CN109136311A

CN109136311A - 一种酶法制备s-腺苷甲硫氨酸的方法

Info

Publication number: CN109136311A
Application number: CN201710452799.1A
Authority: CN
Inventors: 刘珊珊; 刘辉; 周稳文
Original assignee: Shenzhen Gute Xinsheng Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Anhui Gute Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-06-15
Filing date: 2017-06-15
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2037-06-15
Also published as: CN109136311B

Abstract

本发明公开了一种酶法制备S‑腺苷甲硫氨酸的方法，包括以下步骤：(1)利用MAT酶、ATP再生酶和AK酶在反应罐中生成SAM；(2)在反应罐中分离MAT酶、ATP再生酶和AK酶；(3)通过离子交换法将步骤(2)得到的滤出液进行分离，得产物SAM及少量ATP、ADP、AMP：(4)将步骤(3)得到的SAM制备成品。本发明具有以下优点：使用腺苷替代ATP，为工业生产节约了大量成本；优化了SAM生产的反应条件，反应速率快；ATP再生体系使反应中过量消耗的ATP得以再生，提高了转化率，降低了成本；建立了稳定的酶回收体系，节能环保；副产物直接用于循环反应，或集中收集用于生产ATP，操作简单。

Description

一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法

技术领域

本发明涉及S-腺苷甲硫氨酸生产领域，特别涉及一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法。

背景技术

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)于1951年在大鼠的肝脏中被发现，随后被证实了是一种广泛存在于植物、动物、微生物体内的重要生理活性物质，分子式C₁₆H₂₂N₆O₅S，分子量为398.44。其甲硫键上活泼的硫离子使得邻近的碳原子具有亲核攻击能力，从而使SAM具有转甲基、转硫基、转氨丙基等作用。SAM在生物体内参与了多种生化反应，与核酸、蛋白质、磷脂质等的合成紧密相关，也是辅酶A、半胱氨酸、牛磺酸和谷胱甘肽等的生物活性前体。可用于治疗抑郁症、关节炎、肝炎等疾病，而且还是预防癌症、心血管疾病和抗衰老的高级保健药物，起效快、副作用小。

早在上世纪年代，欧洲就已将SAM作为治疗关节炎的处方药使用，后又被用为抗忧郁症的精神病药物。1999年，美国FDA批准SAM作为保健品上市，使它迅速成为最畅销的营养保健品之一。2000年中国开始进口，市场需求逐年增长。

目前SAM的生产方法主要有化学合成法、发酵法和酶法。化学合成法产率低、底物(S-腺苷同型半胱氨酸和甲基供体CH₃I)价格昂贵，加之从产物中分离出有活性的SAM比较困难，所以基本不使用。发酵法使用微生物发酵生产SAM，此方法生产周期长，产量偏低，且过多的副产物使下游工艺处理复杂，环境污染较大。酶法使用甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT，EC2.5.1.6)催化底物L-甲硫氨酸(Met)和三磷酸腺苷(ATP)生成SAM，反应速度快，效率高，产物易纯化，绿色环保。但酶法工业化生产的限制因素是需要昂贵的ATP作为底物和能量供体。原理上，生成1kg SAM需要1.25kg纯ATP，而实际生产中ATP的消耗量需加倍，因此生产成本较高。

因此，现阶段如何降低ATP用量同时提高产品产率是酶法工业化生产SAM急需解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，该方法不使用ATP，而是仅使用价格低廉的腺苷作为底物酶法催化L-甲硫氨酸生成SAM，其克服了现有技术的缺陷，大大降低了生产成本。

本发明原理是在原有甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)催化合成SAM的反应体系中添加腺苷激酶(EC 2.7.1.20，AK)和ATP再生酶，腺苷激酶可催化腺苷生成AMP，通过ATP再生酶的作用可生成ATP用于制备SAM的酶促反应。

ATP再生酶包括多聚磷酸激酶(PPK，EC 2.7.4.1)、腺苷酸激酶(ADK，EC 2.7.4.3)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP，EC 2.7.4.-)。其中，PPK酶催化ADP与多聚磷酸或其盐反应生成ATP，ADK酶催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP，PAP酶则催化AMP与多聚磷酸或其盐反应生成ADP。PPK、ADK及PAP三种酶的合理组合均可再生ATP。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，包括以下步骤：

