CN115678876A

CN115678876A - 可提高菌株核苷产量的蛋白突变体及其应用

Info

Publication number: CN115678876A
Application number: CN202110860057.9A
Authority: CN
Inventors: 孙莹莹; 胡丹; 齐丹丹; 吴涛; 薛婷莉; 李鑫磊; 赵津津; 李岩
Original assignee: Meihua Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Meihua Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-07-28
Filing date: 2021-07-28
Publication date: 2023-02-03

Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体涉及可提高菌株核苷产量的蛋白突变体及其应用。本发明通过对腺嘌呤脱氨酶和嘧啶核苷酸转运蛋白进行点突变，不仅可有效积累菌株所产生的肌苷、腺苷及其它核苷类相关产品，而且不影响菌体生长，实用性更广，有利于降低核苷工业化生产的成本。

Description

可提高菌株核苷产量的蛋白突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及可提高菌株核苷产量的蛋白突变体及其应用。

背景技术

核苷是核酸和核苷酸的组成成分，其属于一类糖苷的总称，是由D-核糖或D-2-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。其中，由D-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与RNA组成，由D-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与DNA组成。

腺苷即腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物，属于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量，广泛应用于医药等行业。

鸟苷的化学名称为9-β-D-呋喃核糖鸟嘌呤，其可作为食品或医药原料的中间体，用于生产5’-鸟苷酸二钠、鸟嘌呤、利巴韦林、阿昔洛韦、泛昔洛韦等食品添加剂或医药原料。

肌苷的化学名称为9-β-D-核糖次黄嘌呤，系细胞代谢改善药，参与体内核酸代谢，在体内转变为肌苷酸及三磷酸腺苷，参与细胞的能量代谢和蛋白质合成，提高各种酶，特别是辅酶A与丙酮酸氧化酶的活性，从而使细胞在缺氧状态下继续进行代谢，活化肝脏功能，促进受损伤肝脏的恢复，可刺激体内产生抗体并促进肠道对铁的吸收。

在基因工程菌领域，以细菌作为宿主菌具有明显优势，如发酵周期短、原料要求简单、基因工程技术成熟等。目前，微生物发酵是生产核苷主要的方法，所用生产菌主要是芽孢杆菌类，包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌及短小芽孢杆菌等。芽孢杆菌类作为核苷的出发菌株，其优势是磷酸戊糖途径比较活跃，嘌呤核苷磷酸化酶活力低。在芽孢杆菌属中，包括枯草芽孢杆菌在内的许多菌株具有可靠的安全性。传统菌株选育发现，芽孢杆菌的突变株能够过量合成叶酸、腺苷、肌苷、鸟苷、核黄素等一系列嘌呤途径代谢中间产物或该途径的衍生代谢产物，成为选育高产核苷类代谢产物的重要出发菌株。

发明内容

本发明通过实验室诱变获得一系列解淀粉芽孢杆菌高产菌，而经过对其进行比较基因组学分析、筛选及验证后，意外发现当腺嘌呤脱氨酶(由adeC基因编码)第135位脯氨酸突变为丝氨酸，第158位苯丙氨酸移码突变；嘧啶核苷酸转运蛋白(由nupC基因编码)第175位苏氨酸突变为脯氨酸，第231位谷氨酰胺无义突变时，均有利于提高菌株的核苷产量，且在一个蛋白同时发生两处突变，及两个蛋白同时发生上述四处突变时，可以逐渐地进一步地提升核苷产量。而枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌同为核苷生产菌，且蛋白序列同源性较高，故将解淀粉芽孢杆菌的上述突变引入枯草芽孢杆菌后发现可获得同样的效果。

基于上述发现，本发明提供了可提高菌株核苷产量的蛋白突变体及其应用。

具体而言，本发明首先提供可提高菌株核苷产量的蛋白突变体，其包括：

1)腺嘌呤脱氨酶突变体，其在野生型腺嘌呤脱氨酶(由adeC基因编码)的基础上发生以下至少一个突变：a)第135位脯氨酸突变为丝氨酸；b)第158位苯丙氨酸移码突变；和/或，

2)嘧啶核苷酸转运蛋白突变体，其在野生型嘧啶核苷酸转运蛋白(由nupC基因编码)的基础上发生以下至少一个突变：c)175位苏氨酸变为脯氨酸；d)第231位谷氨酰胺无义突变。

其中，adeC是腺嘌呤脱氨酶基因，是核苷支路降解的关键基因，核苷合成途径需要腺嘌呤用于菌体生长代谢，所以adeC基因弱化或失活有利于嘌呤核苷合成。

之前有文献报道过可敲除该基因用于核黄素生产，敲除该基因可能会影响菌体生长，但没有通过点突变方式对该基因进行修饰。本发明则是通过adeC^P135S和adeC^F158fs突变达到adeC基因弱化的目的。

nupC编码嘧啶核苷酸转运蛋白，是嘧啶合成途径的关键调节酶，与嘌呤合成存在竞争，该酶活的高低直接影响进入嘌呤合成途径的通量。故降低该酶酶活对于提高嘌呤途径的通量以及核苷类代谢产物或源于嘌呤途径代谢物的积累具有重要的意义。本发明则是通过nupC^T175P和nupC^Q231*突变失活嘧啶核苷酸转运蛋白，进而提高核苷产量。

作为优选，所述野生型腺嘌呤脱氨酶源自解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌；优选所述腺嘌呤脱氨酶突变体的序列如SEQ ID NO.2(含P135S突变)、SEQ ID NO.4(含F158fs突变)、SEQ ID NO.10(含P135S突变)或SEQ ID NO.12(含F158fs突变)所示。

作为优选，所述野生型嘧啶核苷酸转运蛋白源自解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌；优选所述嘧啶核苷酸转运蛋白突变体的序列如SEQ ID NO.6(含T175P突变)、SEQ IDNO.8(含Q231*突变)、SEQ ID NO.14(含T175P突变)、或SEQ ID NO.16(含Q231*突变)所示。

本领域技术人员应该理解，在上述蛋白突变体序列的N端或C端添加标签蛋白或将其与其他蛋白进行融合形成融合蛋白，在不改变上述突变蛋白本身的活性的情况下，上述添加标签的蛋白或融合蛋白也在本发明的保护范围内。

第二方面，本发明还提供编码所述的蛋白突变体的核酸。

根据上述提供的蛋白突变体，本领域技术人员能够获得其编码核酸的序列。基于密码子的简并性，编码上述氨基酸序列的核酸序列不止一种，所有能够编码上述蛋白突变体的核酸均在本发明的保护范围内。

优选地，编码野生型腺嘌呤脱氨酶的核酸源自解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。

作为优选方案，编码所述腺嘌呤脱氨酶突变体的基因的核苷酸的序列如SEQ IDNO.1(含P135S突变)、SEQ ID NO.3(含F158fs突变)、SEQ ID NO.9(含P135S突变)或SEQ IDNO.11(含F158fs突变)所示。

优选地，编码野生型嘧啶核苷酸转运蛋白的核酸源自解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。

作为优选方案，编码所述嘧啶核苷酸转运蛋白突变体的基因的核苷酸的序列如SEQ ID NO.5(含T175P突变)、SEQ ID NO.7(含Q231*突变)、SEQ ID NO.13(含T175P突变)、或SEQ ID NO.15(含Q231*突变)所示。

进一步的，本发明还提供含有所述核酸的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

所述表达盒为在所述核酸的上游或下游连接用于驱动其转录、表达的元件得到的重组核酸分子。

所述载体可为表达载体或克隆载体，包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、转座子等。

所述宿主细胞包括但不限于菌株细胞。

第三方面，本发明提供所述的蛋白突变体或所述的核酸或所述的生物材料在以下任一方面的应用：

(1)构建高产核苷或其衍生物的菌株；

(2)筛选高产核苷或其衍生物的菌株。

优选所述菌株选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、产氨棒杆菌中的一种。

优选所述核苷为腺苷、肌苷、鸟苷、黄苷中的一种或几种；所述衍生物为肌苷酸、鸟苷酸、黄苷酸、次黄苷酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、核黄素中的一种或几种。

进一步的，本发明还提供一种核苷生产菌株，其表达所述的蛋白突变体；和/或，其含有所述的核酸。

作为优选，所述核苷生产菌株同时表达所述腺嘌呤脱氨酶突变体和嘧啶核苷酸转运蛋白突变体；和/或，其同时含有编码所述腺嘌呤脱氨酶突变体和嘧啶核苷酸转运蛋白突变体的核酸。

作为一种优选方案，所述核苷生产菌株同时表达第135位脯氨酸突变为丝氨酸的腺嘌呤脱氨酶突变体(优选序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.10所示)和第231位谷氨酰胺无义突变的嘧啶核苷酸转运蛋白突变体(优选序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.16所示)；和/或，其同时含有编码上述腺嘌呤脱氨酶突变体和嘧啶核苷酸转运蛋白突变体的核酸，即同时含有序列如下所示的核酸：a)选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9中的至少一个；以及，b)选自SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.15中的至少一个。

