KR101234513B1

KR101234513B1 - 3'-포스포아데노신-5'-포스포술페이트의 효소 합성법

Info

Publication number: KR101234513B1
Application number: KR1020077017945A
Authority: KR
Inventors: 가즈야 이시게; 도시타다 노구치
Original assignee: 야마사 쇼유 가부시키가이샤
Priority date: 2005-01-25
Filing date: 2006-01-24
Publication date: 2013-02-19
Also published as: KR20070104388A; EP1842910A1; EP2100956B1; JP4505011B2; US8728789B2; WO2006080313A1; US20090215114A1; JPWO2006080313A1; CN101107356B; CA2595873A1; US20140206042A1; CA2595873C; EP2100956A1; US9193958B2; CN101107356A; EP1842910A4

Abstract

본 발명은 아데노신 5'-트리인산 술푸릴라제(ATPS)와 아데노신 5'-포스포술페이트 키나제(APSK)를 이용하여 ATP를 황산화 및 인산화하여 3'-포스포아데노신-5'-포스포술페이트(PAPS)를 제조하는 방법에 있어서, ATP 대신에, 아데노신 5'-모노인산(AMP), 폴리인산, 폴리인산 의존적 뉴클레오티드 5'-디인산 키나제(PNDK) 및 폴리인산:AMP 인산 전이 효소(PAP)로 이루어진 아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)의 공급·재생계 또는 아데노신 5'-모노인산(AMP), 폴리인산, 폴리인산 의존적 뉴클레오티드 5'-디인산 키나제(PNDK) 및 아데닐산 키나제(ADK)로 이루어진 아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)의 공급·재생계를 이용함을 특징으로 하는 PAPS의 제조법으로 관한다.

Description

3'-포스포아데노신-5'-포스포술페이트의 효소 합성법 {METHOD OF ENZYMATICALLY SYNTHESIZING 3'-PHOSPHOADENOSINE-5'-PHOSPHOSULFATE}

본 발명은 내열성 세균 지오바실루스·스테아로서모필루스 유래의 아데노신 5'-트리포스페이트 술푸릴라제(adenosine 5'-triphosphate sulfurylase: ATPS)와 아데노신 5'-포스포술페이트 키나제(adenosine 5'-phosphosulfate kinase: APSK), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 유래의 폴리인산 의존적 뉴클레오시드 5'-디인산 키나제(Polyphosphate-Driven Nucleoside Diphosphate Kinase; PNDK), 이 PNDK를 이용한 아데노신 5'-트리포스페이트(adenosine 5-triphosphate: ATP) 공급·재생계 및 이 ATPS와 APSK와 ATP 공급·재생계를 링크시킨 실용적인 3'-포스포아데노신-5'-포스포술페이트(3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate: PAPS)의 효소 합성법에 관한 것이다.

PAPS는 미생물로부터 식물, 고등동물에 이르기까지 생체 내에서 널리 이용되는 황산공여체이다. 또, 프로테오글리칸 질환으로 대표되는 몇 개의 질환과 PAPS와의 관계도 보고되고 있으며, PAPS의 생체 내에서의 역할은 매우 중요하여 의약품 등의 분야에서 이용될 가능성이 있다.

PAPS의 효소 합성법으로서, 예를 들면, 빵 효모나 랫트 간장으로부터 추출한 ATPS와 APSK의 2개의 효소를 이용한 2단계 반응에 의해, ATP로부터 제조하는 방법(하기 식 1 및 2)이 알려져 있다.

그러나, 이 방법에서는 수 밀리그램 내지 수십 밀리그램의 PAPS 밖에 제조할 수 없으며, 고가의 ATP를 필요로 하여 산업적으로 실용적인 방법이라고는 말하기 어렵다.

(상기 식중, ATP는 아데노신 5'-트리포스페이트, ADP는 아데노신 5'-디인산, APS는 아데노신 5'-포스포술페이트, PPi는 무기 피로인산, SO₄ ^2-는 황산이온을 나타낸다)

따라서, PAPS를 실용적으로 생산하기 위하여는 생산성 및 조작성이 우수한 미생물 유래 효소를 이용하는 것(제1 과제)과 고가의 ATP를 필요로 하지 않는 ATP 공급·재생계의 구축(제2 과제)이 필수로 된다.

온다(恩田) 등은 제1 과제를 해결하기 위하여, 바실루스속 세균 또는 서머스속 세균 유래의 열안정성이 높은 ATPS 및 APSK의 2개의 효소를 이용함으로서 2단계 반응에 의해 PAPS를 효율적으로 생산하는 것이 가능함을 보고하고 있다(특허문헌 1∼3).

그러나, 온다 등의 방법을 실시하기 위해서는 당해 내열성 세균의 균체 파쇄액으로부터 ATPS 및 APSK를 정제하지 않으면 안된다. 그렇지만, 당해 2효소의 세포내 함유량은 낮고, 이 때문에 대량의 균체배양을 필요로 하며, 또한, 2효소의 정제 조작이 극히 번잡하다는 문제가 있었다.

한편, 제2 과제를 해결하기 위하여 이부키(伊吹) 등은 PAPS 합성계에 아세틸포스페이트와 아세트산 키나제로 이루어진 ATP 재생계를 링크시켜, APSK 반응으로 생성하는 ADP를 ATP로 변환하여 재이용하는 방법을 보고하고 있다(비특허문헌 1).

그러나, 반응 당초에는 여전히 고가의 ATP를 기질로서 사용하고, 또한 ATP 재생을 위한 인산 공여체로서 고가의 아세틸포스페이트를 다량으로 사용하므로, 이 방법은 실천적인 방법으로 될 수 없었다.

종래, 염가의 인산 도너로서는 폴리인산(Poly P_n)이 알려져 있으며, 이 폴리인산을 이용한 아데노신 5'-모노인산(adenosine 5'-monophosphate: AMP)로부터 ATP 공급·재생계로서는 하기식(3) 및(4)로 표시되는 폴리인산 키나제(PPK) 및 아데닐산 키나제(ADK)의 협조 작용을 이용하는 계(특허문헌 4)와 하기식(5) 및 (6)으로 표시되는 폴리인산:AMP인산 전이효소(PAP) 및 ADK를 이용하는 계(특허문헌 5)가 알려져 있다.

(상기 식중, ATP는 아데노신 5-트리포스페이트, ADP는 아데노신 5'-디인산, AMP는 아데노신 5'-모노인산, Poly P_n는 폴리인산, n은 정수를 나타낸다)

이 PPK 및 ADK의 협조 작용을 이용하는 ATP 공급·재생계를 PAPS의 효소합성에 응용하는 것도, 이미 보고되어 있지만(특허문헌 6), 이 방법을 상세하게 해석한 결과, PAPS의 생성량은 최대 5 mM 정도밖에 되지 않는 것이 판명되었다. 이러한 낮은 수득량의 원인을 예의 검토한 바, PPK 및 ADK의 협조 작용을 이용한 ATP 공급·재생계가 효과적으로 기능하지 않고, 반응계내의 ATP 농도를 ADP나 AMP에 대해서 우세하게 유지하는 것이 곤란하고, 이것이 결과적으로 PAPS 생성을 비효율적인 것으로 하고 있는 것이 판명되었다(후술하는 비교예 1 참조).

PPK는 생체 내에서는 폴리인산 합성 효소로서 기능하고 있다고 생각되고 있으며, 식(4)에 나타낸 이 효소 반응의 평형은 폴리인산 합성 쪽으로 크게 치우쳐 있다(비특허문헌 2). 또한, 그의 ATP 합성 활성은 미약하기 때문에, 이 효소를 이용한 ATP 공급·재생계는 예를 들면, 기질 농도가 5 mM 정도이하의 낮은 농도에서의 반응에서는 양호하게 기능하지만, 기질 농도가 10 mM를 넘는 것 같은 높은 농도에서의 반응에서는 충분히 기능할 수 없는 것이 판명되었다.

또한, PAP 및 ADK를 이용하는 ATP 공급·재생계를 PAPS의 효소 합성에 응용한 예는 보고되어 있지 않지만, ADK가 식(6)의 반응을 완전히 가역적으로 촉매하기 때문에, 후술하는 비교예 2에 나타낸 바와 같이, 반응계내의 ATP 농도를 높게 유지하지 못하고, 결과적으로 PAPS의 생성은 비효율적이었다.

따라서, PAPS의 실천적 제조를 가능하게 하기 위해서는 ATP 농도를 ADP나 AMP에 대해 우세하게 유지 가능한, 강력한 신규 ATP 공급·재생계를 구축하는 것이 불가결했다.

이러한 강력한 ATP 공급·재생계를 구축하기 위한 하나의 수단으로서 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 유래의 폴리인산 의존적 뉴클레오티드 5'-디인산 키나제(Polyphosphate-Driven Nucleoside Diphosphate Kinase; PNDK)의 이용이 고려된다. 즉, 최근, 녹농균 유래의 PNDK가 동정되고(비특허문헌 3, 4), 이 효소를 코드하는 유전자도 취득되어 있다(비특허문헌 2, 5).

더욱이, 이 PNDK가 PPK와 유사한 폴리인산 의존적인 ADP의 인산화 활성을 나타내지만, 그의 아미노산 배열은 PPK의 그것과 전혀 상동성을 갖지 않고, 또한, 대장균 유래의 PPK의 100배 이상, 녹농균 유래 PPK의 약 1000배에 달하는 현저하게 높은 비활성을 가지는 효소이며(비특허문헌 2), PPK와는 대조적으로, 폴리인산 합성 활성이 사실상 무시할 수 있는 만큼 미약하고, 반응 평형이 ATP 합성 쪽으로 크게 치우쳐 있기 때문에, ATP의 공급·재생계에 이용하는 효소로서 이상적인 것으로 고려된다.

그렇지만, 이 효소의 녹농균의 생산성은 낮으므로, 이 효소를 산업적으로 이용하기 위해서는 유전자 재조합 기술을 이용하여 당해 효소의 유전자를 클론화하고, 대장균 등을 숙주로서 이 효소를 대량 생산시키는 것이 필요하지만, 본 발명자들이 과거에 행한 실험에서는 유전자 재조합 기술을 이용하여도 이 효소의 생산성은 변함없이 낮고, 이 효소의 실용화는 곤란했다.