(1)利用甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)、ATP再生酶和腺苷激酶(AK)在反应罐中生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)：

通过基因工程改造、发酵、纯化获得MAT酶、ATP再生酶和AK酶，或以自然提取等其它方式获得MAT酶、ATP再生酶和AK酶。所有酶可以以游离酶的形式制成酶液；也可进一步固定于固定化载体上，制得固定化酶。

在反应体系中按比例添加MAT酶、ATP再生酶和AK酶，反应生成SAM，其中所述反应体系为含有底物L-甲硫氨酸(Met)或其盐、腺苷、多聚磷酸或其盐以及镁离子和锰离子的一种或两种的水溶液。

另外，反应体系中还可包含钠离子、钾离子、铵离子的一种或几种，Tris和磷酸根离子的一种或几种。本发明添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。

(2)在反应罐中分离固定化的MAT酶、ATP再生酶和AK酶，或使用过滤设备分离游离的MAT酶、ATP再生酶和AK酶：

固定化的MAT酶、ATP再生酶和AK酶在反应器中直接分离。上述分离可通过滤袋分离，也可在反应柱中直接分离。

游离的MAT酶、ATP再生酶和AK酶通过过滤器中超滤膜分离。其中，过滤器具有进料口、出料口和回流口，内设截留分子量不大于20kDa的超滤膜。经过过滤器的截留液为回收的酶液，滤出液为分离出酶之后含产物的反应液；

(3)通过离子交换法将步骤(2)得到的滤出液进行分离，得粗产物SAM及少量ATP、ADP、AMP：

通过离子交换法，从上述步骤(2)的滤出液中分离粗产物SAM，经离子交换后的穿出液中主要含有少量ATP、ADP、AMP。

(4)将步骤(3)得到的SAM通过浓缩、结晶、干燥制备成品。

优选的，上述技术方案中，所述酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法还包括以下步骤：

(5)步骤(2)中分离的MAT酶、ATP再生酶和AK酶循环利用：即将分离的MAT酶、ATP再生酶和AK酶添加至反应罐中生成SAM的连续反应；

(6)MAT酶、ATP再生酶和AK酶的连续分离：即连续分离固定化的MAT酶、ATP再生酶和AK酶或使用过滤设备连续分离游离的MAT酶、ATP再生酶和AK酶。

(7)产物SAM的连续分离：反应生成的SAM通过过滤和/或离子交换方法分离；

(8)副产物ATP、ADP和AMP的连续分离：反应生成的ATP、ADP和AMP通过过滤或离子交换方法分离，分离后的产物可直接添加至反应体系或进一步分离纯化后制成纯品。

优选的，上述技术方案中，所述步骤(1)至步骤(4)可以重复至少一次；优选重复多次，例如重复2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50次。

优选的，上述技术方案中，所述步骤(1)中在反应罐中生成S-腺苷甲硫氨酸的反应条件如下：

反应温度为25-55℃，优选温度为30-50℃；

反应pH为5-10，优选pH为6-9；

反应体系为含有底物L-甲硫氨酸(Met)或其盐；腺苷；多聚磷酸或其盐；以及镁离子或锰离子的一种或多种组合。

在反应体系中添加MAT酶、ATP再生酶和AK酶，反应生成S-腺苷甲硫氨酸。

优选的，上述技术方案中，在反应罐中生成S-腺苷甲硫氨酸的反应体系中还包括：

钠离子、钾离子或铵离子的一种或多种组合；Tris或磷酸盐的水溶液的一种或两种组合；其中，钾离子浓度为0.01-0.5M；钠离子浓度为0.01-0.5M；铵离子浓度为0.01-0.3M；Tris浓度为0.01-0.1M；磷酸盐浓度为0.01-0.1M。

优选的，上述技术方案中，所述L-甲硫氨酸浓度为1-30g/L；腺苷浓度为1-50g/L；多聚磷酸或其盐的摩尔浓度为0.01-0.3M；镁离子浓度为0.01-0.2M；锰离子浓度为0.005-0.15M。

