CN113046402B - 一种基于构建双功能酶合成paps的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于构建双功能酶合成PAPS的方法，属于生物技术领域。本发明首先对不同来源的ATP硫酸化酶和APS激酶进行优选，利用蛋白质融合技术，将优选所得的ATP硫酸化酶和APS激酶之间融合一段不同的蛋白接头(linker)，构建了双功能PAPS合酶。进一步对linker进行理性设计和改造，大大提高了转化效率，并简化了酶催化剂的获取，减少酶催化剂在制备过程中的损失。使得ATP转化率提高了25％，催化时间缩短59％。此外通过突变ATP硫酸化酶P环HRAH序列为HNGH和HAGH，进一步提高其酶活，使得PAPS的转化率可达48％。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于构建双功能酶合成PAPS的方法，属于生物技术领域。
背景技术
3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate，PAPS)是已知唯一有活性的硫酸基团供体，是生物“活化”的硫酸盐形式，是细胞对无机硫酸盐的吸收和代谢至关重要的物质。此外，已证实多种疾病的产生与发展会引起组织中PAPS含量的改变，如癌症、HIV等。
PAPS是硫酸软骨素、肝素和硫酸皮肤素等最直接的硫酸根供体。目前PAPS的主要来源为提取法和酶法合成。由于PAPS在大多数生物体内直接含量少，使得提取PAPS工艺繁琐，且副产物较多难以纯化，直接导致PAPS的生产成本高昂。
酶法合成PAPS以腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate，ATP)和硫酸根为底物，经ATP硫酸化酶和APS激酶催化合成PAPS。在反应的第一步由ATP硫酸化酶生成腺苷磷酰硫酸(Adenosine phosphosulfate，APS)和副产物焦磷酸，第二步反应APS经由APS激酶催化合成目的产物PAPS和副产腺苷二磷酸(Adenosine diphosphate，ADP)。由于必然产生的副产物ADP，酶法合成PAPS的底物ATP理论转化率为50％。在高等生物，如哺乳动物、海底蠕虫等生物中，PAPS合成酶为双功能酶，使得硫代谢更加多功能高效率。
由于目前PAPS的纯化处起步阶段，所得PAPS纯度有限，直接导致纯度较高的PAPS价格昂贵且限制了其应用。
发明内容
[技术问题]
目前体外酶法合成PAPS主要为双酶一锅法，存在效率与转化率低，成本高等缺点，不利于规模化生产。
[技术方案]
本发明提供一种基于构建双功能酶合成PAPS的方法，是模仿高等生物生产PAPS的方式，也体现了高等生物体的一种进化趋势，利用不同的接头序列将ATP硫酸化酶和APS激酶融合成一个双功能蛋白，实现人工PAPS合成双功能酶的构建。这种将不稳定的中间体导入双功能酶反应中的机制，极大的提高了底物ATP的转化率和转化效率。且在实际生产中也简化了多酶制备的步骤，降低生产成本。并通过突变ATP硫酸化酶保守区域P环HRAH序列为HNGH和HKGH，进一步提高其催化活力。
本发明提供了一种合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的方法，利用PAPS合成双功能酶，以ATP为底物，合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸。
在本发明的一种实施方式中，所述PAPS合成双功能酶是将ATP硫酸化酶和APS激酶通过融合接头序列连接，得到ATP硫酸化酶和APS激酶的融合蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述融合接头序列如SEQ ID NO:1～5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述融合接头序列可以重复多次，重复次数不超过6次。
在本发明的一种实施方式中，所述ATP硫酸化酶来源于乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母或产黄青霉菌。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于乳酸克鲁维酵母的ATP硫酸化酶Gene ID为2894185；
所述来源于酿酒酵母的ATP硫酸化酶Gene ID为853466；
所述来源于产黄青霉菌的ATP硫酸化酶的GenBank号为CAP86100.1。
在本发明的一种实施方式中，所述APS激酶来源于黄青霉菌、大肠杆菌、酿酒酵母或结核分枝杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于产黄青霉菌的APS激酶Gen Bank号为U39393.1；
所述来源于大肠杆菌的APS激酶Gen Bank号为M74586.1；
所述来源于酿酒酵母的APS激酶Gene ID为853869；
所述来源于结核分枝杆菌的APS激酶Gen Bank号为QGK78545.1。
在本发明的一种实施方式中，将所述ATP硫酸化酶第215位～218位的P环上氨基酸序列HRAH突变为HNGH或HAGH。