특허문헌 1: 일본국 특허 제 3098591호

특허문헌 2: 일본국 특허 제 3078067호

특허문헌 3: 일본국 특허 제 3029915호

특허문헌 4: W098/48031

특허문헌 5: W003/100056

특허문헌 6: 일본국 특허공개 2002-78498호

비특허문헌 1: Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 171-172(1992)

비특허문헌 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 16684-16688(2002)

비특허문헌 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94,439-442(1997)

비특허문헌 4: Biochem. Biophys. Res. Commun., 281, 821-826(2001)

비특허문헌 5: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 16678-16683(2002)

따라서, 실용적인 PAPS 제조법을 확립하기 위하여, 본 발명은 최초로 내열성 세균 지오바실루스·스테아로서모필루스(옛 명칭: 바실루스·스테아로서모필루스) 염색체로부터 ATPS 및 APSK를 코드하는 유전자를 발견하여 재조합 DNA 수법을 이용한 당해 효소의 대량 제조를 목적으로 한다.

다음으로, 본 발명은 재조합 DNA 기술을 이용한 PNDK의 효율적인 생산을 확립하는 것을 목적으로 한다.

마지막으로, 본 발명은 PNDK를 이용한 극히 강력한 ATP 공급·재생계의 구축과 이 ATP 공급·재생계와 내열성 세균 지오바실루스·스테아로서모필루스 유래의 ATPS 및 APSK를 링크시킨 PAPS의 효율적인 제조법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여, 예의 검토를 거듭한 결과, 내열성 세균 지오바실루스·스테아로서모필루스 염색체로부터 ATPS 및 APSK를 코드하는 유전자를 처음으로 발견하고, 재조합 DNA 수법을 이용해 당해 효소의 대량 제조를 가능한 것으로 했다. 더욱이, 당해 효소를 높이 생산하는 대장균 조추출액(粗抽出液)에 가열 처리를 함으로서 PAPS 합성 활성이 현저하게 향상하고, 이것에 의해, 당해 2효소를 특별한 정제를 행하지 않고, 효율적인 PAPS 제조가 가능해졌다.

다음에, 이미 보고되고 있는 357 아미노산 잔기로 이루어진 PNDK를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 정밀히 조사하고, N 말단 측의 수십 아미노산 잔기에 상당하는 부분의 염기배열을 인위적으로 결실시킨 DNA 단편을 이용함으로서 당해 효소의 생산성이 현저하게 향상되고, 목적으로 하는 효소 활성도 소실되지 않음을 발견했다.

더욱이, AMP를 인산화하여 ADP를 생성시키는 효소로서 PAP를, ADP를 인산화하여 ATP를 생성·재생시키는 효소로서 상기 PNDK를 각각 선택하여 양자를 조합함으로서 극히 강력하게 AMP로부터 ATP를 공급할 수 있고, 또한 공급된 ATP를 높은 농도로 유지시키는 것이 가능함을 발견하였다(하기식 7 및 8 참조).

더욱이 PNDK를 ADK와 공존시켰을 경우, PPK를 ADK와 공존시켰을 경우, 특허문헌 4와 동일하게, 양자의 협조 작용으로 폴리인산 의존적인 AMP의 인산화 활성이 생기는 것, 생성된 ADP는 PNDK 단독으로의 강력한 ADP 인산화 활성에 의해 즉각적으로 ATP로 변환되어 PNDK와 ADK의 조합이 역시 AMP로부터의 강력한 ATP 공급·재생계로서 기능할 수 있는 것도 발견했다(하기식 9 및 10 참조).

그리고, PAP 및 PNDK로 이루어진 ATP 공급·재생계, 또는 ADK 및 PNDK로 이루어진 ATP 공급·재생계의 어느 쪽인가를 지오바실루스·스테아로서모필루스 유래의 ATPS 및 APSK를 이용한 PAPS의 효소 합성에 응용한 경우, 어느 ATP 공급·재생계도 반응계내의 ATP 농도를 ADP 나 AMP에 대해 우세하게 유지하여, 결과적으로 PAPS를 효율적으로 합성할 수 있음을 발견했다.

따라서, 본 발명은 아래와 같은 것이다.

(1)배열번호 1로 표시되는 염기배열로 이루어지며, 지오바실루스·스테아로서모필루스 유래의 아데노신 5'-트리인산 술푸릴라제(ATPS)를 코드하는 DNA 단편.

(2)배열번호 1로 표시되는 염기배열에 있어서, 1개 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 염기배열로 이루어지며, ATPS 활성을 가지는 효소를 코드하는 DNA 단편.

(3) 상기 (1) 기재의 DNA 단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하여 ATPS 활성을 가지는 효소를 코드하는 DNA 단편.

(4) 상기 (1)∼(3) 기재의 몇 개의 DNA 단편을 이용하여 재조합 DNA 수법으로 ATPS 활성을 가지는 조효소를 조제하고, 얻어진 조효소를 가열 처리함을 특징으로 하는 ATPS 또는 ATPS 활성을 가지는 효소의 조제법.

(5) 45∼65℃에서 가열 처리하는 상기(4)의 조제법.

(6)배열번호 2로 표시되는 염기배열로 이루어지며, 지오바실루스·스테아로서모필루스 유래의 아데노신 5'-포스포술페이트 키나제(APSK)를 코드하는 DNA 단편.

(7)배열번호 2로 표시되는 염기배열로 이루어지며, 1개 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 염기배열로 이루어지며, APSK 활성을 가지는 효소를 코드하는 DNA 단편.

(8) 상기(6) 기재의 DNA 단편과 엄격한 조건하에서, 하이브리다이즈하여 APSK 활성을 가지는 효소를 코드하는 DNA 단편.

(9) 상기(6)∼(8) 기재의 몇 개의 DNA 단편을 이용하여 재조합 DNA 수법으로 APSK 활성을 가지는 조효소를 조제하고, 얻어진 조효소를 가열 처리함을 특징으로 하는 APSK 또는 APSK 활성을 가지는 효소의 조제법.

(10) 45∼65℃에서 가열 처리하는 상기(9)의 조제법.

(11) 상기(4) 기재의 방법에 의해 조제된 ATPS와 상기(9) 기재의 방법으로 조제된 APSK를 이용하고, 황산이온과 아데노신 5-트리포스페이트(ATP)로부터 3'-포스포아데노신-5'-포스포술페이트(PAPS)를 효소적으로 합성하는 것을 특징으로 하는 PAPS의 제조법.

(12)배열번호 9로 표시되는 염기배열중의 101∼1171로 이루어진 폴리인산 의존적 뉴클레오티드 5'-디인산 키나제(PNDK)를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, N 말단 측의 적어도 72 아미노산 잔기 상당의 염기배열을 결실한 DNA 단편.

(13) 적어도 73 아미노산 잔기에 상당하는 부분의 염기배열을 결실한, 상기(12) 기재의 DNA 단편.

(14) 72이상, 87이하의 아미노산 잔기에 상당하는 부분의 염기배열을 결실한 상기(12) 기재의 DNA 단편.

(15) 73이상, 83이하의 아미노산 잔기에 상당하는 부분의 염기배열을 결실한 상기(12) 기재의 DNA 단편.

(16) 73, 77, 80 또는 83의 아미노산 잔기에 상당하는 부분의 염기배열을 결실한 상기(12) 기재의 DNA 단편.

(17) 상기(12)∼(16) 몇 개의 DNA 단편에 있어서, 1개 또는 몇 개의 염기가 치환, 삽입 또는 부가된 염기배열로 이루어지며, PNDK 활성을 가지는 효소를 코드하는 DNA 단편.

(18) 상기(12)∼(16) 어느 쪽인가에 기재된 DNA 단편과 엄격한 조건하에서, 하이브리다이즈하여 PNDK 활성을 가지는 효소를 코드하는 DNA 단편.

(19) 상기(12)∼(18) 기재의 몇 개의 DNA 단편을 이용하여 재조합 DNA 수법으로 PNDK를 조제하는 PNDK의 제조법.

(20) 상기(19) 기재의 방법에 의해 조제된, 배열번호 10의 N 말단 측의 적어도 72 아미노산을 결실한 아미노산 배열을 가지는 PNDK.

(21) 아데노신 5'-모노인산(AMP), 폴리인산, 폴리인산 의존적 뉴클레오티드 5'-디인산 키나제(PNDK) 및 폴리인산:AMP 인산 전이 효소(PAP)로 이루어진 아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)의 공급·재생계.

(22) 아데노신 5'-모노인산(AMP), 폴리인산, 폴리인산 의존적 뉴클레오티드 5'-디인산 키나제(PNDK) 및 아데닐산 키나제(ADK)로 이루어진 아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)의 공급·재생계.

(23) PNDK가 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 미생물 유래의 것으로, 상기(21) 또는(22) 기재의 ATP의 공급·재생계.

(24) PNDK가 상기(20) 기재의 PNDK인, 상기(21) 또는(22) 기재의 ATP의 공급·재생계.

(25) PAP가 아시네토박터(Acinetobacter) 속에 속하는 미생물 유래의 것인 상기(21) 또는(22) 기재의 ATP의 공급·재생계.

(26) ADK가 대장균 또는 효모 유래의 것인 상기(21) 또는(22) 기재의 ATP의 공급·재생계.

(27) 재조합 DNA 수법으로 형질 전환된 형질 전환체, 이 형질 전환체의 처리물 또는 이 처리물로부터 얻어진 효소를 효소원으로서 사용하는 상기(21) 또는(22) 기재의 ATP의 공급·재생계.

(28) ATP를 에너지원 및/또는 기질로서 소비하는 효소 반응에 의해 생성되는 유용 물질을 염가로, 그리고 효율적으로 제조하는 방법으로, ATP 대신에, 상기(21)∼(26)의 어느 1 항에 기재의 ATP의 공급·재생계를 이용하는 것을 특징으로 하는 유용 물질의 제조법.

(29) ATP를 에너지원 및/또는 기질로서 소비하는 효소 반응에 의해 생성되는 유용 물질이 3'-포스포아데노신-5'-포스포술페이트(PAPS), 당뉴클레오티드, S-아데노실메티오닌(SAM)의 어느 하나인 상기(28) 기재의 유용 물질의 제조법.

