JP2023515250A - 硫酸化多糖の製造方法及びpapsの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)ATP生産能を有するコリネバクテリウム属細菌を宿主に組換えDNA手法によりATPスルフリラーゼ、APSキナーゼの活性の強化を行った菌株を培養した後、界面活性剤等で膜透過性を付与し、グルコース、アデニン等の原料を添加することにより、従来の方法と比較して安価、簡便にPAPSを製造できる。
(2)(1)に記載のATPスルフリラーゼ、APSキナーゼの活性の強化を行った菌株をPAPSの生産/再生反応を担う微生物菌体として用い、エピメラーゼ及び/又は硫酸化酵素を発現する原核生物に属する微生物に膜透過性を付与して混合反応を行うことで、酵素の精製やPAPSを添加することなく、菌体と硫酸マグネシウムなど安価原料を用いて硫酸化多糖を生産できる。
1.以下の工程(1-1)及び(1-2)を含む、硫酸化多糖の製造方法。
(1-1)コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたATPスルフリラーゼをコードする遺伝子及びAPSキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(a)又はその処理物を用意する工程
(1-2)ATP又はATP源、硫酸イオン源及び前記形質転換体(a)又はその処理物を含む反応液を用いて、PAPSの生産反応を行う工程
2.さらに工程(2-1)及び(2-2)を含む、前記1に記載の硫酸化多糖の製造方法。
(2-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたC5-エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(2-2)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、C5-エピマー化をする工程
3.発現可能に導入された硫酸転移酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体又はその処理物若しくは抽出物により硫酸化をする工程を含む、請求項1又は2に記載の硫酸化多糖の製造方法。
4.さらに工程(3-1)及び(3-2)を含む前記3に記載の硫酸化多糖の製造方法。
(3-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入された2-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(3-2)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、2-O-硫酸化をする工程
5.さらに工程(3´-1)~(3´-3)を含む、前記3又は4のいずれか1に記載の硫酸化多糖の製造方法。
(3´-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたC5-エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(3´-2)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入された2-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(3´-3)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物および前記形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、C5-エピマー化及び2-O-硫酸化をする工程
6.さらに工程(4-1)及び(4-2)を含む、前記3~5のいずれか1に記載の硫酸化多糖の製造方法。
(4-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された6-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(d)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(4-2)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(d)又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、6-O-硫酸化をする工程
7.さらに工程(5-1)及び(5-2)を含む前記3~6のいずれか1に記載の硫酸化多糖の製造方法。
(5-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された3-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(e)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(5-2)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(e)又はその処理物若しくは抽出物を反応液に含有させて、3-O-硫酸化をする工程
8.ATP又はATP源、硫酸イオン源及びN-スルフォヘパロサンの存在下、
コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたATPスルフリラーゼをコードする遺伝子及びAPSキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(a)又はその処理物と、
原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたC5-エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物、
原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された2-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物、
原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された6-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(d)又はその処理物若しくは抽出物および