作为优选，所述核苷生产菌株选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、产氨棒杆菌中的一种。

进一步优选地，所述核苷生产菌株为枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。

在一些实施方案中，所述枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的构建方法包括：

步骤A、分别制备adeC^P135S、adeC^F158fs、nupC^T175P、nupC^Q231*点突变基因片段，与载体连接分别获得单一位点突变质粒；

步骤B、通过单一点突变质粒单独或依次转化B.amyloliquefaciens 13952(Δupp)或B.subtilis168(Δupp)菌株，获得表达对应蛋白突变体(或含有编码所述突变体)的菌株。

在一些实施方案中，步骤A中的所述载体为pKSU。

在一些实施方案中，所述两个单一位点突变质粒分别为pKSU-adeC*，pKSU-nupC*，单一位点突变质粒分别转化B.amyloliquefaciens 13952(Δupp)，获得单一位点突变的解淀粉芽孢杆菌菌株；单一位点突变质粒分别转化B.subtilis168(Δupp)，获得单一位点突变的枯草芽孢杆菌菌株。

在一些实施方案中，步骤B具体为：两个单一点突变质粒依次转化B.amyloliquefaciens 13952(Δupp)、B.subtilis168(Δupp)菌株获得两个位点、三个位点或四个位点均发生点突变的解淀粉芽孢杆菌菌株和枯草芽孢杆菌菌株。

经实验发现，同出发菌株B.amyloliquefaciens13952Δupp相比，工程菌的核苷积累量都有提高，引入adeC^F158fs突变的菌株和引入nupC^Q231*突变的菌株积累较少，引入adeC^F158fs&nupC^Q231*突变的菌株积累较多，两个蛋白发生四处点突变的菌株核苷积累最多，说明这两个位点的突变在核苷积累中起到了主要作用。

同出发菌株B.subtilis168Δupp相比，工程菌的核苷积累量都有提高，引入adeC^P135S突变的菌株和引入nupC^Q231*突变的菌株积累较少，而该四位点任意组合突变菌株(如引入adeC^F158fs&nupC^Q231*突变的菌株)积累核苷产量均会变多，两个蛋白发生四处点突变的菌株核苷积累最多，说明这两个位点的突变在核苷积累中均起到了主要作用。

第四方面，本发明还提供所述的菌株在生产核苷或其衍生物中的应用。

具体的，本发明进一步提供一种生产核苷或其衍生物的方法，其包括：培养所述的菌株，以产生、积累和收集核苷。

作为优选，所述方法包括：将所述菌株接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵。

其中，当所述菌株为芽孢杆菌时，优选所述种子培养基配方(g/L)为：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH 7.0～7.2；

优选所述发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖60，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，味精10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，pH 7.0～7.2；

优选所述发酵的条件为35-36℃。

优选发酵时间为40-50h。

在一个优选的实施方式中，所述发酵的条件为35.5℃，发酵46h。

基于上述技术方案，本发明的有益效果如下：

本发明通过点突变即可实现对菌株核苷产量的提升，可有效积累菌株所产生的肌苷、腺苷及其它核苷类相关产品，且不影响菌体生长，实用性更广，有利于降低核苷工业化生产的成本。

附图说明

图1为本发明实施例中解淀粉芽孢杆菌菌株的产肌苷水平比较结果。

图2为本发明实施例中枯草芽孢杆菌菌株的产肌苷水平比较结果。

图3为本发明实施例中工程菌株B.subtilis-E10-1、E10-2、E10-3、E10-4和B.subtilis A5的腺苷合成能力对比结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明所用到的原始菌株B.amyloliquefaciens 13952、B.subtilis 168为实验室保存，其可通过市售途径获得；B.subtilis A5已在CN110257315A中得到公开。本发明所用到的腺苷和肌苷标准品从Sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买，所用DNA聚合酶、DNA纯化试剂盒、限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从Thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。

各实施例涉及引物的序列如表1所示(由上至下依次为SEQ ID NO.17-40)。

表1引物序列

引物	序列5'→3'
		adeC-A-1f	caaaataaggatcctctagagtcgacgacatttatcgtgtaagcgg
adeC-A-1r-1	cgcgggaacacaggaagaaagcatgaaacgaat
		adeC-A-2f-1	attcgtttcatgctttcttcctgtgttcccgcg
adeC-A-1r-2	ttcctgataaaaaggctttaaatctgcggctttaaatctgcggc
		adeC-A-2f-2	gccgcagatttaaagccgcagatttaaagcctttttatcaggaa
adeC-A-2r	ccagtgccaagcttgcatgcctgcagataaacagcagatctgcgtc
		nupC-A-1f	caaaataaggatcctctagagtcgacatgaagtatttcatcggaat
nupC-A-1r-1	attgacattgagaccggcgacattgcggatgc
		nupC-A-2f-1	gcatccgcaatgtcgccggtctcaatgtcaat
nupC-A-1r-2	acttcgaaaaaggattatttttcttcttcagga
		nupC-A-2f-2	tcctgaagaagaaaaataatcctttttcgaagt
nupC-A-2r	ccagtgccaagcttgcatgcctgcagtcagtgaatcaatcccacga
		adeC-S-1f	caaaataaggatcctctagagtcgacttgaataaagaagcgctagt
adeC-S-1r-1	gcaggcacactggaagaaagcataaaatggatat
		adeC-S-2f-1	atatccattttatgctttcttccagtgtgcctgc
adeC-S-1r-2	ttcttcataaaaaggcttgagatcggcggcttgagatcggcag
		adeC-S-2f-2	ctgccgatctcaagccgccgatctcaagcctttttatgaagaa
adeC-S-2r	ccagtgccaagcttgcatgcctgcagctttgtatctaatccgtagc
		nupC-S-1f	caaaataaggatcctctagagtcgacatgaagtatttgattgggat
nupC-S-1r-1	cgacattgatacaggtgacatcgcagatgc
		nupC-S-2f-1	gcatctgcgatgtcacctgtatcaatgtcg
nupC-S-1r-2	cttcgaagaaggattatttttcttcttcctc
		nupC-S-2f-2	gaggaagaagaaaaataatccttcttcgaag
nupC-S-2r	ccagtgccaagcttgcatgcctgcagtcagtaaatcaagcccacaa

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1：工程菌株B.amyloliquefaciens G4(adeC^P135S)，G5(adeC^F158fs)的构建

用引物adeC-A-1f/1r-1和adeC-A-2f-1/2r；adeC-A-1f/1r-2和adeC-A-2f-2/2r，以B.amyloliquefaciens 13952基因组为模板，使用pfu高保真DNA聚合酶扩增分别得到adeC两位点的上下游同源臂；用引物adeC-A-1f/2r分别融合上下游片段分别得到adeC*¹同源片段(含P135S突变，完整adeC*¹基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示共1734bp，突变后氨基酸序列如SEQ ID No.2所示共578个氨基酸序列)和adeC*²同源片段(含F158fs突变，完整adeC*²基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示共1748bp，突变后氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示共582个氨基酸序列)，将2个片段与pKSU(工具载体)质粒经SalI/PstI双酶切、连接、转化等操作后得到质粒pKSU-adeC*¹和pKSU-adeC*²。通过电化学转化至B.amyloliquefaciens 13952中，用含2.5μg/mL氯霉素的LB平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml LB液体中，42℃、200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含5μg/mL的氯霉素LB平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml LB液体中，42℃、200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μM 5-FU的LB平板筛选二次重组子，得到在B.amyloliquefaciens 13952(Δupp)引入adeC^P135S的B.amyloliquefaciens G4菌株，引入adeC^F158fs的B.amyloliquefaciens G5菌株。

实施例2：工程菌株B.amyloliquefaciens G6(nupC^T175P)，G7(nupC^Q231*)的构建

用引物nupC-A-1f/1r-1和nupC-A-2f-1/2r；nupC-A-1f/1r-2和nupC-A-2f-2/2r，以B.amyloliquefaciens 13952基因组为模板，使用pfu高保真DNA聚合酶扩增分别得到nupC两位点的上下游同源臂；用引物nupC-A-1f/2r分别融合上下游片段分别得到nupC*¹同源片段(含T175P突变，完整nupC*¹基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示共1182bp，突变后氨基酸序列如SEQ ID No.6所示共393个氨基酸序列)nupC*²同源片段(含Q231*突变，完整nupC*²基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示共1182bp，突变后氨基酸序列如SEQ ID No.8所示共393个氨基酸序列)，将2个片段与pKSU(工具载体)质粒经SalI/PstI双酶切、连接、转化等操作后得到质粒pKSU-nupC*¹和pKSU-nupC*²。通过电化学转化至B.amyloliquefaciens13952中，筛选方法同实施例1，得到在B.amyloliquefaciens 13952(Δupp)引入nupC^T175P的B.amyloliquefaciens G6菌株，引入nupC^Q231*的B.amyloliquefaciens G7菌株。

实施例3：工程菌株B.amyloliquefaciens G8构建(引入adeC^F158fs&nupC^Q231*突变)

将质粒pKSU-nupC*²转化至B.amyloliquefaciens G5菌株中，获得工程菌B.amyloliquefaciens G8(adeC^F158fs&nupC^Q231*突变)，筛选方法同实施例1。