优选的，上述技术方案中，所述镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁和硝酸镁中的一种或多种；锰离子选自于氯化锰和硫酸锰中的一种或多种；钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和柠檬酸钾中的一种或多种；钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和柠檬酸钠中的一种或多种；铵离子选自于氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和醋酸铵中的一种或多种；多聚磷酸或其盐选自于多聚磷酸钠、多聚磷酸钾和多聚磷酸铵中的一种或多种。

优选的，上述技术方案中，所述MAT酶、ATP再生酶和AK酶为游离或者固定化的酶；所述ATP再生酶为多聚磷酸激酶(PPK)、腺苷酸激酶(ADK)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP)中的任意两种或三种组合，即使用PPK和ADK组合，或ADK和PAP组合，或PPK和PAP组合，或PPK、ADK和PAP的组合

优选的，上述技术方案中，所述MAT酶浓度为0.01-12000U/L，PPK酶浓度为0.01-5000U/L，ADK酶浓度为0.01-5000U/L，PAP酶浓度为0.01-5000U/L，AK酶浓度为0.01-8000U/L。其中将1μM底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。上述的MAT酶、ATP再生酶和AK酶可来源于任何生物，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。

优选地，上述技术方案中，本发明添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。

优选的，上述技术方案中，所述固定化MAT酶、ATP再生酶和AK酶通过下列方式固定于固定化载体：吸附、交联、共价结合、包埋或其组合；所述固定化载体选自于高分子载体、无机载体和磁性高分子微球载体的一种或多种；所述高分子载体选自于纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶、尼龙和合成高聚物的一种或多种组合；所述无机载体选自多孔玻璃、氧化硅、活性炭、硅胶和硅藻土的一种或多种组合。当进行酶促反应时，可将固定化酶分散在反应液中直接进行反应，反应结束后通过过滤方式回收酶；或者将固定化酶装填入反应柱中，按一定流速将反应液通过柱体进行酶促反应。

优选地，上述技术方案中，本发明方法中采用的超滤膜选自于醋酸纤维素膜、聚砜膜、聚丙烯腈膜、聚氯乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜或陶瓷膜。

与现有技术相比，本发明技术具有以下有益效果：

1)使用腺苷替代ATP，为工业生产节约了大量成本，腺苷售价仅为ATP的10％左右，价格低廉，来源广泛；

2)优化了SAM生产的反应条件，使SAM生成浓度达到30g/L以上，反应速率快，效率高；

3)ATP再生体系使反应中过量消耗的ATP得以再生，提高了底物的转化率，降低生产成本；

4)建立了稳定的酶回收体系，整个反应过程中无论固定化酶还是游离酶都可以循环利用，应用于大规模连续生产后成本低，节能环保；

5)少量生成的副产物ATP、ADP及AMP或直接用于循环反应，或集中收集用于生产ATP，或通过过滤、离子交换等方法进行纯化，纯化后的成品可作为附加产品，有一定的经济效益。

附图说明

图1为本发明所使用的MAT酶、ATP再生酶和AK酶的SDS-PAGE图。

图2为本发明方法使用游离酶制备SAM的工艺流程图。

图3为本发明方法使用固定酶制备SAM的工艺流程图。

图4为本发明实施例2的HPLC图谱。

图5为本发明对比例的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。

本发明以下实施例及对比例中使用的各种物质，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1粗酶的制备

本发明方法中的MAT酶、ATP再生酶和AK酶可以商购获得，或者是经过人工改造获得的具有同样催化功能的酶。

酶的制备过程如下：

根据MAT酶、PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶各酶基因序列设计引物，通过PCR分别扩增出基因片段，并将其分别连接至pET载体(市售)，经测序正确后，分别转入E.coli BL21(DE3)菌株(市售)。

将转化后的E.coli BL21(DE3)单克隆接入LB培养基，培养至对数期后，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导5小时收集菌体，使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。

将筛选出的高表达菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后扩大培养，最终接入含500L发酵培养基的发酵罐中，培养至OD600值大于20时加入1mM IPTG诱导5小时后，离心收集菌体。