原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された3-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(e)又はその処理物若しくは抽出物から選ばれる少なくとも1と、を反応液に含有させて硫酸化多糖を生成する、硫酸化多糖の製造方法。
9.ATP又はATP源、硫酸イオン源及びN-スルフォヘパロサンの存在下、
前記形質転換体(a)又はその処理物と、前記形質転換体(b)~(e)又はそれらの処理物若しくは抽出物とを反応液に含有させて硫酸化多糖を生成する、前記8に記載の硫酸化多糖の製造方法。
10.ヘパリンを製造する方法である、前記1~9のいずれか1に記載の硫酸化多糖の製造方法。
11.以下の工程(i)及び(ii)を含む、PAPSの製造方法。
(i)コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたATPスルフリラーゼをコードする遺伝子及びAPSキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体又はその処理物を用意する工程
(ii)ATP又はATP源、硫酸イオン源及び工程(i)で用意した前記形質転換体又はその処理物を含む反応液を用いてPAPSの生産反応を行う工程
本発明の硫酸化多糖の製造方法は、1)PAPSの供給/再生を、菌体を用いた反応により行うことを特徴とする。本発明の方法は、2)C5-エピマー化、3)2-O-硫酸化、4)6-O-硫酸化及び5)3-O-硫酸化の少なくとも1を、菌体を用いた反応により行うことが好ましい。以下各反応に用いる形質転換体(a)~(e)について説明する。
本発明の硫酸化多糖の製造方法において、PAPSの供給/再生は、コリネバクテリウム属に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたATPスルフリラーゼをコードする遺伝子及びAPSキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(a)又はその処理物により行う。
本発明の硫酸化多糖の製造方法において、N-スルフォヘパロサンのC5-エピマー化は、原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたC5-エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物により行う。
本発明の硫酸化多糖の製造方法において、2-O-硫酸化は、原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入された2-O-スルホトランスフェラーゼ(2-OST)をコードする遺伝子を含む形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物により行う。
本発明の硫酸化多糖の製造方法において、6-O-硫酸化は、原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された6-O-スルホトランスフェラーゼ(6-OST)をコードする遺伝子を含む形質転換体(d)又はその処理物若しくは抽出物により行う。
本発明の硫酸化多糖の製造方法において、3-O-硫酸化は、原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された3-O-スルホトランスフェラーゼ(3-OST)をコードする遺伝子を含む形質転換体(e)又はその処理物若しくは抽出物により行う。
本発明において形質転換体の宿主として用いる原核生物に属する微生物としては、本発明所定の遺伝子を発現できるものであれば特に制限されないが、例えば、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属に属する微生物などの細菌が挙げられ、エシェリヒア属細菌が好ましく用いられる。
本発明における形質転換体の処理物とは、菌体の細胞形質膜が物質透過性であるものをいう。本発明において、細胞形質膜が物質透過性であるとは、小型(イオン等)、大型(タンパク質等)の種々の分子が細胞膜を拡散により通過して自由に出入りさせることができることをいう。本発明における形質転換体の処理物は、膜透過性付与のための処理により増殖能を失った休止菌体であることが好ましい。
本発明における形質転換体の抽出物としては、例えば、形質転換体である菌体から得られる粗酵素抽出物、上記処理(例えば、化学的処理又は機械的処理)した菌体から得られる精製酵素、上記した形質転換体又はその処理物を培養した培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物が挙げられる。また、形質転換体の抽出物としては、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物も包含される。
形質転換方法は、公知の方法を制限なく使用できる。このような公知の方法として、例えば、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、電気パルス法などが挙げられる。なかでも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は公知の方法により行うことができる[Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54: 443-447 (1990)]。
本発明の硫酸化多糖の製造方法の一態様は、ATP又はATP源、硫酸イオン源及びN-スルフォヘパロサンの存在下、上記形質転換体(a)又はその処理物と、上記形質転換体(b)~(e)又はそれらの処理物若しくは抽出物から選ばれる少なくとも1とを反応液に含有させて硫酸化多糖を生成する、硫酸化多糖の製造方法である。
本発明の硫酸化多糖の製造方法は、以下の工程(1-1)及び(1-2)を含むことを特徴とする。
(1-1)コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたATPスルフリラーゼをコードする遺伝子及びAPSキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(a)又はその処理物を用意する工程
