CN117402225A - 甲醇耐受性蛋白及提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法 - Google Patents
甲醇耐受性蛋白及提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117402225A CN117402225A CN202210833003.8A CN202210833003A CN117402225A CN 117402225 A CN117402225 A CN 117402225A CN 202210833003 A CN202210833003 A CN 202210833003A CN 117402225 A CN117402225 A CN 117402225A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- methanol
- acid
- seq
- strain
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 555
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 103
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 102
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title claims description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 47
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 97
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 67
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 67
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 67
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 50
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 40
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 17
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 14
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 14
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 12
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 claims description 11
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 10
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 10
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 241000607720 Serratia Species 0.000 claims description 10
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 10
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 claims description 9
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 8
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 8
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 7
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 claims description 7
- 241000588768 Providencia Species 0.000 claims description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N decanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 6
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 claims description 6
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 claims description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 4
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NIONDZDPPYHYKY-SNAWJCMRSA-N (2E)-hexenoic acid Chemical compound CCC\C=C\C(O)=O NIONDZDPPYHYKY-SNAWJCMRSA-N 0.000 claims description 3
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005632 Capric acid (CAS 334-48-5) Substances 0.000 claims description 3
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 claims description 3
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 claims description 3
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 claims description 3
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 claims description 3
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002749 aminolevulinic acid Drugs 0.000 claims description 3
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940099690 malic acid Drugs 0.000 claims description 3
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 claims description 3
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 claims description 3
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940005605 valeric acid Drugs 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 9
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 38
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 33
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 28
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 25
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 15
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 101100278365 Mycobacterium bovis (strain ATCC BAA-935 / AF2122/97) dnaE gene Proteins 0.000 description 10
- 101150035285 dnaE1 gene Proteins 0.000 description 10
- -1 ribulose monophosphate Chemical class 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 7
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 7
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 5
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 102220330872 rs1555894924 Human genes 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 4
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 4
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 101150052264 xylA gene Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 101100205514 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) serS gene Proteins 0.000 description 2
- 241000807905 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 Species 0.000 description 2
- 102000007528 DNA Polymerase III Human genes 0.000 description 2
- 108010071146 DNA Polymerase III Proteins 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 101150014383 adhE gene Proteins 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 101150102092 ccdB gene Proteins 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 101150011516 xlnD gene Proteins 0.000 description 2
- BJHIKXHVCXFQLS-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,5,6-pentahydroxyhexan-2-one Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000193398 Bacillus methanolicus Species 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 101100387272 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) hom gene Proteins 0.000 description 1
- 101100300149 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) pyrC gene Proteins 0.000 description 1
- 101100478403 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) ssb gene Proteins 0.000 description 1
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N D-ribulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012366 Fed-batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001467578 Microbacterium Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 108010048916 alcohol dehydrogenase (acceptor) Proteins 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 102220347590 c.71C>T Human genes 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 238000004177 carbon cycle Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002309 gasification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010025743 hexose phosphate synthetase Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 102220280960 rs1424422846 Human genes 0.000 description 1
- 102220275989 rs1556435940 Human genes 0.000 description 1
- 102200037606 rs370860696 Human genes 0.000 description 1
- 102220028371 rs386352363 Human genes 0.000 description 1
- 102220293309 rs542328397 Human genes 0.000 description 1
- 102220100017 rs754092062 Human genes 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
- UZVNCLCLJHPHIF-NOJKMYKQSA-J zinc;(1e)-2-(ethylcarbamoylamino)-n-methoxy-2-oxoethanimidoyl cyanide;manganese(2+);n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[Zn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.CCNC(=O)NC(=O)C(\C#N)=N\OC UZVNCLCLJHPHIF-NOJKMYKQSA-J 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/48—Tricarboxylic acids, e.g. citric acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/54—Acetic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/56—Lactic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本公开涉及一种甲醇耐受性蛋白及提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法。具体来说,本公开涉及一种甲醇耐受性蛋白,编码前述蛋白的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体,能够表达甲醇耐受性蛋白,用于构建甲醇耐受性和利用率提高的菌株,实现甲醇的高效转化、利用。本公开提供的重组宿主细胞或重组菌株,具有高的甲醇耐受性和利用率,能够利用包含甲醇的底物进行发酵反应,为目标化合物的生产提供碳源及能源,使微生物能够耐受高浓度甲醇,并且对甲醇的利用率提高,解决了由于甲醇毒性导致无法高效转化利用甲醇的问题。并且,能够有效提高对底物中甲醇的转化利用率,具有大规模工业化生产的前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及分子生物学领域,具体涉及一种甲醇耐受性蛋白,表达甲醇耐受性蛋白的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体,重组宿主细胞,甲醇耐受性或利用率提高的重组菌株,提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法,以及生产目标化合物的方法。
背景技术
甲醇是煤炭化工、页岩气化工和工农业废弃物气化的初级平台产品,我国甲醇产能已达8000万吨/年,占国际总量50%以上,呈现过剩趋势。由于甲醇的价格低于常用碳源如葡萄糖的价格,利用甲醇生物转化生产大宗化学品即可以降低化学品生产的原料成本,又可解决甲醇过剩而造成的环境污染,是一种极有潜力的工业发酵原料。因此,近年来,越来越多的研究关注于开发能够利用甲醇进行生物转化生产大宗化学品。
已发现多条甲醇的生物转化途径,例如核酮糖单磷酸途径(ribulosemonophosphate pathway,R uMP),丝氨酸途径(serine pathway)和木酮糖单磷酸途径(xylulose monophosphate pathway,XuMP)等。目前,通过改造模式微生物,在模式微生物内构建甲醇代谢途径,实现对甲醇的转化和利用。大多数研究是通过在平台菌株如大肠杆菌(Escherichia coli)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中阻断甲醛氧化生成甲酸和二氧化碳的途径,减少碳损失,同时表达甲醇脱氢酶(Mdh)、6-磷酸己酮糖合成酶(Hps)和6-磷酸己酮糖异构酶(Phi),构建RuMP途径,赋予菌株生物转化甲醇的能力。但是,目前获得的工程菌株在甲醇作为唯一碳源的无机盐培养基中无法生长,仅可以在甲醇与另一辅助碳源存在的情况下生长[1-3]。
由于甲醇是一种有机溶剂,对微生物细胞具有一定的毒性,这是微生物不能利用甲醇作为唯一碳源生长的影响因素之一,因此,如何提高菌株对甲醇的耐受性,以便更高效地转化利用甲醇,是本领域亟需解决的重要问题。
引用文献:
[1]Bennett,R.K.,Gonzalez,J.E.,Whitaker,W.B.,Antoniewicz,M.R.,Papoutsakis,E.T.,2018.Expression of heterologous non-oxidative pentosephosphate pathway from Bacillus methanolicus and phosphoglucose isomerasedeletion improves methanol assimilation and metabolite production by asynthetic Escherichia coli methylotroph.Metab.Eng.45,75-85.
[2]Witthoff,S.,Schmitz,K.,Niedenfuhr,S.,Noh,K.,Noack,S.,Bott,M.,Marienhagen,J.,2015.Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum formethanol metabolism.Appl.Environ.Microbiol.81,2215-2225.
[3]Tuyishime,P.,Wang,Y.,Fan,L.,Zhang,Q.,Li,Q.,Zheng,P.,Sun,J.,Ma,Y.,2018.Engineering Corynebacterium glutamicum for methanol-dependent growth andglutamate production.Metab.Eng.49,220-231.