其中LB培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％NaCl；种子培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％氯化钠；发酵培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、5％磷酸氢二钠、1％磷酸二氢钠、0.01％硫酸镁和1％甘油。

图1为大肠杆菌表达的MAT酶、PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶的SDS-PAGE图，如图1所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(市售)；泳道2为MAT酶，45kDa；泳道3为PPK酶，40kDa；泳道4为ADK酶，25kDa；泳道5为PAP酶，55kDa；泳道6为AK酶，40kDa。

收获的菌体经超声或高压匀浆破菌后，离心收集上清。通过沉淀和过滤方法制得粗酶。粗酶液中同时含有微量的ATP，不需要额外增加ATP即可启动反应，操作更加便捷。

实施例2使用游离酶制备SAM

图2为本发明方法使用游离酶制备SAM的工艺流程图。如图2所示，根据本发明制备SAM的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备SAM：

(1)在反应罐中生成SAM：

在反应罐中，100L的反应体系为含有底物1.2kg甲硫氨酸、2.5kg腺苷，以及2.0kg六偏磷酸钠、0.27kg氯化铵、1.0kg六水氯化镁和0.8kg磷酸二氢钾的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至7.2，在反应体系中添加MAT酶400U/L、PPK酶200U/L、ADK酶200U/L以及AK酶400U/L开始反应，所添加酶均为粗酶液。反应期间控制pH值为7.2，温度为35℃。

图4为本发明实施例2的HPLC图谱。如图4所示：反应6小时后，高效液相色谱(HPLC)检测SAM的生成量为27g/L。HPLC检测条件为：KromasilC18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长260nm，检测温度25℃。流动相为含有1％冰醋酸、2.0g/L庚烷磺酸钠和10％甲醇的水溶液，pH＝4.0。

(2)在过滤器中分离酶：

通过超滤方法，将步骤(1)的反应液经过过滤器分离混合酶，过滤器内装膜包(购于Pall公司，截留分子量20kDa)，滤出液为分离出酶之后的反应液。

(3)分离产物SAM和其它物质：

使用盐酸调节滤出液的pH值至4.0，在离子交换柱中通过D113大孔阳离子交换树脂，溶液中的SAM、氨基酸等阳离子被吸附，穿出液中主要含有ATP、ADP以及AMP。收集穿出液，用以生产ATP或进一步纯化为纯品ATP、ADP及AMP。

使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的SAM，SAM产量2.4kg，收率90％。

(4)反应罐中生成SAM的连续反应，即步骤(1)的连续反应：

将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐，并添加原酶量10％的新酶进行反应。反应液配制方法同上述步骤(1)。

在35℃、pH为7.2的条件下进行生成SAM的连续反应；6小时后，HPLC检测SAM的生成量为27g/L。HPLC检测条件同上述步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用。

实施例3使用游离酶制备SAM

如图2所示，根据本发明制备SAM的工艺流程图使用游离酶按照如下步骤制备SAM：

(1)在反应罐中生成SAM：

在反应罐中，100L的反应体系为含有底物2.5kg甲硫氨酸、3.5kg腺苷，以及2.5kg六偏磷酸钠、0.37kg氯化钾、1.0kg六水氯化镁、0.3kg一水氯化锰和0.43kg磷酸氢二钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至8.0，在反应体系中添加MAT酶600U/L、PPK酶300U/L、ADK酶100U/L、PAP酶300U/L以及AK酶500U/L开始反应，所添加酶均为粗酶液。反应期间控制pH值为8.0，温度为37℃。

反应8小时后，高效液相色谱(HPLC)检测SAM的生成量为38g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。

(2)在过滤器中分离酶：

(3)分离产物SAM和其它物质：

使用盐酸调节滤出液的pH值至4.0，在离子交换柱中通过D113大孔阳离子交换树脂，溶液中的SAM、氨基酸等阳离子被吸附，穿出液中主要含有ATP、ADP以及AMP。

使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的SAM，SAM产量3.3kg，收率90％。

(4)反应罐中生成SAM的连续反应，即步骤(1)的连续反应：

将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐，并添加原酶量5-10％的新酶进行反应。将步骤(3)中离子交换穿出液加入至反应罐配制溶液，反应液配制方法同上述步骤(1)，腺苷加入量减少75％。

