CN115786320A

CN115786320A - 一种基于自组装策略构建固定化酶合成磺酸基供体paps的方法

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Publication number: CN115786320A
Application number: CN202211651602.4A
Authority: CN
Inventors: 康振; 胥睿睿; 汪培林; 堵国成; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-12-21
Filing date: 2022-12-21
Publication date: 2023-03-14

Abstract

本发明公开了一种基于自组装策略构建固定化酶合成磺酸基供体PAPS的方法，属于生物技术领域。本发明提供一种利用聚集蛋白自组装PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶，实现酶的固定化用以合成PAPS。通过进一步对linker进行理性设计和改造，大大提高了转化效率。本发明通过自组装肽同时实现PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶的共固定化，直接破壁添加离心沉淀，实现一步法合成PAPS。固定化PAPS合成双功能酶在循环利用十次后仍具有45％的ATP转化率，约为第一次使用的50％。该方法简化了酶的分离纯化步骤，提高了酶的利用效率，大幅降低了工业化PAPS生产的成本。

Description

一种基于自组装策略构建固定化酶合成磺酸基供体PAPS的方法

技术领域

本发明涉及一种基于自组装策略构建固定化酶合成磺酸基供体PAPS的方法，属于生物技术领域。

背景技术

酶是一种绿色、高效的生物催化剂，广泛应用于工业上高附加值产品的生产。目前工业酶制剂使用过程中存在的主要问题是其在生产、分离和应用过程中的问题。其中酶制剂的生产过程过于复杂；纯化过程过于繁琐且成本过高；酶制剂不能重复利用等一系列问题成为工业上酶法生产高附加值产品的主要制约因素。由于游离酶在催化过程中不断被消耗，回收困难或无法被回收，造成极大的浪费。另外，实际的工业应用过程中仍存在着酶的纯化成本高、稳定性差且不能重复利用的问题。因此，降低酶的生产分离成本，提高酶的稳定性和解决酶的回收问题是提高酶工业属性、实现其高效工业转化的关键。而通过酶固定化技术应用酶是突破这些限制的一种方法。

酶固定化技术是一种通过物理、化学或生物手段将酶束缚在一定的空间内，保留其大部分催化活性，并提高其稳定性和可重复使用次数的一类技术。固定化酶的传统制备方法分为物理法、化学法两大类。物理法包括物理吸附法、包埋法等。吸附法以同体表面物理吸附为依据使酶和不溶性载体相接触达到固定化的目的；包埋法通过将酶包封在高聚物网格或半透膜实现酶的固定化。物理法固定化酶的优点是操作简单、酶载量大且酶不参加化学反应，酶的结构和催化活性不会受到影响。但是吸附法由于载体和酶之间不形成化学键，酶与载体的结合并不稳固。包埋法由于包埋物对底物及产物的交换具有空间阻碍作用，因此对于一些反应并不适用。化学法包括结合法和交联法。结合法是通过形成化学键将酶连接到载体上；而交联法通过交联剂将酶表面的基团交联起来，从而形成大分子的不溶性固定化酶。化学法固定化酶具有良好的热稳定性和贮藏性。但是进行化学修饰时易造成酶失活。

生物固定化是一种新型的酶固定化方法，包括全细胞催化和酶的活性聚集。活性聚集是利用一些短肽(聚集标签)和聚集蛋白或者二者结合使酶在细胞内形成大分子的不溶性固定化酶。包涵体长期以来被认为是错误折叠的无活性的蛋白质聚集体。然而研究表明，目的蛋白和一些标签的结合可以促使活性包涵体的产生，这些标签由含有几个氨基酸短肽链和聚集诱导标签组成。活性包涵体具有许多优点，例如酶活保持性高；纯化简单；稳定性高；易于长期储存；具有可重用性；在与生产细胞分离后基本上不含转基因等，是一种无载体、可生物生产和生物降解的固定化技术。

