CN101107356A

CN101107356A - 3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸的酶合成法

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Publication number: CN101107356A
Application number: CNA2006800028922A
Authority: CN
Inventors: 石毛和也; 野口利忠
Original assignee: Yamasa Corp
Current assignee: Yamasa Corp
Priority date: 2005-01-25
Filing date: 2006-01-24
Publication date: 2008-01-16
Anticipated expiration: 2026-01-24
Also published as: EP1842910A1; US9193958B2; WO2006080313A1; EP1842910A4; CA2595873C; KR101234513B1; CA2595873A1; US20140206042A1; JPWO2006080313A1; JP4505011B2; CN101107356B; KR20070104388A; US20090215114A1; EP2100956B1; EP2100956A1; US8728789B2

Abstract

本发明涉及PAPS的制造方法，它是使用腺苷5′－三磷酸硫酸化酶(ATPS)和腺苷5′－磷酸硫酸激酶(APSK)将ATP硫酸化和磷酸化而制造3′－磷酸腺苷－5′－磷酸硫酸(PAPS)的方法，其特征在于，利用由腺苷5′－单磷酸(AMP)、多磷酸、多磷酸依赖性核苷5′－二磷酸激酶(PNDK)和多磷酸：AMP磷酸转移酶(PAP)构成的腺苷5′－三磷酸(ATP)的供给·再生体系或者由腺苷5′－单磷酸(AMP)、多磷酸、多磷酸依赖性核苷5′－二磷酸激酶(PNDK)和腺苷酸激酶(ADK)构成的腺苷5′－三磷酸(ATP)的供给·再生体系代替ATP。

Description

3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸的酶合成法

技术领域

本发明涉及来源于耐热性细菌嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的腺苷5′-三磷酸硫酸化酶(adenosine 5′-triphosphate sulfurylase：ATPS)和腺苷5′-磷酸硫酸激酶(adenosine 5′-phosphosulfate kinase：APSK)、来源于绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的多磷酸依赖性核苷5′-二磷酸激酶(Polyphosphate-Driven Nucleoside Diphosphate Kinase：PNDK)、利用该PNDK的腺苷5′-三磷酸(adenosine 5′-triphosphate：ATP)供给·再生体系以及使该APTS和APSK与ATP供给·再生体系结合的实用的3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(3′-phosphoadenosine 5′-phosphosulfate：PAPS)的酶合成法。

背景技术

PAPS是从微生物到植物、高等动物在生物体内广泛被利用的硫酸供体。此外，也报道了以蛋白多糖疾病为代表的若干种疾病与PAPS的关联，PAPS在生物体内的作用非常重要，可以在药品等领域中得到利用。

作为PAPS的酶合成法，例如已知通过使用提取自面包酶和大鼠肝脏的ATPS和APSK这两种酶的2步反应由ATP进行制造的方法(下述式1和2)。

但是，通过该方法，仅能制造数毫克～数十毫克的PAPS，而且需要高价的ATP，不能说是产业上实用的方法。

(式1)

(式2)

(上述式中，ATP表示腺苷5′-三磷酸，ADP表示腺苷5′-二磷酸，APS表示腺苷5′-磷酸硫酸，PPi表示无机焦磷酸，SO₄ ^2-表示硫酸离子)

因此，为了实用性地生产PAPS，必须使用生产性和操作性良好的来源于微生物的酶(第1课题)，并且必须构筑不需要高价ATP的ATP供给·再生体系(第2课题)。

为了解决第1课题，恩田等报告了通过使用来源于芽孢杆菌属细菌或嗜热菌属细菌的热稳定性高的ATPS和APSK这2种酶，可以由2步反应高效地生产PAPS的技术方案(专利文献1～3)。

但是，为了实施恩田等的方法，必须从该耐热性细菌的菌体破碎液纯化ATPS和APSK。然而，这两种酶的细胞内含量低，因此存在需要大量的菌体培养且两种酶的纯化操作非常繁杂的问题。

另一方面，为了解决第2课题，伊吹等报告了使由乙酰磷酸和乙酸激酶构成的ATP再生体系与PAPS合成体系结合，将APSK反应中生成的ADP转化为ATP进行再利用的方法(非专利文献1)。

但是，因为反应最初依然使用高价的ATP作为底物，而且作为用于ATP再生的磷酸供体大量使用高价的乙酰磷酸，所以该方法无法成为实用性的方法。

目前，作为廉价的磷酸供体，已知有多磷酸(Poly P_n)，作为使用该多磷酸的源于腺苷5′-单磷酸(adenosine 5′-monophosphate：AMP)的ATP供给·再生体系，已知以下述式(3)和(4)表示的利用多磷酸激酶(PPK)和腺苷酸激酶(ADK)的协调作用的体系(专利文献4)以及以下述式(5)和(6)表示的利用多磷酸：AMP磷酸转移酶(PAP)和ADK的体系(专利文献5)。

(式3)

(式4)

(式5)

(式6)

(上述式中，ATP表示腺苷5′-三磷酸，ADP表示腺苷5′-二磷酸，AMP表示腺苷5′-单磷酸，Poly P_n表示多磷酸，n表示整数)

虽然该利用PPK和ADK的协调作用的ATP供给·再生体系在PAPS的酶合成中的应用已有报道(专利文献6)，但是仔细分析该方法后，发现PAPS的生成量最多也仅达到5mM左右。认真研究该低产量的原因后发现，利用PPK和ADK的协调作用的ATP供给·再生体系未有效地运作，难以使反应体系内的ATP浓度相对于ADP和AMP维持于主导地位，因此使PAPS生成的效率差。

PPK被认为在生物体内起到多磷酸合成酶的作用，以式(4)表示的该酶反应的平衡大幅偏向多磷酸合成侧(非专利文献2)。此外，已知由于其ATP合成活性微弱，因此利用该酶的ATP供给·再生体系虽然在例如底物浓度5mM左右以下的低浓度下的反应中良好地运作，但是在例如底物浓度超过10mM的高浓度下的反应中无法充分发挥作用。

此外，虽然未报道有将利用PAP和ADK的ATP供给·再生体系应用于PAPS的酶合成的例子，但是由于ADK完全可逆地催化式(6)的反应，因此如后述的比较例2所示，无法保持反应体系内的较高的ATP浓度，因而PAPS的生成效率差。

因此，为了实现PAPS的实用性的制造，必须构筑可将ATP浓度相对于ADP和AMP维持于主导地位的强力的新ATP供给·再生体系。

作为用于构筑这样的强力的ATP供给·再生体系的一种手段，考虑利用来源于绿脓杆菌的多磷酸依赖性核苷5′-二磷酸激酶。即，最近鉴定了来源于绿脓杆菌的PNDK(非专利文献3、4)，也获得了编码该酶的基因(非专利文献2、5)。

另外，该PNDK虽然表现出与PPK类似的多磷酸依赖性的ADP的磷酸化活性，但是其氨基酸序列与PPK完全不具有同源性，而且具有达到来源于大肠杆菌的PPK的100倍以上、来源于绿脓杆菌的PPK的约1000倍以上的明显更高的比活性(非专利文献2)，与PPK相比，多磷酸合成活性弱到事实上可以忽略的程度，反应平衡大幅偏向于ATP合成侧，因此认为作为用于ATP的供给·再生体系的酶是理想的。

然而，因为该酶在绿脓杆菌中的生产性低，所以为了在产业上利用该酶，需要利用基因重组技术克隆该酶的基因，将大肠杆菌等作为宿主，使该酶大量生产，但在本发明人过去进行的实验中，即使利用基因重组技术，该酶的生产性仍旧较低，该酶的实用化困难。

专利文献1：日本专利特许第3098591号

专利文献2：日本专利特许第3078067号

专利文献3：日本专利特许第3029915号

专利文献4：WO 98/48031

专利文献5：WO 03/100056

专利文献6：日本专利特开2002-78498号

非专利文献1：Nucleic Acids Symp.Ser.，27，171-172(1992)

非专利文献2：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99，16684-16688(2002)

非专利文献3：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，439-442(1997)

非专利文献4：Biochem.Biophys.Res.Commun.，281，821-826(2001)

非专利文献5：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99，16678-16683(2002)

发明的揭示

因此，为了确立实用的PAPS制造方法，本发明的目的最初在于从耐热性细菌嗜热脂肪地芽孢杆菌(原嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))染色体中发现编码ATPS和APSK的基因，使用重组DNA方法大量制造该酶。

接着，本发明的目的在于确立利用重组DNA技术的PNDK的高效生产。

最后，本发明的目的在于提供使用PNDK的非常强力的ATP供给·再生体系的构成以及使该ATP供给·再生体系与来源于耐热性细菌嗜热脂肪地芽孢杆菌的ATPS和APSK结合的PAPS的高效制造方法。

为了实现上述目的，本发明人反复认真研究后，首次从耐热性细菌嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体中发现编码ATPS和APSK的基因，使使用重组DNA方法大量制造该酶成为可能。另外，通过对高效生产该酶的大肠杆菌粗提取液实施加热处理，PAPS合成活性显著提高，由此不对该两种酶实施特别的纯化就可以实现高效的PAPS制造。

接着，对已经报道的编码由357个氨基酸残基构成的PNDK的多核苷酸进行精密检查，发现通过使用人为地使N末端侧的相当于数十个氨基酸残基的量的碱基序列缺失的DNA片段，该酶的生产性显著提高，作为目标的酶活性也不会失去。