实施例4：工程菌株B.subtilis E4(adeC^P135S)，E5(adeC^F158fs)的构建

用引物adeC-S-1f/1r-1和adeC-S-2f-1/2r；adeC-S-1f-2/1r和adeC-S-2f-2/2r，以B.subtilis 168基因组为模板，使用pfu高保真DNA聚合酶扩增分别得到adeC*³和adeC*⁴的上下游同源臂；用引物adeC-S-1f/2r分别融合上下游片段分别得到adeC*³同源片段(含P135S突变，完整adeC*³基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示共1734bp，突变后氨基酸序列如SEQ ID No.10所示共578个氨基酸序列)和adeC*⁴同源片段(含F158fs突变，完整adeC*⁴基因的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示共1748bp，突变后氨基酸序列如SEQ ID No.12所示共582个氨基酸序列)，将2个片段与pKSU(工具载体)质粒经SalI/PstI双酶切、连接、转化等操作后得到质粒pKSU-adeC*³和pKSU-adeC*⁴。通过电化学转化至B.subtilis168中，用含2.5μg/mL氯霉素的LB平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到5ml LB液体中，42℃、200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含5μg/mL的氯霉素LB平板获得一次重组子；将一次重组子接到5ml LB液体中，42℃、200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μM 5-FU的LB平板筛选二次重组子，得到在B.subtilis168(Δupp)引入adeC^P135S的B.subtilis E4菌株，引入adeC^F158fs的B.subtilis E5菌株。

实施例5：工程菌株B.subtilis E6(nupC^T175P)，E7(nupC^Q231*)的构建

用引物nupC-A-1f/1r-1和nupC-A-2f-1/2r；nupC-A-1f/1r-2和nupC-A-2f-2/2r，以B.subtilis 13952基因组为模板，使用pfu高保真DNA聚合酶扩增分别得到nupC两位点的上下游同源臂；用引物nupC-A-1f/2r分别融合上下游片段分别得到nupC*³同源片段(含T175P突变，完整nupC*³基因的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示共1182bp，突变后氨基酸序列如SEQ ID No.14所示共393个氨基酸序列)nupC*⁴同源片段(含Q231*突变，完整nupC*⁴基因的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示共1182bp，突变后氨基酸序列如SEQ ID No.16所示共393个氨基酸序列)，将2个片段与pKSU(工具载体)质粒经SalI/PstI双酶切、连接、转化等操作后得到质粒pKSU-nupC*³和pKSU-nupC*⁴。通过电化学转化至B.subtilis 168中，筛选方法同实施例1，得到在B.subtilis 168(Δupp)引入nupC^T175P的B.subtilis E6菌株，引入nupC^Q231*的B.subtilis E7菌株。

实施例6：工程菌株B.subtilis E8构建(引入adeC^F158fs&nupC^Q231*突变)

将质粒pKSU-nupC*⁴转化至B.subtilis E5菌株中，获得工程菌B.subtilis E8(adeC^F158fs&nupC^Q231*突变)，筛选方法同实施例1。

实施例7：工程菌株B.amyloliquefaciens G4、G5、G6、G7、G8、和B.amyloliquefaciens 13952以及B.subtilis-E4、E5、E6、E7、E8和168肌苷合成能力对比

1.培养基：

(1)种子培养基配方(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH 7.0～7.2，121℃下灭菌20min。

(2)发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖60，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，味精10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，pH 7.0～7.2，121℃下灭菌20min。

2.培养方法

(1)将菌株三区划线LB平板，37℃过夜培养；

(2)挑单菌落接种至30mL种子培养基中，110rpm，36℃培养7～8h；

(3)按10％接种量转接至30ml发酵培养基中，摇床转速130rpm，35.5℃培养46h；

解淀粉芽孢杆菌菌株的发酵结果见图1，从结果可以看出，同出发菌株B.amyloliquefaciens13952相比，工程菌的核苷积累量都有提高，G4(adeC^P135S)和G5(adeC^F158fs)单点工程菌分别积累肌苷0.44g/L和0.37g/L，说明adeC^P135S和adeC^F158fs的引入能够降低腺嘌呤脱氨酶活性，增加产苷。G7(nupC^T175P)和G8(nupC^Q231*)单点工程菌肌苷分别提高0.51g/L和0.34g/L，说明nupC^T175P和nupC^Q231*的引入能够降低嘧啶核苷酸转运蛋白活性，增加嘌呤核苷产量提升，尤其是肌苷。两个蛋白发生两处点突变的B.amyloliquefaciens G8菌株肌苷积累最多，提高了1.13g/L，说明这两个蛋白的突变在在解淀粉芽孢杆菌的核苷积累中起到了主要作用。

枯草芽孢杆菌菌株的发酵结果见图2，从结果可以看出，同出发菌株B.subtilis168相比，工程菌的核苷积累量都有提高，E4(adeC^P135S)和E5(adeC^F158fs)单点工程菌分别积累肌苷33.9mg/L和37.7mg/L，说明adeC^P135S和adeC^F158fs的引入能够降低腺嘌呤脱氨酶活性，增加产苷。E7(nupC^T175P)和E8(nupC^Q231*)单点工程菌肌苷分别提高53.4mg/L和33.7mg/L，说明nupC^T175P和nupC^Q231*的引入能够降低嘧啶核苷酸转运蛋白活性，增加嘌呤核苷产量提升，尤其是肌苷。两个蛋白发生两处点突变的B.subtilis E8菌株肌苷积累最多，提高了99.5mg/L，说明这两个蛋白的突变在枯草芽孢杆菌的核苷积累中起到了主要作用。

实施例12：工程菌株B.subtilis E10-1、E10-2(引入adeC^P135S&adeC^F158fs突变)、E10-3和E10-4构建(引入nupC^T175P&nupC^Q231*突变)

将质粒pKSU-adeC*¹转化至B.subtilis A5菌株中，获得工程菌B.subtilis E10-1。将质粒pKSU-adeC*²转化至B.subtilis E10-1菌株中，获得工程菌B.subtilis E10-2(adeC^P135S&adeC^F158fs突变)，E10-3及E10-4构建方法同上，以上筛选方法均同实施例6。

实施例13：工程菌株B.subtilis-E10-1、E10-2、E10-3、E10-4和B.subtilis A5腺苷合成能力对比

培养基及发酵方法同实施例5，发酵结果见图3，从结果可以看出，同出发菌株B.subtilis A5相比，工程菌的核苷积累量都有提高，E10-1(adeC^P135S)和E10-2(adeC^F158fs)单点工程菌腺苷分别提高1.6g/L和1g/L，E10-3(nupC^T175P)和E10-4(nupC^Q231*)单点工程菌腺苷提高2.3g/L和0.7g/L，说明枯草芽孢杆菌这两个位点的突变在核苷积累中起到了主要作用。

参照上述方式，发明人还对其他的突变组合方式进行了多次实验，最终发现，该四种突变体任意组合突变工程菌所提升腺苷产量均大于单点突变工程菌，说明两基因位点均为核苷生产菌重要位点，且组合后效果更佳。

本发明中的菌株代号如B.subtilis E4和B.subtilis E5等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。上述方法构建的包含腺嘌呤脱氨酶基因adeC和嘧啶核苷酸转运蛋白基因nupC的工程菌的用途，包括但是不局限于生产核苷。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 梅花（上海）生物科技有限公司

<120> 可提高菌株核苷产量的蛋白突变体及其应用

<130> KHP211117891.1

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1734

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgaacaaag aaacactggc tgaacggctg aatgcatcag ccggcagaca aaaagccgat 60

accgtcatta aaaacggaaa aatcatggat gtatttaacc aggaatggat ttctgcagat 120

atcgccatta cggacggagt gattgtcgga ttgggcgagt atgaagggaa agaagtcatt 180

gatgcagaag gtcaaatgat cgttccgggc tttattgacg gacatgttca tatcgagtcc 240

tctatggtta ctccgattga atttgcaaaa gccgtcctcc cccacggagt gactactgtc 300

attactgatc ctcacgaaat tgcgaacgtt tccggggcaa aaggcatttc atttatgata 360

gagcaggcga aaaaagcgcc tctgaacatt cgtttcatgc tttcttcctg tgttcccgcg 420

gcaagctttg aacgctcagg agctgtatta aaagccgcag atttaaagcc tttttatcag 480

gaaaaagagg tgctggggct tgcggaagtt atggattatg tgtctgttgc ggaaggcgaa 540

gaggatatgc ttgagaaact gcttgatgcc aagcatcacg gaaagcggat tgacgggcat 600

ttagccggac tgtcttcaga tatcatcaat atatacagga ccgcatcggt gtcaaatgat 660

catgaagtga cgacaaaagc cgaggcgctg gacagaatca gacggggaat gtatgtcatg 720

ctgcgcgaag gatcggtggc taaaaatacg ctcaatgtgc tgccggcggt gaatgaaaaa 780

aatgcacggc gctttttctt ttgtacggat gataaacatg tagacgatct gctttcagaa 840

ggaagtgtga accaccaagt caaaatggcg ataaaggcgg gacttgatcc attccttgcg 900

tatcagctcg ccagcttaaa tgcggccgag tgctacgacc ttgaaacaaa aggggcggtt 960

gcgccgggtt ttgacgcaga tctgctgttt atttcagatt tgcgggaggc tgccgtcacg 1020

aagaccatgg tcgccggacg gaccgttgcc gagaacggac gcacggttta tgaacagtct 1080

gccggctctt attctccgga tcaggcgctg ttggatacag tgcggctgaa agcgccgctc 1140

actgaatctg attttcatat gccgattcaa gagggcaggc aaatgaatgt aatcgaaatc 1200

ataccgaatc atttggaaac gaggaaaaaa gaagtgcctg cgccatctgc tgacgcattt 1260

tgttctgata cacaaaatga tttattaaaa atcgccgtcg cagagcggca cagcggagaa 1320

aaaatgatag ggctcggaat tgtacaagga ttcgggttaa aagaaggcgc cattgccaca 1380

accatttctc acgattccca caatatcatc gctgtcggta caaacgatgc cgatttggca 1440

agagcaatca acaggctccg tgacaccggg ggagggttaa cagccgtgaa aaacggagaa 1500

ttgcttcact ctgttccgct tccgatcgcc gggcttttgt ctgataagtc cgcggaatgg 1560

gtgaatgaca gtttgggcgt gcttcatgaa aagcttcctc tgctcggatt caccggtgat 1620

ttcaacccgt ttctcacatt atcgttttta gcgcttcccg tcattccgga cattaaaatg 1680

acggcagcgg gtctgtttga tgttaaggcc tttcagcata ttccgcttca ataa 1734

<210> 2

<211> 577

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asn Lys Glu Thr Leu Ala Glu Arg Leu Asn Ala Ser Ala Gly Arg