3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate，PAPS)是腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate，ATP)的衍生物，是磺酸基的活化形式，是已知唯一的活性磺酸基团供体。在硫酸软骨素、肝素和硫酸皮肤素等依靠磺酸化修饰后具有活性的化合物的生物合成中起着重要作用。ADP磷酸化酶是指具有将ADP磷酸化生成ATP能力的酶，包括聚磷酸激酶(ACS Catal.2021,11(16):10405–10415)和聚磷酸外切酶(EnzymeRes.2015；2015:404607.)，ADP磷酸化酶能同时利用PAPS合成过程中的副产物ADP和焦磷酸PPi，与PAPS合成双功酶酶搭配使用，可实现底物ATP等摩尔合成产物PAPS。

由于目前酶法合成PAPS的酶的制备成本过高，直接导致PAPS价格昂贵从而限制了其应用。

发明内容

目前体外酶法合成PAPS需要将过程中的酶进行纯化，利用纯酶进行催化，存在酶分离纯化成本高，催化过程中酶不稳定，不能重复使用等缺点，不利于规模化生产。本发明将PAPS合成过程中的人工PAPS合酶和ADP磷酸化酶用生物自组装法固定化酶法合成PAPS。以ATP和硫酸根为底物，经固定化的酶催化合成PAPS，提高酶的使用效率，降低生产成本。

本发明在前期研究的基础上，提供一种基于构建固定化酶合成PAPS的方法，利用不同的聚集蛋白实现PAPS合成双功能酶(ASAK^S5)和ADP磷酸化酶(PaPPX)的胞内自聚集组装，实现酶的固定化。其中PAPS合成双功能酶(ASAK^S5)催化Mg-ATP和SO₄ ^2-生成产物PAPS和副产物ADP和PPi，ADP磷酸化酶催化副产物生成Mg-ADP和PPi生成ATP，因此两个酶级联催化可实现等摩尔底物ATP和产物PAPS。

这种固定化酶催化合成PAPS的方法在实际生产中简化了酶分离纯化的步骤，显著的提高了酶的稳定性和可重复利用性，极大的降低了生产成本。

本发明提供了一种固定化酶，所述固定化酶是，将光杆菌来源的聚集蛋白CipA或CipB通过SEQ ID NO.11～15任一所述的连接肽连接至酶蛋白的N端或C端得到的；所述酶蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的PAPS合成双功能酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的ADP磷酸化酶，分别得到PAPS合成双功能酶固定化酶和ADP磷酸化酶固定化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述ADP磷酸化酶来源于铜绿假单胞菌，其Gene ID为877947。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于发光杆菌的聚集蛋白CipA的Gene ID为155404。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于发光杆菌的聚集蛋白CipB的Gene ID为1890126。

在本发明的一种实施方式中，将光杆菌来源的聚集蛋白CipA或CipB通过SEQIDNO.11～15任一所述的连接肽连接至酶蛋白的N端或C端得到的。

在本发明的一种实施方式中，编码所述PAPS合成双功能酶的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述ADP磷酸化酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示。

本发明还提供了一种编码上述固定化酶的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pET28a(+)、pCDF-Duet-1为表达载体。

本发明还提供了表达上述固定化酶或携带上述基因或携带上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或者真菌为表达宿主。

本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了上述固定化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以E.coli BL21(DE3)为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以pET28a为表达载体。

本发明提供了一种合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的方法，所述方法为，所述方法为，以ATP和MgSO₄为底物，利用所述固定化酶或所述重组细胞催化转化合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸。

本发明提供了一种酶固定化技术用以合成PAPS的方法，通过不同的自组装肽分别实现PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶的固定化，分别单独添加，实现一锅双酶级联催化合成PAPS，每次反应结束后，通过低温离心收集酶，再进行下一次催化。

在本发明的一种实施方式中，通过自组装肽同时实现PAPS合成双功能酶和PAPS合成双功能酶的共固定化，直接破壁添加离心沉淀，实现一步法合成PAPS。并通过低温离心收集，进行下一次催化。

在本发明的一种实施方式中，所述固定化PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶是将聚集蛋白分别与其通过融合接头序列连接，得到自组装固定化的PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶。

在本发明的一种实施方式中，将所述聚集蛋白及短肽，融合到了PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶的N端和C端。

