CN1184157A

CN1184157A - 生产核苷－5’－磷酸酯的方法

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Publication number: CN1184157A
Application number: CN97122934A
Authority: CN
Inventors: 三原康博; 宇多川隆; 山田秀明; 浅野泰久
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1996-11-21
Filing date: 1997-11-21
Publication date: 1998-06-10
Anticipated expiration: 2017-11-21
Also published as: BR9705813A; US6355472B2; DE69721213D1; DE69721213T2; US20020004590A1; EP0857788A2; ES2199330T3; KR100458970B1; EP0857788B1; US6207435B1; CN1117870C; EP0857788A3; JPH10201481A; BR9705813B1; JP4304727B2; KR19980042777A; US6015697A

Abstract

通过用生化方法将核苷磷酸化,便宜并高效地生产核苷－5’－磷酸酯的方法。通过使酸性磷酸酶、尤其是对核苷具有较高亲和性和/或温度稳定性提高的酸性磷酸酶以及导入具有所述酸性磷酸酶活性的蛋白质编码基因的微生物,在pH3.0—5.5条件下作用于核苷和磷酸基团供体(选自聚磷酸或其盐、苯膦酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐)产生并收集核苷－5’－磷酸酯,生产核苷－5’－磷酸酯。

Description

生产核苷-5’-磷酸酯的方法

本发明涉及核苷-5’-磷酸酯的生产方法。本发明也涉及新的酸性磷酸酶、编码该酸性磷酸酶的基因、含有该基因的重组DNA，涉及包含该重组DNA、可用来生产核苷-5’-磷酸酯的微生物。核苷-5’-磷酸酯可用作调味品、药物和生产这类物质的原料。

通过使用以下磷酸基团供体，用生化方法将核苷磷酸化，生产核苷-5’-磷酸酯的方法是已知，包括使用对硝基苯磷酸的方法(日本专利公告39-29858)、使用无机磷酸的方法(日本专利公告42-1186)、使用多磷酸的方法(日本专利公开53-56390)、使用乙酰磷酸的方法(日本专利公开56-82098)和使用三磷酸腺苷(ATP)的方法(日本专利公开63-230094)。然而，因为这些方法使用的底物昂贵或在反应中产生副产物，所以在高效并便宜地生产核苷-5’-磷酸酯方面不能令人满意。

因此，本发明人研制出一种方法，通过让特定的微生物细胞在酸性条件下作用于核苷和磷酸基团供体(选自多磷酸或其盐、苯磷酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐)，高效地生产核苷-5’-磷酸酯，而不产生2’-、3’-核苷异构体副产物(日本专利公开7-231793)。

然而，甚至该方法也有以下缺点。即例如，在反应期间由于在所用微生物细胞中不幸地微量存在降解核苷的活性，一部分底物被降解。而且，如果继续反应，那么产生并积累的核苷-5’-磷酸酯被降解。因此，在反应溶液中产生副产物，已不可能获得足够的产量。此外，因为每个微生物细胞的转磷酸活性低，如果加入高浓度的底物，那么反应不能进行。

本发明的目的是提供便宜并有效地生产核苷-5’-磷酸酯的方法，本发明的另一目的是提供一种酶、一个编码该酶的基因、含有该基因的重组DNA以及含有该重组DNA、可用于生产核苷-5’-磷酸酯的微生物。

本发明人进行了各种研究，以便研制出比常规方法更有效地生产核苷-5’-磷酸酯的方法，结果发现，通过让从微生物无细胞提取物中纯化的酸性磷酸酶在pH 3.0-5.5的条件下，作用于核苷和磷酸基团供体(选自多磷酸或其盐、苯磷酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐)，可以有效高产地生产核苷-5’-磷酸酯。另外，本发明人已成功地从不同的细菌中获得编码酸性磷酸酶的野生型基因，并通过在得自埃希氏杆菌细菌的腹性磷酸酶上导入一个突变，成功地获得在野生型酸性磷酸酶具有更多核苷菌亲和力的酸性磷酸酶的编码基因。而且，本发明人发现，通过按照遗传工程技术大量表达该基因，大大提高了核苷-5’-磷酸酯的生产率。

本发明人还尝试制备温度稳定性提高的突变型酸性磷酸酶，目的是用酸性磷酸酶在较高温度下进行磷酸转移反应，使得核苷-5’-磷酸酯的生产效率更高，因为反应速度提高，并且在反应溶液中的磷酸酯受体浓度更高。然后，本发明人成功地制备了比实施例19中描述的突变型酸性磷酸酶温度稳定性更高的突变型酸性磷酸酶，并可以在高温下用于反应中，因此完成了本发明。

即本发明提供生产核苷-5’-磷酸酯的方法，包括以下步骤：让对核苷具有较高亲和性和/或温度稳定性提高的酸性磷酸酶，在pH 3.0-5.5的条件下作用于核苷和磷酸基团供体(最好选自多磷酸或其盐、苯磷酸或其盐、乙酰磷酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐)，生产并收集核苷-5’-磷酸酯。

另一方面，本发明提供生产核苷-5’-磷酸酯的方法，包括以下步骤：让微生物在pH 3.0-5.5的条件下，作用于核苷和磷酸基团供体，生产并收集核苷-5’-磷酸酯；其中微生物用包含对核苷-5’-磷酸酯具有较高亲和性和/或温度稳定性提高的酸性磷酸酶的编码基因的重组DNA转化。

另一方面，本发明提供对核苷具有较高亲和性和/或温度稳定性提高的突变型酸性磷酸酶、编码这些酸性磷酸酶的基因、含有这些基因的重组DNA和包含重组DNA的微生物。<1>酸性磷酸酶的制备

用于本发明的酸性磷酸酶不特别限制，只要它在pH 3.0-5.5的条件下，通过将磷酸基团从磷酸基团供体(例如选自多磷酸或其盐、苯磷酸或其盐、乙酰磷酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐)转移到核苷催化产生核苷-5’-磷酸酯的反应即可。这种酸性磷酸酶最好包括得自微生物的那些酸性磷酸酶。在特别推荐的实施方案中，本发明使用得自属于摩根氏菌属、埃希氏杆菌属、普罗威登斯菌属、肠杆菌属、克雷伯氏杆菌属或沙雷氏菌属细菌的一种酶。这种细菌的代表实例包括以下细菌菌株。

摩氏摩根氏菌NCIMB 10466

摩氏摩根氏菌IFO 3168

摩氏摩根氏菌IFO 3848

Esherichia blattae JCM 1650

Esherichia blattae ATCC 33429

Esherichia blattae ATCC 33430

斯托氏普罗威登斯菌ATCC 29851

斯托氏普罗威登斯菌ATCC 33672

产气肠杆菌IFO 12010

产气肠杆菌IFO 13534

Klebsiella planticola IFO 14939

Klebsiella planticola IAM 1133

Serratia ficaria IAM 13540

粘质沙雷氏菌IAM 12143

我们注意到，酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)最初为在酸性条件下催化水解磷酸酯反应的酶，它具有降解通过转磷酸反应生成的核苷-5’-磷酸酯的核苷酸酶活性(在下文，核苷酸酶活性称为“磷酸单酯酶活性”)。甚至这样一种酸性磷酸酶也可以用于本发明生产核苷-5’-磷酸酯的方法中。然而，为了高产地获得核苷-5’-磷酸酯，需要使用突变型酸性磷酸酶，与用上述细菌生产的野生型酸性磷酸酶相比，它在将向核苷的转磷酸反应中对核苷的亲和性提高(必要时，下文简称为“突变型酸性磷酸酶”)。最好使用Km值低于100mM的突变型酸性磷酸酶。

通过表达直接突变编码下述酸性磷酸酶的基因获得的突变型基因获得突变型酸性磷酸酶。或者，用紫外光辐射或通常用于人工诱变的突变剂(诸如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)等)，处理产生对核苷具有较高亲和性酸性磷酸酶的微生物，然后培养突变的微生物，产生对核苷具有较高亲和性的突变型酸性磷酸酶，也可以获得突变型酸性磷酸酶。

具有酸性磷酸酶活性的蛋白质可以从上述微生物中获得，即通过在适当的培养基中培养具有该活性的微生物菌株，收获增殖的微生物细胞，破碎这些微生物细胞以制备无细胞提取物，然后适当地从中纯化该蛋白质。

培养微生物的培养基不受特别限制，为此可以获得含有一般碳源、氮源、无机离子和可选的有机营养物源的普通培养基。适当使用的碳源包括例如诸如葡萄糖和蔗糖等的糖类、诸如甘油等的醇类化合物和有机酸。所用的氮源包括例如氨气、氨水和铵盐。必要时适当使用的无机离子包括例如镁离子、磷离子、钾离子、铁离子和锰离子。适当使用的有机营养物源包括例如维生素和氨基酸以及含有它们的那些营养物源，诸如酵母膏、胨、肉膏、玉米浆、水解酪蛋白和大豆水解物等。

培养条件也不特别限制。微生物例如可以在需氧条件下培养大约12-48小时，同时将pH和温度适当地控制在pH 5-8和25-40℃的范围内。

可以例如通过离心，从培养液中收获增殖的微生物细胞。用常规方法，从收获的微生物细胞中制备无细胞提取物。即用诸如超声处理、Dyno-mill和French Press等方法破碎微生物细胞，然后通过离心除去细胞碎片，获得无细胞提取物。

用通常用于酶纯化的适当技术组合(诸如硫酸铵分级分离、离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤层析和等电纯化等)，从无细胞提取物中纯化酸性磷酸酶。关于沉淀，不需要必需完全纯化酸性磷酸酶。做到除去诸如参加降解核苷底物的酶等污染物就足够了。<2>酸性磷酸酶基因的制备

含有编码具有酸性磷酸酶活性的蛋白质结构基因的DNA片断，可以从例如具有该酶活性的微生物细胞中开始克隆。克隆方法包括例如用止该酶活性作为指标筛选染色体基因表达文库的方法、制备该蛋白质的抗体以筛选染色体基因表达文库的方法、以及分析氨基酸序列(诸如该纯化蛋白质的N-末端序列等)，并在此基础上制备探针以筛选基因文库的方法。

具体地说，上述摩氏摩根氏菌、Esherichia blattae、斯托氏普罗威登斯菌、产气肠杆菌、Klebsiella planticola、Klebsiella planticola、Serratia ficaria或粘质沙雷氏菌的酸性磷酸酶的编码基因的克隆，可以通过制备每种微生物的染色体基因表达文库，并用磷酸酶活性作为指标筛选该文库来进行。

即可以如下制备染色体基因表达文库：首先制备摩氏摩根氏菌或Esherichia blattae的染色体DNA，用适当的限制性内切酶部分降解该DNA，随后将其与能在大肠杆菌中自主复制的载体连接，用获得的重组DNA转化大肠杆菌。可以使用多种限制性内切酶降解染色体DNA，通过调整降解反应的时间调整降解程度。可以使用任何载体克隆该基因，只要它能在大肠杆菌中自主复制即可。可以使用例如pUC19、pUC118、pHSG298、pBR322和pBluescript II。

载体可以与含有酸性磷酸酶编码基因的DNA片断连接以制备重组DNA，即预先用与降解染色体DNA使用的相同的限制性内切酶或用产生的剪切末端与染色体DNA片断剪切末端互补的限制性内切酶降解载体，然后用诸如T4 DNA连接酶等连接酶，将其与DNA片断连接。任何微生物菌株都可以用作制备的重组DNA的受体，只要它适于载体的复制即可。可以使用例如诸如HB101、JM109和DH5等大肠杆菌的微生物菌株。

由此获得的转化体在琼脂培养基上生长，形成菌落。此后，将含有对硝基苯磷酸的反应溶液倒到培养基表面上，进行反应，然后表达磷酸酶活性的菌株释放对硝基酚，并表现出黄色。包含含目的酸性磷酸酶编码基因的DNA片断的转化体可以如下筛选：通过在酸性条件下进行上述反应，用颜色变化作为指标筛选转化体。

此后，从筛选的转化体回收重组DNA，分析含与载体连接的酸性磷酸酶编码基因的DNA片断的结构。关于酸性磷酸酶编码基因的核苷酸顺序，得自摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的基因示于顺序表的SEQID NO：2中，得自Esherichia blattae JCM 1650的基因示于顺序表的SEQID NO：6中，得自斯托氏普罗威登斯菌ATCC 29851的基因示于顺序表的SEQ ID NO：21中，得自产气肠杆菌IFO 12010的基因示于顺序表的SEQ ID NO：23中，得自Klebsiella planticola IFO 14939的基因示于顺序表的SEQ ID NO：25中，得自Serrtia ficaria IAM 13540的基因示于顺序表的SEQ ID NO：27中。

得出的由上述基因编码的酸生磷酸酶的氨基酸序列在SEQ ID NO：4、8、22、24、26和28中进行了描述。本发明最好使用由上述基因编码的酸性磷酸酶。另外，本发明也最好使用包含的氨基酸顺序与上述基因编码的酸性磷酸酶中任一种的氨基酸顺序基本相同的酸性磷酸酶。“基本相同”是指酸性磷酸酶的氨基酸序列可以替代、缺失、插入或转换一个或多个氨基酸残基，而不损失产生核苷-5’-磷酸酯的活性(下文称为“转磷酸活性”)<3>突变型酸性磷酸酶编码基因的制备

按上述方法获得的野生型酸性磷酸酶具有磷酸单酯酶活性。因此，磷酸单酯酶活性可能作为核苷-5’-磷酸酯生产中，随着时间的推移造成产物的伴随性降解的因素致使反应产率降低。为了克服这一情况，最好在酸性磷酸酶的编码基因上产生人工突变，使得对核苷的亲和性增加。

另外，用酸性磷酸酶在较高温度下进行磷酸酯转移反应，使得核苷-5’-磷酸酯的生产有效得多，因为反应速度提高，并且在反应溶液中的磷酸酯受体的浓度可以更高。为此，最好在酸性磷酸酶的编码基因上产生人工突变，使得温度稳定性提高。

在DNA的目的位点上产生目的突变的定位点诱变的方法包括例如使用PCR的方法(Higuchi，R.，61，in PCR technology，Erlich，H.A.Eds.，Stockton press(1989)；Carter，P.，Meth.i n Enzymol.，154，382(1987))，和使用噬菌体的方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth.in Enzymol.，154，350(1987)；Kunkel，T.A.等人，Meth.in En zymol.，154，367(1987))。

对核苷亲和性较高的突变型酸性磷酸酶的实例为包含的氨基酸顺序与选自顺序表的SEQ ID NO：4、8、22、24、26和28中描述顺序的其中一种氨基酸顺序基本相同、并具有增加野生型酸性磷酸酶对核苷亲和性的突变的酸性磷酸酶。具体地说，得自Esherichia blattaeJCM 1650的突变型酸性磷酸酶的实例为，顺序表中SEQ ID NO：8中描述的氨基酸顺序的第74位甘氨酸残基和/或第153位异亮氨酸残基被另一个氨基酸残基替代。在以下描述的实施例中，突变型酸性磷酸酶的编码基因作为一个实施例进行描述，其中第74位甘氨酸残基用天冬氨酸残基替代，而第153位的异亮氨酸残基用苏氨酸残基替代。

选自顺序表中SEQ ID NO：8中的包括第63位亮氨酸残基、第65位丙氨酸残基、第66位谷氨酸残基、第69位天冬氨酸残基、第71位丝氨酸残基、第72位丝氨酸残基、第85位丝氨酸残基、第92位丙氨酸残基、第94位丙氨酸残基、第116位天冬氨酸残基、第130位丝氨酸残基、第135位苏氨酸残基和/或第136位谷氨酸残基用另一氨基酸替代的其它突变，进一步提高了酸性磷酸酶对核苷的亲和性。

温度稳定性提高的突变型酸性磷酸酶的实例为，包含的氨基酸顺序与选自顺序表的SEQ ID NO：4、8、22、24、26和28中描述顺序的其中一种氨基酸顺序基本相同、并且具有增加野生型酸性磷酸酶温度稳定性的突变的酸性磷酸酶。具体地说，得自Esherichia blattaeJCM 1650的突变型酸性磷酸酶的实例是，顺序表中SEQ ID NO：8中描述的氨基酸顺序中的第104位谷氨酸残基和/或第151位苏氨酸残基被另一个氨基酸残基替代。在以下描述的实施例中，编码突变型酸性磷酸酶的基因作为一个实施例进行描述，其中第104位谷氨酸残基用甘氨酸残基替代，而第151位苏氨酸残基用丙氨酸残基替代。