(30) 아데노신 5'-트리포스페이트 술푸릴라제(ATPS)와 아데노신 5'-포스포술페이트 키나제(APSK)를 이용해 ATP를 황산화 및 인산화하여 3'-포스포아데노신-5'-포스포술페이트(PAPS)를 제조하는 방법에 있어서, ATP 대신에, 상기(21)∼(27)의 어느 1항 기재의 ATP의 공급·재생계를 이용하는 것을 특징으로 하는 PAPS의 제조법.

(31) ATPS와 APSK가 지오바실루스(Geobacillus) 속에 속하는 미생물 유래의 것인 상기(30) 기재의 PAPS의 제조법.

(32) 상기(4) 기재의 방법에 의해 조제된 ATPS와 상기(9) 기재의 방법으로 조제된 APSK를 이용하는 상기(30) 기재의 PAPS의 제조법.

(33) 30∼50℃의 반응 온도 하에서, PAPS를 효소 합성하는 상기(30) 기재의 PAPS의 제조법.

[발명 효과]

지오바실루스·스테아로서모필루스 유래의 ATPS 및 APSK의 아미노산 배열 및 염기배열 모두 전혀 보고되어 있지 않은 상황에 있어서, 본 발명자들에 의해, 지오바실루스·스테아로서모필루스 유래의 ATPS 및 APSK 상당하는 유전자의 클로닝에 처음으로 성공하고, 이것에 의해 지오바실루스·스테아로서모필루스 유래의 ATPS 및 APSK를 유전자 공학의 수법으로, 대량으로 제조하는 것이 가능해졌다. 또한, 유전자 공학으로 얻어진 양효소는 활성적으로 만족할 수 있는 것은 아니었지만, 가열 처리라는 극히 간편하고도 실천적인 처리를 함으로서 양효소(兩酵素)의 PAPS 합성 활성이 비약적으로 높아지는 것을 발견하고, 이것에 의해 PAPS를 보다 간편하고도 대량으로 제조하는 것을 처음으로 가능하게 하였다.

또한, 이미 보고되어 있는 PNDK의 N 말단 측의 적어도 72 아미노산 잔기 상당한 염기배열을 결실한 DNA 단편을 사용함으로서, N 말단 측의 적어도 72 아미노산 잔기에 상당하는 부분을 결실한 아미노산 배열을 가지는 PNDK를 간편하고도 대량으로 제조하는 것이 비로소 가능하게 되었다. 이 N 말단 결손의 PNDK는 PNDK 자체의 활성은 유지되고 있기 때문에, 이 PNDK를 이용함으로서, 실용적인 ATP 합성·재생계 및 GTP 합성·재생계를 구축할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 ATP의 공급·재생계는 AMP, 폴리인산 등의 염가의 원료만을 사용하고, 이것을 PAPS의 합성에 응용했을 경우, 반응계내의 ATP 농도를 ADP나 AMP에 대해서 우세함을 유지 가능하고, 대 AMP 전환율 60%이상의 효율로 PAPS를 합성할 수 있다. 이 합성 효율은 종래의 PPK 및 ADK의 협조 작용을 이용한 ATP 공급·재생계를 응용했을 때의 5배 이상의 효율이고, PAP 및 ADK를 이용한 ATP 공급·재생계를 응용했을 때의 1.5배 이상의 효율이다.

또한, ATPS와 APSK로서 지오바실루스(Geobacillus) 속에 속하는 미생물 유래의 것, PNDK로서 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 미생물 유래의 것, PAP로서 아시네토박터(Acinetobacter) 속에 속하는 미생물 유래의 것, ADK로서 대장균 또는 효모 유래의 것을 사용함으로서, 30∼50℃의 반응 온도이어도 효소활성의 저하를 초래하지 않고, 각각의 효소가 협조하여 PAPS를 효율적으로 합성 가능하다.

도 1은 ATP 공급·재생계를 공역시키지 않았을 때의, PAPS의 경시적인 생성량을 나타낸 것이다(실시예 1의(3)). ■은 콘트롤 반응에서의 PAPS 생성량, ▲은 비가열 처리의 조효소를 이용한 반응에서의 PAPS 생성량, ●은 가열 처리조효소액을 이용한 반응에서의 PAPS 생성량을 각각 나타낸다.

도 2는 ADK 및 PNDK를 이용한 본 발명의 ATP 공급·재생계를 공역시킨 PAPS 합성 반응에 있어서의, 경시 변화를 나타낸 것이다(실시예 3의(7)).

도 3은 PAP 및 PNDK를 이용한 본 발명의 ATP 공급·재생계를 공역시킨 PAPS 합성 반응에 있어서의, 경시 변화를 나타낸 것이다(실시예 3의(8)).

도 4는 PPK 및 ADK의 협조 작용을 이용한 종래의 ATP 공급·재생계를 공역시킨 PAPS 합성 반응에 있어서의, 경시 변화를 나타낸 것이다(비교예 1).

도 5는 PAP 및 ADK를 이용한 종래의 ATP 공급·재생계를 공역시킨 PAPS 합성 반응에 있어서의, 경시 변화를 나타낸 것이다(비교예 2).

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

(A) 지오바실루스·스테아로서모필루스 유래 ATPS 및 APSK

지오바실루스·스테아로서모필루스 유래 ATPS 및 APSK는 각각 배열번호 3 및 배열번호 4에 나타낸 아미노산 배열을 가지는 효소, 또는 배열번호 3 및 배열번호 4의 아미노산 배열에 있어서의 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 가지는 효소이다.

몇 개의 아미노산의 결실은 예를 들면, 30 아미노산 이내를 말하며, 바람직하기로는 10 아미노산 이내의 결실을 의미한다. 또한, 몇 개의 아미노산의 치환이란, 예를 들면 25 아미노산 이내를 말하며, 바람직하기로는 10 아미노산 이내의 치환을 의미한다. 더욱이 몇 개의 아미노산의 부가란, 예를 들면 40 아미노산 이내를 말하며, 바람직하기로는 20 아미노산 이내의 부가를 의미한다. 또한, 아미노산의 결실, 치환 또는 부가는 배열번호 3 또는 배열번호 4의 아미노산 배열과 85%이상, 더욱이 90%이상, 특히 95%이상의 상동성을 가지는 것이 포함된다. 이들의 변경을 가지는 경우에도, ATPS 또는 APSK 활성을 각각 가지는 것이 필요하다.

지오바실루스·스테아로서모필루스 유래 ATPS 및 APSK를 코드하는 유전자는 각각 배열번호 1 및 배열번호 2에 나타낸 염기배열을 가지는 유전자이거나, 또는 배열번호 1 및 배열번호 2의 염기배열에 있어서의 1 또는 복수의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기배열을 가지는 유전자이다. 1 또는 복수의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기배열을 가지는 유전자로서는배열번호 1 또는 2의 DNA 단편과 엄격한 조건에서, 하이브리다이즈하는 것을 들 수 있다. 여기서 엄격한 조건으로서는 0.1% SDS를 함유하는 0.2×SSC 중 50℃, 0.1% SDS를 함유하는 1×SSC 중 60℃ 등의 조건을 들 수 있다. 1 또는 복수의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기배열을 가지는 유전자에는 배열번호 1 또는 배열번호 2의 염기배열과 85%이상, 더욱이 90%이상, 특히 95%이상의 상동성을 가지는 것이 포함된다. 이러한 유전자는 예를 들면,배열번호 1 및 배열번호 2 각각의 양단 부분의 합성 DNA를 프라이머로 하고, 지오바실루스·스테아로서모필루스 염색체 DNA를 주형으로 하는 PCR법에 의해 목적 유전자를 증폭하는 방법에 의해 취득할 수 있다.

분리된 각 유전자는 벡터 DNA에 연결함으로서 각종 숙주-벡터계에 보관 유지시킬 수 있다. 숙주로서는 미생물, 곤충 세포, 배양 세포 등, 각종의 것을 이용할 수 있다. 미생물, 예를 들면 대장균을 이용하는 경우에는 EK1계, 효모를 이용하는 경우에는 SC1계를 이용할 수 있다.

미생물을 숙주로서 이용하는 경우, 벡터로서는 균체 내에 안정하게 보관 유지되는 것이면 시판의 어떠한 플라스미드도 사용 가능하다. 예를 들면, 숙주로서 대장균을 이용하는 경우에는 pTrc99A(아마샴) 등의 플라스미드의 사용이 바람직하다.

클론화된 유전자(DNA 단편)를 특정의 프로모터 배열의 하류에 연결함으로서, 본 발명의 ATPS 및 APSK를 대량으로 생산시킬 수 있다. 예를 들면, pTrc99A는 발현 유도 가능한 trc프로모터를 가지며, 배양 도중에 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 배지에 첨가함으로서, 목적으로 하는 ATPS 및 APSK를 생산시킬 수 있다.

형질 전환체의 배양은 통상의 방법에 의해 실시할 수 있다. 즉, 바실루스속 또는 대장균류에 속하는 세균을 예로 들어 설명하면, 배지로서는 부이용 배지, LB배지(1% 트립톤, 0.5% 이스트 엑기스, 1% 식염) 또는 2xYT배지(1.6% 트립톤, 1% 이스트 엑기스, 0.5% 식염) 등을 사용할 수 있으며, 당해 배지에 종균을 접종한 후, 30∼50℃에서 10∼50시간 정도, 필요에 따라, 교반하면서 배양하여 얻어진 배양액을 원심분리하여 미생물 균체를 회수할 수가 있다.

상기 미생물 균체를 기계적 파괴(웨링 블랜더, 프렌치 프레스, 호모지나이저, 유발 등에 의한다), 동결 융해, 자기 소화, 건조(동결건조, 풍건 등에 의한다), 효소 처리(리소자임 등에 의한다), 초음파 처리, 화학 처리(산, 알칼리 처리 등에 의한다) 등의 공지 방법으로 파쇄하고, 얻어진 균체의 파괴물 또는 균체의 세포벽 또는 세포막의 변성물 등의 균체 처리물을 본 발명의 ATPS 및 APSK의 조효소액으로서 이용할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 ATPS 및 APSK는 상기 조효소액에 가열 처리를 가함으로서, PAPS 합성 활성을 높일 수 있다. 가열 처리는 45℃부터 65℃의 온도에서 5분 내지 1시간 정도 보온함으로서 행할 수 있으며, 바람직하기로는 55℃에서 30분 정도의 처리하는 것이 효과적이다.