(1-2)ATP又はATP源、硫酸イオン源、前記形質転換体(a)又はその処理物を含む反応液を用いて、PAPSの生産反応を行う工程
本発明の硫酸化多糖の製造方法は、以下の工程(2-1)及び(2-2)を含むことが好ましい。
(2-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたC5-エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(2-2)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物を反応液に含有させて、C5-エピマー化をする工程
本発明の硫酸化多糖の製造方法は、以下の工程(3-1)及び(3-2)を含むことが好ましい。
(3-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入された2-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(3-2)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物を反応液に含有させて、2-O-硫酸化をする工程
また、反応液中に工程(2-2)で生産された硫酸化多糖が存在する場合には、当該工程で生産された硫酸化多糖の2-O-硫酸化が行われる。
例えば、C5-エピマー化されたN-スルフォヘパロサンが存在する場合には、C5-エピマー化されたN-スルフォヘパロサンの2-O-硫酸化が行われる。
(3´-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたC5-エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(3´-2)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入された2-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(3´-3)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物および前記形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、C5-エピマー化及び2-O-硫酸化をする工程
本発明の硫酸化多糖の製造方法は、以下の工程(4-1)及び(4-2)を含むことが好ましい。
(4-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された6-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(d)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(4-2)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(d)又はその処理物若しくは抽出物を反応液に含有させて、6-O-硫酸化をする工程
本発明の硫酸化多糖の製造方法は、以下の工程(5-1)及び(5-2)を含むことが好ましい。
(5-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された3-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(e)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(5-2)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(e)又はその処理物若しくは抽出物を反応液に含有させて、3-O-硫酸化をする工程
上記した1)PAPSの供給/再生、2)C5-エピマー化、3)2-O-硫酸化、4)6-O-硫酸化及び5)3-O-硫酸化の反応条件について以下説明する。
上記のようにして培養することにより、反応液中に硫酸化多糖が生産される。反応液を回収することにより硫酸化多糖を回収できるが、さらに、公知の方法で硫酸化多糖を反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、例えば、蒸留法、膜透過法、有機溶媒抽出法等が挙げられる。
本発明の硫酸化多糖の製造方法に用いるN-スルフォヘパロサンは、ヘパロサンが脱アセチル化、脱ポリマー化及びN-硫酸化されたものである。ヘパロサンの製造及びヘパロサンからN-スルフォヘパロサンの製造は公知の方法(例えば、国際公開第2018/048973号)により行うことができる。
(a1)kpsS遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
前記原核生物に属する微生物は、前記(a1)に加えて、さらに以下の(a2)及び(a3)の少なくとも一方の遺伝子改変を有していてもよい。
(a2)kfiA、kfiB、kfiC及びkfiD遺伝子から選択される少なくとも1の遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
(a3)yhbJ遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変
「遺伝子の発現の増大」とは、非改変株と比較して該遺伝子の発現が上昇することをいう。遺伝子の発現の増大の一態様としては、例えば、非改変株と比較して、該遺伝子の発現が好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上に上昇していることが挙げられる。
上記した(a3)のyhbJ遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変としては、宿主である原核生物に属する微生物のゲノムDNAのうちyhbJに相当する部分をコードするDNAに改変を加えることにより、yhbJに相当する部分がコードするタンパク質の機能を低減若しくは完全に停止させることが挙げられる。
(I)yhbJに相当する部分をコードするDNAの全部または一部を除去する。
(II)yhbJに相当する部分をコードするDNAに、1または数個の置換、欠失もしくは付加する。