然后，选择PAP作为磷酸化AMP而生成ADP的酶，选择上述的PNDK作为磷酸化ADP而生成·再生ATP的酶，发现通过组合两者，可以非常强力地由AMP供给ATP，而且可以使供给的ATP维持在高浓度(参照下述式7和8)。

(式7)

(式8)

另外，还发现使PNDK与ADK共存的情况、使PPK与ADK共存的情况与专利文献4同样，由于两者的协调作用产生多磷酸依赖性的AMP的磷酸化活性，生成的ADP通过PNDK单独的强力ADP磷酸化活性立即被转化为ATP，PNDK和ADK的组合果然可以起到基于AMP的强力的ATP供给·再生体系的作用(参照下述式9和10)。

(式9)

(式10)

而且，发现将由PAP和PNDK构成的ATP供给·再生体系或者由ADK和PNDK构成的ATP供给·再生体系中的任一种应用于使用来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的ATPS和APSKPAPS的PAPS的酶合成的情况下，在任一种ATP供给·再生体系中都使反应体系内的ATP浓度相对于ADP和AMP维持在主导地位，从而可以高效地合成PAPS。

因此，本发明具有如下的技术内容。

(1)由以序列编号1表示的碱基序列构成，编码来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的腺苷5′-三磷酸硫酸化酶(ATPS)的DNA片段。

(2)由以序列编号1表示的碱基序列中缺失、置换、插入或添加了1个或数个碱基的碱基序列构成，编码具有ATPS活性的酶的DNA片段。

(3)与上述(1)所述的DNA片段在严格条件下杂交，编码具有ATPS活性的酶的DNA片段。

(4)ATPS或具有ATPS活性的酶的调制方法，其特征在于，使用上述(1)～(3)所述的任一种DNA片段，通过重组DNA方法调制具有ATPS活性的粗酶，对得到的粗酶进行加热处理。

(5)在45～65℃下进行加热处理的上述(4)的调制方法。

(6)由以序列编号2表示的碱基序列构成，编码来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的腺苷5′-磷酸硫酸激酶(APSK)的DNA片段。

(7)由以序列编号2表示的碱基序列中缺失、置换、插入或添加了1个或数个碱基的碱基序列构成，编码具有APSK活性的酶的DNA片段。

(8)与上述(6)所述的DNA片段在严格条件下杂交，编码具有APSK活性的酶的DNA片段。

(9)APSK或具有APSK活性的酶的调制方法，其特征在于，使用上述(6)～(8)所述的任一种DNA片段，通过重组DNA方法调制具有APSK活性的粗酶，对得到的粗酶进行加热处理。

(10)在45～65℃下进行加热处理的上述(9)的调制方法。

(11)PAPS的制造方法，其特征在于，使用通过上述(4)所述的方法调制的ATPS和通过上述(9)所述的方法调制的APSK，由硫酸离子和腺苷5′-三磷酸(ATP)以酶法合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)。

(12)由以序列编号9表示的碱基序列中的101～1171构成的编码多磷酸依赖性核苷5′-二磷酸激酶(PNDK)的多核苷酸中，缺失N末端侧的相当于至少72个氨基酸残基的碱基序列的DNA片段。

(13)缺失相当于至少73个氨基酸残基的量的碱基序列的上述(12)所述的DNA片段。

(14)缺失相当于72个以上、87个以下的氨基酸残基的量的碱基序列的上述(12)所述的DNA片段。

(15)缺失相当于73个以上、83个以下的氨基酸残基的量的碱基序列的上述(12)所述的DNA片段。

(16)缺失相当于73、77、80或83个的氨基酸残基的量的碱基序列的上述(12)所述的DNA片段。

(17)由上述(12)～(16)中任一项的碱基序列中缺失、置换、插入或添加了1个或数个碱基的碱基序列构成，编码具有PNDK活性的酶的DNA片段。

(18)与上述(12)～(16)中任一项所述的DNA片段在严格条件下杂交，编码具有PNDK活性的酶的DNA片段。

(19)使用上述(12)～(18)所述的任一种DNA片段，通过重组DNA方法调制PNDK的PNDK的制造方法。

(20)通过上述(19)所述的方法调制的，具有序列编号10的缺失N末端侧的至少72个氨基酸的氨基酸序列的PNDK。

(21)由腺苷5′-单磷酸(AMP)、多磷酸、多磷酸依赖性核苷5′-二磷酸激酶(PNDK)和多磷酸：AMP磷酸转移酶(PAP)构成的腺苷5′-三磷酸(ATP)的供给·再生体系。

(22)由腺苷5′-单磷酸(AMP)、多磷酸、多磷酸依赖性核苷5′-二磷酸激酶(PNDK)和腺苷酸激酶(ADK)构成的腺苷5′-三磷酸(ATP)的供给·再生体系。

(23)PNDK来源于属于假单胞菌(Pseudomonas)属的微生物的上述(21)或(22)所述的ATP的供给·再生体系。

(24)PNDK为上述(20)所述的PNDK的上述(21)或(22)所述的ATP的供给·再生体系。

(25)PAP来源于属于不动杆菌(Acinetobacter)属的微生物的上述(21)或(22)所述的ATP的供给·再生体系。

(26)ADK来源于大肠杆菌或酵母的上述(21)或(22)所述的ATP的供给·再生体系。

(27)使用通过重组DNA方法转化了的转化体、该转化体的处理物或由该处理物得到的酶作为酶源的上述(21)或(22)所述的ATP的供给·再生体系。

(28)有用物质的制造方法，它是低成本且高效地制造通过将ATP作为能量源和/或底物进行消耗的酶反应生成的有用物质的方法，其特征在于，利用上述(21)～(26)中任一项所述的ATP的供给·再生体系替代ATP。

(29)通过将ATP作为能量源和/或底物进行消耗的酶反应生成的有用物质为3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)、糖核苷酸、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)中的任一种的上述(28)所述的有用物质的制造方法。

(30)PAPS的制造方法，它是使用腺苷5′-三磷酸硫酸化酶(ATPS)和腺苷5′-磷酸硫酸激酶(APSK)将ATP硫酸化和磷酸化而制造3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)的方法，其特征在于，利用上述(21)～(27)中任一项所述的ATP的供给·再生体系替代ATP。

(31)ATPS和APSK来源于属于地芽孢杆菌(Geobacillus)属的微生物的上述(30)所述的PAPS的制造方法。

(32)使用通过上述(4)所述的方法调制的ATPS和通过上述(9)所述的方法调制的APSK的上述(30)所述的PAPS的制造方法。

(33)在30～50℃的反应温度下进行PAPS的酶合成的上述(30)所述的PAPS的制造方法。

在来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的ATPS和APSK的氨基酸序列和碱基序列都完全未被报道的情况下，本发明人首次成功地克隆了对应于来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的ATPS和APSK的基因，由此可以通过基因工程的方法大量地制造来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的ATPS和APSK。此外，虽然通过基因工程得到的两种酶在活性上不足，但发现通过实施加热处理这一非常简便且实用的处理，两种酶的PAPS合成活性大幅提高，由此首次可以更简便且大量地制造PAPS。

此外，通过使用已经报道的PNDK的N末端侧的相当于至少72个氨基酸残基的碱基序列缺失的DNA片段，首次可以更简便且大量地制造具有N末端侧的相当于至少72个氨基酸残基的量缺失的氨基酸序列的PNDK。由于该N末端缺损的PNDK维持了PNDK本身的活性，因此利用该PNDK，可以构筑实用性的ATP合成·再生体系和GTP合成·再生体系。

另外，本发明的ATP合成·再生体系仅使用AMP、多磷酸等廉价的原料，将其应用于PAPS的合成的情况下，可以将反应体系内的ATP浓度相对于ADP和AMP维持在主导地位，能够以相对于AMP的转化率在60％以上的效率合成PAPS。该合成效率为应用以往的利用PPK和ADK的协调作用的ATP合成·再生体系时的5倍以上的效率，为应用利用PAP和ADK的ATP合成·再生体系时的1.5倍以上的效率。

另外，通过ATPS和APSK使用来源于属于地芽孢杆菌属的微生物的酶，PNDK使用来源于属于假单胞菌属的微生物的酶，PAP使用来源于属于不动杆菌属的微生物的酶，ADK使用来源于大肠杆菌或酵母的酶，即使在30～50℃的反应温度下也不会导致酶活性的下降，各酶协调，可以高效地合成PAPS

附图的简单说明

图1为表示不同时采用ATP供给·再生体系时的PAPS的经时的生成量的图(实施例1的(3))，■表示对照反应中的PAPS生成量，▲表示使用未加热处理的粗酶的反应中的PAPS生成量，●表示使用加热处理粗酶液的反应中的PAPS生成量。

图2为表示同时采用利用ADK和PNDK的本发明的ATP供给·再生体系的PAPS合成反应中的经时变化的图(实施例3的(7))。

图3为表示同时采用利用PAP和PNDK的本发明的ATP供给·再生体系的PAPS合成反应中的经时变化的图(实施例3的(8))。

图4为表示同时采用利用PPK和ADK的协调作用的以往的ATP供给·再生体系的PAPS合成反应中的经时变化的图(比较例1)。

图5为表示同时采用利用PAP和ADK的以往的ATP供给·再生体系的PAPS合成反应中的经时变化的图(比较例2)。

实施发明的最佳方式

(A)来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的ATPS和APSK

来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的ATPS和APSK分别为具有序列编号3和序列编号4中表示的氨基酸序列的酶或者具有序列编号3和序列编号4的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列的酶。

