CN117512034A - 一种3´-磷酸腺苷-5´-磷酰硫酸的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种3′‑磷酸腺苷‑5′‑磷酰硫酸的合成方法，其反应体系中包括ATP硫酸化酶和APS激酶，分别用于催化以下两步反应：1)ATP硫酸化酶催化ATP和SO4 2‑反应生成5′‑腺苷磷酰硫酸；2)APS激酶催化5′‑腺苷磷酰硫酸生成3′‑磷酸腺苷‑5′‑磷酰硫酸；其中，所述合成方法的反应体系中还加入了无机焦磷酸酶，用于将ATP硫酸化酶催化ATP反应生成5′‑腺苷磷酸硫酸的步骤中产生的焦磷酸降解为磷酸。本发明的方法可以在25～30℃的常温条件下进行，并且反应时间短，1个小时即可制备出大量PAPS，转化率达到80％以上，适合快速制备PAPS。
Description
技术领域
本发明属于合成生物学领域技术领域，具体地说，是一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的合成方法。
背景技术
自然的生物体内存在着各种各样的化学修饰反应，硫酸化反应就是其中一种，其对细胞或生物的发育、分化、免疫等生物学功能的发挥起到重要作用。在生物体中，大多数的硫酸化反应都是通过硫酸转移酶催化3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)的硫酸基团转移到特定底物中合成被硫酸化的代谢产物。
PAPS的生物合成方法主要包括发酵法(包括普通发酵和底物Fed-batch全细胞催化合成)和生物酶法合成。
发酵法是通过引入外源基因对细胞基因组进行改造从而改造细胞的代谢途径，实现从底物ATP到PAPS的转化。在正常生理条件下，细胞内绝大多数的ATP都供给自身进行能量代谢，因此，细胞内实际可用的ATP较少，这导致普通发酵法生产PAPS的转化率较低。CN112625995B公开了一种全细胞催化生产PAPS的方法，其利用分批添加ATP底物，30℃催化反应15-16h，转化率可达96.12％。但多质粒转化可能会导致宿主负荷太大，致使细胞死亡，导致转化率下降或批反应间转化率不稳定。另外，由于细胞膜限制了细胞工厂对底物的摄取以及对产物的渗透，这使得该反应比使用酶法合成花费更长的时间。PAPS作为一种活性高能物质长时间暴露在室温条件下会迅速发生降解，这导致最终实际转化率下降。同时，发酵法由于发生的副反应较多而产生更多的副产物，后期分离纯化成本较高。
目前使用生物酶法合成PAPS的方法较为常见。生物酶法合成PAPS通常分为两步：1)ATP硫酸化酶催化ATP反应生成5′-腺苷磷酰硫酸(Adenosine-5′-phosphosulfate，APS)；2)APS激酶催化APS生成PAPS。正常情况下以ATP和硫酸根为底物，经过ATP硫酸化酶和APS激酶两步催化反应，PAPS的转化率均低于50％。CN113046402B公开了一种基于ATP硫酸化酶和APS激酶构建的一种双功能酶合成PAPS的方法。该方法利用一段linker将ATP硫酸化酶和APS激酶连接起来形成一个新的融合蛋白。其通过优化linker序列以及ATP硫酸化酶的序列可使PAPS的转化率达到48％。
由于PAPS作为一种高能磷酸化合物，在体外不能稳定的长期保存，在生物体内也不容易大量蓄积，这为很多需要硫酸化的代谢产物的生产带来了一定的困难。目前商品化的PAPS价格昂贵(达7000元/5mg，TargetMol)，无法满足大量生产需求。因此，构建稳定、高效的PAPS合成方法对硫酸软骨素、芥子油苷、肝素等化合物的工业化生物合成具有重要意义。
发明内容
针对目前体外酶法合成PAPS的方法存在转化率低，效率低的问题，本发明根据文献查找获得ATP硫酸化酶、APS激酶以及无机焦磷酸酶的基因序列，下载其CDS区序列，选择其催化结构域的部分序列，并对其进行密码子优化，然后选择合适的表达载体和宿主菌，构建ATP硫酸化酶、APS激酶以及无机焦磷酸酶的基因表达载体；将上述表达载体转化宿主菌中，经过诱导表达、纯化以及鉴定，得到高纯度的ATP硫酸化酶、APS激酶以及无机焦磷酸酶，并以此建立了酶法合成PAPS的反应体系。经过验证，本发明的反应体系能够高效合成PAPS。
因此，本发明的目的，就是提供一种稳定高效的体外酶法合成PAPS的方法，具体如下：
一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的合成方法，其反应体系中包括ATP硫酸化酶和APS激酶，分别用于催化以下两步反应：
1)ATP硫酸化酶催化ATP和SO4 2-反应生成5′-腺苷磷酰硫酸；
2)APS激酶催化5′-腺苷磷酰硫酸生成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸；
其中，所述合成方法的反应体系中还加入了无机焦磷酸酶，用于将ATP硫酸化酶催化ATP反应生成5′-腺苷磷酸硫酸的步骤中产生的焦磷酸降解为磷酸。