(III)yhbJに相当する部分をコードするDNAを、改変前のDNA配列との同一性が80%未満であるDNA配列と置き換える。
本発明のPAPSの製造方法は、ATP源、硫酸イオン源、上記した形質転換体(a)又はその処理物を含む反応液に含有させて、PAPSの生産反応を行うことを特徴とする。すなわち、本発明のPAPSの製造方法は、下の工程(i)及び(ii)を含む。
(i)コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入されたATPスルフリラーゼをコードする遺伝子及びAPSキナーゼをコードする遺伝子を含み、かつ細胞形質膜が物質透過性である形質転換体又はその処理物を用意する工程
(ii)ATP源、硫酸イオン源及び工程(i)で用意した前記形質転換体又はその処理物を含む反応液を用いてPAPSの生産反応を行う工程
Corynebacterium ammoniagenes野生株ATCC 6872の染色体上のgltD-purT間にT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含むλDE3を挿入するためのプラスミドを以下の通り構築した。gltD側を増幅するためのプライマーを2種[gltD-purT_1(配列番号1)とgltD-purT_2BX(配列番号2)]、ならびに、purT側を増幅するためのプライマーを2種[gltD-purT_3BX(配列番号3)とgltD-purT_4(配列番号4)]、デザインした。
レストらの方法[Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541(1999)]に従って電気穿孔法にてATCC 6872株にpC-DE3を導入し、カナマイシン耐性株を選択した。該カナマイシン耐性株の1株から得た染色体の構造をサザンハイブリダイゼーション[Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed.,2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]により調べたところ、pC-DE3がCampbellタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれていることが確認された。
プラスミドpCS299P[Appl.Microbiol.Biotech.,63,592(2004)]をBamHIで消化した。pET21bを鋳型にpCET_Fw2(配列番号7)およびpCET_Rv2(配列番号8)でPCRを行い、lacI-PT7を含むDNA断片を取得した。これらをQIAquick PCR Purification Kit(キアゲン社)により精製し、In-Fusion cloning kit(タカラバイオ社製)を用いて連結した。該反応産物を用い、常法に従ってEscherichia coli DH5α(東洋紡社製)を形質転換して20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地で培養し形質転換株を選択した。コロニーPCRにより目的クローンを選抜後、該形質転換株を20μg/mlのカナマイシンを含むLB培地に植菌して終夜培養し、得られた培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン社)によりプラスミドを調製した。塩基配列解析により、該プラスミドは、pCS299Pに約1.9 kbのpET21b由来lacI-PT7 DNA断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。同プラスミドをpCET212と命名した。
Escherichia coli BL21(DE3)株の染色体DNAを鋳型にGro_F(配列番号13)およびGro_R(配列番号14)でPCRを行い、GroES-GroELを含むDNA断片を取得した。次にpKD46[Datsenko, K.A., Warner, B.L., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Vol. 97. 6640-6645(2000)]を鋳型にAraC_ParaB_F(配列番号15)およびAraC_ParaB_R(配列番号16)でPCRを行い、AraC_ParaBを含むDNA断片を取得した。pCDF-Duet1(Novagen社)を鋳型にpCDF-SmOri-F(配列番号17)およびpCDF-SmOri-R(配列番号18)でPCRを行い、ストレプトマイシン耐性遺伝子とColdDF複製開始点を含むDNA断片を取得した。これらをQIAquick PCR Purification Kit(キアゲン社)により精製し、In-Fusion cloning kit(タカラバイオ社製)を用いて連結した。該反応産物を用い、常法に従ってEscherichia coli DH5α(東洋紡社製)を形質転換して50μg/mlのストレプトマイシンを含むLB寒天培地で培養し形質転換株を選択した。コロニーPCRにより目的クローンを選抜後、該形質転換株を50μg/mlのストレプトマイシンを含むLB培地に植菌して終夜培養し、得られた培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン社)によりプラスミドを調製した。塩基配列解析により、該プラスミドは、pCDF-Duet1に約1.2 kbのpKD46由来AraC-ParaB DNA断片と約2.0 kbのBL21(DE3)由来GroES-GroEL DNA断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。同プラスミドをpGro(Sm)と命名した。
ヒト由来C5-epimeraseの触媒ドメイン領域(E53-N609)を文献記載[Biochemical and Biophysical Research Communications Volume 339, Issue 2, 13 January 2006, Pages 597-602]の方法によりpMAL-C2Xベクター(New England Biolabs社)にクローニングを行い、MBP-C5を造成した。MBP-C5をpGro7(タカラバイオ社)とともにOrigami-B(DE3)(Novagen社)に形質転換を行い、C5-epimeraseを発現するEscherichia coli Origami-B(DE3)/MBP-C5_pGro7株を造成した。