在本发明的一种实施方式中，所述融合接头序列如SEQ ID NO.11～15所示。

在本发明的一种实施方式中，所述融合接头序列可以是重复序列，重复次数大于等于10次。

在本发明的一种实施方式中，所述人工PAPS合成双功能酶来源于本实验室。由酿酒酵母的ATP硫酸化酶和大肠杆菌的APS激酶通过柔性的接头序列融合而成；

在本发明的一种实施方式中，所述ADP磷酸化酶是指能够磷酸化ADP生成ATP的酶，包括聚磷酸激酶PPK和聚磷酸外切酶PPX。

在本发明的一种实施方式中，所述聚磷酸外切酶为EC 3.6.1.11，其中来源包括不限于铜绿假单胞菌，其Gene ID为877947。

在本发明的一种实施方式中，所述聚集蛋白来源于天然微生物或人工设计。

所述来源于发光杆菌的聚集蛋白CipA的Gene ID为155404；

所述来源于发光杆菌的聚集蛋白CipB的Gene ID为1890126；

所述来自淀粉样β前体蛋白的聚集蛋白Aβ42的Gene ID为112927；

所述自组装蛋白为18A、L6KD、HVdoT、GFIL8、NSPdoT、DMdoT、ELK16、CipA、CipB、Aβ42，优选CipA或CipB。

所述来源于酿酒酵母的聚集短肽EAK16来自于酿酒酵母zuotin的Gene ID为1806634842。

所述人工设计的聚集短肽18A、L6KD、GFIL8、NSPdoT、HVdoT、DMdoT，序列如SEQ IDNO:1～6所示。

在本发明的一种实施方式中，对酿酒酵母来源的聚集短肽EAK16进行了突变，为增强短肽的疏水性将所有的A替换成了L。

在本发明的一种实施方式中，固定化的PAPS合成双功能酶的循环次数至少为10次。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中缓冲溶液为10～50mM Tris-HCl，pH为6.0～8.0，添加2～20mM ATP、4～40mM硫酸镁混合2～200mM硫酸钠和0.5～1.0mg/mL固定化PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述催化反应温度为20～40℃，催化时间为2～10h。

在本发明的一种实施方式中，催化体系添加保护剂麦芽糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘油、BSA中的一种或多种。其中麦芽糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇的添加量为终浓度10～50mg/mL；甘油的添加量为终浓度10-50mL/mL(v/v)；BSA的添加量为终浓度20～100mg/mL。

本发明还保护所述固定化酶合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的方法，或提高3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成量的方法在合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸中的应用。

本发明还提供了一种上述固定化酶或上述基因或上述重组载体或上述重组细胞或上述方法在合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸，或利用3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸生产的相关产品中的应用。

有益效果

1、本发明通过筛选不同的聚集蛋白和聚集短肽，实现了PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶的胞内自组装，实现了PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶的生物法固定化。

2、本发明通过优化聚集蛋白和聚集短肽与PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶结合的位置及接头序列的长短和刚性，显著提高了固定化PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶的催化活性。相比原始的催化体系不需要复杂的纯化，稳定性更高，生产得到的PAPS效率也更高。

3、本发明通过自组装肽同时实现PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶的共固定化，直接破壁添加离心沉淀，实现一步法合成PAPS。

4、本发明通过向反应体系中添加的稳定剂和优化催化体系可以使酶长时间保持较高的活性，固定化的PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶搭配可以重复使用十次仍具有较高的活性。

附图说明

图1是聚集蛋白聚集示意图。

图2是聚集蛋白聚集绿色荧光蛋白显微镜图。

图3是PAPS双功能酶和ADP磷酸化酶融合不同聚集蛋白的包涵体蛋白胶图。

图4是聚集蛋白连接不同连接肽的PAPS双功能酶胶图。

图5是固定化PAPS双功能酶和ADP磷酸化酶与其纯酶的稳定性对比图。

图6是添加不同保护剂对固定化PAPS双功能酶和ADP磷酸化酶稳定性影响图。

图7是反应体系固定化PAPS双功能酶和ADP磷酸化酶添加比例优化图。

图8是固定化PAPS双功能酶和ADP磷酸化酶循环不同的次数1mol ATP转化为1molPAPS的转化率图。

图9是共固定PAPS双功能酶和ADP磷酸化酶蛋白胶图。

图10是固定化共固定PAPS双功能酶和ADP磷酸化酶合成PAPS流程图。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的Escherichia coli BL21(DE3)、pET28a(+)(日本Takara)、pCDF-Duet-1(日本Takara)、pET28a-ASAK^S5、pET28a-PaPPX为实验室保藏，所述pET28a-ASAK^S5的构建方法公开于(ACS Catal.2021,11(16):10405–10415)；所述pET28a-PaPPX通过酶切BamHI/HindIII线性化pET28a(+)和PaPPX(氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示)后一步自组装产生，PaPPX由上海生工根据大肠杆菌进行密码子优化并进行合成。所涉及的质粒构建试剂及测序验证均在上海生物生工公司购买和完成。所涉及的各种分析纯试剂购自国药集团。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB培养基：10g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉。

