DE60035781T2

DE60035781T2 - Vektoren, zellen und verfahren zur herstellung von pyrimidindeoxyribonucleosiden

Info

Publication number: DE60035781T2
Application number: DE60035781T
Authority: DE
Inventors: David Martin Rockville ANDERSON; Lin Gaithersburg LIU; Sergey Gaithersburg PODKOVYROV; Baomin Rockville WANG
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1999-07-01
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2020-07-01
Also published as: US20050009083A1; ATE368743T1; DE60035781D1; ES2290041T3; MXPA02000134A; US7387893B2; KR20020019938A; US6777209B1; NO20016270D0; IL147225A0; EP1190064A1; AU5547700A; CZ301565B6; JP2003504029A; CZ20014695A3; EP1190064B1; NO20016270L; WO2001002580A1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betriffst die Herstellung von Pyrimidinen, Purinen und Derivaten davon, z. B. Desoxyribonucleosiden, unter Verwendung von genetisch modifizierten Zellen, die neuartige DNA-Konstrukte enthalten.
Hintergrund der Erfindung
Thymidin ist als pharmazeutisches Zwischenprodukt, insbesondere für die chemische Synthese von Azidothymidin („AZT", verkauft unter der Handelsmarke ZIDOVUDIN), verwendbar. Obwohl AZT vom ZIDOVUDIN-Typ eine der ersten, für HIV/AIDS entwickelten Therapien war, findet es fortdauernd wichtige und ausgedehnte Verwendung (Langreth, R., The Wall Street Journal, 21. Nov. 1995, S. B12). AZT vom ZIDOVUDIN-Typ ist, insbesondere wenn es in Kombinationstherapien, wie als Kombination mit Lamivudin (auch bekannt als 3TC), verkauft unter der Handelsmarke EPIVIR, verwendet wird, wertvoll. Diese Lamivudin- und 3TC-Kombination wird unter der Handelsmarke COMBIVIR verkauft. Obwohl das HIV-Virus mutieren kann, um Resistenzen gegen entweder AZT oder 3TC auszubilden, ist die Nucleotid-Analog-Kombination vom COMBIVIR-Typ besonders effektiv, da die reverse Transkriptase offensichtlich nicht gleichzeitig gegen beide Nucleosidanaloga resistent sein kann (Larder, B. A. et al., Science 269: 696–699, 1995). AZT vom ZIDOVUDIN-Typ ist auch in Verbindung mit Medikamenten vom HIV-Protease-Inhibitor-Typ nützlich (Waldholz, M., The Wall Street Journal, 30. Jan. 1996, S. B1) und in der Behandlung von HIV-infizierten Schwangeren, um die Häufigkeit der Infektion des Fetus bei der Geburt zu verringern. 1997 starben etwa 600000 Kinder, die sich bei ihren Müttern bei der Geburt angesteckt hatten, an AIDS. AZT vom VIDOVUDIN-Typ, mehrere Monate vor der Geburt eingenommen, kann die Übertragung des Virus auf die Kinder um zwei Drittel reduzieren. In der Herstellung von AZT verwendetes, durch chemische Synthese produziertes Thymidin, stellt einen sehr signifikanten Kostenaufwand dar.
Im U.S. Patent 5213972 (McCandliss & Anderson, nachstehend das „'972-Patent") wird ein Verfahren für die Herstellung von Pyrimidindesoxyribonucleosid (PdN) offenbart (siehe insbesonders Beispiele 7 bis 14 des '972-Patents). Es wird ein replizierbarer Mikroorganismus gezeigt, der eine eine Pyrimidin-Desoxyribonucleotid-Phosphohydrolase, die ein PdN Monophosphat in ein Pyrimidindeoxyribonucleosid verwandelt, codierende DNA-Sequenz enthält und exprimiert. Insbesondere beschreiben McCandliss & Anderson, vorstehend, ein Fermentationsverfahren, das verwendet werden kann, um Thymidin herzustellen, das die Expression der Desoxthymidylat-Phosphohydrolase (dTMPase) von dem Bacillus-Bakteriophagen PBS1 einschließt. Dieser Enzymtyp wurde in der Natur von Bakteriophagen exprimiert gefunden, die kein Thymidin in ihrer DNA enthalten, aber stattdessen Verbindungen wie Desoxyuridin oder Hydroxymethyldesoxyuridin enthalten.