ヘパロサンの発酵生産はEscherichia coli K5株もしくはNissle株を用い、特許文献[WO2018/048973 A1]に記載の方法で行った。得られたヘパロサンは同文献に従い、化学的に脱アセチル化処理、脱ポリマー化を行った後、化学的にN-硫酸化を行った。その後、エタノール沈殿で分画を行い、N-スルフォヘパロサンを得た。得られたN-スルフォヘパロサンは同文献に従い、酵素反応によるウロン酸残基C5位のエピメリ化と2-O位の硫酸化を行ったのち、エタノール沈殿で分画を行い、2-O-硫酸化N-スルフォヘパロサンを得た。
実施例3で得られたATCC 6872(DE3)/pSC-3-13株を、50μg/mlカナマイシンを含むBY-Glucose寒天培地[グルコース10g、普通ブイヨン培地(極東製薬工業社製)20g、酵母エキス(ディフコ社製)5g、バクトアガー(ディフコ社製)20gを水1Lに含む培地]に植菌して、30℃で一晩培養した。
実施例5で得られたOrigami-B(DE3)/MBP-C5_pGro7株を50μg/mLのアンピシリンと20μg/mLのクロラムフェニコール、15μg/mLのテトラサイクリン、15μg/mLのカナマイシンを含む5mLのTB培地が入った太型試験管に接種し、30℃で16時間培養した。該培養液を50μg/mLのアンピシリンと20μg/mLのクロラムフェニコール、15μg/mLのテトラサイクリン、15μg/mLのカナマイシンを含むTB培地が500mLが入ったバッフル付き三角フラスコに1.2%接種し、37℃で6時間振盪培養した後、終濃度1mMのIPTGと終濃度4mMのアラビノースを添加し、28℃で20時間培養した。その後、該培養液を遠心分離しペレットを湿菌体として取得、-80℃で凍結した。
実施例7、8で得られたATCC 6872(DE3)/pSC-3-13、Origami-B(DE3)/MBP-C5_pGro7、Origami-B(DE3)/H-MBP-2OST_pGro(Sm)の凍結菌体を、凍結菌体重量が333g/Lとなるようそれぞれ蒸留水にて懸濁し、菌体懸濁液を調製した。こうして得られたATCC 6872(DE3)/pSC-3-13菌体懸濁液30 ml、Origami-B(DE3)/MBP-C5_pGro7菌体懸濁液6 mlおよびOrigami-B(DE3)/H-MBP-2OST_pGro(Sm) 菌体懸濁液6mlを250ml容培養槽中18mlの反応液[グルコース60g/L、KH2PO4 8.75g/L、K2HPO4 15g/L、MgSO4・7H2O 20g/L、D-パントテン酸カルシウム 0.3g/L、ニコチン酸 0.2g/L、アデニン4.05g/L、塩化ベンザルコニウム1.25g/L、アデカノールLG-109(アデカ社製) 1ml/L、N-スルフォヘパロサン(実施例6で作製された)1g/Lを含む水溶液]に添加し、37℃、撹拌速度500rpm、通気量0.75mL/分の培養条件下、2.8%濃度アンモニア水溶液でpHを6.5に調整しつつ22時間反応した。この間、反応開始6時間後にグルコース60g/L、MgSO4・7H2O 5.0g/L、アデニン2.7g/Lとなるよう追加添加した。
実施例7、8で得られたATCC 6872(DE3)/pSC-3-13、Origami-B(DE3)/MBP-6OST3_pGro7の凍結菌体を、凍結菌体重量が333 g/Lとなるようそれぞれ蒸留水にて懸濁し、菌体懸濁液を調製した。こうして得られたATCC 6872(DE3)/pSC-3-13菌体懸濁液30ml、Origami-B(DE3)/MBP-6OST3_pGro7菌体懸濁液6mlおよび蒸留水6mlを250ml容培養槽中18mlの反応液[グルコース60g/L、KH2PO4 8.75g/L、K2HPO4 15g/L、MgSO4・7H2O 20g/L、D-パントテン酸カルシウム 0.3g/L、ニコチン酸 0.2g/L、アデニン4.05g/L、塩化ベンザルコニウム1.25g/L、アデカノールLG-109(アデカ社製) 1ml/L、2-O-硫酸化N-スルフォヘパロサン(実施例6で作製された)0.5g/Lを含む水溶液]に添加し、32℃、撹拌速度500rpm、通気量0.75mL/分の培養条件下、2規定水酸化カリウムの水溶液でpHを7.4に調整しつつ22時間反応した。
実施例10で示された条件にて22時間反応を行った。この間、反応開始3時間後に、実施例8で得られたIL/HIS-3OST1_pGro(Sm)の凍結菌体を、凍結菌体重量が333 g/Lとなるようそれぞれ蒸留水にて懸濁し調製された菌体懸濁液を6ml添加した。反応中適宜サンプリングを行い、反応液を取得した。実施例9と同様の手法を用いて、PAPSの検出、定量を行った。結果を図8に示す。
実施例7で得られたATCC 6872(DE3)/pSC3-13の凍結菌体を、凍結菌体重量が333g/Lとなるよう蒸留水にて懸濁し、菌体懸濁液を調製した。こうして得られた菌体懸濁液30mlを250ml容培養槽中30mlの反応液[グルコース60g/L、KH2PO4 8.75g/L、K2HPO4 15g/L、MgSO4・7H2O 20g/L、D-パントテン酸カルシウム 0.3g/L、ニコチン酸 0.2g/L、アデニン4.05g/L、塩化ベンザルコニウム0.625g/L、アデカノールLG-109(アデカ社製) 1ml/L、を含む水溶液]に添加し、32℃、撹拌速度500rpm、通気量0.75mL/分の培養条件下、2規定水酸化カリウム水溶液でpHを7.4に調整しつつ22時間反応した。
Claims (11)
- 以下の工程(1-1)及び(1-2)を含む、硫酸化多糖の製造方法。
(1-1)コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたATPスルフリラーゼをコードする遺伝子及びAPSキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(a)又はその処理物を用意する工程
(1-2)ATP又はATP源、硫酸イオン源及び前記形質転換体(a)又はその処理物を含む反応液を用いて、PAPSの生産反応を行う工程 - さらに工程(2-1)及び(2-2)を含む、請求項1に記載の硫酸化多糖の製造方法。