因此，可以按照上述定位点诱变方法，在野生型基因的特定位点替代核苷酸，以编码这些突变型酸性磷酸酶。增加对核苷亲和性的突变是合乎需要的突变，即通过这种突变，生产核苷-5’-磷酸酯的活性与野生型酸性磷酸酶相比，基本上不降低。然而，甚至在产生核苷-5’-磷酸酯的活性降低的情况下，如果磷酸单酯酶活性降低的程度大于产生核苷-5’-磷酸酯的活性降低程度，结果与野生型酸性磷酸酶相比，磷酸单酯酶的活性与产生核苷-5’-磷酸酯的活性之比降低，那么也是足够的。关于对核苷亲和性的增加程度，在转磷酸反应中对核苷的Km值最好低于100mM。

增加温度稳定性的突变是指，在温度处理后这种突变残留的活性高于野生型酸性磷酸酶的残留活性。温度稳定性增加的程度最好是在pH7.0、50℃处理30分钟后不发生活性降低。

正如下面实施方案中描述的，Esherichia blattae JCM 1650的酸性磷酸酶的氨基酸顺序与摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的氨基酸顺序高度同源，在SEQ ID NO：4描述的氨基酸顺序中的第72位甘氨酸残基、第102位的谷氨酸残基、第149位苏氨酸残基和第151位异亮氨酸残基分别相当于SEQ ID NO：8描述的氨基酸顺序中的第74位甘氨酸残基、第104位谷氨酸残基、第151位苏氨酸残基和第153位的异亮氨酸残基。另外，除Esherichia blattae JCM 1650之外，得自诸如斯托氏普罗威登斯菌ATCC 29851、产气肠杆菌IFO 12010、Klebsiellaplanticola IFO 14939和Serrtia ficaria IAM 13540等微生物的酸性磷酸酶的氨基酸顺序与摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的氨基酸顺序高度同源，这些酸性磷酸酶的氨基酸顺序包括每个分别相当于在SEQ IDNO：4描述的氨基酸顺序中的第72位甘氨酸残基、第102位的谷氨酸残基、第149位苏氨酸残基和第151位异亮氨酸残基的氨基酸残基。因此，得自这些微生物的突变型酸性磷酸酶的编码基因可以按上述方法获得。在SEQ ID NO：22、24或26中描述的得自斯托氏普罗威登斯菌ATCC 29851、产气肠杆菌IFO 12010或Klebsiella planticola IFO14939的酸性磷酸酶的氨基酸顺序中的第92位甘氨酸残基、第122位谷氨酸残基、第169位苏氨酸残基和第171位异亮氨酸残基以及在SEQID NO：28中描述的得自Serrtia ficaria IAM 13450的酸性磷酸酶的基硫顺序中的第88位甘氨酸残基、第118位谷氨酸残基、第165位苏氨酸残基和第167位异亮氨酸残基分别相当于在SEQ ID NO：4描述的氨基酸顺序中的第72位甘氨酸残基、第102位谷氨酸残基、第149位苏氨酸残基和第151位异亮氨酸残基。

图12描述了比较上述酸性磷酸酶的氨基酸顺序的结果。在图12基础上，决定酸性磷酸酶的哪个氨基酸残基相当于另一酸性磷酸酶的另一氨基酸残基。<4>将酸性磷酸酶基因导入宿主中

高水平表达酸性磷酸酶活性的重组微生物可以通过以下步骤获得：将含有按上述方法获得的具有酸性磷酸酶活性的蛋白质编码基因的DNA片断与适当的载体重组后，将该DNA片断导入宿主中。在这一步骤中，用野生型酸性磷酸酶的编码基因表达野生型酸性磷酸酶，而用突变型酸性磷酸酶的编码基因表达突变型酸性磷酸酶。

宿主包括诸如上述HB101、JM109和DH5等的大肠杆菌微生物菌株。除这些菌株外，还可以将所有细菌用作宿主，只要构建的重组DNA的复制起点和酸性磷酸酶基因起作用、重组DNA可复制、而酸性磷酸酶基因可以表达即可。其中一个最优选的宿主是大肠杆菌JM109。

导入酸性磷酸酶编码基因的载体不特别限制，只要它可在宿主中复制即可。使用大肠杆菌作为宿主时，载体的实例是在该细菌中可自主复制的质粒。例如可以使用ColE1型质粒、pl5A型质粒、R因子型质粒和噬菌体型质粒。这类质粒具体包括例如pBR322(Gene，2，95(1977)、pUC19(Gene，33，103(1985)、pUC119(Mehtods inEmzymology，153，3(1987))、pACYC184(J.Bacteriol.，134，1141(1978)和pSC101(Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.，70，3240(1973))。

当含有酸性磷酸酶编码基因的DNA片断含有在宿主中起作用的启动子时，可以将DNA片断照原样与载体连接。当该DNA片断不含这一启动子时，可以将在宿主微生物中起作用的另一启动子(诸如lac、trp和PL等)连接到该基因上游位置。甚至当该DNA片断含有该启动子时，该启动子也可以用另一启动子替代，以便有效地表达酸性磷酸酶编码基因。

将通过载体与含有酸性磷酸酶编码基因的DNA片断连接构建的重组DNA导入宿主中的方法没有特殊的限制。可以用常规方法将重组DNA导入宿主中。使用大肠杆菌作为宿主时，可以使用例如氯化钙法(J.Mol.Biol.，53，159(1970))、Hanahan法(J.Mol.Biol.，166，557(1983))、SEM法(Gene，96，23(1990))、Chung等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86，2172(1989))和电击法(Nucleic Acids Res.，16，6127(1988))。

酸性磷酸酶基因可以插入自主复制的载体DNA上，可以将其导入宿主中，使得它作为上述染色体外DNA包含于宿主中。或者，可以按照使用转导、转座子(Biotechnol.，1,417(1983))、Mu噬菌体(日本专利公开2-109985)或同源重组(Experiment s in Molecular Genetics，ColdSpring Harbour Lab.(1972))的方法，将酸性磷酸酶基因引入宿主微生物的染色体中。<5>用重组微生物表达酸性磷酸酶基因

按上述方法获得的已导入重组DNA(含有酸性磷酸酶编码基因)的转化体，通过将其培养在适当的培养基(含有碳源、氮源、无机离子和可选的有机营养物源)中，能够在其细胞中高水平地表达酸性磷酸酶活性。适当使用的碳源包括例如诸如葡萄糖等的糖类、诸如甘油等的醇类化合物和有机酸。所用的氮源包括例如氨气、氨水和铵盐。必要时适当使用的无机离子包括例如镁离子、磷离子、钾离子、铁离子和锰离子。适当使用的有机营养物源包括例如维生素和氨基酸以及含有它们的那些营养物源，诸如酵母膏、胨、肉膏、玉米浆、水解酪蛋白和大豆水解物。根据启动子，将诸如IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)等表达诱导剂加入培养基中，可以增加酸性磷酸酶活性的表达量。

培养条件也不特别限制。例如可以在需氧条件下培养大约12-48小时，同时将pH和温度适当地控制在pH 5-8和25-40℃的范围内。

此后，从培养物中收获微生物细胞，通过破碎制备无细胞提取物，可以从其中纯化酸性磷酸酶。使用通常用于酶纯化的的适当技术组合(诸如上述第<1>条中描述的那些技术等)进行纯化。关于纯化，不必完全纯化酸性磷酸酶。做到除去诸如参加核苷底物降解的酶等污染物就足够了。<6>核苷-5’-磷酸酯的生产

核苷-5’-磷酸酯可以在反应混合物中生产，即让按第<1>条描述方法获得的酸性磷酸酶、或野生型酸性磷酸酶、或通过按照第<5>条描述的遗传工程技术大量表达基因得到的突变型酸性磷酸酶，与核苷及磷酸基团供体(选自多磷酸或其盐、苯磷酸或其盐、乙酰磷酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐)接触并引起反应。为了在该反应中达到高生产率，重要的是将反应溶液的pH调至3.0-5.5的弱酸性范围内。

当用遗传工程技术大量表达酸性磷酸酶的编码基因时，特别是当大量表达对核苷的亲和性较高的突变型酸性磷酸酶编码基因时，也可以使用含转化体微生物细胞的培养物，便宜并有效地生产核苷-5’-磷酸酯，从培养物中分离并收获微生物细胞，或按照例如固定化处理、丙酮处理或冷冻干燥处理代替纯化的酸性磷酸酶，从微生物细胞中获得产物。

使用的核苷包括例如嘌呤核苷，诸如肌苷、鸟苷、腺苷、黄苷、嘌呤核糖核苷、6-甲氧基嘌呤核糖核苷、2，6-二氨基嘌呤核糖核苷、6-氟嘌呤核糖核苷、6-硫代嘌呤核糖核苷、2-氨基-6-硫代嘌呤核糖核苷和巯基鸟苷等；和嘧啶核苷，诸如尿苷、胞苷、5-氨基尿苷、5-羟基尿苷、5-溴尿苷和6-氮杂尿苷等。反应结果是，这些天然型核苷和非天然型核苷在它们的5’-位置上专一性地磷酸化，分别生产出相应的核苷-5’-磷酸酯。

需要加入反应溶液中的核苷浓度为1-20g/dl。使用微溶于水的核苷时，可以通过加入硼酸或诸如二甲基亚砜等表面活性剂，提高反应产量。

通过发酵生产核苷时，发酵后的发酵培养基可以照原样加入磷酸化反应液中。当培养基中包含分解核苷-5’-磷酸酯的成分时，最好使用纯化步骤，使得除去所述成分。

关于所用的磷酸基团供体，可作为多磷酸或其盐使用的那些磷酸基团供体包括例如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、它们的混合物、其钠盐、钾盐和它们的盐的混合物。那些可作为苯磷酸或其盐使用的磷酸基团供体包括例如苯磷酸二钠、苯磷酸二钾、邻，邻-二苯磷酸酐和它们的混合物。那些可作为氨甲酰磷酸或其盐使用的磷酸基团供体包括例如氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵、氨甲酰磷酸二锂和它们的混合物。那些可作为乙酰磷酸或其盐使用的磷酸基团供体包括例如乙酰磷酸锂钾。磷酸基团供体使用的浓度由作为磷酸基团受体的核苷浓度决定。磷酸基团供体的用量通常为核苷用量的1-5倍。

在温度通常为20-60℃、最好为30-40℃，pH为3.5-6.5、最好为4.0-5.0的弱酸性范围内的反应中，获得最佳结果。使用温度稳定性增加的突变型酸性磷酸酶时，反应温度为20-70℃，最好为30-60℃。可以采用静止方法和搅拌方法中的任一种方法进行反应。反应时间根据诸如所用酶的活性和底物浓度等条件而延迟，然而，一般为1-100小时。

在完成反应后，可以采用使用合成树脂吸附的方法、使用沉淀剂的方法和其它常规收集和分离方法，从混合物中收集和分离由此生产的核苷-5’磷酸酯。

[实施例]

下面参考实施例具体解释本发明，然而，本发明不限于这些实施例。

用肌苷作为底物，在以下条件下测定转磷酸活性。反应在pH 5.0、30℃下进行10分钟，在反应溶液(1ml)中含有40μmol/ml肌苷、100μmol/ml焦磷酸钠、100μmol/ml乙酸钠缓冲液(pH5.0)和酶。加入200μl 2N盐酸中止反应。此后，通过离心除去沉淀。然后，定量测定通过转磷酸反应产生的5’-肌苷酸。在该标准反应条件下每1分钟产生1μmol 5’-肌苷酸的酶量定为1个单位。

使用5’-肌苷酸作为底物，在以下条件下测定磷酸单酯酶活性。反应在30℃下进行10分钟，在反应溶液(1ml)中含有10μmol/ml 5’-肌苷酸、100μmol/ml MES/NaOH缓冲液(pH6.0)和酶。加入200μl 2N盐酸中止反应。此后，通过离心除去沉淀。然后，定量测定通过水解反应产生的肌苷。在该标准反应条件下每1分钟产生1μmol肌苷的酶量定为1个单位。

在以下条件下用高效液相层析(HPLC)分析肌苷和5’-肌苷酸。

柱子：Cosmosil 5C18-AR(4.6×150 mm)[由nacalai tesque生产]；

流动相：5mM磷酸钾缓冲液(pH2.8)/甲醇＝95/5；

流速：1.0ml/min；

温度：室温；

检测：UV 245nm。

顺便说说，在用除肌苷外的核苷作为原料生产核苷-5’-磷酸酯的反应中，按照上述方法用HPLC分析作为原料的核苷和产生的核苷-5’-磷酸酯。

实施例1：得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶的纯化和表征

将含有1g/dl胨、0.5g/dl酵母膏和1g/dl氯化钠的营养培养基(pH7.0，50ml)注入坂口(Sakaguchi)烧瓶(500ml)中，在120℃下灭菌20分钟。每个烧瓶用白金接种环接种一次摩氏摩根氏菌NCIMB 10466斜面培养物，在30℃震荡培养16小时。将通过离心从培养物收获的微生物细胞(大约3,000g)悬浮在100mM磷酸钾缓冲液(1L，pH7.0)中。在4℃下进行超声处理20分钟，以破碎微生物细胞。对处理后的悬浮液进行离心，以除去不溶部分。由此制备得到无细胞提取物。

将硫酸铵加入无细胞提取物中，使得达到30％的饱和度。通过离心除去出现的沉淀，然后再将硫酸铵加入上清液中，使得达到60％的饱和度。通过离心收集出现的沉淀，将其溶于100mM磷酸钾缓冲液中。

该粗酶溶液对5L 100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析4次，然后将其加到用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的DEAE-Toyopeal 650M柱(φ4.1×22cm)上，然后用800ml 20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗涤。在通过柱子的一个部分中发现转磷酸活性，从而回收该部分。

将硫酸铵加入该部分中，使得达到35％的饱和度，将其吸附到用含有35％饱和度硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的Butyl-Toyopeal柱(φ3.1×26cm)上。用磷酸钾缓冲液(pH7.0)中饱和度为35-20％的线性浓度梯度进行洗脱。

收集活性部分，并对1L 50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析，然后加到用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的羟基磷灰石柱(φ5×6.5cm)上。用50-300mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)的线性浓度梯度进行洗脱。

收集活性部分，并进行超滤浓缩。将该酶溶液加到HiLoad TM16/60 Superdex 200柱上(由Pharmacia生产)。用含有100mM氯化钠的50mM磷酸钾缓冲液，以1.0ml/min的流速进行洗脱。

按照上述步骤，结果从无细胞提取物中纯化出表现转磷酸活性的酶，纯化倍数为大约550倍，回收率大约为10％。该纯化方法的比活和回收率示于表1中。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，该酶样是均一的。

表1回收步骤总活性总蛋白比活回收率

(单位) (mg) (单位/mg) (％)1.无细胞提取物 597 127,200 0.005 1002.硫酸铵分级分离 568 122,210 0.005 95(30-60％)3.DEAE-Toyopearl 517 36,498 0.014 874.Butyl-Toyopearl 394 1,121 0.351 665.羟基磷灰石 112 50 2.244 196.Superdex 200 63 24 2.630 10

纯化的酶具有以下性质。

(1)作用：将磷酸基团从诸如多磷酸等磷酸基团供体转移到核苷上，产生核苷-5’-磷酸酯。相反地，该酶也表现出水解磷酸酯的活性。

(2)底物专一性：在转磷酸反应中用作磷酸基团供体的那些底物包括例如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、苯磷酸二钠、苯磷酸二钾、邻，邻-二苯磷酸酐、氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵和氨甲酰磷酸二锂。作为磷酸基团受体的那些底物包括例如嘌呤核糖核苷、肌苷、鸟苷、腺苷、黄苷、尿苷和胞苷。另一方面，在磷酸酯水解反应中受到作用的那些底物包括例如无机磷酸，诸如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸等；磷酸酯，诸如苯磷酸二钠、苯磷酸二钾、邻，邻-二苯磷酸酐、氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵和氨甲酰磷酸二锂；以及5’-核苷酸，诸如5’-嘌呤核糖核苷酸、5’-肌苷酸、5’-鸟苷酸、5’-腺苷酸、5’-黄苷酸、5’-尿苷酸和5’-胞苷酸等。

