CN112779203B - 高产l-半胱氨酸的基因工程菌及其构建与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高产L‑半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法，以及其在微生物发酵制备L‑半胱氨酸中的应用。本发明通过(1)强化大肠杆菌L‑半胱氨酸合成途径中S‑Sulfocysteine转化为L‑半胱氨酸的效率(2)强化大肠杆菌L‑半胱氨酸合成途径中硫代硫酸根的利用率得到L‑半胱氨酸高产的大肠杆菌基因工程菌株，L‑半胱氨酸的产量从3.90g/L提升到了4.88g/L。

Description

高产L-半胱氨酸的基因工程菌及其构建与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法，以及其在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
(二)背景技术
半胱氨酸(cysteine，符号cys或c)有两种同分异构体：L-半胱氨酸和D-半胱氨酸。生物体内绝大部分是L-半胱氨酸，其是生物体内S元素主要的存在形式之一，其是很多含硫化合物的代谢来源。L-半胱氨酸是分子式为HSCH2CH(NH2)COOH的半必需氨基酸，因具有巯基侧链而通常作为亲核试剂参与某些酶促反应。L-半胱氨酸的巯基易于氧化生成胱氨酸，它们在维持蛋白质结构中起重要作用，此外，L-半胱氨酸在生物体内还具有多种的生理作用，如抗氧化，参与抗生素耐受，还和细胞的运动能力有重要的关系。但是高浓度的L-半胱氨酸对细胞也表现出一定的毒性。
目前国内L-半胱氨酸的生产主要有以下3种方法：化学合成法——以α-溴丙烯酸甲酯和硫脲为原料，反应得到2-甲基噻唑啉-4-羧酸甲酯，在进一步水解得到；毛发水解法——将毛发或者羽毛加工形成胱氨酸后，溶解在盐酸中，然后通过电解还原制得；酶催化法——第一步与化学合成法相同通过反应得到2-甲基噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)，在嗜噻唑假单胞菌的三种酶作用下不对称水解成L-半胱氨酸；综合考虑L-半胱氨酸现有生产方法的回收率和环境因素，以可再生的廉价基质用微生物发酵生产L-半胱氨酸受到越来越多的关注。而在德国Wacker公司实现了微生物发酵法产业化生产L-半胱氨酸。
随着微生物发酵技术的日益完善，人们开始使用细菌生产L-半胱氨酸，但因为野生菌株自身的代谢通路不足以高产L-半胱氨酸，所以需要通过代谢改造的方式来构建可以高产L-半胱氨酸的菌株。
(三)发明内容
本发明目的本发明目的是高产L-半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法，以及其在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建：
(1)以菌株E.coil CCTCC NO：M 20191026为底盘菌，在其基因组中的cysM基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM)；
(2)将工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM)基因组中的NrdH基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdH)；
(3)将工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdH)基因组中的cysW基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW)；
(4)将工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW)基因组中的HflC基因和cysM基因铆钉连接，得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW HflC-cysM)；
(5)在质粒上过表达glpE基因，转化到工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdHcysW HflC-cysM)中得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW HflC-cysM)/pglpE)F，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
优选的，所述基因工程菌为大肠杆菌ZJBSSC007(Escherichia coli ZJBSSC007)，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2020年12月3日，保藏编号：CCTCC NO：M 2020847。
本发明通过用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列置换cysM和NrdH的原有启动子，构建HflC-cysM蛋白，增强胞内L-半胱氨酸前体OAS的合成和 S-Sulfocysteine转化为L-半胱氨酸的效率；通过用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS 序列置换cysW的原有启动子，增强了菌体对硫元素的摄取效率；通过在质粒上过表达glpE基因增强了菌体对硫代硫酸根的使用效率。
本发明还涉及构建所述基因工程菌的方法，包括如下步骤：
(1)以菌株E.coil CCTCC NO：M 20191026为底盘菌，在其基因组中的cysM基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM)；
(2)将工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM)基因组中的NrdH基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdH)；
(3)将工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdH)基因组中的cysW基因的启动子替换为trc启动子，得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW)；
(4)将工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW)基因组中的HflC基因和cysM基因铆钉连接，得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW HflC-cysM)；
(5)在质粒上过表达glpE基因，转化到工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdHcysW HflC-cysM)中得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW HflC-cysM)/pglpE)F，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
具体的，所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至发酵培养基中，于25～30℃、180～200rpm条件下进行发酵培养，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述L-半胱氨酸。
所述发酵培养基组成如下：葡萄糖40～45g/L、(NH4)2SO4 5～10g/L、KH2PO4 0.5～2.0g/L、Na2S2O3 5～10g/L、酵母提取物8g/L,Na2HPO4·10H2O 1～5g/mL，0.5～2.0ml/L 微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；所述微量元素溶液组成如下：500g/L MgSO4·7H2O，5g/L FeSO4·7H2O,5g/L MnSO4·8H2O,5g/L ZnSO4，溶剂为去离子水。