(B) 녹농균 유래의 PNDK

본 발명에서 사용하는 DNA 단편은 배열번호 9로 표시되는 염기배열의 101∼1171로 이루어진 PNDK를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 적어도 N 말단 측의 72 아미노산 잔기 상당의 염기배열, 바람직하기로는 73 아미노산 잔기 상당의 염기배열을 결실한 DNA 단편이다.

이와 같은 DNA 단편 중에서, 72이상, 87이하의 아미노산 잔기에 상당하는 부분의 염기배열을 결실한 DNA 단편, 바람직하기로는 73이상, 83이하의 아미노산 잔기에 상당하는 부분의 염기배열을 결실한 DNA 단편이 예시되며, 보다 구체적으로는 후술하는 실시예에 나타낸 73, 77, 80 또는 83의 아미노산 잔기에 상당하는 부분의 염기배열을 결실한 DNA 단편을 들 수 있다.

이러한 DNA 단편은 후술하는 실시예에서 상술되어 있는 바와 같이, PNDK를 코드하는 ppk2 구조 유전자의 목적으로 하는 아미노산 상당하는 부분을 결실시킨 후의 5'말단에 대응하는 합성 DNA 및 ppk2 구조 유전자의 3'말단 부분의 합성 DNA의 2종의 프라이머를 이용하여 녹농균 염색체 DNA를 주형으로서 PCR법에 의해 목적으로 하는 DNA 단편을 증폭함으로서 취득할 수 있다.

분리된 각 DNA 단편은 벡터 DNA에 연결함으로서 각종의 숙주 벡터계를 구축할 수 있으며, 선택한 숙주-벡터계로 범용되고 있는 방법에 의해 목적으로 하는 본 발명의 PNDK를 제조할 수 있다.

본 발명의 PNDK의 제조시에 숙주로서는 미생물, 곤충 세포, 배양 세포 등 각종의 것을 이용할 수가 있다. 예를 들면, 대장균을 이용했을 경우에는 EK1계, 효모를 이용했을 경우에는 SC1계를 이용할 수 있다.

미생물을 숙주로서 이용한 경우, 벡터로서는 균체 내에 안정에 유지되는 것이면 시판의 어느 플라스미드도 사용 가능하다. 예를 들면, 숙주로서 대장균을 이용했을 경우에는 pTrc99A(아마샴) 등의 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.

클론화된 유전자(DNA 단편)를 특정의 프로모터 배열의 하류에 연결함으로서, 본 발명의 PNDK를 대량으로 생산할 수 있다. 예를 들면, pTrc99A는 발현 유도 가능한 trc 프로모터를 가지며, 배양의 도중에 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 배지에 첨가함으로서, 목적으로 하는 PNDK를 생산할 수 있다.

형질 전환체의 배양은 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다. 즉, 바실루스속 또는 대장균 종류에 속하는 세균을 예로 들어 설명하면, 배지로서는 브이용 배지, LB배지(1% 트립톤, 0.5% 이스트 엑기스, 1% 식염) 또는 2xYT배지(1.6% 트립톤, 1% 이스트 엑기스, 0.5% 식염) 등을 사용할 수 있으며, 당해 배지에 종균을 접종한 후, 30∼50℃에서 10∼50시간 정도, 필요에 따라, 교반하면서 배양하여 얻어진 배양액을 원심분리하여 미생물 균체를 회수할 수 있다.

상기 미생물 균체를 기계적 파괴(웨링 블랜더, 프렌치 프레스, 호모지나이저, 유발 등에 의함), 동결 융해, 자기 소화, 건조(동결건조, 풍건 등에 의함), 효소 처리(리소자임 등에 의함), 초음파 처리, 화학처리(산, 알칼리 처리 등에 의함) 등의 공지인 방법으로 파쇄하여 얻어진 균체의 파괴물 또는 균체의 세포벽 또는 세포막의 변성물 등의 균체 처리물을 본 발명의 PNDK 조효소액으로서 이용할 수 있다.

또한, 경우에 따라서는 상기 균체 처리물로부터 PNDK 활성을 가지는 획분을 통상의 효소의 정제 수단(염석처리, 등전점 침전 처리, 유기용매 침전처리, 투석 처리, 각종 크로마토그래피 처리 등)에 의해 정제하여 부분 정제 효소 또는 정제 효소로서 이용할 수 있다.

이와 같이 하여 조제한 본 발명의 PNDK는 사용한 DNA 단편에 대응하여 배열번호 10의 N 말단 측의 적어도 72 아미노산 잔기에 상당하는 부분을 결실한 아미노산 배열을 가지는 PNDK이다.

(C) ATP 공급·재생계

본 발명의 ATP 공급·재생계로서는, (i) AMP, 폴리인산, PNDK 및 PAP로 이루어진 ATP의 공급·재생계와 (ii) AMP, 폴리인산, PNDK 및 ADK로 이루어진 ATP의 공급·재생계가 포함된다. 여기서, 본 발명의 ATP 공급·재생계는 ATP 공급·재생계를 구성하는 시약을 포함한다.

PAP, ADK 및 PNDK는 모두 공지의 효소이고, 동물유래, 식물유래, 미생물유래 등 특정 유래에 한정되지 않는다. 효소 조제의 간편함 등의 점으로부터 미생물유래의 효소를 사용하는 것이 편리하다. 또한, 근년의 유전자 재조합 기술을 이용하여 당해 유전자를 클론화하고, 대장균 등을 숙주로서 대량 생산하여, 얻어진 재조합균으로부터 당해 효소를 조제하는 것도 가능하다.

그중에서도, PNDK로서 상술한 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 미생물 유래의 것, PAP로서 아시네토박터(Acinetobacter) 속에 속하는 미생물 유래의 것, ADK로서 대장균 또는 효모 유래의 것을 효소로서 사용하는 것이 바람직하다.

반응계에 첨가하는 상기 각 효소는 소망의 활성을 가지는 한 어떠한 형태이 여도 좋고, 구체적으로는 미생물의 균체(형질 전환체를 포함한다), 이 균체의 처리물 또는 이 처리물로부터 얻어진 효소 등을 예시할 수 있다. 미생물의 균체의 조제는 당해 미생물이 생육 가능한 배지를 이용하여 통상의 방법에 따라 배양한 후, 원심분리 등으로 집균하는 방법으로 행할 수 있다. 구체적으로, 바실루스속 또는 대장균류에 속하는 세균을 예로 들어 설명하면, 배지로서는 부이용 배지, LB배지(1% 트립톤, 0.5% 이스트 엑기스, 1% 식염) 또는 2xYT배지(1.6% 트립톤, 1% 이스트 엑기스, 0.5% 식염) 등을 사용할 수 있으며, 당해 배지에 종균을 접종한 후, 30∼50℃에서 10∼50시간 정도, 필요에 따라 교반하면서 배양하고, 얻어진 배양액을 원심분리하여 미생물 균체를 회수할 수 있다.

미생물의 균체 처리물로서는 상기 미생물 균체를 기계적 파괴(웨링 블랜더, 프렌치 프레스, 호모지나이저, 유발 등에 의한다), 동결 융해, 자기 소화, 건조(동결건조, 풍건 등에 의한다), 효소 처리(리소자임 등에 의한다), 초음파 처리, 화학처리(산, 알칼리 처리 등에 의한다) 등의 일반적인 처리법으로 따라 처리하여 얻어진 균체의 파괴물 또는 균체의 세포벽 또는 세포막의 변성물을 예시할 수가 있다.

효소로서는 상기균체 처리물로부터 소망의 효소 활성을 가지는 획분을 통상의 효소의 정제 수단(염석처리, 등전점 침전 처리, 유기용매 침전 처리, 투석 처리, 각종 크로마토그래피 처리 등)을 시행하여 얻어진 조효소 또는 정제 효소를 예시할 수 있다.

본 발명의 ATP의 공급·재생계에 첨가하는 AMP(시판품), 폴리인산(시판품), 각종 효소(PAP, PNDK 및 ADK) 농도는 ATP 공급·재생계를 응용하는 유용 물질에 따라서 다르지만, AMP로서는 예를 들면 1∼200 mM, 바람직하기로는 10∼100 mM의 범위, 폴리인산으로서는 무기 인산으로 환산해 1∼1000 mM, 바람직하기로는 50∼500 mM의 범위, 효소 농도로서는 0.001 유니트/mL이상, 바람직하기로는 0.001∼10 유니트/mL의 범위에서 적의 설정할 수 있다.

이러한 ATP 공급·재생계를 응용 가능한 유용 물질로서는 ATP를 에너지원 및/또는 기질로서 소비하는 효소 반응에 의해 생성되는 유용 물질이면 좋고, 구체적으로는 PAPS, 당뉴클레오티드, S-아데노실메티오닌(SAM) 등을 예시할 수 있다.

(D) PAPS의 효소 합성

PAPS의 효소 합성 반응은 ATP와 황산이온으로부터 ATPS의 촉매 작용에 의해 ATP의 5'-인산을 황산화하고(식 1), 생성되는 아데노신-5'-포스포술페이트의 3'-히드록시기를, ATP를 인산 공여체로서 APSK의 촉매 작용에 의해 인산화하는(식 2) 것이다.

반응에 첨가되는 ATP는 시판의 것을 사용할 수 있다. 사용 농도로서는, 예를 들면 1∼200 mM, 바람직하기로는 1∼20 mM의 범위에서 적의 설정하면 좋다. 또한, 반응에 첨가하는 황산기 공여체로서는, 반응액 중에서 황산이온을 생성하는 것이면 좋고, 시판의 황산나트륨이나 황산마그네슘 등의 황산염을 사용할 수가 있다. 사용 농도로서는, 예를 들면 1∼200 mM, 바람직하기로는 10∼100 mM의 범위에서 적의 설정할 수 있다.

PAPS의 합성은 pH 4∼9의 범위의 적당한 완충액 중에 ATP 및 황산염을 첨가하고, 다시 0.001유니트 이상, 바람직하기로는 0.001∼1.0유니트의 ATPS 및 0.001유니트 이상, 바람직하기로는 0.001∼1.0유니트의 APSK를 첨가하고, 20℃이상, 바람직하기로는 30∼50℃에서 1∼50시간정도, 필요에 따라 교반하면서 반응시킴으로서 실시할 수 있다.