TB培养基：2.31g/L KH₂PO₄，12.54g/L K₂HPO₄，12g/L胰蛋白胨，24g/L酵母粉，4mL/L甘油。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

包涵体的蛋白定量：将包涵体用8M的尿素溶解，使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型)进行定量。

固定化PAPS双功能酶酶活定义为：35℃条件下，从底物ATP和硫酸镁出发，每小时合成1μM PAPS所需酶量。

固定化PaPPX的酶活定义为：35℃条件下，以ADP为底物，焦磷酸为磷酸供体，每小时合成1μM ATP所需酶量。

ADP磷酸化PaPPX酶活的检测方法：

ATP检测试剂盒购自上海生工。作用原理为己糖激酶催化葡萄糖和ATP形成葡萄糖6-磷酸，葡萄糖6-磷酸脱氢酶进一步催化葡萄糖6-磷酸和NADP⁺脱氢生成NADPH。NADPH在340nm处具有特征吸收峰，NADPH的量与ATP的量成比例。所有程序均按照手册说明进行。

PAPS双功能酶的酶活检测方法：

反应体系中加入5mM ATP，5mM MgSO₄，用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)将反应体系定容至1.5mL，置于35℃恒温孵育2h后，利用高效液相检测PAPS的产量。

PAPS检测方法：

采用Agilent 1600HPLC系统，Polyamine II柱(4.6×250mm,12nm)，流动相：50mMKH₂PO₄和0.1％三乙胺溶液，流速：0.6mL·min^-1，进样量：5μL，检测时间35min，检测器：UV254nm。

PAPS合成转化率：

产品PAPS的摩尔数与底物ATP的摩尔比值。

实施例1：PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶的固定化表达及酶活测定

具体步骤如下：

(1)pET28a-ASAK^S5、pET28a-PaPPX的构建：

所述pET28a-ASAKS5的构建方法公开于(ACS Catal.2021,11(16):10405–10415)；所述pET28a-PaPPX通过酶切BamHI/HindIII线性化pET28a(+)和PaPPX(氨基酸序列如SEQIDNO.17所示)后一步自组装产生，PaPPX由上海生工进行合成。

(2)聚集蛋白(图1～2)的选择

选取来源于发光杆菌的聚集蛋白CipA(Gene ID为155404)、来源于发光杆菌的聚集蛋白CipB(Gene ID为1890126)、来源于酿酒酵母zuotin的EAK16(Gene ID为1879200149)，及人工设计的聚集短肽18A、L6KD、HVdoT、GFIL8、NSPdoT、DMdoT、Aβ42(GeneID为112927)进行选择。

依据大肠杆菌密码子偏好性规律进行密码子优化，聚集蛋白18A、L6KD、GFIL8、NSPdoT、HVdoT、DMdoT、Aβ42、酿酒酵母zuotin(部分区域)、CipA、CipB的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～10所示(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20～29所示)的序列作为聚集蛋白。

(3)将上述优化后的聚集蛋白核苷酸序列通过GGGGS linker分别连接至质粒pET28a-ASAK^S5的C端Not I和Xho I限制性酶切位点之间和N端Ncol I和Bamh I限制性酶切位点之间得到不同重组质粒：pET28a-ASAK^S5-聚集蛋白。

(4)将上述优化后的核苷酸序列分别连接至质粒pET28a-PaPPX的C端Not I和XhoI限制性酶切位点之间和N端Ncol I和Bamh I限制性酶切位点之间得到不同重组质粒：pET28a-PaPPX-聚集蛋白。