优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖42g/L、(NH4)2SO49g/L、KH2PO4 1g/L、Na2S2O37g/L、酵母提取物8g/L,Na2HPO4·10H2O 2.52g/mL，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：500g/L MgSO4·7H2O，5g/L FeSO4·7H2O,5g/LMnSO4·8H2O,5g/L ZnSO4，溶剂为去离子水。
所述基因工程菌发酵前，通常先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm 的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到发酵培养基中培养。
本发明有益效果主要体现在：本发明通过(1)强化大肠杆菌L-半胱氨酸合成途径中S-Sulfocysteine转化为L-半胱氨酸的效率(2)强化大肠杆菌L-半胱氨酸合成途径中硫代硫酸根的利用率得到L-半胱氨酸高产的大肠杆菌基因工程菌株，L-半胱氨酸的产量从3.90g/L提高到了4.88g/L。
(四)附图说明
图1为L-半胱氨酸代谢途径图和本发明改造位点；
图2为实施例2构建工程菌OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量；
图3为实施例3构建工程菌OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量；
图4为实施例4构建工程菌OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量；
图5为实施例5构建工程菌OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量；
图6为实施例5构建工程菌OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明亲本E.coli菌株W3110 EYC来自中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 20191026，已在CN 111019877A中公开。
菌株E.coli W3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心(Coli Genetic Stock Center)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号CGSC#4474，已在专利US 2009/0298135A1， US2010/0248311A1中公开。
表1：基因编辑涉及的基因及相应途径
基因名称 涉及途径
metF 四氢叶酸的合成
fliY 半胱氨酸的内运
glyA 丝氨酸降解
GCV 甘氨酸降解
malY 蛋氨酸的合成
表2:引物序列
Figure BDA0002904362020000041
Figure BDA0002904362020000051
Figure BDA0002904362020000061
实施例中，如未特别说明，所述卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述壮观霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述氨苄霉素在培养基中终浓度为 0.10mg/L。
实施例1：L-半胱氨酸含量的测定
检测方法如下：
酸性茚三酮配制：称取250mg茚三酮加入6mL乙酸和4mL盐酸，配制成酸性茚三酮溶液。
样品处理：将样品浓度稀释到0.1～1g/L之间；
反应条件：分别取500μL样品、500μL乙酸和500μL酸性茚三酮混合，沸水浴 10min；
检测条件：将反应样品在OD560 nm处测定其OD560值。
实施例2：构建有效菌株E.coli W3110 EYC(Trc-cysM)及摇瓶发酵
以Escherichia coli W3110 EYC(CCTCC NO：M 20191026)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System.Applied EnvironmentalMicrobiology.81:2506-2514)，用来源于pTrc99A的trc启动子(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)，在基因组替换cysM的原有启动子，以增强cysM的表达强度。
(1)构建pTarget-cysM质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-cysM-F/pT-cysM-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-cysM 质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-cysM含Donor质粒：以E.coli W3110基因组为模版， pTD-cysM-up-F与pTD-cysM-up-R为引物扩增获得上游部分donor DNA(F1)， pTD-cysM-down-F和pTD-cysM-down-R为引物扩增获得下游部分donor DNA(F2)，胶回收纯化PCR片段得到F1和F2；以pTcysM质粒为模板，以pTD-line-F/pTD-line-R 为引物扩增质粒线性化片段，PCR产物经过DpnI在37℃保温消化3h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照(One step clone kit，VazymeBiotech，Nanjing，China)说明书将线性化pTarget-cysM质粒、片段F1和F2连接在一起，通过测序验证得到 pTD-cysM质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入E.coli W3110EYC中，挑选单克隆到含0.05mg/L卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mLLB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖， 150rpm、30℃培养至OD600 0.4～0.6；4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(3)取150ng pTD-cysM质粒与100μl电转感受态细胞混合，转入预冷的2mm 电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM，BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1mL LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5mL离心管中，30℃复苏2～3h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，30℃倒置培养18～20h，以cysM-VF和Trc-down为引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段600bp左右的片段，则证明是E.coli W3110EY(Trc-cysM)阳性菌落。