数个氨基酸的缺失是指例如30个氨基酸以内、较好是10个氨基酸以内的缺失。此外，数个氨基酸的置换是指例如25个氨基酸以内、较好是10个氨基酸以内的置换。另外，数个氨基酸的添加是指例如40个氨基酸以内、较好是20个氨基酸以内的添加。此外，氨基酸的缺失、置换或添加包括与序列编号3或序列编号4的氨基酸序列具有85％以上、更好是90％以上、特别好是95％以上的同源性的情况。即使是具有这些改变的情况下，也必须分别具有ATPS或APSK活性。

编码来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的ATPS和APSK的基因分别为具有基因序列编号1和序列编号2中表示的碱基序列的基因或者具有序列编号1和序列编号2的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或数个碱基的碱基序列的基因。作为具有缺失、置换或添加了1个或数个碱基的碱基序列的基因，可以例举与序列编号1或2的DNA片段在严格条件下杂交的基因。在这里，严格条件可以例举在含有0.1％SDS的0.2×SSC中50℃、含有0.1％SDS的1×SSC中60℃等条件。具有缺失、置换或添加了1个或数个碱基的碱基序列的基因包括与序列编号1或序列编号2的碱基序列具有85％以上、更好是90％以上、特别好是95％以上的同源性的基因。这样的基因例如可以通过以将序列编号1和序列编号2各自的两端部分的合成DNA作为引物、将嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体DNA作为模板的PCR法扩增目标基因的方法来获得。

分离了的各基因可以通过连接于载体DNA来保持于各种宿主-载体体系中。作为宿主，可以使用微生物、昆虫细胞、培养细胞等各种宿主。对于微生物，例如使用大肠杆菌的情况下，可以使用EK1类，使用酵母的情况下，可以使用SC1类。

使用微生物作为宿主的情况下，只要可以稳定地保持在菌体内，作为载体可以使用市售的任一种质粒。例如，使用大肠杆菌作为宿主的情况下，较好是使用pTrc99A(Amersham)等质粒。

通过将克隆了的基因(DNA片段)连接于特定的启动子序列的下游，可以大量地生产本发明的ATPS和APSK。例如，pTrc99A具有可表达诱导的trc启动子，通过在培养的中途将异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)添加入培养基，可以生产作为目标的ATPS和APSK。

转化体的培养通过通常的方法实施。即，若以属于芽孢杆菌属或大肠杆菌类的细菌为例进行说明，则培养基可以使用肉汤培养基、LB培养基(1％胰胨、0.5％酵母提取物、1％食盐)或2xYT培养基(1.6％胰胨、1％酵母提取物、0.5％食盐)等，可以在该培养基中接种种菌后，在30～50℃下根据需要一边搅拌一边培养10～50小时，将得到的培养液离心分离，回收微生物菌体。

可以将上述微生物菌体通过机械破坏(采用旋转搅拌机、弗氏压碎器、匀浆器、研钵等)、冻结溶解、自我消化、干燥(采用冷冻干燥、风干等)、酶处理(采用溶菌酶等)、超声波处理、化学处理(采用酸、碱处理等)等公知的方法进行破碎，把得到的菌体的破碎物或者菌体的细胞壁或细胞膜的变性物等菌体处理物用作本发明的ATPS和APSK的粗酶液。

这样得到的ATPS和APSK通过对上述粗酶液实施加热处理，可以提高PAPS合成活性。加热处理可以通过在45℃～65℃的温度下保温5分钟～1小时左右来实施，较好是在55℃下处理30分钟左右，这样比较有效果。

(B)来源于绿脓杆菌的PNDK

本发明中使用的DNA片段为由以序列编号9表示的碱基序列中的101～1171构成的编码PNDK的多核苷酸中缺失至少N末端侧的相当于72个氨基酸残基的碱基序列、较好是相当于73个氨基酸残基的碱基序列的DNA片段。

这样的DNA片段中，可以示例缺失相当于72个以上、87个以下的氨基酸残基的量的碱基序列的DNA片段，较好是缺失相当于73个以上、83个以下的氨基酸残基的量的碱基序列的DNA片段，更具体地可例举后述实施例中所示的缺失相当于73、77、80或83个的氨基酸残基的量的碱基序列的DNA片段。

如后述实施例中所详述地，通过使用对应于编码PNDK的ppk2结构基因的使相当于作为目标的氨基酸的部分缺失后的5′末端的合成DNA以及ppk2结构基因的3′末端部分的合成DNA这2种引物，以绿脓杆菌染色体DNA作为模板，以PCR法扩增目标DNA片段，从而可以获得这样的DNA片段。

分离了的各DNA片段可以通过连接于载体DNA来构筑各种宿主-载体体系，通过选择的宿主-载体体系中广泛使用的方法可以制造作为目标的本发明的PNDK。

制造本发明的PNDK时，作为宿主，可以使用微生物、昆虫细胞、培养细胞等各种宿主。例如，使用大肠杆菌的情况下，可以使用EK1类，使用酵母的情况下，可以使用SC1类。

通过将克隆了的基因(DNA片段)连接于特定的启动子序列的下游，可以大量地生产本发明的PNDK。例如，pTrc99A具有可表达诱导的trc启动子，通过在培养的中途将异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)添加入培养基，可以生产作为目标的PNDK。

转化体的培养通过常规方法实施。即，若以属于芽孢杆菌属或大肠杆菌类的细菌为例进行说明，则培养基可以使用肉汤培养基、LB培养基(1％胰胨、0.5％酵母提取物、1％食盐)或2xYT培养基(1.6％胰胨、1％酵母提取物、0.5％食盐)等，可以在该培养基中接种种菌后，在30～50℃下根据需要一边搅拌一边培养10～50小时，将得到的培养液离心分离，回收微生物菌体。

可以将上述微生物菌体通过机械破坏(采用旋转搅拌机、弗氏压碎器、匀浆器、研钵等)、冻结溶解、自我消化、干燥(采用冷冻干燥、风干等)、酶处理(采用溶菌酶等)、超声波处理、化学处理(采用酸、碱处理等)等公知的方法进行破碎，把得到的菌体的破碎物或者菌体的细胞壁或细胞膜的变性物等菌体处理物用作本发明的PNDK的粗酶液。

此外，也可以根据情况从上述菌体处理物中通过通常的酶纯化方法(盐析处理、等电点沉淀处理、有机溶剂沉淀处理、透析处理、各种层析法处理等)纯化具有PNDK活性的组分，制成部分纯化酶或纯化酶使用。

这样调制的本发明的PNDK为具有对应于使用的DNA片段缺失了序列编号10的N末端侧的相当于至少72个氨基酸残基的部分的氨基酸序列的PNDK。

(C)ATP供给·再生体系

作为本发明的ATP供给·再生体系，包括(i)由AMP、多磷酸、PNDK和PAP构成的ATP的供给·再生体系以及(ii)由AMP、多磷酸、PNDK和ADK构成的ATP的供给·再生体系。在这里，本发明的ATP供给·再生体系包含构成ATP供给·再生体系的试剂。

PAP、ADK和PNDK都是公知的酶，并不限定于动物来源、植物来源、微生物来源等特定的来源。从酶调制的简便程度来看，较好是使用微生物来源的酶。此外，也可以利用近年来的基因重组技术克隆该基因，以大肠杆菌等为宿主大量生产，由得到的重组菌调制该酶。

其中，较好是PNDK使用来源于属于假单胞菌属的微生物的酶，PAP使用来源于属于不动杆菌属的微生物的酶，ADK使用来源于大肠杆菌或酵母的酶。

添加于反应体系中的上述各酶只要具有所需的活性，可以是任意的形态，具体可以示例微生物的菌体(包括转化体)、该菌体的处理物或由该处理物得到的酶等。微生物的菌体的调制可以通过使用该微生物可生长的培养基，以通常的方法培养后以离心分离等收集菌体的方法来实施。若具体以属于芽孢杆菌属或大肠杆菌类的细菌为例进行说明，则培养基可以使用肉汤培养基、LB培养基(1％胰胨、0.5％酵母提取物、1％食盐)或2xYT培养基(1.6％胰胨、1％酵母提取物、0.5％食盐)等，可以在该培养基中接种种菌后，在30～50℃下根据需要一边搅拌一边培养10～50小时，将得到的培养液离心分离，回收微生物菌体。

作为微生物的菌体处理物，可以示例将上述微生物菌体通过机械破坏(采用旋转搅拌机、弗氏压碎器、匀浆器、研钵等)、冻结溶解、自我消化、干燥(采用冷冻干燥、风干等)、酶处理(采用溶菌酶等)、超声波处理、化学处理(采用酸、碱处理等)等一般的处理方法进行处理而得到的菌体的破碎物或者菌体的细胞壁或细胞膜的变性物。

作为酶，可以示例由上述菌体处理物对具有所需的酶活性的组分实施通常的酶纯化方法(盐析处理、等电点沉淀处理、有机溶剂沉淀处理、透析处理、各种层析法处理等)而得到的粗酶或纯化酶。

