CN113999827B - 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明将来源于微生物Exiguobacterium sibiricum的NADH依赖型亮氨酸脱氢酶(LeuDH)作为亲本，基于定点突变技术对酶结构进行改造，通过半理性设计的方法获得了催化活性提高的突变体K77S/N270L/L52S和K77S/N270L/T143C。相对于亲本无法催化戊酮，该突变体酶在25℃孵育条件下，对戊酮体现催化活性。本发明所述突变体使得难以催化的戊酮底物展现催化活性，具有更好的工业化应用前景。

Description

一种亮氨酸脱氢酶突变体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其是指一种亮氨酸脱氢酶突变体及其制备方法与应用。
背景技术
亮氨酸脱氧酶(Leucine dehydrogenase，LeuDH，EC1.4.1.9)是一种辅酶 NADH依赖型的氧化还原酶，它能将手性酮酸氢化还原生成对应的手性非天然氨基酸，并具有反应条件温和、产物光学纯和转化效率高等优点。1961 年，Sanwal等人最先在Bacillus cereus中克隆和表达了亮氨酸脱氧酶，随后，对不同菌株来源的亮氨酸脱氢酶基因进行克隆和异源表达，可以为一些手性非天然氨基酸的生物合成提供更多途径。亮氨酸脱氢酶是一种常见的氧化还原酶，来源广泛。来源不同的亮氨 酸脱氢酶具有不同的催化性质和功能，通过基因工程手段构建高酶活菌株可以改善反应。
然而，野生型亮氨酸脱氢酶目前难以催化脂肪族酮类。目前，蛋白质工程已成为帮助野生型酶克服自身局限性的重要手段；2012年，Abrahamson 等人以天然的Baillusstereothermophilus亮氨酸脱氢酶为模板，在酶活性口袋与天然底物羧基结合的两个关键位点K68和N261由亲水性残基突变为疏水性残基S68和L261之后，其催化的底物由脂肪族氨基酸改变为不含羧基的脂肪酮类化合物，创造出了非天然的胺脱氢酶(aminedehydrogenase， AmDH)。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其制备方法与应用。本发明提供了催化活性提高的亮氨酸脱氢酶突变体，所述突变体以来源于微生物Exiguobacterium sibiricum的亮氨酸脱氢酶(LeuDH)为亲本，对第52位、第77位、第270位突变，具体说，是将亲本中的Leu52 位的亮氨酸突变为丝氨酸Ser，Lys77位的赖氨酸突变为丝氨酸Ser，Asn270 位的天冬氨酸突变为亮氨酸Leu，获得三元突变体酶，命名为 K77S/N270L/L52S。对第143位、第77位、第270位突变，具体说，是将亲本中的Thr52位的苏氨酸突变为半胱氨酸Cys，Lys77位的赖氨酸突变为丝氨酸Ser，Asn270位的天冬氨酸突变为亮氨酸Leu，获得三元突变体酶，命名为K77S/N270L/T143C。
一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述突变体在氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示的亮氨酸脱氢酶为亲本，将所述亲本序列中第77位氨基酸突变为丝氨酸和第270位氨基酸突变为亮氨酸，将第52位和/或第143位氨基酸突变为除与自身同一生化特性类别氨基酸以外的其他任意氨基酸。
在本发明的一个实施例中，所述突变体在氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示的亮氨酸脱氢酶为亲本，将所述亲本序列中第77位氨基酸突变为丝氨酸和第270位氨基酸突变为亮氨酸，将第52位突变为丝氨酸和/或第143位氨基酸突变为半胱氨酸。
在本发明的一个实施例中，所述突变体酶突变体的氨基酸序列见SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5。
在本发明的一个实施例中，编码所述突变体酶突变体的核苷酸序列见 SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.6。
在本发明的一个实施例中，携带所述的表达载体的表达宿主为大肠杆菌 BL21(DE3)。
一种核酸，编码所述的亮氨酸脱氢酶突变体。
一种重组载体，携带所述的核酸。
在本发明的一个实施例中，所述重组载体的载体为pET28a(+)。
一种重组菌，包含所述的重组载体。
在本发明的一个实施例中，所述重组菌的宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。
一种亮氨酸脱氢酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
(1)根据突变位点设计突变引物，以携带亮氨酸脱氢酶亲本编码基因的重组载体为模板进行定点突变，构建含编码突变体基因的表达载体；
(2)将含编码突变体基因的表达载体转化进表达宿主；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养或96孔板筛菌，离心收集细胞，将细胞进行超声破碎后再离心所得上清液，得到所述亮氨酸脱氢酶突变体。
所述亮氨酸脱氢酶突变体的具体制备方法为：
(1)在亲本LeuDH的三维结构模型以及保守性的基础上确定突变位点；
(2)以pET28a(+)-LeuDH为模板，设计正向和反向突变引物，使用全质粒PCR方法对LeuDH进行突变，突变引物如下所示，下划线为突变位点：
Leu52-F：5’-GGGTCCGGCACTGGGTGGTDBBCGTATGTGGAATTAC -3’
Leu52-R：5’-GTAATTCCACATACGVVHACCACCCAGTGCCGGACCC -3’