在本发明的一种实施方式中，在反应体系中加入硫酸盐作为硫酸根供体，在反应中可适当添加。
在本发明的一种实施方式中，硫酸根供体可以是硫酸镁、硫酸钠、硫酸钾。
在本发明的一种实施方式中，硫酸根供体可优选为硫酸镁。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中缓冲溶液为10～50mM Tris-HCl，pH为6.0～8.0，添加2～20mM ATP、1～5mM硫酸镁和2～200mM硫酸钠，0.5～1.0mg/mL PAPS合成双功能酶。
在本发明的一种实施方式中，所述催化反应温度为20～40℃，催化时间为24～72h。
本发明还提供一种提高3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成量的方法，利用PAPS合成双功能酶，以ATP为底物转化合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸。
在本发明的一种实施方式中，所述PAPS合成双功能酶是将ATP硫酸化酶和APS激酶通过融合接头序列连接，得到ATP硫酸化酶和APS激酶的融合蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述融合接头序列如SEQ ID NO:1～5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述融合接头序列可以重复多次，重复次数不超过6次。
在本发明的一种实施方式中，所述ATP硫酸化酶来源于乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母或产黄青霉菌。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于乳酸克鲁维酵母的ATP硫酸化酶Gene ID为2894185；
所述来源于酿酒酵母的ATP硫酸化酶Gene ID为853466；
所述来源于产黄青霉菌的ATP硫酸化酶的GenBank号为CAP86100.1。
在本发明的一种实施方式中，所述APS激酶来源于黄青霉菌、大肠杆菌、酿酒酵母或结核分枝杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于产黄青霉菌的APS激酶Gen Bank号为U39393.1；
所述来源于大肠杆菌的APS激酶Gen Bank号为M74586.1；
所述来源于酿酒酵母的APS激酶Gene ID为853869；
所述来源于结核分枝杆菌的APS激酶Gen Bank号为QGK78545.1。
在本发明的一种实施方式中，将所述ATP硫酸化酶第215位～218位的P环上氨基酸序列HRAH突变为HNGH或HAGH。
在本发明的一种实施方式中，催化合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的催化体系中缓冲液为10～50mM Tris-HCl，pH为6.0～8.0，添加2～20mM ATP、1～5mM硫酸镁，0.5～1.0mg/mL人工PAPS合成双功能酶。
在本发明的一种实施方式中，在催化体系中还可添加2～200mM硫酸钠。
在本发明的一种实施方式中，催化体系添加保护剂甘油、BSA、DTT中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，甘油的添加量为终浓度40～200mg/mL；BSA的添加量为终浓度20～100mg/mL；DTT的添加量为10～50mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述催化反应温度为20～40℃，催化时间为24～72h。
本发明还保护所述合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的方法，或提高3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成量的方法在合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸中的应用。
本发明还保护所述合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的方法，或提高3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成量的方法在利用3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸生产的相关产品中的应用。
[有益效果]
1、本发明通过筛选不同来源的ATP硫酸化酶和APS激酶，获得了优良的ATP硫酸化酶和APS激酶基因，比酶活较其他来源的酶更高，生产得到的PAPS产量也更高。
2、本发明通过借鉴和模仿高等生物的双功能酶模式，利用接头序列人工构建出PAPS合成双功能酶，拉近双酶之间的距离，缩短了中间底物的传递传质过程，提高催化活力，并简化了催化剂的获得，可以降低在反应过程中因为需要添加多种酶，在每次操作时存在的误差从而导致的产量的不稳定，且反应时间显著缩短，反应效率显著提升。