1 5 10 15

Gln Lys Ala Asp Thr Val Ile Lys Asn Gly Lys Ile Met Asp Val Phe

20 25 30

Asn Gln Glu Trp Ile Ser Ala Asp Ile Ala Ile Thr Asp Gly Val Ile

35 40 45

Val Gly Leu Gly Glu Tyr Glu Gly Lys Glu Val Ile Asp Ala Glu Gly

50 55 60

Gln Met Ile Val Pro Gly Phe Ile Asp Gly His Val His Ile Glu Ser

65 70 75 80

Ser Met Val Thr Pro Ile Glu Phe Ala Lys Ala Val Leu Pro His Gly

85 90 95

Val Thr Thr Val Ile Thr Asp Pro His Glu Ile Ala Asn Val Ser Gly

100 105 110

Ala Lys Gly Ile Ser Phe Met Ile Glu Gln Ala Lys Lys Ala Pro Leu

115 120 125

Asn Ile Arg Phe Met Leu Ser Ser Cys Val Pro Ala Ala Ser Phe Glu

130 135 140

Arg Ser Gly Ala Val Leu Lys Ala Ala Asp Leu Lys Pro Phe Tyr Gln

145 150 155 160

Glu Lys Glu Val Leu Gly Leu Ala Glu Val Met Asp Tyr Val Ser Val

165 170 175

Ala Glu Gly Glu Glu Asp Met Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala Lys His

180 185 190

His Gly Lys Arg Ile Asp Gly His Leu Ala Gly Leu Ser Ser Asp Ile

195 200 205

Ile Asn Ile Tyr Arg Thr Ala Ser Val Ser Asn Asp His Glu Val Thr

210 215 220

Thr Lys Ala Glu Ala Leu Asp Arg Ile Arg Arg Gly Met Tyr Val Met

225 230 235 240

Leu Arg Glu Gly Ser Val Ala Lys Asn Thr Leu Asn Val Leu Pro Ala

245 250 255

Val Asn Glu Lys Asn Ala Arg Arg Phe Phe Phe Cys Thr Asp Asp Lys

260 265 270

His Val Asp Asp Leu Leu Ser Glu Gly Ser Val Asn His Gln Val Lys

275 280 285

Met Ala Ile Lys Ala Gly Leu Asp Pro Phe Leu Ala Tyr Gln Leu Ala

290 295 300

Ser Leu Asn Ala Ala Glu Cys Tyr Asp Leu Glu Thr Lys Gly Ala Val

305 310 315 320

Ala Pro Gly Phe Asp Ala Asp Leu Leu Phe Ile Ser Asp Leu Arg Glu

325 330 335

Ala Ala Val Thr Lys Thr Met Val Ala Gly Arg Thr Val Ala Glu Asn

340 345 350

Gly Arg Thr Val Tyr Glu Gln Ser Ala Gly Ser Tyr Ser Pro Asp Gln

355 360 365

Ala Leu Leu Asp Thr Val Arg Leu Lys Ala Pro Leu Thr Glu Ser Asp

370 375 380

Phe His Met Pro Ile Gln Glu Gly Arg Gln Met Asn Val Ile Glu Ile

385 390 395 400

Ile Pro Asn His Leu Glu Thr Arg Lys Lys Glu Val Pro Ala Pro Ser

405 410 415

Ala Asp Ala Phe Cys Ser Asp Thr Gln Asn Asp Leu Leu Lys Ile Ala

420 425 430

Val Ala Glu Arg His Ser Gly Glu Lys Met Ile Gly Leu Gly Ile Val

435 440 445

Gln Gly Phe Gly Leu Lys Glu Gly Ala Ile Ala Thr Thr Ile Ser His

450 455 460

Asp Ser His Asn Ile Ile Ala Val Gly Thr Asn Asp Ala Asp Leu Ala

465 470 475 480

Arg Ala Ile Asn Arg Leu Arg Asp Thr Gly Gly Gly Leu Thr Ala Val

485 490 495

Lys Asn Gly Glu Leu Leu His Ser Val Pro Leu Pro Ile Ala Gly Leu

500 505 510

Leu Ser Asp Lys Ser Ala Glu Trp Val Asn Asp Ser Leu Gly Val Leu

515 520 525

His Glu Lys Leu Pro Leu Leu Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asn Pro Phe

530 535 540

Leu Thr Leu Ser Phe Leu Ala Leu Pro Val Ile Pro Asp Ile Lys Met

545 550 555 560

Thr Ala Ala Gly Leu Phe Asp Val Lys Ala Phe Gln His Ile Pro Leu

565 570 575

Gln

<210> 3

<211> 1748

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgaacaaag aaacactggc tgaacggctg aatgcatcag ccggcagaca aaaagccgat 60

accgtcatta aaaacggaaa aatcatggat gtatttaacc aggaatggat ttctgcagat 120

atcgccatta cggacggagt gattgtcgga ttgggcgagt atgaagggaa agaagtcatt 180

gatgcagaag gtcaaatgat cgttccgggc tttattgacg gacatgttca tatcgagtcc 240

tctatggtta ctccgattga atttgcaaaa gccgtcctcc cccacggagt gactactgtc 300

attactgatc ctcacgaaat tgcgaacgtt tccggggcaa aaggcatttc atttatgata 360

gagcaggcga aaaaagcgcc tctgaacatt cgtttcatgc ttccttcctg tgttcccgcg 420

gcaagctttg aacgctcagg agctgtatta aaagccgcag atttaaagcc gcagatttaa 480

agccttttta tcaggaaaaa gaggtgctgg ggcttgcgga agttatggat tatgtgtctg 540

ttgcggaagg cgaagaggat atgcttgaga aactgcttga tgccaagcat cacggaaagc 600

ggattgacgg gcatttagcc ggactgtctt cagatatcat caatatatac aggaccgcat 660

cggtgtcaaa tgatcatgaa gtgacgacaa aagccgaggc gctggacaga atcagacggg 720

gaatgtatgt catgctgcgc gaaggatcgg tggctaaaaa tacgctcaat gtgctgccgg 780

cggtgaatga aaaaaatgca cggcgctttt tcttttgtac ggatgataaa catgtagacg 840

atctgctttc agaaggaagt gtgaaccacc aagtcaaaat ggcgataaag gcgggacttg 900

atccattcct tgcgtatcag ctcgccagct taaatgcggc cgagtgctac gaccttgaaa 960

caaaaggggc ggttgcgccg ggttttgacg cagatctgct gtttatttca gatttgcggg 1020

aggctgccgt cacgaagacc atggtcgccg gacggaccgt tgccgagaac ggacgcacgg 1080

tttatgaaca gtctgccggc tcttattctc cggatcaggc gctgttggat acagtgcggc 1140

tgaaagcgcc gctcactgaa tctgattttc atatgccgat tcaagagggc aggcaaatga 1200

atgtaatcga aatcataccg aatcatttgg aaacgaggaa aaaagaagtg cctgcgccat 1260

ctgctgacgc attttgttct gatacacaaa atgatttatt aaaaatcgcc gtcgcagagc 1320

ggcacagcgg agaaaaaatg atagggctcg gaattgtaca aggattcggg ttaaaagaag 1380

gcgccattgc cacaaccatt tctcacgatt cccacaatat catcgctgtc ggtacaaacg 1440

atgccgattt ggcaagagca atcaacaggc tccgtgacac cgggggaggg ttaacagccg 1500

tgaaaaacgg agaattgctt cactctgttc cgcttccgat cgccgggctt ttgtctgata 1560

agtccgcgga atgggtgaat gacagtttgg gcgtgcttca tgaaaagctt cctctgctcg 1620

gattcaccgg tgatttcaac ccgtttctca cattatcgtt tttagcgctt cccgtcattc 1680

cggacattaa aatgacggca gcgggtctgt ttgatgttaa ggcctttcag catattccgc 1740

ttcaataa 1748

<210> 4

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Asn Lys Glu Thr Leu Ala Glu Arg Leu Asn Ala Ser Ala Gly Arg

1 5 10 15

Gln Lys Ala Asp Thr Val Ile Lys Asn Gly Lys Ile Met Asp Val Phe

20 25 30

Asn Gln Glu Trp Ile Ser Ala Asp Ile Ala Ile Thr Asp Gly Val Ile

35 40 45

Val Gly Leu Gly Glu Tyr Glu Gly Lys Glu Val Ile Asp Ala Glu Gly

50 55 60

Gln Met Ile Val Pro Gly Phe Ile Asp Gly His Val His Ile Glu Ser

65 70 75 80

Ser Met Val Thr Pro Ile Glu Phe Ala Lys Ala Val Leu Pro His Gly

85 90 95

Val Thr Thr Val Ile Thr Asp Pro His Glu Ile Ala Asn Val Ser Gly

100 105 110

Ala Lys Gly Ile Ser Phe Met Ile Glu Gln Ala Lys Lys Ala Pro Leu

115 120 125

Asn Ile Arg Phe Met Leu Pro Ser Cys Val Pro Ala Ala Ser Phe Glu

130 135 140

Arg Ser Gly Ala Val Leu Lys Ala Ala Asp Leu Lys Pro Gln Ile

145 150 155

<210> 5

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaagtatt tcatcggaat tatcggaatc attgtgtttt taggtcttgc ctggctcgcc 60

agcaacggca aaaaaagaat cagaatccgg ccgatcgccg tcatgctcgt tttgcagctg 120

attctcggtt acattctcct caataccggg atcgggaatt ttcttgtcgg cggatttgcc 180

aaaggattta actacttgct ggaatatgca tcagaaggga ttaactttgt attcggcgga 240

cttgtgaatg cgaaacagac gacattcttc atgagcgtgc tcctgccgat cgtctttata 300

tccgctttaa tcggaatatt gcagcattgg aaggttctcc ctttcatcac gaagtatatc 360

ggtcttgcat taagcaaggt gaacggaatg gggaaaatcg aatcttacaa cgctgtcgca 420

tccgcgattt tgggtcagtc ggaagttttt atcagcttga aaaaacagct cggctatctt 480

actgaacagc gcttatacac gctttgcgca tccgcaatgt cgccggtctc aatgtcaatc 540

gtcggttctt acatgatgat gctgaagcct gaatacgtcg tgacggcgct tgtgctgaac 600

ttattcggcg gatttatcat tgcttctatc atcaacccgt acaccgtcag caaagatgag 660

gatttgatcg ttgttcctga agaagaaaaa caatcctttt tcgaagtgct cggtgagtat 720

ataatggatg gattcagagt cgccgttgtc gtagcggcga tgctgatcgg atttgtcgca 780

ctcattgccc tggtcaatgg cgtttttaac gcggtcttcg gcattacatt ccaggcgctg 840

ctcggctatg tatttgcgcc attcgcgttt ttaaccggta ttccgtggaa tgaagcggtg 900

agtgccggaa gcattatggc gacgaaaatg gtatcgaatg aatttgtggc gatgcagacg 960

ctctcatccg gcgatttcca tttcagtgcg catactcagg cagtggtatc tgtattcctt 1020

gtctcatttg cgaatttctc ttctatcgga atcattacgg gtgcggtgaa agggctgcat 1080

gaaaaacaag gaaacgtcgt cgcgcggttc gggctgaagc tgctgtacgg ggcaacgctc 1140

gtcagcttcc tgacagcggc gatcgtggga ttgattcact ga 1182

<210> 6

<211> 393

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Lys Tyr Phe Ile Gly Ile Ile Gly Ile Ile Val Phe Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ala Trp Leu Ala Ser Asn Gly Lys Lys Arg Ile Arg Ile Arg Pro Ile

20 25 30

Ala Val Met Leu Val Leu Gln Leu Ile Leu Gly Tyr Ile Leu Leu Asn

35 40 45

Thr Gly Ile Gly Asn Phe Leu Val Gly Gly Phe Ala Lys Gly Phe Asn

50 55 60

Tyr Leu Leu Glu Tyr Ala Ser Glu Gly Ile Asn Phe Val Phe Gly Gly

65 70 75 80

Leu Val Asn Ala Lys Gln Thr Thr Phe Phe Met Ser Val Leu Leu Pro

85 90 95

Ile Val Phe Ile Ser Ala Leu Ile Gly Ile Leu Gln His Trp Lys Val

100 105 110

Leu Pro Phe Ile Thr Lys Tyr Ile Gly Leu Ala Leu Ser Lys Val Asn

115 120 125

Gly Met Gly Lys Ile Glu Ser Tyr Asn Ala Val Ala Ser Ala Ile Leu

130 135 140

Gly Gln Ser Glu Val Phe Ile Ser Leu Lys Lys Gln Leu Gly Tyr Leu

145 150 155 160

Thr Glu Gln Arg Leu Tyr Thr Leu Cys Ala Ser Ala Met Ser Pro Val

165 170 175

Ser Met Ser Ile Val Gly Ser Tyr Met Met Met Leu Lys Pro Glu Tyr

180 185 190

Val Val Thr Ala Leu Val Leu Asn Leu Phe Gly Gly Phe Ile Ile Ala

195 200 205

Ser Ile Ile Asn Pro Tyr Thr Val Ser Lys Asp Glu Asp Leu Ile Val

210 215 220

Val Pro Glu Glu Glu Lys Gln Ser Phe Phe Glu Val Leu Gly Glu Tyr

225 230 235 240

Ile Met Asp Gly Phe Arg Val Ala Val Val Val Ala Ala Met Leu Ile

245 250 255

Gly Phe Val Ala Leu Ile Ala Leu Val Asn Gly Val Phe Asn Ala Val

260 265 270

Phe Gly Ile Thr Phe Gln Ala Leu Leu Gly Tyr Val Phe Ala Pro Phe

275 280 285

Ala Phe Leu Thr Gly Ile Pro Trp Asn Glu Ala Val Ser Ala Gly Ser

290 295 300

Ile Met Ala Thr Lys Met Val Ser Asn Glu Phe Val Ala Met Gln Thr

305 310 315 320

Leu Ser Ser Gly Asp Phe His Phe Ser Ala His Thr Gln Ala Val Val

325 330 335

Ser Val Phe Leu Val Ser Phe Ala Asn Phe Ser Ser Ile Gly Ile Ile

340 345 350

Thr Gly Ala Val Lys Gly Leu His Glu Lys Gln Gly Asn Val Val Ala

355 360 365

Arg Phe Gly Leu Lys Leu Leu Tyr Gly Ala Thr Leu Val Ser Phe Leu

370 375 380

Thr Ala Ala Ile Val Gly Leu Ile His

385 390

<210> 7

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaagtatt tcatcggaat tatcggaatc attgtgtttt taggtcttgc ctggctcgcc 60

agcaacggca aaaaaagaat cagaatccgg ccgatcgccg tcatgctcgt tttgcagctg 120

attctcggtt acattctcct caataccggg atcgggaatt ttcttgtcgg cggatttgcc 180

aaaggattta actacttgct ggaatatgca tcagaaggga ttaactttgt attcggcgga 240

cttgtgaatg cgaaacagac gacattcttc atgagcgtgc tcctgccgat cgtctttata 300

tccgctttaa tcggaatatt gcagcattgg aaggttctcc ctttcatcac gaagtatatc 360

ggtcttgcat taagcaaggt gaacggaatg gggaaaatcg aatcttacaa cgctgtcgca 420

tccgcgattt tgggtcagtc ggaagttttt atcagcttga aaaaacagct cggctatctt 480

actgaacagc gcttatacac gctttgcgca tccgcaatgt cgacggtctc aatgtcaatc 540

gtcggttctt acatgatgat gctgaagcct gaatacgtcg tgacggcgct tgtgctgaac 600

ttattcggcg gatttatcat tgcttctatc atcaacccgt acaccgtcag caaagatgag 660

gatttgatcg ttgttcctga agaagaaaaa taatcctttt tcgaagtgct cggtgagtat 720

ataatggatg gattcagagt cgccgttgtc gtagcggcga tgctgatcgg atttgtcgca 780

ctcattgccc tggtcaatgg cgtttttaac gcggtcttcg gcattacatt ccaggcgctg 840

ctcggctatg tatttgcgcc attcgcgttt ttaaccggta ttccgtggaa tgaagcggtg 900

agtgccggaa gcattatggc gacgaaaatg gtatcgaatg aatttgtggc gatgcagacg 960

ctctcatccg gcgatttcca tttcagtgcg catactcagg cagtggtatc tgtattcctt 1020

gtctcatttg cgaatttctc ttctatcgga atcattacgg gtgcggtgaa agggctgcat 1080

gaaaaacaag gaaacgtcgt cgcgcggttc gggctgaagc tgctgtacgg ggcaacgctc 1140

gtcagcttcc tgacagcggc gatcgtggga ttgattcact ga 1182

<210> 8

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Lys Tyr Phe Ile Gly Ile Ile Gly Ile Ile Val Phe Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ala Trp Leu Ala Ser Asn Gly Lys Lys Arg Ile Arg Ile Arg Pro Ile

20 25 30

Ala Val Met Leu Val Leu Gln Leu Ile Leu Gly Tyr Ile Leu Leu Asn

35 40 45

Thr Gly Ile Gly Asn Phe Leu Val Gly Gly Phe Ala Lys Gly Phe Asn

50 55 60

Tyr Leu Leu Glu Tyr Ala Ser Glu Gly Ile Asn Phe Val Phe Gly Gly

65 70 75 80

Leu Val Asn Ala Lys Gln Thr Thr Phe Phe Met Ser Val Leu Leu Pro

85 90 95

Ile Val Phe Ile Ser Ala Leu Ile Gly Ile Leu Gln His Trp Lys Val

100 105 110

Leu Pro Phe Ile Thr Lys Tyr Ile Gly Leu Ala Leu Ser Lys Val Asn

115 120 125

Gly Met Gly Lys Ile Glu Ser Tyr Asn Ala Val Ala Ser Ala Ile Leu

130 135 140

Gly Gln Ser Glu Val Phe Ile Ser Leu Lys Lys Gln Leu Gly Tyr Leu

145 150 155 160

Thr Glu Gln Arg Leu Tyr Thr Leu Cys Ala Ser Ala Met Ser Thr Val

165 170 175

Ser Met Ser Ile Val Gly Ser Tyr Met Met Met Leu Lys Pro Glu Tyr

180 185 190

Val Val Thr Ala Leu Val Leu Asn Leu Phe Gly Gly Phe Ile Ile Ala

195 200 205

Ser Ile Ile Asn Pro Tyr Thr Val Ser Lys Asp Glu Asp Leu Ile Val

210 215 220

Val Pro Glu Glu Glu Lys

225 230

<210> 9

<211> 1734

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttgaataaag aagcgctagt caataggctg aatgcttcag ccaaaagaca aaaagctgat 60

atcgtcatta aaaacggaaa aatcatggac gtatataatc aagaatggat atatgaagat 120

attgcgatta cagatggagt tattgtaggc ctcggtgagt atgaaggcga aaatatcatt 180

gatgcagagg gacaaatgat tgttccgggt tttattgatg gacatgtaca tattgagtcg 240

tcaatggtta caccgattga gttcgctaaa gcagtgttgc ctcatggcgt gacgacggtt 300

gttacagatc cgcatgagat cgcgaatgtg tctggtgaaa aagggattga gtttatgctt 360

gaacaagctc ggcatacacc gctgaatatc cattttatgc tttcttccag tgtgcctgcc 420

gcaagttttg agcgattagg cgcaattctc aaagctgccg atctcaagcc tttttatgaa 480

gaagaagaag tattagggct ggctgaagtt atggattatg tgtcggttca gcaggctgaa 540

aaagacatgg ttcagaaact gcttgatgcc cgtgtggcag gaaaaaggat agacggtcat 600

ttagctggtt tatcaacaga cctcattaac atttacagaa ccgcatttgt cttaaacgac 660

catgaagtaa catcgaagga agaagccctt gatcgtatca gaaggggcat gtatgtcatg 720

atgcgtgaag gatcagtcgc caaaaacacg ctcaatgtgc tgccggcggt gaatgaaaag 780

aacgcacgcc ggttcttttt ctgtacggat gataagcatg tggatgattt attgtcagag 840

ggaagtgtaa accatcaggt gaaaatggcg attcaagccg gacttaatcc gtttttagcc 900

tatcagctag gaagcctcaa tgcagccgaa tgctacggat tagatacaaa gggagcgatt 960

gccccgggtt ttgacgctga tttgcttttt gtatctgatc tggaaaatgt cactgtcaca 1020

atgacgatgg taaaagggca gactgttgct gaagacagca aagcggtcta tcaggatcat 1080

gcttcaactg cagcaccaga tcaggcactg cttgattctg ttaagcttgc tgctcctctt 1140

aacaaacagg attttcatat gccaatcgat tcagagcagc agatcaatgt cattcaaatc 1200

ataccaaatc agcttgaaac acgattagta caagttccgg ctcctgttgc ccgcgaattt 1260

gagcctgaca ctgagcttga tttgttaaag attgcagttg tcgagcggca taaaggatta 1320

aaagaaaccg gacttggtgt tgtgaaaggt tttggattca agagcggagc gattgccaca 1380

accatttcac acgactccca taatattatt gccgtcggaa cgaatgatga ggatatcgcg 1440

gcggcagtta ataagctgca ggaaattggc ggaggattaa caattataaa aaatggggaa 1500

gagctccatt cagtaccgct gccgattgca gggttattat ccgaccaatc tgcagagcaa 1560

gtgaatcaaa gcttgctgac gcttcatgat aaattgtcgt taatcggttt cacaggcgga 1620

tttaatccat ttttgacatt gtcgttttta gcgttgcctg tcattcctga tattaaaatg 1680

acgactacgg gattattcga tgtaaaatca tttcaacaca tatcactgca ataa 1734

<210> 10

<211> 577

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Asn Lys Glu Ala Leu Val Asn Arg Leu Asn Ala Ser Ala Lys Arg

1 5 10 15

Gln Lys Ala Asp Ile Val Ile Lys Asn Gly Lys Ile Met Asp Val Tyr

20 25 30

Asn Gln Glu Trp Ile Tyr Glu Asp Ile Ala Ile Thr Asp Gly Val Ile

35 40 45

Val Gly Leu Gly Glu Tyr Glu Gly Glu Asn Ile Ile Asp Ala Glu Gly

50 55 60

Gln Met Ile Val Pro Gly Phe Ile Asp Gly His Val His Ile Glu Ser

65 70 75 80

Ser Met Val Thr Pro Ile Glu Phe Ala Lys Ala Val Leu Pro His Gly

85 90 95

Val Thr Thr Val Val Thr Asp Pro His Glu Ile Ala Asn Val Ser Gly

100 105 110

Glu Lys Gly Ile Glu Phe Met Leu Glu Gln Ala Arg His Thr Pro Leu

115 120 125

Asn Ile His Phe Met Leu Pro Ser Ser Val Pro Ala Ala Ser Phe Glu

130 135 140

Arg Leu Gly Ala Ile Leu Lys Ala Ala Asp Leu Lys Pro Phe Tyr Glu

145 150 155 160

Glu Glu Glu Val Leu Gly Leu Ala Glu Val Met Asp Tyr Val Ser Val

165 170 175

Gln Gln Ala Glu Lys Asp Met Val Gln Lys Leu Leu Asp Ala Arg Val

180 185 190

Ala Gly Lys Arg Ile Asp Gly His Leu Ala Gly Leu Ser Thr Asp Leu

195 200 205

Ile Asn Ile Tyr Arg Thr Ala Phe Val Leu Asn Asp His Glu Val Thr

210 215 220

Ser Lys Glu Glu Ala Leu Asp Arg Ile Arg Arg Gly Met Tyr Val Met

225 230 235 240

Met Arg Glu Gly Ser Val Ala Lys Asn Thr Leu Asn Val Leu Pro Ala

245 250 255

Val Asn Glu Lys Asn Ala Arg Arg Phe Phe Phe Cys Thr Asp Asp Lys

260 265 270

His Val Asp Asp Leu Leu Ser Glu Gly Ser Val Asn His Gln Val Lys

275 280 285

Met Ala Ile Gln Ala Gly Leu Asn Pro Phe Leu Ala Tyr Gln Leu Gly

290 295 300

Ser Leu Asn Ala Ala Glu Cys Tyr Gly Leu Asp Thr Lys Gly Ala Ile

305 310 315 320

Ala Pro Gly Phe Asp Ala Asp Leu Leu Phe Val Ser Asp Leu Glu Asn

325 330 335

Val Thr Val Thr Met Thr Met Val Lys Gly Gln Thr Val Ala Glu Asp

340 345 350

Ser Lys Ala Val Tyr Gln Asp His Ala Ser Thr Ala Ala Pro Asp Gln

355 360 365

Ala Leu Leu Asp Ser Val Lys Leu Ala Ala Pro Leu Asn Lys Gln Asp

370 375 380

Phe His Met Pro Ile Asp Ser Glu Gln Gln Ile Asn Val Ile Gln Ile

385 390 395 400

Ile Pro Asn Gln Leu Glu Thr Arg Leu Val Gln Val Pro Ala Pro Val

405 410 415

Ala Arg Glu Phe Glu Pro Asp Thr Glu Leu Asp Leu Leu Lys Ile Ala

420 425 430

Val Val Glu Arg His Lys Gly Leu Lys Glu Thr Gly Leu Gly Val Val

435 440 445

Lys Gly Phe Gly Phe Lys Ser Gly Ala Ile Ala Thr Thr Ile Ser His

450 455 460

Asp Ser His Asn Ile Ile Ala Val Gly Thr Asn Asp Glu Asp Ile Ala

465 470 475 480

Ala Ala Val Asn Lys Leu Gln Glu Ile Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ile

485 490 495

Lys Asn Gly Glu Glu Leu His Ser Val Pro Leu Pro Ile Ala Gly Leu

500 505 510

Leu Ser Asp Gln Ser Ala Glu Gln Val Asn Gln Ser Leu Leu Thr Leu

515 520 525

His Asp Lys Leu Ser Leu Ile Gly Phe Thr Gly Gly Phe Asn Pro Phe

530 535 540

Leu Thr Leu Ser Phe Leu Ala Leu Pro Val Ile Pro Asp Ile Lys Met

545 550 555 560

Thr Thr Thr Gly Leu Phe Asp Val Lys Ser Phe Gln His Ile Ser Leu

565 570 575

Gln

<210> 11

<211> 1748

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgaataaag aagcgctagt caataggctg aatgcttcag ccaaaagaca aaaagctgat 60

atcgtcatta aaaacggaaa aatcatggac gtatataatc aagaatggat atatgaagat 120

attgcgatta cagatggagt tattgtaggc ctcggtgagt atgaaggcga aaatatcatt 180

gatgcagagg gacaaatgat tgttccgggt tttattgatg gacatgtaca tattgagtcg 240

tcaatggtta caccgattga gttcgctaaa gcagtgttgc ctcatggcgt gacgacggtt 300

gttacagatc cgcatgagat cgcgaatgtg tctggtgaaa aagggattga gtttatgctt 360

gaacaagctc ggcatacacc gctgaatatc cattttatgc ttccttccag tgtgcctgcc 420

gcaagttttg agcgattagg cgcaattctc aaagctgccg atctcaagcc gccgatctca 480

agccttttta tgaagaagaa gaagtattag ggctggctga agttatggat tatgtgtcgg 540

ttcagcaggc tgaaaaagac atggttcaga aactgcttga tgcccgtgtg gcaggaaaaa 600

ggatagacgg tcatttagct ggtttatcaa cagacctcat taacatttac agaaccgcat 660

ttgtcttaaa cgaccatgaa gtaacatcga aggaagaagc ccttgatcgt atcagaaggg 720

gcatgtatgt catgatgcgt gaaggatcag tcgccaaaaa cacgctcaat gtgctgccgg 780

cggtgaatga aaagaacgca cgccggttct ttttctgtac ggatgataag catgtggatg 840

atttattgtc agagggaagt gtaaaccatc aggtgaaaat ggcgattcaa gccggactta 900

atccgttttt agcctatcag ctaggaagcc tcaatgcagc cgaatgctac ggattagata 960

caaagggagc gattgccccg ggttttgacg ctgatttgct ttttgtatct gatctggaaa 1020

atgtcactgt cacaatgacg atggtaaaag ggcagactgt tgctgaagac agcaaagcgg 1080

tctatcagga tcatgcttca actgcagcac cagatcaggc actgcttgat tctgttaagc 1140

ttgctgctcc tcttaacaaa caggattttc atatgccaat cgattcagag cagcagatca 1200

atgtcattca aatcatacca aatcagcttg aaacacgatt agtacaagtt ccggctcctg 1260

ttgcccgcga atttgagcct gacactgagc ttgatttgtt aaagattgca gttgtcgagc 1320

ggcataaagg attaaaagaa accggacttg gtgttgtgaa aggttttgga ttcaagagcg 1380

gagcgattgc cacaaccatt tcacacgact cccataatat tattgccgtc ggaacgaatg 1440

atgaggatat cgcggcggca gttaataagc tgcaggaaat tggcggagga ttaacaatta 1500

taaaaaatgg ggaagagctc cattcagtac cgctgccgat tgcagggtta ttatccgacc 1560

aatctgcaga gcaagtgaat caaagcttgc tgacgcttca tgataaattg tcgttaatcg 1620

gtttcacagg cggatttaat ccatttttga cattgtcgtt tttagcgttg cctgtcattc 1680

ctgatattaa aatgacgact acgggattat tcgatgtaaa atcatttcaa cacatatcac 1740

tgcaataa 1748

<210> 12

<211> 169

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Asn Lys Glu Ala Leu Val Asn Arg Leu Asn Ala Ser Ala Lys Arg

1 5 10 15

Gln Lys Ala Asp Ile Val Ile Lys Asn Gly Lys Ile Met Asp Val Tyr

20 25 30

Asn Gln Glu Trp Ile Tyr Glu Asp Ile Ala Ile Thr Asp Gly Val Ile

35 40 45

Val Gly Leu Gly Glu Tyr Glu Gly Glu Asn Ile Ile Asp Ala Glu Gly

50 55 60

Gln Met Ile Val Pro Gly Phe Ile Asp Gly His Val His Ile Glu Ser

65 70 75 80

Ser Met Val Thr Pro Ile Glu Phe Ala Lys Ala Val Leu Pro His Gly

85 90 95

Val Thr Thr Val Val Thr Asp Pro His Glu Ile Ala Asn Val Ser Gly

100 105 110

Glu Lys Gly Ile Glu Phe Met Leu Glu Gln Ala Arg His Thr Pro Leu

115 120 125

Asn Ile His Phe Met Leu Pro Ser Ser Val Pro Ala Ala Ser Phe Glu

130 135 140

Arg Leu Gly Ala Ile Leu Lys Ala Ala Asp Leu Lys Pro Pro Ile Ser

145 150 155 160

Ser Leu Phe Met Lys Lys Lys Lys Tyr

165

<210> 13

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgaagtatt tgattgggat tatcggttta atcgtgtttt taggcctcgc gtggatcgcg 60

agcagcggca aaaaaagaat taagatccgc ccaattgttg ttatgctcat tttgcaattt 120

attcttggct acattctcct caataccgga atagggaatt tcctcgtggg aggatttgca 180

aaaggattcg gttacctgct tgaatacgcg gcagagggaa ttaactttgt gtttggcggc 240

ttggtgaatg cggaccaaac gacattcttt atgaatgttc tcttgccaat cgtgtttatt 300

tccgctctga tcgggattct gcaaaagtgg aaagtcctcc cgtttatcat tagatatatc 360

ggccttgccc tcagcaaggt aaacggtatg ggaagattgg aatcgtataa cgcagtggct 420

tctgcgattt tagggcagtc agaagtattt atctccttga agaaagaact cggtctttta 480

aatcagcagc gcttgtacac gctttgcgca tctgcgatgt cacctgtatc aatgtcgatt 540

gtcggtgcgt atatgacaat gctgaaaccg gaatatgttg taacagcgct tgttttgaac 600

ttatttggcg gtttcattat cgcttctatt atcaatccgt acgaggttgc aaaagaagag 660

gatatgcttc gtgttgagga agaagaaaaa caatccttct tcgaagtgct cggagaatac 720

attcttgacg gtttcaaagt agcggttgtc gtcgctgcga tgctgattgg atttgtcgcg 780

attattgcat tgatcaatgg catttttaat gcagtattcg gtatttcgtt ccaaggcatt 840

cttggatatg tgtttgctcc attcgctttt cttgtcggta tcccatggaa tgaagctgtt 900

aatgcgggaa gcattatggc aacaaaaatg gtatcgaatg aatttgtcgc catgacgtcg 960

cttacgcaaa acggtttcca tttcagcggc cgtacaacag cgatcgtatc ggtattcctt 1020

gtgtcatttg cgaacttctc ctcaatcgga atcattgccg gtgccgtaaa aggactgaat 1080

gaaaagcaag gaaatgtcgt cgctcgtttc ggcttgaaat tattatacgg tgctacgctt 1140

gtcagctttt tatcagcagc aattgtgggc ttgatttact ga 1182

<210> 14

<211> 393

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Lys Tyr Leu Ile Gly Ile Ile Gly Leu Ile Val Phe Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ala Trp Ile Ala Ser Ser Gly Lys Lys Arg Ile Lys Ile Arg Pro Ile

20 25 30

Val Val Met Leu Ile Leu Gln Phe Ile Leu Gly Tyr Ile Leu Leu Asn

35 40 45

Thr Gly Ile Gly Asn Phe Leu Val Gly Gly Phe Ala Lys Gly Phe Gly

50 55 60

Tyr Leu Leu Glu Tyr Ala Ala Glu Gly Ile Asn Phe Val Phe Gly Gly

65 70 75 80

Leu Val Asn Ala Asp Gln Thr Thr Phe Phe Met Asn Val Leu Leu Pro

85 90 95

Ile Val Phe Ile Ser Ala Leu Ile Gly Ile Leu Gln Lys Trp Lys Val

100 105 110

Leu Pro Phe Ile Ile Arg Tyr Ile Gly Leu Ala Leu Ser Lys Val Asn

115 120 125

Gly Met Gly Arg Leu Glu Ser Tyr Asn Ala Val Ala Ser Ala Ile Leu

130 135 140

Gly Gln Ser Glu Val Phe Ile Ser Leu Lys Lys Glu Leu Gly Leu Leu

145 150 155 160

Asn Gln Gln Arg Leu Tyr Thr Leu Cys Ala Ser Ala Met Ser Pro Val

165 170 175

Ser Met Ser Ile Val Gly Ala Tyr Met Thr Met Leu Lys Pro Glu Tyr

180 185 190

Val Val Thr Ala Leu Val Leu Asn Leu Phe Gly Gly Phe Ile Ile Ala

195 200 205

Ser Ile Ile Asn Pro Tyr Glu Val Ala Lys Glu Glu Asp Met Leu Arg

210 215 220

Val Glu Glu Glu Glu Lys Gln Ser Phe Phe Glu Val Leu Gly Glu Tyr

225 230 235 240

Ile Leu Asp Gly Phe Lys Val Ala Val Val Val Ala Ala Met Leu Ile

245 250 255

Gly Phe Val Ala Ile Ile Ala Leu Ile Asn Gly Ile Phe Asn Ala Val

260 265 270

Phe Gly Ile Ser Phe Gln Gly Ile Leu Gly Tyr Val Phe Ala Pro Phe

275 280 285

Ala Phe Leu Val Gly Ile Pro Trp Asn Glu Ala Val Asn Ala Gly Ser

290 295 300

Ile Met Ala Thr Lys Met Val Ser Asn Glu Phe Val Ala Met Thr Ser

305 310 315 320

Leu Thr Gln Asn Gly Phe His Phe Ser Gly Arg Thr Thr Ala Ile Val

325 330 335

Ser Val Phe Leu Val Ser Phe Ala Asn Phe Ser Ser Ile Gly Ile Ile

340 345 350

Ala Gly Ala Val Lys Gly Leu Asn Glu Lys Gln Gly Asn Val Val Ala

355 360 365

Arg Phe Gly Leu Lys Leu Leu Tyr Gly Ala Thr Leu Val Ser Phe Leu

370 375 380

Ser Ala Ala Ile Val Gly Leu Ile Tyr

385 390

<210> 15

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgaagtatt tgattgggat tatcggttta atcgtgtttt taggcctcgc gtggatcgcg 60

agcagcggca aaaaaagaat taagatccgc ccaattgttg ttatgctcat tttgcaattt 120

attcttggct acattctcct caataccgga atagggaatt tcctcgtggg aggatttgca 180

aaaggattcg gttacctgct tgaatacgcg gcagagggaa ttaactttgt gtttggcggc 240

ttggtgaatg cggaccaaac gacattcttt atgaatgttc tcttgccaat cgtgtttatt 300

tccgctctga tcgggattct gcaaaagtgg aaagtcctcc cgtttatcat tagatatatc 360

ggccttgccc tcagcaaggt aaacggtatg ggaagattgg aatcgtataa cgcagtggct 420

tctgcgattt tagggcagtc agaagtattt atctccttga agaaagaact cggtctttta 480

aatcagcagc gcttgtacac gctttgcgca tctgcgatgt catctgtatc aatgtcgatt 540

gtcggtgcgt atatgacaat gctgaaaccg gaatatgttg taacagcgct tgttttgaac 600

ttatttggcg gtttcattat cgcttctatt atcaatccgt acgaggttgc aaaagaagag 660

gatatgcttc gtgttgagga agaagaaaaa taatccttct tcgaagtgct cggagaatac 720

attcttgacg gtttcaaagt agcggttgtc gtcgctgcga tgctgattgg atttgtcgcg 780

attattgcat tgatcaatgg catttttaat gcagtattcg gtatttcgtt ccaaggcatt 840

cttggatatg tgtttgctcc attcgctttt cttgtcggta tcccatggaa tgaagctgtt 900

aatgcgggaa gcattatggc aacaaaaatg gtatcgaatg aatttgtcgc catgacgtcg 960

cttacgcaaa acggtttcca tttcagcggc cgtacaacag cgatcgtatc ggtattcctt 1020

gtgtcatttg cgaacttctc ctcaatcgga atcattgccg gtgccgtaaa aggactgaat 1080

gaaaagcaag gaaatgtcgt cgctcgtttc ggcttgaaat tattatacgg tgctacgctt 1140

gtcagctttt tatcagcagc aattgtgggc ttgatttact ga 1182

<210> 16

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Lys Tyr Leu Ile Gly Ile Ile Gly Leu Ile Val Phe Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ala Trp Ile Ala Ser Ser Gly Lys Lys Arg Ile Lys Ile Arg Pro Ile

20 25 30

Val Val Met Leu Ile Leu Gln Phe Ile Leu Gly Tyr Ile Leu Leu Asn

35 40 45

Thr Gly Ile Gly Asn Phe Leu Val Gly Gly Phe Ala Lys Gly Phe Gly

50 55 60

Tyr Leu Leu Glu Tyr Ala Ala Glu Gly Ile Asn Phe Val Phe Gly Gly

65 70 75 80

Leu Val Asn Ala Asp Gln Thr Thr Phe Phe Met Asn Val Leu Leu Pro

85 90 95

Ile Val Phe Ile Ser Ala Leu Ile Gly Ile Leu Gln Lys Trp Lys Val

100 105 110

Leu Pro Phe Ile Ile Arg Tyr Ile Gly Leu Ala Leu Ser Lys Val Asn

115 120 125

Gly Met Gly Arg Leu Glu Ser Tyr Asn Ala Val Ala Ser Ala Ile Leu

130 135 140

Gly Gln Ser Glu Val Phe Ile Ser Leu Lys Lys Glu Leu Gly Leu Leu

145 150 155 160

Asn Gln Gln Arg Leu Tyr Thr Leu Cys Ala Ser Ala Met Ser Thr Val

165 170 175

Ser Met Ser Ile Val Gly Ala Tyr Met Thr Met Leu Lys Pro Glu Tyr

180 185 190

Val Val Thr Ala Leu Val Leu Asn Leu Phe Gly Gly Phe Ile Ile Ala

195 200 205

Ser Ile Ile Asn Pro Tyr Glu Val Ala Lys Glu Glu Asp Met Leu Arg

210 215 220

Val Glu Glu Glu Glu Lys

225 230

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

caaaataagg atcctctaga gtcgacgaca tttatcgtgt aagcgg 46

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgcgggaaca caggaagaaa gcatgaaacg aat 33

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

attcgtttca tgctttcttc ctgtgttccc gcg 33

<210> 20

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttcctgataa aaaggcttta aatctgcggc tttaaatctg cggc 44

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gccgcagatt taaagccgca gatttaaagc ctttttatca ggaa 44

<210> 22

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcagataa acagcagatc tgcgtc 46

<210> 23

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caaaataagg atcctctaga gtcgacatga agtatttcat cggaat 46

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

attgacattg agaccggcga cattgcggat gc 32

<210> 25

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gcatccgcaa tgtcgccggt ctcaatgtca at 32

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acttcgaaaa aggattattt ttcttcttca gga 33

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tcctgaagaa gaaaaataat cctttttcga agt 33

<210> 28

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcagtcag tgaatcaatc ccacga 46

<210> 29

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

caaaataagg atcctctaga gtcgacttga ataaagaagc gctagt 46

<210> 30

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gcaggcacac tggaagaaag cataaaatgg atat 34

<210> 31

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

atatccattt tatgctttct tccagtgtgc ctgc 34

<210> 32

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ttcttcataa aaaggcttga gatcggcggc ttgagatcgg cag 43

<210> 33

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ctgccgatct caagccgccg atctcaagcc tttttatgaa gaa 43

<210> 34

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcagcttt gtatctaatc cgtagc 46

<210> 35

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

caaaataagg atcctctaga gtcgacatga agtatttgat tgggat 46

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cgacattgat acaggtgaca tcgcagatgc 30

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gcatctgcga tgtcacctgt atcaatgtcg 30

<210> 38

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cttcgaagaa ggattatttt tcttcttcct c 31

<210> 39

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gaggaagaag aaaaataatc cttcttcgaa g 31

<210> 40

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcagtcag taaatcaagc ccacaa 46

Claims

1.可提高菌株核苷产量的蛋白突变体，其特征在于，其包括：

1)腺嘌呤脱氨酶突变体，其在野生型腺嘌呤脱氨酶的基础上发生以下至少一个突变：a)第135位脯氨酸突变为丝氨酸；b)第158位苯丙氨酸移码突变；和/或，

2)嘧啶核苷酸转运蛋白突变体，其在野生型嘧啶核苷酸转运蛋白的基础上发生以下至少一个突变：c)175位苏氨酸变为脯氨酸；d)第231位谷氨酰胺无义突变。

2.根据权利要求1所述的蛋白突变体，其特征在于，所述野生型腺嘌呤脱氨酶源自解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌；优选所述腺嘌呤脱氨酶突变体的序列如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示。

3.根据权利要求1或2所述的蛋白突变体，其特征在于，所述野生型嘧啶核苷酸转运蛋白源自解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌；优选所述嘧啶核苷酸转运蛋白突变体的序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.14、或SEQ ID NO.16。

4.编码权利要求1-3中任一项所述的蛋白突变体的核酸。

5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，编码所述腺嘌呤脱氨酶突变体的基因的核苷酸的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11所示；和/或，

编码所述嘧啶核苷酸转运蛋白突变体的基因的核苷酸的序列如SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.13、或SEQ ID NO.15所示。

6.含有权利要求4或5所述的核酸的生物材料。

7.权利要求1-3中任一项所述的蛋白突变体或权利要求4或5所述的核酸或权利要求6所述的生物材料在以下任一方面的应用：

(1)构建高产核苷或其衍生物的菌株；

(2)筛选高产核苷或其衍生物的菌株；

优选所述菌株选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、产氨棒杆菌中的一种；

8.一种核苷生产菌株，其特征在于，其表达权利要求1-3中任一项所述的蛋白突变体；和/或，其含有权利要求4或5所述的核酸。

9.根据权利要求8所述的核苷生产菌株，其特征在于，所述核苷生产菌株选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、产氨棒杆菌中的一种。

10.一种生产核苷或其衍生物的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求8或9所述的核苷生产菌株，以产生、积累和收集核苷。