(5)分别将重组质粒pET28a-ASAK^S5-聚集蛋白、pET28a-PaPPX-聚集蛋白转入E.coli BL21(DE3)，验证后在含有卡那霉素(50μg/L)的LB平板上划线培养，挑取单菌落接种于LB种子培养基中，培养至种子液后，将种子液按1mL/50mL体积分数转接到50mL TB发酵培养基中，继续培养1～2h后加入0.5mM的IPTG并在30℃进行诱导培养8-12h。结束后收集菌体，称量菌体湿重并超声破碎后用于纯化和分析。所得包涵体胶图如图3所示。

结果显示：ASAK和PaPPX均以胞内沉淀的形式表达。

(5)不同双功能酶ASAK^S5固定化酶的酶活检测：

通过将收集的菌体E.coli BL21(DE3)/pET28a-ASAK^S5-聚集蛋白超声破碎后高速离心收集沉淀，利用pH 7.5的20mM Tris-HCl洗三次对目的蛋白进行除杂；得到含有不同聚集蛋白的双功能酶ASAK^S5的固定化酶；

在催化体系中加入50～100mg上述不同湿菌体破碎得到的固定化双功能酶，终浓度为5～10mM的ATP和10～20mM的MgSO₄，35～40℃催化2～10h，利用高效液相色谱检测PAPS的生成，PAPS合成双功能酶ASAK^S5的N端融合任何聚集蛋白后包涵体皆不具有催化活性，而C端融合不同聚集蛋白PAPS合成双功能酶包涵体的比酶活结果如表1所示。

表1：C端融合不同聚集蛋白PAPS合成双功能酶包涵体的比酶活比较

名称	比酶活(U/g)
		融合发光杆菌来源CipA的ASAK<sup>S5</sup>	270±12
融合发光杆菌来源CipB的ASAK<sup>S5</sup>	12±2
		融合酿酒酵母来源EAK16的ASAK<sup>S5</sup>	76±10
融合人工自组装肽18A的ASAK<sup>S5</sup>	218±13
		融合人工自组装肽L6KD的ASAK<sup>S5</sup>	206±14
融合人工自组装肽GFIL8的ASAK<sup>S5</sup>	0
		融合人工自组装肽HVdoT的ASAK<sup>S5</sup>	155±10
融合人工自组装肽NSPdoT的ASAK<sup>S5</sup>	47±6
		融合人工自组装肽DMdoT的ASAK<sup>S5</sup>	58±5
融合人工自组装肽Aβ42的ASAK<sup>S5</sup>	142±8

结果显示，PAPS合成双功能酶ASAK^S5的N端融合任何聚集蛋白后包涵体皆不具有催化活性，C端融合发光杆菌来源的聚集蛋白CipA的双功能酶包涵体比酶活最高，比酶活为270U/g湿菌体。

(6)不同ADP磷酸化酶固定化酶的酶活检测

通过将酶聚集体的比活性(U/mg酶聚集体)乘以产量(以mg酶聚集体/g湿细胞为单位)来计算的生物量比活性产量可以定义为“每克湿细胞的催化活性”。该参数允许对融合不同聚集蛋白的酶聚集体进行定量比较，考虑其特定的活性和产量，并考虑不同的表达水平和不同程度的稳定性。

步骤(4)得到的E.coli BL21(DE3)/pET28a-PaPPX-聚集蛋白的发酵液，即为不同ADP磷酸化酶的固定化酶；

在催化体系中加入50～100mg不同的湿菌体破碎得到的固定化ADP磷酸化酶，终浓度为5～10mM的ADP和10～20mM的MgSO₄和5～10mM的焦磷酸，35～40℃催化2h，利用高效液相色谱检测ATP的生成，N端融合任何聚集蛋白后皆不具有催化活性，C端融合不同聚集蛋白的ADP磷酸化酶的比酶活结果如表2所示。

表2：C端融合不同聚集蛋白的ADP磷酸化酶的比酶活比较

结果显示，N端融合任何聚集蛋白后皆不具有催化活性。

C端融合发光杆菌来源的聚集蛋白CipA的PaPPX包涵体比酶活最高，比酶活为950U/g湿菌体。

实施例2：不同接头序列的PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶的酶活比较

融合固定化的PAPS合成双功能酶的构建：按照基因操作手段将发光杆菌来源的聚集蛋白CipA和PAPS合成双功能酶ASAK^S5融合为一个片段，分别在接头部分添加不同融合接头序列(linker)，融合为一个片段，使聚集蛋白和PAPS合成双功能酶之间保持一定的空间位置，避免蛋白之间相互干扰，避免聚集蛋白形成致密的结构影响底物的物质交换。

