TW202204632A

TW202204632A - 硫酸化多醣之製造方法及３＇－磷酸腺苷－５＇－磷醯硫酸（ｐａｐｓ）之製造方法

Info

Publication number: TW202204632A
Application number: TW110112230A
Authority: TW
Inventors: 福永健太; 西原彬; 加藤崚介; 倉都将宏; 林幹朗; 橋本信一
Original assignee: 美商瑞瑟勒綜合技術協會; 日商大塚製藥工場股份有限公司; 日商麒麟生物材料股份有限公司
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2021-04-01
Publication date: 2022-02-01
Also published as: US20230159969A1; EP4127204A4; AU2021249958B2; WO2021199445A1; JP2023515250A; BR112022019828A2; JP2023171870A; CN115605603A; EP4127204A1; IL296974A; KR20230004466A; CA3174029A1; SA522440743B1; AU2021249958A1; WO2021201282A1; JP7398684B2

Abstract

本發明之一目標為提供一種藉由使利用微生物或其處理物之代謝活性的PAPS製造/再生系統與在混合諸如硫酸鎂之廉價原材料之後表現硫酸化酶之微生物或其處理物或提取物反應來容易地製造硫酸化多醣的方法。本發明之另一目標為提供一種由廉價原料製造PAPS之實用方法。本發明係關於一種硫酸化多醣之製造方法及一種PAPS之製造方法，該等方法包含製備棒狀桿菌屬(the genus Corynebacterium)細菌之轉化體(a)或該轉化體(a)之處理物的步驟，該轉化體(a)至少包含以可表現方式引入其中的編碼ATP硫酸化酶之基因及編碼APS激酶之基因，且其中該轉化體(a)之細胞質膜為物質可滲透的；以及藉由使用含有ATP或ATP源、硫酸根離子源以及該轉化體(a)或該其處理物質之反應溶液進行用於製造PAPS之反應的步驟。

Description

硫酸化多醣之製造方法及3'-磷酸腺苷-5'-磷醯硫酸(PAPS)之製造方法

本發明係關於一種使用表現ATP硫酸化酶及APS激酶(腺苷酸硫酸激酶)之棒狀桿菌屬(the genus Corynebacterium)細菌由諸如葡萄糖及腺嘌呤之廉價原材料製造3'-磷酸腺苷5'-磷醯硫酸(下文中，稱為PAPS)的方法，及一種使用棒狀桿菌屬細菌及表現各種硫酸化酶之屬於原核生物之微生物來製造硫酸化多醣的方法。

PAPS為廣泛存在於微生物至較高生物體中之輔酶且活體內充當硫酸根基團之供體。在較高生物體中，PAPS為用於生物合成諸如硫酸軟骨素及硫酸乙醯肝素之葡糖胺聚糖所需的。眾所周知，硫酸化活體內代謝物具有各種生理功能，且預期PAPS自身用作生髮劑(PTL 1)、具有保濕效果之皮膚外用劑(PTL 2)以及類似物。

已知以下方法作為PAPS之製造方法：使用來源於經純化酵母之ATP硫酸化酶、來源於青黴(blue mold)之APS激酶及來源於大腸桿菌(Escherichia coli)之焦磷酸酶的方法，其中使用ATP作為原材料(NPL 1)；使用來源於嗜熱性細菌之熱穩定ATP硫酸化酶、APS激酶以及來源於酵母之焦磷酸酶的方法，其中如同上文方法使用ATP作為原材料(PTL 3)；使用來源於熱穩定細菌之ATP硫酸化酶、APS激酶及來源於綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)之多磷酸激酶的方法，其中使用腺苷5'-單磷酸(下文中被稱為AMP)作為原材料(PTL 4)；及類似方法。

同時，已知一種藉由使用產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)之突變體菌株工業上製造ATP的方法，其中將細菌細胞之膜用二甲苯或界面活性劑處理以向其賦予滲透性，其中使用諸如葡萄糖及腺嘌呤之廉價原材料(NPL 2)。

PAPS為極不穩定的化合物。即使在使用粗酶之方法中，藉由製備由作為宿主之大腸桿菌以重組方式表現之來源於熱穩定細菌的APS激酶及ATP硫酸化酶之粗酶，隨後在反應之前進行加熱處理，藉此抑制來源於大腸桿菌之污染性酶的活性來製造PAPS (PTL 4)。

PTL8揭示PAPS在大腸桿菌之粗酶溶液中降解。大腸桿菌具有與PAPS之降解相關的一些酶且有可能藉由缺失此類酶之基因來抑制PAPS之降解。

肝素(其為硫酸化多醣)為主要抗凝血劑，且用於血栓栓塞及瀰漫性血管內凝血症候群，並防止人工透析期間及體外循環中之凝血及其類似者。行業內，自豬之腸道黏膜提取且純化大部分肝素。在2008年由於豬源性肝素經雜質污染所發生之死亡事故，因此已進行非動物來源之製造受控及品質受控之肝素之研究及研發。

作為一特定實例，醱酵製造且純化N-乙醯肝素前體(下文中被稱為肝素前體) (其為一些革蘭氏陰性(Gram-negative)微生物之莢膜多醣)的方法為化學上N-去乙醯化及N-硫酸化，隨後為酶促表異構化及硫酸化，以產生具有與來源於豬之彼等肝素相同之結構及抗凝活性的肝素(PTL 5至7及NPL 3及4)。

已知硫酸軟骨素為另一種適用的硫酸化多醣，且其已用作關節疼痛之藥物及保護角膜表面層之滴眼劑。已使用自各種動物組織提取且純化之硫酸軟骨素，但近來已報導以與肝素相同之方式使用硫酸化酶之方法，其中使用來源於大腸桿菌之莢膜多醣作為原材料(NPL 5及6)。

在使用經純化酶執行硫酸化之方法中(其中使用來源於微生物膠囊之多醣作為原材料)，PAPS在硫酸化酶之反應中充當硫酸根基團之供體且需要作為輔酶。在使用來源於微生物膠囊之莢膜多醣作為原材料製造硫酸化多醣的上文提及之方法中，藉由將PAPS硫酸根基團轉移至受質多醣來產生3'-磷酸腺苷5'-磷酸鹽(下文中，稱為PAP)，將硫酸對硝苯酯之硫酸根基團以酶方式轉移至PAP，藉此再生PAPS，且進行多醣之酶促硫酸化反應(PTL 6及NPL 3)。引用清單 專利文獻

PTL 1：WO2012/057336 PTL 2：JP-A-2012-201665 PTL 3：JP-A-H5-137588 PTL 4：日本專利第4505011號 PTL 5：日本專利第5830464號 PTL 6：美國專利第8771995號 PTL 7：WO2018/048973 PTL 8：WO2020/013346非專利文獻

NPL 1：Glycobiology 第21卷, 第6期, 第771-780頁, 2011 NPL 2：Biosci. Biotechnol. Biochem. 65 (3), 644-650, 2001 NPL 3：Carbohydrate Polymers 122 (2015) 399-407 NPL 4：Advanced Drug Delivery Reviews 97 (2016) 237-249 NPL 5：Metabolic Engineering 27 (2015) 92-100 NPL 6：Biotechnology and Bioengineering 115 (2018) 1561-1570

技術問題

描述於NPL 1及PTL 1及2中的製造PAPS之習知方法各自使用諸如ATP及AMP之相對昂貴的核苷酸作為原材料且使用藉由培養細菌製備之酶或粗酶，隨後將細菌細胞分離，藉由音波處理或類似物破壞細菌細胞且離心。因此，不容易在工業規模上進行彼等方法。

另一方面，如上文所描述，為製造PAPS，已知使用經純化酶或粗酶之方法，其中使用ATP或AMP作為原材料，但使用微生物自身製造PAPS之實例為未知的。另外，如上文所描述，PAPS為極不穩定的化合物，且在先前技術中，在使用粗酶的情況下，執行諸如藉由熱處理抑制污染酶之活性的複雜步驟。

鑒於以上內容，難以預測PAPS可藉由與僅藉由在作為宿主之棒狀桿菌屬細菌中表現ATP硫酸化酶及APS激酶工業上製造ATP之方法類似的方法來製造。此係由於如同在大腸桿菌的情況下，棒狀桿菌屬亦具有與PAPS之降解相關的一些酶。

另外，如上文所描述，以酶方式硫酸化多醣之習知方法使用自藉由培養表現硫酸化酶之微生物製備的細胞裂解物純化之複數種硫酸化酶，隨後收集且進行音波處理或類似者。此等方法並不易於在工業規模上實施。另外，需要昂貴的PAPS及硫酸對硝苯酯作為原材料。

因此，本發明之一目標為提供一種藉由使利用微生物或其處理物之代謝活性的PAPS製造/再生系統與在混合諸如硫酸鎂之廉價原材料之後表現硫酸化酶之微生物或其處理物或提取物反應來容易地製造硫酸化多醣的方法。本發明之另一目標為提供一種由廉價原料製造PAPS之實用方法。問題之解決方案

本發明之發明人已基於以下發現(1)及(2)完成本發明。 (1)與相關技術之方法相比，可藉由使用具有ATP製造能力之棒狀桿菌屬細菌作為宿主培養其中藉由重組DNA技術增強ATP硫酸化酶及APS激酶活性的菌株，用界面活性劑或類似物賦予其膜滲透率且添加諸如葡萄糖及腺嘌呤之原材料來更容易地及低成本地製造PAPS。 (2)可使用細菌細胞及諸如硫酸鎂之廉價原材料而無需酶純化或PAPS添加，藉由使用描述於(1)中之具有經增強ATP硫酸化酶及APS激酶活性之菌株作為負責PAPS製造/再生反應之微生物細菌細胞，向表現表異構酶及/或硫酸化酶之屬於原核生物之微生物賦予膜滲透率且執行混合反應來製造硫酸化多醣。

亦即，本發明係如下。 1.一種硫酸化多醣之製造方法，該方法包含以下步驟(1-1)及(1-2)： (1-1)製備棒狀桿菌屬細菌之轉化體(a)或該轉化體(a)之處理物，該轉化體(a)至少包含以可表現方式引入其中的編碼ATP硫酸化酶之基因及編碼APS激酶之基因；及 (1-2)藉由使用含有ATP或ATP源、硫酸根離子源及該轉化體(a)或該其處理物之反應溶液來進行用於製造PAPS之反應。 2.如1之硫酸化多醣之製造方法，該方法進一步包含以下步驟(2-1)及(2-2)： (2-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(b)或該轉化體(b)之處理物或提取物，該轉化體(b)至少包含以可表現方式引入其中的編碼C5-表異構酶之基因；及 (2-2)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將該轉化體(b)或該其處理物或提取物併入該反應溶液中來進行C5-表異構化。 3.如1或2之硫酸化多醣之製造方法，其包含藉由包含以可表現方式引入其中的編碼磺基轉移酶之基因的轉化體或該轉化體之處理物或提取物進行硫酸化。 4.如3之硫酸化多醣之製造方法，該方法進一步包含以下步驟(3-1)及(3-2)： (3-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(c)或該轉化體(c)之處理物或提取物，該轉化體(c)至少包含以可表現方式引入其中的編碼2-O-磺基轉移酶之基因；及 (3-2)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將該轉化體(c)或該其處理物或提取物併入該反應溶液中來進行2-O-硫酸化。 5.如3或4之硫酸化多醣之製造方法，該方法進一步包含以下步驟(3'-1)至(3'-3)： (3'-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(b)或該轉化體(b)之處理物或提取物，該轉化體(b)至少包含以可表現方式引入其中的編碼C5-表異構酶之基因； (3'-2)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(c)或該轉化體(c)之處理物或提取物，該轉化體(c)至少包含以可表現方式引入其中的編碼2-O-磺基轉移酶之基因；及 (3'-3)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將該轉化體(b)或該其處理物或提取物及該轉化體(c)或該其處理物或提取物併入該反應溶液中來進行C5-表異構化及2-O-硫酸化。 6.如3至5中任一項之硫酸化多醣之製造方法，該方法進一步包含以下步驟(4-1)及(4-2)： (4-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(d)或該轉化體(d)之處理物或提取物，該轉化體(d)至少包含以可表現方式引入其中的編碼6-O-磺基轉移酶之基因；及 (4-2)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將該轉化體(d)或該其處理物或提取物併入該反應溶液中來進行6-O-硫酸化。 7.如3至6中任一項之硫酸化多醣之製造方法，該方法進一步包含以下步驟(5-1)及(5-2)： (5-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(e)或該轉化體(e)之處理物或提取物，該轉化體(e)至少包含以可表現方式引入其中的編碼3-O-磺基轉移酶之基因；及 (5-2)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將該轉化體(e)或該其處理物或提取物併入該反應溶液中來進行3-O-硫酸化。 8.一種硫酸化多醣之製造方法，該方法包含藉由在ATP或ATP源、硫酸根離子源及N-磺基肝素前體之存在下，將以下物質併入反應溶液中來產生硫酸化多醣，棒狀桿菌屬細菌之轉化體(a)或該轉化體(a)之處理物，該轉化體(a)至少包含以可表現方式引入其中的編碼ATP硫酸化酶之基因及編碼APS激酶之基因，及選自以下之至少一者：屬於原核生物之微生物之轉化體(b)或該轉化體(b)之處理物或提取物，該轉化體(b)至少包含以可表現方式引入其中的編碼C5-表異構酶之基因，屬於原核生物之微生物之轉化體(c)或該轉化體(c)之處理物或提取物，該轉化體(c)至少包含以可表現方式引入其中的編碼2-O-磺基轉移酶之基因，屬於原核生物之微生物之轉化體(d)或該轉化體(d)之處理物或提取物，該轉化體(d)至少包含以可表現方式引入其中的編碼6-O-磺基轉移酶之基因，及屬於原核生物之微生物之轉化體(e)或該轉化體(e)之處理物或提取物，該轉化體(e)至少包含以可表現方式引入其中的編碼3-O-磺基轉移酶之基因。 9.如7之硫酸化多醣之製造方法，該方法進一步包含在ATP或ATP源、硫酸根離子源及N-磺基肝素前體之存在下，將該轉化體(a)或該其處理物及該等轉化體(b)至(e)或該等其處理物或提取物併入反應溶液中來產生硫酸化多醣。 10.如1至9中任一項之硫酸化多醣之製造方法，其用於製造肝素。 11.一種PAPS之製造方法，該方法包含以下步驟(i)及(ii)： (i)製備棒狀桿菌屬細菌之轉化體或該轉化體之處理物，該轉化體至少包含以可表現方式引入其中的編碼ATP硫酸化酶之基因及編碼APS激酶之基因；及 (ii)藉由使用含有ATP或ATP源、硫酸根離子源及步驟(i)中製備之該轉化體或該其處理物之反應溶液來進行用於製造PAPS之反應。本發明之有利效果