(3)最适pH：5.2(转磷酸反应)，6.5(磷酸酯水解反应)。

(4)pH稳定性：pH 3.0-12.0(在30℃处理60分钟)。

(5)最适温度：大约35℃。

(6)温度稳定性：可稳定至30℃(在pH7.0下处理30分钟)。

(7)加入金属离子和抑制剂的效果：

加入任何金属离子，该酶都不表现出与其活性有关的激活现象。该活性受Ag²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的抑制。该活性也受碘乙酸的抑制。

(8)分子量：按照高效液相层析(TSKgel G-3000SW，由Toyo Soda生产)计算的分子量为大约190,000。

(9)亚基分子量：按照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳计算的亚基分子量为大约25,000。

该酶不仅表现出将磷酸基团转移到核苷的活性，而且表现出相反的水解磷酸酯的活性。此外，该酶表现出的磷酸酯水解活性(磷酸单酯酶活性)比转磷酸活性高出的倍数不低于20倍。其它性质与用属于摩根氏菌属细菌产生的已知酸性磷酸酶的那些性质(Microbiology，140，1341-1350(1994))很好地吻合。因此，已经阐明该酶为酸性磷酸酶。

将焦磷酸钠(10g/dl)和肌苷(2g/dl)溶于pH为5.5、5.0、4.5、4.0和3.5的乙酸钠缓冲液中，加入上述酶样，使达到50单位/dl的浓度。该反应混合物在30℃下保温6小时，同时保持每个pH；随着时间的推移，测定产生的5-’肌苷酸的量。产生的肌苷酸只含有5’-肌苷酸。根本没有观察到2’-肌苷酸和3’-肌苷酸副产物的产生。结果示于图1中。5’-肌苷酸的生产速度在pH 5.0下最大。然而，5’-肌苷酸最大积累量在较低pH下更高。在pH4.0下的反应条件对5’-肌苷酸的生产最有效，其中通过进行3小时的反应，5’-肌苷酸产生并积累的量为2.60g/dl。

实施例2：用得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶

样品进行的各种核苷的磷酸化反应

将焦磷酸钠(10g/dl)和作为磷酸基团受体的肌苷、鸟苷、尿苷或胞苷(2g/dl)溶于乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入实施例1中制备的酶样，使达到50单位/dl的浓度。该反应混合物在30℃下保温3小时，同时将pH保持在4.0。通过反应产生的核苷-5’-酯的量示于表2中。

产生的核苷酸只含有核苷-5’-酯。根本没有观察到核苷-2’-酯和核苷-3’-酯副产物的产生。

表2

核苷产物产量

(g/dl)

肌苷 5’-肌苷酸 2.60

鸟苷 5’-鸟苷酸 1.90

尿苷 5’-尿苷酸 1.30

胞苷 5’-胞苷酸 0.98

实施例3：用得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶样品

从作为磷酸基团供体的各种磷酸化合物生产5’-肌苷酸

将肌苷(2g/dl)和作为磷酸基团供体的三聚磷酸钠、多磷酸钠(商品名：Polygon P，由Chiyoda Chemical生产)、苯磷酸二钠或氨甲酰磷酸二钠(10g/dl)溶于乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入实施例1中制备的酶样，使得其浓度为50单位/dl。该反应混合物在30℃下保温3小时，同时将pH保持在4.0。通过反应产生的5’-肌苷酸的量示于表3中。

使用任何磷酸基团供体，都有效地产生并积累5’-肌苷酸。然而，使用多磷酸钠作为磷酸基团供体时，5’-肌苷酸的积累量最高。

表3

磷酸基团供体产生的5’-肌苷酸

(g/dl)

三聚磷酸钠 2.10

多磷酸钠 2.72

苯磷酸二钠 2.33

氨甲酰磷酸二钠 2.54

实施例4：得自Esherichia blattae的酸性磷酸酶的纯化和表征

将含有1g/dl胨、0.5g/dl酵母膏和1g/dl氯化钠的营养培养基(pH7.0，50ml)注入坂口烧瓶(500ml)中，在120℃下灭菌20分钟。每个烧瓶用白金接种环接种一次Esherichia blattae JCM 1650斜面培养物，在30℃震荡培养16小时。通过离心从培养物收获微生物细胞。将微生物细胞(大约3,300g)悬浮在100mM磷酸钾缓冲液(1L，pH7.0)中。在4℃下进行超声处理20分钟，以破碎微生物细胞。对处理后的悬浮液进行离心，以除去其不溶部分。由此制备得到无细胞提取物。

该粗酶溶液对5L 100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析4次，然后将其加到用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的DEAE-Toyopeal 650M柱(φ6.2×35cm)上，然后用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗涤。在通过柱子的一个部分中发现转磷酸活性，从而收集该部分。

将硫酸铵加入该活性部分中，使得达到35％的饱和度，将其加到到用含有35％饱和度硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的Butyl-Toyopeal柱(φ5.0×22.5cm)上。用磷酸钾缓冲液(pH7.0)中饱和度为35-20％的线性浓度梯度进行洗脱。

收集活性部分，并对1L 100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)透析，然后加到用100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的羟基磷灰石柱(φ3.0×7.0cm)上。用50-100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)的线性浓度梯度进行洗脱，并收集活性部分。

该酶溶液对1L 100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)透析，然后加到用10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)平衡的CM-Toyopearl柱(φ2.0×14.0cm)上。用磷酸钾缓冲液(pH6.0)中含有0-300mM氯化钾的线性浓度梯度进行洗脱。收集从柱子洗脱的活性部分。

按照上述步骤，结果从无细胞提取物中纯化出表现转磷酸活性的酶，纯化倍数为大约600倍，回收率大约为16％。该纯化方法的比活和回收率示于表4中。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，该酶样品是均一的。

表4步骤总活性总蛋白比活回收率

(单位) (mg) (单位/mg) (％)1.无细胞提取物 365 160,650 0.002 1002.硫酸铵分级分离 340 138,895 0.002 93(30-60％)3.DEAE-Topopearl 318 30,440 0.010 874.Butyl-Topopearl 232 661 0.347 635.羟基磷灰石 96 96 1.000 266.CM-Toyopearl 59 43 1.365 16

纯化的酶具有以下性质。

(2)底物专一性：在转磷酸反应中作为磷酸基团供体的那些底物包括例如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、苯磷酸二钠、苯磷酸二钾、邻，邻-二苯磷酸酐、氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵和氨甲酰磷酸二锂。作为磷酸基团受体的那些底物包括例如嘌呤核糖核苷、肌苷、鸟苷、腺苷、黄苷、尿苷和胞苷。另一方面，在磷酸酯水解反应中受到作用的那些底物包括例如无机磷酸，诸如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸等；磷酸酯，诸如苯磷酸二钠、苯磷酸二钾、邻，邻-二苯磷酸酐、氨甲酰磷酸二钠、氨甲酰磷酸二钾、氨甲酰磷酸二铵和氨甲酰磷酸二锂等；以及5’-核苷酸，诸如5’-嘌呤核糖核苷酸、5’-肌苷酸、5’-鸟苷酸、5’-腺苷酸、5’-黄苷酸、5’-尿苷酸和5’-胞苷酸。

(3)最适pH：5.2(转磷酸反应)，6.5(磷酸酯水解反应)。

(4)pH稳定性：pH3.5-12.0(在30℃处理60分钟)。

(5)最适温度：大约35℃。

(6)温度稳定性：可稳定至40℃(在pH7.0下处理30分钟)。

(7)加入金属离子和抑制剂的效果：

加入任何金属离子，该酶都不表现出与其活性有关的激活现象。该活性受Fe²⁺、Ag²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的抑制。该活性也受碘乙酸的抑制。

(8)分子量：按照高效液相层析(TSKgel G-3000SW，由Toyo Soda生产)计算的分子量为大约188,000。

(9)亚基分子量：按照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳计算的亚基分子量为大约24,500。

该酶不仅表现出将磷酸基团转移到核苷的活性，而且也表现出相反的水解磷酸酯的活性，其方式与从摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的无细胞提取物中纯化的酶相似。此外，该酶表现出的磷酸酯水解活性(磷酸单酯酶活性)比转磷酸活性高出的倍数不低于30倍。因此，已经阐明该酶为酸性磷酸酶。

将焦磷酸钠(15g/dl)和肌苷(3g/dl)溶于pH为5.5、5.0、4.5、4.0和3.5的乙酸钠缓冲液中，加入上述酶样，使达到50单位/dl的浓度。该反应混合物在30℃下保温6小时，同时保持每个pH；随着时间的推移，测定产生的5-’肌苷酸的量。产生的肌苷酸只含有5’-肌苷酸。根本没有观察到2’-肌苷酸和3’-肌苷酸副产物的产生。结果示于图2中。5’-肌苷酸的生产速度在pH5.0下最大。然而，5’-肌苷酸最大积累量在较低pH下更高。在pH4.0下的反应条件对5’-肌苷酸的生产最有效。通过在30℃、pH4.0下进行3小时的反应，5’-肌苷酸产生并积累的量为1.56g/dl。

实施例5：用得自Esherichia blattae的酸性磷酸酶

样品进行的各种核苷的磷酸化反应

将焦磷酸钠(15g/dl)和肌苷、鸟苷、尿苷或胞苷(3g/dl)溶于乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入实施例4中制备的酶样，使得其浓度为50单位/dl。该反应混合物在35℃下保温3小时，同时将pH保持在4.0。产生的核苷-5’-酯的量示于表5中。

表5

核苷产物产量

(g/dl)

肌苷 5’-肌苷酸 1.56

鸟苷 5’-鸟苷酸 1.05

尿苷 5’-尿苷酸 1.87

胞苷 5’-胞苷酸 1.22

实施例6：用得自Esherichia blattae的酸性磷酸酶样品

从作为磷酸基团供体的各种磷酸化合物生产5’-肌苷酸

将肌苷(2g/dl)和作为磷酸基团供体的三聚磷酸钠、多磷酸钠(商品名：Polygon P，由Chiyoda Chemical生产)、苯磷酸二钠或氨甲酰磷酸二钠(10g/dl)溶于乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入实施例4中制备的酶样，使得其浓度为50单位/dl。该反应混合物在35℃下保温3小时，同时将pH保持在4.0。产生的5’-肌苷酸的量示于表6中。

表6

磷酸基团供体产生的5’-肌苷酸

(g/dl)

三聚磷酸钠 1.20

多磷酸钠 1.79

苯磷酸二钠 1.50

氨甲酰磷酸二钠 1.53

实施例7：摩氏摩根氏菌染色体

的酸性磷酸酶编码基因的分离(1)N-末端氨基酸顺序的测定

将按照实施例1描述的方法从摩氏摩根氏菌NCIMB 10466无细胞提取物中纯化的酸性磷酸酶，吸附到DITC膜(由Milligen/Biosearoh生产)上，用Prosequencer 6625(由Milligen/Biosearch生产)测定其N-末端氨基酸顺序。确定了顺序表SEQ ID NO：1中所示一个包含20个残基的N-末端氨基酸顺序。(2)含有酸性磷酸酶编码基因的DNA片断的分离

按照Murray和Thomson(Nucl.Acid Res.，4321,8(1980))的方法，从培养的摩氏摩根氏菌NCIMB 10466微生物细胞中提取染色体DNA。用限制性内切酶Sau3 AI部分降解染色体DNA。此后，借助于蔗糖密度梯度离心分离3-6kbp的DNA片断。质粒载体pUC118(由Takara Shuzo生产)用限制性内切酶BamHI降解，将其与部分降解的染色体DNA片断连接。用DNA连接药盒(由Takara Shuzo生产)按照指定的方法进行DNA连接。此后，按照常规方法，用获得的DNA混合物转化大肠杆菌JM109(由Takara Shuzo生产)。转化体在含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基上铺平板，让其生长以制备基因文库。

将含有4mM对硝基苯磷酸和100mM MES/NaOH缓冲液(pH6.5)的反应溶液倒在转化体生长的琼脂培养基上，将温度保持在30℃15分钟。表达磷酸酶活性的菌株释放对硝基酚并表现出黄色。因此，用该现象作为指标筛选转化体。筛选了一个包含大约20,000个转化体菌株的基因表达文库，结果获得30个表达磷酸酶活性的转化体菌株。

表达磷酸酶活性的转化体(30个菌株)经过单克隆分离。将单克隆培养在含有100μg/ml氨苄青霉素的L培养基(2.5ml)上，让其在37℃培养16小时。将含有肌苷(2g/dl)和焦磷酸钠(10g/dl)的乙酸钠缓冲液(100mM，pH5.0，50μl)加入从培养物中收获的微生物细胞中，反应混合物在30℃保温16小时。通过HPLC分析检测5’-肌苷酸的生产，以筛选具有转磷酸活性的微生物菌株。结果，我们成功地获得5个转化体，它们表现出转磷酸活性，并假定包含含有目的酸性磷酸酶基因的DNA片断。

实施例8：得自摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的

酸性磷酸酶基因核苷酸顺序的测定

按照碱裂解法(Molecular Cloning 2nd edition(J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Cold Spring Harbour Laboratory Press，pl.25(1989))，从实施例7获得的、假定包含含有酸性磷酸酶基因(得自摩氏摩根氏菌NCIMB 10466)的DNA片断的一个转化体菌株制备质粒，分析插入的DNA片断。该质粒命名为pMPI501。图3显示了测定的插入DNA片断的限制性内切酶图谱。

通过亚克隆进一步具体测定酸性磷酸酶基因区。结果显示，该酸性磷酸酶基因包含在用限制性内切酶HindIII和EcoRI剪切的大小为1.2kbp的片断上。因此为了测定该核苷酸顺序，构建一个质粒DNA，将1.2kbp片断与用HindIII和EcoRI降解的pUC118连接。按照常规方法，用命名为pMPI505的该质粒DNA转化大肠杆菌JM109(由TakaraShuzo生产)，将其在含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基铺平板，以获得转化体。

按照碱裂解法，从包含pMPI505的大肠杆菌JM109(由TakaraShuzo生产)的转化体中提取质粒，测定核苷酸顺序。按照Sanger的方法(J.Mol.Biol.，143，161(1980))，用Taq DyeDeoxy末端循环测序药盒(由Applied Biochemical生产)测定核苷酸顺序。一个测定的开放阅读框架的核苷酸顺序示于顺序表的SEQ ID NO：2中。从该核苷酸顺序得出的蛋白质氨基酸顺序示于顺序表的SEQ ID NO：3中。在该氨基酸顺序中发现一个与纯化酶N-末端氨基酸顺序完全吻合的部分顺序。纯化酶的N-末端从SEQ ID NO：3中所示顺序的第21位丙氨酸残基开始。因此，我们假定SEQ ID NO：3中所示的氨基酸顺序为前体蛋白的氨基酸顺序，并且包含从第1位甲硫氨酸残基至第20位丙氨酸残基区域的多肽在翻译后被去除。由此得出的成熟蛋白的氨基酸顺序示于顺序表的SEQ ID NO：4中。从该氨基酸顺序估计的成熟蛋白的分子量计算为24.9千道尔顿，它与纯化酶的SDS-PAGE结果很好地吻合。按照上述结果，由于包含含该片断质粒的转化体表现出转磷酸活性，鉴定该开放阅读框架为目的酸性磷酸酶的编码区。

分别比较核苷酸顺序和氨基酸顺序与已知顺序的同源性。使用EMBL和SWISS-PROT的数据库。结果揭示出，顺序表的SEO ID NO：2中所示的核苷酸顺序与得自摩氏摩根氏菌的已知酸性磷酸酶基因的核苷酸顺序(Thaller，M.C.等人，Microbiology，140，1341(1994))吻合，只是在后者中，第54位G为A，第72位G为A，第276位T为G，第378位T为C，第420位G为T，第525位C为G，第529位C为T和第531位G为A，并且顺序表的SEQ ID NO：4中所示的氨基酸顺序与得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶基因的氨基酸顺序相同。即包含顺序表SEQ ID NO：4中所示氨基酸顺序的蛋白质的编码基因为摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的酸性磷酸酶基因。

前体蛋白包含249个氨基酸，从其顺序得出的蛋白质的分子量为27.0千道尔顿。

用质粒pMPI505转化的大肠杆菌JM109菌株命名为AJ13143，已经于1996年2月23日在布达佩斯条约下，在工业科学技术局的国家生命科学和人类技术研究所(邮政编码：305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)进行了国际储藏，给予的储藏号为FERMBP-5422。