本发明的ATP供给·再生体系中添加的AMP(市售品)、多磷酸(市售品)、各种酶(PAP、PNDK和ADK)的浓度虽然根据应用ATP供给·再生体系的有用物质的不同而不同，但AMP可以在例如1～200mM、较好是10～100mM的范围内适当设定，多磷酸可以在换算为无机磷酸时在1～1000mM、较好是50～500mM的范围内适当设定，酶浓度可以在0.001单位/mL以上、较好是在0.001～10单位/mL的范围内适当设定。

作为可应用这样的ATP供给·再生体系的有用物质，只要是通过将ATP作为能量源和/或底物进行消耗的酶反应生成的有用物质即可，具体可以示例PAPS、糖核苷酸、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)等。

(D)PAPS的酶合成

PAPS的酶合成反应为，由ATP和硫酸离子通过ATPS的催化作用将ATP的5′-磷酸硫酸化(式1)，以ATP为磷酸供体通过APSK的催化作用将生成的腺苷-5′-磷酸硫酸的3′-羟基磷酸化(式2)。

(式1)

(式2)

反应中添加的ATP可以使用市售的产品。作为使用浓度，在例如1～200mM、较好是1～20mM的范围内适当设定即可。此外，作为反应中添加的硫酸根供体，只要是在反应液中生成硫酸离子的物质即可，可以使用市售的硫酸钠或硫酸镁等硫酸盐。作为使用浓度，在例如1～200mM、较好是10～100mM的范围内适当设定即可。

可以通过在pH4～9的范围内的适当的缓冲液中添加ATP和硫酸盐，再添加0.001单位以上、较好是0.001～1.0单位的ATPS以及0.001单位以上、较好是0.001～1.0单位的APSK，在20℃以上、较好是30～50℃的温度下根据需要一边搅拌一边反应1～50小时左右，从而实施PAPS的合成。

此外，也可以不使用ATP而并用前述的ATP供给·再生体系。

即，可以通过在pH4～9的范围内的适当的缓冲液中添加AMP、硫酸根供体和多磷酸，再添加0.001单位/mL以上、较好是0.001～10单位/mL的PAP，0.001单位/mL以上、较好是0.001～10单位/mL以上的PNDK，0.001单位以上、较好是0.001～10单位的ATPS以及0.001单位以上、较好是0.001～10单位的APSK，在20℃以上、较好是30～50℃的温度下根据需要一边搅拌一边反应1～100小时左右，从而实施应用由AMP、多磷酸、PNDK和PAP构成的ATP供给·再生体系的PAPS的合成。

此外，可以通过在pH4～9的范围内的适当的缓冲液中添加AMP、硫酸根供体和多磷酸，再添加0.001单位/mL以上、较好是0.001～10单位/mL的ADK，0.001单位/mL以上、较好是0.001～10单位/mL以上的PNDK，0.001单位以上、较好是0.001～10单位的ATPS以及0.001单位以上、较好是0.001～10单位的APSK，在20℃以上、较好是30～50℃的温度下根据需要一边搅拌一边反应1～100小时左右，从而实施应用由AMP、多磷酸、PNDK和ADK构成的ATP供给·再生体系的PAPS的合成。

另外，在上述任一种反应中，因为由ATPS反应生成的焦磷酸可能会引起生成物抑制，所以通过添加0.001单位/mL以上、较好是0.001～10单位/mL的无机焦磷酸酶(Inorganic Pyrophosphatase)，可以使合成效率提高。

反应后，反应液中生成的PAPS可以通过使用活性炭或离子交换树脂等的常规的层析处理方法进行分离纯化。

实施例

以下，示例实施例对本发明进行详细且具体的说明，但应理解本发明并不限定于以下的例子。此外，实施例中的DNA的调制、采用限制性酶的剪切、采用T4DNA连接酶的DNA连接以及大肠杆菌的转化方法全部按照《分子克隆实验室手册》第二版(“Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Second Edition”)(Maniatis等编，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1989))实施。此外，反应液中的核苷酸类的定量通过HPLC法实施。具体来说，分离使用YMC公司制的ODS-AQ312柱，洗脱液使用0.5M磷酸二氢钾溶液。

实施例1

(1)ATPS基因和APSK基因的鉴定

虽然来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的ATPS基因和APSK基因未经鉴定，但该菌菌株10的基因组DNA的部分碱基序列已被公开(登录号NC_002926)。因此，利用网络服务(http://www．ncbi．nlm．nih.gov/genomes/geblast.cgi？gi＝5025&tax＝272567)，在已公开的该株基因组DNA的部分序列中用tBLASTn程序检索是否存在可编码与来源于枯草杆菌的公知的ATPS(登录号CAA04411)类似的氨基酸序列的开放阅读框(以下简称ORF)的DNA区域。

其结果为，判明该株染色体中存在可编码氨基酸序列与来源于枯草杆菌的ATPS类似的ORF的DNA区域。另外，在该基因的下游发现可编码氨基酸序列与来源于枯草杆菌的APSK(登录号CAA04412)类似的ORF的DNA区域。它们分别被期待是该菌中的ATPS基因和APSK基因。

因此，通过以下所示的PCR法扩增被期待为该菌ATPS基因的DNA片段。即，使用下述(A)和(B)的引物，使用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制DNA热循环仪，对0.1mL反应液(50mM氯化钾、10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、嗜热脂肪地芽孢杆菌TH6-2株(FERM BP-2758)的染色体DNA0.1μg、2种引物DNA各0.2μM、ExTaqDNA聚合酶2.5单位)重复热变性(94℃、1分钟)、退火(55℃、1分钟)、聚合(72℃、2分钟)的步骤30次。另外，该TH6-2株以嗜热脂肪芽孢杆菌TH6-2的名称在1989年2月4日作为FERM BP-2758保藏于

305-8566日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6、独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。另外，由于嗜热脂肪芽孢杆菌现在更名为嗜热脂肪地芽孢杆菌，因此为以防万一，将同一株以嗜热脂肪地芽孢杆菌TH6-2的名称在2005年12月7日作为FERM BP-10466保藏于前述的专利生物保藏中心。

(A)5′-TTGAATTCCTTGCCTCATGAACATGGCAGC-3′(序列编号5)

(B)5′-TACTGCAGGCTCATCGCGATCCTCCTTTAG-3′(序列编号6)

此外，通过使用(C)和(D)这2种引物DNA的与上述同样的PCR法扩增被期待为该菌APSK基因的DNA片段。

(C)5′-TTGAATTCCGCTAAAGGAGGATCGCGATGA-3′(序列编号7)

(D)5′-TTCTGCAGCGACCTTGTCAAATGACCTCCC-3′(序列编号8)

各基因扩增后，以苯酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，在水溶性部分中添加2倍容积的乙醇，使DNA沉淀。将沉淀回收的DNA按照文献(《分子克隆实验室手册》第二版，前述)通过琼脂糖凝胶电泳分离，纯化各DNA片段。将该DNA分别用限制性酶EcoR I和Pst I切断，使用同样用限制性酶EcoR I和Pst I消化了的质粒pTrc99A(从Pharmacia Biotech公司购得)和T4DNA连接酶连接。使用各自的连接反应液转化大肠杆菌JM109菌，从得到的氨苄青霉素抗性转化体分离质粒pTrc-ylnB和pTrc-ylnC。

质粒pTrc-ylnB为承载来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌TH6-2株的含ATPS基因的DNA片段的质粒，质粒pTrc-ylnC为承载来源于同株的含APSK基因的DNA片段的质粒。分析克隆的两基因的碱基序列的结果为，该菌ATPS基因是序列编号1中所示的DNA碱基序列，该菌APSK基因是序列编号2中所示的DNA碱基序列。将这些DNA碱基序列翻译成氨基酸序列的结果为，该菌ATPS是序列编号3中所示的氨基酸序列，该菌APSK是序列编号4中所示的氨基酸序列。该菌ATPS显示与来源于枯草杆菌的同种酶有68％的氨基酸序列同源性，该菌APSK显示与来源于枯草杆菌的同种酶有63％的氨基酸序列同源性。

(2)ATPS和APSK粗酶液的调制

将大肠杆菌JM109株分别以pTrc99A载体、pTrc-ylnB和pTrc-ylnC转化，将得到的转化体接种到100mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的2xYT培养基中，在30℃下振荡培养。达到4×10⁸个菌/mL时，在培养液中添加IPTG至0.4mM的最终浓度，再继续在30℃下振荡培养一晚。培养结束后，通过离心分离(10000×g，10分钟)回收菌体，悬浮于10mL的缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5mM EDTA、1mM2-巯基乙醇)中后，进行超声波处理，破碎菌体，再通过离心分离(10000×g，10分钟)除去菌体残渣。将这样得到的上清部分作为粗酶液。

如下所述测定各粗酶液中的ATPS活性。即，在最终浓度分别达到Tris-HCl缓冲液(pH8)50mM、硫酸镁20mM、ATP1mM的反应混合液中添加1单位/mL的焦磷酸酶(Roche Diagnostics公司)、1单位/mL的APSK(Calbiochem公司)和酶液，在37℃下保温10分钟后，通过加入经冰冷的0.5M磷酸二氢钠溶液停止反应。通过HPLC测定生成的PAPS的量，将1分钟生成1μ mol的PAPS的ATPS的量作为1单位。