Thr143-F：CACATGGAGACCGACTTTGTDBSCGGCGTTAGTCCGG
Thr143-R：CCGGACTAACGCCGSVHACAAAGTCGGTCTCCATGTG
(3)将构建成功的突变体质粒导入表达宿主E.coli BL21(DE3)，在96 孔板中挑选验证后的阳性单克隆进行诱导表达培养；
(4)对活性表现最好的突变体离心处理菌液，用缓冲液重悬后进行超声破碎，通过镍离子亲和层析纯化得到突变体酶K77S/N270L/L52S和 K77S/N270L/T143C。
所述的亮氨酸脱氢酶突变体在合成2-氨基戊烷中的应用，并以戊酮为底物。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明所述的本发明在一种来自微生物Exiguobacterium sibiricum的亮氨酸脱氢酶基础上，通过半理性设计和定点突变技术改造亮氨酸脱氢酶分子结构，最终获得了催化活性提高的突变体酶K77S/N270L/L52S和 K77S/N270L/T143C，在25℃下孵育，K77S/N270L/L52S的活性比 K77S/N270L提高了118％，K77S/N270L/L52S的活性比K77S/N270L提高了 188％，而亲本在对戊酮完全没有活性。突变体酶K77S/N270L/L52S的酶活为1.55Umg-1，突变体酶K77S/N270L/T143C的酶活为2.05U mg-1。
催化活性的突变体酶在催化工艺中使得工业生产的成本更低，具有实际应用意义。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明亲本的保守性分析；
图2是本发明单个96孔板筛菌的结果；
图3是本发明亮氨酸脱氢酶(44kDa)在经过镍柱纯化后用过SDS-PAGE 验证。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明基于一种高酶活的LeuDH重组大肠杆菌工程菌，该大肠杆菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶，SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明根据uniprotKB数据库，在Glu/Leu/Phe/Val dehydrogenases家族中的所有序列中选择长度在 300-400无冗余蛋白序列(数量：13051；日期：28/07/2020)，将这13051 个序列在MAFFT服务器使用“mafft-add”模块基于结构进行比对并用软件统计了全位点所有氨基酸在13051个序列中的出现频率，并以此为依据指导底物口袋附近位点进行突变，从96孔板中筛选从而获得了催化活性增强的亮氨酸脱氢酶突变体，为拓宽亮氨酸脱氢酶的工业化应用打下了基础。
本发明提供了催化活性提高的亮氨酸脱氢酶突变体，所述突变体以来源于微生物Exiguobacterium sibiricum的亮氨酸脱氢酶(LeuDH)为亲本，对第52位、第77位、第270位突变，具体说，是将亲本中的Leu52位的亮氨酸突变为丝氨酸Ser，Lys77位的赖氨酸突变为丝氨酸Ser，Asn270位的天冬氨酸突变为亮氨酸Leu，获得三元突变体酶，命名为K77S/N270L/L52S。
对第143位、第77位、第270位突变，具体说，是将亲本中的Thr52 位的苏氨酸突变为半胱氨酸Cys，Lys77位的赖氨酸突变为丝氨酸Ser， Asn270位的天冬氨酸突变为亮氨酸Leu，获得三元突变体酶，命名为 K77S/N270L/T143C。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，则均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，则均为本领域的常规方法。
本发明亮氨酸脱氢酶活力测定方法：
活性的测量在含有20mM底物和0.2mM的NADH的NH4CL/NH4OH buffer(2M，pH 9.5)中进行，活性参数由NADH的消耗量计算。
在上述反应条件下，将每分钟产生1μmol NADH所需的酶量定义为1个酶活单位，即1U。
酶活力计算公式：酶活(U)＝EW×V×103/(6220×L)；
EW为1min内吸光度的变化；V为反应体积(mL)；6220为NADH的摩尔消光系数；L为光程距离(cm)。
实施例中涉及到的培养基如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L；pH 7.0， 121℃灭菌20min；LB固体培养基为在液体培养基基础上添加质量浓度20g/L 的琼脂粉。
TB液体培养基：酵母提取物24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油4mL/L；K2HPO472 mmol/L，KH2PO417 mmol/L，121℃灭菌20min。
实施例1：96孔板筛菌
根据口袋附近位点的保守性，设计包含了其他可能出现的氨基酸的简并密码子引物，挑选平板上的转化子于96深孔板中培养，每个孔含200μL LB 培养基(kan浓度为50μg/mL)，然后置于37℃，250rpm的恒温摇床上震荡培养过夜。之后从每个孔吸取50μL种子液转移到另一块位置对应的96深孔板，每个孔含400μL LB培养基(kan浓度为50μg/mL)。在37℃，250rpm 的恒温摇床上震荡培养3-4h。接着，加入50μL 2mM的IPTG诱导表达 LeuDH，于25℃，250rpm的恒温摇床上震荡培养18h。诱导后的菌液吸取 100μL测OD。之后于高通量深孔板离心机离心收菌(4℃，1900x g，5min)，向每个孔加入含有溶菌酶和DNAseI的Tris-HCl缓冲液200μL，室温孵育15 min。最后2600x g离心10min，澄清的上清液即为粗酶液。实验结果见图2，先通过粗酶液的测量，从大量突变菌株中选出粗酶酶活提高的菌株，再通过纯酶的测量到准确的结论。