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的问题,例如,由于甲醇的细胞毒性,导致菌株对甲醇的耐受性低,无法高效转化利用甲醇。为此,本公开提供了一种甲醇耐受性蛋白,为包含如SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示序列的蛋白的突变体。本公开发现,蛋白突变体能够显著提高菌株的甲醇耐受性,以及菌株对甲醇的转化利用率;使菌株能够高效生物转化甲醇,有利于实现以甲醇为底物原料的大规模发酵生产,具有重要的工业应用价值。
用于解决问题的方案
本公开提供了如下技术方案。
(1)一种甲醇耐受性蛋白,其中,所述甲醇耐受性蛋白包含如下(i)-(iv)中任一项所示的序列:
(i)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的突变体序列,所述突变体序列在对应SEQ IDNO:2所示序列的第167位突变为非甘氨酸(G)的其它氨基酸;
(ii)如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的突变体序列,所述突变体序列在对应SEQID NO:4所示序列的第222位突变为非亮氨酸(L)的其它氨基酸;
(iii)如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的突变体序列,所述突变体序列在对应SEQID NO:6所示序列的第6位突变为非苏氨酸(T)的其它氨基酸;
(iv)与(i)~(iii)任一项所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性,且不包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示序列的突变体序列;
并且,包含如(i)-(iv)任一项所示序列的甲醇耐受性蛋白具有提高微生物的甲醇耐受性的蛋白活性。
(2)根据(1)所述的甲醇耐受性蛋白,其中,所述(i)所示的突变体序列对应SEQ IDNO:2所示序列,包含如下的突变的氨基酸:第167位的氨基酸由甘氨酸(G)突变为精氨酸(R);或者
所述(ii)所示的突变体序列对应SEQ ID NO:4所示序列,包含如下的突变的氨基酸:第222位的氨基酸由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F);或者,
所述(iii)所示的突变体序列对应SEQ ID NO:6所示序列,包含如下的突变的氨基酸:第6位的氨基酸由苏氨酸(T)突变为异亮氨酸(I)。
在一种具体的实施方式中,所述甲醇耐受性蛋白包含如SEQ ID NO:7-9任一序列所示的氨基酸序列。
(3)一种多核苷酸,其编码如(1)-(2)任一项所述的甲醇耐受性蛋白。
(4)一种核酸构建体,其中,所述核酸构建体包含(3)所述的多核苷酸,所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接;所述调控序列用于指导所述甲醇耐受性蛋白在宿主细胞中的表达。
(5)一种重组表达载体,其中,所述重组表达载体包含(3)所述的多核苷酸,或(4)所述的核酸构建体。
(6)一种重组微生物宿主细胞,其中,所述重组宿主细胞包含(1)-(2)任一项所述的甲醇耐受性蛋白,(3)所述的多核苷酸,(4)所述的核酸构建体,或者(5)所述的重组表达载体。
(7)根据(6)所述的重组宿主细胞,其中,所述宿主细胞来源于埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、肠道菌属(Enterobacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物。
在一种具体的实施方式中,所述宿主细胞来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
在一种具体的实施方式中,所述宿主细胞来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
(8)根据(1)-(2)任一项所述的甲醇耐受性蛋白,根据(3)所述的多核苷酸,根据(4)所述的核酸构建体或根据(5)所述的重组表达载体在如下(a)-(c)至少一项中的用途:
(a)提高微生物的甲醇耐受性,或制备用于提高微生物的甲醇耐受性的试剂或试剂盒;
(b)提高微生物的甲醇利用率,或制备用于提高微生物的甲醇利用率的试剂或试剂盒;
(c)制备生物转化甲醇的微生物,或制备用于制备生物转化甲醇的微生物的试剂或试剂盒。
(9)一种甲醇耐受性或利用率提高的重组菌株,其中,所述重组菌株包含(1)-(2)任一项所述的甲醇耐受性蛋白,根据(3)所述的多核苷酸,根据(4)所述的核酸构建体或根据(5)所述的重组表达载体。
在一种具体的实施方式中,所述菌株选自大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
在一种具体的实施方式中,所述菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
(10)根据(6)-(7)任一项所述的重组宿主细胞,或根据(9)所述的重组菌株在生物转化甲醇,或生物转化甲醇以生产目标化合物中的用途。
(11)一种提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法,其中,所述方法包括向微生物的细胞内引入如(1)-(2)任一项所述的甲醇耐受性蛋白,根据(3)所述的多核苷酸,根据(4)所述的核酸构建体或根据(5)所述的重组表达载体的步骤。
在一种具体的实施方式中,所述微生物来源于埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、肠道菌属(Enterobacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)或棒状杆菌属(Corynebacterium)。
在一种具体的实施方式中,所述微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
在一种具体的实施方式中,所述微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
(12)一种生产目标化合物的方法,其包括使用根据(6)-(7)任一项所述的重组宿主细胞,或根据(9)所述的重组菌株进行发酵反应,以生产目标化合物的步骤;其中,所述发酵反应的底物包含甲醇。
在一种具体的实施方式中,所述目标化合物包括氨基酸、有机酸中的至少一种。
在一种具体的实施方式中,所述氨基酸包括如下的一种或两种以上的组合:赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物。
在一种具体的实施方式中,所述有机酸包括如下的一种或两种以上的组合:柠檬酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、丁酸、棕榈酸、草酸、草酰乙酸、酒石酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸或上述的任一种的有机酸的衍生物。
在一种具体的实施方式中,所述方法还包括分离或纯化所述目标化合物的步骤。
发明的效果
在一些实施方式中,本公开提供的甲醇耐受性蛋白,为包含SEQ ID NO:2所示序列(Cgl1823蛋白)、SEQ ID NO:4所示序列(Cgl1931蛋白)、或SEQ ID NO:6所示序列(Cgl1931蛋白)的蛋白突变体。本公开发现,蛋白突变体能够显著提高菌株的甲醇耐受性和利用率。以利用Cgl1823蛋白突变体构建的工程菌株为例,其可高效率转化利用甲醇,有利于实现以甲醇为底物原料的大规模发酵生产。
在一些实施方式中,本公开提供的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体,能够表达甲醇耐受性蛋白,用于构建甲醇耐受性和利用率提高的菌株,实现甲醇的高效转化、利用。
在一些实施方式中,本公开提供的重组宿主细胞或重组菌株,具有高的甲醇耐受性和利用率,能够利用包含甲醇的底物进行发酵反应,通过甲醇的高效生物转化,为目标化合物的生产提供碳源及能源。
在一些实施方式中,本公开提供的提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法,通过向微生物的细胞内转入本公开中的甲醇耐受性蛋白,多核苷酸、核酸构建体或重组表达载体,使微生物能够耐受高浓度甲醇,并且对甲醇的利用率提高,解决了由于甲醇毒性导致无法高效转化利用甲醇的问题。
在一些实施方式中,本公开提供的生产目标化合物的方法,以本公开中的重组菌株或重组宿主细胞进行发酵反应,能够有效提高对底物中甲醇的转化利用率,具有大规模工业化生产的前景。
附图说明
图1示出了突变菌株甲醇耐受性测试结果(CGXII培养基+70g/L甲醇);
图2示出了有效突变位点对甲醇耐受的影响;
图3Cgl1823G167R突变对菌株甲醇利用的影响。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时,词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”,但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的,词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的,并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中,术语“约”表示:一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”,但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外,权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时,选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点,也包括相对于前述数值端点而言,所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
如本公开所使用的,“生物转化”是指外源化学物在机体内经多种酶催化的代谢转化。“甲醇生转化”、“生物转化甲醇”在本文中可以互换地使用,是指甲醇进入微生物内代谢途径,经同化途径被同化为生物质进入碳循环,或经异化途径被异化为CO2。