实施例9：通过表达得自摩氏摩根氏菌NCIMB 10466的

酸性磷酸酶基因放大活性

将实施例8中构建的大肠杆菌JM109/pMPI505接种在含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的L培养基(50ml)中，在37℃下培养16小时。通过离心从其培养物中收获微生物细胞，用生理盐水洗涤1次。将微生物细胞悬浮于100mM磷酸钾缓冲液(5ml，pH7.2)中，通过在4℃下进行20分钟的超声处理破碎细胞。将处理后的溶液离心，以除去不溶部分，由此制备得到无细胞提取物。

测定获得的无细胞提取物的转磷酸活性，而使用的对照为从摩氏摩根氏菌野生型菌株和用质粒pUC118按照上述相同方法转化的大肠杆菌JM109制备的无细胞提取物。结果示于表7中。在大肠杆菌JM109/pUC118中没有检测到转磷酸活性。在摩氏摩根氏菌野生型菌株中转磷酸活性也很低。另一方面，大肠杆菌JM109/pMPI505表现出高转磷酸活性，其比活为摩氏摩根氏菌野生型菌株的150倍。按照该结果，证明导入的DNA片断使大肠杆菌高水平地表达酸性磷酸酶。

表7

微生物菌株转磷酸活性

(单位/mg)

摩氏摩根氏菌NCIMB 10466 0.008

大肠杆菌JM109/pUC118 未检测到

大肠杆菌JM109/pMPI505 1.250

实施例11：Esherichia blattae染色体

的酸性磷酸酶编码基因的分离(1)N-末端氨基酸顺序的测定

将从Esherichia blattae JCM 1650无细胞提取物中纯化的酸性磷酸酶，吸附到DITC膜(由Milligen/Biosearch生产)上，用Prosequencer6625(由Milligen/Biosearch生产)测定其N-末端氨基酸顺序。确定了顺序表SEQ ID NO：8中所示的一个包含15个残基的N-末端氨基酸顺序。(2)含有酸性磷酸酶编码基因的DNA片断的分离

按照Murray和Thmoson(Nucl.Acid Res.，4321,8(1980))的方法，从培养的Esherichia blattae JCM 1650细胞中提取染色体DNA。用限制性内切酶Sau3AI部分降解染色体DNA。此后，用蔗糖密度梯度离心分离3-6kbp的DNA片断。质粒载体pUC118(由Takara Shuzo生产)用限制性内切酶BamHI降解，将其与部分降解的染色体DNA片断连接。用DNA连接药盒(由Takara Shuzo生产)按照指定方法进行DNA连接。此后，按照常规方法，用获得的DNA混合物转化大肠杆菌JM109(由Takara Shuzo生产)。转化体在含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基铺平板，让其生长以制备基因文库。

将含有4mM对硝基苯磷酸和100mM MES/NaOH缓冲液(pH6.5)的反应溶液倒在转化体生长的琼脂培养基表面上，将温度保持在30℃15分钟。表达磷酸酶活性的菌株释放对硝基酚并表现出黄色。因此，用该现象作为指标筛选转化体。筛选了一个包含大约8,000个转化体菌株的染色体基因表达文库，结果获得14个表达磷酸酶活性的转化体菌株。

表达磷酸酶活性的转化体(14个菌株)经过单克隆分离。将单克隆培养在含有100μg/ml氨苄青霉素的L培养基(2.5ml)上，让其在37℃培养16小时。将含有肌苷(2g/dl)和焦磷酸钠(10g/dl)的乙酸钠缓冲液(100mM，pH5.0，50μl)加入从培养液中收获的微生物细胞中，在30℃进行16小时的反应。通过HPLC分析检测5’-肌苷酸的生产，以筛选具有转磷酸活性的菌株。结果，我们成功地获得3个转化体，它们表现出转磷酸活性，并假定包含含目的酸性磷酸酶基因的DNA片断。

实施例12：得自Esherichia blattae JCM 1650的

酸性磷酸酶基因核苷酸顺序的测定

按照碱裂解法，从实施例11获得的、假定包含含酸性磷酸酶基因(得自Esherichia blattae JCM 1650)的DNA片断的一个转化体菌株中提取质粒，分析插入的DNA片断。该质粒命名为pEPI301。图5显示了测定的插入DNA片断的限制性内切酶图谱。

通过亚克隆进一步具体测定酸性磷酸酶基因区。结果显示，该酸性磷酸酶基因包含在用限制性内切酶ClaI和BamHI剪切的、大小为2.4kbp的片断上。因此为了测定该核苷酸顺序，构建质粒DNA，其中将该片断与用ClaI和BamHI降解的pBluescript KS(+)(由Stratagene生产)连接。按照常规方法，用命名为pEPI305的该质粒DNA转化大肠杆菌JM109(由Takara Shuzo生产)，将其在含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基铺平板，以获得转化体。

按照碱裂解法，从包含pEPI305的大肠杆菌JM109(由TakaraShuzo生产)转化体中提取质粒，测定核苷酸顺序。一个测定的开放阅读框架的核苷酸顺序示于顺序表的SEQ ID NO：6中。从该核苷酸顺序得出的蛋白质的氨基酸顺序示于顺序表的SEQ ID NO：7中。在该氨基酸顺序中发现一个与纯化酶N-末端氨基酸顺序完全吻合的部分顺序。纯化酶的N-末端从SEQ ID NO：7中所示顺序的第19位亮氨酸残基开始。因此，我们假定SEQ ID NO：7中所示的氨基酸顺序为前体蛋白质的氨基酸顺序，并且包含从第1位甲硫氨酸残基至第18位丙氨酸残基区域的多肽在翻译后被去除。由此推测的成熟蛋白的氨基酸顺序示于顺序表的SEQ ID NO：8中。因此，估计的成熟蛋白的分子量计算为25.1千道尔顿，它与纯化酶的SDS-PAGE结果很好地吻合。按照上述结果，由于包含含该片断的质粒的转化体表现出转磷酸活性，因此鉴定该开放阅读框架为目的酸性磷酸酶的编码区。

即包含顺序表ESQ ID NO：8中所示氨基酸顺序的蛋白质编码基因为Esherichia blattae JCM 1650的酸性磷酸酶基因。

分别比较核苷酸顺序和氨基酸顺序与已知顺序的同源性。使用EMBL和SWISS-PROT的数据库。结果，揭示出顺序表的SEQ ID NO：8中所示的蛋白质与编码它的DNA是新的。该基因编码的前体蛋白包含249个氨基酸，由其顺序得出的蛋白质的分子量为27.0千道尔顿。

分别比较氨基酸顺序与已知顺序的同源性。结果，该蛋白质表现出与斯托氏普罗威登斯菌的酸性磷酸酶、实施例8中的摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶和鼠伤寒沙门氏菌的酸性磷酸酶的高度同源性，同源性分别为77.1％、77.1％和44.3％。

用质粒pEPI305转化的大肠杆菌JM109菌株命名为AJ13144，已经于1996年2月23日在布达佩斯条约下，在工业科学技术局的国家生命科学和人类技术研究所(邮政编码：305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)进行了国际储藏，给予的储藏号为FERM BP-5423。

实施例13：通过表达得自Esherichia blattae JCM 1650的

酸性磷酸酶基因放大活性

将实施例12中构建的大肠杆菌JM109/pEPI305接种在含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的L培养基(50ml)中，在37℃下培养16小时。通过离心从其培养物中收获微生物细胞，用生理盐水洗涤1次。将微生物细胞悬浮于100mM磷酸钾缓冲液(5ml，pH7.2)中，通过在4℃下进行20分钟的超声处理破碎细胞。将处理后的溶液离心，以除去不溶部分，由此制备得到无细胞提取物。

测定获得的无细胞提取物的转磷酸活性，而使用的对照为从Esherichia blattae野生型菌株和用质粒pBluescript KS(+)按照上述相同方法转化的大肠杆菌JM109中制备的无细胞提取物。结果示于表8中。在大肠杆菌JM109/pBluescript KS(+)中没有检测到转磷酸活性。在Esherichia blattae野生型菌株中转磷酸活性也很低。另一方面，大肠杆菌JM109/pEPI305表现出高转磷酸活性，其比活为Esherichia blattae野生型菌株的120倍。按照该结果，证明导入的DNA片断使大肠杆菌高水平地表达酸性磷酸酶。

表8

微生物菌株转磷酸活性

(单位/mg)

Esherichia blattae JCM 1650 0.002

大肠杆菌JM109/pBluescript KS(+) 未检测到

大肠杆菌JM109/pEPI305 0.264

实施例14：用包含得自Esherichia blattae JCM 1650的

酸性磷酸酶基因的菌株从肌苷生产5’-肌苷酸

将焦磷酸钠(12g/dl)和肌苷(6g/dl)溶于100mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入上述大肠杆菌JM109/pEPI305的微生物细胞，使转化为微生物细胞干重时的细胞浓度为200mg/dl。反应混合物在35℃下保温10小时，同时将pH保持在4.0；随着时间的推移，测定产生的5’-肌苷酸的量。产生的肌苷酸只含有5’-肌苷酸。根本没有观察到2’-肌苷酸和3’-肌苷酸副产物的生产。结果示于图6中。在短时间内，用该微生物在从焦磷酸盐和肌苷产生5’-肌苷酸的反应中，非常高效地生产和积累5’-肌苷酸。

实施例15：磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶

编码基因的制备

正如实施例13和实施例14所描述的，包含得自Esherichia blattae的酸性磷酸酶基因的菌株表达相当大量的酸性磷酸酶，并且在短时间内，在用该微生物从焦磷酸盐和肌苷生产5’-肌苷酸的反应中，非常高效地生产和积累5’-肌苷酸。然而，它揭示出5’-肌苷酸的积累量不超过一定程度，因为该酸性磷酸酶本身具有的磷酸单酯酶活性，使生产的5’-肌苷酸降解。因此，试图按照用PCR定位点诱变的方法，将突变导入实施例11克隆的得自Esherichia blattae的该酸性磷酸酶基因中，改进该酶。

使用DNA合成仪(由Applied Biosystems生产的394型)，按照磷酰胺化物法，分别合成顺序表的SEQ ID NO：9、10和11中所示的寡核苷酸MUT300、MUT310和MUT320。

将在实施例12中制备的、作为模板的质粒pEPI305、作为引物的M13引物RV(由Takara Shuzo生产)和MUT310寡核苷酸(每种2.5μmol)以及Taq DNA聚合酶(2.5单位，由Takara Shuzo生产)加入含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP(每种200μM)、氯化钾(50mM)和氯化镁(1.5mM)的100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3，100μl)中，进行PCR反应，其中一个循环包括在94℃下30秒、在55℃下2分钟和在72℃下3分钟，重复该循环25次。使用PJ2000型热循环仪(由Takara Shuzo生产)进行PCR反应。此外，以上述相同方式，用质粒pEPI305(1ng)作为模板、M13引物M3(由Takara Shuzo生产)和MUT300寡核苷酸(每种2.5μmol)作为引物进行PCR反应。每种反应溶液通过用Microspin柱S-400(由Pharmacia生产)进行凝胶过滤纯化，以除去引物。

将每种PCR反应产物(1μl)加入含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP(每种200μM)、氯化钾(50 mM)和氯化镁(1.5mM)的100mMTris-HCl缓冲液(pH8.3，95μl)中，将其在94℃加热10分钟，然后在60分钟内冷却至37℃。此后，将温度保持在37℃15分钟，形成异源双链。加入Taq DNA聚合酶(2.5单位)，在72℃下反应3分钟，使得完成异源双链。此后，将M13引物RV和M13引物M3(每种2.5μmol)加入该反应溶液中，进行PCR反应，其中一个周期包括在94℃下30秒、在55℃下2分钟和在72℃下3分钟，重复10次周期。

将第二个PCR反应的产物用ClaI和BamHI降解，然后用苯酚/氯仿抽提，然后进行乙醇沉淀。将该DNA片断与用ClaI和BamHI降解的pBluescript KS(+)连接。按照常规方法，用获得的质粒DNA转化大肠杆菌JM109(由Takara Shuzo生产)，将其在含有100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基上铺平板，以获得转化体。

按照碱裂解法，从转化体中提取质粒，以测定其核苷酸顺序，证实目的核苷酸被替代。由此制备编码突变型磷酸酶的突变型基因，其中成熟蛋白的第74位甘氨酸残基(GGG)用天冬氨酸残基(G^*A^*T)替代。含有该突变型基因的质粒命名为pEPI310。

按照上述相同的方式，用pEPI305作为模板，MUT300和MUT320寡核苷酸作为引物，制备编码突变型磷酸酶的突变型基因，其中成熟蛋白的第153位异亮氨酸残基(ATC)用苏氨酸残基(A^*CC)替代。含有该突变型基因的质粒命名为pEPI320。此外，按照上述相同的方式，用pEPI310作为模板，MUT300和MUT320寡核苷酸作为引物，制备编码突变型磷酸酶的突变型基因，其中成熟蛋白的第74位甘氨酸残基(GGG)用天冬氨酸残基(G^*A^*T)替代，而第153位异亮氨酸残基(ATC)用苏氨酸残基(A^*CC)替代。含有该突变型基因的质粒命名为pEPI330。

将已导入含有相应突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI310、大肠杆菌JM109/pEP1320和大肠杆菌JM109/pEPI330，以及已导入含野生型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI305接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的L培养基(50ml)中，在37℃培养16小时。从它们的培养物中收获微生物细胞，用生理盐水洗涤1次。将微生物细胞悬浮于100mM磷酸钾缓冲液(5ml，pH7.0)中，通过在4℃下超声处理20分钟破碎细胞。离心处理后的溶液，以除去不溶部分，由此制备得到无细胞提取物。在pH4.0下测定获得的无细胞提取物的磷酸单酯酶活性和转磷酸活性，将它们与野生型菌株的活性进行比较。

表9表明野生型酸性磷酸酶和磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶的磷酸单酯酶活性和转磷酸活性的测定结果。它表明，与野生型酸性磷酸酶相比，磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶的磷酸单酯酶活性和转磷酸活性都降低，并且磷酸单酯酶活性的降低程度大于转磷酸活性的降低程度，结果，与野生型酸性磷酸酶相比，突变型酸性磷酸酶的磷酸单酯酶活性与转磷酸活性之比降低。

表9质粒磷酸单酯酶活性转磷酸活性比值¹⁾

(单位/mg) (单位/mg) (相对值)pEPI305 2.38 0.132 18.03(100)pEPI310 0.26 0.019 13.68(76)pEPI320 0.88 0.123 7.15(39)pEPI330 0.42 0.070 6.00(33)1)：磷酸单酯酶活性与产生核苷-5’-磷酸酯活性之比

实施例16：用包含磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶

编码基因的菌株从肌苷生产5’-肌苷酸

将已导入含有磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶编码基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI310、大肠杆菌JM109/pEPI320和大肠杆菌JM109/pEPI330，以及已导入含野生型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI305接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的L培养基(50ml)中，在37℃培养16小时。

将焦磷酸钠(12g/dl)和肌苷(6g/dl)溶于乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入通过上述培养获得的每种大肠杆菌菌株的微生物细胞，使转化为微生物细胞干重时的细胞浓度为200mg/dl。反应混合物在35℃下保温32小时，同时将pH保持在4.0；随着时间的推移，测定产生的5’-肌苷酸的量。结果示于图7中。

在图7中，纵坐标轴表示5’-肌苷酸的浓度(mg/dl)，而横坐标轴表示反应时间(h)。对于用相应的菌株细胞测定的反应进程，大肠杆菌JM109/pEPI305用实心圆表示，大肠杆菌JM109/pEPI310用实心三角表示，大肠杆菌JM109/pEPI320用空心圆表示，而大肠杆菌JM109/pEPI330用空心方块表示。

在用包含磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶的菌株从肌苷生产5’-肌苷酸的反应中，生产的5’-肌苷酸的降解速度降低。结果，5’-肌苷酸的产量和积累量都增加了。大肠杆菌JM109/pEPI330表现出最高积累量的5’-肌苷酸，该菌株包含磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶的编码基因，其中第74位甘氨酸残基和第153位异亮氨酸残基分别用天冬氨酸残基和苏氨酸残基替代。

实施例17：用包含磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶

编码基因的菌株生产各种核苷-5’-磷酸酯

将已导入含有磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶编码基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI330接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的L培养基(50ml)中，在37℃培养16小时。

将焦磷酸钠(12g/dl)和作为磷酸基团受体的肌苷、鸟苷、尿苷或胞苷(6g/dl)溶于100mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入上述微生物细胞中，使转化为细胞干重时的细胞浓度为200mg/dl。反应混合物在35℃下保温32小时，同时将pH保持在4.0。生产的核苷-5’-磷酸酯的量示于表10中。产生的核苷酸只含有核苷-5’-磷酸酯。根本没有观察到核苷-2’-磷酸酯和核苷-3’-磷酸酯副产物的生产。