实施例2：突变体酶K77S/N270L/L52S和K77S/N270L/T143C的表达与纯化
将重组大肠杆菌于摇瓶过表达，在OD达到0.6时，加入终浓度为0.3mM 的IPTG诱导表达，然后于恒温摇床培养16h(25℃，180rpm)。在冰上使用超声破碎仪破碎。之后于4℃，12000rpm离心20min，上清液用于蛋白纯化或者粗酶液的提取。对于蛋白纯化，将经过0.22μm滤膜超滤后的上清液装载于Ni-NTA凝胶柱，以1mL/min的冲洗速度使用20-500mM浓度梯度的咪唑洗脱于含有500mM NaCl的Tris-HCl(500mM)缓冲液，大部分蛋白被收集在洗脱液中。洗脱液经过SDS凝胶电泳分析。使用MWCO 30000da的滤柱超滤出去咪唑。纯化的酶于磷酸盐缓冲液收集。根据Bradford法测定纯化后酶液的蛋白浓度，通过SDS-PAGE检测蛋白纯度。结果见图3，由图可知，得到条带正确的、高纯度的纯酶后，酶活的计算由酶的活性单位由酶活除以蛋白含量得到，是酶活检测前的样品准备工作，备用。
实施例3：突变体酶K77S/N270L/L52S和K77S/N270L/T143C的催化活性
在25℃温度，200μL反应体系包含：一定量的纯酶，20mM底物，0.2mM NADH，2M氯化铵氨水缓冲液(pH 9.5)。保温2min后添加适当酶液开始反应1min并测定340nm处吸光度的变化。根据NADH的减少量计算酶活。
实验结果：
表1 esi改造的胺脱氢酶对于底物戊酮的酶活测量
Figure BDA0003380171870000071
实验结论：K77S/N270L/L52S和K77S/N270L/T143C，，K77S/N270L/L52S的活性比K77S/N270L提高了118％，K77S/N270L/L52S 的活性比K77S/N270L提高了188％，而亲本在对戊酮完全没有活性。
序列信息：
1，本发明亮氨酸脱氢酶突变体亲本的氨基酸序列为(如SEQ ID NO.1所示)：
MVETNVEARFSIFETMAMEDYEQVVFCHDKVSGLKAIIAIHDTTLGPA LGGLRMWNYASDEEALIDALRLAKGMTYKNAAAGLNLGGGKAVIIGDAK TQKSEALFRAFGRYVQSLNGRYITAEDVNTTVADMDYIHMETDFVTGVSP AFGSSGNPSPVTAYGVYRGMKAAAKEVYGTDSLGGKTVAIQGVGNVAFNL CRHLHEEGAKLIVTDINQDALRRAEEAFGALVVGPDEIYSVDADIFAPCAL GATLNDETIPQLKVKIIAGAANNQLKEDRHGDMLQERGILYTPDFVINAGG VINVADELDGYNRERAMKKVELVYDAVAKVIEIAKRDHLPTYRAAEKMAEERIATMGSARSQFLRRDKNILGSRG
2，本发明亮氨酸脱氢酶亲本的核苷酸序列(如SEQ ID NO.2所示)为：
ATGGTTGAAACCAACGTCGAAGCGCGTTTCAGCATCTTCGAAACC ATGGCGATGGAGGATTACGAGCAGGTCGTTTTCTGCCACGACAAAGTT AGCGGCCTGAAAGCGATCATTGCGATTCACGATACCACCCTGGGTCCGGCACTGGGTGGTCTGCGTATGTGGAATTACGCATCTGACGAAGAAGCG CTGATTGACGCACTGCGTCTGGCCAAAGGTATGACCTACAAAAACGCG GCAGCAGGTCTGAATCTGGGCGGCGGTAAAGCAGTTATCATCGGCGAC GCGAAAACCCAGAAAAGCGAAGCACTGTTTCGCGCATTTGGTCGTTAC GTTCAGAGCCTGAACGGCCGCTATATTACCGCAGAAGACGTTAATACC ACCGTTGCAGACATGGACTACATCCACATGGAGACCGACTTTGTTACCG GCGTTAGTCCGGCATTTGGTAGTTCTGGTAATCCGAGTCCGGTTACGGC ATATGGTGTTTATCGCGGCATGAAAGCGGCAGCGAAAGAAGTTTACGG TACCGATAGCCTGGGCGGTAAAACCGTTGCAATTCAAGGCGTTGGCAA CGTTGCCTTTAACCTGTGTCGTCATCTGCACGAAGAAGGCGCAAAACTG ATCGTTACCGATATTAATCAGGACGCACTGCGTCGCGCAGAAGAAGCA TTTGGCGCACTGGTTGTTGGTCCGGACGAAATTTATAGCGTTGACGCGG ATATTTTTGCACCGTGCGCACTGGGCGCAACCCTGAACGACGAAACCA TCCCGCAGCTGAAAGTCAAAATTATTGCGGGCGCGGCGAACAATCAGC TGAAAGAAGATCGCCACGGCGATATGCTGCAAGAACGCGGTATTCTGT ACACCCCGGATTTTGTCATTAACGCAGGCGGCGTTATCAACGTAGCGG ACGAACTGGACGGTTATAATCGCGAACGCGCGATGAAAAAAGTCGAGCTGGTTTACGACGCGGTTGCGAAAGTCATTGAGATCGCAAAACGCGATC ATCTGCCGACCTATCGCGCTGCCGAAAAAATGGCGGAAGAACGTATTG CAACCATGGGTTCTGCACGTAGTCAGTTTCTGCGTCGCGACAAAAACAT CCTGGGTAGTCGCGGTTAAAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCA CCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCT
3，本发明氨酸脱氢酶突变体K77S/N270L/L52S的氨基酸序列(见SEQ ID NO.3)为：
MVETNVEARFSIFETMAMEDYEQVVFCHDKVSGLKAIIAIHDTTLGPA LGGSRMWNYASDEEALIDALRLAKGMTYSNAAAGLNLGGGKAVIIGDAK TQKSEALFRAFGRYVQSLNGRYITAEDVNTTVADMDYIHMETDFVTGVSP AFGSSGNPSPVTAYGVYRGMKAAAKEVYGTDSLGGKTVAIQGVGNVAFN LCRHLHEEGAKLIVTDINQDALRRAEEAFGALVVGPDEIYSVDADIFAPCA LGATLNDETIPQLKVKIIAGAALNQLKEDRHGDMLQERGILYTPDFVINAG GVINVADELDGYNRERAMKKVELVYDAVAKVIEIAKRDHLPTYRAAEKMAEERIATMGSARSQFLRRDKNILGSRG
4，本发明氨酸脱氢酶突变体K77S/N270L/L52S的核苷酸序列(见SEQ ID NO.4)为：
ATGGTTGAAACCAACGTCGAAGCGCGTTTCAGCATCTTCGAAACCA TGGCGATGGAGGATTACGAGCAGGTCGTTTTCTGCCACGACAAAGTTAG CGGCCTGAAAGCGATCATTGCGATTCACGATACCACCCTGGGTCCGGCA CTGGGTGGTAGTCGTATGTGGAATTACGCATCTGACGAAGAAGCGCTGA TTGACGCACTGCGTCTGGCCAAAGGTATGACCTACAGCAACGCGGCAGC AGGTCTGAATCTGGGCGGCGGTAAAGCAGTTATCATCGGCGACGCGAAAACCCAGAAAAGCGAAGCACTGTTTCGCGCATTTGGTCGTTACGTTCAGA GCCTGAACGGCCGCTATATTACCGCAGAAGACGTTAATACCACCGTTGC AGACATGGACTACATCCACATGGAGACCGACTTTGTTACCGGCGTTAGT CCGGCATTTGGTAGTTCTGGTAATCCGAGTCCGGTTACGGCATATGGTGT TTATCGCGGCATGAAAGCGGCAGCGAAAGAAGTTTACGGTACCGATAGC CTGGGCGGTAAAACCGTTGCAATTCAAGGCGTTGGCAACGTTGCCTTTA ACCTGTGTCGTCATCTGCACGAAGAAGGCGCAAAACTGATCGTTACCGA TATTAATCAGGACGCACTGCGTCGCGCAGAAGAAGCATTTGGCGCACTG GTTGTTGGTCCGGACGAAATTTATAGCGTTGACGCGGATATTTTTGCACC GTGCGCACTGGGCGCAACCCTGAACGACGAAACCATCCCGCAGCTGAA AGTCAAAATTATTGCGGGCGCGGCGCTAAATCAGCTGAAAGAAGATCGC CACGGCGATATGCTGCAAGAACGCGGTATTCTGTACACCCCGGATTTTGT CATTAACGCAGGCGGCGTTATCAACGTAGCGGACGAACTGGACGGTTAT AATCGCGAACGCGCGATGAAAAAAGTCGAGCTGGTTTACGACGCGGTT GCGAAAGTCATTGAGATCGCAAAACGCGATCATCTGCCGACCTATCGCG CTGCCGAAAAAATGGCGGAAGAACGTATTGCAACCATGGGTTCTGCACG TAGTCAGTTTCTGCGTCGCGACAAAAACATCCTGGGTAGTCGCGGTTAA AAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCT
5，本发明氨酸脱氢酶突变体K77S/N270L/T143C的氨基酸序列(见SEQ ID NO.5)为：
MVETNVEARFSIFETMAMEDYEQVVFCHDKVSGLKAIIAIHDTTLGPA LGGLRMWNYASDEEALIDALRLAKGMTYSNAAAGLNLGGGKAVIIGDAK TQKSEALFRAFGRYVQSLNGRYITAEDVNTTVADMDYIHMETDFVCGVSP AFGSSGNPSPVTAYGVYRGMKAAAKEVYGTDSLGGKTVAIQGVGNVAFN LCRHLHEEGAKLIVTDINQDALRRAEEAFGALVVGPDEIYSVDADIFAPCA LGATLNDETIPQLKVKIIAGAALNQLKEDRHGDMLQERGILYTPDFVINAG GVINVADELDGYNRERAMKKVELVYDAVAKVIEIAKRDHLPTYRAAEKMAEERIATMGSARSQFLRRDKNILGSRG
6，本发明氨酸脱氢酶突变体K77S/N270L/T143C的核苷酸序列(见SEQ ID NO.6)为：