示例性的,微生物内甲醇生物转化的同化途径包括但不限于核酮糖单磷酸途径(ribulose monophosphate pathway,RuMP),丝氨酸途径(serine pathway)、木酮糖单磷酸途径(xylulose monophosphate pathway,XuMP)、核酮糖二磷酸途径等等。
如本公开所使用的,“甲醇生物转化菌株”、“生物转化甲醇的菌株”、“生物转化甲醇的微生物”可以互换地使用,均是指通过生物学途径转化甲醇的微生物,从而能够借助该甲醇生物转化菌株将甲醇转化为对环境无害的产物(如二氧化碳),或将甲醇转化成菌体、氨基酸、有机酸等目标化合物。
如本公开所使用的,“甲醇耐受性提高的菌株”“甲醇耐受性提高的微生物”是指该菌株对甲醇的耐受性较出发菌株有所提高,或能够在高甲醇环境下生长或生长速度提高,进而对于甲醇的利用效率显著提高。
如本公开所使用的,“甲醇利用率提高的菌株”“甲醇利用率提高的微生物”是指该菌株转化利用甲醇的速率提高,或能够在高甲醇环境下生长或生长速度提高,或该菌株在共利用甲醇与其他碳源时,对甲醇转化利用的比例提高。
如本公开所使用的,“甲醇耐受性蛋白”是指利用该蛋白对微生物进行改造后使微生物的甲醇耐受性,或生物转化甲醇的利用率提高。
如本公开所使用的,术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的,它可以包含修饰的氨基酸,并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如,二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作,如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
如本公开所使用的,术语“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如,一种存在于生物体中,可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的,“天然存在的”和“野生型的”是同义词。在一些实施方式中,本公开中野生型蛋白包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6中任一项所示的氨基酸序列。
如本公开所使用的,术语“突变体”是指相对于“野生型”,或者“相比较的”多核苷酸或多肽,在一个或多个(例如,若干个)位置处包含改变(即,取代、插入和/或缺失)的多核苷酸或多肽,其中,取代是指用不同的核苷酸或氨基酸置换占用一个位置的核苷酸或氨基酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸或氨基酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸或氨基酸之后添加核苷酸或氨基酸。
如本公开所使用的,术语“突变的氨基酸”,包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个的氨基酸”。在本公开中,术语“突变”是指氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中,术语“突变”是指“取代”。
在一些实施方式中,突变体蛋白在对应SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的一个或多个位置处具有突变的氨基酸。在一些实施方式中,突变体在对应SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的一个或多个位置处具有取代的氨基酸。包含突变的氨基酸的突变体具有甲醇耐受性蛋白活性,可提高微生物的甲醇耐受性及利用率。
在本公开中,“突变”还可以包含在对应SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示序列的一个或几个位置处不影响蛋白活性的添加、缺失或取代的氨基酸。众所周知,在多肽的某些区域,例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性,例如,适当替换、添加或缺失某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性。示例性的,本公开的“突变”包含在对应SEQ ID NO:2所示序列的多肽的C端和N端至少一端的至少一个氨基酸残基的缺失或添加,且多肽具有甲醇耐受性蛋白活性。
在一些实施方式中,本公开的“突变”可以选自“保守突变”。在本公开中,术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。
如本公开所使用的,术语“保守置换”涉及用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族,并且包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、β-支链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。
如本公开所使用的,术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式,也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分,其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的,能够通过标准分子生物学方法(例如,使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时,这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C),其中“U”取代“T”。换句话说,“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物,或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分,如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
如本公开所使用的,术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定:将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分,且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言,可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
在一些实施方式中,当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时,两个或多个序列或子序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。在某些实施方式中,所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(例如,多核苷酸)的整个长度上基本相同。
本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说,“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后,一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此,例如,就“对应于序列1所示氨基酸序列的第150位的氨基酸残基”而言,如果在序列1所示氨基酸序列的末端加上6×His标签,那么所得突变体中对应于序列1所示氨基酸序列的第150位就可能是第156位。
如本公开所使用的,术语“表达”包括涉及RNA产生及蛋白产生的任何步骤,包括但不限于:转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
如本公开所使用的,术语“核酸构建体”是包含具有编码甲醇耐受性蛋白的多核苷酸的重组表达元件。在一些实施方式中,核酸构建体中还包括调控序列。编码甲醇耐受性蛋白的多核苷酸与调控序列“可操作地连接”,是指将编码甲醇耐受性蛋白的多核苷酸与调控序列功能性连接,以启动和介导甲醇耐受性蛋白的表达,所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。
如本公开所使用的,术语“载体”指的是DNA构建体,其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列,从而在合适的宿主中表达目标基因。“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括,例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合,例如启动子和增强子;ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列;以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要,并可以使用任何载体,包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列,例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体,来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。在本公开中,“重组表达载体”与“重组载体”可以互换地使用。
本公开中的术语“宿主细胞”意指易于用包含本公开的甲醇耐受性蛋白,或包含编码甲醇耐受性蛋白的多核苷酸、核酸构建体或重组表达载体的任何细胞类型。术语“重组宿主细胞”涵盖导入多核苷酸、核酸构建体或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞,重组宿主细胞具体通过转化来实现。
