に、１３５番目のスレオニン残基（ACC）がリジン残基（*A*A*A）に、１３６番目のグルタミン酸残基（GAG）がアスパラギン酸残基（GA*C）に、１５３番目のイソロイシン残基（ATC）がスレオニン残基（A*CC）にそれぞれ置換した、変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作製した。この変異型遺伝子を含むプラスミドをpEPI370と命名した。
【００３３】
【実施例１】
エシェリヒア・ブラッタエ由来変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた５’−グアニル酸の生産
＜１＞酸性フォスファターゼを含む菌体の調製
参考例１記載のプラスミドpEPI370を保持するエシェリヒア・コリJM109/pEPI370をＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養後、培養液から遠心分離により集菌し、菌体を取得した。
【００３４】
＜２＞ヌクレオシドスラリーの粉砕
グアノシン結晶を水中でスラリーとし、粉砕機（スイスWAB社製DYNO-MILL）により結晶の粉砕処理を行った。この際、粉砕時間などの条件を変更して様々な粒経の結晶を取得した。グアノシン結晶は単位重量あたりの比表面積は0.2m2/gであったものが、粉砕後0.4m2/g以上に増加し、結晶の微細化が可能であった（表１）。なお、グアノシン結晶の比表面積はstokesの抵抗則に基づく沈降法に従い、沈降式粒度分布測定装置（島津製作所(株)遠心沈降式粒度分布測定装置SA-CP3）で測定した平均粒経をもとに算出した。
【００３５】
＜３＞５’−グアニル酸の生産
次に酸性ピロ燐酸29.3g、およびグアノシンの未粉砕結晶又は粉砕結晶のスラリー7.5g(グアノシン含量として)を水溶液中で混合して苛性ソーダでpH4.5付近に調整後、上記菌体を100mg添加して最終液量が100mlとなるように調製し、30℃で40時間反応を行い、生成した５’−グアニル酸の量を測定した。
【００３６】
グアノシン結晶の比表面積と最大蓄積時点での蓄積および収率を表１及び図１に、反応経時収率変化を図２に示した。その結果、粉砕結晶を基質とした場合、未粉砕結晶を基質とした場合に比べ、良好に燐酸化反応が進行し、５’−グアニル酸生成収率で14％以上、燐酸収率で1.4%以上、成績が向上した。
【００３７】
【表１】
【実施例２】
エシェリヒア・ブラッタエ由来変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた各種ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの生産
＜１＞酸性フォスファターゼを含む菌体の調製
実施例１と同様に、エシェリヒア・コリJM109/pEPI370をＬ培地に接種し、37℃で16時間培養後、培養液から遠心分離により集菌し、菌体を取得した。
【００３９】
＜２＞ヌクレオシドスラリーの粉砕
ヌクレオシド結晶を水中でスラリーとし、粉砕機（スイスWAB社製DYNO-MILL）により結晶の粉砕処理を行った。ヌクレオシド結晶は単位重量あたりの比表面積は0.2m2/gであったものが、粉砕後0.4m2/g以上に増加し、結晶の微細化が可能であった。なお、比表面積はstokesの抵抗則に基づく沈降法に従い沈降式粒度分布測定装置（島津製作所(株)遠心沈降式粒度分布測定装置SA-CP3）で測定した平
均粒経をもとに算出した。
【００４０】
＜３＞ヌクレオチドの生産
次に、酸性ピロ燐酸29.3g、および、イノシンもしくはアデノシンの未粉砕結晶又はこれらのヌクレオシドの粉砕結晶のスラリー5g(ヌクレオシド含量として)を水溶液中で混合して苛性ソーダでpH4.5付近に調整後、上記菌体を100mg添加して最終液量が100mlとなるように調製後、30℃で24時間反応を行い、生成したヌクレオチドの量を測定した。最大蓄積時点での蓄積を表２に示した。その結果、粉砕したヌクレオシドスラリーを基質とした場合、未粉砕結晶を基質とした場合に比べ良好に燐酸化反応が進行し、ヌクレオチド生成量の向上が認められた。
【００４１】
【表２】
【実施例３】
エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来新規変異型酸性フォスファターゼ遺伝子の作製
エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来野生型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子に、遺伝子工学的手法によって部位特異的変異を導入し、ヌクレオシドに対する親和性が向上した変異型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を作製した。
【００４３】
特開平10-201481号公報の実施例２４記載の方法にて取得したエンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来野生型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpENP110より、野生型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を含む、制限酵素SalIと制限酵素KpnIで切り出される1.6kbpの大きさのDNA断片を切り出し、SalI及びKpnIで切断したpUC19（酒造社製）に結合し、このプラスミドをpENP120と命名した。
【００４４】
DNA合成装置（アプライドバイオシステム社製モデル394）を用いてホスホアミダイト法にて配列表に示す配列のオリゴヌクレオチドMUT110（配列番号３）、MUT120（配列番号４）、MUT130（配列番号５）、MUT140（配列番号６）、MUT150（配列番号７）を合成した。
【００４５】