(2-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたC5-エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(2-2)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、C5-エピマー化をする工程 - 発現可能に導入された硫酸転移酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体又はその処理物若しくは抽出物により硫酸化をする工程を含む、請求項1又は2に記載の硫酸化多糖の製造方法。
- さらに工程(3-1)及び(3-2)を含む請求項3に記載の硫酸化多糖の製造方法。
(3-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入された2-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(3-2)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、2-O-硫酸化をする工程 - さらに工程(3´-1)~(3´-3)を含む、請求項3又は4のいずれか1項に記載の硫酸化多糖の製造方法。
(3´-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたC5-エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(3´-2)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入された2-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(3´-3)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物および前記形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、C5-エピマー化及び2-O-硫酸化をする工程 - さらに工程(4-1)及び(4-2)を含む、請求項3~5のいずれか1項に記載の硫酸化多糖の製造方法。
(4-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された6-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(d)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(4-2)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(d)又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、6-O-硫酸化をする工程 - さらに工程(5-1)及び(5-2)を含む請求項3~6のいずれか1項に記載の硫酸化多糖の製造方法。
(5-1)原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された3-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(e)又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
(5-2)N-スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体(e)又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、3-O-硫酸化をする工程 - ATP又はATP源、硫酸イオン源及びN-スルフォヘパロサンの存在下、
コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたATPスルフリラーゼをコードする遺伝子及びAPSキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(a)又はその処理物と、
原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたC5-エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(b)又はその処理物若しくは抽出物、
原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された2-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(c)又はその処理物若しくは抽出物、
原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された6-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(d)又はその処理物若しくは抽出物および
原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された3-O-スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体(e)又はその処理物若しくは抽出物から選ばれる少なくとも1と、を反応液に含有させて硫酸化多糖を生成する、硫酸化多糖の製造方法。 - ATP又はATP源、硫酸イオン源及びN-スルフォヘパロサンの存在下、
前記形質転換体(a)又はその処理物と、前記形質転換体(b)~(e)又はそれらの処理物若しくは抽出物とを反応液に含有させて硫酸化多糖を生成する、請求項8記載の硫酸化多糖の製造方法。 - ヘパリンを製造する方法である、請求項1~9のいずれか1項に記載の硫酸化多糖の製造方法。
- 以下の工程(i)及び(ii)を含む、PAPSの製造方法。
(i)コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたATPスルフリラーゼをコードする遺伝子及びAPSキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体又はその処理物を用意する工程
(ii)ATP又はATP源、硫酸イオン源及び工程(i)で用意した前記形質転換体又はその処理物を含む反応液を用いてPAPSの生産反応を行う工程
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