또, ATP를 사용하지 않고, 전술한 ATP 공급·재생계를 병용하는 것도 가능하다. 즉, AMP, 폴리인산, PNDK 및 PAP로 이루어진 ATP의 공급·재생계를 응용한 PAPS의 합성은 pH 4∼9의 범위의 적당한 완충액 중에, AMP, 황산기 공여체 및 폴리인산을 첨가하고, 다시 0.001유니트/mL이상, 바람직하기로는 0.001∼10유니트/mL의 PAP, 0.001유니트/mL이상, 바람직하기로는 0.001∼10유니트/mL PNDK, 0.001유니트 이상, 바람직하기로는 0.001∼10유니트의 ATPS 및 0.001유니트 이상, 바람직하기로는 0.001∼10유니트의 APSK를 첨가하고, 20℃이상, 바람직하기로는 30∼50℃에서 1∼100시간 정도, 필요에 따라 교반하면서 반응시킴으로서 실시할 수 있다.

또, AMP, 폴리인산, PNDK 및 ADK로 이루어진 ATP의 공급·재생계를 응용한 PAPS의 합성은 pH 4∼9의 범위의 적당한 완충액 중에, AMP, 황산기 공여체 및 폴리인산을 첨가하고, 다시 0.001유니트/mL이상, 바람직하기로는 0.001∼10유니트/mL의 ADK, 0.001유니트/mL이상, 바람직하기로는 0.001∼10유니트/mL PNDK, 0.001유니트 이상, 바람직하기로는 0.001∼10유니트의 ATPS 및 0.001유니트 이상, 바람직하기로는 0.001∼10유니트의 APSK를 첨가하고, 20℃이상, 바람직하기로는 30∼50℃에서 1∼100시간 정도, 필요에 따라 교반하면서 반응시킴으로서 실시할 수 있다.

또, 상기 어느 반응에 있어서도, ATPS 반응에 의해 생성하는 피로인산이 생성물 저해를 일으키는 경우가 있기 때문에, 0.001유니트/mL이상, 바람직하기로는 0.001∼10유니트/mL의 무기 피로포스파타제(Inorganic Pyrophosphatase)를 첨가함으로서 합성 효율을 향상시킬 수 있다.

반응 후, 반응액 중에 생성한 PAPS는 활성탄이나 이온교환 수지 등을 이용한 통상의 크로마토그래피 처리법에 의해분리 정제할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세하고, 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 아래의 예에 의해 한정되지 않음은 명백하다. 또한, 실시예에 있어서의 DNA의 조제, 제한 효소에 의한 절단, T4DNA 리가제에 의한 DNA 연결 및 대장균의 형질 전환법은 모두 "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition" (Maniatis 등 편, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1989))에 따라 행했다. 또한, 반응액 중의 뉴클레오티드류의 정량은 HPLC법에 따라 행했다. 구체적으로 분리에는 YMC사제의 ODS-AQ312 컬럼을 이용하고, 용출액으로서 0.5M 인산-칼륨 용액을 이용했다.

실시예 1

(l) ATPS 유전자 및 APSK 유전자의 분류

지오바실루스·스테아로서모필루스 유래 ATPS 유전자 및 APSK 유전자는 미동정이지만, 이 균주 10주의 게놈 DNA의 일부의 염기배열은 공개되어 있다(Accession Number NC_002926). 거기서, 웹 서비스(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/geblast.cgi?gi=5025&tax=272567)를 이용하고, 공개되어 있는 이 균주 게놈 DNA의 부분 배열 중에, 고초균 유래의 공지의 ATPS(Accession Number CAA04411)와 유사한 아미노산 배열의 오픈 리딩 프레임(이하, ORF라 약칭한다)을 코드할 수 있는 DNA 영역이 존재하는지 아닌지를, tBLASTn 프로그램을 이용해 검색했다.

이 결과, 이 균주 염색체에는 고초균 유래 ATPS와 아미노산 배열이 유사한 ORF를 코드할 수 있는 DNA 영역이 존재하는 것이 판명되었다. 또한, 이 유전자의 하류에는 고초균 유래 APSK(Accession Number CAA04412)와 아미노산 배열이 유사한 ORF를 코드할 수 있는 DNA 영역이 발견되었다. 이들은 각각, 이 균주에 있어서의 ATPS 유전자 및 APSK 유전자인 것으로 기대되었다.

여기서, 이 균주 ATPS 유전자로 기대되는 DNA 단편을 이하에 나타낸 PCR법으로 증폭했다. 즉, 하기(A) 및 (B)의 프라이머를 이용하여 반응액 0.1mL 중(50 mM 염화칼륨, 10 mM 트리스염산(pH 8.3), 1.5 mM 염화마그네슘, 0.001% 젤라틴, 지오바실루스·스테아로서모필루스 TH6-2주(FERM BP-2758)의 염색체 DNA 0.1㎍, 2종류의 프라이머 DNA 각각 0.2 μM, ExTaqDNA 폴리메라제 2.5유니트)를 Perkin-Elmer Cetus Instrument사제 DNA Thermal Cycler를 이용하여 열변성(94℃, 1분), 어닐링(55℃, 1분), 폴리메라이제이션(72℃, 2분)의 스텝을 30회 반복했다. 또, 당해 TH6-2주는 바실루스·스테아로서모필루스 TH6-2의 명칭으로 1989년 2월 4일에 305-8566 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1초메 1번지 1 중앙 제6, 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물 기탁센터에 FERM BP-2758로서 기탁되어 있다. 또, 바실루스·스테아로서모필루스는 현재 지오바실루스·스테아로서모필루스로 명칭 변경되었기 때문에, 만약을 위해, 동일 주를, 2005년 12월 7일에, 전기 특허생물기탁센터에 지오바실루스·스테아로서모필루스 TH6-2의 명칭으로, FERM BP-10466로서 기탁했다.

(A) 5'-TTGAATTCCTTGCCTCATGAACATGGCAGC-3'(배열번호 5)

(B) 5'-TACTGCAGGCTCATCGCGATCCTCCTTTAG-3'(배열번호 6)

또한, 이 균 APS 키나제 유전자로 기대되는 DNA 단편을, (C) 및 (D)의 2종류의 프라이머 DNA를 이용한 상기와 같은 PCR법으로 증폭했다.

(C) 5'-TTGAATTCCGCTAAAGGAGGATCGCGATGA-3'(배열번호 7)

(D) 5'-TTCTGCAGCGACCTTGTCAAATGACCTCCC-3'(배열번호 8)

각 유전자 증폭 후, 반응액을 페놀/클로로포름(1: 1) 혼합액으로 처리하고, 수용성 획분에 2배용의 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 침전 회수한 DNA를 문헌(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, 전술) 방법에 따라서 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, 각 DNA 단편을 정제했다. 이 DNA 각각을 제한효소 EcoRI 및 PstI으로 절단하고, 동일한 제한효소 EcoRI 및 PstI로 소화한 플라스미드 pTrc99A(Pharmacia Biotech사에서 입수)와 T4DNA 리가제를 이용하여 연결했다. 각각의 연결 반응액을 이용하여 대장균 JM109균을 형질 전환하여 얻어진 앰피실린 내성 형질 전환체로부터 플라스미드 pTrc-ylnB 및 pTrc-ylnC를 분리했다.

플라스미드 pTrc-ylnB는 지오바실루스·스테아로서모필루스 TH6-2주 유래 ATPS 유전자를 함유하는 DNA 단편을 포함하는 플라스미드이고, pTrc-ylnC는 같은 주 유래 APSK 유전자를 함유하는 DNA 단편을 포함하는 플라스미드이다. 클론화한 양유전자의 염기배열을 해석한 결과, 이 균 ATPS 유전자는 배열번호 1, 이 균 APSK 유전자는 배열번호 2에 나타낸 DNA 염기배열이었다. 이들의 DNA 염기배열을 아미노산 배열로 번역한 결과, 이 균 ATPS는 배열번호 3, 이 균 APSK는 배열번호 4에 나타낸 아미노산 배열이었다. 이 균 ATPS는 고초균 유래 동일 효소와 68%의 아미노산 배열상동성을, 또한, 이 균 APSK는 고초균 유래 동일 효소와 63%의 아미노산 배열 상동성을 각각 나타냈다.

(2) ATPS 및 APSK 조효소액의 조제

대장균 JM109주를 pTrc99A 벡터, pTrc-ylnB 및 pTrc-ylnC의 각각으로 형질 전환하여 얻어진 형질 전환체를, 100㎍/mL의 앰피실린을 함유하는 2xYT배지 100mL에 식균하고, 30℃에서 진탕 배양했다. 4x10⁸균/mL에 도달한 시점에서, 배양액에 최종농도 0.4 mM가 되도록 IPTG를 첨가하고, 다시 30℃에서 밤새 진탕 배양을 계속했다. 배양종료후, 원심분리(10,000×g, 10분)하여 균체를 회수하고, 10mL의 완충액(50 mM 트리스염산(pH 8.0), 0.5 mM EDTA, 1 mM 2-메르캅토에탄올)에 현탁한 후, 초음파 처리하고, 균체를 파쇄하고, 다시 원심분리(10,000ㅧg, 10분)하여 균체 잔사를 제거했다. 이와 같이 하여 얻어진 상청 획분을 조효소액으로 했다.

각 조효소액 중의 ATPS 활성을 이하와 같이 측정했다. 즉, 최종 농도가 각각, 트리스염산 완충액(pH 8) 50 mM, 황산마그네슘 20 mM, ATP 1 mM로 되는 반응 혼액에, 1 unit/mL의 피로포스파타제(Roche Diagnostics 사), 1 unit/mL의 APSK(Calbiochem 사), 및 효소액을 첨가하고, 37℃에서 10분간 보온한 후, 빙냉 0.5M 인산2수소나트륨 용액을 첨가하여 반응을 정지했다. 생성된 PAPS의 양을 HPLC로 정량하고, 1분간에 1 μmole의 PAPS 가 생성되는 ATPS의 양을 1 유니트로 했다.

또, APSK 활성을 이하와 같이 측정했다. 즉, 최종 농도가 각각, 트리스염산 완충액(pH 8) 50 mM, 황산마그네슘 20 mM, ATP 1 mM로 되는 반응 혼액에, 1 unit/mL의 피로포스파타제(Roche Diagnostics사), 1 unit/mL의 ATPS(Calbiochem사) 및 효소액을 첨가하고, 37℃에서 10분간 보온한 후, 빙냉 0.5M 인산2수소나트륨 용액을 첨가하여 반응을 정지했다. 생성된 PAPS의 양을 HPLC로 정량하고, 1분간에 1 μmole의 PAPS가 생성되는 APSK의 양을 1U 유니트로 했다. 각각의 측정 결과를 표 1 및 2에 나타낸다.

