CN113151238A

CN113151238A - 磷酸戊糖变位酶突变体及其在构建高产核苷的枯草芽孢杆菌中的应用

Info

Publication number: CN113151238A
Application number: CN202110565833.2A
Authority: CN
Inventors: 孙莹莹; 胡丹; 齐丹丹; 李岩
Original assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Current assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-05-24
Also published as: CN113151238B

Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种磷酸戊糖变位酶突变体及其在构建高产核苷的枯草芽孢杆菌中的应用。本发明发现磷酸戊糖变位酶第159位(丝氨酸突变为苯丙氨酸)和第336位(组氨酸突变为酪氨酸)的突变对在核苷积累中起到了主要作用，利用该发现可以构建和筛选高产核苷的枯草芽孢杆菌，有利于提高核苷的产量，为核苷的工业化生产奠定了基础。

Description

磷酸戊糖变位酶突变体及其在构建高产核苷的枯草芽孢杆菌中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种磷酸戊糖变位酶突变体及其在构建高产核苷的枯草芽孢杆菌中的应用。

背景技术

基因工程菌以细菌作为宿主菌优势明显，如发酵周期短、原料要求简单、基因工程技术成熟等。目前，微生物发酵是生产核苷主要的方法，所用生产菌主要是芽孢杆菌类，包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌及短小芽孢杆菌等。芽孢杆菌类作为核苷的出发菌株，其优势是磷酸戊糖途径比较活跃，嘌呤核苷磷酸化酶活力低。在芽孢杆菌属中，包括枯草芽孢杆菌在内的许多菌株具有可靠的安全性。传统菌株选育发现，芽孢杆菌的突变株能够过量合成叶酸、腺苷、肌苷、鸟苷、核黄素等一系列嘌呤途径代谢中间产物或该途径的衍生代谢产物，成为选育高产核苷类代谢产物重要出发菌株。但目前生产上大多为芽孢诱变菌种，遗传背景不清晰，成本高、转化率低，造成工业化生产水平普遍偏低。因此，亟待通过代谢工程的手段，改善菌种性能。

核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷都是由D-核糖或D-Z-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。由D-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与RNA组成，由D-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与DNA组成。腺苷即腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物，属于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量，广泛应用于医药等行业。鸟苷，化学名称：9-β-D-呋喃核糖鸟嘌呤。可作为食品或医药原料的中间体，用于生产5’-鸟苷酸二钠、鸟嘌呤、利巴韦林、阿昔洛韦、泛昔洛韦等食品添加剂或医药原料。肌苷，化学名称：9-β-D-核糖次黄嘌呤。系细胞代谢改善药，参与体内核酸代谢，在体内转变为肌苷酸及三磷酸腺苷，参与细胞的能量代谢和蛋白质合成，提高各种酶，特别是辅酶A与丙酮酸氧化酶的活性，从而使细胞在缺氧状态下继续进行代谢，活化肝脏功能，促进受损伤肝脏的恢复，可刺激体内产生抗体并促进肠道对铁的吸收。

核苷磷酸化酶参与从外部环境获得的或由核苷酸的细胞内分解产生的核苷的细胞内代谢。枯草芽孢杆菌中存在两种嘌呤核苷磷酸化酶：一种对腺苷特异(PupA)，另一种对鸟苷和肌苷特异(PupG)。嘌呤合成途径中核苷磷酸化酶催化核糖核苷向游离碱加核糖1-磷酸裂解。该碱基具有合成代谢的功能(核苷酸合成中的再利用)或分解代谢的功能(用作氮源)。然而，仅当细胞在贫瘠氮源上生长时，枯草芽孢杆菌中的嘌呤碱基才发生降解。枯草芽孢杆菌中核苷降解是由核糖核苷形成的核糖1-磷酸通过磷酸戊糖变位酶转化为核糖5-磷酸，然后进一步分解代谢或转化为磷酸核糖焦磷酸，用于核苷酸合成。

在现有技术中，虽然CN106906174A提到了一种产肌苷的重组菌及其制备方法与应用，但其是对磷酸戊糖变位酶进行弱化或失活，改造方式为启动子缺失或基因缺失，而未进一步提供与该酶效果相关度较高的位点信息。