根據本發明之硫酸化多醣之製造方法，可藉由使用利用微生物之代謝活性的PAPS製造/再生系統及表現硫酸化酶之微生物或其處理物或提取物來容易地及低成本地製造硫酸化多醣。另外，根據本發明之PAPS之製造方法，可藉由利用微生物或其處理物之代謝活性來容易地及低成本地製造PAPS。此外，藉由在本發明之方法中使用棒狀桿菌屬，不必以複雜方式修飾基因以避免PAPS之降解。

＜轉化體＞本發明之硫酸化多醣之製造方法的特徵在於以下步驟：1)藉由使用細菌細胞之反應來執行PAPS之供應/再生。在本發明之方法中，較佳地，亦藉由使用細菌細胞之反應來執行以下步驟中之至少一者：2) C5-表異構化、3) 2-O-硫酸化、4) 6-O-硫酸化及5) 3-O-硫酸化。在下文中，將描述用於各反應中之轉化體(a)至(e)。

＜＜轉化體(a)：PAPS之供應/再生＞＞在本發明之硫酸化多醣之製造方法中，使用屬於棒狀桿菌屬之微生物之轉化體(a)或轉化體(a)之處理物執行PAPS之供應/再生，該轉化體(a)至少包含以可表現方式引入其中的編碼ATP硫酸化酶之基因及編碼APS激酶之基因。

棒狀桿菌屬細菌性物種之實例包括產氨棒狀桿菌、嗜醋酸棒狀桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋麩酸棒狀桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、解烷棒狀桿菌(Corynebacterium alkanolyticum)、帚石南棒狀桿菌(Corynebacterium callunae)、鈍齒棒狀桿菌(Corynebacterium crenatum)、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、百合棒狀桿菌(Corynebacterium lilium)、糖蜜棒狀桿菌(Corynebacterium melassecola)、產熱氨棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes) (有效棒狀桿菌(Corynebacterium efficiens))及力士棒狀桿菌(Corynebacterium herculis)。

棒狀桿菌屬之菌株之實例包括產氨棒狀桿菌(停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)) ATCC 6871及ATCC 6872、嗜醋酸棒狀桿菌ATCC 13870、醋麩酸棒狀桿菌ATCC 15806、解烷棒狀桿菌ATCC 21511、帚石南棒狀桿菌ATCC 15991、鈍齒棒狀桿菌AS1.542、麩胺酸棒狀桿菌ATCC 13020、ATCC 13032、ATCC 13060、ATCC 13869及FERM BP-734、百合棒狀桿菌ATCC 15990、糖蜜棒狀桿菌ATCC 17965、有效棒狀桿菌(產熱氨棒狀桿菌) AJ12340 (FERM BP-1539)、力士棒狀桿菌(Corynebacterium herculis) ATCC 13868、分歧短桿菌(Brevibacterium divaricatum) (麩胺酸棒狀桿菌) ATCC 14020、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum) (麩胺酸棒狀桿菌) ATCC 13826、ATCC 14067及AJ12418 (FERM BP-2205)以及乳酸醱酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum) (麩胺酸棒狀桿菌) ATCC 13869。

屬於棒狀桿菌屬之細菌亦包括習知分類為短桿菌屬但目前整合至棒狀桿菌屬中之細菌(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991))。另外，停滯棒狀桿菌亦包括習知地分類為產氨棒狀桿菌但目前藉由16S rRNA核苷酸序列分析或類似者重新分類為停滯棒狀桿菌之細菌[Int. J Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879 (2010)]。

此等菌株獲自例如美國典型培養物保藏中心(the American Type Culture Collection) (地址:12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)。亦即，向各菌株給與登記號且菌株可使用此登記號獲得(參考：https://www.atcc.org/)。對應於各菌株之登記號描述於美國典型培養物保藏中心之目錄號中。另外，此等菌株係獲自例如保藏各菌株之儲藏所。棒狀桿菌屬細菌可為野生型菌株、其突變體菌株或人工重組子。

在本發明中，將編碼ATP硫酸化酶之基因及編碼APS激酶之基因以可表現方式引入至棒狀桿菌屬細菌中。

ATP硫酸化酶藉由以下反應式自硫酸鹽產生腺苷5'-磷醯硫酸(APS)。

[化學式1]

(在上式中，ATP表示腺苷5'-三磷酸。)

ATP硫酸化酶之一個態樣為MET3。ATP硫酸化酶之源不受特定限制且其實例包括來源於釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、粟酒裂殖酵母菌(Shizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)、粗厚神經胞子菌(Neurospora crassa)、產黃青黴菌(Penicillium chrysogenum)、乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)、徒長病菌(Fusarium fujikuroi)、米麴菌(Aspergillus oryzae)或棉病囊菌(Ashbya gossypii)之ATP硫酸化酶，且其中，來源於釀酒酵母菌之ATP硫酸化酶為較佳的。

編碼ATP硫酸化酶之基因之實例包括SEQ ID NO: 22中所示之核苷酸序列。其實例進一步包括編碼具有ATP硫酸化酶活性之多肽且包含與SEQ ID NO: 22中所示之核苷酸序列較佳80%或更大，更佳90%或更大，甚至更佳95%或更大且尤佳98%或更大一致之核苷酸序列的DNA；及編碼具有ATP硫酸化酶活性之多肽且包含在嚴格條件下與SEQ ID NO: 22中所示之核苷酸序列雜交之核苷酸序列或與上文核苷酸序列互補之核苷酸序列的DNA。術語「嚴格條件」係指在其下形成所謂的特異性雜交體且不形成非特異性雜交體的條件。其實例包括在其下彼此為較高水準一致之DNA (例如，彼此為80%或更大，較佳90%或更大，更佳95%或更大，甚至更佳97%或更大且尤佳99%或更大一致的DNA)彼此雜交且彼此為較低水準一致之DNA並不彼此雜交的條件；或其為用於在正常的南方雜交(Southern hybridization)中進行洗滌之條件的條件，其中洗滌在對應於60℃，1 × SSC及0.1% SDS，較佳為60℃，0.1 × SSC及0.1% SDS，且更佳為68℃，0.1 × SSC及0.1% SDS的鹽濃度及溫度下執行一次，較佳為二至三次。

藉由轉化體之細胞提取液體中ATP硫酸化酶活性值的增加來檢查轉化體中之ATP硫酸化酶活性。ATP硫酸化酶活性可藉由描述於文獻[Medina DC等人，Temperature effects on the allosteric transition of ATP sulfurylase from Penicillium chrysogenum. Arch. Biochem. Biophys. 1; 393 (1): 51-60 (2001)]中之方法來檢查。

除非另外規定，否則本發明中關於一致性之數值可為使用熟習此項技術者已知之同源性搜尋程式計算的數值。核苷酸序列之數值之實例包括使用BLAST中之預設參數計算的數值[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]，且胺基酸序列之數值之實例包括使用BLAST2中之預設參數計算的數值[Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997), Genome Res., 7, 649 (1997), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/ information3. htmL]。

APS激酶根據以下反應式自APS產生PAPS。

[化學式2]

(在上式中，ADP表示腺苷5'-二磷酸。)

APS激酶之一個態樣包括MET14。APS激酶之源不受特定限制且其實例包括來源於釀酒酵母菌、白色念珠菌、粟酒裂殖酵母菌、解脂耶氏酵母菌、粗厚神經胞子菌、產黃青黴菌、乳酸克魯維酵母菌、徒長病菌、米麴菌或棉病囊菌之APS激酶，且其中，來源於釀酒酵母菌之APS激酶為較佳的。

編碼APS激酶之基因之實例包括SEQ ID NO: 23中所示之核苷酸序列。其實例進一步包括編碼具有APS激酶活性之多肽且包含與SEQ ID NO: 23中所示之核苷酸序列較佳80%或更大，更佳地90%或更大，甚至更佳地95%或更大且尤佳98%或更大一致之核苷酸序列的DNA；及編碼具有APS激酶活性之多肽且包含在嚴格條件下與SEQ ID NO: 23中所示之核苷酸序列雜交之核苷酸序列或與上文核苷酸序列互補之核苷酸序列的DNA。

藉由轉化體之細胞提取液體中APS激酶活性值的增加來檢查轉化體中之APS激酶活性。APS激酶活性可藉由描述於文獻[Renosto F.等人，Adenosine 5'-phosphosulfate kinase from Penicillium chrysogenum. Purification and kinetic characterization. J. Biol. Chem. 259 (4): 2113-2123 (1984)]中之方法來檢查。

將編碼ATP硫酸化酶之基因及編碼APS激酶之基因引入至棒狀桿菌屬細菌中可藉由將上述DNA分別併入至宿主之染色體中或藉由將上述DNA選殖至可在宿主中擴增之適當質體載體中且將載體引入至宿主中來進行。

質體載體可為任何質體載體，只要其具有控制棒狀桿菌屬細菌中之自主複製功能的基因即可。其特定實例包括來源於乳酸醱酵短桿菌2256之pAM330 [JP-A-S58-67699]，[Miwa, K.等人，Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48: 2901-2903 (1984)]及[Yamaguchi, R.等人，Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16: 265-267 (1985)]；pHM1519 [Miwa, K.等人，Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48: 2901-2903 (1984)]及pCRY30 [Kurusu, Y.等人，Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57: 759-764 (1991)]，其來源於穀麩胺酸狀桿菌ATCC 3058；pCG4 [JP-A-S57-183799]及[Katsumata, R.等人，Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol., 159: 306-311 (1984)]、pAG1、pAG3、pAG14及pAG50 [JP-A-S62-166890]，以及pEK0、pEC5及pEKEx1 [Eikmanns, B.J.等人，A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102: 93-98 (1991)]，其來源於麩胺酸棒狀桿菌T250；以及類似者。

啟動子可為來源於宿主之啟動子或異源啟動子。其實例包括甘油醛3-磷酸去氫酶A基因(gapA)之啟動子PgapA、蘋果酸去氫酶基因(mdh)之啟動子Pmdh、乳酸脫氫酶A基因(ldhA)之啟動子PldhA以及來源於麩胺酸棒狀桿菌R之類似物。

終止子之實例包括大腸桿菌rRNA操縱子之rrnB T1T2終止子、大腸桿菌之trpA終止子、乳酸醱酵短桿菌之trp終止子，以及類似物。

作為本發明之一個態樣，與PAPS之降解相關的酶之基因表現並未減弱。與PAPS之降解相關的酶之基因之實例包括cysQ基因及CP01850基因。作為轉化體(a)之一個態樣，至少一種選自cysQ基因及CP01850基因之基因之表現並未減弱。

＜＜轉化體(b)：C5-表異構化＞＞在根據本發明之硫酸化多醣之製造方法中，使用屬於原核生物之微生物之轉化體(b)或轉化體(b)之處理物或提取物來執行N-磺基肝素前體之C5-表異構化，該轉化體(b)至少包含以可表現方式引入其中的編碼C5-表異構酶之基因。

C5-表異構酶不受特定限制，只要其可催化葡糖醛酸(GlcUA)殘基異構化成艾杜糖醛酸(IdoA)殘基即可。C5-表異構酶可來源於動物、植物、微生物以及類似物中之任一者。舉例而言，人類C5-表異構酶可用作C5-表異構酶。

編碼C5-表異構酶之基因之實例包括SEQ ID NO: 24中所示之核苷酸序列。其實例進一步包括編碼具有C5-表異構酶活性之多肽且包含與SEQ ID NO: 24中所示之核苷酸序列較佳80%或更大，更佳90%或更大，甚至更佳95%或更大且尤佳98%或更大一致之核苷酸序列的DNA；及編碼具有C5-表異構酶活性之多肽且包含在嚴格條件下與SEQ ID NO: 24中所示之核苷酸序列雜交之核苷酸序列或與上文核苷酸序列互補之核苷酸序列的DNA。

藉由轉化體之細胞提取液體中C5-表異構酶活性值的增加來檢查轉化體中之C5-表異構酶活性。C5-表異構酶活性可藉由描述於文獻[Babu P.等人，A rapid, nonradioactive assay for measuring heparan sulfate C-5 epimerase activity using hydrogen/deuterium exchange-mass spectrometry. Methods. Mol. Biol. 1229: 209-219 (2015)]中之方法來量測。

下文中，將描述表現磺基轉移酶之轉化體。在根據本發明之硫酸化多醣之製造方法中，使用包含以可表現方式引入至其中的編碼磺基轉移酶之基因的轉化體或轉化體之處理物或提取物來執行硫酸化。在本發明中，磺基轉移酶不受特定限制，只要其將硫酸根基團轉移至多醣以產生硫酸化多醣即可。磺基轉移酶之實例包括2-O-磺基轉移酶(2-OST)、6-O-磺基轉移酶(6-OST)及3-O-磺基轉移酶(3-OST)。

＜＜轉化體(c)：2-O-硫酸化＞＞在本發明之硫酸化多醣之製造方法中，使用屬於原核生物之微生物之轉化體(c)或轉化體(c)之處理物或提取物來執行2-O-硫酸化，該轉化體(c)至少包含以可表現方式引入其中的編碼2-O-磺基轉移酶(2-OST)之基因。

2-OST不受特定限制，只要其可催化O-2位置處之IdoA殘基之硫酸化即可。另外，2-OST可來源於動物、植物、微生物以及類似物中之任一者。舉例而言，來源於倉鼠之2-OST可用作2-OST。

編碼2-OST之基因之實例包括SEQ ID NO: 19中所示之核苷酸序列。其實例進一步包括編碼具有2-OST活性之多肽且包含與SEQ ID NO: 19中所示之核苷酸序列較佳80%或更大，更佳90%或更大，甚至更佳95%或更大且尤佳98%或更大一致之核苷酸序列的DNA；及編碼具有2-OST活性之多肽且包含在嚴格條件下與SEQ ID NO: 19中所示之核苷酸序列雜交之核苷酸序列或與上文核苷酸序列互補之核苷酸序列的DNA。

藉由轉化體之細胞提取液體中2-OST活性值的增加來檢查轉化體中之2-OST活性。2-OST活性可藉由描述於文獻[Zhang J.等人，High cell density cultivation of recombinant Escherichia coli strains expressing 2-O-sulfotransferase and C5-epimerase for the production of bioengineered heparin. Appl. Biochem. Biotechnol. 175(6): 2986-2995 (2015)]中之方法來檢查。

＜＜轉化體(d)：6-O-硫酸化＞＞在本發明之硫酸化多醣之製造方法中，使用屬於原核生物之微生物之轉化體(d)或轉化體(d)之處理物或提取物來執行6-O-硫酸化，該轉化體(d)至少包含以可表現方式引入其中的編碼6-O-磺基轉移酶(6-OST)之基因。