根据本发明的优选实施例，所述ATP硫酸化酶的编码基因来源于Kluyveromyceslactis.并经过密码子优化，优化的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明的优选实施例，所述APS激酶的编码基因来源于Penicilliumchrysogenum.并经过密码子优化，优化的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明的优选实施例，所述无机焦磷酸酶的编码基因来源于Escherichiacoli.并经过密码子优化，优化的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
根据本发明的合成方法，所述反应体系包括：
反应缓冲液Tris-HCl：20～60mM，SO4 2-：5mM～100mM，ATP：1mM～50mM，ATP硫酸化酶：1.5μM～0.75mM，APS激酶：1.5μM～0.75mM，无机焦磷酸酶：1.5μM～0.75mM。
优选的，所述反应体系包括：
反应缓冲液Tris-HCl：50mM，SO4 2-：5mM，ATP：10mM，ATP硫酸化酶：7.5μM，APS激酶：7.5μM，无机焦磷酸酶：7.5μM。
进一步的，所述SO4 2-的供体为硫酸钠或硫酸镁。
根据本发明的优选实施例，反应缓冲液Tris-HCl的pH为8.0。
根据本发明的优选实施例，所述反应体系的温度为25～30℃。
根据本发明的优选实施例，反应时间为1小时。
本发明的3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的合成方法具有以下有益效果：
1、本发明的方法可以在25～30℃的常温条件下进行，并且反应时间短，1个小时即可制备出大量PAPS，转化率达到80％以上，适合快速制备PAPS。
2、鉴于PAPS在体外不能稳定的长期保存(需要低温-80℃保存)，因此快速制备PAPS对于高产PAPS意义重大，渴望大幅降低PAPS的价格。
附图说明
图1为本发明的PAPS生成反应原理图。
图2显示了APS激酶(APS Kinase)、ATP硫酸化酶(ATP Sulfurylase)和无机焦磷酸酶(PPase)的表达、纯化以及SDS-PAGE鉴定结果，图中，泳道1为粗酶上清液，泳道2为Ni-NTA流穿液，泳道3为QFF洗脱。
图3为PAPS合成体系中PAPS的液相检测结果图。
图4显示了不同反应温度(A)、pH(B)、Mg2+浓度(C)对PAPS转化率的影响。
图5为PAPS反应条件优化前后PAPS转化率的变化。
具体实施方式
本申请的发明人通过表达不同来源的ATP硫酸化酶、APS激酶和无机焦磷酸酶，构建了PAPS反应体系，如图1所示，相比现有的生物酶法两步合成PAPS，本发明在反应体系中增加了无机焦磷酸酶，用于将ATP硫酸化酶催化ATP反应生成5′-腺苷磷酰硫酸的步骤中生成的焦磷酸进一步降解为磷酸，从而推动ATP硫酸化酶催化ATP反应生成5′-腺苷磷酰硫酸的反应平衡向右进行，进而提升整体的PAPS转化率；随后通过优化反应体系中底物的浓度、辅助因子的浓度、反应温度以及pH等，进一步提高了PAPS的转化率。以下通过具体实例对本发明进行详细说明。
以下实施例中所使用的表达宿主Escherichia coli.BL21(DE3)为商业化菌株，可通过常规市售途径获得。
以下实施例中所使用的质粒pET21b(+)为商业化质粒，可通过常规市售途径获得。
以下实施例中所使用的方法，如无特别说明，均为本技术领域中的常规操作，或者是按照产品说明书进行操作。
实施例1、ATP硫酸化酶、APS激酶和无机焦磷酸酶的表达、纯化以及鉴定
分别选取来源于Kluyveromyces lactis.的ATP硫酸化酶基因、来源于Penicilliumchrysogenum.的APS激酶基因和来源于Escherichia coli.的无机焦磷酸酶的基因，依据表达宿主密码子偏好性进行密码子优化，将优化后的基因序列装载进质粒pET21b(+)中，得到相应的重组表达质粒，其中：
Kluyveromyces lactis.来源的ATP硫酸化酶基因的GenBank登录号为XM_454393.1，经密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
Penicillium chrysogenum.来源的APS激酶基因的GenBank登录号为U39393.1，经密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
Escherichia coli.来源的无机焦磷酸酶的基因的GenBank登录号为M23550.1，经密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
将重组表达质粒转化入BL21(DE3)菌株中，经过菌落PCR验证正确后，挑取高拷贝的单克隆菌株，并将其接入含有50μg/l羧苄青霉素(Carbenicillin)的LB种子培养基中，于37℃、200rpm过夜培养。