发明内容

有关磷酸戊糖变位酶(由drm基因编码)与枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径的功能关联文献报道尚不是很清晰，本发明意外发现该酶的第159位丝氨酸突变为苯丙氨酸和/或第336位组氨酸突变为酪氨酸后有助于提高核苷产量，推测原因可能如下：

drm编码磷酸戊糖变位酶，为核糖-1-磷酸合成核糖-5-磷酸的关键基因，而核糖-5-磷酸为核苷合成的重要前体，推测通过双点突变该基因可能得到强化后使酶活提高，从而增加核糖-5-磷酸前体供应，进而促进核苷合成。

基于上述发现，本发明提供了一种磷酸戊糖变位酶突变体及其在构建高产核苷的枯草芽孢杆菌中的应用。

具体而言，第一方面，本发明提供一种磷酸戊糖变位酶突变体，其在序列如SEQ IDNO.1所示的磷酸戊糖变位酶的基础上发生以下至少一个突变：

1)第159位丝氨酸突变为苯丙氨酸；

2)第336位组氨酸突变为酪氨酸。

作为优选，所述磷酸戊糖变位酶突变体同时发生了两个所述的突变。

作为优选，所述磷酸戊糖变位酶突变体源于枯草芽孢杆菌。

更优选地，编码磷酸戊糖变位酶野生型的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第二方面，本发明还提供了编码所述的磷酸戊糖变位酶突变体的核酸。

在一些实施方案中，所述的核酸可由核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的drm基因(bacillus subtilis 168)突变得到。

第三方面，本发明还提供了所述的磷酸戊糖变位酶突变体或核酸在以下任一方面的应用：

(1)构建高产核苷的枯草芽孢杆菌；

(2)筛选高产核苷的枯草芽孢杆菌。

进一步的，本发明还提供一种枯草芽孢杆菌，其表达所述的磷酸戊糖变位酶突变体；和/或，其含有所述的核酸。

drm^S159F、drm^H336Y单一位点突变分别获得枯草芽孢杆菌B.subtilis A14、B.subtilis A15菌株。两个单一点突变质粒依次转化B.subtilisA5(Δupp)菌株获得两个位点均发生点突变的枯草芽孢杆菌B.subtilis A16。实验显示，同出发菌株B.subtilisA5-Δupp相比，工程菌的核苷积累量都有提高，A14积累较多，A15积累较少，两个位点均发生点突变的A16菌株腺苷积累最多，说明这两个位点的突变在核苷积累中起到了主要作用。表明本发明所述枯草芽孢杆菌为核苷高产菌株，能有效积累核苷，提高核苷的产量，为核苷的工业化生产奠定了基础。

本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌的构建方法，包括：

步骤A、分别制备drm^S159F、drm^H336Y点突变基因片段，与载体连接分别获得两个单一位点突变质粒；

步骤B、两个单一点突变质粒分别转化B.subtilisA5(Δupp)菌株获得单一位点突变的枯草芽孢杆菌。

在一些实施方案中，所述的构建方法中步骤A所述载体为pKSU。

在一些实施方案中，所述两个单一位点突变质粒分别为pKSU-drm*¹，pKSU-drm*²，单一位点突变的枯草芽孢杆菌为B.subtilis A14、B.subtilis A15菌株。

在一些实施方案中，所述枯草芽孢杆菌的构建方法步骤B为两个单一点突变质粒依次转化B.subtilisA5(Δupp)菌株获得两个位点均发生点突变的枯草芽孢杆菌B.subtilis A16。

第四方面，本发明还提供所述的枯草芽孢杆菌在生产核苷中的应用。

作为优选，所述的核苷包括腺苷、鸟苷和肌苷中的一种或几种。

进一步的，本发明还提供一种生产核苷的方法，包括：培养所述的枯草芽孢杆菌，以产生、积累和收集核苷。

在一些实施方案中，所述方法包括：将上述枯草芽孢杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵。

作为优选，所述发酵中所使用的种子培养基中含有如下组分：

葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，玉米浆干粉5g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰0.01g/L，pH 7.0～7.2。

作为优选，所述发酵中所使用的发酵培养基中含有如下组分：

葡萄糖60g/L，酵母粉3.5g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸铵25g/L，硫酸锰0.01g/L，硫酸镁5g/L，味精10g/L，玉米浆干粉15g/L，碳酸钙25g/L，pH 7.0～7.2。