[표 1]

균주	ATPS활성(유니트/mL)	ATPS비활성(유니트/mL)
JM109/pTrc99A	<0.1	<0.01
JM109/pTrc-ylnB	58	3.4

[표 2]

균주	APSK활성(유니트/mL)	APSK비활성(유니트/mL)
JM109/pTrc99A	<0.1	<0.01
JM109/pTrc-ylnC	2.5	0.19

(3) ATPS 조효소액 및 APSK 조효소액을 이용한 PAPS의 합성

최종 농도가 각각, Hepes 완충액(pH 8) 50 mM, 염화마그네슘 25 mM, 황산나 트륨 100 mM, ATP 50 mM로 되는 반응 혼액에, 5 유니트/mL 피로포스파타제(Roche사제), 0.2% 용량의 ATPS 조효소액, 0.5% 용량의 APSK 조효소액을 첨가하고, 37℃에서 보온했다.

또한, 양 조효소액 대신에 동일하게 가열 처리한 조효소액(각 조효소액을 55℃로 온도 조절된 수조에 30분간 침지한 후, 실온에서 30분간 정치하고, 원심분리하여 얻어진 상청)을 상기와 동일 용량 첨가한 반응혼액을 조제하고, 동일하게 보온했다. 다시 콘트롤로서 양 조효소액 대신에 pTrc99A를 유지하는 대장균 JM109주부터 조제한 조효소액을 상기와 동일한 용량 첨가한 반응 혼액을 조제하고, 동일하게 보온했다.

이들 반응의 PAPS의 생성량의 경시적 변화를 도 1에 나타냈다. 그 결과, 콘트롤을 제외한 어느 반응에 있어서도, PAPS의 경시적 생성이 확인되었지만, ATPS 및 APSK 가열 처리 조효소액을 이용한 반응에서는 비가열 처리의 동일 조효소액을 이용했을 경우와 비교하여 현저히 PAPS 합성 효율이 높고, 각 시점에서 2∼3배의 PAPS 생성량을 나타냈다. 반응 개시 10시간 후의 대 1/2ATP 전환율은 양 가열 처리 조효소액을 이용한 반응의 경우는 75%인데 대해, 비가열 처리의 동일 조효소액을 이용했을 경우는 38%에 지나지 않는 것이었다.

실시예 2

(l) N 말단 영역의 아미노산 잔기가 결실된 PNDK를 코드하는 유전자의 클로닝

녹농균 Pseudomonas aeruginosa PAO1주(ATCC BAA-47)의 염색체 DNA를 사이토 와 미우라의 방법(Biochem. Biophys. Acta., 72, 619(1963))으로 조제했다. 다음에, 표 3에 나타내는 12종류의 프라이머 DNA를 통상의 방법에 따라 합성하고, 표 4에 나타낸 1에서 11의 조합으로 2종류의 프라이머 DNA를 이용하여 상기 염색체 DNA를 템플레이트로 한 PCR법에 의해, N 말단 영역의 아미노산 잔기가 여러 가지 정도로 결실한 PNDK를 코드하는 유전자를 증폭했다. 또, Pseudomonas aeruginosa PAO1주는 ATCC로부터 입수 가능하다.

[표3]

[표 4]

조합 번호	DNA 프라이머	플라스미드
1	PPK2F1 및 PPK2R1	pTrc-ppk2
2	PPK2F2 및 PPK2R1	pTrc-ppk2N3
3	PPK2F4 및 PPK2R1	pTrc-ppk2N60
4	PPK2F5 및 PPK2R1	pTrc-ppk2N72
5	PPK2F10 및 PPK2R1	pTrc-ppk2N74
6	PPK2F11 및 PPK2R1	pTrc-ppk2N78
7	PPK2F13 및 PPK2R1	pTrc-ppk2N81
8	PPK2F6 및 PPK2R1	pTrc-ppk2N84
9	PPK2F7 및 PPK2R1	pTrc-ppk2N89
10	PPK2F8 및 PPK2R1	pTrc-ppk2N94
11	PPK2F9 및 PPK2R1	pTrc-ppk2N109

PCR에 의한 N 말단 영역 결실 PNDK를 코드하는 유전자의 증폭은 반응액 100 mL(50 mM 염화칼륨, 10 mM 트리스염산(pH 8.3), 1.5 mM 염화마그네슘, 0.001% 젤라틴, 템플레이트 DNA 0.1 ㎍, 표 4에 나타낸 조합 1에서 11의 2종류의 프라이머 DNA 각각 0.2 μM, ExTagDNA 폴리메라제 2.5 유니트)를 Perkin-Elmer Cetus Instrument사제 DNA Thermal Cycler를 사용하여 변성(94℃, 1분), 어닐링(55℃, 1.5분), 폴리메라이제이션(72℃, 1.5분)의 스텝을 30회 반복함으로서 행했다.

각 유전자 증폭 후, 반응액을 페놀/클로로포름(1: 1) 혼합액으로 처리하고, 수용성 획분에 2배용의 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 침전 회수한 DNA를 문헌(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, 전술)의 방법으로 따라서 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, 0.9∼1.3kb에 상당하는 각 DNA 단편을 정제했다. 이 DNA 각각을 제한 효소 NcoI 및 BamHI으로 절단하고, 동일 제한 효소 NcoI 및 BamHI으로 소화한 후, 플라스미드 pTrc99A(Pharmacia Biotech사에서 입수)와 T4DNA 리가제를 이용하여 연결했다.

각각의 연결 반응액을 이용하여 대장균 JM109균을 형질 전환하고, 얻어진 앰피실린 내성 형질 전환체로부터 각 플라스미드(pTrc-ppk2, pTrc-ppk2N3, pTrc- ppk2N60, pTrc-ppk2N72, pTrc-ppk2N74, pTrc-ppk2N78, pTrc-ppk2N80, pTrc-ppk2N81, pTrc-ppk2N84, pTrc-ppk2N89, pTrc-ppk2N94 및 pTrc-ppk2N109)를 분리했다.

플라스미드 pTrc-ppk2는 완전 길이의 PNDK를 코드하는 유전자를, pTrc-ppk2N3은 N 말단 측 2아미노산 잔기를 결실한 PNDK(이하, PNDKN3라 칭한다)를 코드하는 유전자를, pTrc-ppk2N60은 N 말단 측 59아미노산 잔기를 결실한 PNDK(이하, PNDKN60이라 칭한다)를 코드하는 유전자를, pTrc-ppk2N72는 N 말단 측 71아미노산 잔기를 결실한 PNDK(이하, PNDKN72라 칭한다)를 코드하는 유전자를, pTrc-ppk2N74는 N 말단 측 73아미노산 잔기를 결실한 PNDK(이하, PNDKN74라 칭한다)를 코드하는 유전자를, pTrc-ppk2N78은 N 말단 측 77아미노산 잔기를 결실한 PNDK(이하, PN DKN78라 칭한다)를 코드하는 유전자를, pTrc-ppk2N81은 N 말단 측 80아미노산 잔기를 결실한 PNDK(이하, PNDKN81라 칭한다)를 코드하는 유전자를, pTrc-ppk 2N84는 N 말단 측 83아미노산 잔기를 결실한 PNDK(이하, PNDKN84로 칭한다)를 코드하는 유전자를, pTrc-ppk2N89는 N 말단 측 88아미노산 잔기를 결실한 PNDK(이하, PNDKN89라 칭한다)를 코드하는 유전자를, pTrc-ppk2N94는 N 말단 측 93아미노산 잔기를 결실한 PNDK(이하, PNDKN94로 칭한다)를 코드하는 유전자를, pTrc-ppk2N109는 N 말단 측 108 아미노산 잔기를 결실한 PNDK(이하, PNDKN109라 칭한다)를 코드하는 유전자를, 각각 함유하는 NcoI-BamHI DNA 단편이, pTrc99A의 trc 프로모터 하류의 NcoI-BamHI 절단 부위에 삽입된 것이다.

(2) 각종 N 말단 영역 결실 PNDK 조효소액의 조제

상기의 각 플라스미드를 유지하는 대장균 JM109 균을 100 ㎍/mL의 앰피실린을 함유하는 2xYT배지 300mL에 식균하고, 37℃에서 진탕 배양했다. 4×10⁸균/mL에 도달한 시점에서 배양액에 최종농도 1mM가 되도록 IPTG를 첨가하고, 다시 37℃에서 5시간 진탕 배양을 계속했다. 배양 종료후, 원심분리(10,000×g, 10분)하여 균체를 회수하고, 30mL의 완충액(50mM 트리스염산(pH 7.5), 0.5mM EDTA, 1mM 2-메르캅토에탄올)에 현탁한 후, 초음파 처리하고, 균체를 파쇄하고, 다시 원심분리(10,000×g, 10분)하여 균체 잔사를 제거했다. 이와 같이 얻어진 상청 획분을 조효소액으로 했다.

(3) 각종 N 말단 영역 결실 PNDK 조효소액의 활성 측정

상기 조효소액 중의 PNDK 활성의 단위(유니트)를 이하에 나타내는 방법으로 측정, 산출했다. 즉, 10mM 염화마그네슘, 80mM 황산암모늄, 10 mM ADP 및 폴리인산(무기 인산으로서 30mM)을 함유하는 50mM 트리스염산 완충액(pH 8.0)에 상기의 조효소액 각각을 첨가하고, 37℃에서 보온하여 반응을 행하고, 100℃, 1분간의 열처리하여 반응을 정지시켰다. 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용해 반응액 중의 ATP를 정량하고, 37℃에서 1분간에 1 μmole의 ATP를 생성하는 활성을 1단위(유니트)로 했다. 상기의 각종 N 말단 영역 결실 PNDK 조효소액 중의 PNDK 활성을 표 5에 나타낸다.

[표 5]

조효소액	PNDK 활성(유니트/mL 조효소액)
PNDK(대조)	7.1
PNDKN3	7.3
PNDKN60	5.2
PNDKN72	8.6
PNDKN74	60.5
PNDKN78	84.3
PNDKN81	29.2
PNDKN84	191
PNDKN89	4.9
PNDKN94	3.8
PNDKN109	1.2

각 PNDK의 비활성은 특히 크게 변동하고 있는 것은 아니므로 상기 5로부터 명백한 바와 같이, 73이상, 83이하의 아미노산 잔기에 상당하는 부분의 염기배열을 결실한 DNA 단편을 이용함으로서, PNDK를 대량으로 조제할 수 있는 것이 명백해졌다.