具体为，将前面一个基因的终止密码子去除，与linker直接连接，再与另一个基因的起始密码子连接；linker的序列可以为SEQ ID NO.11～15。

将linker序列设计在引物上后由上海生工进行合成，通过PCR扩增添加linker，然后使用blunting kination ligation(BKL)试剂盒(Takara,Japan)连接产物，所有构建均通过上海生工进行或安升达进行测序验证。

同理构建融合固定化ADP磷酸化酶，对其活性进行验证。

分别制备得到含有不同linker的E.coli BL21(DE3)/pET28a-ASAK^S5-linker-CipA、E.coli BL21(DE3)/pET28a-PaPPX-linker-CipA。

表达条件：

挑取单菌落于LB培养基中过夜培养，将种子按照1mL/50mL接种于TB培养基中，继续培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时进行诱导表达，诱导条件：0.1～0.2mM的IPTG诱导表达(30℃，220rpm)，表达时间为8～12h。重组菌株的培养均需加入50mg/L硫酸卡那霉素以保证质粒的稳定性。

表达后的结果如表3所示，在序列如SEQ ID NO.11～15所示的linker中，SEQ IDNO.15的效果更好。

表3：不同linker融合后的酶活数据

同时，以linker未重复进行对比，具体实施方式同上，区别在于，调整linker分别为(GGGGS)*1，(EAAAAK)*1，(GMALP)*1，结果如表4所示：

表4：不同linker融合后的酶活数据

结果显示，随着linker长度的增加，所得到的双功能酶的比酶活也逐渐提高，使用刚性linker连接的PAPS合成双功能酶的比酶活要高于柔性linker。

最终结果表明使用刚性PTlinker融合的PAPS合成双功能酶的比酶活最高。因而将CipA使用刚性PT linker融合的PAPS合成双功能酶简称为固定化的PAPS合成双功能酶。部分蛋白胶图如图4所示。

实施例3：固定化酶和游离酶稳定性的比较

具体步骤如下：

(1)固定化酶的制备

按照实施例1～2的方法制备得到E.coli BL21(DE3)/pET28a-ASAK^S5-linker-CipA、E.coli BL21(DE3)/pET28a-PaPPX-linker-CipA；其中linker采用的是：PT linker(PTPPTTPTPPTTPTPTP)；

按照实施例1～2的方法分别制备得到ASAK^S5-CipA固定化酶及PaPPX-CipA固定化酶。

(2)游离酶PAPS合成双功能酶ASAK^S5、ADP磷酸化酶PaPPX纯酶的制备

分别将pET28a-ASAK^S5、pET28a-PaPPX导入E.coli BL21(DE3)中，分别制备得到E.coli BL21(DE3)/pET28a-ASAK^S5、E.coli BL21(DE3)/pET28a-PaPPX重组大肠杆菌菌株；

分别将重组大肠杆菌菌株在37℃的LB培养基中培养过夜，并转移到TB培养基中，当OD600达到0.6～0.8，加入0.5mmol/L IPTG在30℃下继续培养8～12h；

然后，通过在4℃下以8000～10，000g离心15分钟来收集细胞。通过在50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5中超声处理破坏细胞。离心除去细胞碎片，收集粗酶溶液作为上清液。使用AKTA start 25(GE Healthcare,美国)蛋白纯化仪进行纯化，用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，30mM咪唑和500mM NaCl)和洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，500mM咪唑和500mM NaCl)中通过镍亲和色谱从粗酶溶液中纯化蛋白质。纯化的蛋白质溶液使用HiTrap脱盐柱(GE Healthcare,美国)和洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)进行脱盐。使用Bradford蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度，分别制备得到游离酶PAPS合成双功能酶ASAK^S5、ADP磷酸化酶PaPPX纯酶；