表10

核苷产物产量

(g/dl)

肌苷 5’-肌苷酸 7.45

鸟苷 5’-鸟苷酸 4.77

尿苷 5’-尿苷酸 8.93

胞苷 5’-胞苷酸 6.60

实施例18：用包含磷酸单酯酶活性较低的酸性磷酸酶编码基因的

菌株从作为磷酸基团供体的各种磷酸化合物生产5’-肌苷酸

将已导入含有突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI330接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的L培养基(50ml)中，在37℃培养16小时。

将肌苷(6g/dl)和作为磷酸基团供体的三聚磷酸钠、多磷酸钠(商品名：Polygon P，由Chiyoda Chemical生产)、苯磷酸二钠或氨甲酰磷酸二钠(12g/dl)溶于100mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，加入上述微生物细胞中，使转化为细胞干重时的细胞浓度为200mg/dl。反应混合物在35℃下保温32小时，同时将pH保持在4.0。生产的5’-肌苷酸的量示于表11中。使用任何磷酸基团供体，都有效地产生并积累5’-肌苷酸。然而，使用多磷酸作为磷酸基团供体时，5’-肌苷酸的积累量最高。

表11

磷酸基团供体生产的5’-肌苷酸

(g/dl)

三聚磷酸钠 5.96

多磷酸钠 8.84

苯磷酸二钠 7.60

氨甲酰磷酸二钠 7.73实施例19

对得自Esherichia blattae JCM1650的新突变型酸性磷酸酶

基因的产生和该突变型酸性磷酸酶基因的酶学性质的研究

在实施例19-22中，在以下条件下，测定对核苷的转磷酸活性。用含40μmol/ml肌苷、100μmol/ml焦磷酸钠、100μmol/ml乙酸钠缓冲液(pH4.0)和酶的1ml反应溶液，在30℃、pH4.0下进行10分钟的反应。加入200μl 2N盐酸中止该反应。然后，通过离心除去沉淀，在上述条件下，测定通过转磷酸生成的5’-肌苷酸的量。在这些标准反应条件下，生产1μmol肌苷酸的酶量定义为1单位。

此外，将肌苷浓度从10μmol/ml变为100μmol/ml，在上述组成的反应条件下测定转磷酸活性，使用Hanes-Woolf作图法[Biochem.J.，26,1406(1932)]测定转磷酸活性中肌苷的速度常数。

按照以下所述，对实施例15中所述的用来提高核苷-5’-磷酸酯的产量的突变型酶进行详细分析。随后发现，突变型酶对核苷的亲和性野生型酶的对核苷亲和性，提高了2倍。因此，本发明人认为，通过增加上述酶对核苷的亲和性，可以提高核苷-5’-磷酸酯的生产率，通过遗传工程技术，进一步修饰该酶。

使用实施例15所述的含有得自Esherichia blattae的野生型酸性磷酸酶编码基因的质粒pEPI305，通过遗传工程技术将位点专一性突变导入该质粒DNA中，产生编码突变型酸性磷酸酶的基因。pEPI305为通过将用限制性内切酶ClaI和BamHI剪切并含有得自blattae埃希氏杆菌JCM6150野生型酸性磷酸酶编码基因的2.4Kbp DNA片断连接到用ClaI和BamHI剪切的pBluescript KS(+)(由Stratagene供应)上形成的质粒DNA。该酸性磷酸酶编码基因的碱基顺序由顺序表的SEQ IDNO：6表示。此外，由该碱基顺序得出的前体蛋白的氨基酸顺序由顺序表的SEQ ID NO：7表示。从纯化酶(实施例4中描述的)分析结果，推测出成熟蛋白的氨基酸顺序，用顺序表的SEQ ID NO：8表示。

使用DNA合成仪(由Applied Biosystem供应的394型)，用磷酰胺化物法合成具有顺序表中所示顺序的寡核苷酸MUT300(顺序表的SEQ ID NO：9)、MUT310(顺序表的SEQ ID NO：10)、MUT320(顺序表的SEQ ID NO：11)、MUT330(顺序表的SEQ ID NO：12)、MUT340(顺序表的SEQ ID NO：13)、MUT350(顺序表的SEQ ID NO：14)、MUT360(顺序表的SEQ ID NO：15)、MUT370(顺序表的SEQ IDNO：16)、MUT380(顺序表的SEQ ID NO：17)和MUT390(顺序表的SEQ ID NO：18)。

将作为模板的1ng pEPI305、2.5μmol M13引物RV(由TakaraShuzo Co.，Ltd.供应)、2.5μmol寡核苷酸MUT310和2.5单位Taq DNA聚合酶(由Takara Shuzo Co.，Ltd.供应)加入含有200μM dATP、200μM dCTP、200μM dGTP、200μM dTTP、50mM氯化钾和1.5mM氯化镁的100μl Tris-盐酸缓冲液(pH8.3)中。进行PCR，其中三步步骤-即在94℃下30秒、在55℃下2分钟和在72℃下3分钟，重复25次。在该反应中，使用PJ2000型热循环器(由Takara Shuzo Co.，Ltd.供应)。另外，用1ng pEPI305作为模板、2.5μmol M13引物M3(由Takara Shuzo Co.，Ltd.供应)作为引物和2.5μmol寡核苷酸MUT300同样进行PCR。通过用Microspin柱S-400(由Pharmacia供应)进行凝胶过滤纯化每种反应溶液，以除去引物。

将1μl每种PCR溶液加入含有200μM dATP、200μM dCTP、200μM dGTP、200μM dTTP、50mM氯化钾和1.5mM氯化镁的95μl 100 mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.3)中。将混合物在94℃加热10分钟，然后在60分钟内冷却至37℃，在37℃保温15分钟，以形成异源双链。加入2.5单位Taq DNA聚合酶，在72℃下反应3分钟，以完成异源双链。随后，将2.5μmol M13引物RV和2.5μmol M13引物M3加入该反应溶液中，进行PCR反应，其中三步步骤-即在94℃下30秒、在55℃下2分钟和在72℃下3分钟，重复10次。

将第二个PCR产物用ClaI和BamHI剪切，然后用苯酚和氯仿的混合物抽提，用乙醇沉淀。将该DNA片断连接到用ClaI和BamHI剪切的pBluescript KS(+)上。用常规方法，用所得的质粒DNA转化大肠杆菌JM109(由Takara Shuzo Co.，Ltd.供应)。将其在含有100μg/ml的氨苄青霉素的L琼脂培养基上铺平板，以获得转化体。用碱细菌裂解法从转化体中制备质粒，测定碱基顺序，鉴定出目的碱基已被替代。用Sanger等人的方法[J.Mol.Biol.，143，161(1980)]，用Taq DyeDeoxyTerminator Cycle测序药盒(由Applied Biochemical供应)进行碱基顺序的测定。这样，产生编码突变型磷酸酶的突变型基因，其中成熟蛋白的第74位甘氨酸残基(GGG)用天冬氨酸残基(G^*A^*T)替代。该含突变型基因的质粒命名为pEPI310(实施例15)。

用已导入突变的质粒作为模板重复上述步骤，以累积性地导入位点专一性突变。用碱细菌裂解法从转化体中制备质粒，测定碱基顺序，鉴定出目的碱基已被替代。所得的编码突变型磷酸酶的突变型基因和突变位点示于表12中。突变位点中的氨基酸残基表示用SEQ ID NO：8表示的成熟蛋白的氨基酸顺序中的一个氨基酸残基。

表12

质粒名称	原材料	引物	突变位置和替代的氨基酸
质粒名称	原材料	引物	突变位置和替代的氨基酸	pEPI305	-		野生型
pEPI310	pEPI305	MUT300MUT310	74Gly(GGG)→Asp(G^A^T)	pEPI305	-		野生型
pEPI310	pEPI305	MUT300MUT310	74Gly(GGG)→Asp(G^A^T)	pEPI330	pEPI310	MUT300MUT320	74Gly(GGG)→Asp(G^A^T)153Ile(ATC)→Thr(A^*CC)
pEPI340	pEPI330	MUT300MUT330	63Leu(CTG)→Gln(C^AG)65Ala(GCG)→Gln(^C^AG)66Glu(GAA)→Ala(G^CA)74Gly(GGG)→Asp(G^A^T)153Ile(ATC)→Thr(A^*CC)	pEPI330	pEPI310	MUT300MUT320	74Gly(GGG)→Asp(G^A^T)153Ile(ATC)→Thr(A^*CC)
pEPI340	pEPI330	MUT300MUT330		pEPI350	pEPI340	MUT300MUT340	63Leu(CTG)→Gln(C^AG)65Ala(GCG)→Gln(^C^AG)66Glu(GAA)→Ala(G^CA)74Gly(GGG)→Asp(G^A^T)85Ser(TCC)→Tyr(T^AC)153Ile(ATC)→Thr(A^CC)
pEPI360	pEPI340	MUT300MUT350	63Leu(CTG)→Gln(C^AG)65Ala(GCG)→Gln(^C^AG)66Glu(GAA)→Ala(G^CA)74Gly(GGG)→Asp(G^A^T)135Thr(ACC)→Lys(A^A^A)136Glu(GAG)→Asp(GA^C)153Ile(ATC)→Thr(A^CC)	pEPI350	pEPI340	MUT300MUT340
pEPI360	pEPI340	MUT300MUT350		pEPI370	pEPI360	MUT300MUT360	63Leu(CTG)→Gln(C^AG)65Ala(GCG)→Gln(^C^AG)66Glu(GAA)→Ala(G^CA)69Asn(AAC)→Asp(^GAC)71Ser(AGC)→Ala(^G^CC)72Ser(AGT)→Ala(^G^CT)74Gly(GGG)→Asp(G^A^T)135Thr(ACC)→Lys(A^A^A)136Glu(GAG)→Asp(GA^C)153Ile(ATC)→Thr(A^*CC)
pEPI380	pEPI370	MUT300MUT370	63Leu(CTG)→Gln(C^AG)65Ala(GCG)→Gln(^C^AG)66Glu(GAA)→Ala(G^CA)69Asn(AAC)→Asp(^GAC)71Ser(AGC)→Ala(^G^CC)72Ser(AGT)→Ala(^G^CT)74Gly(GGG)→Asp(G^A^T)116Asp(GAT)→Glu(GA^A)135Thr(ACC)→Lys(A^A^A)136Glu(GAG)→Asp(GA^C)153Ile(ATC)→Thr(A^CC)	pEPI370	pEPI360	MUT300MUT360
pEPI380	pEPI370	MUT300MUT370		pEPI390	pEPI380	MUT300MUT380	63Leu(CTG)→Gln(C^AG)65Ala(GCG)→Gln(^C^AG)66Glu(GAA)→Ala(G^CA)69Asn(AAC)→Asp(^GAC)71Ser(AGC)→Ala(^G^CC)72Ser(AGT)→Ala(^G^CT)74Gly(GGG)→Asp(G^A^T)116Asp(GAT)→Glu(GA^A)130Ser(TCT)→Glu(^G^A^A)135Thr(ACC)→Lys(A^A^A)136Glu(GAG)→Asp(GA^C)153Ile(ATC)→Thr(A^*CC)
pEPI400	pEPI380	MUT300MUT390	63Leu(CTG)→Gln(C^AG)65Ala(GCG)→Gln(^C^AG)66Glu(GAA)→Ala(G^CA)69Asn(AAC)→Asp(^GAC)71Ser(AGC)→Ala(^G^CC)72Ser(AGT)→Ala(^G^CT)74Gly(GGG)→Asp(G^A^T)92Ala(GCC)→Ser(^A^GC)94Ala(GCG)→Glu(G^A^A)116Asp(GAT)→Glu(GA^A)135Thr(ACC)→Lys(A^A^A)136Glu(GAG)→Asp(GA^C)153Ile(ATC)→Thr(A^CC)	pEPI390	pEPI380	MUT300MUT380

导入含突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI330、大肠杆菌JM109/pEPI340、大肠杆菌JM109/pEPI350、大肠杆菌JM109/pEPI360、大肠杆菌JM109/pEPI370、大肠杆菌JM109/pEPI380、大肠杆菌JM109/pEPI390和大肠杆菌JM109/pEPI400以及已导入含有野生型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI305中的每一种接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素和1mM IPTG的50ml L培养基中，在37℃培养16小时。通过离心，从每个菌株的2L培养液中收集细胞，用生理盐水溶液洗涤1次。将细胞悬浮于50ml 100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，在4℃下超声处理20分钟以破碎细胞。离心如此处理的溶液，以除去不溶部分，制备无细胞提取物。用实施例4描述的方法，从每种无细胞提取物中纯化每种酸性磷酸酶。每种酶产物在SDS-聚丙烯酰胺电泳中都是均一的。

测定纯化的突变型酸性磷酸酶和野生型酸性磷酸酶转磷酸中的肌苷速度常数，结果示于表13中。我们发现，在实施例15中描述的、在大肠杆菌JM109/pEPI330中表达的提高核苷-5’-磷酸酯生产率的突变型酶，其Vmax降低，但它对肌苷的Km值大大降低，这意味着与在大肠杆菌JM109/pEPI305中表达的野生型酶相比，它对肌苷的亲和性增加2倍或2倍以上。这暗示着，该突变型酶的核苷-5’-磷酸酯的生产率大大提高，其原因不仅是因为其核苷酸酶活性降低，而且因为它对核苷的亲和性提高-这是一个重要因素。因此，我们预期，对核苷的亲和性提高导致生产率的提高。

在已导入本实施例中产生的新突变型酶基因的大肠杆菌JM109中表达的新突变型酶表现出对核苷的亲和性比在实施例15中描述的大肠杆菌JM109/pEPI330中表达酶的亲和性更高。因此，我们预计核苷-5’-磷酸酯的生产率提高。此外，在大肠杆菌JM109/pEPI380中表达的突变型酶与野生型酶相比，不仅提高了对核苷的亲和性，而且也提高了Vmax值。另外，我们预计核苷-5’-磷酸酯的生产率提高。

表13

具有酶的菌株 Km(mM) Vmax(单位/mg)大肠杆菌JM109/pEPI305 202 1.83大肠杆菌JM109/pEPI330 109 1.39大肠杆菌JM109/pEPI340 85 1.03大肠杆菌JM109/pEPI350 85 0.93大肠杆菌JM109/pEPI360 55 1.33大肠杆菌JM109/pEPI370 42 1.15大肠杆菌JM109/pEPI380 42 2.60大肠杆菌JM109/pEPI390 42 2.58大肠杆菌JM109/pEPI400 43 2.11实施例20

用含新的突变型酸性磷酸酶基因的菌株生产5’-肌苷酸

将已导入含有突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI330、大肠杆菌JM109/pEPI340、大肠杆菌JM109/pEPI360、大肠杆菌JM109/pEPI370和大肠杆菌JM109/pEPI380中的每一种接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的50ml L培养基中，在37℃培养16小时。

将焦磷酸(15g/dl)和8g/dl肌苷溶于乙酸盐缓冲液(pH4.0)中。在该溶液中加入已导入含有上述突变型酸性磷酸酶基因和野生型酸性磷酸酶基因的大肠杆菌JM109菌株，使得按照细胞干重计的细胞浓度达到200mg/dl。反应在35℃下进行32小时，同时将pH保持在4.0，在整个过程中测定形成的5’-肌苷酸的量。形成的肌苷酸只是5’-肌苷酸，根本没有观察到2’-肌苷酸和3’-肌苷酸副产物的生成。结果示于图8中。

实施例15中描述的大肠杆菌JM109/pEPI330显示大量积累5’-肌苷酸。尽管仍有底物，但当5’肌苷酸的积累量达到7.5g/dl时5’-肌苷酸的产生停止，5’-肌苷酸的量不再增加。相反，含有新的突变型酸性磷酸酶基因的菌株提供大量积累的5’-肌苷酸。尤其是，在使用大肠杆菌JM109/pEPI370和大肠杆菌JM109/pEPI380的反应中，提供更大量积累的5’-肌苷酸。此外，该反应速率高，表明5’-肌苷酸的生产率进一步大大提高。尤其是在大肠杆菌JM109/pEPI380中，反应速率高，表明相当高的反应性。实施例21

用含新的突变型酸性磷酸酶基因的菌株生产各种核苷-5’-磷酸酯

将已导入含有新的突变型酸性磷酸酶基因质粒的大肠杆菌JM109/pEPI380接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的50ml L培养基中，在37℃培养16小时。