本公开中的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思,即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法,这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本公开的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞,只要是能够包含本公开的甲醇耐受性蛋白,或包含编码甲醇耐受性蛋白的多核苷酸、核酸构建体或重组表达载体的细胞即可。在一些实施方式中,宿主细胞来源于适合发酵生产氨基酸的微生物,包括但不限于可以包括埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、肠道菌属(Enterobacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)等的菌株。在一些实施方式中,宿主细胞为大肠杆菌(Escherichiacoli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。在一些实施方式中,宿主细胞为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032,谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067菌株或上述任一种的衍生菌株。
在一些实施方式中,本公开中的宿主细胞还可以是具有甲醇生物转化途径的其他类型的菌株,其包括野生型菌株和重组菌株。
示例性的,宿主细胞为通过如下方法改造的谷氨酸棒杆菌:
1)增强所述菌株中木糖代谢途径相关酶的活性或导入外源性的木糖代谢途径相关酶;
2)增强核酮糖单磷酸途径相关酶的活性或导入外源性的核酮糖单磷酸途径相关酶;和/或
3)增强丝氨酸途径相关酶的活性或导入外源性的丝氨酸途径途径相关酶。
本公开的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行,包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等,并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
如本公开所使用的,术语“目标化合物”可以选自氨基酸、有机酸,也可以选自本领域中可能通过生物合成得到的其他种类的化合物。
本公开的术语“氨基酸”或“L-氨基酸”是指其中氨基和羧基结合至相同碳原子的蛋白质的基本构成单元。示例性的,氨基酸选自如下的一种或多种:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述的任一种的氨基酸的衍生物。此外,氨基酸也可以是本领域中其他种类的氨基酸。
本公开的术语“有机酸”可以是具有酸性的有机化合物,例如,其中包括羧基和磺酸基的那些化合物。示例性的,有机酸包括如下的一种或多种:乳酸、醋酸、琥珀酸、丁酸、棕榈酸、草酸、草酰乙酸、酒石酸、柠檬酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸或上述任一种的有机酸的衍生物。此外,有机酸也可以是本领域中其他种类的有机酸。
本公开的术语“培养”可以根据本领域的常规方法进行,包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等,并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
除非在本公开中另外定义或由背景清楚指示,否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
甲醇耐受性蛋白
本公开利用突变器载体(pXMJ19Ts-dnaE1D223N)转化谷氨酸棒杆菌,得到重组菌株;通过重组菌株的自发突变,筛选得到甲醇耐受型突变菌株,通过突变位点筛选,得到了能够提高菌株甲醇耐受性和利用率的蛋白突变体。
在一些实施方式中,甲醇耐受性蛋白为Cgl1823蛋白突变体,Cgl1823蛋白突变体在对应SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的一个或多个位置处具有突变的氨基酸。进一步的,Cgl1823蛋白突变体在对应SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的一个或多个位置处具有取代的氨基酸。
在一些具体的实施方式中,Cgl1823蛋白突变体对应SEQ ID NO:2所示氨基酸序列,包含第167位的取代的氨基酸。
在一些更为具体的实施方式中,Cgl1823蛋白突变体对应SEQ ID NO:2所示氨基酸序列,第167位的氨基酸由甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)。
本公开发现,包含上述突变的Cgl1823蛋白突变体,能够显著提高菌株的甲醇耐受性,以及生物转化甲醇的利用率,具有甲醇耐受性蛋白活性。
在一些实施方式中,甲醇耐受性蛋白为Cgl1931蛋白突变体,Cgl1931蛋白突变体在对应SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的一个或多个位置处具有突变的氨基酸。进一步的,Cgl1931蛋白突变体在对应SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的一个或多个位置处具有取代的氨基酸。
在一些具体的实施方式中,Cgl1931蛋白突变体对应SEQ ID NO:4所示氨基酸序列,包含第222位的取代的氨基酸。
在一些更为具体的实施方式中,Cgl1931蛋白突变体对应SEQ ID NO:4所示氨基酸序列,第222位的氨基酸由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)。
本公开发现,包含上述突变的Cgl1931蛋白突变体,能够显著提高菌株的甲醇耐受性,以及生物转化甲醇的利用率,具有甲醇耐受性蛋白活性。
在一些实施方式中,甲醇耐受性蛋白为Cgl1935蛋白突变体,Cgl1935蛋白突变体在对应SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的一个或多个位置处具有突变的氨基酸。进一步的,Cgl1935蛋白突变体在对应SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的一个或多个位置处具有取代的氨基酸。
在一些具体的实施方式中,Cgl1935蛋白突变体对应SEQ ID NO:6所示氨基酸序列,包含第6位的取代的氨基酸。
在一些更为具体的实施方式中,Cgl1935蛋白突变体对应SEQ ID NO:6所示氨基酸序列,第6位的氨基酸由苏氨酸(T)突变为异亮氨酸(I)。
本公开发现,包含上述突变的Cgl1935蛋白突变体,能够显著提高菌株的甲醇耐受性,以及生物转化甲醇的利用率,具有甲醇耐受性蛋白活性。
在一些实施方式中,甲醇耐受性蛋白还包含与Cgl1823蛋白突变体、Cgl1931蛋白突变体或Cgl1935蛋白突变体的氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性,且具有甲醇耐受性蛋白活性的蛋白。
在一些优选的实施方式中,甲醇耐受性蛋白包含如SEQ ID NO:7-9任一项所示的氨基酸序列;或与SEQ ID NO:7-9任一项所示的氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性,且具有甲醇耐受性蛋白活性的蛋白。如SEQ ID NO:7-9所示氨基酸序列的甲醇耐受性蛋白可用于构建具有高甲醇耐受性和利用率的重组菌株,实现对甲醇的高效转化利用。
在一些实施方式中,甲醇耐受性蛋白由多核苷酸编码,本公开对多核苷酸的序列不进行具体限定,只要其能够编码得到上述任一种的具有甲醇耐受性蛋白活性的蛋白即可。
示例性的,多核苷酸编码如SEQ ID NO:2所示序列的Cgl1823蛋白的突变体,其对应SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有如下突变:G499A。或者,多核苷酸编码如SEQ ID NO:4所示序列的Cgl1931蛋白的突变体,其对应SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有如下突变:C664T。或者,多核苷酸编码如SEQ ID NO:6所示序列的Cgl1935蛋白的突变体,其对应SEQID NO:6所示的核苷酸序列具有如下突变:C17T。
突变菌株的构建和蛋白突变体的筛选
在一些实施方式中,本公开以温敏载体pXMJ19Ts-ccdB为模板,与谷氨酸棒杆菌内源DNA聚合酶III编码基因dnaE1进行重组连接,获得重组载体pXMJ19Ts-dnaE1。
在一些实施方式中,本公开以重组载体pXMJ19Ts-dnaE1为模板,将dnaE1第223位天冬氨酸的密码子突变为编码天冬酰胺的密码子,获得突变器载体pXMJ19Ts-dnaE1D223N。突变器载体能够显著提高菌株自发突变的频率,用于菌株的突变筛选。
在一些实施方式中,本公开利用重组载体pXMJ19Ts-dnaE1、突变器载体pXMJ19Ts-dnaE1D223N转化出发菌株,获得待筛选菌株。在一些具体的实施方式中,出发菌株为谷氨酸棒杆菌。在一些更为具体的实施方式中,出发菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。
在一些实施方式中,在不同浓度甲醇存在的环境下,对待筛选菌株进行培养,筛选在高浓度甲醇环境下具有生长优势的菌株,得到具有甲醇耐受性的突变菌株。通过对比甲醇耐受性的突变菌株与出发菌株,获得蛋白突变位点。
甲醇耐受性或利用率提高的重组菌株
在本公开中,甲醇耐受性或利用率提高的重组菌株包含本公开中的甲醇耐受性蛋白,或表达甲醇耐受性蛋白的多核苷酸、核酸构建体或重组表达载体。与出发菌株相比,重组菌株对甲醇耐受性和利用率显著提高,能够实现对甲醇的高效生物转化、利用,在以甲醇为底物原料的微生物发酵中具有重要应用前景。
在一些实施方式中,制备重组菌株的出发菌株来源于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属。进一步的,出发菌株来源于棒状杆菌属的谷氨酸棒杆菌。示例性的,出发菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869或谷氨酸棒杆菌ATCC 14067等。
在一些可选的实施方式中,本公开向C.glutamicum ATCC 13032感受态细胞中转化pRecT质粒,得到C.glutamicum ATCC 13032/pRecT感受态细胞。进一步的,向C.glutamicum ATCC 13032/pRecT感受态细胞中转化pCas9gRNA-cgl质粒,和ssDNA;其中,ssDNA包含编码氨基酸突变位点的核苷酸序列。筛选包含目标突变位点的正确克隆,将正确克隆中的pRecT和pCas9gRNA质粒丢失,得到目标的重组菌株。
示例性的,向C.glutamicum ATCC 13032/pRecT感受态细胞中转化pCas9gRNA-cgl1935质粒,和ssDNA;其中,ssDNA包含编码氨基酸突变位点(Cgl1935T6I)的核苷酸序列。筛选包含目标突变位点的正确克隆,将正确克隆中的pRecT和pCas9gRNA质粒丢失,得到13032-Cgl1935T6I重组菌株。