取2ml种子液接种于200ml LB培养基中，于37℃、200rpm培养至OD600约为0.6，然后加入IPTG至终浓度为0.2～0.4mM，于22℃、150rpm诱导20h，然后离心收集菌体，超声破碎后进行SDS-PAGE检测以及纯化。
将上述收集的菌体进行超声破碎后，10000g离心20min去除细胞碎片，取上清液过0.45μm滤膜，然后依次利用Ni-NTA亲和层析以及QFF柱层析对目的蛋白进行纯化。
Ni-NTA亲和层析的A液：20mM Tris-HCl buffer，pH 7.5；B液：20mM Tris-HClbuffer，1M咪唑，pH 7.5。利用A液进行柱纯化前的清洗、平衡以及样品上柱后的洗杂蛋白，然后利用不同梯度的B液进行洗脱并收集Ni-NTA亲和层析的洗脱液。
将上述收集的Ni-NTA亲和层析的洗脱液进行QFF柱层析。A液：20mM Tris-HClbuffer，pH 7.5；B液：20mM Tris-HCl buffer，1M NaCl，pH 7.5。利用A液进行柱纯化前的清洗、平衡以及样品上柱后的洗杂蛋白，然后利用不同梯度的B相进行洗脱并收集QFF柱层析的洗脱液。对收集的QFF柱层析的洗脱液进行脱盐、浓缩以及SDS-PAGE鉴定，最终得到纯化后的脱盐目的蛋白。
图2显示了SDS-PAGE的鉴定结果，可见ATP硫化酶、APS激酶以及无机焦磷酸酶在大肠杆菌中为可溶性表达。其中，APS激酶的粗酶上清液几乎完全被Ni-NTA层析柱吸附，QFF纯化洗脱后APS激酶纯度为90％以上。ATP硫酸化酶和无机焦磷酸酶的粗酶上清液有部分未被Ni-NTA层析柱吸附，QFF纯化洗脱后ATP硫酸化酶和无机焦磷酸酶的纯度为75％-80％左右。
蛋白纯化后使用20mM Tris-HCl buffer，pH 7.5进行换液浓缩，并将蛋白保存于含有30％甘油的上述溶液中。使用BCA蛋白浓度试剂盒进行蛋白浓度测定，保存ATP硫酸化酶为3mg/ml，APS激酶为26.7mg/ml，无机焦磷酸酶为57mg/ml。
实施例2、PAPS合成体系建立及PAPS合成
PAPS合成体系包括Tris-HCl缓冲盐、ATP、SO4 2-、Mg2+、Li+、ATP硫酸化酶、APS激酶以及无机焦磷酸酶等，具体反应浓度及反应条件如下：
配制10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM系列浓度的Tris-HCl溶液,调节pH为7。配置ATP溶液系列浓度为1mM、10mM、20mM、40mM、50mM、80mM、100mM。配置Na2SO4和LiCl溶液的浓度为1mM、10mM、20mM、40mM、50mM、80mM、100mM。配置MgCl2溶液浓度为1mM。配置ATP硫酸化酶、APS激酶以及无机焦磷酸酶的系列浓度为1μM、1.5μM、3μM、10μM、20μM、40μM、80μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1mM。
按照上述系列浓度配制反应体系进行正交试验，于常温下反应30min，然后经过100℃金属浴10min，最后12000g，离心10min，取上清，用于液相分析检测。进行上述反应时，每次考察一个变量的使用浓度，其他物料均使用最小浓度或中间浓度。
PAPS的液相检测条件如表1所示：
表1：液相检测条件
液相检测结果如图3所示，PAPS的保留时间为3.639min，表明反应体系中有PAPS生成。
根据正交试验的结果，反应体系中ATP、SO4 2-、Li+的浓度并不是越大越好，当这三者的浓度均在60mM以上时，反应体系中的蛋白容易析出，PAPS转化率极低。通过检测PAPS生成，初步摸索出各物料的使用浓度。PAPS反应体系中，反应缓冲液Tris-HCl的使用浓度为20～60mM，SO4 2-的使用浓度为5mM～100mM，ATP的使用浓度为1mM～50mM，ATP硫酸化酶、APS激酶和无机焦磷酸酶的使用浓度均为1.5μM～0.75mM。
实施例3、考察反应温度对PAPS生成的影响
配制5个1ml的PAPS反应体系，其中Tris-HCl，pH 7.0浓度为20mM，ATP浓度为1mM，SO4 2-浓度为5mM，Mg2+的浓度为10mM，Li+的浓度为5mM，ATP硫酸化酶、APS激酶和无机焦磷酸酶的浓度为1.5μM。将上述反应体系分别于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃反应30min，然后经过100℃金属浴10min终止反应，最后12000g，离心10min，取上清，进行液相分析检测。液相检测条件同实施例2中所述。
通过计算上述反应体系中PAPS的转化率(PAPS转化率＝[C(实际检测)/C(理论生成)]×100％)发现，反应温度在40℃时，PAPS的转化率最高可达78％，温度低于40℃时，温度越高，PAPS转化率越高，而当温度高于40℃时，PAPS转化率急速下降，结果见图4A。