鋳型としてpENP120 1ng、プライマーとしてM13プライマーM4（宝酒造社製）およびMUT110オリゴヌクレオチド各2.5μmol、およびタックDNAポリメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットを、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム 50mMおよび塩化マグネシウム 1.5mMを含む100mM トリス−塩酸緩衝液（pH8.3）100μlに添加し、94℃を30秒、55℃を2分、72℃を3分のサイクルを25回繰り返すＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応はサーマルサイクラーPJ2000型（宝酒造社製）を用いて行った。また別に、鋳型としてプラスミドDNA pENP120 1ng、プライマーとしてM13プライマーRV（宝酒造社製）およびMUT6プライマー（宝酒造社製）各2.5μmolを用いて同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれの反応液をマイクロスピンカラムS-400（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過により精製し、プライマーを除去した。
【００４６】
それぞれのＰＣＲ反応液1μlを、dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム50mMおよび塩化マグネシウム 1.5mMを含む100mM トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.3）95μlに添加し、94℃で10分加熱後、60分間かけて37℃まで冷却した後、37℃で15分保温しヘテロ二本鎖を形成させた。これにタックDNAポリメラーゼ2.5ユニットを添加して72℃で3分反応を行い、ヘテロ二本鎖を完成させた。次に、この反応液にM13プライマーRVおよびM13プライマーM3各2.5μmolを添加して、94℃を30秒、55℃を2分、72℃を3分のサイクルを10回繰り返すＰＣＲ反応を行った。
【００４７】
2回目のＰＣＲ反応の生成物をSalI及びEcoRIで切断後フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。このDNA断片をSalI及びEcoRIで切断したpUC19に結合し、得られたプラスミドDNAを用いて常法によりエシェリヒア・コリJM109（宝酒造製）を形質転換した。これを100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にプレーティングし、形質転換体を得た。形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換されていることを確認した。塩基配列の決定は Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用い、サンガーらの方法（J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)）に従って行った。このようにしてプロ蛋白質の92番目のグリシン残基（GGC）がアスパラギン酸残基（G*A*C）に置換した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作製した。この変異型遺伝子を含むプラスミドをpENP130と命名した。
【００４８】
変異を導入したプラスミドを鋳型として同様の操作を繰り返し、累加的に部位特異的変異を導入した。形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換されていることを確認した。作製した変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子と変異部位を表３に示した。なお変異部位のアミノ酸残基はシグナルペプチドが切断される前のプロ蛋白質のアミノ酸配列中のアミノ酸残基を示している。
【００４９】
【表３】
変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109/pENP170、および野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109/pENP120を、アンピシリン100μg/mlおよびIPTG 1mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。それぞれの菌の培養液2Lから遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で1回洗浄した。菌体を50mlの100mM燐酸バッファー（pH7.0）に懸濁し、4℃で20分間超音波処理を行い菌体を破砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。それぞれの無細胞抽出液を用いて燐酸転移反応におけるイノシンに対するKm値を測定した。
【００５１】
ヌクレオシドへの燐酸転移活性の測定は、イノシンを基質として、次の条件で行った。イノシン40μmol/ml、ピロ燐酸ナトリウム100μmol/ml、酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）100μmol/ml及び酵素を含む反応液（1ml）でpH4.0、30℃で10分反応を行った。2N塩酸200μlを添加して反応を停止した後、遠心分離により沈澱を除き、燐酸転移反応により生成した５’−イノシン酸を定量した。この標準反応条件にて1分間に1μmolの５’−イノシン酸を生成する酵素量を１unitと定めた。なお、イノシン及び５’−イノシン酸は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、下記の条件にて分析した。