在37℃、pH为8.0的条件下进行生成SAM的连续反应；8小时后，HPLC检测SAM的生成量为38g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用，上一循环生成的ATP、ADP和AMP等副产物被循环利用。

实施例4使用固定酶制备SAM

图3为本发明方法使用固定酶制备SAM的工艺流程图。如图3所示，根据本发明制备SAM的工艺流程图使用固定酶按照如下步骤制备SAM：

(1)酶的固定

催化用MAT酶、PPK酶、PAP酶以及AK酶以商业化的含氨基合成高聚物载体LX1000HA固定。

将上述实施例1中的粗酶MAT酶5000U/L在恒温搅拌反应罐中加入LX1000HA湿载体2kg，在20℃条件下，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0)清洗2遍，即得固定化MAT酶。将1000U/LPPK酶、1000U PAP酶以及2000U/L AK酶以同样方式分别固定于LX1000HA载体。

(2)在反应柱中生成SAM：

配制反应液，每100L含有底物1.5kg甲硫氨酸、3.0kg腺苷，以及2.0kg六偏磷酸钠、0.4kg氯化钠、1.0kg六水氯化镁和0.8kg磷酸二氢钾的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至6.5，温度升为42-45℃。

将步骤(1)中的固定酶20kg装入反应柱设备，排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以20L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱，反应期间控制温度为42-45℃。反应6小时后，收集反应液，高效液相色谱(HPLC)检测SAM的生成量为28g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。

(3)分离产物SAM和其它物质：

使用盐酸调节反应液的pH值至4.0，在离子交换柱中通过D113大孔阳离子交换树脂，溶液中的SAM、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中主要含有ATP、ADP以及AMP。收集穿出液，用以生产ATP或进一步纯化为纯品ATP、ADP及AMP。

使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的SAM，SAM产量2.5kg，收率90％。

(3)反应柱生成SAM的连续反应，即步骤(2)的连续反应：

配制步骤(2)中所述相同反应液，连续以20L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱，反应期间控制温度为42-45℃。

反应6小时后，HPLC检测SAM的生成量为28g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用。

固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上，酶活性降低10％，需按比例补加或更换部分新酶。

实施例5使用固定酶制备SAM

如图3所示，根据本发明制备SAM的工艺流程图使用固定酶按照如下步骤制备SAM：

(1)酶的固定

催化用MAT酶、ADK酶、PAP酶以及AK酶以商业化的含氨基合成高聚物载体LX1000HA固定。将上述实施例1中所述粗酶MAT酶10000U/L、ADK酶2000U/L、PAP酶2000U/L和AK酶4000U/L混合配成混合酶液，在恒温搅拌反应罐中加入LX1000HA湿载体10kg，在20℃条件下，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0)清洗2遍，即得固定化混合酶。

(2)在反应柱中生成SAM：

配制反应液，每100L含有底物1.8kg甲硫氨酸、3.5kg腺苷，以及1.5kg四聚磷酸、1.5kg六水氯化镁和0.8kg磷酸二氢钾的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至6.8，温度升为37-40℃。

将步骤(1)中的混合固定酶20kg装入反应柱设备，排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以20L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱，反应期间控制温度为37-40℃。反应6小时后，收集反应液，高效液相色谱(HPLC)检测SAM的生成量为30g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。

(3)分离产物SAM和其它物质：

使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的SAM，SAM产量2.7kg，收率90％。

(3)反应柱生成SAM的连续反应，即步骤(2)的连续反应：

配制步骤(2)中所述相同反应液，连续以20L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱，反应期间控制温度为37-40℃。

反应6小时后，HPLC检测SAM的生成量为30g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用。

实施例6

(1)在反应罐中生成SAM：

在反应罐中，100L的反应体系为含有底物0.1kg甲硫氨酸、0.1kg腺苷，以及0.47kg四聚磷酸、0.07kg氯化钾、0.2kg六水氯化镁和0.12kg Tris的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至10.0，在反应体系中添加MAT酶0.01U/L、PPK酶0.01U/L、ADK酶0.01U/L、PAP酶0.01U/L以及AK酶0.01U/L开始反应，所添加酶均为粗酶液。反应期间控制pH值为10.0，温度为25℃。