此外，如下所述测定APSK活性。即，在最终浓度分别达到Tris-HCl缓冲液(pH8)50mM、硫酸镁20mM、ATP 1mM的反应混合液中添加1单位/mL的焦磷酸酶(Roche Diagnostics公司)、1单位/mL的ATPS(Calbiochem公司)和酶液，在37℃下保温10分钟后，通过加入经冰冷的0.5M磷酸二氢钠溶液停止反应。通过HPLC测定生成的PAPS的量，将1分钟生成1μ mol的PAPS的APSK的量作为1单位。

[表1]

菌株	ATPS活性(单位/加L)	ATPS比活性(单位/mg)
菌株	ATPS活性(单位/加L)	ATPS比活性(单位/mg)	JM109/pTrc99A	＜0.1	＜0.01
JM109/pTrc-ylnB	58	3.4	JM109/pTrc99A	＜0.1	＜0.01

[表2]

菌株	APSK活性(单位/mL)	APSK.比活性(单位/mg)
菌株	APSK活性(单位/mL)	APSK.比活性(单位/mg)	JM109/pTrc99A	＜0.1	＜0.01
JM109/pTrc-ylnC	2.5	0.19	JM109/pTrc99A	＜0.1	＜0.01

(3)使用ATPS粗酶液和APSK粗酶液的PAPS的合成

在最终浓度分别达到Hepes缓冲液(pH8)50mM、氯化镁25mM、硫酸钠100mM、ATP50mM的反应混合液中添加5单位/mL的焦磷酸酶(Roche公司制)、0.2％容量的ATPS粗酶液、0.5％容量的APSK粗酶液，在37℃下保温。

此外，调制代替两种粗酶液添加了与上述相同容量的同种的加热处理粗酶液(将各粗酶液在调温至55℃的水槽中浸30分钟后，在室温下静置30分钟，通过离心分离而得到的上清)的反应混合液，同样地保温。另外，调制代替两种粗酶液添加了与上述相同容量的通过保持pTrc99A的大肠杆菌JM109株调制的粗酶液的反应混合液，同样地保温。

这些反应中的PAPS的生成量的经时变化示于图1。其结果为，除对照以外的所有反应中，都确认了PAPS的经时生成，但使用ATPS和APSK加热处理粗酶液的反应中，与使用未加热处理的同种粗酶液的情况相比，PAPS合成效率明显较高，在各时间点显示出2～3倍的PAPS生成量。反应开始10小时后的限定于1/2ATP的转化率在使用两种加热处理粗酶液的反应的情况下为75％，而使用未加热处理的同种粗酶液的情况下仅为38％。

实施例2

(1)编码N末端区域的氨基酸残基缺失的PNDK的基因的克隆

通过齐藤和三浦的方法(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))调制绿脓杆菌PAO1株(ATCC BAA-47)的染色体DNA。接着，按照常规方法合成表3所示的12种引物DNA，通过以表4所示的1～11的组合使用2种引物DNA、将上述染色体DNA作为模板的PCR法，扩增编码N末端区域的氨基酸残基以各种程度缺失的PNDK的基因。另外，绿脓杆菌PAO1株可从ATCC获得。

[表3]

名称	序列
名称	序列	PPK2F1PPK2F2PPK2F4PPK2F5PPK2F6PPK2F7PPK2F8PPK2F9PPK2F10PPK2F11PPK2F13PPK2R1	5’-TTCCATGGGAGAGGTGTAAGGCTTTCCT-3’(序列编号11)5’-AACCATGGGCGAAGAACCCACTGTCAGT-3’(序列编号12)5’-AACCATGGCGGTGGCCCTGCAGGTCGCC-3’(序列编号13)5’-AACCATGGGCAGCGAGGACAGCACCTCG-3’(序列编号14)5’-AACCATGGACTATCCCTATCACACGCGG-3’(序列编号15)5’-AACCATGGCGCGGATGCGCCGCAACGAG-3’(序列编号16)5’-AACCATGGACGAGTACGAGAAGGCCAAG-3’(序列编号17)5’-TTCCATGGAGGTGCAGAGCTGGGTGAAG-3’(序列编号18)5’-TTCCATGGACAGCACCTCGGCGAGCCT-3’ (序列编号19)5’-TTCCATGGCGAGCCTGCCGGCGAACTAT-3’(序列编号20)5’-TTCCATGGTGCCGGCGAACTATCCCTATC-3’(序列编号21)5’-TTGGATCCTGCCGTACAAGCAGATCGTG-3’(序列编号22)

[表4]

组合编号	DNA引物	质粒
组合编号	DNA引物	质粒	1234567891011	PPK2F1 和PPK2R1PPK2F2 和PPK2R1PPK2F4 和PPK2R1PPK2F5 和PPK2R1PPK2F10 和PPK2R1PPK2F11 和PPK2R1PPK2F13 和PPK2R1PPK2F6 和PPK2R1PPK2F7 和PPK2R1PPK2F8 和PPK2R1PPK2F9 和PPK2R1	pTrc-ppk2pTrc-ppk2N3pTrc-ppk2N60pTrc-ppk2N72pTrc-ppk2N74pTrc-ppk2N78pTrc-ppk2N81pTrc-ppk2N84pTrc-ppk2N89pTrc-ppk2N94pTrc-ppk2N109

采用PCR的编码N末端区域缺失PNDK的基因的扩增如下实施。即，使用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制DNA热循环仪，对100mL反应液(50mM氯化钾、10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、模板DNA0.1μg、表4中表示的组合1～11的2种引物DNA各0.2μM、ExTaqDNA聚合酶2.5单位)重复热变性(94℃、1分钟)、退火(55℃、1.5分钟)、聚合(72℃、1.5分钟)的步骤30次。

各基因扩增后，以苯酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，在水溶性部分中添加2倍容积的乙醇，使DNA沉淀。将沉淀回收的DNA按照文献(《分子克隆实验室手册》第二版，前述)的方法通过琼脂糖凝胶电泳分离，纯化0.9～1.3kb左右的各DNA片段。将该DNA分别用限制性酶NcoI和BamHI切断，使用同样用限制性酶NcoI和BamHI消化了的质粒pTrc99A(从Pharmacia Biotech公司购得)和T4DNA连接酶连接。

使用各自的连接反应液转化大肠杆菌JM109菌，从得到的氨苄青霉素抗性转化体分离各质粒(pTrc-ppk2、pTrc-ppk2N3、pTrc-ppk2N60、pTrc-ppk2N72、pTrc-ppk2N74、pTrc-ppk2N78、pTrc-ppk2N80、pTrc-ppk2N81、pTrc-ppk2N84、pTrc-ppk2N89、pTrc-ppk2N94和pTrc-ppk2N109)。

质粒pTrc-ppk2为含有编码全长的PNDK的基因的Nco I-BamH I DNA片段插入于pTrc99A的trc启动子下游的Nco I-BamH I剪切位点的质粒，pTrc-ppk2N3为插入的DNA片段所含的基因编码缺失N末端侧2个氨基酸残基的PNDK(以下称为PNDKN3)的质粒，pTrc-ppk2N60为插入的DNA片段所含的基因编码缺失N末端侧59个氨基酸残基的PNDK(以下称为PNDKN60)的质粒，pTrc-ppk2N72为插入的DNA片段所含的基因编码缺失N末端侧71个氨基酸残基的PNDK(以下称为PNDKN72)的质粒，pTrc-ppk2N74为插入的DNA片段所含的基因编码缺失N末端侧73个氨基酸残基的PNDK(以下称为PNDKN74)的质粒，pTrc-ppk2N78为插入的DNA片段所含的基因编码缺失N末端侧77个氨基酸残基的PNDK(以下称为PNDKN78)的质粒，pTrc-ppk2N81为插入的DNA片段所含的基因编码缺失N末端侧80个氨基酸残基的PNDK(以下称为PNDKN81)的质粒，pTrc-ppk2N84为插入的DNA片段所含的基因编码缺失N末端侧83个氨基酸残基的PNDK(以下称为PNDKN84)的质粒，pTrc-ppk2N89为插入的DNA片段所含的基因编码缺失N末端侧88个氨基酸残基的PNDK(以下称为PNDKN89)的质粒，pTrc-ppk2N94为插入的DNA片段所含的基因编码缺失N末端侧93个氨基酸残基的PNDK(以下称为PNDKN94)的质粒，pTrc-ppk2N104为插入的DNA片段所含的基因编码缺失N末端侧103个氨基酸残基的PNDK(以下称为PNDKN104)的质粒。

(2)各种N末端区域缺失PNDK的粗酶液的调制

将保持上述的各质粒的大肠杆菌接种到300mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的2xYT培养基中，在37℃下振荡培养。达到4×10⁸个菌/mL时，在培养液中添加IPTG至1mM的最终浓度，再继续在37℃下振荡培养5小时。培养结束后，通过离心分离(10000×g，10分钟)回收菌体，悬浮于30mL的缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.5mM EDTA、1mM2-巯基乙醇)中后，进行超声波处理，破碎菌体，再通过离心分离(10000×g，10分钟)除去菌体残渣。将这样得到的上清部分作为粗酶液。

(3)各种N末端区域缺失PNDK的粗酶液的活性测定

将上述的粗酶液中的PNDK活性的单位以如下的方法测定，算出。即，分别在含10mM氯化镁、80mM硫酸铵、10mM ADP和多磷酸(以无机磷酸计为30mM)的50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)中添加上述的粗酶液，通过在37℃下保温进行反应，通过100℃、1分钟的热处理停止反应。使用高效液相色谱(HPLC)对反应液中的ATP进行定量，将在37℃下1分钟生成1μmol的ATP的活性作为1单位。上述的各种N末端区域缺失PNDK的粗酶液中的PNDK活性示于表5。