실시예 3

(l) PNDK의 조제

녹농균 Pseudomonas aeruginosa 유래 PNDK의 조제는 실시예 2에 기재한 바와 같다.

(2) PPK의 조제

대장균 PPK를 문헌 (J. Biosci. Bioeng., 91, 557-563(2001))에 기재된 방법으로 조제했다.

PPK의 활성의 단위(유니트)는 이하에 나타낸 방법으로 산출했다. 즉, 10mM 염화마그네슘, 80mM 황산암모늄, 10mM ADP 및 폴리인산(무기인산으로서 30mM)를 함유하는 50mM 트리스염산 완충액(pH 8.0)에 효소 시료액을 첨가하고, 37℃에서 10분간 보온한 후, 비등탕욕 중에서 1분간 처리함으로서 반응을 정지시켰다. 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 반응액 중의 ATP를 정량하고, 1분간에 1 μmole의 ATP를 생성하는 활성을 1 단위(유니트)로 했다.

(3) PAP의 조제

Acinetobacter johnsonii 유래 PAP를 문헌(WO03/100056)에 기재의 방법으로 조제했다.

PAP의 활성의 단위(유니트)는 이하에 나타내는 방법으로 산출했다. 즉, 10mM 염화마그네슘, 80mM 황산암모늄, 10mM AMP 및 폴리인산(무기 인산으로서 30mM)을 함유하는 50mM 트리스염산 완충액(pH 8.0)에 효소 시료액을 첨가하고, 37℃에서 10분간 보온한 후, 비등탕욕 중에서 1분간 처리하여 반응을 정지하였다. 고속 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 반응액 중의 ADP를 정량하고, 1분간에 1 μmole의 ADP를 생성하는 활성을 1 단위(유니트)로 했다.

(4) ADK의 조제

대장균 ADK를 문헌(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14168-14171(2000))에 기재된 방법으로 조제했다.

ADK의 활성의 단위(유니트)는 이하에 나타내는 방법으로 산출했다. 즉, 10mM 염화마그네슘, 10mM AMP 및 10mM ATP를 함유하는 50mM 트리스염산 완충액(pH 8.0)에 효소 시료액을 첨가하고, 37℃에서 10분간 보온 후, 비등탕욕 중에서 1분간 처리하여 반응을 정지시켰다. 고속 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 반응액 중의 ADP를 정량하고, 1분간에 2 μmole의 ADP를 생성시키는 활성을 1단위(유니트)로 했다.

(5) 무기 피로포스파타제의 조제

무기 피로포스파타제는 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics) 사의 것을 사용했다.

무기 피로포스파타제의 활성 단위(유니트)는 이하에 나타내는 방법으로 산출했다. 즉, 10mM 염화마그네슘 및 10mM 무기 피로인산을 함유하는 50mM 트리스염산 완충액(pH 8.0)에 효소 시료액을 첨가하고, 37℃에서 10분간 보온한 후, 비등탕욕 중에서 1분간 처리하여 반응을 정지시켰다. 생성한 무기 인산의 양을 몰리브덴 블루법("Treatise on Analytical Chemistry" I. M. Kolthoff & P. J. Elving편, 제 5권, 317∼402 페이지, Interscience, New York(1961))으로 정량하고, 1분간에 2 μmol의 무기 인산을 생성시키는 무기 피로포스파타제의 양을 1단위(유니트)로 했다.

(6) ATPS 및 APSK의 조제

Geobacillus stearothermophilus 유래 ATPS 및 APSK의 조제는 실시예 1에 기재한 바와 동일하게 하였다.

(7) ADK 및 PNDK를 이용한 본 발명의 ATP 공급·재생계를 공역 시킨 PAPS 합성

25mM 염화마그네슘, 20mM AMP, 100mM 황산나트륨, 폴리인산(인산으로서 100mM)을 함유하는 50mM Hepes-KOH 완충액(pH 8.0)에 ADK(0.1유니트/mL), PNDK(0.1유니트/mL), ATPS(0.25유니트/mL), APSK(0.25유니트/mL) 및 무기 피로포스파타제(1.0유니트/mL)를 첨가하고, 37℃에서 보온했다. 반응액 조성의 경시적 변화를 도 2에 나타낸다. 이 반응에서는, 생성한 ATP의 농도는 ADP나 AMP가 그에 대해 높게 추이하고, 48 시간 후의 PAPS의 생성량은 12.0mM(대 AMP 전환율 60%)이었다.

(8) PAP 및 PNDK를 이용한 본 발명의 ATP 공급·재생계를 공역시킨 PAPS 합성

25mM 염화마그네슘, 20mM AMP, 100mM 황산나트륨, 폴리인산(인산으로서 100mM)을 함유하는 50mM Hepes-KOH 완충액(pH 8.0)에 PAP(0.1유니트/mL), PNDK(0.1유니트/mL), ATPS(0.25유니트/mL), APSK(0.25유니트/mL) 및 무기 피로포스파타제 (1.0유니트/mL)를 첨가하고, 37℃에서 보온했다. 반응액 조성의 경시적 변화를 도 3에 나타낸다. 이 반응에서도, 생성한 ATP의 농도는 ADP나 AMP가 그에 대해 높게 추이하고, 48시간 후의 PAPS의 생성량은 12.3mM(대 AMP 전환율 62%)이었다.

(9) PAP 및 PNDK를 이용한 본 발명의 ATP 공급·재생계를 공역시킨 PAPS 합성(대량 제조 )

용량 2L의 항온 반응 층에, 25mM 염화마그네슘, 40mM AMP, 100mM 황산나트륨, 폴리인산(인산으로서 100mM)을 함유하는 1L의 수용액을 조제하고, 수산화나트륨으로 pH를 8.0으로 조정한 후, 37℃로 온도를 조절했다. 이것에 PAP를 500유니트, PNDK를 500유니트, ATPS를 250유니트, APSK를 250유니트 및 무기 피로포스파타제를 10,000유니트 첨가하여 반응을 개시했다. 반응 개시 6시간 후에 다시 폴리인산(인산으로서 100mM)을 첨가했다. 또, 반응 중에는 수산화나트륨을 이용하여 반응액의 pH를 8.0으로 유지했다. 이 결과, 반응 개시 30시간 후의 PAPS 생성량은 29.3mM(대 AMP 전환율 73%)에 이르렀다.

비교예 1: PPK 및 ADK의 협조 작용을 이용한 종래의 ATP 공급·재생계를 공역시킨 PAPS 합성

25mM 염화마그네슘, 20mM AMP, 100mM 황산나트륨, 폴리인산(인산으로서 100mM)을 함유하는 50mM Hepes-KOH 완충액(pH 8.0)에 PPK(0.1유니트/mL), ADK(0.1유니트/mL), ATPS(0.25유니트/mL), APSK(0.25유니트/mL) 및 무기 피로포스파타제 (1.0유니트/mL)를 첨가하고, 37℃에서 보온했다. 반응액 조성의 경시적 변화를 도 4에 나타낸다. 이 반응에서는, 생성한 ATP 의 농도는 ADP나 AMP가 그에 대해 낮게 추이하고, 48시간 후의 PAPS의 생성량은 2.3mM (대 AMP 전환율 12%)에 지나지 않았다.

비교예 2: PAP 및 ADK를 이용한 종래의 ATP 공급·재생계를 공역시킨 PAPS 합성

25mM 염화마그네슘, 20mM AMP, 100mM 황산나트륨, 폴리인산(인산으로서 100mM)을 함유하는 50mM Hepes-KOH 완충액(pH 8.0)에 PAP(0.1유니트/mL), ADK(0.1유니트/mL), ATPS(0.25유니트/mL), APSK(0.25유니트/mL) 및 무기 피로포스파타제(1.0유니트/mL)를 첨가하고, 37℃에서 보온했다. 반응액 조성의 경시적 변화를 도 5에 나타낸다. 이 반응에서도, 생성한 ATP의 농도는 ADP나 AMP가 그에 대해 낮게 추이하고, 48시간 후의 PAPS의 생성량은 8.2mM (대 AMP 전환율 41%)에 머문다.

지오바실루스·스테아로서모필루스 유래의 ATPS 및 APSK의 아미노산 배열 및 염기배열 모두 전혀 보고되어 있지 않은 상황에 있어서, 본 발명자들에 의해, 지오바실루스·스테아로서모필루스 유래의 ATPS 및 APSK 상당하는 유전자의 클로닝에 처음으로 성공하고, 이것에 의해 지오바실루스·스테아로서모필루스 유래의 ATPS 및 APSK를 유전자 공학의 수법으로, 대량으로 제조하는 것이 가능해졌다. 또한, 유전자 공학으로 얻어진 양효소는 활성적으로 만족할 수 있는 것은 아니었지만, 가열 처리라는 극히 간편하고도 실천적인 처리를 함으로서 양효소의 PAPS 합성 활성이 비약적으로 높아지는 것을 발견하고, 이것에 의해 PAPS를 보다 간편하고도 대량으로 제조하는 것을 처음으로 가능하게 하였다.