6-OST不受特定限制，只要其可催化6-O位置處之N-硫酸化葡糖胺(GlcNS)殘基之硫酸化即可。6-OST可來源於動物、植物、微生物以及類似物中之任一者。6-OST之實例包括來源於倉鼠之6-OST-1及來源於小鼠之6-OST-3。

編碼6-OST之基因之實例包括SEQ ID NO: 25中所示之核苷酸序列。其實例進一步包括編碼具有6-OST活性之多肽且包含與SEQ ID NO: 25中所示之核苷酸序列較佳80%或更大，更佳90%或更大，甚至更佳95%或更大且尤佳98%或更大一致之核苷酸序列的DNA；及編碼具有6-OST活性之多肽且包含在嚴格條件下與SEQ ID NO: 25中所示之核苷酸序列雜交之核苷酸序列或與上文核苷酸序列互補之核苷酸序列的DNA。

藉由轉化體之細胞提取液體中6-OST活性值的增加來檢查轉化體中之6-OST活性。6-OST活性可藉由描述於文獻[Zhang J.等人，High cell density cultivation of a recombinant Escherichia coli strain expressing a 6-O-sulfotransferase for the production of bioengineered heparin. J. Appl. Microbiol. 118(1): 92-98 (2015)]中之方法來檢查。

＜＜轉化體(e)：3-O-硫酸化＞＞在本發明之硫酸化多醣之製造方法中，使用屬於原核生物之微生物之轉化體(e)或轉化體(e)之處理物或提取物來執行3-O-硫酸化，該轉化體(e)至少包含以可表現方式引入其中的編碼3-O-磺基轉移酶(3-OST)之基因。

3-OST不受特定限制，只要其可催化O-3位置處之N-硫酸化/6-O-硫酸化葡糖胺殘基之硫酸化即可。3-OST可來源於動物、植物、微生物以及類似物中之任一者。舉例而言，來源於小鼠之3-OST-1可用作3-OST。

編碼3-OST之基因之實例包括SEQ ID NO: 26中所示之核苷酸序列。其實例進一步包括編碼具有3-OST活性之多肽且包含與SEQ ID NO: 26中所示之核苷酸序列較佳80%或更大，更佳90%或更大，甚至更佳95%或更大且尤佳98%或更大一致之核苷酸序列的DNA；及編碼具有3-OST活性之多肽且包含在嚴格條件下與SEQ ID NO: 26中所示之核苷酸序列雜交之核苷酸序列或與上文核苷酸序列互補之核苷酸序列的DNA。

藉由轉化體之細胞提取液體中3-OST活性值的增加來檢查轉化體中之3-OST活性。3-OST活性可藉由描述於文獻[Jin W.等人，Increased soluble heterologous expression of a rat brain 3-O-sulfotransferase 1 - A key enzyme for heparin biosynthesis. Protein Expr. Purif. 151:23-29 (2018)]中之方法來檢查。

＜＜屬於原核生物之微生物＞＞用作本發明中之轉化體之宿主的屬於原核生物之微生物不受特定限制，只要其可表現本發明之預定基因即可。其實例包括細菌，諸如屬於大腸桿菌屬(genus Escherichia)、沙雷菌屬(genus Serratia)、芽孢桿菌屬(genus Bacillus)、棒狀桿菌屬(genus Corynebacterium)、微桿菌屬(genus Microbacterium)及假單胞菌屬(genus Pseudomonas)之微生物，且較佳地使用大腸桿菌屬細菌。

用於本發明中之屬於大腸桿菌屬之細菌不受特定限制，且其實例包括藉由微生物學專家已知之分類法分類為大腸桿菌屬的細菌。屬於大腸桿菌屬之細菌之實例包括描述於文獻[Backmann, BJ 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, 第2460-2488頁. 表1. In F.D. Neidhardt (編), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, DC]中之細菌。

屬於大腸桿菌屬之細菌之實例包括大腸桿菌。大腸桿菌之實例包括大腸桿菌K-12菌株，諸如W3110菌株(ATCC 27325)及MG1655菌株(ATCC 47076)；大腸桿菌K5菌株(ATCC 23506)；大腸桿菌B菌株，諸如BL21 (DE3)菌株；大腸桿菌Nissle 1917菌株(DSM 6601)；以及其衍生菌株。

此等菌株獲自例如美國典型培養物保藏中心(地址:12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)。亦即，向各菌株給與登記號且菌株可使用此登記號獲得(參考：https://www.atcc.org/)。對應於各菌株之登記號描述於美國典型培養物保藏中心之目錄中。另外，BL21 (DE3)菌株係獲自例如Life Technologies (產品編號C6000-03)。

出於以可表現方式引入基因之目的，有可能使用可在宿主中自主地複製之載體作為用於轉化屬於原核生物之微生物的載體。載體較佳地為多複本載體。另外，載體較佳地具有標記物，諸如抗生素抗性基因或描述於文獻[Karl Friehs, Plasmid Copy Number and Plasmid Stability, Adv Biochem Engin/Biotechnol 86: 47-82 (2004)]中之另一基因，以便選擇轉化體。此外，載體可具有啟動子或終止子以便表現插入基因。載體之實例包括來源於細菌性質體之載體、來源於酵母質體之載體、來源於細菌噬菌體、黏質體、噬菌質體以及類似物之載體。

能夠在大腸桿菌屬細菌中自主複製的載體之特定實例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322及pSTV29 (皆來自Takara Bio Inc.)、pACYC184及pMW219 (Nippon Gene)、pTrc99A (Pharmacia)、pPROK載體(Clontech)、pKK233-2 (Clontech)、pET載體(Novagen)、pQE載體(Qiagen)及廣泛宿主範圍的載體RSF1010。

啟動子可為來源於宿主之啟動子或異源啟動子。啟動子可為待引入之基因之內部啟動子或其他基因之啟動子。

終止子之實例包括T7終止子、T4終止子、fd噬菌體終止子、tet終止子及trpA終止子。

在上文提及之轉化體(b)至(e)中，可將已引入至屬於原核生物之微生物中的基因中之兩者或更多者引入至一種轉化體中。更具體言之，例如，可將編碼C5-表異構酶之基因及編碼2-O-磺基轉移酶之基因引入至屬於原核生物之一種微生物中以形成一種轉化體。

＜＜轉化體之處理物＞＞本發明中之轉化體之處理物係指其中細菌細胞之細胞質膜為可滲透的物質。在本發明中，當細胞質膜被稱為物質可穿透的時，其意謂各種較小(離子及其類似者)及較大(蛋白質及其類似物)分子藉由擴散穿透細胞膜且藉此可自由進入及離開細胞膜。本發明中之轉化體之處理物較佳為歸因於用於賦予膜滲透性之處理而損失其生長能力的休眠細菌細胞。

轉化體之處理物之實例包括細菌細胞(亦即轉化體)之經界面活性劑處理之物質、細菌細胞之經溶劑處理之物質、細菌細胞之經酶處理之物質、含有保留與細菌細胞之培養物相同功能之存活細菌細胞作為酶源之處理物(諸如細菌細胞之固定產物)、細菌細胞之以超音波方式處理之物質，以及細菌細胞之經機械研磨處理之物質。

使得細胞質膜為物質可穿透的方法之實例包括化學處理及機械處理。在本發明之製造方法中，使得轉化體之細胞質膜為物質可穿透的時機不受特定限制，只要展現本發明之效果即可。可提前使得各轉化體之細胞質膜為物質可穿透的，或其可在藉由使用於反應中之轉化體彼此接觸來執行反應時進行。

化學處理之實例包括使用界面活性劑之方法、使用有機溶劑之方法及使用酶之方法。作為界面活性劑，非離子型界面活性劑為較佳的，此係因為其對蛋白質或類似物之作用更溫和(在相較於離子型界面活性劑時)。界面活性劑之實例包括毛地黃皂苷(digitonin)、皂苷、Triton X100、Triton X114、Tween 20、Tween 80、N,N-雙(3-D-葡糖醯胺基丙基)膽醯胺[BIGCHAP]、N,N-雙(3-D-葡糖醯胺基丙基)去氧膽醯胺[去氧-BIGCHAP]、NIKKOLBL-9EX [聚氧化乙烯(9)月桂基醚]、辛醯基-N-甲基葡糖醯胺[MEGA-8]、氯化苯甲烴銨及以及類似物。

有機溶劑之實例包括苯、甲苯、二甲苯、其他醇以及類似物。酶之實例包括溶菌酶、無色肽酶(achromopeptidase)以及類似物。

用上文提及的物質進行處理之條件(諸如濃度、溫度、時間以及類似物)視細胞之類型而不同，且需要設定適當的條件來執行所需分析，但一般處理濃度為10至1000微克/毫升，且更一般為20至200微克/毫升，溫度為2℃至37℃且時間為1至30分鐘。

機械處理之實例包括超音波處理及機械研磨處理。

＜＜轉化體之提取物＞＞本發明中之轉化體之提取物之實例包括自細菌細胞(亦即轉化體)獲得的粗酶提取物、自如上文(例如化學或機械)處理之細菌細胞獲得的經純化酶、藉由培養上述轉化體或其處理物獲得的培養物之濃縮物，以及培養物之乾燥產物。轉化體之提取物之實例亦包括藉由離心或過濾培養物獲得之細菌細胞、經乾燥細菌細胞及凍乾細菌細胞。

＜＜轉化方法及培養轉化體之方法＞＞可在不具有限制的情況下使用已知轉化方法。此類已知方法之實例包括氯化鈣/氯化銣方法、磷酸鈣方法、DEAE-聚葡萄糖介導之轉染、電脈波方法以及類似方法。其中，電脈波方法適用於棒狀菌，且電脈波方法可藉由已知方法執行[Kurusu, Y.等人，Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric Biol. Chem. 54: 443-447 (1990)]。

較佳的為藉由使用一般用於在各反應之前培養微生物之培養基進行培養來生長轉化體。有可能一般使用天然培養基或含有碳源、氮源、無機鹽及其他營養物質之合成培養基作為培養基。

碳源可為ATP源。碳源之實例包括碳水化合物或糖醇，諸如葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、澱粉、糖蜜、山梨糖醇及甘油；有機酸，諸如乙酸、檸檬酸、乳酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸及葡萄糖酸；及醇，諸如乙醇及丙醇。可單獨使用一種種類或可混合其兩種或更多種種類作為碳源。一般而言，培養基中此等碳源之濃度為約0.1至10 (w/v%)為足夠的。

氮源之實例包括無機或有機銨化合物，諸如氯化銨、硫酸銨、硝酸銨及乙酸銨、脲、氨水、硝酸鈉、硝酸鉀以及類似物。另外，亦有可能使用玉米漿、肉類提取物、蛋白腖、NZ-胺、蛋白質水解物、含氮有機化合物(諸如胺基酸)以及類似物。可單獨使用一種種類或可混合且使用其兩種或更多種種類作為氮源。培養基中氮源之濃度視所使用之氮化合物而變化，但其一般為約0.1至10 (w/v%)。

除諸如硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅及硫酸鈷之硫酸根離子源以外，無機鹽之實例包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硝酸鐵、氯化鈉、碳酸鈣以及類似物。可單獨使用一種種類或可混合且使用其兩種或更多種種類作為無機鹽。培養基中無機鹽之濃度視所使用之無機鹽而變化，但其一般為約0.01至1 (w/v%)。

營養物質之實例包括肉類提取物、蛋白腖、多蛋白腖、酵母提取物、乾酵母、玉米漿、脫脂奶粉、脫脂大豆鹽酸鹽水解物、動物及植物或微生物細菌細胞之提取物及其分解產物以及類似物，且其濃度一般為約0.1至10 (w/v%)。另外，視需要，可添加維生素。維生素之實例包括生物素、硫胺(維生素B1)、吡哆醇(維生素B6)、泛酸、肌醇、菸鹼酸以及類似物。培養基之pH較佳為約6至8。

用於微生物之培養基之較佳實例包括A培養基[Inui, M.等人，Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)]、BT培養基[Omumasaba, C.A.等人，Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)]以及類似物。作為特定培養條件，例如，培養溫度為約15℃至45℃，且培養時間為約1至7天。

＜硫酸化多醣之製造方法＞根據本發明之硫酸化多醣之製造方法之一個態樣為硫酸化多醣之製造方法，該方法包含在ATP或ATP源、硫酸根離子源及N-磺基肝素前體之存在下，藉由將轉化體(a)或其處理物以及選自轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物中之至少一者併入反應溶液中來產生硫酸化多醣。

作為根據本發明之硫酸化多醣之製造方法之一個態樣，其實例包括硫酸化多醣之製造方法，該方法包含在ATP或ATP源、硫酸根離子源及N-磺基肝素前體之存在下，藉由使用含有轉化體(a)或其處理物以及轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物之反應溶液來產生硫酸化多醣。

另外，根據本發明之硫酸化多醣之製造方法之一個態樣為硫酸化多醣之製造方法，該方法包含在PAPS及N-磺基肝素前體之存在下，將選自轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物中之至少一者併入反應溶液中來產生硫酸化多醣。

在本發明之製造方法中，各轉化體可最初添加至反應溶液中，可依序添加至其中，或可最初且依序添加至其中。將各轉化體最初添加至反應溶液中之態樣之特定實例包括其中在ATP或ATP源、硫酸根離子源及N-磺基肝素前體之存在下，藉由將轉化體(a)或其處理物以及轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物最初添加至反應溶液中來產生硫酸化多醣的態樣。

在本發明之硫酸化多醣之製造方法中，使用轉化體(a)或處理物以及轉化體(b)至(e)或其處理物提取物，有可能執行1)用轉化體(a)或其處理物供應/再生PAPS，2)用轉化體(b)或其處理物或提取物進行C5-表異構化，3)用轉化體(c)或其處理物或提取物進行2-O-硫酸化，4)用轉化體(d)或其處理物或提取物進行6-O-硫酸化，以及5)用轉化體(e)或其處理物或提取物進行3-O-硫酸化。

在下文中，將分別描述各步驟，但2) C5-表異構化、3) 2-O-硫酸化、4) 6-O-硫酸化及5) 3-O-硫酸化之次序不受特定限制，只要可獲得所需硫酸化多醣即可。

另外，在下文中，將單獨地描述1)供應/再生PAPS、2) C5-表異構化、3) 2-O-硫酸化、4) 6-O-硫酸化及5) 3-O-硫酸化中之各反應，但可同時執行此等反應中之兩者或更多者。舉例而言，可使用含有全部轉化體(a)或其處理物及轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物之反應溶液同時執行此等反應。