反应10小时后，高效液相色谱(HPLC)检测SAM的生成量为0.5g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。

(2)在过滤器中分离酶：

(3)分离产物SAM和其它物质：

使用盐酸调节滤出液的pH值至4.0，在离子交换柱中通过D113大孔阳离子交换树脂，溶液中的SAM、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中主要含有ATP、ADP以及AMP。收集穿出液，用以生产ATP或进一步纯化为纯品ATP、ADP及AMP。

使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的SAM，SAM产量0.03kg，收率60％。

(4)反应罐中生成SAM的连续反应，即步骤(1)的连续反应：

将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐，并添加原酶量30-40％的新酶进行反应。反应液配制方法同上述步骤(1)。

在25℃、pH为10.0的条件下进行生成SAM的连续反应；10小时后，HPLC检测SAM的生成量为0.5g/L。HPLC检测条件同上述步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用。

实施例7

(1)在反应罐中生成SAM：

在反应罐中，100L的反应体系为含有底物3.0kg甲硫氨酸、5.0kg腺苷，以及14.1kg四聚磷酸、3.73kg氯化钾、4.07kg六水氯化镁和1.56kg二水磷酸二氢钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至5.0，在反应体系中添加MAT酶8000U/L、PPK酶2500U/L、ADK酶2500U/L、PAP酶2500U/L以及AK酶3000U/L开始反应，所添加酶均为粗酶液。反应期间控制pH值为5.0，温度为50℃。

反应8小时后，高效液相色谱(HPLC)检测SAM的生成量为25g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。

(2)在过滤器中分离酶：

(3)分离产物SAM和其它物质：

使用0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的SAM，SAM产量2.3kg，收率90％。

(4)反应罐中生成SAM的连续反应，即步骤(1)的连续反应：

将步骤(2)中分离出的酶经由过滤器的回流口添加至反应罐，并添加原酶量15-30％的新酶进行反应。反应液配制方法同上述步骤(1)。

在50℃、pH为5.0的条件下进行生成SAM的连续反应；8小时后，HPLC检测SAM的生成量为25g/L。HPLC检测条件同上述步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用。

实施例8

(1)酶的固定

催化用MAT酶、PPK酶、ADK酶、PAP酶以及AK酶以商业化的含氨基合成高聚物载体LX1000HA固定。

在恒温搅拌反应罐中，将上述实施例1中所述粗酶MAT酶12000U/L加入LX1000HA湿载体2kg，在20℃条件下，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0)清洗2遍，即得固定化MAT酶。将5000U/LPPK酶、5000U/L ADK酶、5000U PAP酶以及8000U/L AK酶以同样方式分别固定于LX1000HA载体。

(2)在反应柱中生成SAM：

配制反应液，每100L含有底物3.0kg甲硫氨酸、5.0kg腺苷，以及18.36kg六偏磷酸钠、3.73kg氯化钾、2.16kg氯化锰和1.56kg二水磷酸二氢钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至6.0，温度升为55℃。

将步骤(1)中的固定酶20kg装入反应柱设备，排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以20L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱，反应期间控制温度为55℃。反应8小时后，收集反应液，高效液相色谱(HPLC)检测SAM的生成量为27g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。

(3)分离产物SAM和其它物质：

(3)反应柱生成SAM的连续反应，即步骤(2)的连续反应：

配制步骤(2)中所述相同反应液，连续以20L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱，反应期间控制温度为55℃。

8小时后，HPLC检测SAM的生成量为27g/L。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。在该步骤中，酶被循环利用。

固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上，酶活性降低30％，需按比例补加或更换部分新酶。

对比例1

在反应罐中，100L的反应体系为含有底物1.2kg甲硫氨酸、6.5kg ATP，以及0.27kg氯化铵、1.0kg六水氯化镁和0.8kg磷酸二氢钾的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至7.2，在反应体系中添加MAT酶400U/L开始反应，所添加酶为粗酶液。反应期间控制pH值为7.2，温度为35℃。