[表5]

粗酶液	PNDK活性(单位/mL粗酶液)
粗酶液	PNDK活性(单位/mL粗酶液)	PNDK(对照)PNDKN3PNDKN60PNDKN72PNDKN74PNDKN78PNDKN81PNDKN84PNDKN89PNDKN94PNDKN109	7.17.35.28.660.584.329.21914.93.81.2

因为各PNDK的比活性不会有特别大的变化，所以由上述表5可知，通过使用缺失相当于73个以上、83个以下的氨基酸残基的部分的碱基序列的DNA片段，可以大量地调制PNDK。

实施例3

(1)PNDK的调制

来源于绿脓杆菌的PNDK的调制如实施例2所述。

(2)PPK的调制

以文献(J.Biosci.Bioeng.，91，557-563(2001))中记载的方法调制大肠杆菌PPK。

PPK的活性单位以如下的方法算出。即，在含10mM氯化镁、80mM硫酸铵、10mM ADP和多磷酸(以无机磷酸计为30mM)的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中添加酶试样液，在37℃下保温10分钟后，通过在沸腾水浴中处理1分钟停止反应。使用高效液相色谱(HPLC)对反应液中的ATP进行定量，将1分钟生成1μmol的ATP的活性作为1单位。

(3)PAP的调制

以文献(WO 03/100056)中记载的方法调制来源于约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)的PAP。

PAP的活性单位以如下的方法算出。即，在含10mM氯化镁、80mM硫酸铵、10mM AMP和多磷酸(以无机磷酸计为30mM)的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中添加酶试样液，在37℃下保温10分钟后，通过在沸腾水浴中处理1分钟停止反应。使用高效液相色谱(HPLC)对反应液中的ATP进行定量，将1分钟生成1μmol的ADP的活性作为1单位。

(4)ADK的调制

以文献(Proc.Natl.Acad.Sci.美国，97，14168-14171(2000))中记载的方法调制大肠杆菌ADK。

ADK的活性单位以如下的方法算出。即，在含10mM氯化镁、10mM AMP和10mMATP的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中添加酶试样液，在37℃下保温10分钟后，通过在沸腾水浴中处理1分钟停止反应。使用高效液相色谱(HPLC)对反应液中的ATP进行定量，将1分钟生成2μmol的ADP的活性作为1单位。

(5)无机焦磷酸酶的调制

无机焦磷酸酶使用Roche Diagnostics公司的产品。

无机焦磷酸酶的活性单位以如下的方法算出。即，在含10mM氯化镁和10mM无机焦磷酸的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中添加酶试样液，在37℃下保温10分钟后，通过在沸腾水浴中处理1分钟停止反应。通过钼蓝(molybdenum blue)法(《分析化学大全(Treatise on Analytical Chemistry)》，I.M.Kolthoff和P.J.Elving编，第5卷，317～402页，Interscience，纽约(1961))对生成的无机磷酸的量进行定量，将1分钟生成2μmol的无机磷酸的无机焦磷酸酶的量作为1单位。

(6)ATPS和APSK的调制

来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的ATPS和APSK的调制如实施例1中所述。

(7)同时使用利用ADK和PNDK的本发明的ATP供给·再生体系的PAPS合成

在含25mM氯化镁、20mMAMP、100mM硫酸钠、多磷酸(以无机磷酸计为100mM)的50mM Hepes-KOH缓冲液(pH8.0)中添加ADK(0.1单位/mL)、PNDK(0.1单位/mL)、ATPS(0.25单位/mL)、APSK(0.25单位/mL)和无机焦磷酸酶(1.0单位/mL)，在37℃保温。反应液组成的经时变化示于图2。该反应中，生成的ATP浓度相对于ADP和AMP升高，48小时后的PAPS生成量为12.0mM(相对于AMP的转化率为60％)。

(8)同时使用利用PAP和PNDK的本发明的ATP供给·再生体系的PAPS合成

在含25mM氯化镁、20mM AMP、100mM硫酸钠、多磷酸(以无机磷酸计为100mM)的50mM Hepes-KOH缓冲液(pH8.0)中添加PAP(0.1单位/mL)、PNDK(0.1单位/mL)、ATPS(0.25单位/mL)、APSK(0.25单位/mL)和无机焦磷酸酶(1.0单位/mL)，在37℃保温。反应液组成的经时变化示于图3。该反应中，生成的ATP浓度也相对于ADP和AMP升高，48小时后的PAPS生成量为12.3mM(相对于AMP的转化率为62％)。

(9)同时使用利用PAP和PNDK的本发明的ATP供给·再生体系的PAPS合成(大量制造)

在容量2L的恒温反应槽中调制含25mM氯化镁、40mM AMP、100mM硫酸钠、多磷酸(以无机磷酸计为100mM)的1L的水溶液，用氢氧化钠将pH调制8.0后，调温至37℃。在其中添加500单位PAP、500单位PNDK、250单位ATPS、250单位APSK和10000单位无机焦磷酸酶，开始反应。反应开始6小时后，再添加多磷酸(以无机磷酸计为100mM)。另外，反应中使用氢氧化钠将反应液的pH维持于8.0。其结果为，反应开始30小时后的PAPS的生成量达到29.3mM(相对于AMP的转化率为73％)。

比较例1：同时使用利用PPK和ADK的协调作用的以往的ATP供给·再生体系的PAPS合成

在含25mM氯化镁、20mM AMP、100mM硫酸钠、多磷酸(以无机磷酸计为100mM)的50mM Hepes-KOH缓冲液(pH8.0)中添加PPK(0.1单位/mL)、ADK(0.1单位/mL)、ATPS(0.25单位/mL)、APSK(0.25单位/mL)和无机焦磷酸酶(1.0单位/mL)，在37℃保温。反应液组成的经时变化示于图4。该反应中，生成的ATP浓度相对于ADP和AMP降低，48小时后的PAPS生成量仅为2.3mM(相对于AMP的转化率为12％)。比较例2：同时使用利用PAP和ADK的以往的ATP供给·再生体系的PAPS合成

在含25mM氯化镁、20mM AMP、100mM硫酸钠、多磷酸(以无机磷酸计为100mM)的50mM Hepes-KOH缓冲液(pH8.0)中添加PAP(0.1单位/mL)、ADK(0.1单位/mL)、ATPS(0.25单位/mL)、APSK(0.25单位/mL)和无机焦磷酸酶(1.0单位/mL)，在37℃保温。反应液组成的经时变化示于图5。该反应中，生成的ATP浓度也相对于ADP和AMP降低，48小时后的PAPS生成量停留在8.2mM(相对于AMP的转化率为41％)。

序列表

<110>雅玛山酱油株式会社(Yamasa Corporation)

<120>3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸的酶合成法

<130>YS0011

<150>JP2005-16243

<151>2005-01-25

<150>JP2005-138115

<151>2005-05-11

<150>JP2005-215663

<151>2005-07-26

<160>22

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1167

<212>DNA

<213>嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)

<400>1

atgaacatga gcgtaagcat cccgcatggc ggcacattga tcaatcgttg gaatccggac 60

tatccgcttg atgaggcgac caaaacgatc gagctctcca aagccgaact gagcgacttg 120

gagctgatcg gaacgggcgc ctacagcccc ctcactggtt ttttaacgaa aacggattac 180

gacgcggttg ttgaaaccat gcgtctttct gacggcaccg tctggagcat tccgatcacg 240

ctcgcggtaa cagaagaaaa agcgaaagag ctcgccgtcg gcgataaggc gaaactcgtt 300

tatcgtggcg acgtctacgg cgtcattgag attgctgaca tttaccgccc ggacaaaacg 360

aaagaagcga agctcgttta taaaacggat gaacttgccc acccaggcgt gcgcaaactg 420

tttgaaaagc cggatgtgta tgtcggcggg gagattacgc ttgtcaaacg gaccgacaaa 480

ggccaattcg ccgcgtttta ttttgatcca gcggaaacgc ggaaaaagtt tgctgagttt 540

ggctggaaca ccgttgtcgg cttccaaacg cgcaatccgg ttcaccgcgc ccatgaatac 600

attcaaaaat gcgcgctcga gatcgttgat ggcctgtttt taaacccact cgtcggcgaa 660

acgaaagcgg acgatattcc ggctgacatc cggatggaaa gctatcaagt gctgctggaa 720

aactattacc cgaaagaccg cgttttcctc ggcgtcttcc aagctgcgat gcgctatgcc 780

ggtccgcgtg aagccatttt ccacgcaatg gtgcgcaaaa atttcggctg cacgcacttc 840

atcgtcggcc gcgaccacgc tggtgtcggc aattattacg gtacgtatga tgcgcaaaaa 900

atcttcttga actttacggc tgaagagctt ggcattacgc cgctcttttt cgaacatagc 960

ttttactgca cgaaatgcga agggatggca tcgacaaaaa cgtgtccgca tgacgcgaaa 1020

taccatgtcg tcctttccgg cacgaaagtt cgtgaaatgc tgcgcaacgg ccaagtgccg 1080

ccgagcacgt tcagccgccc ggaagtggcc gccgtcttga tcaaagggct gcaagaacgc 1140

gaaacggtcg ccccgtcage gcgctaa 1167

<210>2

<211>612

<212>DNA

<213>嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)