(3)分别将得到的固定化PAPS合成双功能酶ASAK^S5-CipA、固定化ADP磷酸化酶PaPPX-CipA、游离酶PAPS合成双功能酶ASAK^S5、游离酶ADP磷酸化酶PaPPX纯酶经SDS-PAGE验证正确，透析去除盐离子后；进行反应；

(4)向催化体系(含有50-100mM Tris-HCl buffer、pH 7.0～8.5)中加入0.5g/L的游离PAPS合成双功能酶ASAK；

同时向另外的催化体系(含有50-100mM Tris-HCl buffer、pH 7.0～8.5)中加入0.5g/L固定化PAPS合成双功能酶ASAK-CipA；

分别将上述催化体系在35℃下孵育2～24h，每隔两小时取样并加入10mM ATP，20mM MgSO₄，在35℃下进行催化反应，检测酶的活性，利用高效液相色谱检测PAPS的生成。

(5)ADP磷酸化酶稳定性体系：

向催化体系(含有50-100mM Tris-HCl buffer、pH 7.0～8.5)中加入0.5g/L的游离ADP磷酸化酶PaPPX；

同时向另外的催化体系(含有50-100mM Tris-HCl buffer、pH 7.0～8.5)中加入0.5g/L固定化ADP磷酸化酶PaPPX-CipA；

分别将上述催化体系在35℃下孵育2～24h，每隔两小时取样并加入10mM ADP，10mM焦磷酸钠，在35℃下进行催化反应，检测酶的活性，利用ATP检测试剂盒检测ATP的生成。

结果显示，固定化双功能酶和ADP磷酸化酶的稳定性相对游离的酶均有了显著的提高。结果如图5所示，游离酶PaPPX在35℃孵育24小时后，仍具有70％的相对活性。

固定化酶PaPPX-CipA的相对活性达到了89％，相对游离酶PaPPX提高了20％。

而游离酶ASAK的相对活性仅为其初始活性的44％，而固定化酶ASAK-CipA催化活性为初始活性的73％，相对游离酶提高了29％。

实施例4：保护剂的添加对固定化PAPS双功能酶稳定性的影响

(1)固定化酶的制备

按照实施例1～2的方法制备得到E.coli BL21(DE3)/pET28a-ASAK^S5-linker-CipA；其中linker采用的是：PT linker(PTPPTTPTPPTTPTPTP)；

并按照实施例1～2的方法分别制备得到ASAK^S5-CipA固定化酶。

(2)向双功能酶蛋白ASAK^S5-CipA中加入不同的保护剂麦芽糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘油、BSA的添加量为终浓度10mg/mL，在37℃下孵育24h，之后测定固定化双功能酶的活力，用来表征其稳定性。

结果如图6所示，添加入蔗糖、BSA、甘油和山梨醇之后，均对酶的稳定性有不同程度的提高。其中添加BSA和甘油的效果最为显著，孵育24h后，添加BSA的ASAK^S5-CipA仍具有82％的活性，相比于对照提高了9％。

实施例5：优化固定化PAPS双功能酶和ADP磷酸化酶的添加比例合成PAPS

(1)固定化酶的制备

并按照实施例1～2的方法分别制备得到ASAK^S5-CipA固定化酶及PaPPX-CipA固定化酶。

(2)对固定化PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶的添加比例进行了研究。

将得到的固定化PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶按照不同的比例加入催化体系中，ASAK^S5-CipA固定化酶及PaPPX-CipA固定化酶的比例分别为：1：1、2：1、3：1、5：1和10：1；总的酶的添加量是：1～2g/L。

分别向上述催化体系中加入5～10mM ATP，10～20mM MgSO4，10mg/mL的甘油，在35～40℃下进行催化反应2h，反应结束后利用高效液相色谱检测PAPS的生成。

结果如图7所示，固定化PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶的比例为5：1，即可使10mM的ATP转化为9mM的PAPS，PAPS的转化率达到90％。

实施例6：固定化PAPS双功能酶和ADP磷酸化酶的可重复利用次数的研究

(1)固定化酶的制备

(2)对固定化PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶的可重复利用次数进行了研究。

将得到的固定化PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶加入到催化体系中，其中ASAK^S5-CipA为1g/L，PaPPX-CipA为0.2g/L；之后加入10mM ATP，20mM MgSO₄，10mg/mL的甘油，在35～40℃下进行催化反应2h，反应结束后利用高效液相色谱检测PAPS的生成。