(4)pTarget和pCas质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L 卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含 0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落其pTarget-cysM质粒成功消除，挑取 pTarget-cysM质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB 平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含 0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒E.coli W3110EY(Trc-cysM)。
(5)将E.coli W3110EY(Trc-cysM)，以E.coli W3110EYC为对照组，分别接种到10mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养过夜；接种1mL预培养物到装有20mL 的SS培养基的500mL摇瓶中，然后在30℃、200rpm培养发酵到OD600＝0.8-1.0 时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养48h；发酵结束后取1mL发酵液测定 OD600，取1mL发酵液，12000rpm室温离心3min，将发酵上清稀释5倍，根据实施例1方法进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图2所示。
由图可见，基因组替换cysM基因启动子，L-半胱氨酸产量从3.90g/L增加到4.08g/L，这说明cysM表达的增强可有效增加前体物质OAS的合成，从而有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成。
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH 值自然。
SS发酵培养基组成如下：葡萄糖42g/L、(NH4)2SO49g/L、KH2PO4 1g/L、 Na2S2O37g/L、酵母提取物8g/L,Na2HPO4·10H2O 2.52g/mL，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：500g/L MgSO4·7H2O，5g/L FeSO4·7H2O,5g/L MnSO4·8H2O,5g/LZnSO4，溶剂为去离子水。
实施例3：构建有效菌株E.coli W3110EYC(Trc-cysM NrdH)及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-NrdH质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-NrdH-F/pT-NrdH-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-NrdH 质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-NrdH质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-NrdH-up-F、 pTD-NrdH-up-R、pTD-NrdH-down-F和pTD-NrdH-down-R为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-NrdH质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例2获得的E.coli W3110EY(trc-cysM)感受态中，E.coli W3110EY(trc-cysM)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到E coli W3110 EYC(trc-cysM NrdH)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒E coli W3110 EYC(trc-cysMNrdH)。
(6)将构建的E coli W3110 EYC(trc-cysM NrdH)生产菌株以实施例2构建的E.coli W3110 EYC(trc-cysM)为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图3所示。
由图可见，基因组替换NrdH基因启动子，L-半胱氨酸产量从4.08g/L增加到4.25g/L，这说明NrdH表达的增强可以提高S-Sulfocysteine转化为L-半胱氨酸的效率，从而有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成。
实施例4：构建有效菌株E.coli W3110EYC(Trc-cysM NrdH cysW)及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-cysW质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模板，以pT-cysW-F/pT-cysW-R为引物PCR扩增，PCR产物经过DpnI在37℃保温消化 3h，再转化到E.coil DH5α，壮观霉素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-cysW 质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-cysW质粒：以E.coil W3110基因组为模板，pTD-cysW-up-F、 pTD-cysW-up-R、pTD-cysW-down-F和pTD-cysW-down-R为引物，构建步骤同实施例 2(2)，得到pTD-cysW质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例3获得的E.coli W3110EY(trc-cysM NrdH)感受态中，E.coli W3110EY(trc-cysM NrdH)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到E coli W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒E coli W3110 EYC(trc-cysMNrdH cysW)。
(6)将构建的E coli W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW)生产菌株以实施例3 构建的E.coli W3110 EYC(trc-cysM NrdH)为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图4所示。
由图可见，基因组替换cysW基因启动子，L-半胱氨酸产量从4.25g/L增加到4.43g/L，这说明cysW表达的增强可有效增加菌体对硫元素的利用率，从而有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成。
实施例5：构建有效菌株E.coli W3110EYC(Trc-cysM NrdH cysW HflC-cysM)及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-HflCM质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-HflCM-F/pT-HflCM-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的 pTarget-HflCM质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-HflCM质粒：以E.coil W3110基因组为模板，pTD-HflC-up-F、 pTD-HflC-up-R、pTD-M-down-F、pTD-M-down-R、linker-F和linker-R为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-HflM质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例4获得的E.coli W3110EY(trc-cysM NrdH cysW)感受态中，E.coli W3110EY(trc-cysM NrdH cysW)感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到E coli W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW HflC-cysM)阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒E coli W3110 EYC(trc-cysMNrdH cysW HflC-cysM)。