<400>2

atgagcacga acatcgtttg gcatcacaca tcggtcacaa aagaagatcg tcgcaagcgc 60

aacggccatc atagcgccat cctttggttc accgggctgt ccggctccgg caaatcgacg 120

gtggccaatg ccgtctccag acgactgttt gagctcggca ttcagaatta tgtcttagac 180

ggcgacaaca tccggcacgg gctcaataaa gatctcggct tttccgccgc cgaccggacg 240

gaaaacatcc gccgcatcgg cgaagtggca aagctgtttg tcgacagcgg ccagtttgtg 300

ctgacggcgt tcatctcgcc gtttgccgaa gaccgggcgc tcgtccgccg cttagtcgaa 360

gaagacgagt ttatcgaaat ttacgtcaac tgcccgcttg aagaatgcga aaagcgcgat 420

ccgaaagggc tgtatcaaaa agctcgccgc ggggaaatcc gtgaatttac gggcatcgac 480

tcgccgtacg aagcgccgga agcaccggag ctgacgatcg aaacacaccg ttattcggtt 540

gacgaatgtg tcgagcaagt gctcgcctac ctgcgcgagc gaggaatgat cccggacgcg 600

aaaacagact ga 612

<210>3

<211>388

<212>PRT

<213>嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)

<400>3

Met Asn Met Ser Val Ser Ile Pro His Gly Gly Thr Leu Ile Asn Arg

1 5 10 15

Trp Asn Pro Asp Tyr Pro Leu Asp Glu Ala Thr Lys Thr Ile Glu Leu

20 25 30

Ser Lys Ala Glu Leu Ser Asp Leu Glu Leu Ile Gly Thr Gly Ala Tyr

35 40 45

Ser Pro Leu Thr Gly Phe Leu Thr Lys Thr Asp Tyr Asp Ala Val Val

50 55 60

Glu Thr Met Arg Leu Ser Asp Gly Thr Val Trp Ser Ile Pro Ile Thr

65 70 75 80

Leu Ala Val Thr Glu Glu Lys Ala Lys Glu Leu Ala Val Gly Asp Lys

85 90 95

Ala Lys Leu Val Tyr Arg Gly Asp Val Tyr Gly Val Ile Glu Ile Ala

100 105 110

Asp Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Thr Lys Glu Ala Lys Leu Val Tyr Lys

115 120 125

Thr Asp Glu Leu Ala His Pro Gly Val Arg Lys Leu Phe Glu Lys Pro

130 135 140

Asp Val Tyr Val Gly Gly Glu Ile Thr Leu Val Lys Arg Thr Asp Lys

145 150 155 160

Gly Gln Phe Ala Ala Phe Tyr Phe Asp Pro Ala Glu Thr Arg Lys Lys

165 170 175

Phe Ala Glu Phe Gly Trp Asn Thr Val Val Gly Phe Gln Thr Arg Asn

180 185 190

Pro Val His Arg Ala His Glu Tyr Ile Gln Lys Cys Ala Leu Glu Ile

195 200 205

Val Asp Gly Leu Phe Leu Asn Pro Leu Val Gly Glu Thr Lys Ala Asp

210 215 220

Asp Ile Pro Ala Asp Ile Arg Met Glu Ser Tyr Gln Val Leu Leu Glu

225 230 235 240

Asn Tyr Tyr Pro Lys Asp Arg Val Phe Leu Gly Val Phe Gln Ala Ala

245 250 255

Met Arg Tyr Ala Gly Pro Arg Glu Ala Ile Phe His Ala Met Val Arg

260 265 270

Lys Asn Phe Gly Cys Thr His Phe Ile Val Gly Arg Asp His Ala Gly

275 280 285

Val Gly Asn Tyr Tyr Gly Thr Tyr Asp Ala Gln Lys Ile Phe Leu Asn

290 295 300

Phe Thr Ala Glu Glu Leu Gly Ile Thr Pro Leu Phe Phe Glu His Ser

305 310 315 320

Phe Tyr Cys Thr Lys Cys Glu Gly Met Ala Ser Thr Lys Thr Cys Pro

325 330 335

His Asp Ala Lys Tyr His Val Val Leu Ser Gly Thr Lys Val Arg Glu

340 345 350

Met Leu Arg Asn Gly Gln Val Pro Pro Ser Thr Phe Ser Arg Pro Glu

355 360 365

Val Ala Ala Val Leu Ile Lys Gly Leu Gln Glu Arg Glu Thr Val Ala

370 375 380

Pro Ser Ala Arg

385

<210>4

<211>203

<212>PRT

<213>嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)

<400>4

Met Ser Thr Asn Ile Val Trp His His Thr Ser Val Thr Lys Glu Asp

1 5 10 15

Arg Arg Lys Arg Asn Gly His His Ser Ala Ile Leu Trp Phe Thr Gly

20 25 30

Leu Ser Gly Ser Gly Lys Ser Thr Val Ala Asn Ala Val Ser Arg Arg

35 40 45

Leu Phe Glu Leu Gly Ile Gln Asn Tyr Val Leu Asp Gly Asp Asn Ile

50 55 60

Arg His Gly Leu Asn Lys Asp Leu Gly Phe Ser Ala Ala Asp Arg Thr

65 70 75 80

Glu Asn Ile Arg Arg Ile Gly Glu Val Ala Lys Leu Phe Val Asp Ser

85 90 95

Gly Gln Phe Val Leu Thr Ala Phe Ile Ser Pro Phe Ala Glu Asp Arg

100 105 110

Ala Leu Val Arg Arg Leu Val Glu Glu Asp Glu Phe Ile Glu Ile Tyr

115 120 125

Val Asn Cys Pro Leu Glu Glu Cys Glu Lys Arg Asp Pro Lys Gly Leu

130 135 140

Tyr Gln Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ile Arg Glu Phe Thr Gly Ile Asp

145 150 155 160

Ser Pro Tyr Glu Ala Pro Glu Ala Pro Glu Leu Thr Ile Glu Thr His

165 170 175

Arg Tyr Ser Val Asp Glu Cys Val Glu Gln Val Leu Ala Tyr Leu Arg

180 185 190

Glu Arg Gly Met Ile Pro Asp Ala Lys Thr Asp

195 200

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ATPS基因的引物

<400>5

ttgaattcct tgcctcatga acatggcagc 30

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ATPS基因的引物

<400>6

tactgcaggc tcatcgcgat cctcctttag 30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增APSK基因的引物

<400>7

ttgaattccg ctaaaggagg atcgcgatga 30

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增APSK基因的引物

<400>8

ttctgcagcg accttgtcaa atgacctccc 30

<210>9

<211>1191

<212>DNA

<213>绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400>9

gcggccgggc gcggtttgat gggggtcaac ggacgcctcc cggcaggggc atagagtggg 60

ggactgcata gctgaaaacg tagaacggaa ggagtcccgc atgagcgaag aacccactgt 120

cagtcccccc tcccccgagc aacccgccgc gcagccggcc aagccggccc ggccagccgc 180

ccgccgcgcc ccgcgcaagc cggcgacccg ccgcccgcga gtggccagcc cggcgcagaa 240

ggcccgcgag gagatccagg caatcagcca gaagccggtg gccctgcagg tcgccagtgc 300

gccccacggc agcagcgagg acagcacctc ggcgagcctg ccggcgaact atccctatca 360

cacgcggatg cgccgcaacg agtacgagaa ggccaagcac gacctgcaga tcgaactgct 420

caaggtgcag agctgggtga aggagaccgg ccagcgcgtg gtggtcctgt tcgaaggccg 480

cgacgccgcc ggcaagggcg gcaccatcaa gcgcttcatg gaacacctga acccgcgcgg 540

cgcgcggatc gtagccttgg agaaaccgtc ctcccaggag cagggccagt ggtatttcca 600

gcgctacatc caacatctgc ccaccgccgg cgagatggtc ttcttcgacc gctcctggta 660

caaccgcgcc ggcgtcgagc gggtcatggg cttctgttcg ccgctgcaat acctggagtt 720

catgcgccag gcgccggagc tggagcgcat gctcaccaac agcggcatcc tgctgttcaa 780

gtactggttc tcggtgagcc gcgaggaaca actgcggcgc ttcatctcgc gccgcgacga 840

tccgctcaag cactggaagc tgtcgcccat cgacatcaag tctctggaca agtgggacga 900

ctacaccgcc gccaagcagg cgatgttctt ccataccgac accgccgacg cgccgtggac 960

ggtcatcaag tccgacgaca agaagcgcgc gcgactcaac tgcatccgcc acttcctgca 1020

ctcgctggac tacccggaca aggaccggcg catcgcccat gagcccgacc cgttgctggt 1080

ggggccggcc tcgcgggtga tcgaggagga cgagaaggtc tacgccgagg cggccgccgc 1140

gccgggccac gcgaacctgg atatcccggc ctgaggcggg cggtcgcgcc a 1191

<210>10

<211>357

<212>PRT

<213>绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400>10

Met Ser Glu Glu Pro Thr Val Ser Pro Pro Ser Pro Glu Gln Pro Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Lys Pro Ala Arg Pro Ala Ala Arg Arg Ala Pro Arg