In der im '972-Patent beschriebenen Thymidinfermentation wurden die Enzyme, die Thymidin abbauen (Thymidinphosphorylase und Uridinphosphorylase) durch Mutation entfernt, sodass sich Thymidin anreichert. Folglich hilft die Verwendung des dTMPase-Enzyms, den Stoffwechselweg anzulegen, um Thymidinsynthese zu ermöglichen. Eine Expression von dTMPase allein kann jedoch einen kommerziell brauchbaren Spiegel der Thymidinproduktion nicht sicherstellen. Folglich besteht ein anhaltender Bedarf, die Thymidinproduktion durch dTMPase exprimierende Zellen zu verstärken, um die Thymidinproduktion durch Fermentation durch die Senkung der Produktionskosten bezüglich der gängigen chemischen Syntheseverfahren kommerziell brauchbar zu machen.
Der biochemische Weg zur Pyrimidindesoxynucleotid-Produktion z. B. in E. coli ist sowohl auf den Ebenen der Transkription und Translation, als auch auf Proteinebene durch Mechanismen, die Attenuation, Rückkopplungs-Inhibition und Enzymaktivierung, einschließen, hoch reguliert. Neuhard, J. und R. A. Kelln, Biosynthesis und Conversion of Pyrimidines, Kapitel 35 [In] Neidhard, F. C. et al., [Hrsg.] „Escherichia coli und Salmonella Cellular and Molecular Biology", zweite Ausgabe, Band I, S. 580–599, ASM Press, Washington D. C., 1996. Die Expression der dTMPase und die Eliminierung der Thymidin-Störung durch Mutation in den deoA(Thymidinphosphorylase)-, udp(Uridinphosphorylase)- und tdk(Thymidinkinase)-Genen und die daraus resultierenden Expressionsprodukte, ergeben Thymidinsynthese in E. coli, aber nicht mit einem kommerziell brauchbaren Spiegel.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Biosynthese von Purinen und Pyrimidinen schließt einen gemeinsamen Schritt der Reduktion eines Ribonucleosiddiphosphats (in manchen Arten-Triphosphats) zu ihrem entsprechenden Desoxyanalog ein. In dem gesamten Prozess erfordert die Reduktion des Riboserestes zur 2-Desoxyribose ein Paar Wasserstoffatome, die letztendlich durch NADPH und H⁺ gespendet werden. Der direkte Elektronenspender ist jedoch nicht NADPH, sondern die reduzierte Form eines hitzestabilen, Thioredoxin oder Glutaredoxin genannten Proteins und mindestens eine andere unidentifizierte Quelle, da das E. coli Ribonucleotid-Reductase-System in trxA-(Thioredoxin)-grx-(Glutaredoxin)-Doppelmutanten immer noch funktioniert (Neuhard und Kelln, vorstehend). Die reduzierenden Äquivalente des reduzierten Thioredoxins werden auf Ribonucleotiddiphosphatreductase übertragen, die den Reduktionsprozess durchführt. Eine Manipulierung z. B. dieses Schritts könnte sich als nützlich für die Verbesserung der kommerziellen Produktion von Purin- und Pyrimidin-Desoxynucleosiden erweisen.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neuartige DNA-Konstrukte bereitzustellen, z. B. Vektoren und genetisch modifizierte Mikroorganismen, die diese Vektoren enthalten, insbesondere zur Verwendung in der Produktion von gewinnbaren Mengen, besonders kommerziell nutzbaren Mengen von Pyrimidin- und Purin-Desoxynucleosiden.