作为优选，所述发酵的温度为35-36℃，更优选为35.5℃。

在一些实施方案中，发酵时间为40-50h。

基于上述技术方案，本发明的有益效果如下：

本发明发现磷酸戊糖变位酶第159位和第336位的突变对在核苷积累中起到了主要作用，利用该发现可以构建和筛选高产核苷的枯草芽孢杆菌，有利于提高核苷的产量，为核苷的工业化生产奠定了基础。

附图说明

图1为实施例4中的不同菌株产苷水平比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明所用到的原始菌株B.subtilis A5来源为本实验室构建，已在CN110257315B中得到公开。本发明所用到的腺苷、鸟苷和肌苷标准品从Sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买，所用DNA聚合酶、DNA纯化试剂盒、限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从Thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。

各实施例涉及的引物序列如表1(由上至下依次为SEQ ID NO.3-10)所示。

表1引物序列

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1：诱变筛选获得腺苷高产菌株

经过多轮诱变筛选后，获得了B.subtilis MHA菌株，该菌能在含有1g/L的8-氮鸟嘌呤培养基上生长，B.subtilis MHA摇瓶产腺苷水平为10g/L，转化率14％，为一株腺苷高产菌。

通过比较基因组学分析，B.subtilis MHA的磷酸戊糖变位酶(由drm基因编码)具有S159F和H336Y两个氨基酸位点突变，该两个位点的突变可能是促进腺苷高产的因素。因此本发明将该两个位点的突变引入B.subtilis A5菌株，进行验证。

实施例2：工程菌株B.subtilisA14(drm^S159F)，A15(drm^H336Y)的构建

用引物drm-1f/1r、drm-2f/2r和drm-3f/3r，drm-4f/4r以B.subtilis A5基因组为模板，使用pfu高保真DNA聚合酶扩增分别得到drm的上下游同源臂；用引物drm-1f/2r和drm-3f/4r融合上下游片段分别得到drm*同源片段(含S159F和H336Y突变，完整drm*基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示共1185bp，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示共394个氨基酸序列)，将2个片段与pKSU(工具载体)质粒经SalI/PstI双酶切、连接、转化等操作后得到质粒pKSU-drm*¹和pKSU-drm*²。通过电化学转化至B.subtilisA5中，用含2.5μg/mL氯霉素的LB平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml LB液体中，42℃、200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含5μg/mL的氯霉素LB平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml LB液体中，42℃、200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μM 5-FU的LB平板筛选二次重组子，得到在B.subtilisA5(Δupp)引入drm^S159F的B.subtilis A14菌株，引入drm^H336Y的B.subtilisA15菌株。

实施例3：工程菌株B.subtilis A16构建(引入drm^{S159F，H336Y}突变)

将质粒pKSU-drm*¹转化至B.subtilis A15菌株中，获得工程菌B.subtilis A16(drm^{S159F，H336Y})，筛选方法同实施例2。

LB液体培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，调节pH至7.2，0.15Mpa压力下灭菌20min。LB固体培养基配方为：在LB液体培养基中加入琼脂粉(终浓度18g/L)，121℃下灭菌20min。

实施例4：工程菌株B.subtilis-A5、A14、A15、A16和MHA腺苷合成能力对比

1.培养基：

(1)种子培养基配方(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH 7.0～7.2，121℃下灭菌20min。

(2)发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖60，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，味精10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，pH 7.0～7.2，121℃下灭菌20min。

2.培养方法

(1)将菌株三区划线LB平板，37℃过夜培养；

(2)挑单菌落接种至30mL种子培养基中，110rpm，36℃培养7～8h；

(3)按10％接种量转接至30ml发酵培养基中，摇床转速130rpm，35.5℃培养46h；

发酵结果见图1，从结果可以看出，同出发菌株B.subtilisA5相比，工程菌的腺苷积累量都有提高，A14(drm^S159F)和A15(drm^H336Y)单点工程菌腺苷积累量分别提高0.8g/L和0.5g/L，A14提高较多。drm^{S159F，H336Y}的引入增加了核糖-5-磷酸前体供应，双突变工程菌A16(drm^{S159F，H336Y})腺苷积累量提高1g/L，同时鸟苷积累量提高0.5g/L，肌苷积累量提高0.2g/L，说明这两个位点的突变在核苷积累中起到了主要作用。