将焦磷酸(15g/dl)和8g/dl作为磷酸基团受体的肌苷、鸟苷、尿苷或胞苷溶于100mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)中。加入上述菌株，使得按照细胞干重计的细胞浓度达到100mg/dl。反应在35℃下进行12小时，同时将pH保持在4.0。生成的核苷-5’-磷酸酯的量示于表14中。用任何核苷都能很好地进行转磷酸，生成并积累相应的核苷-5’-磷酸酯。生成的核苷酸只是核苷-5’-磷酸酯，根本没有观察到核苷-2’-磷酸酯和核苷-3’-磷酸酯副产物的生成。

表14

核苷产物产量

(g/dl)

肌苷 5’-肌苷酸 12.05

鸟苷 5’-鸟苷酸 5.78

尿苷 5’-尿苷酸 13.28

胞苷 5’-胞苷酸 10.65实施例22

用含新的突变型酸性磷酸酶基因的菌株和作为磷酸基团供体

的各种磷酸化合物生产5’-肌苷酸

将已导入含有新的突变型酸性磷酸酶基因的质粒的大肠杆菌JM109/pEPI380接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的50ml L培养基中，在37℃培养16小时。

将肌苷(6g/dl)和15g/dl三聚磷酸盐、多磷酸盐(“Polygon P”，Chiyoda Kagaku K.K.产品的商品名)、苯乙酸二钠或氨甲酰磷酸二钠溶于100mM乙酸盐缓冲液(pH4.0)中。加入上述菌株，使得按照细胞干重计的细胞浓度达到100mg/dl。反应在35℃下进行12小时，同时将pH保持在4.0。生成的5’-肌苷酸的量示于表15中。用任何磷酸基团供体，都非常有效地生成并积累5’-肌苷酸。尤其使用多磷酸盐作为磷酸基团供体时，积累最大量的5’-肌苷酸。

表15

磷酸基团供体生成的5’-肌苷酸

(g/dl)

三聚磷酸钠 10.84

多磷酸钠 13.35

苯乙酸二钠 12.84

氨甲酰磷酸二钠 12.42

乙酰磷酸钾锂 10.65实施例23：得自斯托氏普罗威登斯菌染色体的酸性磷酸酶基因的

分离和该基因核苷酸顺序的测定

分别合成具有顺序表的SEQ ID NO：19和20中描述的核苷酸顺序的寡核苷酸PRPl和PRP2。在斯托氏普罗威登斯菌酸性磷酸酶编码基因的已知核苷酸顺序(EMBL数据库登记号X64820)基础上，设计这些寡核苷酸来扩增斯托氏普罗威登斯菌的酸性磷酸酶编码基因。

按照Murray和Thomson(Nucl.Acid Res.，4321,8(1980))的方法，从培养的斯托氏普罗威登斯菌ATCC 29851的微生物细胞中提取染色体DNA。将染色体DNA(0.1ng)作为模板，寡核苷酸PRPl和PRP2(每种2.5μmol)作为引物以及Taq DNA聚合酶(2.5单位，由Takara Shuzo生产)加入含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP(每种200μM)、氯化钾(50mM)和氯化镁(1.5mM)的100mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.3，100μl)中，进行PCR反应，其中一个循环包括在94℃下30秒、在55℃下2分钟和在72℃下3分钟，重复该循环30次。该反应溶液经过琼脂糖凝胶电泳，然后借助于玻璃粉(由Takara Shuzo生产)回收大约为1kbp的扩增的DNA片断。该基因片断用BamHI降解，与用BamHI降解的pUC118连接。按上述方法获得的质粒命名为pPRP100。

测定导入pPRP100的转化体大肠杆菌JM109/pPRP100的磷酸单酯酶活性和转磷酸活性。结果，菌株表现出将磷酸转移到核苷的活性以及磷酸单酯酶活性。

按照碱裂解法，从大肠杆菌JM109/pPRP100转化体中提取质粒，以测定核苷酸顺序。一个测定的开放阅读框架的核苷酸顺序和从该核苷酸顺序得出的蛋白质的氨基酸顺序示于顺序表的SEQ ID NO：21和22中。开放阅读框架的核苷酸顺序与已知的斯托氏普罗威登斯菌酸性磷酸酶基因的核苷酸顺序完全吻合。

实施例24：得自产气肠杆菌、Planticola克雷伯氏杆菌

和Serratia ficaria染色体的酸性磷酸酶基因的

分离和这些基因的核苷酸顺序的测定

按照Murray和Thomson(Nucl.Acid Res.，4321,8(1980))的方法，从培养的产气肠杆菌IFO 12010、Klebsiella planticola IFO 14939和Serrtia ficaria IAM 13540的微生物细胞中提取染色体DNA。然后，按照实施例7(2)中描述的方法，构建包含大约20,000个大肠杆菌JM109转化体的染色体基因表达文库并进行筛选，获得表现转磷酸活性的转化体。我们认为这些转化体中的每个都包含得自每个原始菌株的酸性磷酸酶基因。

按照碱裂解法，从认为具有得自产气肠杆菌IFO 12010的酸性磷酸酶基因的一个大肠杆菌转化体中提取质粒DNA，分析质粒内插入的DNA。上述质粒命名为pENP100。得自产气肠杆菌IFO 12010的插入DNA的限制性内切酶图谱示于图9中。

通过亚克隆具体分析酸性磷酸酶基因区的结果显示，该酸性磷酸酶基因包含在用限制性内切酶SalI和KpnI剪切的1.6kbp片断中。然后，将该SalI-KpnI片断与用SalI和KpnI降解的pUC118连接，构建一个质粒。所得的质粒命名为pENP110。

按照上述步骤，按照碱裂解法从认为具有得自Klebsiella planticolaIFO 14939的酸性磷酸酶基因的一个大肠杆菌转化体中提取质粒DNA，分析质粒内插入的DNA。上述质粒命名为pKLP100。得自Klebsiella planticola IFO 14939的插入DNA的限制性内切酶图谱示于图10中。

通过亚克隆具体分析酸性磷酸酶基因区的结果显示，该酸性磷酸酶基因包含在用限制性内切酶KpnI和EcoRI剪切的2.2 kbp片断中。然后，将该KpnI-EcoRI片断与用KpnI和EcoRI降解的pUC118连接，构建一个质粒。所得的质粒命名为pKLP110。

同样地，按照碱裂解法，从认为具有得自Serrtia ficaria IAM 13540的酸性磷酸酶基因的一个大肠杆菌转化体中提取质粒DNA，分析质粒内插入的DNA。上述质粒命名为pSEP100。得自Serrtia ficaria IAM13540的插入DNA的限制性内切酶图谱示于图11中。

通过亚克隆具体分析酸性磷酸酶基因区的结果显示，该酸性磷酸酶基因包含在用限制性内切酶HindIII剪切的1.4kbp片断中。然后，将该HindIII片断与用HindIII降解的pUC118连接，构建一个质粒。所得的质粒命名为pSEP110。

然后，按照碱裂解法，从分别导入pENP110、pKLP110和pSEP110的转化体大肠杆菌JM109/pENP110、大肠杆菌JM109/pKLP110、大肠杆菌JM109/pSEP110中提取质粒DNA。按照实施例8描述的方法，测定这些质粒的插入核苷酸顺序。关于测定的插入的开放阅读框架的核苷酸顺序，产气肠杆菌IFO 12010的示于SEQID NO：23中，Klebsiella planticola IFO 14939的示于SEQ ID NO：25中，而Serrtia ficaria IAM 13540的示于SEQ ID NO：27中。另外，得出的氨基酸顺序分别示于SEQ ID NO：24、26和28中。因为包含这些质粒(含有这些片断)的转化体表现出转磷酸活性，因此鉴定出这些开放阅读框架为目的酸性磷酸酶基因。

分别比较核苷酸顺序和得出的氨基酸顺序与已知顺序的同源性。使用EMBL和SWISS-PROT的数据库。结果揭示出，在顺序表SEQ ID NO：23、25和27中描述的基因是新基因。我们假定由得自产气肠杆菌IFO 12010的基因编码的蛋白质包含248个氨基酸残基，得自Klebsiella planticola IFO 14939的基因编码的蛋白质包含248个氨基酸残基。而得自Serrtia ficaria IAM 13540的基因编码的蛋白质包含244个氨基酸残基。一个可能性是，这些蛋白质可能同得自摩氏摩根氏菌和Esherichia blattae的酸性磷酸酶一样，为前体蛋白。

从核苷酸顺序得出的氨基酸顺序以及在实施例8中获得的得自摩氏摩根氏菌NCIMB 10466酸性磷酸酶得出的氨基酸顺序、在实施例12中获得的得自Esherichia blattae JCM 1650酸性磷酸酶得出的氨基酸顺序以及斯托氏普罗威登斯菌的酸性磷酸酶的已知氨基酸顺序(EMBL登记号X64820)一起，示于图12中，用一个字母表示一个氨基酸残基。在所有氨基酸顺序中相同的氨基酸残基在图12的顺序下用星号表示。

如图12所示，得自6个菌株的酸性磷酸酶的氨基酸顺序相互高度同源，在所有氨基酸顺序中，130个氨基酸残基是相同的。因此，我们假定这些酸性磷酸酶具有相似的功能。

实施例25：通过表达得自产气肠杆菌、Klebsiella planticola

和Serratia ficaria的酸性磷酸酶基因放大活性

将实施例23中构建的大肠杆菌JM109/pPRP100、实施例24中构建的大肠杆菌JM109/pENP110、大肠杆菌JM109/pKLP110和大肠杆菌JM109/pSEP110接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的L培养基(50ml)中，在37℃培养16小时。通过离心，从这些培养物中收获微生物细胞，用生理盐水洗涤1次。将微生物细胞悬浮于100mM磷酸钾缓冲液(5ml，pH7.0)中，通过在4℃下超声处理20分钟破碎细胞。离心处理后的溶液，以除去不溶部分，由此制备无细胞提取物。

测定获得的无细胞提取物的转磷酸活性，同时使用的对照是从斯托氏普罗威登斯菌ATCC 29851、产气肠杆菌IFO 12010、Klebsiellaplanticola IFO 14939、Serrtia ficaria IAM 13540和按上述相同方法用质粒pUC118转化的大肠杆菌JM109。结果示于表16中。在所有野生型菌株中，转磷酸活性都低。在大肠杆菌JM109/pUC118中没有检测到转磷酸活性。另一方面，与野生型菌株相比，导入酸性磷酸酶基因的所有大肠杆菌JM109转化体表现出高转磷酸活性。按照该结果，证明每个导入的DNA片断都使得大肠杆菌高水平地表达酸性磷酸酶。

表16

微生物菌株转磷酸活性

(单位/mg)

斯托氏普罗威登斯菌ATCC 29851 0.005

产气肠杆菌IFO 12010 0.002

Klebsiella planticola IFO 14939 0.002

Serrtia ficaria IAM 13540 0.001

大肠杆菌JM109/pUC118 未检测到

大肠杆菌JM109/pPRP100 0.833

大肠杆菌JM109/pENP110 0.301

大肠杆菌JM109/pKLP110 0.253

大肠杆菌JM109/pSEP110 0.123实施例26

温度稳定性提高的突变型酸性磷酸酶基因的制备

如实施例20、21和22所描述的，实施例19中产生的含得自blattae埃希氏杆菌的突变型酸性磷酸酶基因的菌株表达相当量的酸性磷酸酶。在用该菌株由焦磷酸和肌苷生产5’-肌苷酸的过程中，以高转化率生成并积累5’-肌苷酸。该酸性磷酸酶的最适反应温度为35℃。然而，该反应在较高温度下进行时，反应速率增加，在反应溶液中增加磷酸受体核苷的浓度时，进行该反应。因此，我们预计，核苷-5’-磷酸酯在较短时间内可以更高效地生产。因此，通过用PCR位点专一性突变法，将突变导入实施例19中克隆的得自Esherichia blattae的酸性磷酸酶基因时，提高了该酶的温度稳定性。

使用含有实施例19中描述的得自Esherichia blattae JCM1650的突变型酸性磷酸酶编码基因的质粒pEPI380，用遗传工程法，将位点专一性突变导入该质粒DNA中，产生温度稳定性提高的突变型酸性磷酸酶的编码基因。pEPI380是通过将含有得自Esherichia blattae JCM1650的突变型酸性磷酸酶编码基因、用限制性内切酶ClaI和BamHI剪切的2.4kbp DNA片断与用ClaI和BamHI剪切的pBluescript KS(+)(由Stratagene生产)连接而得到的质粒DNA。由该酸性磷酸酶编码基因的碱基顺序得出的成熟蛋白的氨基酸顺序推测为实施例19的表12中所示的11个氨基酸残基，用顺序表的SEQ ID NO：8的顺序来表示。

用磷酰胺化物法，使用DNA合成仪(Applied Biosystems供应的394型)合成具有顺序表中所示顺序的寡核苷酸MUT300(顺序表中的SEQID NO：9)、MUT400(顺序表中的SEQ ID NO：29)和MUT410(顺序表中的SEQ ID NO：30)。

用PCR法按实施例15的方法，使用实施例19描述的pEPI380作为模板，用MUT300和MUT410作为引物导入突变，产生编码突变型磷酸酶的突变型基因，其中成熟蛋白的第104位谷氨酸残基(GAG)用甘氨酸残基(GG^*T^*)替代。含有该突变型基因的质粒命名为pEPI410。同样地，使用pEPI380作为模板，用MUT300、MUT310和MUT420作为引物导入突变，产生编码突变型磷酸酶的突变型基因，其中第151位苏氨酸残基(ACC)用丙氨酸残基(G^*CC)替代。含有该突变型基因的质粒命名为pEPI420。

从导入含有突变型型磷酸酶基因的质粒pEPI410和pEPI420的大肠杆菌JM109转化体中，用碱细菌裂解法制备质粒，测定碱基顺序，鉴定出目的碱基己被替代。

将导入本实施例中制备的突变型酸性磷酸酶基因的大肠杆菌JM109/pEPI410和大肠杆菌JM109/pEPI420和实施例19中描述的大肠杆菌JM109/pEPI380中的每一种接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的50ml L培养基中，在37℃培养16小时。从每个菌株的50ml培养液中收获细胞，用生理盐水溶液洗涤1次。将这些细胞悬浮于5ml 100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，在4℃下超声处理20分钟，以破碎细胞。离心如此处理的溶液，以除去不溶部分，制备无细胞提取物。

从每个菌株制备的无细胞提取物在0-80℃、pH7.0下保温30分钟。保温完成后，在pH4.0、30℃下的标准反应条件下，用在不同温度下处理的无细胞提取物进行转磷酸，测定残留活性。结果示于图13中。在实施例19中描述的大肠杆菌JM109/pEPI380中表达的突变型酶在40℃30分钟的处理中稳定，但在较高温度下观察到其活性的降低。相反，在导入本实施例中产生的新突变型酶基因的大肠杆菌JM109/pEPI410和大肠杆菌JM109/pEPI420中表达的新突变型酶提高了温度稳定性，即使在50℃处理30分钟，也没有观察到活性的降低。因此我们预计，使用这些菌株在高温下生产核苷-5’-磷酸酯时，生产率进一步提高。实施例27

用含有温度稳定性提高的突变型酸性磷酸酶基因的菌株

生产5’-肌苷酸和5’-鸟苷酸

将已导入突变型酸性磷酸酶基因的大肠杆菌JMI09/pEPI410和大肠杆菌JM109/pEPI420和实施例19中描述的大肠杆菌JM109/pEPI380中的每一种接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的50ml L培养基中，在37℃培养16小时。

将焦磷酸(15g/dl)和8g/dl肌苷或鸟苷溶于乙酸盐缓冲液(pH4.0)中。加入已导入每种突变型酸性磷酸酶基因的大肠杆菌JM109菌株，使得按照细胞干重计的细胞浓度达到100mg/dl。反应在50℃下进行9小时，同时将pH保持在4.0，测定生成的5’-肌苷酸或5’-鸟苷酸的量。结果示于表17中。生成的核苷磷酸酯只有核苷-5’-磷酸酯，根本没有观察到核苷-2’-磷酸酯和核苷-3’-磷酸酯副产物的产生。反应也在35℃下进行12小时，用大肠杆菌JM109/pEPI380菌株作为对照。结果也示于表17中。