Es ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren bereitzustellen, die eine Verbesserung der vorstehend von McCandliss und Anderson beschriebenen darstellen.
In Übereinstimmung mit einem Aspekt vorliegender Erfindung, wird ein DNA-Konstrukt bereitgestellt, das eine transkriptionelle Einheit beinhaltet, die ein Ribonucleotidreductasegen und ein Thioredoxin-Gen enthält.
In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung, wird eine modifizierte Wirtszelle, die ein DNA-Konstrukt gemäß der Erfindung enthält, bereitgestellt.
In Übereinstimmung mit noch einem anderen Aspekt vorliegender Erfindung wird ein Kulturmedium bereitgestellt, das die modifizierten Wirtszellen der Erfindung enthält, und Verfahren für die Produktion eines Purins oder Pyrimidins, zum Beispiel Thymidin, die die Verwendung dieser modifizierten Wirtszellen umfassen.
In einer Ausführungsform, beinhalten die Wirtszellen ein DNA-Konstrukt, das eine Transkriptions-DNA-Einheit enthält (z. B. Operon), welche Einheit DNA-Sequenzen umfasst, die Ribonucleotidreductase und Thioredoxin codieren und in welchem diese Reduktase eine geringere Sensitivität gegenüber allosterischer Inhibierung als eine äquivalente oder entsprechende Wildtyp-Wirtszelle, zeigt. Es werden auch genetisch modifizierte Wirtszellen, die das Konstrukt beinhalten und exprimieren und ein Kulturmedium, das die modifizierten Wirtszellen enthält, bereitgestellt.
Die einzelnen Aspekte der vorliegenden Erfindung offenbaren zum ersten Mal eine Vielzahl von Fortschritten der Lehre von U.S. 5213972 , um verbesserte DNA-Konstrukte und Wirtszellen bereitzustellen, die die Konstrukte zur Verwendung in der kommerziellen Produktion von Pyrimidin-Desoxyribonucleosiden, insbesondere Thymidin, beinhalten.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Das Konstrukt der vorliegenden Erfindung kann chromosomal, oder bevorzugter extrachromosomal sein, sich z. B. auf einem Vektor befinden.
Die Vektoren vorliegender Erfindung schließen Plasmide, Viren, Transposone, Minichromosome oder Phagen, bevorzugt Plasmide, ein. Der die Transkriptionseinheit beinhaltende Vektor, kann nach jeder üblichen, dem Fachmann bekannten Methode, in die Wirtszelle eingeführt werden, z. B. durch P1-Transduktion, Elektroporation oder Transformation. Geeignete, in der vorliegenden Erfindung nützliche Wirtszellen schließen Eukaryonten und Prokaryonten (z. B. ein Bakterium) ein. Die Prokaryonten schließen E. coli, Salmonella, Pseudomonas, Bacillus, Stämme und Mutanten davon ein. Wegen der großen Informationsmenge, genetischen Hilfsmitteln und Mutanten-Allelen, die verfügbar sind, wird E. coli bevorzugt. Es wird besonders bevorzugt, dass ein Transduktionsverfahren für die Wirtszelle der Wahl erhältlich ist, um es zu ermöglichen, Mutationen einfach von einer Wirtszelle auf eine andere zu bewegen und die genetische Mutation des Wirts zu vereinfachen, ohne eine direkte Mutation zu erfordern, wann immer eine neue Mutation gewünscht wird.
Die Erfinder haben gefunden, dass die Verwendung der Bakteriophagen T4-nrdA-, nrdB- und nrdC-Gene besonders nützlich für die Codierung von Reductase und Thioredoxin in E. coli ist. Siehe Sjöberg, B. M., et al., EMBO J., 5: 2031–2036 (1986); Tseng, M.-J., et al., J. Biol. Chem. 263: 16242–16251 (1988); und LeMaster, D. M., J. Virol. 59: 759–760 (1986). Genauer gesagt wurde eine sehr signifikante Verbesserung in der E. coli-Thymidin-Produktion durch die Clonierung und Expression der Ribonucleotidreductase codierenden T4 Bakteriophagen-nrdA- und nrdB-Gene, zusammen mit Thioredoxin codierendem T4 nrdC erreicht, da die T4-Ribonucleotidreductase E. coli-Thioredoxin nicht verwenden kann. Die T4-codierte Ribonucleotidreductase wurde, in Vergleich zu dem E. coli-Enzym, als relativ insensitiv gegenüber der Kontrolle durch allosterische in vitro-Inhibition gefunden (Berglund, O., J. Biol. Chem. 247: 7276–7281, 1972). Die T4-Ribonucleotidreductase wird zum Beispiel, im Unterschied zu dem E. coli-Enzym, nicht durch dATP inhibiert (Berglund, O., J. Biol. Chem. 247: 7270–7275, 1972), sondern sogar durch dATP und ATP stimuliert (Berglund, O., J. Biol. Chem. 247: 7276–7281, 1972).
Die die Ribonucleotidreductase (z. B. nrdA- und nrdB-Gene) und Thioredoxin (z. B. nrdC-Gen) codierenden DNA-Sequenzen werden vom T4-Phagen (Tseng et al. (vorstehend)) abgeleitet. Siehe Campbell, A. M., Bacteriophages, Kapitel 123, Neidhardt, vorstehend und Mathews, C. K., et al., (Hrsg) Bacteriophage T4, American Society of Microbiology, Washington, D. C., 1983. Der Begriff „abgeleitet von" beabsichtigt nicht nur, eine Quelle im Sinn eines physischen Ursprungs, sondern auch Material zu definieren, das strukturelle und/oder funktionale Charakteristika aufweist, die dem von der Referenzquelle stammenden Material entspricht.
Eine andere nützliche Eigenschaft des T4 Phagen-Enzyms ist seine Substratspezifität. Die normale E. coli-Ribonucleotidreductase verwendet UDP als ein Substrat nur schlecht, da der Km für UDP etwa 10-fach höher für UDP wie für CDP ist (Neuhard und Kelln, vorstehend). Das T4-Enzym weist dagegen nur einen zweifachen Unterschied im Km zwischen CDP und UDP auf (Berglund, O., J. Biol. Chem. 247: 7276–7281, 1972), was zwei Wege zur dUTP-Synthese erlaubt. Obwohl es Versuche gegeben hat, eine funktionale Expression von T4-Ribonucleotidreduktase in E. coli zu erhalten, waren frühere Bemühungen nur in der getrennten Expression der Komponenten erfolgreich und konnten Aktivität nur durch das Mischen in vitro zeigen (Tseng, M.-J., P. He, J. M. Nilfinger und G. R. Greenberg, J. Bacteriol. 172: 6323–6332, 1990). Während sie nicht durch die Theorie gebunden sind, glauben die Erfinder, dass vielleicht aufgrund des Fehlens des gewöhnlichen Musters der Rückkopplungs-Inhibition die Expression der T4-Ribonucleotidreductase in E. coli letal ist und sie sorgfältig unter Vorbehalt exprimiert werden muss.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung umfassen vorzugsweise ein regulatorisches Element (z. B. einen Promotor wie den lambda P_L-Operator, Aktivator, Repressor wie den lambda-Repressor, insbesondere eine Temperatur-sensitive Variante und/oder einen Enhancer), geeignete Terminations-Sequenzen, Initiations-Sequenzen und Ribosomen-Bindungsstellen. Der Vektor kann außerdem einen selektierbaren Marker enthalten. Alternativ können regulatorische Elemente (vor allem der lambda-Repressor) auf dem Wirtszellchromosom lokalisiert sein. Es wird bevorzugt, dass nrdA und nrdB stromabwärts von nrdC (bezüglich des Leserahmens) in dem Vektor arrangiert werden. Insbesondere wird bevorzugt, dass nrdB stromabwärts von nrdA arrangiert ist. Daher ist das am meisten bevorzugte Arrangement ein Vektor, der ein nrdCAB enthaltendes Operon beinhaltet.