反应6小时后，高效液相色谱(HPLC)检测SAM的生成量为26g/L。图5为本发明对比例的HPLC图谱。如图5所示，其为反应5小时反应液的HPLC图谱，图中未标出峰为氨基酸。HPLC检测条件同实施例2步骤(1)。

从结果可以看出：对比例1中没有偶联ATP再生酶和AK酶，需使用大量ATP进行反应，且相同时间内SAM生成量降低。

与对比例1比较，本专利添加ATP再生酶与AK酶，使用腺苷代替ATP作为底物和能量供体，为工业生产节约了成本。反应中生成的副产物或循环利用；或分离纯化为纯品，操作简单；或用于生产ATP，均非常适于大规模连续生产。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims

1.一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)、ATP再生酶和腺苷激酶(AK)在反应罐中生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)；

(2)在反应罐中分离固定化的MAT酶、ATP再生酶和AK酶，或使用过滤设备分离游离的MAT酶、ATP再生酶和AK酶；

(3)通过离子交换法将步骤(2)得到的滤出液进行分离，得粗产物SAM及少量ATP、ADP、AMP；

(4)将步骤(3)得到的SAM通过浓缩、结晶、干燥，得成品S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。

2.根据权利要求1所述的一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法还包括以下步骤：

(6)MAT酶、ATP再生酶和AK酶的连续分离：即连续分离固定化的MAT酶、ATP再生酶和AK酶或使用过滤设备连续分离游离的MAT酶、ATP再生酶和AK酶；

3.根据权利要求1所述的一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)至步骤(4)可以重复至少一次；优选重复多次，例如重复2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50次。

4.根据权利要求1所述的一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中在反应罐中生成S-腺苷甲硫氨酸的反应条件如下：

反应温度为25-55℃，优选温度为30-50℃；

反应pH为5-10，优选pH为6-9；

5.根据权利要求1所述的一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中在反应罐中生成S-腺苷甲硫氨酸的反应体系中还包括：

钠离子、钾离子或铵离子的一种或多种组合；Tris或磷酸盐的水溶液的一种或两种组合；其中，钠离子浓度为0.01-0.5M；钾离子浓度为0.01-0.5M；铵离子浓度为0.01-0.3M；Tris浓度为0.01-0.1M；磷酸盐浓度为0.01-0.1M。

6.根据权利要求4所述的一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述MAT酶、ATP再生酶和AK酶为游离或者固定化的酶；所述ATP再生酶为多聚磷酸激酶(PPK)、腺苷酸激酶(ADK)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP)中的任意两种或三种组合。

7.根据权利要求6所述的一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述MAT酶浓度为0.01-12000U/L，PPK酶浓度为0.01-5000U/L，ADK酶浓度为0.01-5000U/L，PAP酶浓度为0.01-5000U/L，AK酶浓度为0.01-8000U/L。

8.根据权利要求4所述的一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述L-甲硫氨酸浓度为1-30g/L；腺苷浓度为1-50g/L；多聚磷酸或其盐的摩尔浓度为0.01-0.3M；镁离子浓度为0.01-0.2M；锰离子浓度为0.005-0.15M。

9.根据权利要求4所述的一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁和硝酸镁中的一种或多种；锰离子选自于氯化锰和硫酸锰中的一种或多种；钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和柠檬酸钾中的一种或多种；钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和柠檬酸钠中的一种或多种；铵离子选自于氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和醋酸铵中的一种或多种；多聚磷酸或其盐选自于多聚磷酸钠、多聚磷酸钾和多聚磷酸铵中的一种或多种。

10.根据权利要求1所述的一种酶法制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述固定化MAT酶、ATP再生酶和AK酶通过下列方式固定于固定化载体：吸附、交联、共价结合、包埋或其组合；所述固定化载体选自于高分子载体、无机载体和磁性高分子微球载体的一种或多种；所述高分子载体选自于纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶、尼龙和合成高聚物的一种或多种组合；所述无机载体选自多孔玻璃、氧化硅、活性炭、硅胶和硅藻土的一种或多种组合。