如实施例21所述，用大肠杆菌JM109/pEPI380高效地生成并积累核苷-5’-磷酸酯。相反，用导入了实施例26制备的得自Esherichiablattae的新突变型酸性磷酸酶基因的大肠杆菌JM109/pEPI410和大肠杆菌JM109/pEPI420进行反应，在较短时间内生成并积累等量的5’-肌苷酸或5’-鸟苷酸。因此，可以更有效地生产核苷-5’-磷酸酯。尤其当使用大肠杆菌JM109/pEPI420时，不仅反应时间缩短，而且大量积累5’-肌苷酸和5’-鸟苷酸，表现出相当高的生产率。

表17

菌株	反应温度(℃)	反应时间(hr)	生成的5’-肌苷酸的量(g/dl)	生成的5’-鸟苷酸的量(g/dl)
菌株	反应温度(℃)	反应时间(hr)	生成的5’-肌苷酸的量(g/dl)	生成的5’-鸟苷酸的量(g/dl)	大肠杆菌JM109/pEPI380	30	12	12.05	5.78
大肠杆菌JM109/pEPI410	50	9	11.85	5.80	大肠杆菌JM109/pEPI380	30	12	12.05	5.78
大肠杆菌JM109/pEPI410	50	9	11.85	5.80	大肠杆菌JM109/pEPI420	50	9	12.60	6.11

图1描述了反应pH和在用得自摩氏摩根氏菌的酶进行的反应中5’-肌苷酸的产生量之间的关系。

图2描述了反应pH和在用得自Esherichia blattae的酶进行的反应中5’-肌苷酸的产生量之间的关系。

图3描述了含有酸性磷酸酶编码基因的摩氏摩根氏菌染色体DNA片断的限制性内切酶图谱。

图4描述了在用包含得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶基因的菌株进行的反应中5’-肌苷酸的产生量。

图5描述了含有酸性磷酸酶编码基因的Esherichia blattae染色体DNA片断的限制性内切酶图谱。

图6描述的图表示在用包含得自Esherichia blattae的酸性磷酸酶基因的菌株进行的反应中5’-肌苷酸的产生量。

图7分别描述了在用包含野生型酸性磷酸酶基因的菌株和包含得自Esherichia blattae的突变型酸性磷酸酶基因的菌株进行的反应中5’-肌苷酸的产生量。

图8描述了在用包含得自Esherichia blattae的新突变型酸性磷酸酶基因的菌株进行的反应中5’-肌苷酸的产生量。

图9描述了含有酸性磷酸酶编码基因、得自产气肠杆菌的染色体DNA片断的限制性内切酶图谱。

图10描述了含有酸性磷酸酶编码基因、得自Planticola克雷伯氏杆菌的染色体DNA片断的限制性内切酶图谱。

图11描述了含有酸性磷酸酶编码基因、得自Serratia ficaria的染色体DNA片断的限制性内切酶图谱。

图12描述了由得自摩氏摩根氏菌、Esherichia blattae、斯托氏普罗威登斯菌、产气肠杆菌、Planticola克雷伯氏杆菌和Serratia ficaria的酸性磷酸酶的核苷酸顺序得出的氨基酸顺序，用一个字母表示一个氨基酸残基。这些氨基酸顺序在顿序表的SEQ ID NO：4、8、22、24、26和28中进行了描述，用三个字母表示一个氨基酸残基。在该图中，在所有氨基酸顺序中相同的氨基酸残基在顺序下用*标记。

图13描述了在从包含得自Esherichia blattae的新突变型酸性磷酸酶基因的菌株中制备的无细胞提取物中，酸性磷酸酶活性的温度稳定性曲线。

顺序表

SEQ ID NO：1的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：20个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：多肽

(v)蛋白质片断类型：N-末端

(vi)来源：

(A)有机体：摩氏摩根氏菌

(B)菌株：NICMB 10466

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：1：Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr1 5 10 15Leu Lys Asn Glu

20

SEQ ID NO：2的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：750个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(vi)来源：

(A)有机体：摩氏摩根氏菌

(B)菌株：NICMB 10466

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1...747

(ix)特征：

(A)名称/关键词：信号肽

(B)位置：1...60

(ix)特征：

(A)名称/关键词：成熟多肽

(B)位置：61...747

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：2：ATG AAG AAG AAT ATT ATC GCC GGT TGT CTG TTC TCA CTG TTT TCC CTT 48Met Lys Lys Asn Ile Ile Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu-20 -15 -10 -5TCC GCG CTG GCC GCG ATC CCG GCG GGC AAC GAT GCC ACC ACC AAG CCG 96Ser Ala Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro

1 5 10GAT TTA TAT TAT CTG AAA AAT GAA CAG GCT ATC GAC AGC CTG AAA CTG 144Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu

15 20 25TTA CCG CCA CCG CCG GAA GTC GGC AGT ATT CAG TTT TTA AAT GAT CAG 192Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln

30 35 40GCA ATG TAT GAG AAA GGC CGT ATG CTG CGC AAT ACC GAG CGC GGA AAA 240Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys45 50 55 60CAG GCA CAG GCA GAT GCT GAC CTG GCC GCA GGG GGT GTG GCA ACC GCA 288Gln Ala Gln Ala Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala

65 70 75TTT TCA GGG GCA TTC GGC TAT CCG ATA ACC GAA AAA GAC TCT CCG GAG 336Phe Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu

80 85 90CTG TAT AAA CTG CTG ACC AAT ATG ATT GAG GAT GCC GGT GAT CTT GCC 384Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala

95 100 105ACC CGC TCC GCC AAA GAA CAT TAC ATG CGC ATC CGG CCG TTT GCG TTT 432Thr Arg Ser Ala Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe

110 115 120TAC GGC ACA GAA ACC TGT AAT ACC AAA GAT CAG AAA AAA CTC TCC ACC 480Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr125 130 135 140AAC GGA TCT TAC CCG TCA GGT CAT ACG TCT ATC GGC TGG GCA ACC GCA 528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala

145 150 155CTG GTG CTG GCG GAA GTG AAC CCG GCA AAT CAG GAT GCG ATT CTG GAA 576Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu

160 165 170CGG GGT TAT CAG CTC GGA CAG AGC CGG GTG ATT TGC GGC TAT CAC TGG 624Arg Gly Tyr Gln Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp

175 180 185CAG AGT GAT GTG GAT GCC GCG CGG ATT GTC GGT TCA GCC GCT GTC GCG 672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala

190 195 200ACA TTA CAT TCC GAT CCG GCA TTT CAG GCG CAG TTA GCG AAA GCC AAA 720Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys205 210 215 220CAG GAA TTT GCA CAA AAA TCA CAG AAA TAA 750Gln Glu Phe Ala Gln Lys Ser Gln Lys

225 229SEQ ID NO：3的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：249个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)有机体：摩氏摩根氏菌

(B)菌株：NICMB 10466

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：3：Met Lys Lys Asn Ile Ile Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu-20 -15 -10 -5Ser Ala Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro

1 5 10Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Ash Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu

15 20 25Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln

30 35 40Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys45 50 55 60Gln Ala Gln Ala Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala

65 70 75Phe Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu

80 85 90Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala

95 100 105Thr Arg Ser Ala Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe

110 115 120Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr125 130 135 140Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala

145 150 155Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu

160 165 170Arg Gly Tyr Gln Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp

175 180 185Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala

190 195 200Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys205 210 215 220Gln Glu Phe Ala Gln Lys Ser Gln Lys

225 229SEQ ID NO：4的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：229个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)有机体：摩氏摩根氏菌

(B)菌株 NICMB 10466(xi)顺序描述：SEQ ID NO：4：Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr1 5 10 15Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu Leu Pro Pro Pro

20 25 30Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln Ala Met Tyr Glu

35 40 45Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Gln Ala Gln Ala

50 55 60Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala Phe Ser Gly Ala65 70 75 80Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu Leu Tyr Lys Leu

85 90 95Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala

100 105 110Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Gly Thr Glu

115 120 125Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr Asn Gly Ser Tyr

130 135 140Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala145 150 155 160Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu Arg Gly Tyr Gln

165 170 175Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser Asp Val

180 185 190Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala Thr Leu His Ser

195 200 205Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys Gln Glu Phe Ala

210 215 220Gln Lys Ser Gln Lys225 229SEQ ID NO：5的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：15个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：多肽

(v)蛋白质片断类型：N-末端

(vi)来源：

(A)有机体 Esherichia blattae

(B)菌株：JCM 1650

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：5：Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro Asp Leu1 5 10 15SEQ ID NO：6的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：750个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(vi)来源：

(A)有机体：Esherichia blattae

(B)菌株：JCM 1650

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1...747

(ix)特征：

(A)名称/关键词：信号肽

(B)位置：1...54

(ix)特征：

(A)名称/关键词：成熟多肽

(B)位置：55...747

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：6：ATG AAA AAA CGT GTT CTG GCA GTT TGT TTT GCC GCA TTG TTC TCT TCT 48Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser-18 -15 -10 -5CAG GCC CTG GCG CTG GTC GCT ACC GGC AAC GAC ACT ACC ACG AAA CCG 96Gln Ala Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro

1 5 10GAT CTC TAC TAC CTC AAG AAC AGT GAA GCC ATT AAC AGC CTG GCG CTG 144Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu15 20 25 30TTG CCG CCA CCA CCG GCG GTG GGC TCC ATT GCG TTT CTC AAC GAT CAG 192Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln

35 40 45GCC ATG TAT GAA CAG GGG CGC CTG CTG CGC AAC ACC GAA CGC GGT AAG 240Ala Mer Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys

50 55 60CTG GCG GCG GAA GAT GCA AAC CTG AGC AGT GGC GGG GTG GCG AAT GCT 288Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala

65 70 75TTC TCC GGC GCG TTT GGT AGC CCG ATC ACC GAA AAA GAC GCC CCG GCG 336Phe Ser Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala

80 85 90CTG CAT AAA TTA CTG ACC AAT ATG ATT GAG GAC GCC GGG GAT CTG GCG 384Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala95 100 105 110ACC CGC AGC GCG AAA GAT CAC TAT ATG CGC ATT CGT CCG TTC GCG TTT 432Thr Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe

115 120 125TAT GGG GTC TCT ACC TGT AAT ACC ACC GAG CAG GAC AAA CTG TCC AAA 480Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys

130 135 140AAT GGC TCT TAT CCG TCC GGG CAT ACC TCT ATC GGC TGG GCT ACT GCG 528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala

145 150 155CTG GTG CTG GCA GAG ATC AAC CCT CAG CGC CAG AAC GAG ATC CTG AAA 576Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys

160 165 170CGC GGT TAT GAG CTG GGC CAG AGC CGG GTG ATT TGC GGC TAC CAC TGG 624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp175 180 185 190CAG AGT GAT GTG GAT GCC GCG CGG GTA GTG GGA TCT GCC GTT GTG GCG 672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala

195 200 205ACC CTG CAT ACC AAC CCG GCG TTC CAG CAG CAG TTG CAG AAA GCG AAG 720Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys

210 215 220GCC GAA TTC GCC CAG CAT CAG AAG AAA TAA 750Ala Glu Phe Ala Gln His Gln Lys Lys

225 230

SEO ID NO：7的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：249个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)有机体：Esherichia blattae

(B)菌株：JCM 1650

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：7：Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser-18 -15 -10 -5Gln Ala Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro

1 5 10Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu15 20 25 30Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln

35 40 45Ala Met Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys

50 55 60Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala

65 70 75Phe Ser Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala

80 85 90Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala95 100 105 110Thr Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe

115 120 125Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys

130 135 140Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala

145 150 155Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys

160 165 170Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp175 180 185 190Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala

195 200 205Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gin Lys Ala Lys

210 215 220Ala Glu Phe Ala Gln His Gln Lys Lys

225 230

SEQ ID NO：8的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：231个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)有机体：Esherichia blattae

(B)菌株：JCM 1650

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：8：Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro Asp Leu1 5 10 15Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu Leu Pro

20 25 30Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln Ala Met

35 40 45Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Leu Ala

50 55 60Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala Phe Ser65 70 75 80Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala Leu His

85 90 95Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg

100 105 110Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Gly

115 120 125Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys Asn Gly

130 135 140Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val145 150 155 160Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys Arg Gly

165 170 175Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser

180 185 190Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala Thr Leu

195 200 205His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys Ala Glu

210 215 220Phe Ala Gln His Gln Lys Lys225 230

SEQ ID NO：9的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它DNA...合成DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：9：CCTCGAGGTC GACGGTATCG 20

SEQ ID NO：10的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它DNA...合成DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：是

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：10：ATTCGCCACA TCGCCACTGC T 21

SEQ ID NO：11的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它DNA...合成DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：11：TAGCCCAGCC GGTAGAGGTA TGSEQ ID NO：12的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它DNA...合成DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)顺序描述： SEQ ID NO：12：TGCATCTGCC TGCGCCTGCT TACSEQ ID NO：13的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它DNA...合成DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：13：AACGCGCCGT AGAAAGCATTSEQ ID NO：14的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它DNA...合成DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：14：GTCCTGGTCT TTGGTATTAC ASEQ ID NO：15的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它DNA...合成DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：15：CACATCGCCA GCGGCCAGGT CTGCATSEQ ID NO：16的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它DNA...合成DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：16：GCATATAGTG TTCTTTCGCG CSEQ ID NO：17的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它DNA...合成DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：17：ATTACAGGTT TCGACCCCAT AASEQ ID NO：18的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：25个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它DNA...合成DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：18：TGATGCATGT CCGGGCTGTC TTTTTSEQ ID NO：19的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：25个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它DNA...合成DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：是

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：19：CTGGATCCTG TGGCTATCAT CACCT 25SEQ ID NO：20的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：25个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它DNA...合成DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：20：CTGGATCCGA CGCGATTTTA CCATA 25SEQ ID NO：21的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：747个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(vi)来源：

(A)有机体：斯托氏普罗威登斯菌

(B)菌株：ATCC29851

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1...744

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：21：ATG AAA AAA CTA TTA GCA GTA TTC TGC GCA GGG GCT TTT GTT TCA ACC 48Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr1 5 10 15AGT GTA TTT GCG GCG ATC CCT CCC GGC AAT GAT GTG ACA ACT AAA CCC 96Ser Val Phe Ala Ala Ile Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro

20 25 30GAT CTT TAT TAT TTA AAA AAC TCA CAG GCT ATT GAT AGT TTA GCG TTA 144Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu

35 40 45TTG CCG CCA CCA CCT GAA GTG GGC AGT ATC TTA TTT TTA AAC GAC CAA 192Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Leu Phe Leu Asn Asp Gln

50 55 60GCG ATG TAT GAA AAA GGC CGT TTA TTG CGA AAT ACT GAG CGT GGA GAA 240Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Glu65 70 75 80CAA GCC GCT AAG GAT GCT GAT CTG GCT GCG GGC GGT GTT GCG AAC GCA 288Gln Ala Ala Lys Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala

85 90 95TTT TCT GAA GCT TTT GGT TAT CCC ATT ACC GAA AAG GAT GCG CCT GAA 336Phe Ser Glu Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Glu

100 105 110ATT CAT AAA TTG CTG ACG AAT ATG ATT GAA GAT GCG GGG GAT TTA GCA 384Ile His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala

115 120 125ACT CGC TCA GCC AAA GAG AAA TAC ATG CGC ATT CGT CCA TTT GCG TTC 432Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe

130 135 140TAC GGT GTT GCT ACC TGT AAC ACG AAA GAT CAG GAC AAA TTA TCT AAG 480Tyr Gly Val Ala Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Asp Lys Leu Ser Lys145 150 155 160AAT GGC TCT TAT CCT TCT GGA CAC ACC GCA ATT GGC TGG GCA TCT GCA 528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ala Ile Gly Trp Ala Ser Ala

165 170 175CTC GTA TTG TCA GAA ATT AAC CCA GAA AAC CAA GAT AAA ATT TTA AAA 576Leu Val Leu Ser Glu Ile Asn Pro Glu Asn Gln Asp Lys Ile Leu Lys

180 185 190CGT GGT TAT GAA CTT GGC CAA AGC CGA GTC ATC TGT GGT TAC CAT TGG 624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp

195 200 205CAA AGT GAT GTT GAT GCA GCT CGT ATC GTT GCA TCG GGT GCG GTA GCA 672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Ala Ser Gly Ala Val Ala

210 215 220ACT TTA CAC TCC AAC CCT GAA TTC CAA AAA CAG TTA CAA AAA GCC AAA 720Thr Leu His Ser Asn Pro Glu Phe Gln Lys Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240GAC GAA TTT GCT AAA CTG AAA AAA TAG 747Asp Glu Phe Ala Lys Leu Lys Lys