本发明的菌株的构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域的技术人员按本发明公开的内容达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。

本发明中的菌株代号如B.subtilis A14和B.subtilis A15等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。上述方法构建的包含有枯草芽孢杆菌磷酸戊糖变位酶双突变基因drm^{S159F，H336Y}工程菌的用途，包括但是不局限于生产核苷。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司

<120> 磷酸戊糖变位酶突变体及其在构建高产核苷的枯草芽孢杆菌中的应用

<130> KHP211111915.2

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 394

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Ala Tyr Lys Tyr Asn Arg Val Phe Leu Ile Val Met Asp Ser

1 5 10 15

Val Gly Ile Gly Glu Ala Pro Asp Ala Ala Asp Phe Asn Asp Glu Gly

20 25 30

Ala His Thr Leu Gly His Ile Ala Glu His Met Asn Gly Leu His Met

35 40 45

Pro Asn Met Ala Lys Leu Gly Leu Gly Leu Ile Glu Asp Ile Lys Gly

50 55 60

Val Glu Lys Thr Glu His Pro Leu Ala Tyr Tyr Gly Lys Met Gln Glu

65 70 75 80

Ala Ser Asn Gly Lys Asp Thr Met Thr Gly His Trp Glu Ile Met Gly

85 90 95

Leu Tyr Ile Asp Lys Pro Phe Lys Val Phe Pro Glu Gly Phe Pro Asp

100 105 110

Glu Leu Leu Gln Glu Leu Glu Lys Arg Ser Gly Arg Lys Ile Ile Gly

115 120 125

Asn Lys Pro Ala Ser Gly Thr Ala Ile Leu Asp Glu Leu Gly Gln Glu

130 135 140

His Met Glu Thr Gly Ala Leu Ile Val Tyr Thr Ser Ala Asp Ser Val

145 150 155 160

Leu Gln Ile Ala Ala His Glu Glu Val Val Pro Leu Glu Glu Leu Tyr

165 170 175

Arg Ile Cys Glu Thr Ala Arg Glu Leu Thr Leu Asp Pro Lys Tyr Met

180 185 190

Val Gly Arg Ile Ile Ala Arg Pro Phe Val Gly Glu Pro Gly Gln Phe

195 200 205

Lys Arg Thr Pro Asn Arg His Asp Tyr Ala Leu Lys Pro Phe Asp Arg

210 215 220

Thr Val Met Asn Glu Leu Lys Asp Cys Gly Leu Asp Val Ile Ser Ile

225 230 235 240

Gly Lys Ile Ser Asp Ile Tyr Asp Gly Glu Gly Ile Thr Ser Ser Arg

245 250 255

Arg Thr Val Ser Asn Met Asp Gly Met Asp Lys Val Ile Asp Thr Leu

260 265 270

Gly Glu Asp Phe Thr Gly Leu Ser Phe Ala Asn Leu Val Asp Phe Asp

275 280 285

Ala Leu Phe Gly His Arg Arg Asp Pro Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Leu

290 295 300

Glu Glu Phe Asp Ala Arg Leu Pro Glu Val Phe Glu Lys Met Arg Glu

305 310 315 320

Asp Asp Leu Leu Ile Ile Thr Ala Asp His Gly Asn Asp Pro Ile His

325 330 335

His Gly Thr Asp His Thr Arg Glu Tyr Val Pro Ile Leu Ala Tyr Ser

340 345 350

Lys Lys His Lys Lys Ala Gln Met Leu Pro Leu Ala Asp Thr Phe Ala

355 360 365

Asp Ile Gly Ala Thr Ile Ala Asp Asn Phe Gln Thr Asn Lys Pro Lys

370 375 380

Tyr Gly Lys Ser Phe Leu Ser Leu Leu Gln

385 390

<210> 2

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcctgcat acaaatataa tcgtgtgttt ttaattgtga tggactcagt cggaatcggc 60