在一些可选的实施方式中,本公开以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组序列为模板,设计引物1183-F和1183-R;以突变菌株基因组为模板,利用引物1183-F和1183-R进行PCR扩增获得带有相应突变位点的DNA片段;根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pK-F/R,以质粒pK18mobsacB为模板,通过PCR反向扩增获得线性化载体片段;将上述的载体和DNA片段进行重组连接,获得包含目标突变位点的突变载体。进一步的,将包含目标突变位点的突变载体转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的感受态细胞,得到目标的重组菌株。
示例性的,以突变菌株基因组为模板,利用引物1183-F和1183-R进行PCR扩增获得带有Cgl1823G167R突变位点的DNA片段;将带有Cgl1823G167R突变位点的DNA片段与pK18载体重组连接,得到带有Cgl1823G167R突变位点的突变载体pK18-cgl1823。pK18-cgl1823转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032的感受态细胞,得到13032-Cgl1823G167R重组菌株。
目标化合物的生产过程
在一些实施方式中,本公开提供的生产目标化合物的方法包括如下步骤:
(1)利用甲醇耐受性或利用率提高的重组菌株进行发酵反应,以生产目标化合物;
(2)从发酵反应液中分离或纯化目标化合物,完成目标化合物的生产过程。
其中,甲醇耐受性或利用率提高的重组菌株是具有甲醇同化途径的重组菌株。示例性的,向携带甲醇利用质粒的重组菌株MX45-4中引入Cgl1823G167R突变位点,得到重组菌株MX45-4-Cgl1823G167R。带有甲醇生物转化途径的重组菌株能够在包含甲醇的底物中进行发酵反应。由于重组菌株具有高的甲醇耐受性和利用率,能够实现对甲醇高效率的生物转化,在以甲醇为底物转化目标化合物的工业发酵领域具有重要的应用前景。
在一些实施方式中,发酵反应的底物中包含甲醇和其他共利用底物;示例性的,以葡萄糖、核糖、酵母粉等等作为甲醇的共利用底物。在一些实施方式中,发酵反应以甲醇为唯一底物。
在一些可选的实施方式中,对带有甲醇生物转化途径的重组菌株进行发酵培养的培养基为添加有5g/L木糖和10-30g/L甲醇的CGXII培养基。
在一些可选的实施方式中,发酵培养的条件为:将不同菌株接种到含有25μg/mL卡那霉素和0.5mM IPTG的TSB液体培养基中培养10h活化,利用CGXII培养基将菌体洗2次,作为种子转接到每孔装有400μL培养基的48孔板中,初始OD600控制0.1,30℃培养44h,孔板摇床转速为800rpm,每个菌株3个平行,使用全自动微生物生长曲线分析仪对菌株的生长曲线进行检测。
在一些具体的实施方式中,对于重组菌株的培养液回收目标化合物,可通过本领域常用方法,包括但不限于:过滤、阴离子交换色谱、结晶或HPLC。
在本领域,用于操纵微生物的方法是已知的,如《分子生物学现代方法》(OnlineISBN:9780471142720,John Wiley and Sons,Inc.)、《微生物代谢工程:方法和规程》(Qiong Cheng Ed.,Springer)和《系统代谢工程:方法和规程》(Hal S.Alper Ed.,Springer)等出版物中被解释。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是,应当理解的是,详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出,因为在阅读该详细说明后,在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰,对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法,如无特殊说明均为常规技术方法,例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可通过正规商业渠道获得。
实施例中用到的培养基
TSB培养基成份为(g/L):葡萄糖,5g/L;酵母粉,5g/L;大豆蛋白胨,9g/L;尿素,3g/L;丁二酸,0.5g/L;K2HPO4·3H2O,1g/L;MgSO4·7H2O,0.1g/L;生物素,0.01mg/L;维生素B1,0.1mg/L;MOPS,20g/L。
CGXII培养基成份为:葡萄糖,20g/L;硫酸铵,20g/L;尿素,5g/L;KH2PO4,1g/L;K2HPO4·3H2O,1.3g/L;MOPS,42g/L;CaCl2,0.01g/L;FeSO4·7H2O,0.01g/L;MnSO4·H2O,0.01g/L;ZnSO4·7H2O,0.001g/L;CuSO4,0.0002g/L;NiCl·6H2O,0.00002g/L;MgSO4·7H2O,0.25g/L;原儿茶酸,0.03g/L;生物素,0.0002g/L;维生素B1,0.0001g/L;初始pH7.2。根据需要添加不同浓度的无水甲醇。
BHI培养基成分为:Brain Heart Infusion(BHI),37g/L;硫酸铵,10g/L;K2HPO4·3H2O,0.2g/L;NaH2PO4,0.3g/L;MgSO4·7H2O,0.5g/L;初始pH 7.2。
实施例1:基于DnaE1突变体的突变器菌株构建
首先,根据文献报道的pXMJ19-nCas9(D10A)NG-AID-gRNA-ccdB-Ts载体信息(Metabolic Engineering,2018,47:200-210.),设计构建获得温敏载体pXMJ19Ts-ccdB。然后利用该质粒载体过表达谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的内源DNA聚合酶III编码基因dnaE1,获得重组载体pXMJ19Ts-dnaE1。最后将dnaE1第223位天冬氨酸的密码子突变为编码天冬酰胺的密码子,获得突变器载体pXMJ19Ts-dnaE1D223N。将上述突变器载体及对照载体pXMJ19Ts-dnaE1转化出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032,获得重组菌株ATCC 13032/pXMJ19Ts-dnaE1D223N和对照菌株ATCC13032/pXMJ19Ts-dnaE1。携带突变器的菌株自发突变的频率是对照菌株(即采用对照载体进行转化的菌株)的37倍,可以用于菌株的快速进化。
实施例2:适应性进化获得甲醇耐受型突变菌
将上述带有突变器的菌株C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19Ts-dnaE1D223N及其对照菌株ATCC13032/pXMJ19Ts-dnaE1分别接入含有5μg/mL氯霉素的TSB液体培养基中活化10h。用CGXII培养基将活化后的菌体洗两次,转入含有20g/L葡萄糖、0.5mM IPTG和5μg/mL氯霉素的CGXII培养基中,设置3个平行,30℃,220rpm条件下培养12h。将上述培养物转接到含有5g/L甲醇、20g/L葡萄糖、0.5mM IPTG和5μg/mL氯霉素的25mL CGXII培养基中,控制初始OD600为0.1。当实验菌株OD600生长至16左右时进行传代培养,并依次提高甲醇的浓度至10g/L、15g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L。最终在70g/L甲醇的浓度下,携带突变器的菌株生长明显优于对照菌株。
将具有生长优势的培养液在含有70g/L甲醇、20g/L葡萄糖和5μg/mL氯霉素的CGXII平板培养基上进行稀释涂布,30℃静置培养48h,挑取菌落较大的3个菌株(D1、D2和D3)在添加70g/L甲醇的CGXII培养基中进行生长测试,确定其生长明显好于对照菌株(图1)。将上述菌株进行全基因组测序,与出发菌株ATCC 13032相比共有35个位点发生点突变,具体突变位点信息见表1。
实施例3:单位点突变菌株构建
根据突变位点序列分析,对上述35个突变位点分为两组,分别利用基于CRISPR/Cas9的单链重组技术和基于传统pK18mobsacB的同源重组技术,进行单位点突变菌株的构建。
(1)基于CRISPR/Cas9单链重组技术的突变菌株构建
以Cgl2893R66N为例,首先根据文献报道的Goldengate克隆方法(Biotechnologyand Bioengineering,2019,116:3016-3029)构建靶向Cgl2893R66N突变位点的pCas9gRNA质粒,sgRNA的靶DNA结合区为AGAAGTGCAGGGCGGTCCTC。具体方法如下:将2893-F和2893-R进行变性退火,得到带有粘性末端的DNA双链产物,再与pCas9gRNA-ccdB质粒(参见CN112111469A)进行Goldengate克隆(Golden Gate组装试剂盒,#E1601),获得pCas9gRNA-cgl2893质粒,该质粒表达Cas9蛋白和靶向定点突变区的sgRNA。上述质粒构建所用引物如表2所示。
采用文献报道的方法制备C.glutamicum ATCC 13032感受态细胞(BiotechnologyLetters,2015,37:2445-52.),将重组辅助质粒pRecT质粒(Bio-Protocol,2018,8(19):e3038.)电转化至13032感受态细胞,得到C.glutamicum ATCC 13032/pRecT感受态细胞。同时为了构建相应的突变菌株,设计了Cgl2893R66N的单链DNA——ss2893(表2),用于突变体构建的重组模板。向上述制备获得的C.glutamicum ATCC 13032/pRecT感受态细胞电转化1μg pCas9gRNA-cgl2893质粒和10μg的ss2893单链DNA,加入1mL 46℃预热的TSB培养基,46℃孵育6min,30℃孵育3h,涂布添加5μg/mL氯霉素、15μg/mL卡那霉素和0.05mM IPTG的TSB平板,培养2天,获得克隆。将上述获得的单克隆进行测序确认,得到正确克隆,然后将正确突变体菌株中的pRecT和pCas9gRNA质粒丢失,具体过程如下:单克隆在无抗性的TSB液体培养基37℃过夜培养,再在无抗性的TSB固体培养基平板划单克隆,然后对长出的单克隆菌分别在3种固体平板(TSB+5μg/mL氯霉素、TSB+15μg/mL卡那霉素和TSB)上划线,30℃培养24h,得到氯霉素和卡那霉素抗性平板不能生长,而TSB平板可以正常生长的菌株,即为丢失两种质粒的突变菌株13032-Cgl2893R66N。