<110> YAMASA CORPORATION <120> METHOD OF ENZYMATICALLY SYNTHESIZING 3'-PHOSPHOADENOSINE-5'-PHOSPHOSULFATE <130> 07P011 <150> JP2005-16243 <151> 2005-01-25 <150> JP2005-138115 <151> 2005-05-11 <150> JP2005-215663 <151> 2005-07-26 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1167 <212> DNA <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 1 atgaacatga gcgtaagcat cccgcatggc ggcacattga tcaatcgttg gaatccggac 60 tatccgcttg atgaggcgac caaaacgatc gagctctcca aagccgaact gagcgacttg 120 gagctgatcg gaacgggcgc ctacagcccc ctcactggtt ttttaacgaa aacggattac 180 gacgcggttg ttgaaaccat gcgtctttct gacggcaccg tctggagcat tccgatcacg 240 ctcgcggtaa cagaagaaaa agcgaaagag ctcgccgtcg gcgataaggc gaaactcgtt 300 tatcgtggcg acgtctacgg cgtcattgag attgctgaca tttaccgccc ggacaaaacg 360 aaagaagcga agctcgttta taaaacggat gaacttgccc acccaggcgt gcgcaaactg 420 tttgaaaagc cggatgtgta tgtcggcggg gagattacgc ttgtcaaacg gaccgacaaa 480 ggccaattcg ccgcgtttta ttttgatcca gcggaaacgc ggaaaaagtt tgctgagttt 540 ggctggaaca ccgttgtcgg cttccaaacg 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tccggcacgg gctcaataaa gatctcggct tttccgccgc cgaccggacg 240 gaaaacatcc gccgcatcgg cgaagtggca aagctgtttg tcgacagcgg ccagtttgtg 300 ctgacggcgt tcatctcgcc gtttgccgaa gaccgggcgc tcgtccgccg cttagtcgaa 360 gaagacgagt ttatcgaaat ttacgtcaac tgcccgcttg aagaatgcga aaagcgcgat 420 ccgaaagggc tgtatcaaaa agctcgccgc ggggaaatcc gtgaatttac gggcatcgac 480 tcgccgtacg aagcgccgga agcaccggag ctgacgatcg aaacacaccg ttattcggtt 540 gacgaatgtg tcgagcaagt gctcgcctac ctgcgcgagc gaggaatgat cccggacgcg 600 aaaacagact ga 612 <210> 3 <211> 388 <212> PRT <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 3 Met Asn Met Ser Val Ser Ile Pro His Gly Gly Thr Leu Ile Asn Arg 1 5 10 15 Trp Asn Pro Asp Tyr Pro Leu Asp Glu Ala Thr Lys Thr Ile Glu Leu 20 25 30 Ser Lys Ala Glu Leu Ser Asp Leu Glu Leu Ile Gly Thr Gly Ala Tyr 35 40 45 Ser Pro Leu Thr Gly Phe Leu Thr Lys Thr Asp Tyr Asp Ala Val Val 50 55 60 Glu Thr Met Arg Leu Ser Asp Gly Thr Val Trp Ser Ile Pro Ile Thr 65 70 75 80 Leu Ala Val Thr Glu Glu Lys Ala Lys Glu Leu Ala Val Gly Asp Lys 85 90 95 Ala Lys Leu Val Tyr Arg Gly Asp Val Tyr Gly Val Ile Glu Ile Ala 100 105 110 Asp Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Thr Lys Glu Ala Lys Leu Val Tyr Lys 115 120 125 Thr Asp Glu Leu Ala His Pro Gly Val Arg Lys Leu Phe Glu Lys Pro 130 135 140 Asp Val Tyr Val Gly Gly Glu Ile Thr Leu Val Lys Arg Thr Asp Lys 145 150 155 160 Gly Gln Phe Ala Ala Phe Tyr Phe Asp Pro Ala Glu Thr Arg Lys Lys 165 170 175 Phe Ala Glu Phe Gly Trp Asn Thr Val Val Gly Phe Gln Thr Arg Asn 180 185 190 Pro Val His Arg Ala His Glu Tyr Ile Gln Lys Cys Ala Leu Glu Ile 195 200 205 Val Asp Gly Leu Phe Leu Asn Pro Leu Val Gly Glu Thr Lys Ala Asp 210 215 220 Asp Ile Pro Ala Asp Ile Arg Met Glu Ser Tyr Gln Val Leu Leu Glu 225 230 235 240 Asn Tyr Tyr Pro Lys Asp Arg Val Phe Leu Gly Val Phe Gln Ala Ala 245 250 255 Met Arg Tyr Ala Gly Pro Arg Glu Ala Ile Phe His Ala Met Val Arg 260 265 270 Lys Asn Phe Gly Cys Thr His Phe Ile Val Gly Arg Asp His Ala Gly 275 280 285 Val Gly Asn Tyr Tyr Gly Thr Tyr Asp Ala Gln Lys Ile Phe Leu Asn 290 295 300 Phe Thr Ala Glu Glu Leu Gly Ile Thr Pro Leu Phe Phe Glu His Ser 305 310 315 320 Phe Tyr Cys Thr Lys Cys Glu Gly Met Ala Ser Thr Lys Thr Cys Pro 325 330 335 His Asp Ala Lys Tyr His Val Val Leu Ser Gly Thr Lys Val Arg Glu 340 345 350 Met Leu Arg Asn Gly Gln Val Pro Pro Ser Thr Phe Ser Arg Pro Glu 355 360 365 Val Ala Ala Val Leu Ile Lys Gly Leu Gln Glu Arg Glu Thr Val Ala 370 375 380 Pro Ser Ala Arg 385 <210> 4 <211> 203 <212> PRT <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 4 Met Ser Thr Asn Ile Val Trp His His Thr Ser Val Thr Lys Glu Asp 1 5 10 15 Arg Arg Lys Arg Asn Gly His His Ser Ala Ile Leu Trp Phe Thr Gly 20 25 30 Leu Ser Gly Ser Gly Lys Ser Thr Val Ala Asn Ala Val Ser Arg Arg 35 40 45 Leu Phe Glu Leu Gly Ile Gln Asn Tyr Val Leu Asp Gly Asp Asn Ile 50 55 60 Arg His Gly Leu Asn Lys Asp Leu Gly Phe Ser Ala Ala Asp Arg Thr 65 70 75 80 Glu Asn Ile Arg Arg Ile Gly Glu Val Ala Lys Leu Phe Val Asp Ser 85 90 95 Gly Gln Phe Val Leu Thr Ala Phe Ile Ser Pro Phe Ala Glu Asp Arg 100 105 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ttctgcagcg accttgtcaa atgacctccc 30 <210> 9 <211> 1191 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 9 gcggccgggc gcggtttgat gggggtcaac ggacgcctcc cggcaggggc atagagtggg 60 ggactgcata gctgaaaacg tagaacggaa ggagtcccgc atgagcgaag aacccactgt 120 cagtcccccc tcccccgagc aacccgccgc gcagccggcc aagccggccc ggccagccgc 180 ccgccgcgcc ccgcgcaagc cggcgacccg ccgcccgcga gtggccagcc cggcgcagaa 240 ggcccgcgag gagatccagg caatcagcca gaagccggtg gccctgcagg tcgccagtgc 300 gccccacggc agcagcgagg acagcacctc ggcgagcctg ccggcgaact atccctatca 360 cacgcggatg cgccgcaacg agtacgagaa ggccaagcac gacctgcaga tcgaactgct 420 caaggtgcag agctgggtga aggagaccgg ccagcgcgtg gtggtcctgt tcgaaggccg 480 cgacgccgcc ggcaagggcg gcaccatcaa gcgcttcatg gaacacctga acccgcgcgg 540 cgcgcggatc gtagccttgg agaaaccgtc ctcccaggag cagggccagt ggtatttcca 600 gcgctacatc caacatctgc ccaccgccgg cgagatggtc ttcttcgacc gctcctggta 660 caaccgcgcc ggcgtcgagc gggtcatggg cttctgttcg ccgctgcaat acctggagtt 720 catgcgccag gcgccggagc tggagcgcat gctcaccaac agcggcatcc 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16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification of ppk2 gene <400> 16 aaccatggcg cggatgcgcc gcaacgag 28 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification of ppk2 gene <400> 17 aaccatggac gagtacgaga aggccaag 28 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification of ppk2 gene <400> 18 ttccatggag gtgcagagct gggtgaag 28 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification of ppk2 gene <400> 19 ttccatggac agcacctcgg cgagcct 27 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification of ppk2 gene <400> 20 ttccatggcg agcctgccgg cgaactat 28 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification of ppk2 gene <400> 21 ttccatggtg ccggcgaact atccctatc 29 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification of ppk2 gene <400> 22 ttggatcctg ccgtacaagc agatcgtg 28

Claims

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배열번호 9로 표시되는 염기배열 중의 101∼1171로 이루어진 폴리인산 의존적 뉴클레오시드 5'-디인산 키나제(PNDK)를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, N 말단으로부터 73개 이상, 83개 이하의 아미노산 잔기에 해당하는 염기배열을 결실한 DNA 단편.
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청구항 제12항에 있어서, 73 아미노산 잔기 분, 77 아미노산 잔기 분, 80 아미노산 잔기 분 또는 83 아미노산 잔기 분의 염기배열을 결실한 DNA 단편.
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청구항 제12항 또는 제16항 기재의 DNA 단편을 이용하여 재조합 DNA 수법으로 PNDK를 조제하는 PNDK의 제조법.
청구항 제19항 기재의 방법에 의해 조제된, 배열번호 10의 N 말단 측의 73 내지 83의 아미노산을 결락한 아미노산 배열을 가지는 PNDK.
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ATP를 소비하는 효소반응에 의해 생성되는 유용 물질을 염가이고 효율적으로 제조하는 방법에 있어서, ATP 대신에, 아데노신 5'-모노인산(AMP), 폴리인산, 청구항 제20항 기재의 폴리인산 의존적 뉴클레오티드 5'-디인산 키나제(PNDK) 및 폴리인산:AMP 인산 전이효소(PAP)로 이루어진 아데노신 5'-트리인산(ATP)의 공급·재생계, 또는 아데노신 5'-모노인산(AMP), 폴리인산, 청구항 제20항 기재의 폴리인산 의존적 뉴클레오티드 5'-디인산 키나제(PNDK) 및 아데닐산키나제(ADK)로 이루어진 아데노신 5'-트리인산(ATP)의 공급·재생계를 이용하는 것을 특징으로 하는 유용물질의 제조법.
청구항 제28항에 있어서, ATP를 소비하는 효소반응에 의해 생성되는 유용 물질이 3'-포스포아데노신-5'-포스포술페이트(PAPS), 당뉴클레오티드, S-아데노실메티오닌(SAM)의 어느 하나인 것인 유용 물질의 제조법.
아데노신 5'-트리인산술푸릴라제(ATPS)와 아데노신 5'-포스포술페이트 키나제(APSK)를 이용하여 ATP를 황산화 및 인산화하여 3'-포스포아데노신-5'-포스포술페이트(PAPS)를 제조하는 방법에 있어서, ATP 대신에 청구항 제28항 기재의 ATP의 공급·재생계를 이용하는 것을 특징으로 하는 PAPS의 제조법.
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청구항 제30항에 있어서, 30∼50℃의 반응온도 하에서 PAPS를 효소합성하는 PAPS의 제조법.