ATGGTTGAAACCAACGTCGAAGCGCGTTTCAGCATCTTCGAAACCA TGGCGATGGAGGATTACGAGCAGGTCGTTTTCTGCCACGACAAAGTTAG CGGCCTGAAAGCGATCATTGCGATTCACGATACCACCCTGGGTCCGGCA CTGGGTGGTCTGCGTATGTGGAATTACGCATCTGACGAAGAAGCGCTGA TTGACGCACTGCGTCTGGCCAAAGGTATGACCTACAGCAACGCGGCAGC AGGTCTGAATCTGGGCGGCGGTAAAGCAGTTATCATCGGCGACGCGAAAACCCAGAAAAGCGAAGCACTGTTTCGCGCATTTGGTCGTTACGTTCAGA GCCTGAACGGCCGCTATATTACCGCAGAAGACGTTAATACCACCGTTGC AGACATGGACTACATCCACATGGAGACCGACTTTGTACGCGGCGTTAGT CCGGCATTTGGTAGTTCTGGTAATCCGAGTCCGGTTACGGCATATGGTGT TTATCGCGGCATGAAAGCGGCAGCGAAAGAAGTTTACGGTACCGATAGC CTGGGCGGTAAAACCGTTGCAATTCAAGGCGTTGGCAACGTTGCCTTTA ACCTGTGTCGTCATCTGCACGAAGAAGGCGCAAAACTGATCGTTACCGA TATTAATCAGGACGCACTGCGTCGCGCAGAAGAAGCATTTGGCGCACTG GTTGTTGGTCCGGACGAAATTTATAGCGTTGACGCGGATATTTTTGCACC GTGCGCACTGGGCGCAACCCTGAACGACGAAACCATCCCGCAGCTGAA AGTCAAAATTATTGCGGGCGCGGCGCTAAATCAGCTGAAAGAAGATCGC CACGGCGATATGCTGCAAGAACGCGGTATTCTGTACACCCCGGATTTTGT CATTAACGCAGGCGGCGTTATCAACGTAGCGGACGAACTGGACGGTTAT AATCGCGAACGCGCGATGAAAAAAGTCGAGCTGGTTTACGACGCGGTT GCGAAAGTCATTGAGATCGCAAAACGCGATCATCTGCCGACCTATCGCG CTGCCGAAAAAATGGCGGAAGAACGTATTGCAACCATGGGTTCTGCACG TAGTCAGTTTCTGCGTCGCGACAAAAACATCCTGGGTAGTCGCGGTTAA AAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCT
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其制备方法与应用
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 374
<212> PRT
<213> （人工合成）
<400> 1
Met Val Glu Thr Asn Val Glu Ala Arg Phe Ser Ile Phe Glu Thr Met
1 5 10 15
Ala Met Glu Asp Tyr Glu Gln Val Val Phe Cys His Asp Lys Val Ser
20 25 30
Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala
35 40 45
Leu Gly Gly Leu Arg Met Trp Asn Tyr Ala Ser Asp Glu Glu Ala Leu
50 55 60
Ile Asp Ala Leu Arg Leu Ala Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala
65 70 75 80
Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp Ala
85 90 95
Lys Thr Gln Lys Ser Glu Ala Leu Phe Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Val
100 105 110
Gln Ser Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr Ala Glu Asp Val Asn Thr Thr
115 120 125
Val Ala Asp Met Asp Tyr Ile His Met Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly
130 135 140
Val Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala
145 150 155 160
Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala Ala Ala Lys Glu Val Tyr Gly
165 170 175
Thr Asp Ser Leu Gly Gly Lys Thr Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Asn
180 185 190
Val Ala Phe Asn Leu Cys Arg His Leu His Glu Glu Gly Ala Lys Leu
195 200 205
Ile Val Thr Asp Ile Asn Gln Asp Ala Leu Arg Arg Ala Glu Glu Ala
210 215 220
Phe Gly Ala Leu Val Val Gly Pro Asp Glu Ile Tyr Ser Val Asp Ala
225 230 235 240
Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Thr Leu Asn Asp Glu Thr