利用上述类似的方法,构建获得13032-Cgl0345L29V、Cgl2760N251D、Cgl0275G84V、Cgl0606L82I、Cgl0963G367G、Cgl1934P45P、Cgl2680I252I、Cgl1935T6I突变菌株。
(2)基于pK18mobsacB同源重组技术的突变菌株构建
以Cgl1183R231C为例,根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组序列,设计引物1183-F和1183-R,以进化获得的D1菌株基因组为模板,通过PCR扩增获得带有相应突变位点的DNA片段。根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pK-F/R,以质粒pK18mobsacB为模板,通过PCR反向扩增获得线性化载体片段,上述两片段回收后重组连接,获得带有Cgl1183R231C突变位点的突变载体pK18-cgl1183R231C。
采用上述相同的方法制备C.glutamicum ATCC 13032感受态细胞,向上述制备获得的13032感受态细胞电转化1μg pK18-cgl1183R231C质粒,加入1mL 46℃预热的TSB培养基,46℃孵育6min,30℃孵育3h,涂布含有25ug/mL卡那霉素的TSB固体培养基,30℃培养1天,获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养,然后转接含有100g/L蔗糖的TSB培养基,30℃培养6h后涂布于添加100g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选,获得突变菌株13032-Cgl1183R231C。
利用上述类似的方法,构建获得13032-Cgl1313S163Y、Cgl1823G167R、Cgl0309V924A、Cgl0449N258S、Cgl0717D181V、Cgl3008D340D、Cgl2884-2885、Cgl1390-1391、Cgl1931L222F、Cgl2236V159A、Cgl1451R224R、Cgl2710S68S、Cgl2982K217K、Cgl1641-1642、Cgl0986R78C、Cgl1322P131S、Cgl1538A268V、Cgl1611G50S、Cgl1724T24I、Cgl2064V747A、Cgl2580D239G、Cgl2830R618C、Cgl0311R241C、Cgl2709V164V、Cgl0335-0336突变菌株。前述突变菌株相对于出发菌株的具体突变位点如表1所示。
实施例4:单位点突变菌株甲醇耐受性测试
为了测试构建的单位点突变菌株对高浓度甲醇耐受的影响,分别利用添加45g/L甲醇的CGXII培养基对获得的35个菌株进行生长测试,并以C.glutamicum ATCC 13032菌株作对照。首先,将不同菌株接种到TSB液体培养基中培养10h活化,然后用CGXII培养基洗菌2次,再转接到每孔装有400μL添加45g/L甲醇的CGXII培养基的48孔板中,初始OD600控制0.1,30℃培养44h,孔板摇床转速为800rpm,每个菌株3个平行,使用全自动微生物生长曲线分析仪对菌株的生长曲线进行检测。
结果如图2所示,可以看出Cgl1823G167R、Cgl1931L222F和Cgl1935T6I突变菌株在高浓度甲醇条件下生长明显快于对照菌株,表明上述突变能够有效提升谷氨酸棒杆菌的甲醇耐受性。
实施例5.甲醇依赖型突变菌株的构建
将文献中的可以共利用甲醇和木糖的甲醇耐受菌株MX-14(CommunicationsBiology,2020,3(1):217.)接种到添加5g/L木糖、5g/L核糖、0.1mM IPTG、5μg/mL氯霉素的BHI液体培养基中,通过连续传代的方式丢掉该菌株中的pEC-XK99E-mdhBs2334-hps-phiBm质粒,获得菌株MX-14-1。
根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组序列,设计引物Up-F/Up-R和Down-F/Down-R,以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组为模板,通过PCR扩增上下游同源臂。设计引物xylA-F和xylA-R,以质粒pXMJ19-xylA(Metabolic Engineering,2018,49:220–231.)为模板,通过PCR扩增xylA片段。根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pk18-F/pk18-R,以质粒pK18mobsacB为模板,通过PCR反向扩增获得线性化载体片段。上述四片段回收后重组连接,获得在染色体adhE基因处插入xylA基因的编辑载体pK18mobsacB-ΔadhE::xylA。向制备获得的MX-14-1感受态细胞电转化1μg pK18mobsacB-ΔadhE::xylA质粒,加入1mL 46℃预热的含有5g/L木糖、5g/L核糖的BHI培养基,46℃孵育6min,30℃孵育3h,涂布于含有5g/L木糖、5g/L核糖、5μg/mL氯霉素、15μg/mL卡那霉素、0.1mM IPTG的BHI固体培养基上,30℃培养3天,获得一次重组的转化子。将一次重组的转化子转接含有5g/L木糖、5g/L核糖、5μg/mL氯霉素、0.1mM IPTG的BHI培养基过夜培养,稀释涂布于添加100g/L蔗糖的BHI培养基进行筛选,获得重组菌株MX45,该菌株中的染色体上已成功插入xylA基因。然后将菌株MX45在5g/L木糖、5g/L核糖的BHI液体培养基中连续传代,丢掉pXMJ19-xylA质粒,获得重组菌株MX45-1,该菌株中无质粒及抗性,可用于后面抗性质粒的引入。
设计引物pXMJ19-F和pXMJ19-R,以温敏载体pXMJ19Ts-ccdB为模板,PCR扩增质粒骨架。设计引物mdhBS2334-F和hps-phiBm-R,以pEC-XK99E-mdhBs2334-hps-phiBm质粒为模板,PCR扩增mdhBS2334-hps-phiBm片段。将上述片段回收后重组连接,获得温敏型质粒pXMJ19Ts-mdhBs2334-hps-phiBm。制备MX45-1感受态细胞,向其中电转化1μg温敏型pXMJ19Ts-mdhBs2334-hps-phiBm质粒,加入1mL 46℃预热的5g/L木糖、5g/L核糖的BHI培养基,46℃孵育6min,30℃孵育2h,涂布于含有5g/L木糖、5g/L果糖、10g/L甲醇、5μg/mL氯霉素、0.1mM IPTG的BHI固体培养基上,30℃培养3天,获得可以共利用甲醇和木糖的甲醇依赖型菌株MX45-4。
制备谷氨酸棒杆菌MX45-4的感受态细胞,向其中电转化1μg实施例3获得的pK18-cgl1823G167R质粒,加入1mL 46℃预热的BHI培养基,46℃孵育6min,30℃孵育3h,涂布含有涂布于含有5g/L木糖、5g/L果糖、10g/L甲醇、5μg/mL氯霉素、15μg/mL卡那霉素、0.1mM IPTG的BHI固体培养基上,30℃培养4天,获得一次重组的转化子。将一次重组的转化子转接含有5g/L木糖、5g/L果糖、10g/L甲醇、5μg/mL氯霉素、0.1mM IPTG的BHI培养基过夜培养,稀释涂布于添加100g/L蔗糖的BHI培养基进行筛选,获得甲醇依赖型突变菌株MX45-4-Cgl1823G167R。
实施例6.测试甲醇依赖型突变菌株的甲醇利用能力
为了测试构建的突变菌株对甲醇的利用能力,对含有Cgl1823G167R突变体的甲醇依赖性突变菌株MX45-4-Cgl1823G167R和对照菌株MX45-4进行生长测试。首先,将菌株接种到5g/L木糖、5g/L果糖、10g/L甲醇、5μg/mL氯霉素、0.1mM IPTG的BHI液体培养基中培养24h进行活化,然后用CGXII培养基洗菌2次,再作为种子转接到每瓶装有30mL添加30g/L甲醇、5g/L木糖、5μg/mL氯霉素、0.1mM IPTG的CGXII培养基的250mL三角瓶中,初始OD600控制为0.1,30℃培养190h,摇床转速为200rpm,每个菌株3个平行,使用分光光度计测定突变菌株和对照菌株的OD600值,并使用生物传感分析仪测定甲醇含量。
结果如图3所示,可以看出MX45-4-Cgl1823G167R突变菌株在30g/L甲醇条件下生长明显快于对照菌株,110h和182h甲醇浓度测试结果见表3,MX45-4-Cgl1823G167R突变菌株消耗甲醇的速度明显快于对照菌株,表明上述突变能够有效提升谷氨酸棒杆菌的甲醇利用能力,显示出良好的应用效果。由以上结果可知,菌株甲醇耐受性的提高也就相应地提高了菌株的甲醇利用能力。本领域技术人员同样可以采用上述同样的方法,构建MX45-4-Cgl1931L222F突变菌株和MX45-4-Cgl1935T6I突变菌株,从而提高菌株的甲醇利用能力。
表3 菌株甲醇消耗情况
菌株 | 110h甲醇消耗(g/L) | 182h甲醇消耗(g/L) |
MX45-4 | 3.33 | 8.33 |
MX45-4-Cgl1823G167R | 5.00 | 10.00 |
表1:突变菌株信息汇总
表2:引物序列
/>
/>
/>
/>
Cgl1823序列
ATGGGGAACTGGGCAGAGATTACTGATGAAATTTCTAAGATTTACCAAGATAATCAGTACAAGATTAGACAAATAAATGATGTTGACGCAGTAAGCGATAAACGTAGAGAAGCGCTACAAGCACTGTTTGAACATACTGGTCGAAATGTAATCGTCTATTATTCAGCGTGGTTAGAAAATGGTCGACGATTTTCCGGGCAATCTACGGATTTTTCGGTAAATGATACTGATAAAAACAGTTTTATGACTGCGCTCCATAAGTTGGATCAGAGTAAAGGTCTCGATCTTATCCTCCACACTCCGGGTGGAGATGTTGCTGCGACAGAGTCGTTAGTAGATTACATTCACGCACTCTTTGGTCAAGATTTCAGAGTCATTGTCCCCCAACTCGCAATGTCAGCAGGAACAATGATCGCACTTTCGTCCAAAGAGATTGTTATGGGGAAGCATTCTAGTCTTGGCCCCATTGATCCTCAGTTTAACGGCCTACCGGCACACGGGTTATTGGAAGAATTTGAGCAAGCGAAGAAAGAGGTCTCTGAGAATCCGCAGACTGCTCATATATGGCAGGTGATCTTGAATAAATACAACCCCACGATGTTGGGTGAAGCTAAAAAAGCTATTCAGTGGTCCAACTCGATGGTTAAGCAGTGGCTTGAAAAGGGTATGTTTTTAGACGAGCCTGACAAAGAAGAAAAAGCCACTCGCGCTATCAAAGAGCTCGCTGATCATTCCGTTACTCTTGCGCATAATCGACACATTTCGGTCAGTAAAGCACTTGAGCTGGGATTGAATATCAAAGAACTTGAGAGCGATCCAAAGCTTCAAGATTTAGTTCTTACTCTTCACCACCTGTCCGTTATTGCTGCGCAACGAGGACCATTAATTAAGTTTGTCGTCAATCATGACAACCGTGGCACTTTTCTGCAGGGGCATGAAAACTAA(SEQ ID NO:1)MGNWAEITDEISKIYQDNQYKIRQINDVDAVSDKRREALQALFEHTGRNVIVYYSAWLENGRRFSGQSTDFSVNDTDKNSFMTALHKLDQSKGLDLILHTPGGDVAATESLVDYIHALFGQDFRVIVPQLAMSAGTMIALSSKEIVMGKHSSLGPIDPQFNGLPAHGLLEEFEQAKKEVSENPQTAHIWQVILNKYNPTMLGEAKKAIQWSNSMVKQWLEKGMFLDEPDKEEKATRAIKELADHSVTLAHNRHISVSKALELGLNIKELESDPKLQDLVLTLHHLSVIAAQRGPLIKFVVNHDNRGTFLQGHEN(SEQ ID NO:2)MGNWAEITDEISKIYQDNQYKIRQINDVDAVSDKRREALQALFEHTGRNVIVYYSAWLENGRRFSGQSTDFSVNDTDKNSFMTALHKLDQSKGLDLILHTPGGDVAATESLVDYIHALFGQDFRVIVPQLAMSAGTMIALSSKEIVMGKHSSLGPIDPQFNGLPAHRLLEEFEQAKKEVSENPQTAHIWQVILNKYNPTMLGEAKKAIQWSNSMVKQWLEKGMFLDEPDKEEKATRAIKELADHSVTLAHNRHISVSKALELGLNIKELESDPKLQDLVLTLHHLSVIAAQRGPLIKFVVNHDNRGTFLQGHEN(SEQ ID NO:7)
Cgl1931序列
ATGTACGCAGAGGAGCGCCGTCGACAGATTGCCTCATTAACGGCAGTTGAGGGACGTGTAAATGTCACAGAATTAGCGGGCCGATTCGATGTCACTGCAGAGACGATTCGACGAGACCTTGCGGTGCTAGACCGCGAGGGAATTGTTCACCGCGTTCACGGTGGCGCAGTAGCCACCCAATCTTTCCAAACCACAGAGTTGAGCTTGGATACTCGTTTCAGGTCTGCATCGTCAGCAAAGTACTCCATTGCCAAGGCAGCGATGCAGTTCCTGCCCGCTGAGCATGGCGGACTGTTCCTCGATGCGGGAACTACTGTTACTGCTTTGGCCGATCTCATTTCTGAGCATCCTAGCTCCAAGCAGTGGTCGATCGTGACCAACTGCCTCCCCATCGCACTTAATCTGGCCAACGCCGGGCTTGATGATGTCCAGCTGCTTGGAGGAAGCGTTCGCGCGATCACCCAGGCTGTTGTGGGTGACACTGCGCTTCGTACTCTCGCGCTGATGCGTGCGGATGTAGTGTTCATCGGCACCAACGCGTTGACGTTGGATCACGGATTGTCTACGGCCGATTCCCAAGAGGCTGCCATGAAATCTGCGATGATCACCAACGCCCACAAGGTGGTGGTGTTGTGTGACTCCACCAAGATGGGCACCGACTACCTCGTGAGCTTTGGCGCAATCAGCGATATCGATGTGGTGGTCACCGATGCGGGTGCACCAGCAAGTTTCGTTGAGCAGTTGCGAGAACGCGATGTAGAAGTTGTGATTGCAGAATGA(SEQ ID NO:3)
MYAEERRRQIASLTAVEGRVNVTELAGRFDVTAETIRRDLAVLDREGIVHRVHGGAVATQSFQTTELSLDTRFRSASSAKYSIAKAAMQFLPAEHGGLFLDAGTTVTALADLISEHPSSKQWSIVTNCLPIALNLANAGLDDVQLLGGSVRAITQAVVGDTALRTLALMRADVVFIGTNALTLDHGLSTADSQEAAMKSAMITNAHKVVVLCDSTKMGTDYLVSFGAISDIDVVVTDAGAPASFVEQLRERDVEVVIAE(SEQ ID NO:4)
MYAEERRRQIASLTAVEGRVNVTELAGRFDVTAETIRRDLAVLDREGIVHRVHGGAVATQSFQTTELSLDTRFRSASSAKYSIAKAAMQFLPAEHGGLFLDAGTTVTALADLISEHPSSKQWSIVTNCLPIALNLANAGLDDVQLLGGSVRAITQAVVGDTALRTLALMRADVVFIGTNALTLDHGLSTADSQEAAMKSAMITNAHKVVVLCDSTKMGTDYFVSFGAISDIDVVVTDAGAPASFVEQLRERDVEVVIAE(SEQ ID NO:8)
Cgl1935序列
ATGATCATCACATTCACCCCAAACCCGAGTATTGATTCCACGCTGTCGCTCGGCGAAGAGCTCTCCCGTGGATCCGTCCAACGACTTGATTCCGTCACCGCTGTCGCAGGTGGTAAAGGCATCAATGTCGCCCACGCTGTCTTGCTTGCGGGCTTTGAAACCTTGGCTGTGTTCCCAGCCGGCAAGCTCGACCCCTTCGTCCCACTGGTCCGCGACATCGGCTTGCCCGTGGAAACTGTTGTGATCAACAAGAACGTCCGCACCAACACCACAGTCACCGAACCGGACGGCACCACCACCAAGCTCAACGGCCCCGGCGCGCCGCTCAGCGAGCAGAAGCTCCGTAGCTTGGAAAAGGTGCTTATCGACGCGCTCCGCCCCGAAGTCACCTGGGTTGTCCTGGCGGGCTCGCTGCCACCAGGGGCACCAGTTGACTGGTACGCGCGTCTCACCGCGTTGATCCATTCAGCACGCCCTGACGTTCGCGTGGCTGTCGATACCTCAGACAAGCCACTGATGGCGTTGGGCGAGAGCTTGGATACACCTGGCGCTGCTCCGAACCTGATTAAGCCAAATGGTCTGGAACTGGGCCAGCTGGCTAACACTGATGGTGAAGAGCTGGAGGCGCGTGCTGCGCAAGGCGATTACGACGCCATCATCGCAGCTGCGGACGTACTGGTTAACCGTGGCATCGAACAGGTGCTTGTCACCTTGGGTGCCGCAGGAGCGGTGTTGGTCAACGCAGAAGGTGCGTGGACTGCTACTTCTCCAAAGATTGATGTTGTATCCACCGTTGGAGCTGGAGACTGTGCTCTTGCAGGTTTTGTTATGGCACGTTCCCAGAAGAAAACACTGGAGGAATCTCTGCTGAATGCCGTGTCTTACGGCTCGACTGCGGCGTCTCTTCCTGGCACTACCATTCCTCGTCCTGACCAACTCGCCACAGCTGGTGCAACGGTCACCCAAGTCAAAGGATTGAAAGAATCAGCATGA(SEQ ID NO:5)MIITFTPNPSIDSTLSLGEELSRGSVQRLDSVTAVAGGKGINVAHAVLLAGFETLAVFPAGKLDPFVPLVRDIGLPVETVVINKNVRTNTTVTEPDGTTTKLNGPGAPLSEQKLRSLEKVLIDALRPEVTWVVLAGSLPPGAPVDWYARLTALIHSARPDVRVAVDTSDKPLMALGESLDTPGAAPNLIKPNGLELGQLANTDGEELEARAAQGDYDAIIAAADVLVNRGIEQVLVTLGAAGAVLVNAEGAWTATSPKIDVVSTVGAGDCALAGFVMARSQKKTLEESLLNAVSYGSTAASLPGTTIPRPDQLATAGATVTQVKGLKESA(SEQ ID NO:6)
MIITFIPNPSIDSTLSLGEELSRGSVQRLDSVTAVAGGKGINVAHAVLLAGFETLAVFPAGKLDPFVPLVRDIGLPVETVVINKNVRTNTTVTEPDGTTTKLNGPGAPLSEQKLRSLEKVLIDALRPEVTWVVLAGSLPPGAPVDWYARLTALIHSARPDVRVAVDTSDKPLMALGESLDTPGAAPNLIKPNGLELGQLANTDGEELEARAAQGDYDAIIAAADVLVNRGIEQVLVTLGAAGAVLVNAEGAWTATSPKIDVVSTVGAGDCALAGFVMARSQKKTLEESLLNAVSYGSTAASLPGTTIPRPDQLATAGATVTQVKGLKESA(SEQ ID NO:9)
本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此,除非特殊说明,所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。
此外,从上述描述中,本领域技术人员可从本公开中很容易清楚本公开的关键特征,在不脱离本公开的精神及范围的情况下,可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件,因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。
Claims (12)
1.一种甲醇耐受性蛋白,其中,所述甲醇耐受性蛋白包含如下(i)-(iv)中任一项所示的序列:
(i)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的突变体序列,所述突变体序列在对应SEQ ID NO:2所示序列的第167位突变为非甘氨酸(G)的其它氨基酸;
(ii)如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的突变体序列,所述突变体序列在对应SEQ IDNO:4所示序列的第222位突变为非亮氨酸(L)的其它氨基酸;
(iii)如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的突变体序列,所述突变体序列在对应SEQ IDNO:6所示序列的第6位突变为非苏氨酸(T)的其它氨基酸;
(iv)与(i)~(iii)任一项所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性,且不包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示序列的突变体序列;