藉由本發明之硫酸化多醣之製造方法製造的硫酸化多醣之實例包括肝素。

＜＜供應/再生PAPS＞＞本發明之硫酸化多醣之製造方法的特徵在於包含以下步驟(1-1)及(1-2)： (1-1)製備棒狀桿菌屬細菌之轉化體(a)或轉化體(a)之處理物，該轉化體(a)至少包含以可表現方式引入其中的編碼ATP硫酸化酶之基因及編碼APS激酶之基因；及 (1-2)藉由使用含有ATP或ATP源、硫酸根離子源及轉化體(a)或其處理物之反應溶液來進行用於製造PAPS之反應。

由轉化體(a)或其處理物表現之ATP硫酸化酶及APS激酶在轉化體(a)或其處理物中與ATP或ATP源及硫酸根離子源反應，且藉此製造PAPS。PAPS在硫酸化多醣之製造中充當硫酸根基團之供體。另外，由轉化體(a)或其處理物製造的PAPS用於硫酸化多醣之製造方法中，且藉此獲得PAP。可藉由轉化體(a)或其處理物由此PAP來製造PAPS。因此，PAPS可藉由將轉化體(a)或其處理物併入反應溶液中來供應/再生。

＜＜C5-表異構化＞＞本發明之硫酸化多醣之製造方法較佳地包含以下步驟(2-1)及(2-2)： (2-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(b)或轉化體(b)之處理物或提取物，該轉化體(b)至少包含以可表現方式引入其中的編碼C5-表異構酶之基因；及 (2-2)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將轉化體(b)或其處理物或提取物併入反應溶液中來進行C5-表異構化。

在步驟(2-2)中，藉由表現C5-表異構酶之轉化體(b)或其處理物或提取物來進行N-磺基肝素前體之C5-表異構化。

＜＜2-O-硫酸化＞＞本發明之硫酸化多醣之製造方法較佳地包含以下步驟(3-1)及(3-2)： (3-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(c)或轉化體(c)之處理物或提取物，該轉化體(c)至少包含以可表現方式引入其的編碼2-O-磺基轉移酶之基因；及 (3-2)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將轉化體(c)或其處理物或提取物併入反應溶液中來進行2-O-硫酸化。

在步驟(3-2)中，使用由轉化體(a)或其處理物製造的PAPS作為硫酸根基團之供體，藉由表現2-O-磺基轉移酶的轉化體(c)或其處理物或提取物來執行N-磺基肝素前體之2-O-硫酸化。當步驟(2-2)中製造之硫酸化多醣存在於反應溶液中時，進行步驟中製造的硫酸化多醣之2-O-硫酸化。舉例而言，當存在C5-表異構化之N-磺基肝素前體時，進行C5-表異構化之N-磺基肝素前體之2-O-硫酸化。

可同時進行上文提及的C5-表異構化及2-O-硫酸化。亦即，本發明之硫酸化多醣之製造方法較佳地包含以下步驟(3'-1)至(3'-3)： (3'-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(b)或轉化體(b)之處理物或提取物，該轉化體(b)至少包含以可表現方式引入其中的編碼C5-表異構酶之基因； (3'-2)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(c)或轉化體(c)之處理物或提取物，該轉化體(c)至少包含以可表現方式引入其中的編碼2-O-磺基轉移酶之基因；及 (3'-3)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將轉化體(b)或其處理物或提取物及轉化體(c)或其處理物或提取物併入反應溶液中來進行C5-表異構化及2-O-硫酸化。

＜＜6-O-硫酸化＞＞本發明之硫酸化多醣之製造方法較佳地包含以下步驟(4-1)及(4-2)： (4-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(d)或轉化體(d)之處理物或提取物，該轉化體(d)至少包含以可表現方式引入其中的編碼6-O-磺基轉移酶之基因；及 (4-2)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將轉化體(d)或其處理物或提取物併入反應溶液中來進行6-O-硫酸化。

在步驟(4-2)中，使用由轉化體(a)或其處理物製造PAPS作為硫酸根基團之供體，藉由表現6-O-磺基轉移酶的轉化體(d)或其處理物或提取物來執行N-磺基肝素前體之6-O-硫酸化。

當步驟(2-2)、(3-2)或(3'-3)中製造之硫酸化多醣存在於反應溶液中時，進行步驟中製造的硫酸化多醣之6-O-硫酸化。

舉例而言，當存在C5-表異構化之N-磺基肝素前體時，進行C5-表異構化之N-磺基肝素前體之6-O-硫酸化。當存在2-O-硫酸化之N-磺基肝素前體時，進行2-O-硫酸化之N-磺基肝素前體之6-O-硫酸化。

當存在C5-表異構化及2-O-硫酸化之N-磺基肝素前體時，進行C5-表異構化及2-O-硫酸化之N-磺基肝素前體之6-O-硫酸化。

＜＜3-O-硫酸化＞＞本發明之硫酸化多醣之製造方法較佳地包含以下步驟(5-1)及(5-2)： (5-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(e)或轉化體(e)之處理物或提取物，該轉化體(e)至少包含以可表現方式引入其中的編碼3-O-磺基轉移酶之基因；及 (5-2)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將轉化體(e)或其處理物或提取物併入反應溶液中來進行3-O-硫酸化。

在步驟(5-2)中，使用由轉化體(a)或其處理物製造的PAPS作為硫酸根基團之供體，藉由表現3-O-磺基轉移酶的轉化體(e)或其處理物或提取物來執行N-磺基肝素前體之3-O-硫酸化。

當步驟(2-2)、(3-2)、(3'-3)或(4-2)中製造之硫酸化多醣存在於反應溶液中時，進行步驟中製造之硫酸化多醣之3-O-硫酸化。

舉例而言，當存在C5-表異構化之N-磺基肝素前體時，進行C5-表異構化之N-磺基肝素前體的之3-O-硫酸化。當存在2-O-硫酸化之N-磺基肝素前體時，進行2-O-硫酸化之N-磺基肝素前體之3-O-硫酸化。當存在6-O-硫酸化之N-磺基肝素前體時，進行6-O-硫酸化之N-磺基肝素前體之3-O-硫酸化。

當存在C5-表異構化及2-O-硫酸化之N-磺基肝素前體時，進行C5-表異構化及2-O-硫酸化之N-磺基肝素前體之3-O-硫酸化。當存在C5-表異構化及6-O-硫酸化之N-磺基肝素前體時，進行C5-表異構化及6-O-硫酸化之N-磺基肝素前體之3-O-硫酸化。當存在2-O-硫酸化及6-O-硫酸化之N-磺基肝素前體時，進行2-O-硫酸化及6-O-硫酸化之N-磺基肝素前體之3-O-硫酸化。

當存在C5-表異構化、2-O-硫酸化及6-O-硫酸化之N-磺基肝素前體時，進行C5-表異構化、2-O-硫酸化及6-O-硫酸化之N-磺基肝素前體之3-O-硫酸化。

＜＜反應條件＞＞下文將描述上文提及的1)供應/再生PAPS、2) C5表異構化、3) 2-O-硫酸化、4) 6-O-硫酸化及5) 3-O-硫酸化之反應條件。

反應溶液之pH較佳為約6至8。在反應期間，較佳地使用氨水溶液、氫氧化鈉、氫氧化鉀或類似物之水溶液，藉由將反應溶液之pH控制至幾乎中性，特定言之約7的pH控制器來進行反應。

反應溫度，亦即反應期間轉化體之存活溫度較佳為20℃至50℃，且更佳為25℃至47℃。反應時間較佳為約1至7天，且更佳為約1至3天。培養物可為分批類型、分批補料類型及連續類型中之任一者。其中，分批類型為較佳的。

充氣條件反應可在還原條件或微好氧條件下執行。還原條件由反應溶液之氧化還原電位定義。反應溶液之氧化還原電位較佳為約-200 mV至-500 mV且更佳為-250 mV至-500 mV。

反應溶液之還原狀態可容易地使用刃天青(resazurin)指示器估計，且可使用氧化-還原電位計精確地量測。可使用(但不限於)已知方法作為在還原條件下製備反應溶液之方法。

具體言之，可藉由使蒸餾水或類似物經受熱處理或減壓處理移除溶解氣體來獲得在還原條件下用於反應溶液之水溶液。另外，可添加適當還原劑(例如，硫代乙醇酸、抗壞血酸、胱胺酸鹽酸鹽、巰基乙酸、硫代硫醇乙酸、麩胱甘肽、硫化鈉或類似物)來製備在還原條件下用於反應溶液之水溶液。此等方法之適當組合亦為在還原條件下製備反應溶液之水溶液的有效方法。

在反應期間維持還原條件的情況下，需要儘可能地防止來自反應系統外部之氧氣混合，且此方法之特定實例包括其中藉由諸如氮氣或二氧化碳氣體之惰性氣體封閉反應系統的方法。

在反應期間維持微好氧條件的情況下，可在其中將充氣速率設定為0.5 vvm或類似物的低值或更低值且將攪拌速度設定為500 rpm或類似物的低值或更低值的條件下進行反應。在一些情況下，可與其中在開始反應之後的適當時間停止充氣的狀態組合執行反應，且厭氧狀態程度在攪拌速度為100 rpm或更低的條件下增加。

＜＜收集硫酸化多醣＞＞藉由如上文所描述之培養在反應溶液中製造硫酸化多醣。硫酸化多醣可藉由回收反應溶液來收集，且此外，可藉由已知方法將硫酸化多醣與反應溶液分離。此類已知方法之實例包括蒸餾法、膜滲透法、有機溶劑提取法及其類似方法。

＜＜製備N-磺基肝素前體＞＞藉由脫乙醯、解聚合及N-硫酸化肝素前體來獲得用於本發明之硫酸化多醣之製造方法中的N-磺基肝素前體。可藉由已知方法(例如，WO2018/048973)進行肝素前體之製造及由肝素前體進行之N-磺基肝素前體之製造。

肝素前體之製造方法之實例包括包含在培養基中培養具有以下(a1)之基因修飾且具有肝素前體製造能力的屬於原核生物之微生物以在培養基中產生肝素前體，且自培養基中收集肝素前體之方法： (a1)增加kpsS基因之表現量的基因修飾。除(a1)以外，屬於原核生物之微生物亦可進一步具有以下基因修飾(a2)及(a3)中之至少一者： (a2)增加至少一種選自kfiA、kfiB、kfiC及kfiD基因中之基因之表現量的基因修飾；及 (a3)造成yhbJ基因之功能喪失的基因修飾

kpsS基因為由區域I、區域II及區域III之基因組當中的區域I編碼之基因。kpsS參與起始肝素前體合成。在肝素前體製造中，kpsS與kpsC一起在將多個Kdo連接子添加至內膜中之磷脂醯甘油中起作用。

作為kpsS基因，來源於大腸桿菌屬之kpsS基因為較佳的。其特定實例包括大腸桿菌K5菌株之kpsS基因。大腸桿菌K5菌株之kpsS基因之核苷酸序列及由該基因編碼之蛋白質之胺基酸序列可獲自公共資料庫。將大腸桿菌K5菌株之kpsS基因登記為GenBank寄存號CAA52659.1。

kpsS基因之實例包括具有SEQ ID NO: 27中所示之核苷酸序列的DNA，或在表現量在具有與SEQ ID NO: 27中所示之核苷酸序列90%或更大一致之核苷酸序列且具有肝素前體製造能力的屬於原核生物之微生物中增加時具有增加微生物之肝素前體製造能力之特性的DNA。

kfiA、kfiB、kfiC及kfiD為由區域I、區域II及區域III之基因組當中的區域II編碼之基因。如圖2中所展示，kfiA、kfiB、kfiC及kfiD參與肝素前體合成且在添加糖且藉此合成肝素前體中起作用。

作為kfiA、kfiB、kfiC或kfiD基因，來源於大腸桿菌屬之kfiA、kfiB、kfiC或kfiD基因為較佳的。其特定實例包括大腸桿菌K5菌株之kfiA、kfiB、kfiC或kfiD基因。大腸桿菌K5菌株之kfiA、kfiB、kfiC或kfiD基因之核苷酸序列及由該基因編碼之蛋白質之胺基酸序列可獲自公共資料庫。將kfiA登記為GenBank寄存號CAA54711.1；將kfiB登記為GenBank寄存號CAE55824.1；將kfiC登記為GenBank寄存號CAA54709.1；且將kfiD登記為GenBank寄存號CAA54708.1。

kfiA基因之實例包括具有SEQ ID NO: 28中所示之核苷酸序列的DNA，或在表現量在具有與SEQ ID NO: 28中所示之核苷酸序列90%或更大一致之核苷酸序列且具有肝素前體製造能力的屬於原核生物之微生物中增加時具有增加微生物之肝素前體製造能力之特性的DNA。

kfiB基因之實例包括具有SEQ ID NO: 29中所示之核苷酸序列的DNA，或在表現量在具有與SEQ ID NO: 29中所示之核苷酸序列90%或更大一致之核苷酸序列且具有肝素前體製造能力的屬於原核生物之微生物中增加時具有增加微生物之肝素前體製造能力之特性的DNA。

kfiC基因之實例包括具有SEQ ID NO: 30中所示之核苷酸序列的DNA，或在表現量在具有與SEQ ID NO: 30中所示之核苷酸序列90%或更大一致之核苷酸序列且具有肝素前體製造能力的屬於原核生物之微生物中增加時具有增加微生物之肝素前體製造能力之特性的DNA。

kfiD基因之實例包括具有SEQ ID NO: 31中所示之核苷酸序列的DNA，或在表現量在具有與SEQ ID NO: 31中所示之核苷酸序列90%或更大一致之核苷酸序列且具有肝素前體製造能力的屬於原核生物之微生物中增加時具有增加微生物之肝素前體製造能力之特性的DNA。

圖3展示肝素前體生物合成路徑之示意圖。GlmS為UDP-N-乙醯基葡糖胺供應路徑中之第一酶，其為肝素前體之前驅體且為催化果糖-6-磷酸鹽至葡糖胺-6-磷酸鹽之反應的酶。YhbJ為陰性控制GlmS之酶。

作為yhbJ基因，來源於大腸桿菌屬之yhbJ基因為較佳的。其特定實例包括大腸桿菌K-12菌株之yhbJ基因。大腸桿菌K-12菌株之yhbJ基因之核苷酸序列及由該基因編碼之蛋白質之胺基酸序列可獲自公共資料庫。將大腸桿菌K-12菌株之yhbJ基因登記為GenBank寄存號BAE77249.1。

yhbJ基因之實例包括具有SEQ ID NO: 32中所示之核苷酸序列的DNA，或在表現量在具有與SEQ ID NO: 32中所示之核苷酸序列90%或更大一致之核苷酸序列且具有肝素前體製造能力的屬於原核生物之微生物中降低時具有增加微生物之肝素前體製造能力之特性的DNA。