【００５２】
カラム：Cosmosil 5C18-AR （4.6×150mm）〔ナカライテスク社製品〕
移動相：5mM 燐酸カリウムバッファー（pH 2.8）／メタノール＝95／5
流速：1.0ml/min
温度：室温
検出：ＵＶ245nm
【００５３】
上記の組成の反応条件においてイノシン濃度を10から100μmol/mlまで変化させて燐酸転移活性を測定し、Hanes-Woolfプロット（Biochem.J., 26,1406 (1932)）により燐酸転移反応におけるイノシンの速度定数を求めた。
【００５４】
エシェリヒア・コリ JM109/pEPI305で発現している野生型酵素のKm値は200mMと算出された。一方、本実施例で作製したエシェリヒア・コリ JM109/pEPI330で発現している変異型酵素のKm値は40mMと算出され、新たに構築したエンテロバクター・アエロゲネス由来変異型酸性フォスファターゼは、イノシンに対するKm値が大きく低下し、イノシンに対する親和性が向上していることが明らかになった。
【００５５】
【実施例４】
エンテロバクター・アエロゲネス由来変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた５’−グアニル酸の生産
＜１＞酸性フォスファターゼを含む菌体の調製
実施例３で取得したエンテロバクター・アエロゲネス由来変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を導入したエシェリヒア・コリ JM109/pENP170を、IPTG 1mMを含むL培地50mlに接種し、37℃で１６時間培養後、培養液から遠心分離により集菌し、菌体を取得した。
【００５６】
＜２＞グアノシン結晶スラリーの粉砕
グアノシン結晶を水中でスラリーとし、粉砕機（スイスWAB社製DYNO-MILL）により結晶の粉砕処理を行った。グアノシン結晶は、単位重量あたりの比表面積は0.2m2/gであったものが、粉砕後0.4m2/g以上に増加し、結晶の微細化が可能であった。なお、比表面積はstokesの抵抗則に基づく沈降法に従い沈降式粒度分布測定装置（島津製作所(株)遠心沈降式粒度分布測定装置SA-CP3）で測定した平均粒経をもとに算出した。
【００５７】
＜３＞グアノシンの燐酸化
次に酸性ピロ燐酸29.3g、およびグアノシンの未粉砕結晶又は粉砕結晶のスラリー7.5g(グアノシン含量として)を水溶液中で混合して苛性ソーダでpH4.5付近に調整後、上記菌体を100mg添加して最終液量が100mlとなるように調製し、30℃で40時間反応を行い、生成した５’−グアニル酸量を測定した。最大蓄積時の反応成績を表４に示した。グアノシンの粉砕結晶を基質とした場合、未粉砕結晶を基質とした場合に比べ良好に燐酸化反応が進行し、５’−グアニル酸収率が19％向上した。
【００５８】
【表４】
【発明の効果】
本発明により、ヌクレオシドまたはその前駆体、特に難溶性のヌクレオシドまたはその前駆体を原料として、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを酵素反応により効率よく製造することができる。
【００６０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 グアノシン結晶の比表面積と５’−グアニル酸の収率との関係を示す図。
【図２】 ５’−グアニル酸の収率の反応経時変化を示す図。
Claims (7)
- ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を物理的処理により粉砕し、粉砕したヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸供与体と反応させ、ヌクレオシドを燐酸化してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成せしめることを特徴とするヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
- ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を、比表面積が０．４ｍ2／ｇ以上となるように物理的処理により粉砕する請求項１記載のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
- 前記酵素が酸性フォスファターゼである請求項１又は２に記載のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
- 前記酸性フォスファターゼは、ヌクレオシドに対する親和性が上昇した酸性フォスファターゼである請求項３記載のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
- 前記反応をｐＨ３．０〜５．５の条件下で行う請求項３又は４に記載のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
- 前記ヌクレオシドがグアノシンである請求項１〜５のいずれか一項に記載のヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
- 比表面積が０．４ｍ2／ｇ以上であるヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸供与体と反応させ、ヌクレオシドを燐酸化してヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成せしめることを特徴とするヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法。
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