245 250 255
Ile Pro Gln Leu Lys Val Lys Ile Ile Ala Gly Ala Ala Asn Asn Gln
260 265 270
Leu Lys Glu Asp Arg His Gly Asp Met Leu Gln Glu Arg Gly Ile Leu
275 280 285
Tyr Thr Pro Asp Phe Val Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala
290 295 300
Asp Glu Leu Asp Gly Tyr Asn Arg Glu Arg Ala Met Lys Lys Val Glu
305 310 315 320
Leu Val Tyr Asp Ala Val Ala Lys Val Ile Glu Ile Ala Lys Arg Asp
325 330 335
His Leu Pro Thr Tyr Arg Ala Ala Glu Lys Met Ala Glu Glu Arg Ile
340 345 350
Ala Thr Met Gly Ser Ala Arg Ser Gln Phe Leu Arg Arg Asp Lys Asn
355 360 365
Ile Leu Gly Ser Arg Gly
370
<210> 2
<211> 1190
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 2
atggttgaaa ccaacgtcga agcgcgtttc agcatcttcg aaaccatggc gatggaggat 60
tacgagcagg tcgttttctg ccacgacaaa gttagcggcc tgaaagcgat cattgcgatt 120
cacgatacca ccctgggtcc ggcactgggt ggtctgcgta tgtggaatta cgcatctgac 180
gaagaagcgc tgattgacgc actgcgtctg gccaaaggta tgacctacaa aaacgcggca 240
gcaggtctga atctgggcgg cggtaaagca gttatcatcg gcgacgcgaa aacccagaaa 300
agcgaagcac tgtttcgcgc atttggtcgt tacgttcaga gcctgaacgg ccgctatatt 360
accgcagaag acgttaatac caccgttgca gacatggact acatccacat ggagaccgac 420
tttgttaccg gcgttagtcc ggcatttggt agttctggta atccgagtcc ggttacggca 480
tatggtgttt atcgcggcat gaaagcggca gcgaaagaag tttacggtac cgatagcctg 540
ggcggtaaaa ccgttgcaat tcaaggcgtt ggcaacgttg cctttaacct gtgtcgtcat 600
ctgcacgaag aaggcgcaaa actgatcgtt accgatatta atcaggacgc actgcgtcgc 660
gcagaagaag catttggcgc actggttgtt ggtccggacg aaatttatag cgttgacgcg 720
gatatttttg caccgtgcgc actgggcgca accctgaacg acgaaaccat cccgcagctg 780
aaagtcaaaa ttattgcggg cgcggcgaac aatcagctga aagaagatcg ccacggcgat 840
atgctgcaag aacgcggtat tctgtacacc ccggattttg tcattaacgc aggcggcgtt 900
atcaacgtag cggacgaact ggacggttat aatcgcgaac gcgcgatgaa aaaagtcgag 960
ctggtttacg acgcggttgc gaaagtcatt gagatcgcaa aacgcgatca tctgccgacc 1020
tatcgcgctg ccgaaaaaat ggcggaagaa cgtattgcaa ccatgggttc tgcacgtagt 1080
cagtttctgc gtcgcgacaa aaacatcctg ggtagtcgcg gttaaaagct tgcggccgca 1140
ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagccct 1190
<210> 3
<211> 374
<212> PRT
<213> （人工合成）
<400> 3
Met Val Glu Thr Asn Val Glu Ala Arg Phe Ser Ile Phe Glu Thr Met
1 5 10 15
Ala Met Glu Asp Tyr Glu Gln Val Val Phe Cys His Asp Lys Val Ser
20 25 30
Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala
35 40 45
Leu Gly Gly Ser Arg Met Trp Asn Tyr Ala Ser Asp Glu Glu Ala Leu
50 55 60
Ile Asp Ala Leu Arg Leu Ala Lys Gly Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala
65 70 75 80
Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp Ala
85 90 95
Lys Thr Gln Lys Ser Glu Ala Leu Phe Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Val
100 105 110
Gln Ser Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr Ala Glu Asp Val Asn Thr Thr
115 120 125
Val Ala Asp Met Asp Tyr Ile His Met Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly
130 135 140
Val Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala
145 150 155 160
Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala Ala Ala Lys Glu Val Tyr Gly
165 170 175
Thr Asp Ser Leu Gly Gly Lys Thr Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Asn
180 185 190
Val Ala Phe Asn Leu Cys Arg His Leu His Glu Glu Gly Ala Lys Leu
195 200 205
Ile Val Thr Asp Ile Asn Gln Asp Ala Leu Arg Arg Ala Glu Glu Ala
210 215 220
Phe Gly Ala Leu Val Val Gly Pro Asp Glu Ile Tyr Ser Val Asp Ala
225 230 235 240
Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Thr Leu Asn Asp Glu Thr
245 250 255
Ile Pro Gln Leu Lys Val Lys Ile Ile Ala Gly Ala Ala Leu Asn Gln
260 265 270
Leu Lys Glu Asp Arg His Gly Asp Met Leu Gln Glu Arg Gly Ile Leu
275 280 285
Tyr Thr Pro Asp Phe Val Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala
290 295 300
Asp Glu Leu Asp Gly Tyr Asn Arg Glu Arg Ala Met Lys Lys Val Glu
305 310 315 320
Leu Val Tyr Asp Ala Val Ala Lys Val Ile Glu Ile Ala Lys Arg Asp
325 330 335
His Leu Pro Thr Tyr Arg Ala Ala Glu Lys Met Ala Glu Glu Arg Ile
340 345 350
Ala Thr Met Gly Ser Ala Arg Ser Gln Phe Leu Arg Arg Asp Lys Asn
355 360 365
Ile Leu Gly Ser Arg Gly
370
<210> 4
<211> 1190
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 4
atggttgaaa ccaacgtcga agcgcgtttc agcatcttcg aaaccatggc gatggaggat 60
tacgagcagg tcgttttctg ccacgacaaa gttagcggcc tgaaagcgat cattgcgatt 120
cacgatacca ccctgggtcc ggcactgggt ggtagtcgta tgtggaatta cgcatctgac 180
gaagaagcgc tgattgacgc actgcgtctg gccaaaggta tgacctacag caacgcggca 240
gcaggtctga atctgggcgg cggtaaagca gttatcatcg gcgacgcgaa aacccagaaa 300
agcgaagcac tgtttcgcgc atttggtcgt tacgttcaga gcctgaacgg ccgctatatt 360
accgcagaag acgttaatac caccgttgca gacatggact acatccacat ggagaccgac 420
tttgttaccg gcgttagtcc ggcatttggt agttctggta atccgagtcc ggttacggca 480
tatggtgttt atcgcggcat gaaagcggca gcgaaagaag tttacggtac cgatagcctg 540
ggcggtaaaa ccgttgcaat tcaaggcgtt ggcaacgttg cctttaacct gtgtcgtcat 600
ctgcacgaag aaggcgcaaa actgatcgtt accgatatta atcaggacgc actgcgtcgc 660
gcagaagaag catttggcgc actggttgtt ggtccggacg aaatttatag cgttgacgcg 720
gatatttttg caccgtgcgc actgggcgca accctgaacg acgaaaccat cccgcagctg 780