(6)将构建的E coli W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW HflC-cysM)生产菌株以实施例4构建的E.coli W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW)为对照组，按照实施例2 (6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图5所示。
由图可见，将基因组的HflC与cysM铆钉后，L-半胱氨酸产量从4.43g/L增加到4.67g/L，这说明HflC和cysM的铆钉蛋白可以有效提高cysM的表达，从而有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成。
实施例6：过表达质粒pC glpE菌株的构建及其摇瓶发酵
(1)构建pC glpE质粒：在以之前构建的PEAmC质粒为模板，以 PEAmC-line-F/PEAmC-line-R为引物获得PCR线性扩增产物PEAmC-line质粒，PCR 产物经过Dpn I在37℃保温消化3h后用Clean up试剂盒回收DNA片段；在以 Corynebacterium glutamicum的基因组为模板，以p glpE-F/pglpE-R为引物获得PCR 扩增产物glpE，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将线性化PEAmC-line质粒、片段glpE连接在一起，将连接产物通过化学转化法转化到DH5α感受态中；最后挑选克隆子，通过测序验证得到pC glpE质粒。
(2)制备E coli W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW HflC-cysM)化学转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(3)将构建好的pC glpE质粒，通过化学转化法转化到E coli W3110 EYC(cysMNrdH cysW HflC-cysM)感受态中，获得E coli W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW HflC-cysM)/pEAmC glpE。
(4)将构建的生产菌株E coli W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW HflC-cysM) /pEAmC glpE以实施例5构建的E coli W3110 EYC(trc-cysM NrdH cysW)为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图6所示。
由图可见，在质粒上过表达glpE基因，L-半胱氨酸产量从4.67g/L增加到4.88g/L，这说明质粒上过表达glpE基因，有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 高产L-半胱氨酸的基因工程菌及其构建与应用
<160> 44
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtagaccac aacggttttc acacaggaaa 60
cagacc 66
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
ggctgttttg gcggatgaga g 21
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacttagtac agcagacggg cgc 53
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
gagcggataa caatttcaca caggaaacag accatgagct tttttcacgc cag 53
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
ctctcatccg ccaaaacagc cttataaacc aggtcgaacc c 41
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
gcgtgctaac tgcgctgaac 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
tactgccgcc aggcaaattc 20
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
taatactagt caaacagaca taacaacatt gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
gctctaaaac aatgttgtta tgtctgtttg actagtatta tacctaggac 50
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
cggtgctttt tttgaattct ctagatcgag atttcccgcc tggac 45
<210> 11
<211> 67
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
ccgctcacaa ttccacacat tatacgagcc ggatgattaa ttgtcaaatt caccccgaat 60
gttgtta 67
<210> 12
<211> 67
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 12
atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaccatg aaattagcac 60
atctggg 67
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 13
gggtaataga tctaagcttc tgcaggcaca tcgacgccct gaaca 45
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 14
ctgcagaagc ttagatctat taccc 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 15
tctagagaat tcaaaaaaag caccg 25
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 16
ggccttttgc tcacatgttc 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 42
tagcacgatc aacggcactg 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 43