结果如图8所示。将反应结束后的体系离心，上清利用高效液相色谱检测PAPS的生成。

(3)将步骤(2)得到的沉淀，利用pH＝7.5，50-100mM Tris-HCl清洗三次后重新加入新的催化体系进行下一轮的催化，具体为：

将得到的沉淀加入到催化体系中，之后加入10mM ATP，20mM MgSO₄，10mg/mL的甘油，在35～40℃下进行催化反应2h，反应结束后利用高效液相色谱检测PAPS的生成。

按照上述方法，继续进行循环八次，一共循环十次，利用高效液相色谱检测PAPS的生成，结果如图8所示。

结果显示，固定化PAPS合成双功能酶在循环利用十次后仍具有45％的ATP转化率，约为第一次使用的50％。

实施例7：共固定化PAPS双功能酶和ADP磷酸化酶的实现PAPS的合成

选取酶活性最高的固定化PAPS双功能酶和ADP磷酸化酶；其中linker采用的是：PTlinker(PTPPTTPTPPTTPTPTP)。

将固定化的ADP磷酸化酶连接到质粒pCDFDuet的EcoRI和HindIII限制性酶切位点之间得到重组质粒pCDFDuet-PaPPX-linker-CipA。

将重组质粒pCDFDuet-PaPPX-linker-CipA和pET28a-CipAASAK^S5-linker-CipA(制备方法同实施例1～2)转入E.coli BL21(DE3)，验证后在含有卡那霉素和壮观霉素(50μg/L)的平板上划线培养，挑取单菌落接种于LB种子培养基中，培养至种子液后，将种子液按1mL/50mL体积分数转接到50mL TB发酵培养基中，继续培养1～2h后加入0.5mM的IPTG并在30℃进行诱导培养8-12h。

结束后收集菌体，超声破碎后高速离心收集沉淀，利用pH 7.5的20mM Tris-HCl洗三次对目的蛋白进行除杂。蛋白胶图如图9所示。

制备得到含有ASAK^S5-CipA固定化酶及PaPPX-CipA固定化酶的混合酶。

将得到的固定化混酶加入催化体系中，之后加入10mM ATP，120mM MgSO₄，在35～40℃下进行催化反应2h，反应结束后利用高效液相色谱检测PAPS的生成(图10)。

结果显示10mM的ATP可以合成9mM的PAPS，PAPS的合成效率达到90％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种固定化酶，其特征在于，所述固定化酶是，将光杆菌来源的聚集蛋白CipA或CipB通过SEQ ID NO.11～15任一所述的连接肽连接至酶蛋白的N端或C端得到的；所述酶蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的PAPS合成双功能酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的ADP磷酸化酶，分别得到PAPS合成双功能酶固定化酶和ADP磷酸化酶固定化酶。

2.根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，将光杆菌来源的聚集蛋白CipA或CipB通过SEQ ID NO.11～15任一所述的连接肽连接至酶蛋白的C端得到的。

3.编码权利要求1或2所述的固定化酶的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组载体。

5.表达权利要求1或2所述的固定化酶或携带权利要求3所述基因或携带权利要求4所述的重组载体的重组细胞。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或者真菌为表达宿主。

7.一种合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的方法，其特征在于，所述方法为，所述方法为，以ATP和MgSO₄为底物，利用权利要求1或2所述的PAPS合成双功能酶固定化酶和ADP磷酸化酶固定化酶或表达PAPS合成双功能酶固定化酶和ADP磷酸化酶固定化酶的权利要求5或6所述的重组细胞催化转化合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，催化转化体系添加保护剂麦芽糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘油、BSA中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述催化转化体系为：缓冲溶液为10～50mM Tris-HCl，pH为6.0～8.0，添加2～20mM ATP、4～40mM硫酸镁混合2～200mM硫酸钠和0.1～5.0mg/mL固定化PAPS合成双功能酶和ADP磷酸化酶。

10.权利要求1或2所述的固定化酶或权利要求3所述的基因或权利要求4所述的重组载体或权利要求5或6所述的重组细胞或权利要求6～9任一所述的方法在合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸，或利用3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸生产的相关产品中的应用。