aaagtcaaaa ttattgcggg cgcggcgcta aatcagctga aagaagatcg ccacggcgat 840
atgctgcaag aacgcggtat tctgtacacc ccggattttg tcattaacgc aggcggcgtt 900
atcaacgtag cggacgaact ggacggttat aatcgcgaac gcgcgatgaa aaaagtcgag 960
ctggtttacg acgcggttgc gaaagtcatt gagatcgcaa aacgcgatca tctgccgacc 1020
tatcgcgctg ccgaaaaaat ggcggaagaa cgtattgcaa ccatgggttc tgcacgtagt 1080
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ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagccct 1190
<210> 5
<211> 374
<212> PRT
<213> （人工合成）
<400> 5
Met Val Glu Thr Asn Val Glu Ala Arg Phe Ser Ile Phe Glu Thr Met
1 5 10 15
Ala Met Glu Asp Tyr Glu Gln Val Val Phe Cys His Asp Lys Val Ser
20 25 30
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35 40 45
Leu Gly Gly Leu Arg Met Trp Asn Tyr Ala Ser Asp Glu Glu Ala Leu
50 55 60
Ile Asp Ala Leu Arg Leu Ala Lys Gly Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala
65 70 75 80
Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp Ala
85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Thr Leu Asn Asp Glu Thr
245 250 255
Ile Pro Gln Leu Lys Val Lys Ile Ile Ala Gly Ala Ala Leu Asn Gln
260 265 270
Leu Lys Glu Asp Arg His Gly Asp Met Leu Gln Glu Arg Gly Ile Leu
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Ile Leu Gly Ser Arg Gly
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<211> 1190
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 6
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ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagccct 1190

Claims (9)

1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶为亲本，将所述亲本序列中第77位氨基酸突变为丝氨酸和第270位氨基酸突变为亮氨酸，将第52位突变为丝氨酸和/或第143位氨基酸突变为半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列见SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5。
3.根据权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，编码亮氨酸脱氢酶突变体的核苷酸序列见SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6。
4.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1-3中任一项所述的亮氨酸脱氢酶突变体。
5.一种重组载体，其特征在于，携带权利要求4所述的核酸。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的载体为pET28a(+)。
7.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求6所述的重组载体。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主为大肠杆菌BL21（DE3）。
9.权利要求1-3中任一项所述的亮氨酸脱氢酶突变体在合成2-氨基戊烷中的应用。
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Patent Citations (3)

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基于生物计算策略定点突变改造亮氨酸脱氢酶的底物专一性;王曾宇;《中国科技论文在线》;20220113;第1-10页 *

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