20 25 30

Lys Pro Ala Thr Arg Arg Pro Arg Val Ala Ser Pro Ala Gln Lys Ala

35 40 45

Arg Glu Glu Ile Gln Ala Ile Ser Gln Lys Pro Val Ala Leu Gln Val

50 55 60

Ala Ser Ala Pro His Gly Ser Ser Glu Asp Ser Thr Ser Ala Ser Leu

65 70 75 80

Pro Ala Asn Tyr Pro Tyr His Thr Arg Met Arg Arg Asn Glu Tyr Glu

85 90 95

Lys Ala Lys His Asp Leu Gln Ile Glu Leu Leu Lys Val Gln Ser Trp

100 105 110

Val Lys Glu Thr Gly Gln Arg Val Val Val Leu Phe Glu Gly Arg Asp

115 120 125

Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Met Glu His Leu Asn

130 135 140

Pro Arg Gly Ala Arg Ile Val Ala Leu Glu Lys Pro Ser Ser Gln Glu

145 150 155 160

Gln Gly Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Ile Gln His Leu Pro Thr Ala

165 170 175

Gly Glu Met Val Phe Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val

180 185 190

Glu Arg Val Met Gly Phe Cys Ser Pro Leu Gln Tyr Leu Glu Phe Met

195 200 205

Arg Gln Ala Pro Glu Leu Glu Arg Met Leu Thr Asn Ser Gly Ile Leu

210 215 220

Leu Phe Lys Tyr Trp Phe Ser Val Ser Arg Glu Glu Gln Leu Arg Arg

225 230 235 240

Phe Ile Ser Arg Arg Asp Asp Pro Leu Lys His Trp Lys Leu Ser Pro

245 250 255

Ile Asp Ile Lys Ser Leu Asp Lys Trp Asp Asp Tyr Thr Ala Ala Lys

260 265 270

Gln Ala Met Phe Phe His Thr Asp Thr Ala Asp Ala Pro Trp Thr Val

275 280 285

Ile Lys Ser Asp Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Asn Cys Ile Arg His

290 295 300

Phe Leu His Ser Leu Asp Tyr Pro Asp Lys Asp Arg Arg Ile Ala His

305 310 315 320

Glu Pro Asp Pro Leu Leu Val Gly Pro Ala Ser Arg Val Ile Glu Glu

325 330 335

Asp Glu Lys Val Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Gly His Ala Asn

340 345 350

Leu Asp Ile Pro Ala

355

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ppk2基因的引物

<400>11

ttccatggga gaggtgtaag gctttcct 28

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ppk2基因的引物

<400>12

aaccatgggc gaagaaccca ctgtcagt 28

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ppk2基因的引物

<400>13

aaccatggcg gtggccctgc aggtcgcc 28

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ppk2基因的引物

<400>14

aaccatgggc agcgaggaca gcacctcg 28

<210>15

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ppk2基因的引物

<400>15

aaccatggac tatccctatc acacgcgg 28

<210>16

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ppk2基因的引物

<400>16

aaccatggcg cggatgcgcc gcaacgag 28

<210>17

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ppk2基因的引物

<400>17

aaccatggac gagtacgaga aggccaag 28

<210>18

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ppk2基因的引物

<400>18

ttccatggag gtgcagagct gggtgaag 28

<210>19

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ppk2基因的引物

<400>19

ttccatggac agcacctcgg cgagcct 27

<210>20

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ppk2基因的引物

<400>20

ttccatggcg agcctgccgg cgaactat 28

<210>21

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ppk2基因的引物

<400>21

ttccatggtg ccggcgaact atccctatc 29

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增ppk2基因的引物

<400>22

ttggatcctg ccgtacaagc agatcgtg 28

Claims

1.DNA片段，其特征在于，由以序列编号1表示的碱基序列构成，编码来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的腺苷5′-三磷酸硫酸化酶(ATPS)。

2.DNA片段，其特征在于，由以序列编号1表示的碱基序列中缺失、置换、插入或添加了1个或数个碱基的碱基序列构成，编码具有ATPS活性的酶。

3.DNA片段，其特征在于，与权利要求1所述的DNA片段在严格条件下杂交，编码具有ATPS活性的酶。

4.ATPS或具有ATPS活性的酶的调制方法，其特征在于，使用权利要求1～3中任一项所述的DNA片段，通过重组DNA方法调制具有ATPS活性的粗酶，对得到的粗酶进行加热处理。

5.如权利要求4所述的调制方法，其特征在于，在45～65℃下进行加热处理。

6.DNA片段，其特征在于，由以序列编号2表示的碱基序列构成，编码来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的腺苷5′-磷酸硫酸激酶(APSK)。

7.DNA片段，其特征在于，由以序列编号2表示的碱基序列中缺失、置换、插入或添加了1个或数个碱基的碱基序列构成，编码具有APSK活性的酶。

8.DNA片段，其特征在于，与权利要求6所述的DNA片段在严格条件下杂交，编码具有APSK活性的酶。

9.APSK或具有APSK活性的酶的调制方法，其特征在于，使用权利要求6～8中任一项所述的DNA片段，通过重组DNA方法调制具有APSK活性的粗酶，对得到的粗酶进行加热处理。

10.如权利要求9所述的调制方法，其特征在于，在45～65℃下进行加热处理。

11.PAPS的制造方法，其特征在于，使用通过权利要求4所述的方法调制的ATPS和通过权利要求9所述的方法调制的APSK，由硫酸离子和腺苷5′-三磷酸(ATP)以酶法合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)。

12.DNA片段，其特征在于，由以序列编号9表示的碱基序列中的101～1171构成的编码多磷酸依赖性核苷5′-二磷酸激酶(PNDK)的多核苷酸中，缺失N末端侧的相当于至少72个氨基酸残基的碱基序列。

13.如权利要求12所述的DNA片段，其特征在于，缺失相当于至少73个氨基酸残基的量的碱基序列。

14.如权利要求12所述的DNA片段，其特征在于，缺失相当于72个以上、87个以下的氨基酸残基的量的碱基序列。

15.如权利要求12所述的DNA片段，其特征在于，缺失相当于73个以上、83个以下的氨基酸残基的量的碱基序列。

16.如权利要求12所述的DNA片段，其特征在于，缺失相当于73、77、80或83个的氨基酸残基的量的碱基序列。

17.DNA片段，其特征在于，由权利要求12～16中任一项所述的碱基序列中缺失、置换、插入或添加了1个或数个碱基的碱基序列构成，编码具有PNDK活性的酶。

18.DNA片段，其特征在于，与权利要求12～16中任一项所述的DNA片段在严格条件下杂交，编码具有PNDK活性的酶。

19.PNDK的制造方法，其特征在于，使用权利要求12～18中所述的任一种DNA片段，通过重组DNA方法调制PNDK。

20.PNDK，其特征在于，通过权利要求19所述的方法调制，具有序列编号10的缺失N末端侧的至少72个氨基酸的氨基酸序列。

21.腺苷5′-三磷酸(ATP)的供给·再生体系，其特征在于，由腺苷5′-单磷酸(AMP)、多磷酸、多磷酸依赖性核苷5′-二磷酸激酶(PNDK)和多磷酸：AMP磷酸转移酶(PAP)构成。

22.腺苷5′-三磷酸(ATP)的供给·再生体系，其特征在于，由腺苷5′-单磷酸(AMP)、多磷酸、多磷酸依赖性核苷5′-二磷酸激酶(PNDK)和腺苷酸激酶(ADK)构成。

23.如权利要求21或22所述的ATP的供给·再生体系，其特征在于，PNDK来源于属于假单胞菌属的微生物。

24.如权利要求21或22所述的ATP的供给·再生体系，其特征在于，PNDK为权利要求20所述的PNDK。

25.如权利要求21或22所述的ATP的供给·再生体系，其特征在于，PAP来源于属于不动杆菌属的微生物。

26.如权利要求21或22所述的ATP的供给·再生体系，其特征在于，ADK来源于大肠杆菌或酵母。

27.如权利要求21或22所述的ATP的供给·再生体系，其特征在于，使用通过重组DNA方法转化了的转化体、该转化体的处理物或由该处理物得到的酶作为酶源。

28.有用物质的制造方法，它是低成本且高效地制造通过将ATP作为能量源和/或底物进行消耗的酶反应生成的有用物质的方法，其特征在于，利用权利要求21～26中任一项所述的ATP的供给·再生体系替代ATP。

29.如权利要求28所述的有用物质的制造方法，其特征在于，通过将ATP作为能量源和/或底物进行消耗的酶反应生成的有用物质为3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)、糖核苷酸、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)中的任一种。

30.PAPS的制造方法，它是使用腺苷5′-三磷酸硫酸化酶(ATPS)和腺苷5′-磷酸硫酸激酶(APSK)将ATP硫酸化和磷酸化而制造3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)的方法，其特征在于，利用权利要求21～27中任一项所述的ATP的供给·再生体系替代ATP。

31.如权利要求30所述的PAPS的制造方法，其特征在于，ATPS和APSK来源于属于地芽孢杆菌属的微生物。

32.如权利要求30所述的PAPS的制造方法，其特征在于，使用通过权利要求4所述的方法调制的ATPS和通过权利要求9所述的方法调制的APSK。

33.如权利要求30所述的PAPS的制造方法，其特征在于，在30～50℃的反应温度下进行PAPS的酶合成。