245

SEQ ID NO：22的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：248个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)有机体：斯托氏普罗威登斯菌

(B)菌株：ATCC 29851

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：22：Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr 1 5 10 15Ser Val Phe Ala Ala Ile Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro

20 25 30Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu

35 40 45Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Leu Phe Leu Asn Asp Gln

50 55 60Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Glu65 70 75 80Gln Ala Ala Lys Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala

85 90 95Phe Ser Glu Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Glu

100 105 110Ile His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala

115 120 125Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe

130 135 140Tyr Gly Val Ala Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Asp Lys Leu Ser Lys145 150 155 160Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ala Ile Gly Trp Ala Ser Ala

165 170 175Leu Val Leu Ser Glu Ile Asn Pro Glu Asn Gln Asp Lys Ile Leu Lys

180 185 190Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp

195 200 205Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Ala Ser Gly Ala Val Ala

210 215 220Thr Leu His Ser Asn Pro Glu Phe Gln Lys Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240Asp Glu Phe Ala Lys Leu Lys Lys

245

SEQ ID NO：23的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：744个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(vi)来源：

(A)有机体：产气肠杆菌

(B)菌株：IFO 12010

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B) 位置：1...744

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：23：ATG AAA AAG CGC GTT CTC GCC CTC TGC CTC GCC AGC CTG TTT TCC GTT 48Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val1 5 10 15AAC GCT TTC GCG CTG GTC CCT GCC GGC AAT GAT GCA ACC ACC AAA CCG 96Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro

20 25 30GAT CTC TAT TAT CTG AAA AAT GCA CAG GCC ATC GAT AGT CTG GCG CTG 144Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu

35 40 45TTG CCG CCG CCG CCG GAA GTT GGC AGC ATC GCA TTT TTA AAC GAT CAG 192Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln

50 55 60GCG ATG TAT GAG AAA GGA CGG CTG TTG CGC AAT ACC GAA CGT GGC AAG 240Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys65 70 75 80CTG GCG GCT GAA GAT GCT AAC CTG AGC GCC GGC GGC GTC GCG AAT GCC 288Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala

85 90 95TTC TCC AGC GCT TTT GGT TCG CCC ATC ACC GAA AAA GAC GCG CCG CAG 336Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gln

100 105 1l0TTA CAT AAG CTG CTG ACA AAT ATG ATT GAG GAT GCC GGC GAT CTG GCC 384Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala

115 120 125ACC CGC AGC GCG AAA GAG AAA TAT ATG CGC ATT CGC CCG TTT GCG TTC 432Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe

130 135 140TAC GGC GTT TCA ACC TGT AAC ACT ACC GAG CAG GAC AAG CTG TCG AAA 480Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys145 150 155 160AAC GGA TCT TAC CCT TCC GGC CAT ACC TCT ATC GGT TGG GCA ACC GCG 528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala

165 170 175CTG GTA CTG GCG GAG ATC AAT CCG CAG CGG CAA AAC GAA ATT CTC AAA 576Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys

180 185 190CGC GGC TAT GAA TTG GGC GAA AGC CGG GTT ATC TGC GGC TAT CAT TGG 624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp

195 200 205CAG AGC GAT GTC GAT GCG GCG CGG ATA GTC GGC TCG GCG GTG GTG GCG 672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala

210 215 220ACC CTG CAT ACC AAC CCG GCC TTC CAA CAG CAG TTG CAG AAA GCA AAG 720Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240GAT GAA TTC GCC AAA ACG CAG AAG TAA 747Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gln Lys

245

SEQ ID NO：24的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：248个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)有机体：产气肠杆菌

(B)菌株：IFO 12010

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：24：Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val1 5 10 15Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro

20 25 30Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu

35 40 45Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln

50 55 60Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys65 70 75 80Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala

85 90 95Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gln

100 105 110Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala

115 120 125Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe

130 135 140Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys145 150 155 160Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala

165 170 175Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys

180 185 190Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp

195 200 205Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala

210 215 220Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gln Lys

245SEQ ID NO：25的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：747个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(vi)来源：

(A)有机体：Klebsiella planticola

(B)菌株：IFO 14939

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1...747

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：25：ATG AAA AAG CGT GTA CTC GCC CTT TGC CTT GCC AGC CTC TTT TCA GTT 48Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val1 5 10 15AGC GCC TTT GCG CTG GTT CCC GCC GGC AAT GAT GCC ACC ACC AAG CCC 96Ser Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro

20 25 30GAT CTC TAC TAT CTG AAA AAT GCC CAG GCC ATT GAC AGC CTG GCG CTG 144Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu

35 40 45TTG CCA CCG CCG CCG GAA GTG GGC AGC ATT GCG TTT TTA AAC GAT CAG 192Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln

50 55 60GCG ATG TAT GAG AAA GGC CGT CTG CTG CGC GCC ACC GCC CGC GGC AAG 240Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Ala Thr Ala Arg Gly Lys65 70 75 80TTG GCG GCA GAA GAT GCC AAC CTG AGC GCG GGT GGC GTG GCC AAC GCC 288Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala

85 90 95TTC TCC GCA GCA TTC GGC TCC CCG ATC AGC GAA AAA GAC GCC CCG GCG 336Phe Ser Ala Ala Phe Gly Ser Pro Ile Ser Glu Lys Asp Ala Pro Ala

100 105 110CTG CAC AAA CTG CTC ACC AAC ATG ATT GAA GAC GCG GGC GAT CTG GCG 384Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala

115 120 125ACC CGA GGC GCG AAA GAG AAG TAT ATG CGT ATT CGT CCG TTT GCC TTC 432Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe

130 135 140TAC GGC GTG TCC ACC TGC AAT ACC ACC GAA CAG GAT AAG CTG TCG AAA 480Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys145 150 155 160AAC GGC TCC TAC CCT TCC GGA CAC ACC TCT ATC GGC TGG GCG ACC GCC 528Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala

165 170 175CTG GTG CTG GCC GAA ATC AAC CCG CAG CGC CAG AAT GAG ATT CTC AAG 576Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys

180 185 190CGC GGC TAT GAG CTC GGT GAA AGT CGG GTG ATC TGC GGT TAC CAC TGG 624Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp

195 200 205CAG AGC GAT GTT GAC GCC GCG CGG ATT GTC GGC TCG GCG GTG GTT GCA 672Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala

210 215 220ACC CTG CAT ACC AAT CCG GCC TTC CAG CAG CAG CTG CAA AAA GCC AAA 720Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240GAC GAG TTT GCG AAA CAG CAG AAA TAG 747Asp Glu Phe Ala Lys Gln Gln Lys

245

SEQ ID NO：26的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：248个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)有机体：Klebsiella planticola

(B)菌株：IFO 14939

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：26：Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val1 5 10 15Ser Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro

20 25 30Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu

35 40 45Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln

50 55 60Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Ala Thr Ala Arg Gly Lys65 70 75 80Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala

85 90 95Phe Ser Ala Ala Phe Gly Ser Pro Ile Ser Glu Lys Asp Ala Pro Ala

100 105 110Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala

115 120 125Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe

165 170 175Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys

180 185 190Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp

195 200 205Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala

210 215 220Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys225 230 235 240Asp Glu Phe Ala Lys Gln Gln Lys

245

SEQ ID NO：27的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：735个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(vi)来源：

(A)有机体：Serratia ficartia

(B)菌株：IAM 13540

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1...732

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：27：ATG AAA AAA ATA TTA TTA GCC ACA TTA AGC TGC GCC GCG TTG ACG CAG 48Met Lys Lys Ile Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gln1 5 10 15TTT TCC TTT GCC GCC AAA GAT GTC ACT ACC CAC CCT GAG GTT TAT TTT 96Phe Ser Phe Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr His Pro Glu Val Tyr Phe

20 25 30CTG CAA GAA TCA CAG TCC ATC GAC AGC CTG GCA CTA TTG CCG CCG CCG 144Leu Gln Glu Ser Gln Ser Ile Asp Ser Leu Ala Leu Leu Pro Pro Pro

35 40 45CCG GCG ATG GAC AGC ATT GAT TTC CTG AAT GAC AAA GCG CAA TAC GAC 192Pro Ala Met Asp Ser Ile Asp Phe Leu Asn Asp Lys Ala Gln Tyr Asp

50 55 60GCC GGG AAA ATA GTG CGC AAT ACT CCG CGT GGC AAG CAG GCT TAT GAT 240Ala Gly Lys Ile Val Arg Asn Thr Pro Arg Gly Lys Gln Ala Tyr Asp 65 70 75 80GAC GCC CAC GTT GCC GGG GAC GGC GTT GCC GCC GCA TTT TCC AAC GCC 288Asp Ala His Val Ala Gly Asp Gly Val Ala Ala Ala Phe Ser Asn Ala

85 90 95TTC GGC CTA GAA ATA GCC CAA CGG AAA ACG CCG GAG CTG TTT AAG CTG 336Phe Gly Leu Glu Ile Ala Gln Arg Lys Thr Pro Glu Leu Phe Lys Leu

100 105 110GTG ATG AAA ATG CGT GAA GAC GCC GGC GAT TTG GCG ACC CGC AGC GCC 384Val Met Lys Met Arg Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala

115 120 125AAA AAT CAC TAT ATG CGC ATT CGC CCC TTT GCG TTT TAT AAC GAA GCG 432Lys Asn His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Asn Glu Ala

130 135 140ACC TGC CGA CCG GAC GAA GAA AGC ACC CTG TCG AAG AAC GGT TCT TAC 480Thr Cys Arg Pro Asp Glu Glu Ser Thr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Tyr145 150 155 160CCT TCC GGC CAT ACC ACC ATC GGC TGG GCG ACC GCG CTG GTG CTG GCT 528Pro Ser Gly His Thr Thr Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala

165 170 175GAA ATC AAC CCC GCC AGG CAG GGT GAA ATC CTG CAG CGC GGC TAT GAT 576Glu Ile Asn Pro Ala Arg Gln Gly Glu Ile Leu Gln Arg Gly Tyr Asp

180 185 190ATG GGC CAA AGC CGG GTT ATC TGC GGT TAT CAC TGG CAA AGC GAC GTG 624Met Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser Asp Val

195 200 205ACT GCG GCG CGC ATG GCG GCG TCG GCC ATG GTG GCG CGT TTG CAT GCC 672Thr Ala Ala Arg Met Ala Ala Ser Ala Met Val Ala Arg Leu His Ala

210 215 220GAA CCC ACC TTC GCC GCC CAG CTG CAA AAG GCC AAA GAC GAA TTC AAC 720Glu Pro Thr Phe Ala Ala Gln Leu Gln Lys Ala Lys Asp Glu Phe Asn225 230 235 240GGC CTG AAA AAG TAA 735Gly Leu Lys Lys

SEQ ID NO：28的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：244个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)来源：

(A)有机体：Serratia ficartia

(B)菌株：IAM 13540

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：28：Met Lys Lys Ile Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gln 1 5 10 15Phe Ser Phe Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr His Pro Glu Val Tyr Phe

20 25 30Leu Gln Glu Ser Gln Ser Ile Asp Ser Leu Ala Leu Leu Pro Pro Pro

35 40 45Pro Ala Met Asp Ser Ile Asp Phe Leu Asn Asp Lys Ala Gln Tyr Asp

50 55 60Ala Gly Lys Ile Val Arg Asn Thr Pro Arg Gly Lys Gln Ala Tyr Asp65 70 75 80Asp Ala His Val Ala Gly Asp Gly Val Ala Ala Ala Phe Ser Asn Ala

85 90 95Phe Gly Leu Glu Ile Ala Gln Arg Lys Thr Pro Glu Leu Phe Lys Leu

100 105 110Val Met Lys Met Arg Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala

115 120 125Lys Asn His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Asn Glu Ala

130 135 140Thr Cys Arg Pro Asp Glu Glu Ser Thr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Tyr145 150 155 160Pro Ser Gly His Thr Thr Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala

165 170 175Glu Ile Asn Pro Ala Arg Gln Gly Glu Ile Leu Gln Arg Gly Tyr Asp

180 185 190Met Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser Asp Val

195 200 205Thr Ala Ala Arg Met Ala Ala Ser Ala Met Val Ala Arg Leu His Ala

210 215 220Glu Pro Thr Phe Ala Ala Gln Leu Gln Lys Ala Lys Asp Glu Phe Asn225 230 235 240Gly Leu Lys Lys

SEQ ID NO：29的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii) 分子类型：其它DNA...合成DNA

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：29：CCCGGCGTCA CCAATCATAT T 21

SEQ ID NO：30的资料：

(i)顺序特性

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸 (C)链型：单链(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：其它DNA...合成DNA(iii)假设：否(iv)反义：否(xi)顺序描述：SEQ ID NO：30：GCCGGTAGAG GCATGCCCGG A 21

Claims

1.生产核苷-5’-磷酸酯的方法，包括让对核苷具有较高亲和性和/或较高温度稳定性的酸性磷酸酶，在pH 3.0-5.5条件下作用于核苷和磷酸基团供体，生产并收集核苷-5’-磷酸酯。

2.生产核苷-5’-磷酸酯的方法，包括让微生物在pH 3.0-5.5条件下作用于核苷和磷酸基团供体，生产并收集核苷-5’-磷酸酯；其中微生物用包含对核苷具有较高亲和性和/或较高温度稳定性的酸性磷酸酶编码基因的重组DNA转化。

3.按照权利要求1或2的生产核苷-5’-磷酸酯的方法，其中对核苷的Km值低于100mM。

4.按照权利要求1或2的生产核苷-5’-磷酸酯的方法，其中酸性磷酸酶在50℃下是稳定的。

5.按照权利要求1或2的生产核苷-5’-磷酸酯的方法，其中对核苷具有较高亲和性的酸性磷酸酶得自属于埃希氏杆菌属、摩根氏菌属、普罗威登斯菌属、肠杆菌属、克雷伯氏杆菌属或沙雷氏菌属的细菌。

6.按照权利要求5的生产核苷-5’-磷酸酯的方法，其中酸性磷酸酶包含的氨基酸顺序与选自顺序表的SEQ ID NO：4、8、25、27、29和31中描述顺序的某一个氨基酸顺序基本相同，所述酸性磷酸酶在选自顺序表的SEQ ID NO：4、8、25、27、29和31中描述顺序的某一个氨基酸顺序上具有一个突变，该突变提高了对核苷的亲和性和/或温度稳定性。

7.按照权利要求5的生产核苷-5’-磷酸酯的方法，其中所述突变选自顺序表的SEQ ID NO：8中的第63位亮氨酸残基、第65位丙氨酸残基、第66位谷氨酸残基、第69位天冬氨酸残基、第71位丝氨酸残基、第72位丝氨酸残基、第74位甘氨酸残基、第85位丝氨酸残基、第92位丙氨酸残基、第94位丙氨酸残基、第104位谷氨酸残基、第116位天冬氨酸残基、第130位丝氨酸残基、第135位苏氨酸残基、第136位谷氨酸残基、第151位苏氨酸残基和/或第153位异亮氨酸残基用另一氨基酸的替代。

8.按照权利要求1或2的生产核苷-5’-磷酸酯的方法，其中磷酸基团供体选自多磷酸或其盐、苯磷酸或其盐、乙酰磷酸或其盐和氨甲酰磷酸或其盐。

9.一种突变型酸性磷酸酶，它包含的氨基酸顺序与选自顺序表的SEQ ID NO：4、8、25、27、29和31中描述顺序的某一个氨基酸顺序基本相同，所述酸性磷酸酶在选自顺序表的SEQ ID NO：4、8、25、27、29和31中描述顺序的某一个氨基酸顺序上具有一个突变，该突变提高对核苷的亲和性和/或温度稳定性。

10.按照权利要求9的一种突变型酸性磷酸酶，其中所述突变选自顺序表的SEQ ID NO：8中的第63位亮氨酸残基、第65位丙氨酸残基、第66位谷氨酸残基、第69位天冬氨酸残基、第71位丝氨酸残基、第72位丝氨酸残基、第74位甘氨酸残基、第85位丝氨酸残基、第92位丙氨酸残基、第94位丙氨酸残基、第104位谷氨酸残基、第116位天冬氨酸残基、第130位丝氨酸残基、第135位苏氨酸残基、第136位谷氨酸残基、第151位苏氨酸残基和/或第153位异亮氨酸残基用另一氨基酸的替代。

11.按权利要求9定义的酸性磷酸酶的编码基因。

12.包含按权利要求11定义的基因的重组DNA。

13.包含按权利要求12定义的重组DNA的微生物。