上文(a1)至(a3)中之各基因藉由例如使用上文所描述之各基因之核苷酸序列的BLAST搜索或FASTA搜索而容易地獲自公共資料庫。另外，各基因之同系物可藉由例如使用微生物(諸如細菌)之染色體作為模板且使用基於此等已知基因序列製造之寡核苷酸作為引子的PCR來獲得。

上文(a1)至(a3)中之各基因可為基因之變異體，只要維持由該基因編碼之蛋白質之原始功能(例如，活性或特性)即可。可檢查由基因之變異體編碼之蛋白質是否維持其原始功能；具體言之，例如在原始功能藉由將基因之變異體引入至具有肝素前體製造能力的屬於原核生物之微生物中而提高肝素前體製造能力時。

上文(a1)至(a3)中之各基因之變異體可根據定點突變誘發方法藉由修飾基因之編碼區以使得所編碼蛋白質之特定位置處的胺基酸殘基經取代、缺失、插入或添加來獲得。另外，上文(a1)至(a3)中之各基因之變異體亦可藉由例如突變處理來獲得。

只要維持其原始功能，上文基因(a1)至(a3)中之每一者均可為編碼具有胺基酸序列之蛋白質的基因，其中一個或若干個位置處之一個或若干個胺基酸經取代、缺失、插入或添加。舉例而言，在經編碼蛋白質中，其N端及/或C端可經延長或縮短。片語「一個或若干個」視蛋白質之三維結構中的胺基酸殘基之位置及類型而不同。其特定實例包括1至50、1至40、1至30，且其較佳為1至20，更佳為1至10，甚至更佳為1至5且尤佳為1至3。

如上文所描述之一個或若干個胺基酸之取代、缺失、插入或添加為正常維持蛋白質之功能的保守突變。保守突變之代表為保守取代。保守取代為其中在取代位點為芳族胺基酸的情況下取代發生在Phe、Trp與Tyr之間；在取代位點為疏水性胺基酸的情況下取代發生在Leu、Ile與Val之間；在取代位點為極性胺基酸的情況下取代發生在Gln與Asn之間；在取代位點為鹼性胺基酸的情況下取代發生在Lys、Arg與His之間；在取代位點為酸性胺基酸的情況下取代發生在Asp與Glu之間以及在取代位點為具有羥基之胺基酸的情況下取代發生Ser與Thr之間的突變。視為保守取代的取代之特定實例包括用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；以及用Met、Ile或Leu取代Val。另外，如上文所描述之胺基酸之取代、缺失、插入、添加、其倒置以及類似物包括由天然存在之突變(突變體或變異體) (諸如基於基因所來源於之生物體之個體差異或物種差異的突變)引起的取代、缺失、插入及添加、倒置以及類似物。

另外，只要維持其原始功能，上文(a1)至(a3)中之各基因可為編碼與整個胺基酸序列80%或更大，較佳90%或更大，更佳95%或更大，甚至更佳97%或更大且尤佳99%或更大一致之蛋白質的基因。

另外，只要維持其原始功能，上文(a1)至(a3)中之各基因可為在嚴格條件下與可由已知基因序列(諸如與核苷酸序列之全部或一部分互補的序列)製備之探針雜交的DNA。術語「嚴格條件」係指在其下形成所謂的特異性雜交體且不形成非特異性雜交體的條件。其實例包括在其下彼此為較高水準一致之DNA (例如，彼此為80%或更大，較佳90%或更大，更佳95%或更大，甚至更佳97%或更大且尤佳99%或更大一致的DNA)彼此雜交且彼此為較低水準一致之DNA並不彼此雜交的條件；或其為用於在正常的南方雜交中進行洗滌之條件的條件，其中洗滌在對應於60℃，1 × SSC及0.1% SDS，較佳為60℃，0.1 × SSC及0.1% SDS，且更佳為68℃，0.1 × SSC及0.1% SDS的鹽濃度及溫度下執行一次，較佳為二至三次。

用於上文雜交中之探針可為各基因之互補序列之一部分。此探針可藉由使用基於已知基因序列製造之寡核苷酸作為引子且使用含有上文(a1)至(a3)中之各基因之DNA片段作為模板的PCR來製造。舉例而言，長度為約300 bp之DNA片段可用作探針。在長度為約300 bp之DNA片段用作探針的情況下，用於在雜交中進行洗滌的條件之實例包括50℃，2 × SSC及0.1% SDS之條件。

另外，由於密碼簡併視宿主而不同，因此上文(a1)至(a3)中之各基因可為藉由用等效密碼子置換任一密碼子而獲得的基因，只要維持其原始功能即可。舉例而言，表1至3之基因可經修飾以使得視所使用宿主之密碼子使用之頻率而定，其具有最佳密碼子。

突變處理之實例包括藉由羥胺或類似物活體外處理具有上文(a1)至(a3)中之各基因之核苷酸序列的DNA分子之方法；藉由X射線、紫外線或諸如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、甲磺酸乙酯(EMS)及甲烷磺酸甲酯(MMS)以及類似物之誘變劑處理攜帶上文(a1)至(a3)中之各基因的微生物之方法。

＜＜＜增加基因表現之基因修飾＞＞＞片語「基因表現的增加」意謂與未經修飾菌株之表現相比，基因之表現升高。增加基因之表現之一個態樣之實例包括其中與未經修飾菌株之表現相比，基因之表現較佳地增加1.5倍或更多倍，更佳地增加2倍或更多倍且甚至更佳地增加3倍或更多倍的態樣。

另外，片語「基因表現增加」不僅意謂目標基因在最初表現目標基因之菌株中的表現增加，且亦意謂目標基因最初未表現目標基因之菌株中表現。亦即，片語「基因表現增加」包括例如將目標基因引入至不具有目標基因之菌株中且目標基因於其中表現的情況。此外，片語「基因表現增加」亦稱為片語「基因表現增強」或「基因表現升高」。

基因表現的增加可藉由例如增加基因之複本數來實現。增加基因之複本數可藉由將基因引入至宿主之染色體中來實現。將基因引入至染色體中可使用例如同源重組來執行(Miller I, J.H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory)。可引入基因之僅一個複本或可引入其兩個或更多個複本。

舉例而言，可藉由執行同源重組，同時靶向在染色體上具有多個複本之序列來將基因之多個複本引入至染色體中。在染色體上具有多個複本的序列之實例包括重複DNA序列(重複DNA)且反向重複序列存在於轉位子之兩端處。

替代地，可在靶向染色體上之適當序列，諸如製造目標物質非必需之基因時執行同源重組。同源重組可藉由例如以下方法來執行：使用直鏈DNA之方法；使用含有熱敏複製源之質體的方法；使用能夠接合轉移之質體之方法；使用不具有在宿主中起作用之複製源的自殺載體之方法；或使用噬菌體之轉導方法。另外，亦可使用轉位子或Mini-Mu將基因無規引入至染色體中(JP-A-H2-109985)。

可藉由使用具有與全部或一部分基因互補之序列之探針的南方雜交、使用基於基因之序列製造之引子的PCR或類似者來檢查目標基因是否已經引入至染色體中。

另外，亦可藉由將含有基因之載體引入至宿主中來增加基因之複本數。舉例而言，有可能藉由將含有目標基因之DNA片段接合至在宿主中起作用之載體，且用表現載體轉化宿主來構築基因之表現載體來增加基因之複本數。可藉由例如使用具有目標基因的微生物之基因體DNA作為模板的PCR來獲得含有目標基因之DNA片段。轉化方法不受特定限制且可使用習知已知方法。

可使用可在宿主細胞中自主複製的之載體作為載體。載體較佳地為多複本載體。另外，載體較佳地具有標記物，諸如抗生素抗性基因或描述於文獻[Karl Friehs, Plasmid Copy Number and Plasmid Stability, Adv Biochem Engin/Biotechnol 86: 47-82 (2004)]中之另一基因，以便選擇轉化體。此外，載體可具有啟動子或終止子以便表現插入基因。載體之實例包括來源於細菌性質體之載體、來源於酵母質體之載體、來源於細菌噬菌體、黏質體、噬菌質體以及類似物之載體。

能夠在腸內菌科細菌(諸如大腸桿菌)中自主複製的載體之特定實例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322及pSTV29 (全部來自Takara Bio Inc.)；pACYC184及pMW219 (Nippon Gene)；pTrc99A (Pharmacia)；pPROK載體(Clontech)；pKK233-2 (Clontech)；pET載體(Novagen)；pQE載體(Qiagen)及廣泛宿主範圍的載體RSF1010。

在引入基因之情況下，其足以使基因保留在本發明中之具有基因修飾的屬於原核生物之微生物中。具體言之，其足以引入基因以使得其在本發明之細菌中起作用之啟動子序列的控制下表現。啟動子可為來源於宿主之啟動子或異源啟動子。啟動子可為待引入之基因之內部啟動子或其他基因之啟動子。舉例而言，可使用稍後將描述的更強啟動子作為啟動子。

用於終止轉錄之終止子可安置在基因之下游。終止子不受特定限制，只要其在本發明之細菌中起作用即可。終止子可為來源於宿主之終止子或異源終止子。終止子可為對待引入基因具有特異性之終止子或可為其他基因之終止子。終止子之特定實例包括T7終止子、T4終止子、fd噬菌體終止子、tet終止子及trpA終止子。

可用於各種微生物中之載體、啟動子及終止子詳細描述於例如「Basic Lecture 8 on Microbiology, Gene Engineering, KYORITSU SHUPPAN, 1987」中且可使用此等載體、啟動子及終止子。

另外，在引入兩種或更多種基因的情況下，足以使各基因以可表現方式保留在本發明之細菌中。舉例而言，各基因可全部保留在單個表現載體上或可全部保留在染色體上。此外，各基因可為單獨地保留在複數個表現載體上或可單獨地保留在單一或複數個表現載體及一染色體上。此外，兩種或更多種基因可形成操縱子(operon)且經引入。「引入兩種或更多種基因之情況」之實例包括引入分別編碼兩種或更多種酶之基因的情況、引入分別編碼形成單一酶之兩個或更多個次單元之基因的情況以及其組合。

待引入基因不受特定限制，只要其編碼在宿主中起作用之蛋白質即可。待引入基因可為來源於宿主之基因或異源基因。待引入之基因可藉由例如使用基於基因之核苷酸序列設計之引子且使用具有基因或攜載基因之質體或類似物的生物體之基因體DNA作為模板的PCR來獲得。另外，待引入之基因可例如基於基因之核苷酸序列來完全合成[Gene, 60 (1), 115-127 (1987)]。

此外，基因表現的增加可藉由提高基因之轉錄效率來實現。提高基因之轉錄效率可藉由例如用更強啟動子置換染色體上的基因之啟動子來實現。「更強啟動子」係指相對於天然存在之野生型啟動子增強基因轉錄的啟動子。

「更強啟動子」之實例包括已知高表現啟動子，諸如uspA啟動子、T7啟動子、trp啟動子、lac啟動子、thr啟動子、tac啟動子、trc啟動子、tet啟動子、araBAD啟動子、rpoH啟動子、PR啟動子及PL啟動子。

另外，可使用各種報導基因來獲得高活性類型之習知啟動子作為更強啟動子。舉例而言，啟動子之活性可藉由使啟動子區中之-35及-10區更接近共有序列來增加(WO2000/18935)。

高活性類型啟動子之實例包括各種tac樣啟動子(Katashkina JI等人，俄羅斯聯邦專利申請案2006134574)及pnlp8啟動子(國際WO2010/027045)。用於評估啟動子強度之方法及強啟動子之實例描述於已知文獻[Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)及類似者]中。

另外，基因表現量的增加可藉由提高基因之轉譯效率來實現。基因之轉譯效率之提高可藉由例如用更強SD序列置換染色體上之基因之Shine-Dalgarno (SD)序列(亦稱作核糖體結合位點(RBS))來實現。

「更強SD序列」係指其中mRNA轉譯相對於天然存在之野生型SD序列得到改善的SD序列。更強SD序列之實例包括來自噬菌體T7的基因10之RBS [Olins P.O.等人，Gene, 1988, 73, 227-235]。另外，已知RBS與起始密碼子之間的間隔區中(特定言之緊接著起始密碼子(5'-UTR)之上游的序列中)的若干核苷酸之取代、插入或缺失顯著影響mRNA之穩定性及轉譯效率，且因此可藉由修飾此等核苷酸來提高基因之轉譯效率。

在本發明中，影響基因(諸如啟動子、SD序列及RBS與起始密碼子之間的間隔區)之表現的位點亦統稱為「表現控制區」。表現控制區可使用基因搜索軟體，諸如啟動子搜索載體或GENETYX來確定。此等表現控制區之修飾可藉由例如使用熱敏載體之方法或Red驅動整合方法來執行(WO2005/010175)。

基因轉譯效率之提高亦可藉由例如密碼子修飾來實現。具體言之，例如在執行基因之異源表現以及類似者的情況下，可藉由用更頻繁使用之同義密碼子置換存在於基因中之罕見密碼子來提高基因之轉譯效率。

密碼子取代可藉由例如其中將目標突變引入至DNA中之目標位點中之定點誘變方法來執行。定點誘變方法之實例包括使用PCR之方法[Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H.A.編，Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382 (1987)]及使用噬菌體之方法[Kramer, W.及Frits, H.J., Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T.A.等人，Meth. In Enzymol., 154, 367 (1987)]。替代地，可完全地合成其中密碼子已經取代之基因片段。各種生物體中密碼子之使用頻率描述於「Codon usage database」中[http://www.kazusa.or.jp/codon；Nakamura, Y.等人，Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)]。

另外，亦可藉由擴增增加基因之表現的調節子或藉由缺失或減弱減小基因之表現的調節子來增加基因之表現。如上文所描述之用於增加基因之表現的此類技術可單獨使用或可以任何組合形式使用。

可例如藉由檢查基因之轉錄量的增加或藉由檢查由基因表現之蛋白質之量的增加來檢查基因之表現的增加。另外，可例如藉由檢查由基因表現之蛋白質之活性的增加來檢查基因之表現的增加。

檢查基因之轉錄量的增加可藉由將自基因轉錄之mRNA之量與未經修飾菌株(諸如野生菌株或母體菌株)進行比較來執行。用於評估mRNA之量的方法之實例包括北方雜交(Northern hybridization)、RT-PCR以及類似者[Sambrook, J.,等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual/第三版, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001]。mRNA之量的增加係指例如與未經修飾菌株之量相比，mRNA之量已較佳地增加1.5倍或更多倍，已更佳地增加2倍或更多倍且已甚至更佳地增加3倍或更多倍的情況。