atgaaattag cacatctggg 20
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 44
acacattata cgagccgg 18
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 17
taatactagt atgcatactg tccaggcata gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 18
gctctaaaac tatgcctgga cagtatgcat actagtatta tacctaggac 50
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 19
cggtgctttt tttgaattct ctagactgtg ctcggcgtca ccatc 45
<210> 20
<211> 67
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 20
ccgctcacaa ttccacacat tatacgagcc ggatgattaa ttgtcaatta tgcctggaca 60
gtatgca 67
<210> 21
<211> 67
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 21
atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaccatg ttcgattttt 60
caaaggt 67
<210> 22
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 22
gggtaataga tctaagcttc tgcaggattc tgtgggctac acagg 45
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 23
taatactagt gcaaaagaga acgattgcgt gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 24
gctctaaaac tatgcctgga cagtatgcat actagtatta tacctaggac 50
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 25
ggattccgcg atctgttttc 20
<210> 26
<211> 59
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 26
gtgaccacac attatacgag ccggatgatt aattgtcaaa ccgaaacaga ctgttaacc 59
<210> 27
<211> 59
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 27
atccggctcg tataatgtgt ggtcacaaag gagatataca tggcacaaca gactccttt 59
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 28
gaacggtttc atcccttcca 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 29
tctgccaggt gcagcgttag 20
<210> 30
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 30
taatactagt ggtatgaacc tggcgcatgg gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 31
gctctaaaac ccatgcgcca ggttcatacc actagtatta tacctaggac 50
<210> 32
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 32
cggtgctttt tttgaattct ctagaaacag ggcttcacgt tgatc 45
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 33
accgtttcgc ccgcatctcc tgactcagct 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 34
ggagatgcgg gcgaaacggt gatttgctgt 30
<210> 35
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 35
ctgcagaagc ttagatctat taccctggca aagtggagaa ccgtg 45
<210> 36
<211> 53
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 36
gagcggataa caatttcaca caggaaacag accatgacca ccagcccgac cag 53
<210> 37
<211> 41
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 37
ctctcatccg ccaaaacagc cttaccactg ttcatgctgc g 41
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 38
gtatatctcc ttggtcgcct atttaccact gttcatgctg cg 42
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 39
ggctgttttg gcggatgaga g 21
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 40
gcagaaatta ttgcaaccgc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 41
tactgccgcc aggcaaattc 20

Claims (4)

1.一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为大肠杆菌ZJBSSC007（Escherichia coli ZJBSSC007），保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2020年12月4日，保藏编号：CCTCC NO：M2020847。
2.权利要求1所述基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至发酵培养基中，于25～30℃、180～200rpm条件下进行发酵培养，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述L-半胱氨酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖40~45g/L、(NH4)2SO4 5~10g/L、KH2PO4 0.5~2.0g/L、Na2S2O3 5~10g/L、酵母提取物8g/L,Na2HPO4·10H2O1~5g/mL，0.5~2.0 ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；所述微量元素溶液组成如下：500g/L MgSO4·7H2O，5g/L FeSO4·7H2O,5g/L MnSO4·8H2O,5g/L ZnSO4，溶剂为去离子水。
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