3、本发明通过向反应体系中添加的稳定剂和优化催化体系可以使酶长时间保持较高的活性；与其他体外酶法催化合成PAPS相比，显著的提高了合成效率，降低了成本。
4、本发明通过对ATP硫酸化酶的P环保守区突变，进一步提高了合成效率，使得底物催化转化率达到48％(理论值50％)，可以有效地进行PAPS规模化合成。
附图说明
图1是PAPS合成示意图。
图2是PAPS合成双功能酶构建示意图。
图3是不同来源ATP硫酸化酶和APS激酶纯化胶图；泳道1～5分别是酿酒酵母来源ATP硫酸化酶，克拉维酵母来源ATP硫酸化酶，大肠杆菌来源APS激酶，酿酒酵母来源APS激酶，产黄青霉来源APS激酶。
图4是部分接头序列的双功能酶催化活力比较图。
图5是双功能酶与双酶一锅法合成PAPS转化率比较图。
图6是改造不同P环后双功能酶催化活力比较图。
图7是添加不同稳定剂48h后双功能酶相对活力图。
具体实施方式
1.Escherichia coli BL21(DE3)、pET28a(+)为实验室保藏。
2.质粒构建试剂及测序验证均在上海生物生工公司购买和完成。
3.各种分析纯试剂购自国药集团。
4.培养基：
LB培养基：10g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉。
TB培养基，2.31g/L KH2PO4，12.54g/L K2HPO4，12g/L胰蛋白胨，24g/L酵母粉，4mL/L甘油。
PAPS双功能酶酶活定义为：37℃条件下，每小时合成1μM PAPS所需要的酶量。
PAPS双功能酶的酶活检测方法：反应体系中加入5mM ATP，5mM MgSO4，2mg ASTIV，用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)将反应体系定容至1.5mL，置于37℃恒温孵育24h后，利用高效液相检测PAPS产量。
PAPS检测方法：采用Agilent 1600HPLC系统，Polyamine II柱(4.6×250mm,12nm)，流动相：50mM KH2PO4和0.1％三乙胺溶液，流速：0.6mL·min-1，进样量：5μL，检测时间35min，检测器：UV 254nm。
ATP转化率：产品PAPS的摩尔数与底物ATP的摩尔比值。
实施例1：ATP硫酸化酶和APS激酶的表达和纯化
选取来源于酿酒酵母的ATP硫酸化酶(Gene ID为853466)、来源于产黄青霉菌的ATP硫酸化酶(GenBank号为CAP86100.1)、来源于乳酸克鲁维酵母的ATP硫酸化酶(Gene ID为2894185)，依据大肠杆菌密码子偏好性规律进行密码子优化，将优化后的核苷酸序列连接至质粒pET28a(+)的Nde I和Hind III限制性酶切位点之间，得到重组质粒。
选取来源于产黄青霉菌的APS激酶(Gen Bank号为U39393.1)、来源于大肠杆菌的APS激酶(Gen Bank号为M74586.1)、来源于酿酒酵母的APS激酶(Gene ID为853869)、结核分枝杆菌的APS激酶(Gen Bank号为QGK78545.1)，依据大肠杆菌密码子偏好性规律进行密码子优化，将优化后的核苷酸序列连接至质粒pET28a(+)的Nde I和Hind III限制性酶切位点之间，得到重组质粒。
将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)，验证后在含有卡那霉素(50μg/L)的平板上划线培养，挑取单菌落接种于LB种子培养基中，培养至种子液后，将种子液按1mL/50mL体积分数转接到50mL TB发酵培养基中，继续培养1～2h后加入0.5mM的IPTG并在30℃进行诱导培养6-10h。结束后收集菌体，超声破碎后用于纯化和分析。
将收集的菌体超声破碎后高速离心去除细胞碎片，上清利用0.22μm水系膜过滤，利用Ni-NTA亲和层析对目的蛋白进行纯化。A液平衡柱子后上样粗酶液，再利用A液平衡层析柱，之后利用不同浓度的B液冲洗层析柱并收集冲洗液，利用SDS-PAGE验证纯化的组分，并将最纯的组分用PD-10脱盐柱进行脱盐，脱盐时使用低盐缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1MNaCl；pH 6.0)，收集得到纯化脱盐的蛋白，如图3所示。
A液：20mM Tris-HCl buffer pH 7.5，500mM NaCl；
B液：20mM Tris-HCl buffer pH 7.5，500mM NaCl，500mM咪唑。
实施例2：不同来源的ATP硫酸化酶和APS激酶的比较
将酿酒酵母菌、乳酸克鲁维酵母菌、产黄青霉菌来源的ATP硫酸化酶基因构建至载体上获得目的蛋白后，向催化体系中加入等摩尔蛋白0.1mM，催化体系为50-100mM Tris-HCl buffer pH 7.0～8.5，再加入5mM ATP，4mM MgSO4，35～40℃催化60h，利用高效液相色谱检测APS的生成，比较后酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶的比酶活更高，更具优势。
在获得大肠杆菌、酿酒酵母菌、产黄青霉菌、结核分支杆菌来源的APS激酶蛋白后，级联酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶一同催化比较。向催化体系中加入终浓度为0.1～5mM不同来源的APS激酶和酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶，再加入终浓度为5～10mM的ATP和10～20mM的MgSO4，35～40℃催化55～60h，利用高效液相色谱检测PAPS的生成，比较后大肠杆菌来源的APS激酶比酶活更高，更具优势。
表1不同来源的PAPS合成途径酶的比酶活比较
| 名称 | 比酶活(U/mg) |
| 酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶 | 652±15 |
| 乳酸克鲁维酵母来源的ATP硫酸化酶 | 408±12 |
| 大肠杆菌来源的APS激酶 | 518±22 |
| 产黄青霉菌来源的APS激酶 | 396±25 |
| 酿酒酵母来源的APS激酶 | 308±18 |
实施例3：不同接头序列的双功能酶的酶活测定比较
双功能酶的构建：按照基因操作手段将酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶和大肠杆菌来源的APS激酶融合为一个片段(两种酶的前后顺序不影响其表达)，分别在接头部分添加不同融合接头序列(linker)，融合为一个片段，使两种酶均保持一定的空间位置，催化更加有序，具体为，将前面一个基因的终止密码子去除，与linker直接连接，再与另一个基因的起始密码子连接；linker的序列可以为SEQ ID NO.1～5(分别是GGGGGS、EAAAAK、GMALP、GA2PA3PAKQEA3PAPA2KAEAPA3PA2KA、KESGSVSSEQLAQFRSLD)，此处比较重复次数n＝1。
表达条件：挑取单菌落于LB培养基中过夜培养，将种子按照1mL/50mL接种于TB培养基中，继续培养至OD600为0.6-0.8时进行诱导表达，诱导条件：0.1-0.2mM的IPTG诱导表达(25℃，220rpm)，表达时间为10-15h。重组菌株的培养均需加入50mg/L硫酸卡那霉素以保证质粒的稳定性。
表达后的结果如图4所示，在序列如SEQ ID NO.1～5所示的linker中，SEQ IDNO.1的效果更好，对SEQ ID NO.1所示的重复序列进行优化，结果如表2所示，序列重复次数在1～6之间时，随着重复次数的增加，所得到的双功能酶的比酶活也逐渐提高，因而将重复次数为6的序列简称为PAPS合成双功能酶。
表2双功能酶接头重复次数优化
| 名称 | 比酶活(U/mg) |
| (GGGGS)*1 | 562±18 |
| (GGGGS)*2 | 593±23 |
| (GGGGS)*3 | 613±18 |
| (GGGGS)*4 | 608±25 |
| (GGGGS)*5 | 625±15 |
| (GGGGS)*6 | 660±17 |
实施例4：双酶一锅法和双功能酶法合成PAPS的比较
将纯化所得PAPS合成双功能酶和ATP硫酸化酶及APS激酶经SDS-PAGE验证正确，透析去除盐离子后，向催化体系(含有50-100mM Tris-HCl buffer、pH 7.0～8.5)中加入0.1～5mM大肠杆菌来源的APS激酶和0.1～5mM酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶，向另外的催化体系中加入相同摩尔数的PAPS合成双功能酶，之后加入5～10mM ATP，10～20mM MgSO4，在35～40℃下进行催化反应，反应结束后利用高效液相色谱检测PAPS的生成。
双酶一锅法反应到达终点的时间为68±4h，底物ATP转化率仅为31％，生产强度为22.79±1.26mg/(h·mg蛋白)；双功能酶催化到终点的时间为28±3h，ATP转化率为45％，生产强度为80.35±7.77mg/(h·mg蛋白)。
实施例5：P环优化的双功能酶的酶活测定比较
对PAPS合成双功能酶的ATP硫酸化酶区域P环进行更换和突变，是将ATP硫酸化酶的第215-218位的HARH分别替换为HNGH和HAGH，在获得纯化后的重组蛋白，对其酶催化活力比较分析。向催化体系中添加相同浓度的重组蛋白0.5mg/L，之后加入5mM ATP，4mM MgSO4，比较24h后的PAPS产量。结果如图6所示，HRAH、HNGH、HAGH的比酶活分别为660、680、690U/mg，说明将ATP硫酸化酶的第215-218位的HARH分别替换为HNGH和HAGH之后，同样能够取得较高的酶活，甚至略有提升。
按照实施例4的实施方式，将P环优化后的双功能酶应用于PAPS的制备中，P环优化为HNGH、HAGH之后的双功能酶，其制备得到的PAPS的转化率分别为45％和48％。
实施例6：保护剂的添加对PAPS双功能酶稳定性的影响
向双功能酶蛋白中加入不同的保护剂甘油(40mg/mL)、BSA(20mg/mL)、DTT(10mg/mL)中的1种或2种，在37℃下孵育48h，之后测定双功能酶的活力，用来表征其稳定性。结果如图7所示，添加入甘油、BSA、DTT之后，均对酶的稳定性有不同程度的提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种基于构建双功能酶合成PAPS的方法