gaagcgccgg atgccgctga ctttaatgac gaaggcgctc atacgctcgg tcatattgcc 120

gagcatatga acggattaca tatgccgaat atggcaaagc tcggccttgg tcttatcgaa 180

gatatcaaag gtgtagaaaa aacagaacat ccgcttgcct attatggaaa aatgcaagaa 240

gcgtcaaacg gcaaagatac gatgaccggc cattgggaga ttatgggttt atacattgat 300

aaaccgttta aagtgttccc ggaaggcttt cctgatgaat tgcttcaaga gctggaaaag 360

agatctggcc gcaaaattat tggaaacaag ccggcttccg gcacagcgat tttggatgag 420

cttggccagg agcacatgga gacaggggct ttaattgttt acacgtctgc tgactctgtt 480

ctgcaaattg ccgctcacga agaggttgtg ccgcttgagg agctgtatcg catttgcgaa 540

acggcgagag agctgacgct tgatccgaaa tatatggttg gccgcattat tgcacggccg 600

ttcgtcggag agccgggtca attcaaacgg acgccaaacc gccatgatta tgcgctgaag 660

ccgtttgacc gcactgtcat gaatgaattg aaagactgcg gcttagatgt gatttcaatc 720

ggtaaaatct ctgatattta cgacggagaa ggcattactt cttcacgcag aacggtttct 780

aatatggacg gaatggacaa ggtgatcgat acgctgggag aagattttac gggtctgagc 840

tttgcgaacc ttgttgattt tgacgcgtta ttcggacacc gccgtgaccc tgaaggctac 900

ggacgcgcgc ttgaagaatt tgatgcgcgg cttccggaag tgtttgaaaa aatgagagaa 960

gacgatctgt taattattac agccgaccac ggcaatgatc cgattcatca tgggactgac 1020

catacacgcg agtatgtgcc gattctcgct tacagcaaaa aacataagaa agcgcaaatg 1080

ctgccgcttg cagatacatt tgccgatatt ggcgcaacga tcgctgataa tttccaaaca 1140

aataaaccga aatacgggaa aagcttttta tctttattac aatag 1185

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caaaataagg atcctctaga gtcgacatgc ctgcatacaa atataa 46

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgtgagcgg caatttgcag aacaaagtca gcagacgtgt 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acacgtctgc tgactttgtt ctgcaaattg ccgctcacga 40

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcagaaat cggatcattg ccgtgg 46

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaaataagg atcctctaga gtcgacctgc aaattgccgc tcacga 46

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgtatggtca gtcccatgat aaatcggatc attgccgtgg 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccacggcaat gatccgattt atcatgggac tgaccataca 40

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcagatca cgcgtacagg gaatgt 46

Claims

1.一种磷酸戊糖变位酶突变体，其特征在于，其在序列如SEQ ID NO.1所示的磷酸戊糖变位酶的基础上发生以下至少一个突变：

1)第159位丝氨酸突变为苯丙氨酸；

2)第336位组氨酸突变为酪氨酸。

2.根据权利要求1所述的磷酸戊糖变位酶突变体，其特征在于，其同时发生了两个所述的突变。

3.根据权利要求1或2所述的磷酸戊糖变位酶突变体，其特征在于，所述磷酸戊糖变位酶突变体源于枯草芽孢杆菌；优选编码磷酸戊糖变位酶野生型的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

4.编码权利要求1-3中任一项所述的磷酸戊糖变位酶突变体的核酸。

5.权利要求1-3中任一项所述的磷酸戊糖变位酶突变体或权利要求4所述的核酸在以下任一方面的应用：

(1)构建高产核苷的枯草芽孢杆菌；

(2)筛选高产核苷的枯草芽孢杆菌。

6.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，其表达权利要求1-3中任一项所述的磷酸戊糖变位酶突变体；和/或，其含有权利要求4所述的核酸。

7.权利要求6所述的枯草芽孢杆菌在生产核苷中的应用。

8.一种生产核苷的方法，其特征在于，包括：培养权利要求6所述的枯草芽孢杆菌，以产生、积累和收集核苷。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括：将所述枯草芽孢杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵；

所述种子培养基中含有如下组分：

葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，玉米浆干粉5g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰0.01g/L，pH 7.0～7.2；

所述发酵培养基中含有如下组分：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为35-36℃。