蛋白質之量的增加可藉由例如使用抗體之西方墨點(Western blot)來檢查。蛋白質之量的增加係指例如與未經修飾菌株之量相比，蛋白質之量已較佳地增加1.5倍或更多倍，已更佳地增加2倍或更多倍且已甚至更佳地增加3倍或更多倍的情況。

蛋白質之活性的增加可藉由例如量測蛋白質之活性來檢查。蛋白質之活性的增加係指例如與未經修飾菌株之活性相比，蛋白質之活性已較佳地增加1.5倍或更多倍，已更佳地增加2倍或更多倍且已甚至更佳地增加3倍或更多倍的情況。

用於增加基因之表現的上述技術可用於增強上文基因(a1)及(a2)中之每一者之表現。

增加kpsS基因之表現的基因修飾較佳地為kpsS基因之表現控制區之修飾及增加複本數之基因修飾中之至少一者。kpsFEDUCS基因以肝素前體製造基因組形式存在，但如稍後將在實例中所描述，本發明之發明人已發現藉由增加其中僅kpsS基因之表現來獲得特定提高肝素前體之製造的效果。因此，作為增加kpsS基因之表現的基因修飾，用於增加kpsS基因之複本數的基因修飾為尤佳的。

增加至少一種選自kfiA、kfiB、kfiC及kfiD基因之基因之表現的基因修飾較佳地為至少一種選自kfiA、kfiB、kfiC及kfiD基因之基因之表現控制區的修飾及增加基因之複本數中的至少一者。如圖1中所展示，kfiA、kfiB、kfiC及kfiD基因構成操縱子。增加由kfiA、kfiB、kfiC及kfiD基因構成之整個操縱子的基因修飾為較佳的，且kfiA、kfiB、kfiC及kfiD基因之表現控制區的修飾為更佳的。

＜＜＜造成基因功能之喪失的基因修飾＞＞＞造成上文(a3)之yhbJ基因之功能喪失的基因修飾之實例包括其中由對應於yhbJ之一部分編碼的蛋白質之功能藉由修飾作為宿主的屬於原核生物之微生物之基因體DNA中的編碼對應於yhbJ之部分的DNA而減少或完全停止的基因修飾。

在本發明之方法中，待添加至編碼對應於yhbJ之部分之DNA的修飾之形式不受特定限制，只要由對應於yhbJ之基因編碼的蛋白質之功能減少或完全停止即可，且可適當地使用已知方法。

減少或完全停止由對應於yhbJ之部分編碼的蛋白質之功能的形式之實例包括以下修飾(I)至(III)中之任一者： (I)移除編碼對應於yhbJ之部分的DNA之全部或一部分。 (II)對編碼對應於yhbJ之部分的DNA進行一個或若干個取代、缺失或添加。 (III)編碼對應於yhbJ之部分的DNA在修飾之前經與DNA序列小於80%一致之DNA序列置換。

yhbJ基因之功能之喪失之實例包括相較於未經修飾菌株之活性，yhbJ基因之活性較佳為20%或更低，更佳為10%或更低，且甚至更佳為5%或更低的情況。可藉由北方墨點法(Northern blotting method)、西方墨點法(Western blotting method)或類似方法檢驗glmS之表現量來檢查yhbJ之活性[Kalamorz F.等人，(2007)「Feedback control of glucosamine-6-phosphate synthase GlmS expression depends on the small RNA GlmZ and involves the novel protein YhbJ in Escherichia coli.」Mol Microbiol. 65 (6):1518-33]。

在本發明之硫酸化多醣之製造方法中，可使用藉由用已知方法化學修飾肝素前體獲得之N-磺基肝素前體用於反應溶液，其中肝素前體係藉由用於製造肝素前體之上述方法獲得。

＜PAPS之製造方法＞本發明之PAPS之製造方法的特徵在於藉由將ATP源、硫酸根離子源、上述轉化體(a)或其處理物併入至反應溶液中來進行PAPS製造反應。亦即，本發明之PAPS之製造方法包含以下步驟(i)及(ii)： (i)製備棒狀桿菌屬細菌之轉化體或轉化體之處理物，該轉化體至少包含以可表現方式引入其中的編碼ATP硫酸化酶之基因及編碼APS激酶之基因，其中轉化體之細胞質膜為物質可穿透的；及 (ii)藉由使用含有ATP源、硫酸根離子源及步驟(i)中製備之轉化體或其處理物之反應溶液來進行用於製造PAPS之反應。

根據本發明之PAPS之製造方法，可藉由細菌細胞反應使用表現ATP硫酸化酶及APS激酶之棒狀桿菌屬細菌之轉化體或其處理物來製造PAPS。

實例實例展示如下，但本發明不限於以下實例。實例 1

產氨棒狀桿菌DE3質體之構築如下構築用於將含有T7 RNA聚合酶基因之λ DE3插入產氨棒狀桿菌野生型菌株ATCC 6872之染色體上的gltD-purT之間的質體。設計用於擴增gltD側[gltD-purT_1 (SEQ ID NO: 1)及gltD-purT_2BX (SEQ ID NO: 2)]之兩種種類之引子及用於擴增purT側[gltD-purT_3BX] (SEQ ID NO: 3)及gltD-purT_4 (SEQ ID NO: 4)]之兩種種類之引子。

此時，為執行用於連接在第一PCR中擴增之gltD側接片段及purT側接片段的第二次PCR (融合PCR)，將與用於擴增purT側接片段之5'引子(gltD-purT_4；SEQ ID NO: 4)之3'側上的約25個鹼基之序列互補的序列添加至用於擴增gltD側接片段之3'引子(gltD-purT_2BX；SEQ ID NO: 2)之5'側上。另外，將用於In-Fusion選殖之序列添加至用於擴增gltD側接片段之5'引子(gltD-purT_1)及用於擴增purT側接片段之3'引子(gltD-purT_4)的5'側。此外，將BglII及XhoI識別序列添加至gltD側及purT側上之喜好部分以插入λ DE3。

根據如Saito等人之方法[Biochim. Biophys. Acta 72, 619 (1963)]來製備產氨棒狀桿菌ATCC 6872菌株(下文中被稱為ATCC 6872) (其為產氨棒狀桿菌之野生型菌株)之染色體DNA。

使用染色體DNA作為模板，執行用於擴增gltD側接片段及purT側接片段之第一次PCR，且藉此獲得gltD側接上之約0.8 kb DNA片段及purT側接上之約0.8 kb DNA片段。接著，執行第二次PCR以連接此等gltD側接片段及purT側接片段，且藉此獲得約1.6 kb DNA片段(gltD-BX-purT)。

用BamHI切割質體pESB30，其中含有枯草桿菌(Bacillus subtilis)之聚果糖生成酶基因sacB之2.6 kb PstI DNA片段[Mol. Microbiol., 6, 1195 (1992)]含於具有康微素抗性基因之大腸桿菌之載體pHSG299之PstI裂解位點[Gene, 61, 63, (1987)]處。此後，使用In-Fusion選殖套組連接上文獲得之gltD-BX-purT片段(Takara Bio Inc.)。使用反應產物，根據習知方法[Molecular cloning: a laboratory manual,第3版, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]轉化大腸桿菌DH5 α [由TOYOBO CO., LTD.製造]。

在含有20微克/毫升康微素(kanamycin)之LB瓊脂培養基[在1 L水中含有10 g胰化蛋白腖(bactotryptone) (由Difco製造)、5 g酵母提取物(由Difco製造)、10 g氯化鈉及16 g細菌瓊脂(Bacto agar) (由Difco製造)且將其pH調節至pH 7.0的培養基]上培養所獲得菌株，且選擇經轉化菌株。在藉由菌落PCR選擇目標純系後，將經轉化菌株接種至含有20微克/毫升康微素之LB培養基(除不含有瓊脂以外的具有與LB瓊脂培養基相同之組成的培養基)且培養隔夜，且藉此使用QIAprep Spin Miniprep套組(Qiagen)由所獲得培養液製備質體。核苷酸序列分析證實，質體具有其中約1.6 kb gltD-BX-purT片段插入至pESB30中的結構。

隨後，藉由使用自大腸桿菌BL21 (DE3)提取之染色體DNA作為模板且使用DE3-for_Xho (SEQ ID NO: 5)及DE3-rev_Bgl (SEQ ID NO: 6)之引子的PCR來擴增4.5 kb λ DE3片段。將XhoI識別序列添加至DE3-for_Xho，且將BglII識別序列添加至DE3-rev_Bgl。將此片段及具有其中約1.6 kb gltD-BX-purT片段插入至pESB30中之結構的質體用XhoI及BglII消化，且接著藉由DNA接合套組(Takara Bio Inc.)連接。

以與上文所描述相同之方式轉化大腸桿菌DH5 α，在含有20微克/毫升康微素之LB瓊脂培養基上培養因此獲得之菌株，且選擇經轉化菌株。將經轉化菌株接種至含有20微克/毫升康微素之LB培養基中且培養隔夜，且藉此使用QIAprep Spin Miniprep套組(Qiagen)由所獲得培養液來製備質體。核苷酸序列分析證實，質體具有其中約4.5 kb λ DE3片段插入至pESB30上之約1.6 kb gltD-purT之間的結構。將此質體命名為pC-DE3。實例 2

產氨棒狀桿菌之λ DE3插入菌株之構築根據Rest等人之方法[Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541 (1999)]藉由電致孔將PC-DE3引入至ATCC 6872菌株中，且選擇康微素抗性菌株。當藉由南方雜交[Molecular cloning: a laboratory manual, 第3版, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]檢測自康微素抗性菌株中之一者獲得的染色體之結構時，證實藉由Campbell類型同源重組將pC-DE3整合至染色體中。

將經轉化菌株(單一重組子)施加至Suc瓊脂培養基[在1 L水中含有100 g蔗糖、7 g肉類提取物、10 g蛋白腖、3 g氯化鈉、5 g酵母提取物(由Difco製造)及15 g細菌瓊脂(由Difco製造)且將其pH調節至pH 7.2之的培養基]中且在30℃下培養1天，且選擇生長菌落。其中存在sacB基因之菌株不可在此培養基上生長，此係因為其將蔗糖轉化為自殺受質[J. Bacteriol., 174, 5462 (1991)]。另一方面，其中sacB基因已藉由λ DE3插入型與染色體附近存在之野生型之間的第二次同源重組缺失的菌株可在此培養基上生長而不產生自殺受質。在此同源重組期間，野生型結構或其中λ DE3片段已插入於gltD-purT之間的菌株與sacB一起脫落。此時，在野生型結構與sacB一起脫落的菌株中，發生針對λ DE3插入型之基因置換。

藉由使用因此獲得之第二重組子以及DE3-for_Xho及DE3-rev_Bgl之引子的菌落PCR獲得其中λ DE3插入於ATCC 6872之gltD-purT之間的菌株。將此菌株命名為ATCC 6872 (DE3)。實例 3

具有用於表現MET3-MET14之DNA片段的質體之構築用BamHI消化質體pCS299P [Appl. Microbiol. Biotech., 63, 592 (2004)]。藉由pCET_Fw2 (SEQ ID NO: 7)及pCET_Rv2 (SEQ ID NO: 8)且使用pET21b作為模板來執行PCR，以獲得含有lacI-PT7之DNA片段。此等係藉由QIAquick PCR純化套組(Qiagen)純化且使用In-Fusion選殖套組(Takara Bio Inc.)連接。使用反應產物，根據習知方法轉化大腸桿菌DH5 α (由TOYOBO CO., LTD.製造)且在含有20微克/毫升康微素之LB瓊脂培養基上培養，並選擇經轉化菌株。在藉由菌落PCR選擇目標純系之後，將經轉化菌株接種至含有20微克/毫升康微素之LB培養基中且培養隔夜，且藉此使用QIAprep Spin Miniprep套組(Qiagen)由所獲得培養液來製備質體。核苷酸序列分析證實，質體為具有其中來源於pET21b之約1.9 kb lacI-PT7 DNA片段插入至pCS299P中之結構的質體。將此質體命名為pCET212。

隨後，構築其中將來源於釀酒酵母菌之MET3及MET14插入pCET212之T7啟動子之下游的質體。設計用於擴增來自釀酒酵母菌S288C菌株(下文中被稱為S288C)之染色體DNA的兩種種類之引子(MET3_1 (SEQ ID NO: 9)及MET3_2 (SEQ ID NO: 10))及用於擴增MET14之兩種種類之引子(MET14_3 (SEQ ID NO: 11)及MET14_4 (SEQ ID NO: 12))。

在彼時，為執行連接在第一次PCR中擴增之MET3片段及MET14片段的第二次PCR (融合PCR)，將與用於擴增MET14之5'引子(MET14_3；SEQ ID NO: 11)之5'側上的約15個鹼基之序列互補的序列添加至用於擴增MET3之3'引子(MET3_2；SEQ ID NO: 10)之5'側，且將與MET3_3之5'側上的約15個鹼基之序列互補的序列添加至MET14_3之5'側。另外，將用於In-Fusion選殖之序列添加至用於擴增MET3之5'引子(MET3_1)及用於擴增MET13之3'引子(MET14_4)的5'側。使用S288C菌株之染色體DNA作為模板，執行用於擴增MET3及MET14之第一次PCR，且藉此獲得下游區域中的約1.5 kb MET3之DNA片段及約0.6 kb DNA片段。接著，執行第二次PCR以連接此等MET3片段及MET14片段，且藉此獲得約2.1 kb DNA片段(MET3-MET14)。此DNA片段係使用QIAquick PCR純化套組(Qiagen)純化且接著使用In-Fusion選殖套組(Takara Bio Inc.)接合至用NdeI及XhoI消化之pCET212。使用反應產物，根據習知方法來轉化大腸桿菌DH5 α (由TOYOBO CO., LTD.製造)。在含有20微克/毫升康微素之LB瓊脂培養基上培養因此獲得之菌株，且選擇經轉化菌株。在藉由菌落PCR選擇目標純系之後，將經轉化菌株接種至含有20微克/毫升康微素之LB培養基中且培養隔夜，且藉此使用QIAprep Spin Miniprep套組(Qiagen)由所獲得培養液來製備質體。核苷酸序列分析證實，質體具有其中約2.1 kb MET3-MET14片段插入至pCET212中的結構。將此質體命名為pSC-3-13。藉由將pSC-3-13轉化成ATCC 6872 (DE3)，獲得產氨棒狀桿菌之製造PAPS之ATCC 6872 (DE3)/pSC-3-13菌株。實例 4