<130> BAA200988A
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Glu Ala Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Met Ala Leu Pro
1 5
<210> 4
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gly Ala Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Lys Gln Glu Ala
1 5 10 15
Pro Ala Lys Gln Glu Ala Pro Ala Lys Gln Glu Ala Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Ala Pro Ala Lys Ala Glu Ala Pro Ala Lys Ala Glu Ala Pro Ala
35 40 45
Lys Ala Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Lys Ala
50 55 60
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
Claims (6)
1.一种合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的方法，其特征在于，以ATP为底物，利用PAPS合成双功能酶合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸；所述PAPS合成双功能酶是由ATP硫酸化酶和APS激酶通过融合接头序列连接而成的ATP硫酸化酶和APS激酶的融合蛋白；所述融合接头序列如SEQ ID NO.1～5任一所示；所述ATP硫酸化酶来源于酿酒酵母；所述APS激酶来源于大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合接头序列重复多次，重复次数小于6次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述ATP硫酸化酶第215位～218位的P环上氨基酸序列HRAH突变为HNGH或HAGH。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，催化合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的催化体系中缓冲液为10～50mM Tris-HCl，pH为6.0～8.0，添加2～20mM ATP、1～5mM硫酸镁，0.5～1.0mg/mL PAPS合成双功能酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，催化体系添加保护剂甘油、BSA、DTT中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述催化反应温度为20～40℃，催化时间为24～72h。
Priority Applications (1)
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Application publication date: 20210629 Assignee: NANJING HANXIN PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Assignor: Jiangnan University Contract record no.: X2023980051872 Denomination of invention: A method for synthesizing PAPS based on constructing bifunctional enzymes Granted publication date: 20230428 License type: Common License Record date: 20231213 |
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Application publication date: 20210629 Assignee: BLOOMAGE BIOTECH Co.,Ltd. Assignor: Jiangnan University Contract record no.: X2024980001409 Denomination of invention: A method for synthesizing PAPS based on constructing bifunctional enzymes Granted publication date: 20230428 License type: Common License Record date: 20240125 |