实施例4、考察pH对PAPS生成的影响
配制7个1ml的PAPS反应体系，其中Tris-HCl的浓度为20mM，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。其余物料使用浓度同实施例3。
将上述反应体系于室温反应30min，然后经过100℃金属浴10min终止反应，最后12000g，离心10min，取上清，进行液相分析检测。液相检测条件同实施例2。
通过计算上述反应体系中PAPS的转化率发现，当缓冲液Tris-HCl的pH为8.0时，PAPS的转化率最高达到71％，过高或过低pH均不利于PAPS生成，结果见图4B。
实施例5、考察不同浓度的Mg2+对PAPS生成的影响
配制6个1ml的PAPS反应体系，其中Mg2+浓度分别为1mM、5mM、10mM、20mM、25mM、50mM。其余物料使用浓度同实施例3。
将上述反应体系于室温反应30min，然后经过100℃金属浴10min终止反应，最后12000g，离心10min，取上清，进行液相分析检测。液相检测条件同实施例2。
通过在PAPS合成体系中加入不同浓度的Mg2+并计算此时的PAPS的转化率发现，当反应体系中的Mg2+浓度为1mM时，PAPS的转化率最高。随着反应体系中Mg2+浓度的增加，PAPS的转化率急剧下降，结果如图4C所示。
实施例6、各反应因素优化前后对PAPS转化率的影响
综合上述PAPS反应体系中各反应因素(ATP浓度、Mg2+浓度、SO4 2-浓度、温度、pH影响)的结果，配制2种10ml的PAPS反应体系，具体如表2所示。
表2：10ml PAPS反应体系
25～30℃反应1h后，PAPS的转化率结果如图5所示，可知优化前PAPS的转化率不足20％，经过优化后，PAPS的转化率达到了82％，提升了4倍有余。
基于上述方法，本领域技术人员容易看出，通过分批添加补料、扩大反应体系、适当延长反应时间以及优化底物浓度等本领域已知的方法，可以达到大批量制备PAPS的目的。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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Claims (10)
1.一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的合成方法，其反应体系中包括ATP硫酸化酶和APS激酶，分别用于催化以下两步反应：
1)ATP硫酸化酶催化ATP和SO4 2-反应生成5′-腺苷磷酰硫酸；
2)APS激酶催化5′-腺苷磷酰硫酸生成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸；
其特征在于，所述合成方法的反应体系中还加入了无机焦磷酸酶，用于将ATP硫酸化酶催化ATP反应生成5′-腺苷磷酸硫酸的步骤中产生的焦磷酸降解为磷酸。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述ATP硫酸化酶的编码基因来源于Kluyveromyces lactis.并经过密码子优化，优化的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述APS激酶的编码基因来源于Penicillium chrysogenum.并经过密码子优化，优化的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述无机焦磷酸酶的编码基因来源于Escherichia coli.并经过密码子优化，优化的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述反应体系包括：
反应缓冲液Tris-HCl：20～60mM，SO4 2-：5mM～100mM，ATP：1mM～50mM，ATP硫酸化酶：1.5μM～0.75mM，APS激酶：1.5μM～0.75mM，无机焦磷酸酶：1.5μM～0.75mM。
6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述反应体系包括：
反应缓冲液Tris-HCl：50mM，SO4 2-：5mM，ATP：10mM，ATP硫酸化酶：7.5μM，APS激酶：7.5μM，无机焦磷酸酶：7.5μM。
7.根据权利要求5或6所述的合成方法，其特征在于，所述SO4 2-的供体为硫酸钠或硫酸镁。
8.根据权利要求5或6所述的合成方法，其特征在于，反应缓冲液Tris-HCl的pH为8.0。
9.根据权利要求5或6所述的合成方法，其特征在于，所述反应体系的温度为25～30℃。
10.根据权利要求5或6所述的合成方法，其特征在于，反应时间为1小时。
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