并且,包含如(i)-(iv)任一项所示序列的甲醇耐受性蛋白具有提高微生物的甲醇耐受性的蛋白活性。
2.根据权利要求1所述的甲醇耐受性蛋白,其中,所述(i)所示的突变体序列对应SEQID NO:2所示序列,包含如下的突变的氨基酸:第167位的氨基酸由甘氨酸(G)突变为精氨酸(R);或者
所述(ii)所示的突变体序列对应SEQ ID NO:4所示序列,包含如下的突变的氨基酸:第222位的氨基酸由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F);或者,
所述(iii)所示的突变体序列对应SEQ ID NO:6所示序列,包含如下的突变的氨基酸:第6位的氨基酸由苏氨酸(T)突变为异亮氨酸(I);
优选地,所述甲醇耐受性蛋白包含如SEQ ID NO:7-9任一序列所示的氨基酸序列。
3.一种多核苷酸,其编码如权利要求1-2任一项所述的甲醇耐受性蛋白。
4.一种核酸构建体,其中,所述核酸构建体包含权利要求3所述的多核苷酸,所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接;所述调控序列用于指导所述甲醇耐受性蛋白在宿主细胞中的表达。
5.一种重组表达载体,其中,所述重组表达载体包含权利要求3所述的多核苷酸,或权利要求4所述的核酸构建体。
6.一种重组微生物宿主细胞,其中,所述重组宿主细胞包含权利要求1-2任一项所述的甲醇耐受性蛋白,权利要求3所述的多核苷酸,权利要求4所述的核酸构建体,或者权利要求5所述的重组表达载体。
7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞,其中,所述宿主细胞来源于埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、肠道菌属(Enterobacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物;
优选的,所述宿主细胞来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);更优选的,所述宿主细胞来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
8.根据权利要求1-2任一项所述的甲醇耐受性蛋白,根据权利要求3所述的多核苷酸,根据权利要求4所述的核酸构建体或根据权利要求5所述的重组表达载体在如下(a)-(c)至少一项中的用途:
(a)提高微生物的甲醇耐受性,或制备用于提高微生物的甲醇耐受性的试剂或试剂盒;
(b)提高微生物的甲醇利用率,或制备用于提高微生物的甲醇利用率的试剂或试剂盒;
(c)制备生物转化甲醇的微生物,或制备用于制备生物转化甲醇的微生物的试剂或试剂盒。
9.一种甲醇耐受性或利用率提高的重组菌株,其中,所述重组菌株包含权利要求1-2任一项所述的甲醇耐受性蛋白,权利要求3所述的多核苷酸,权利要求4所述的核酸构建体,或者权利要求5所述的重组表达载体;可选地,所述菌株选自大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);优选地,所述菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
10.根据权利要求6-7任一项所述的重组宿主细胞,或根据权利要求9所述的重组菌株在生物转化甲醇,或生物转化甲醇以生产目标化合物中的用途。
11.一种提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法,其中,所述方法包括向微生物的细胞内引入如权利要求1-2任一项所述的甲醇耐受性蛋白,如权利要求3所述的多核苷酸,如权利要求4所述的核酸构建体,或者如权利要求5所述的重组表达载体的步骤;
可选地,所述微生物来源于埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、肠道菌属(Enterobacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)或棒状杆菌属(Corynebacterium);可选地,所述微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);优选的,所述微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
12.一种生产目标化合物的方法,其包括使用根据权利要求6-7任一项所述的重组宿主细胞,或根据权利要求9所述的重组菌株进行发酵反应,以生产目标化合物的步骤;其中,所述发酵反应的底物包含甲醇;
可选地,所述目标化合物包括氨基酸、有机酸中的至少一种;
可选地,所述氨基酸包括如下的一种或两种以上的组合:赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物;
可选地,所述有机酸包括如下的一种或两种以上的组合:柠檬酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、丁酸、棕榈酸、草酸、草酰乙酸、酒石酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸或上述的任一种的有机酸的衍生物;
任选地,所述方法还包括分离或纯化所述目标化合物的步骤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210833003.8A CN117402225A (zh) | 2022-07-14 | 2022-07-14 | 甲醇耐受性蛋白及提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210833003.8A CN117402225A (zh) | 2022-07-14 | 2022-07-14 | 甲醇耐受性蛋白及提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117402225A true CN117402225A (zh) | 2024-01-16 |
Family
ID=89496727
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210833003.8A Pending CN117402225A (zh) | 2022-07-14 | 2022-07-14 | 甲醇耐受性蛋白及提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117402225A (zh) |
-
2022
- 2022-07-14 CN CN202210833003.8A patent/CN117402225A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5254353B2 (ja) | 2−デオキシ−シロ−イノソース(doi)生産細菌及びこれを用いた2−デオキシ−シロ−イノソース(doi)生産方法 | |
CN113151127B (zh) | 一种l-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用 | |
US10415068B2 (en) | Microorganism for production of putrescine and methods for production of putrescine using the same | |
CN113249347B (zh) | 丙酮酸脱氢酶的突变体及其用于生产l-氨基酸的方法 | |
CN111411092B (zh) | 高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用 | |
CN112779203B (zh) | 高产l-半胱氨酸的基因工程菌及其构建与应用 | |
CN106164252B (zh) | 用于琥珀酸产生的改进微生物 | |
CN106701649B (zh) | 生产l-谷氨酰胺的菌株和生产l-谷氨酰胺的方法 | |
KR20230004466A (ko) | 황산화된 다당류의 제조 방법 및 paps의 제조 방법 | |
CN117402225A (zh) | 甲醇耐受性蛋白及提高微生物的甲醇耐受性或利用率的方法 | |
CN113278620A (zh) | 一种突变的高渗诱导型启动子PproP及其应用 | |
CN113122563A (zh) | 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法 | |
CN113201538A (zh) | 具有启动子活性的多核苷酸及其在生产目标化合物中的用途 | |
WO2016030373A1 (en) | Modified microorganism for improved production of fine chemicals on sucrose | |
WO2014171205A1 (ja) | アニリン生産性の向上したコリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるアニリンの製造方法 | |
CN115449518B (zh) | 基于mdh基因的具有启动子活性的多核苷酸及其用途 | |
JP7407941B2 (ja) | O-ホスホセリン排出タンパク質変異体、並びにそれを用いたo-ホスホセリン、システイン及びその誘導体の生産方法 | |
WO2022152036A1 (zh) | 具有启动子活性的多核苷酸及其在生产目标化合物中的用途 | |
CN117802020A (zh) | 一种提高缬氨酸产量的工程菌、生物材料及其应用 | |
CN116891868A (zh) | 一种渗透压耐受性功能基因鉴定方法及功能基因的应用 | |
CN117737021A (zh) | 突变型柠檬酸合酶及其应用 | |
CN116445379A (zh) | N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶的失活及其在生产谷氨酸中的应用 | |
CN115851802A (zh) | 谷氨酸高产菌株的构建方法及其在谷氨酸生产中的应用 | |
CN116004501A (zh) | Nadp-铁氧还蛋白还原酶突变体及其在生产谷氨酸中的应用 | |
CN116144564A (zh) | 一种谷氨酸生产菌株的构建方法及其在生产谷氨酸中的用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |