NL9400836A - Stabiele ADP-afhankelijke kinasen, hun bereiding, alsmede hun gebruik. - Google Patents

Description

Stabiele ADP-afhankelijke kinasen, hun bereiding, alsmede hun gebruik

De uitvinding heeft betrekking op enzymen en enzympreparaten die de fosforylering van substraten katalyseren waarbij ADP wordt omgezet in AMP. De uitvinding heeft tevens betrekking op expressiesystemen en micro-organ is men die deze enzymen kunnen produceren. Ook heeft de uitvinding betrekking op werkwijzen voor de bereiding en de toepassing van dergelijke ADP-afhankelijke kinasen met hoge stabiliteit.

Achtergrond

Enzymen zijn in staat op reversibele wijze biochemische omzetting te katalyseren en worden op grote schaal toegepast in verscheidene takken van de nijverheid zoals de farmaceutische industrie en de voedingsmiddelenindustrie. Daarnaast zijn enzymen essentieel voor tal van diagnostische bepalingen zoals die ondermeer toegepast worden in de gezondheidszorg of onderzoeks- en ontwikkelingslaboratoria. De hierbij gebruikte enzymen zijn veelal afkomstig uit micro-organismen. Micro-organismen lenen zich in het algemeen goed voor de efficiënte en grootschalige produktie van enzymen. Daarnaast kunnen micro-organismen als bron gebruikt worden van DNA-fragmenten die coderen voor bruikbare enzymen. Het is algemeen bekend dat door gebruik te maken van genetische modificatietechnieken, waarbij dergelijke DNA-fragmenten in geschikte gastheren worden geïntroduceerd, er nieuwe micro-organismen kunnen worden verkregen die de gewenste enzymen op efficiënte wijze kunnen produceren.

Een belangrijke factor die de bruikbaarheid van enzymen bepaalt is hun activiteit. De temperatuur waarbij de omzetting wordt uitgevoerd speelt hierbij een zeer belangrijke rol [voor een overzicht zie P.W. Hochachka en G.N. Somero (1973) Strategies of Biochemical Adaptation, W.B. Saunders Company, Philadelphia]. Het is algemeen bekend dat enzymatische reacties sneller verlopen naarmate de temperatuur verhoogd wordt. Daarnaast beïnvloedt de temperatuur de substraataffiniteit van sommige enzymen. Voorts kan door de keuze van een geschikte temperatuur de oplosbaarheid van een of meer reactanten worden veranderd waardoor het evenwicht van de reacties op bruikbare wijze kan worden beïnvloed. Tenslotte zijn er omzettingen die alleen bij hoge temperaturen kunnen worden uitgevoerd zoals bijvoorbeeld de polymerase-keten-reactie.

Er bestaat derhalve een grote behoefte aan enzymen die een breed temperatuurbereik bezitten en bij hoge temperaturen actief zijn. Het is gebleken dat enzymen uit thereof iele micro-organismen in het algemeen een hoge activiteit bezitten bij hoge temperaturen en daarom voor een aantal toepassingen zeer geschikt zijn [H. Rossi (1986) European Conference on Biotechnology, European Institute of Technology & Conzorzio ZAI, Verona, pp. 46-50, Verona; R. Jaenicke en P. Zavodsky (1990) FEBS Lett. 268: 344-349; D. Cowan (1992) Trends Biotechnol. 10: 315*323; R.A. Herbert (1992) Trends Biotechnol. 10: 395*402].

De bruikbaarheid van enzymen wordt niet alleen bepaald door hun activiteit maar ook door hun stabiliteit. Deze stabiliteit is niet alleen nodig tijdens de omzetting maar ook in het stadium voordat de enzymen worden toegepast. In veel gevallen dienen er speciale voorzorgen genomen te worden om de stabiliteit van enzymen tijdens bereiding, transport en opslag te verbeteren. In een aantal gevallen kan dit gerealiseerd worden door het drogen van enzymen. Dit is echter een kostbare procedure. Bovendien verliezen veel enzymen hun activiteit tijdens drogen. Tenslotte worden enzymen veelal toegepast bij omzettingen waarbij water als oplosmiddel wordt gebruikt en dient het gedroogde enzym weer opgelost te worden. Een andere wijze waarop de stabiliteit verhoogd kan worden is door waterige oplossingen van enzymen in gekoelde of bevroren vorm te bewaren. Dit brengt echter grote koel-, transport- en opslagkosten met zich mee. Daarom bestaat er grote behoefte aan enzymen die een inherente hoge stabiliteit bezitten. Het is bekend dat enzymen uit thermofiele micro-organismen een hoge fysische en chemische stabiliteit bezitten waardoor het toepassingsgebied van het enzym wordt vergroot [Rossi (1988); Jaenicke en Zavodsky (1990); Cowan (1992); Herbert (1992); vide supra]. Het gebruik van dergelijke enzymen voor tal van toepassingen biedt derhalve grote voordelen.

De enzymatische activering van substraten door middel van fosforylering speelt een cruciale rol in het metabolisme van levende wezens en fosfaatoverdracht is een basisreactie in de biochemie [L. Stryer, Biochemistry (1988) W.H. Freeman & Company, New York]. Het is daarom niet verrassend dat er uit tal van organismen enzymen zijn geïsoleerd die deze fosforylering kunnen katalyseren in een reactie waarbij de energiedrager adenosinetrifosfaat (ATP) wordt omgezet in adenosinedifosfaat (ADP) volgens de onderstaande reactie waarin X het substraat is en X-P het substraat met een extra fosfaat vertegenwoordigt:

X + ATP - X-P + ADP

Deze enzymen behoren tot de groep van kinasen en bekende voorbeelden zijn de enzymen hexokinase, glucokinase en fosfofructokinaee. Hexokinasen en glucokinasen katalyseren met verschillende efficiëntie de omzetting van glucose naar glucose-6-fosfaat terwijl fosfofructokinaee de omzetting van fructose-6-fosfaat naar fructose-l,6-difosfaat verzorgt. Deze en andere kinasen worden op grote schaal toegepast in diagnostische tests waarbij de concentratie van de uitgangstoffen bepaald kan worden [J. Keesey (1987) Biochemica Information (1st Edition) Boehringer Mannheim Bio-chemicals, Duitsland]. Omdat alle enzymatische reacties reversibel zijn wordt hierbij ook gebruik gemaakt van de omgekeerde reactie waarbij ATP wordt gevormd uit een gefosforyleerd substraat en ADP zoals hierboven is aangegeven. Hierbij bestaat vooral belangstelling voor de bepaling van suikers en hun afbraakprodukten die in levende cellen worden gevormd. Een bekend voorbeeld is de bepaling van glucose met behulp van hexokinase. Hierbij wordt veelal het hexokinase uit gist gebruikt dat een molecuul-gewicht heeft van 96 kDa [H.R. Mahler and E.H. Cordes (1975) Biological Chemistry, Harper & Row Publishers, New York].

Een probleem bij bovenstaande fosforylering is de afhankelijkheid van ATP. Niet altijd is ATP beschikbaar bij een omzetting, bijvoorbeeld in geval van een gekoppelde reactie waarbij ATP wordt omgezet in ADP. Daarnaast is ATP in de aanwezigheid van tweewaardige ionen instabiel bij hoge temperaturen en hydrolyseert het sneller dan bijvoorbeeld ADP [M. Tetas en J.M. Lowenstein (1963) Biochemistry 2, blz. 350-357]· Be aanwezigheid van tweewaardige kationen bij fosfotransferase-reacties is veelal noodzakelijk. Tenslotte is ATP een kostbare verbinding. Deze problemen bestaan niet of in sterk verminderde mate voor ADP-afhankelijke kinasen die adenosine-monofosfaat (AMP) vormen volgens onderstaande reactie waarin X het substraat is en X-P het substraat met een extra fosfaat vertegenwoordigt:

X + ADP - X-P + AMP

Er is een zeer beperkt aantal ADP-afhankelijke fosforyleringen bekend. Zo katalyseert adenylaat-kinase de omzetting van 2 ADP in ATP en AMP. Daarnaast bestaat er een polyfosfaat:AMP-fosfotransferase dat polyfosfaat defosforyleert terwijl AMP wordt gefosforyleerd. Hoewel deze enzymen toepassingsmogelijkheden bezitten zijn deze niet in staat om andere substraten dan ADP of polyfosfaat te fosforyleren.

In het bijzonder zijn deze enzymen niet in staat om suikers en hun afbraakprodukten te fosforyleren. Daarnaast wordt in het geval van adenylaat-kinase weer ATP gevormd dat zoals boven aangegeven niet stabiel is bij hoge temperatuur en ligt het evenwicht van de reactie van het polyfosfaat:AMP-fosfotransferase sterk aan de kant van de vorming van ADP en defosforylering van polyfosfaat.

In de afgelopen jaren is een groot aantal thermofiele en hyperthermofiele micro-organismen beschreven [K.O. Stetter, G. Fiala, G. Huber, R. Huber, en G. Segerer (1990) FEMS Microbiol. Rev. 75: 117-124]. Uit deze organismen zijn al verschillende thermostabiele en thermoactieve enzymen beschreven. Een voorbeeld bij uitstek is de Archaeon Pyrococcus furiosus, behorend tot de familie van de Thermococcales, die met een optimale groei temperatuur van 100 aC een van de meest extreem thermofiele micro-organismen is [G. Fiala en K.O.Stetter (1986) Arch. Microbiol. 145: 56-61; Stetter et al. (1990) vide supra]. Het is bekend dat enzymen die door P. furiosus worden geproduceerd tot de meest thermostabiele en thermoactieve gerekend kunnen worden. Zo bezit het B-glucosidase van P. furiosus na 85 uur verhitting in waterige oplossingen bij een temperatuur van 100 *C nog ongeveer de helft van zijn activiteit [S.W.M. Kengen, E.J. Luesink, A.J.M. Stams, A.J.B. Zehnder (1993) Eur. J. Biochem. 213: 305-312].

Uit bovenstaande is duidelijk dat er behoefte bestaat aan ADP-afhankelijke kinasen die een reactie katalyseren waarin het substraat geen ADP of polyfosfaat is. Zulke ADP-afhankelijke kinasen zijn tot nu toe echter niet beschreven.

Beschrijving van de uitvinding

De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe groep van ADP-afhankelijke kinasen die een hoge thermoactiviteit en hoge thermische stabiliteit bezitten en een reactie katalyseren waarin het eubstraat geen ADP of polyfosfaat is. In het bijzonder heeft de vinding betrekking op een ADP-afhankelijke hexokinase en fosfofructokinase uit het hyperthermofiele micro-organisme Pyrococcus furiosus.

Verrassenderwijs is gevonden dat er ADP-afhankelijke kinasen voorkomen in het hyperthermofiele organisme Pyrococcus furiosus, dat een maximale groéitemperatuur heeft van 103 *C, maar nog groei vertoont bij 70 *C [Fiala en Stetter (1986) vide supra]. In het bijzonder is er aanzienlijke activiteit gevonden van een ADP-afhankelijk hexokinase dat vervolgens in gezuiverde vorm is verkregen en bestaat uit polypeptiden met een moleculairgewicht van circa 50 kDa. Het ADP-afhankelijke kinase blijkt daarnaast ook in diaeervorm voor te komen. Daarnaast is er in P. furiosus ook een aanzienlijke activiteit gevonden van een ADP-afhankelijk fosfofructokinase. Deze ontdekkingen geven aan dat er een nieuwe familie ADP-afhankelijke kinasen bestaat, waarvan het bestaan niet eerder gekend of zelfs vermoed was. Gezien de hogere thermische stabiliteit van ADP boven ATP [Tetas en Lowenstein (1963) vide supra] wordt aangenomen dat er in P. furiosus meer ADP-afhankelijke enzymen voorkomen waarvan het bestaan nog niet bekend is.

Ook een andere soort van het geslacht Pyrocoeeus, P. woesei [W. Zillig, et al. (1987) Syst. Appl. Microbiol. 9: 62-70] blijkt nu ADP-afhankelijk hexokinase en fosfofructokinase te bevatten. Deze en andere ADP-afhankelijke kinasen zullen ook voorkomen in andere soorten van het geslacht Pyrococcus en andere vertegenwoordigers van de Thermococcales. Omdat deze micro-organismen behoren tot de Archaea [Stetter et al. (1990) vide supra] is het mogelijk dat ADP-afhankelijke hexokinase, fosfofructokinase en andere kinasen ook voorkomen in andere vertegenwoordigers van dit superkoninkrijk of domein dat een aparte fylogenetische positie inneemt [C.R. Woese, 0. Kandier en M.L. Wheelis (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4576-^579] · Daarnaast wordt verondersteld dat ook in andere thermofiele micro-organismen, die het vermogen hebben te groeien boven een temperatuur van 70 *C, ADP-afhankelijke hexokinase, fosfofructokinase en andere kinasen voorkomen. Omdat het bestaan van ADP-afhankelijke hexokinase en fosfofructokinase nog niet bekend was, is het tenslotte goed mogelijk dat er na gericht zoeken ook in andere, niet-thermofiele micro-organismen, dergelijke ADP-afhankelijke kinasen kunnen worden aangetroffen.

De toepassing van ATP-afhankelijk hexokinase en ATP-afhankelijk fosfofructokinase in diagnostische bepalingen is bekend [Keesey (1987) vide supra]. Vergelijkbare toepassingen kunnen worden gerealiseerd eet de hier beschreven familie van stabiele, ADP-afhankelijke kinasen. Daarnaast kunnen, zoals hierboven aangegeven, ook andere, bijvoorbeeld gekoppelde, reacties verzorgd worden door dergelijke ADP-afhankelijke kinasen. In het celvrije extract van P. furiosus kan de activiteit van ADP-afhankelijke kinasen op eenvoudige wijze bepaald worden. Hieruit blijkt dat toepassing van dergelijke enzymen niet beperkt is tot gezuiverde enzymen. Ondanks het feit dat P. furiosus alleen onder anaerobe condities kan groeien blijken de ADP-afhankelijke hexokinase en fosfo- fructokinase ook onder aerobe condities goed te functioneren, wat in overeenstemming is met de activiteit van veel andere enzymen uit dit organisme [zie Kengen et al. (1993) vide supra]. Hierdoor hebben deze ADP-afhankelijke enzymen uitstekende toepassingsmogelijkheden.

Het ADP-afhankelijke hexokinase is ook gezuiverd en kan worden gebruikt voor de bepaling van de N-terminale aminozuurvolgorde. Deze volgorde kan vervolgens gebruikt worden om DNA-fragmenten te isoleren die coderen voor het ADP-afhankeli jke hexokinase van P. furiosus. Vervolgens kunnen deze DNA-fragmenten gebruikt worden voor de produktie van dit enzym in geschikte gastheren zoals Escherichia colt. Een analoog voorbeeld voor een ander enzym van P. furiosus is onlangs beschreven [H.I.L. Eggen, A.C.M. Geerling, K. Waldkötter, G. Antranikian & W.M. de Vos (1993) Gene 132: 143-1^8]. Vervolgens kan het gen dat codeert voor het ADP-afhankelijke hexokinase worden gebruikt om vergelijkbare homologe genen uit andere micro-organismen te detecteren. Dit kan plaats vinden door middel van DNA-DNA-hybridisatie onder verschillende condities of, indien de nucleotidevolgorde van het gen is bepaald, door middel van amplificatie via de polymerase-keten-reactie (PCR) [zie onder meer J. Sambrook, E.F. Fritsch, & T. Maniatis (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.]. Gezien het feit dat het hexokinase en ook andere enzymen zoals het S-glucosidase (vide supra) via bekende zuiveringsmethoden uit P. furiosus gezuiverd kunnen worden, zal een dergelijke genetische benadering eveneens kunnen worden toegepast op het ADP-afhankelijke fosfofructokinase en andere ADP-afhankelijke kinasen. De gevonden genen kunnen vervolgens in geschikte gastheren tot expressie gebracht worden en de verkregen enzym activiteit kan gebruikt worden bij ADP-afhankelijke omzettingen.

De enzympreparaten volgens de uitvinding kunnen, naast het nieuwe ADP-afhankelijke enzym, andere enzymen, eventueel andere fijnverdeelde celresten, verdunningsmiddelen zoals water, stabilisatiemiddelen e.d. bevatten. De preparaten zijn bij voorkeur homogeen. Zij kunnen ook een gedroogde, bij voorbeeld gesproeidroogde of gevriesdroogde, vorm hebben.

De uitvinding heeft betrekking op werkwijzen voor de bereiding van ADP-afhankelijke enzymen en enzympreparaten, zowel door klassiek kweken van microorganismen die deze enzymen bevatten en afscheiden van het enzym of enzymmengsel, als door kweken van recombinante cellen die de genetische code voor dit enzym bevatten.

De uitvinding betreft tevens enzymatische bepalingen waarin de boven beschreven enzymen en enzympreparaten worden toegepast. Ook dekt de uitvinding diagnostische kits voor het uitvoeren van dergelijke be* palingen. Deze kits bevatten het enzym of enzympreparaat in een geschikte vormen, alsmede bij voorkeur verdere reactiecomponenten, zoals ADP in geval van een suikerbepaling of glucose in geval van een ADP-bepaling, en verder de nodige hulpmiddelen zoals verdunningsmiddelen, detectie-middelen, handleidingen voor het uitvoeren van diagnostische bepalingen.

V&orbfifill.l·

Dit voorbeeld beschrijft de methode voor de bepaling van hexo* kinase-activiteit in celextracten van het hyperthermofiele micro-organisme Pyrococcus furiosus. P. furiosus werd verkregen van de Deutsche Sammlung ftlr Micro-organismen (DSM) te Braunschweig, Duitsland, onder nummer DSM 3638, en werd gekweekt als beschreven [Kengen et al. (1993). vide supra]. Standaard handelingen zoals enzym- en eiwitbepalingen werden uitgevoerd als beschreven [Kengen et al. (1993)* vide supra].

Celextracten werden verkregen door celsuspensies van Pyrococcus furiosus (1 gram/ml Tris/Cl' buffer; 10 mM, pH 7,8), te behandelen met de French press (138 MPa). Celresten werden verwijderd door centrifugatie (60 min, lOO.OOOxg). Het supernatant werd gebruikt als celvrij extract. Het eiwitgehalte ligt tussen de 23 en 35 mg/ml. De celextracten werden niet anaëroob behandeld, aangezien het hexokinase zuurstof-stabiel is.

Hexokinase-activiteit werd gemeten in een gekoppelde assay, waarbij het gevormde glucose-6-fosfaat met behulp van glucose-6-fosfaat-dehydrogenase afkomstig van gist (Boehringer Mannheim, Duitsland) werd omgezet tot 6-fosfogluconaat. De hieraan gekoppelde reductie van NADP tot NADPH2 wordt gebruikt als maat voor de activiteit. Aangezien het gist-enzym niet stabiel is bij hoge temperatuur werd de assay uitgevoerd bij 50*C. Het hexokinase van P. furiosus is bij deze temperatuur nog voldoende actief om gemeten te kunnen worden. Het complete reactiemengsel voor bepalen van hexokinase-activiteit bevat dus; Tris/Cl' buffer (100 mM; pH 7,8). glucose (15 mM), ADP (2 mM). Mg2* (10 mM). NADP (0.5 mM), glucose-6-fosfaat-dehydrogenase (1,75 units) en 10 μΐ celvrij extract van P. furiosus. Wanneer ADP werd vervangen door ATP kon een geringe hexokinase-activiteit in het celvrij extract aangetoond worden. Deze was echter een gevolg van verontreiniging van ATP met sporen ADP.

Op deze wijze konden hoge activiteiten ADP-afhankelijk hexokinase aangetoond worden in celvrije extracten van P. furiosus. Afhankelijk van het gebruikte groeisubstraat werden waarden bereikt tot 1,4 μαοί glucose omgezet tot glucose-6-fosfaat per min per mg eiwit (50*C). Wanneer wordt aangenomen dat de Q10 van de reactiesnelheid gelijk is aan 2 [Hochachika en Somera (1973) vide supra], dan kan een specifieke activiteit berekend worden van 45 f*iol/min.mg eiwit bij 100*C.

Voorbeeld 2.

In dit voorbeeld wordt de enzym-assay beschreven voor het aantonen van fosfofructokinase in celvrije extracten van P. furiosus. Evenals het hexokinase is ook dit enzym afhankelijk van ADP in plaats van ATP.

Fosfofructokinase werd gemeten in een assay, waarin de ADP-afhankelijke vorming van fructose-1,6-bisfosfaat uit fructose-6-fosfaat werd gekoppeld aan de oxydatie van NADK met behulp van aldolase, triose-fosfaat-isomerase en glycerol-3~fosfaat-dehydrogenase (hulp-enzymen afkomstig van konijn en geleverd door Boerhinger Mannheim, Duitsland). Het volledige reactiemengsel voor de bepaling van fosfofructokinase bevatte: Tris/Cl" buffer (100 mM; pH 7.8), dithiothreitol (1 mM), ADP (2 mM), Mg24 (10 mM), NADH (0,4 mM), fructose-6-fosfaat (4 mM), aldolase (0,22 units), triosefosfaat-isomerase (11,4 units), glycerol-3~fosfaat-dehydrogenase (3.7 units) en 20 μΐ celvrij extract van P. furiosus.

Op deze wijze werden specifieke activiteiten bereikt tot 0,05 μπιοί fructose-6-fosfaat omgezet tot fructose-1,6-bisfosfaat per minuut per mg eiwit (50*C). Bij 100*0 bedraagt de specifieke activiteit dan 1,6 lanol/min.mg eiwit.

Voorbeeld 3

In dit voorbeeld wordt beschreven dat de ADP-afhankelijke hexokinase en fosfofructokinase ook in cel-extracten van Pyrococcus uoesei voorkomen. P. uoesei DSM 3773 werd verkregen, gekweekt en behandeld als boven beschreven voor P. furiosus. In een cel-vrij extract werd bij 50 *C een ADP-afhankelijke hexokinase activiteit van 1 pmol/min.mg eiwit en een ADP-afhankelijke fosfofructokinase-activiteit van 0,05 ymol/min.mg eiwit aangetroffen.

Voorbeeld 4

Dit voorbeeld beschrijft de zuivering en karakterisatie van het ADP-afhankelijke hexokinase uit P. furiosus. Standaard biochemische handelingen werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [Kengen et al. (1993). vide supra].

Celvrij extract werd bereid door 25 g cellen van P. furiosus te suspenderen in 25 ml 100 aM Tris/Cl" buffer (pH 7-8). De celeuspensie werd 1 maal behandeld set de French Press bij 138 MPa en celresten werden verwijderd door centrifugatie gedurende 30 min bij 100.000 x g. Het supernatant met een eiwitgehalte van 29.^ mg/ml werd gebruikt bij verdere zuiveringen.

Als eerste zuiveringsstap werd een ammoniumsulfaatprecipitatie uitgevoerd waarbij bleek dat het hexokinase precipiteerde tussen 60 % en 70 % ammoniumsulfaat. Vervolgens werd het supernatant van een 58 % ammoniumsulfaat-precipitatie gebruikt voor hydrofobe-interactie-chromatografie met behulp van een Phenylsepharose CL-^B kolom (Pharmacia. Uppsala, Zweden). De kolom werd geëlueerd met een afnemende gradient van ammmoniumsulfaat (2,5 M tot 0 M) in 100 mH Tris/Cl' buffer (pH 7.8). Het hexokinase bleek te elueren bij 2 N ammoniumsulfaat. De actieve fracties werden vervolgens geconcentreerd en ontzout door middel van ultrafiltratie met een Amicon YM-5 filter (5 kDa cut-off). Aan het actieve concentraat werd 5®M van het detergens 3*([3’Cholamidopropyl]-dimethylammonio)-l-propaansulfonaat (CHAPS; Sigma Chemie, Axel, Nederland) toegevoegd. Vervolgens werd verder gezuiverd door middel van chromatografie op een Mono-Q HR anionwisselaar (Pharmacia). Actieve fracties elueerden bij 0,18 M NaCl in 100 mM Tris/Cl' buffer (pH 7.8) en 1 mM CHAPS. Na het ontzouten door middel van Amicon YM-5 ultrafiltratie werden de actieve fracties verder gezuiverd middels chromatografie op een hydroxylapatiet-kolom die geëlueerd werd met een gradient van 1-50 mM natriumfosfaat (pH 6,8; 1 mM CHAPS). Actieve fracties elueerden bij 0,33 mM fosfaat. Vervolgens werd het eiwit gebonden aan een Phenyl-Superose HR-kolom en geëlueerd via een afnemende gradient van ammoniumsulfaat in 50 mM natriumfosfaat (pH 7.0). Actieve fracties elueerden bij 0,58 M ammoniumsulfaat. Na ontzouten werd een tweede Mono-Q HR zuivering uitgevoerd in 50 mM PIPES buffer (pH 6,2). Het hexokinase bleek te elueren bij 0,2 M NaCl.

Het aldus gezuiverde hexokinase gaf op een SDS-polyacrylamide-gel-electroforese een band met een schijnbaar moleculair gewicht van ongeveer 46 kDa. Uit natieve polyacrylamide-gelelectroforese bleek een molecuul-gewicht van ongeveer 92 kDa. Hieruit kan geconcludeerd worden dat het hexokinase ie samengesteld uit twee Identieke subunits.

Het gezuiverde eiwit bezit een specifieke activiteit van 224 /anol/min.mg eiwit (50’C). Het celvrije extract dat in deze zuivering als uitgangsmateriaal diende had een specifieke activiteit van 0,228 janol/min.mg eiwit. Er werd dus een zuiveringsfactor bereikt van 982 maal.

Voor glucose en ADP werd een K„ bepaald van respectievelijk 0,8 mM en 0,042 mM.

Met betrekking tot de specificiteit is gebleken dat ADP niet vervangen kon worden door mogelijke andere fosforylgroep-donoren te weten ATP, GDP, fosfoënolpyruvaat (PEP) of pyrofosfaat (PPj).

Het hexokinase is zuurstof-stabiel, dat wil zeggen het enzym wordt niet geïnactiveerd onder normale atmosferische omstandigheden. Ook het gezuiverde eiwit was niet zuurstofgevoelig.

Claims (17)

1. Enzympreparaat dat de fosforylering en/of defosforylering van een substraat katalyseert, eet het kenmerk dat het een enzym bevat dat de fosforylering van een substraat, anders dan ADP of polyfosfaat, katalyseert, waarbij ADP wordt omgezet in ANP.

2. Enzympreparaat dat de fosforylering en/of defosforylering van een substraat katalyseert, met het kenmerk dat het een enzym bevat dat de fosforylering van een substraat katalyseert, waarbij ADP wordt omgezet in AMP, en dat het werkzaam is bij een temperatuur boven 70*C.

3. Enzympreparaat volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk dat het substraat een suiker of een afbraakprodukt van een suiker is.

4. Enzympreparaat volgens een der conclusies 1-3· net het kenmerk dat het een cel-extract, of een gezuiverde fractie daarvan, uit een micro-organisme is.

5. Enzympreparaat volgens conclusie 4, met het kenmerk dat het micro-organisme kan groeien bij een temperatuur van 75 *C of hoger.

6. Enzympreparaat volgens conclusie 4 of 5. net het kenmerk dat het micro-organisme behoort tot de Archaea.

7. Enzympreparaat volgens een der conclusies 4-6, met het kenmerk dat het micro-organisme behoort tot de Thermococcales.

8. Enzympreparaat volgens conclusie 7· net het kenmerk dat het micro-organisme behoort tot het geslacht Pyrococcus.

9. Enzympreparaat volgens conclusie 8, met het kenmerk dat het micro-organisme Pyrococcus furiosus DSM 3636 of Pyrococcus voesei DSM 3773 is.

10. Enzympreparaat volgens een der conclusies 1-9. met het kenmerk dat het enzym een eiwit met een subunit-molecuulgewicht tussen de 40 en 60 kDa is.

11. Gezuiverd enzym volgens een der conclusies 1-10.

12. Werkwijze voor de bereiding van een enzympreparaat volgens een der conclusies 1-10 of een enzym volgens conclusie 11. waarbij men een microorganisme van de groep der Archaea, in het bijzonder van de familie der Thermococcales, meer in het bijzonder van het geslacht Pyrococcus kweekt en uit het kweekmedium een enzymfractie afscheidt, en daaruit eventueel het enzym isoleert.

13. DNA-fragment, dat codeert voor een enzym volgens conclusie 11.

14. Recombinant micro-organisme, dat het DNA-fragment volgens conclusie 12 tot expressie kan brengen.

15. Werkwijze voor de enzym-gekatalyseerde fosforylering of defosforylering van een substraat, waarbij men een enzympreparaat volgens een der conclusies 1-10 of een enzym volgens conclusie 11 toepast.

16. Werkwijze volgens conclusie 1^, waarbij het substraat glucose of fructose-6-fosfaat is.

17. Diagnostische kit die een enzympreparaat volgens een der conclusies 1-10 of een enzym volgens conclusie 11 en eventueel ADP of glucose bevat.