具有用於表現伴隨蛋白之DNA片段的質體之構築使用Gro_F (SEQ ID NO: 13)及Gro_R (SEQ ID NO: 14)且使用大腸桿菌BL21 (DE3)菌株之染色體DNA作為模板執行PCR，且藉此獲得含有GroES-GroEL之DNA片段。接著，使用pKD46 [Datsenko, K.A., Warner, B.L., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, 第97卷. 6640-6645 (2000)]作為模板且使用AraC_ParaB_F (SEQ ID NO: 15)及AraC_ParaB_R (SEQ ID NO: 16)來執行PCR，且藉此獲得含有AraC_ParaB之DNA片段。使用pCDF-SmOri-F (SEQ ID NO: 17)及pCDF-SmOri-R (SEQ ID NO: 18)且使用pCDF-Duet1 (Novagen)作為模板來執行PCR，且藉此獲得含有鏈黴素抗性基因及ColdDF複製源之DNA片段。此等係藉由QIAquick PCR純化套組(Qiagen)純化且使用In-Fusion選殖套組(Takara Bio Inc.)連接。使用反應產物，根據習知方法轉化大腸桿菌DH5 α (由TOYOBO CO., LTD.製造)且在含有50微克/毫升鏈黴素之LB瓊脂培養基上培養，並選擇經轉化菌株。在藉由菌落PCR選擇目標純系之後，將經轉化菌株接種至含有50微克/毫升鏈黴素之LB培養基中且培養隔夜，且藉此使用QIAprep Spin Miniprep套組(Qiagen)由所獲得培養液來製備質體。核苷酸序列分析證實，質體具有其中來源於pKD46之約1.2 kb AraC-ParaB DNA片段及來源於BL21 (DE3)之約2.0 kb之GroES-GroEL DNA片段插入至pCDF-Duet1中的結構。將質體命名為pGro (Sm)。實例 5

表現C5-表異構酶、2OST、6OST -3及3OST-1之大腸桿菌之構築根據描述於文獻[Biochemical and Biophysical Research Communications 第339卷，第2期，2006年1月13日，第597-602頁]中之方法將人類C5-表異構酶(E53-N609)之催化域區域選殖中pMAL-C2X載體(New England Biolabs)中以構築MBP-C5。將MBP-C5轉化為Origami-B (DE3) (Novagen)以及pGro7 (Takara Bio Inc.)，且藉此構築表現C5-表異構酶之大腸桿菌之Origami-B (DE3)/MBP-C5_pGro7菌株。

SEQ ID NO: 19展示來源於中國倉鼠且經密碼子最佳化以在大腸桿菌中表現的2-O-磺基轉移酶同功異型物1之催化域(R51-N356)之核苷酸序列。使用上文所描述之人工合成序列作為模板及SEQ ID NO: 20及21之引子來執行PCR。藉由接合非依賴型選殖方法[Methods Mol Biol. 2009; 498: 105-115]將此PCR片段選殖至pET-His6-MBP-TEV-LIC (Addgene)中，以構築H-MBP-2OST。藉由pGro (Sm)將H-MBP-2OST轉化為Origami-B (DE3)(Novagen)，且藉此構築表現2OST之大腸桿菌之Origami-B (DE3)/H-MBP-2OST_pGro (Sm)菌株。

藉由描述於文獻[Chemistry & Biology 第14卷，第9期，2007年9月21日，第986-993頁]中之方法將來源於小鼠之6-O-磺基轉移酶同功異型物3之催化域(P120-L424)選殖至pMAL-C2X載體(New England Biolabs)中，以構築MBP-6OST3。將MBP-6OST3轉化為Origami-B (DE3) (Novagen)以及pGro7 (Takara Bio Inc.)，且藉此構築表現6OST-3之大腸桿菌之Origami-B (DE3)/MBP-6OST3_pGro7菌株。

藉由描述於文獻[J Biol Chem.2004年6月11日; 279 (24): 25789-97]中之方法將來源於小鼠之3-O磺基轉移酶之催化域(G48-H311)選殖至pET28a載體(Novagen)中，以構築HIS-3OST1。將HIS-3OST1轉化為BL21-CodonPlus (DE3)-RIL (Agilent Technologies)以及pGro (Sm)，且藉此構築表現3OST1之大腸桿菌之RIL/HIS-3OST1_pGro(Sm)菌株。實例 6

N-磺基肝素前體及2-O-硫酸化N-磺基肝素前體之製備。根據描述於專利文獻[WO2018/048973 A1]中之方法藉由使用大腸桿菌K5菌株或Nissle菌株進行醱酵來製造肝素前體。根據文獻，所獲得肝素前體經化學去乙醯化及解聚合，且接著經化學N-硫酸化。此後，藉由乙醇沈澱執行分餾，以獲得N-磺基肝素前體。使所獲得N-磺基肝素前體藉由根據相同文獻之酶反應經受糖醛酸殘基中C5位置之表異構化及2-O位置之硫酸化，且接著藉由乙醇沈澱經受分餾，且藉此獲得2-O-硫酸化N-磺基肝素前體。實例 7

ATCC 6872 (DE3)/pSC-3-13之培養將實例3中獲得之ATCC 6872 (DE3)/pSC-3-13菌株接種於含有50微克/毫升康微素之BY-Glucose瓊脂培養基[在1 L水中含有10 g葡萄糖、20 g普通肉湯培養基(由Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.製造)、5 g酵母提取物(由Difco製造)及20 g細菌瓊脂(由Difco製造)的培養基]上且在30℃下培養隔夜。

將兩個盤之細菌細胞接種至含350 ml初級種子培養基[含有葡萄糖50 g/L、高聚蛋白腖(High Polypeptone) (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) 10g/L、酵母提取物(Asahi) 10 g/L、KH₂ PO₄ 1 g/L、K₂ HPO₄ 1 g/L、(NH₄ )₂ SO₄ 0.5 g/L、脲0.5 g/L、L-胱胺酸0.03 g/L、MgSO₄ -7H₂ O 1 g/L、CaCl₂ -2H₂ O 0.1 g/L、ZnSO₄ -7H₂ O 0.01 g/L、FeSO₄ -7H₂ O 0.01 g/L、MnSO₄ -5H₂ O 0.02 g/L、D-泛酸鈣0.01 g/L、生物素40微克/公升、鹽酸噻胺0.005 g/L及菸鹼酸0.005 g/L，其藉由氫氧化鈉將pH調節至pH 7.2，且在使用高壓釜在122℃下滅菌20分鐘之後向其中單獨添加L-半胱胺酸0.1 g/L、硫代硫酸鈉1 g/L及康微素0.1 g/L的培養基]之2 L錐形瓶中，且在30℃下在220 rpm之攪拌速度下培養24小時。

向含1700 ml次級種子培養基[含有葡萄糖100 g/L、果糖4 g/L、酵母提取物(由Asahi製造) 10 g/L、KH₂ PO₄ 1.25 g/L、K₂ HPO₄ 1 g/L、麩胺酸鈉單水合物2.1 g/L、L-胱胺酸0.02 g/L、MgSO₄ -7H₂ O 1.25 g/L、CaCl₂ -2H₂ O 0.1 g/L、CuSO₄ -5H₂ O 0.002 g/L、ZnSO₄ -7H₂ O 0.01 g/L、FeSO₄ -7H₂ O 0.02 g/L、MnSO₄ -5H₂ O 0.02 g/L、D-泛酸鈣0.015 g/L、生物素40微克/公升、菸鹼酸0.005 g/L及ADEKA NOL LG-109 (由ADEKA製造) 1 ml/L，藉由氫氧化鈉將pH調節至7.2，在單獨添加脲3.2 g/L之後在122℃下在高壓釜中滅菌20分鐘且向其中單獨添加鹽酸噻胺0.1 g/L、L-半胱胺酸0.3 g/L、硫代硫酸鈉2.5 g/L及康微素0.2 g/L的培養基]之6 L培養槽中接種300 ml上文培養溶液且在30℃、650 rpm之攪拌速度以及2 L/min之充氣速率的培養條件下培養24小時，同時用18%氨水將其pH調節至6.8。

向含1700 ml主培養基[含有KH₂ PO₄ 10 g/L、K₂ HPO₄ 10 g/L、麩胺酸鈉單水合物1 g/L、L-胱胺酸0.02 g/L、CaCl₂ -2H₂ O 0.1 g/L、CuSO₄ -5H₂ O 0.005 g/L、ZnSO₄ -7H₂ O 0.01 g/L、FeSO₄ -7H₂ O 0.02 g/L、生物素150微克/公升、菸鹼酸0.005 g/L、脲2 g/L及ADEKA NOL LG-109 (由ADEKA製造) 1 ml/L，且在高壓釜中在122℃下滅菌20分鐘之後向其中單獨添加葡萄糖125g/L、果糖25 g/L、MgSO₄ -7H₂ O 10 g/L、MnSO₄ -5H₂ O 0.02 g/L、D-泛酸鈣0.015 g/L、鹽酸噻胺0.005 g/L、L-半胱胺酸0.15 g/L、硫代硫酸鈉2.5 g/L及康微素0.2 g/L的培養基]之6 L培養槽中接種300 ml上文培養溶液且在30℃及2 L/min之充氣速率的培養條件下培養25小時，同時調節650 rpm與900 rpm之間的攪拌速度以使得已溶解之氧量不會降至低於1 ppm，且同時用18%氨水將其pH調節至6.8。

在此時段期間，添加IPTG以使得自培養開始6小時之後最終濃度變成1 mM，且自培養開始10小時之後進一步添加生物素100微克/公升、菸鹼酸0.015 g/L、D-泛酸鈣0.015 g/L及鹽酸噻胺0.005 g/L。完成培養之後，藉由離心機將培養溶液分成細菌細胞及培養上清液，且藉此獲得呈濕細菌細胞形式之集結粒且在-80℃下冷凍。實例 8

Origami-B (DE3)/MBP-C5_pGro7、Origami-B (DE3)/H-MBP-2OST_pGro (Sm)、Origami-B (DE3)/MBP-6OST3_pGro7及RIL/HIS-3OST1_pGro (Sm)之培養將實例5中獲得之Origami-B (DE3)/MBP-C5_pGro7菌株接種至含有5 mL TB培養基之大試管中，該TB培養基含有50微克/毫升安比西林(ampicillin)、20微克/毫升氯胺苯醇、15微克/毫升四環素及15微克/毫升康微素，且在30℃下培養16小時。將1.2%培養溶液接種至含有500 mL TB培養基之具有擋板的錐形瓶中，該TB培養基含有50微克/毫升安比西林、20微克/毫升氯胺苯醇、15微克/毫升四環素及15微克/毫升康微素，且在37℃下搖晃培養6小時。此後，向其中添加最終濃度為1 mM之IPTG及最終濃度為4 mM之阿拉伯糖，且在28℃下執行培養20小時。此後，將培養溶液離心，且藉此獲得呈濕細菌細胞形式之集結粒且在-80℃下冷凍。

將實例5中獲得之Origami-B(DE3)/H-MBP-2OST_pGro(Sm)菌株接種至含有5 mL TB培養基之大試管中，該TB培養基含有50微克/毫升安比西林、50微克/毫升鏈黴素、15微克/毫升四環素及15微克/毫升康微素，且在30℃下培養16小時。將1.2%培養溶液接種至含有500 mL TB培養基之具有擋板的錐形瓶中，該TB培養基含有50微克/毫升安比西林、50微克/毫升鏈黴素、15微克/毫升四環素及15微克/毫升康微素，且在30℃下搖晃培養12小時。此後，向其中添加最終濃度為1 mM之IPTG及最終濃度為4 mM之阿拉伯糖，且在28℃下執行培養20小時。此後，將培養溶液離心，且藉此獲得呈濕細菌細胞形式之集結粒且在-80℃下冷凍。

將實例5中獲得之Origami-B(DE3)/MBP-6OST3_pGro7菌株接種至含有5 mL TB培養基之大試管中，該TB培養基含有50微克/毫升安比西林、20微克/毫升氯胺苯醇、15微克/毫升四環素及15微克/毫升康微素，且在30℃下培養16小時。將1.2%培養溶液接種至含有500 mL TB培養基之具有擋板的錐形瓶中，該TB培養基含有50微克/毫升安比西林、20微克/毫升氯胺苯醇、15微克/毫升四環素及15微克/毫升康微素，且在37℃下搖晃培養4小時。此後，向其中添加最終濃度為1 mM之IPTG及最終濃度為4 mM之阿拉伯糖，且在28℃下執行培養20小時。此後，將培養溶液離心，且藉此獲得呈濕細菌細胞形式之集結粒且在-80℃下冷凍。

將實例5中獲得之RIL/HIS-3OST1_pGro(Sm)菌株接種至含有5 mL TB培養基之大試管中，該TB培養基含有50微克/毫升鏈黴素、15微克/毫升康微素，且在30℃下培養16小時。將1.2%培養溶液接種至含有500 mL TB培養基之具有擋板的錐形瓶中，該TB培養基含有50微克/毫升鏈黴素及15微克/毫升康微素，且在37℃下搖晃培養4小時。此後，向其中添加最終濃度為1 mM之IPTG及最終濃度為4 mM之阿拉伯糖，且在28℃下執行培養20小時。此後，將培養溶液離心，且藉此獲得呈濕細菌細胞形式之集結粒且在-80℃下冷凍。實例 9

使用ATCC 6872 (DE3)/pSC-3-13、Origami-B (DE3)/MBP-C5_pGro7及Origami-B (DE3)/H-MBP-2OST_pGro (Sm)之針對N-磺基肝素前體之2-O位置處之硫酸化反應的測試將實例7及8中獲得之ATCC 6872 (DE3)/pSC-3-13、Origami-B (DE3)/MBP-C5_pGro7及Origami-B (DE3)/H-MBP-2OST_pGro (Sm)之冷凍細菌細胞中之每一者懸浮於蒸餾水中，使得冷凍細菌細胞之重量變成333 g/L以製備細菌細胞懸浮液。將因此獲得之30 ml ATCC 6872 (DE3)/pSC-3-13細菌細胞懸浮液、6 ml Origami-B (DE3)/MBP-C5_pGro7細菌細胞懸浮液及6 mL Origami-B (DE3)/H- MBP-2OST_pGro (Sm)細菌細胞懸浮液添加至含18 ml反應溶液[含有葡萄糖60 g/L、KH₂ PO₄ 8.75 g/L、K₂ HPO₄ 15 g/L、MgSO₄ -7H₂ O 20 g/L、D-泛酸鈣0.3 g/L、菸鹼酸0.2 g/L、腺嘌呤4.05 g/L、氯化苯甲烴銨1.25 g/L、ADEKA NOL LG-109 (由ADEKA製造) 1 ml/L及N-磺基肝素前體1 g/L (製造於實例6中)的水溶液]之250 ml生物反應器中，且在37℃、500 rpm之攪拌速度及0.75 mL/min之充氣速率的培養條件下反應22小時，同時用2.8%氨水溶液將其pH調節至6.5。在此時段期間，在反應開始之後6小時進一步添加葡萄糖60 g/L、MgSO₄ -7H₂ O 5.0 g/L及腺嘌呤2.7 g/L。

適當地在反應期間執行取樣以獲得反應溶液。將所獲得反應溶液適當地稀釋且接著離心，使用由Shimadzu Corporation製造之HPLC藉由用UV偵測器量測254 nm處之吸收度來偵測且定量PAPS。結果展示於圖4中。另外，根據專利文獻[WO2018/048973 A1]執行藉由酶消化進行之不飽和雙醣之產生及藉由HPLC進行之分析。

亦即，將所獲得反應溶液離心，且將所得上清液加熱且維持處於80℃持續10分鐘，以使蛋白質變性。將蛋白質變性之後的溶液離心，且使用3 k分子量過濾裝置(由Merck製造)藉由超過濾將所得上清液去鹽。將脫鹽後之溶液供應至含有0.5 U/ml各肝素酶I、II及III (由Sigma製造，但亦可使用其他肝素酶)之肝素酶反應溶液[由50 mM乙酸銨及2 mM氯化鈣構成]，且使其在35℃下經受酶消化，持續2小時。藉由在酶消化之後將溶液維持處於95℃持續15分鐘，使肝素酶失活。

藉由使用Shimadzu HPLC及強陰離子交換管柱(spherisorb-SAX層析管柱，4.0 × 250 mm，5微米，由Waters製造)在肝素酶去活化之後使溶液經受移動相A [含有1.8 mM磷酸二氫鈉且用磷酸將pH調節至pH 3.0的水溶液]及移動相B [含有1.8 mM磷酸二氫鈉及1 M過氯酸鈉且用磷酸將pH調節至pH 3.0的水溶液]之梯度溶離模式分析來執行不飽和雙醣分析。

藉由用UV偵測器量測232 nm處之吸收度來偵測不飽和雙醣。藉由與不飽和雙醣標準試劑(由Iduron製造)比較來檢查δ-UA-GlcNS及δ-UA、2S-GlcNS之滯留時間。藉由獲得δ-UA、2S-GlcNS相對於所偵測之δ-UA-GlcNS及δ-UA、2S-GlcNS之總面積的面積比率來檢查2-O-硫酸化。結果展示於圖5中。實例 10

使用ATCC 6872 (DE3)/pSC-3-13及Origami-B (DE3)/MBP-6OST3_pGro7之針對2-O-硫酸化N-磺基肝素前體之6-O位置處之硫酸化反應的測試將實例7及8中獲得之ATCC 6872(DE3)/pSC-3-13及Origami-B(DE3)/MBP-6OST3_pGro7之冷凍細菌細胞中之每一者懸浮於蒸餾水中，使得冷凍細菌細胞之重量變成333 g/L以製備細菌細胞懸浮液。將因此獲得之30 ml ATCC 6872 (DE3)/pSC-3-13細菌細胞懸浮液及6 ml Origami-B(DE3)/MBP-6OST3_pGro7細菌細胞懸浮液以及6 ml蒸餾水添加至含18 ml反應溶液[含有葡萄糖60 g/L、KH₂ PO₄ 8.75 g/L、K₂ HPO₄ 15 g/L、MgSO₄ -7H₂ O 20 g/L、D-泛酸鈣0.3 g/L、菸鹼酸0.2 g/L、腺嘌呤4.05 g/L、氯化苯甲烴銨1.25 g/L、ADEKA NOL LG-109 (由ADEKA製造) 1 ml/L及2-O-硫酸化N-磺基肝素前體0.5 g/L (製造於實例6中)的水溶液]之250 ml生物反應器中，且在32℃、500 rpm之攪拌速度及0.75 mL/min之充氣速率的培養條件下反應22小時，同時用2N氫氧化鉀水溶液將其pH調節至7.4。

在此時段期間，在反應開始之後6小時進一步添加葡萄糖60 g/L、MgSO₄ -7H₂ O 5.0 g/L及腺嘌呤2.7 g/L。適當地在反應期間執行取樣以獲得反應溶液。使用與實例9中相同的方法來執行PAPS之偵測及定量。結果展示於圖6中。

另外，藉由與實例9中相同的方法來分析反應之後糖鏈中所含有之硫酸化組合物。藉由與不飽和雙醣標準試劑(由Iduron製造)比較來檢查δ-UA、2S-GlcNS及δ-UA、2S-GlcN、6S之滯留時間。藉由獲得δ-UA、2S-GlcN、6S相對於所偵測之δ-UA、2S-GlcNS及δ-UA、2S-GlcN、6S之總面積的面積比率來檢查6-O-硫酸化。結果展示於圖7中。實例 11

使用ATCC 6872 (DE3)/pSC-3-13、Origami-B (DE3)/MBP-6OST3_pGro7及RIL/HIS-3OST1_pGro (Sm)之針對2-O-硫酸化N-磺基肝素前體之6-O位置及3-O位置處之硫酸化反應的測試在描述於實例10中之條件進行反應，持續22小時。在此時段期間，在反應開始之後3小時，使實例8中獲得之IL/HIS-3OST1_pGro(Sm)之冷凍細菌細胞懸浮於蒸餾水中，使得冷凍細菌細胞之重量變為333 g/L，且添加6 ml所製備之細菌細胞懸浮液。適當地在反應期間執行取樣以獲得反應溶液。使用與實例9中相同之方法，執行PAPS之偵測及定量。結果展示於圖8中。

反應完成後，使反應溶液離心，適當地稀釋所得上清液，且此後使用BIOPHEN(商標) ANTI IIa量測套組(由Hyphen Biomed製造)量測抗IIa活性，以檢查3-O-硫酸化。另外，亦量測實例10之反應之後溶液之抗IIa活性作為未添加RIL/HIS-3OST1_pGro (Sm)之陰性對照。使用BIOPHENN(商標) UFH校準器(由Hyphen Biomed製造)產生校準曲線。結果展示於表1中。

[表1] 表1.抗IIa活性之測量

添加RIL/HIS- 3OSTl_pGro (Sm)	抗IIa活性(IU/ml-上清液)
已添加	375
未添加	-36

實例 12

使實例7中獲得之ATCC 6872(DE3)/pSC-3-13之冷凍細菌細胞懸浮於蒸餾水中，使得冷凍細菌細胞之重量變為333 g/L以製備細菌細胞懸浮液。將因此獲得之30 ml細菌細胞懸浮液添加至含30 ml反應溶液[含有葡萄糖60 g/L、KH₂ PO₄ 8.75 g/L、K₂ HPO₄ 15 g/L、MgSO₄ -7H₂ O 20 g/L、D-泛酸鈣0.3 g/L、菸鹼酸0.2 g/L、腺嘌呤4.05 g/L、氯化苯甲烴銨0.625 g/L、ADEKA NOL LG-109 (由ADEKA製造) 1 ml/L的水溶液]之250 ml生物反應器中，且在32℃、500 rpm之攪拌速度及0.75 mL/min之充氣速率的培養條件下反應22小時，同時用2N氫氧化鉀水溶液將其pH調節至7.4。

在此時段期間，在反應開始之後6小時，進一步添加葡萄糖60 g/L、KH₂ PO₄ 2.19 g/L、K₂ HPO₄ 3.75 g/L、MgSO₄ -7H₂ O 5.0 g/L及腺嘌呤2.7 g/L。適當地在反應期間執行取樣以獲得反應溶液。

將所獲得反應溶液適當地稀釋且接著離心，使用由Shimadzu Corporation製造之HPLC藉由用UV偵測器量測254 nm處之吸收度來偵測且定量PAPS。結果展示於圖9中。

如上文所描述，將能夠製造且再生PAPS之棒狀桿菌屬細菌及表現硫酸化酶之屬於原核生物之微生物添加至原材料(諸如葡萄糖、腺嘌呤及硫酸鎂)且與其反應，且藉此由多醣高效地製造硫酸化多醣。

雖然已參考本發明之特定實施例詳細描述本發明，但是對熟習此項技術者而言，在不偏離本發明之精神及範疇的情況下，可對其作出各種改變及修改。本文中所引用之所有參考文獻以全文併入本文中。本申請案係基於2020年4月3日申請的國際申請案第PCT/JP2020/015388號，其全部內容以引用之方式併入其中。

[圖1]圖1展示大腸桿菌K5菌株之染色體上的肝素前體合成基因簇之示意圖。 [圖2]圖2展示參與肝素前體製造之酶之示意圖。 [圖3]圖3展示肝素前體生物合成路徑之示意圖。 [圖4]圖4為展示在N-磺基肝素前體之2-O-硫酸化反應測試中反應溶液之上清液中所含有的PAPS之濃度之時間依賴性變化的圖式。 [圖5]圖5為展示在N-磺基肝素前體之2-O-硫酸化反應測試中不飽和雙醣HPLC分析中δ-UA、2S-GlcNS之面積比之時間依賴性變化的圖式。 [圖6]圖6為展示在2-O-硫酸化N-磺基肝素前體之6-O-硫酸化反應測試中反應溶液之上清液中所含有的PAPS之濃度之時間依賴性變化的圖式。 [圖7]圖7為展示在2-O-硫酸化N-磺基肝素前體之6-O-硫酸化反應測試中不飽和雙醣HPLC分析中δ-UA、2S-GlcNS、6S之面積比之時間依賴性變化的圖式。 [圖8]圖8為展示在2-O-硫酸化N-磺基肝素前體之6-O-位置及3-O-位置硫酸化反應測試中反應溶液之上清液中所含有的PAPS之濃度之時間依賴性變化的圖式。 [圖9]圖9為展示在PAPS製造測試中反應溶液之上清液中所含有的PAPS之濃度之時間依賴性變化的圖式。

Claims

一種硫酸化多醣之製造方法，該方法包含以下步驟(1-1)及(1-2)： (1-1)製備棒狀桿菌屬(the genus Corynebacterium)細菌之轉化體(a)或該轉化體(a)之處理物，該轉化體(a)至少包含以可表現方式引入其中的編碼ATP硫酸化酶之基因及編碼APS激酶之基因；及 (1-2)藉由使用含有ATP或ATP源、硫酸根離子源及該轉化體(a)或其處理物之反應溶液來進行用於製造PAPS之反應。
如請求項1之硫酸化多醣之製造方法，該方法進一步包含以下步驟(2-1)及(2-2)： (2-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(b)或該轉化體(b)之處理物或提取物，該轉化體(b)至少包含以可表現方式引入其中的編碼C5-表異構酶之基因；及 (2-2)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將該轉化體(b)或該其處理物或提取物併入該反應溶液中來進行C5-表異構化。
如請求項1或2之硫酸化多醣之製造方法，其包含藉由包含以可表現方式引入其中的編碼磺基轉移酶之基因的轉化體或該轉化體之處理物或提取物進行硫酸化。
如請求項3之硫酸化多醣之製造方法，該方法進一步包含以下步驟(3-1)及(3-2)： (3-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(c)或該轉化體(c)之處理物或提取物，該轉化體(c)至少包含以可表現方式引入其中的編碼2-O-磺基轉移酶之基因；及 (3-2)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將該轉化體(c)或該其處理物或提取物併入該反應溶液中來進行2-O-硫酸化。
如請求項3或4之硫酸化多醣之製造方法，該方法進一步包含以下步驟(3'-1)至(3'-3)： (3'-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(b)或該轉化體(b)之處理物或提取物，該轉化體(b)至少包含以可表現方式引入其中的編碼C5-表異構酶之基因； (3'-2)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(c)或該轉化體(c)之處理物或提取物，該轉化體(c)至少包含以可表現方式引入其中的編碼2-O-磺基轉移酶之基因；及 (3'-3)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將該轉化體(b)或該其處理物或提取物及該轉化體(c)或該其處理物或提取物併入該反應溶液中來進行C5-表異構化及2-O-硫酸化。
如請求項3至5中任一項之硫酸化多醣之製造方法，該方法進一步包含以下步驟(4-1)及(4-2)： (4-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(d)或該轉化體(d)之處理物或提取物，該轉化體(d)至少包含以可表現方式引入其中的編碼6-O-磺基轉移酶之基因；及 (4-2)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將該轉化體(d)或該其處理物或提取物併入該反應溶液中來進行6-O-硫酸化。
如請求項3至6中任一項之硫酸化多醣之製造方法，該方法進一步包含以下步驟(5-1)及(5-2)： (5-1)製備屬於原核生物之微生物之轉化體(e)或該轉化體(e)之處理物或提取物，該轉化體(e)至少包含以可表現方式引入其中的編碼3-O-磺基轉移酶之基因；及 (5-2)在N-磺基肝素前體之存在下，藉由將該轉化體(e)或該其處理物或提取物併入該反應溶液中來進行3-O-硫酸化。
一種硫酸化多醣之製造方法，該方法包含藉由在ATP或ATP源、硫酸根離子源及N-磺基肝素前體之存在下，將以下物質併入反應溶液中來產生硫酸化多醣，棒狀桿菌屬細菌之轉化體(a)或該轉化體(a)之處理物，該轉化體(a)至少包含以可表現方式引入其中的編碼ATP硫酸化酶之基因及編碼APS激酶之基因，及選自以下之至少一者：屬於原核生物之微生物之轉化體(b)或該轉化體(b)之處理物或提取物，該轉化體(b)至少包含以可表現方式引入其中的編碼C5-表異構酶之基因，屬於原核生物之微生物之轉化體(c)或該轉化體(c)之處理物或提取物，該轉化體(c)至少包含以可表現方式引入其中的編碼2-O-磺基轉移酶之基因，屬於原核生物之微生物之轉化體(d)或該轉化體(d)之處理物或提取物，該轉化體(d)至少包含以可表現方式引入其中的編碼6-O-磺基轉移酶之基因，及屬於原核生物之微生物之轉化體(e)或該轉化體(e)之處理物或提取物，該轉化體(e)至少包含以可表現方式引入其中的編碼3-O-磺基轉移酶之基因。
如請求項8之硫酸化多醣之製造方法，該方法進一步包含在ATP或ATP源、硫酸根離子源及N-磺基肝素前體之存在下，將該轉化體(a)或該其處理物及該等轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物併入該反應溶液中來產生硫酸化多醣。
如請求項1至9中任一項之硫酸化多醣之製造方法，其用於製造肝素。
一種PAPS之製造方法，該方法包含以下步驟(i)及(ii)： (i)製備棒狀桿菌屬細菌之轉化體或該轉化體之處理物，該轉化體至少包含以可表現方式引入其中的編碼ATP硫酸化酶之基因及編碼APS激酶之基因；及 (ii)藉由使用含有ATP或ATP源、硫酸根離子源及步驟(i)中製備之該轉化體或該其處理物之反應溶液來進行用於製造PAPS之反應。