Die T4-Ribonukleotidreductase ist in vivo nicht frei von einer Rückkopplungskontrolle (J. Ji. R. G. Sargent und C. K. Mathews, J. Biol. Chem. 266: 16289–16292, 1991; und Berglund, vorstehend). Um die Ribonucleosiddiphosphat-Reduktion z. B. für die Thymidinproduktion weiter zu fördern, wird das die regulatorische Untereinheit nrdA codierende Gen durch zum Beispiel einen mutierenden Ansatz modifiziert, um ein Enzym herzustellen, das zu einer gesteigerten Thymidinproduktion fähig ist, aufgrund z. B. einer verminderten Sensitivität gegenüber allosterischer Inhibition, zum Beispiel Inhibition durch das Zwischenprodukt des Enzyms, oder Hemmung durch ein aus einem Vorgang stromabwärts resultierenden Produkt.
Um T4 nrdA-Mutanten zu konstruieren, kann zielgerichtete Mutagenese verwendet werden, um Genbasen zu modifizieren oder zu verändern (z. B. ersetzen), die Aminosäuren codieren, die vermutlich z. B. die an der allosterischen Regulation beteiligte dTTP-Bindungsstelle ändern. Die Analyse der Aminosäuresequenz der T4-Ribonukleotidreductase enthüllte ein Segment, das gut zu der postulierten Konsensus-Sequenz, die vermutlich an der dTTP-Bindung beteiligt ist (E. M. Mclntosh und R. H. Haynes, Mol. Cell. Biol. 6: 1711–1721, 1986), passte. Eine Mutation in diesem Bereich der T4-Ribonukleotidreductase kann unter Verwendung der Oligonucleotid-gerichteten Mutagenese gesetzt werden. Der allgemeine Ansatz kann nach dem Versuch von More et al. (More, J. T., J. M. Ciesla, L.-M. Changchien, G. F. Maley und F. Maley, Biochemistry 33: 2104–2112, 1994) geformt werden, um die dTTP-Bindung der Desoxycytidylatdeaminase zu reduzieren, obwohl in dem Fachgebiet andere Verfahren bekannt sind, zum Beispiel Burk et al., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. 94, S. 412–417; Caldwell und Joyce (1992), PCR Methods Applic. 2, S. 28–33; Stemmer (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91, S. 10747–10751; Cunningham und Wells (1989), Science 244, S. 1081 bis 1085 und Krishnan et al., (1994), FERS Lett. 353, S. 185 bis 188. Eine Mutation, ⁷⁹Ala in Ile in dem T4-nrdA schien sehr nützlich zu sein. Zum Beispiel war die Thymidinproduktivität von den ⁷⁹Ala in Ile-Mutanten im T4-nrdA enthaltenden Stämmen signifikant erhöht, wie durch Schüttelflaschenfermentation evaluiert wurde. Wie nachstehend gezeigt, erreichten die Erfinder einen mindestens 25%igen Anstieg über dem Elternstamm ohne diese einzige Veränderung.
Obwohl die ⁷⁹Ala in Ile-Mutation ein erfolgreiches Beispiel ist, werden die Fachleute nun erkennen, dass jetzt viele Aminosäureänderungen in diesem Bereich möglich sind, um den gewünschten Effekt zu erhalten, die dTTP-Bindung vermeintlich zu unterbrechen, aber die Basisfunktionalität des Enzyms nicht zu zerstören. Es kann zum Beispiel die Substitution von ⁷⁹Ala durch andere Aminosäuren, die ähnliche Seitenketten zeigen (z. B. Leucin, Valin) genutzt werden.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die ein Konstrukt beinhaltet, welches Konstrukt (z. B. Vektor) eine transkriptionale Einheit, die heterologe Ribonucleotidreductase und Thioredoxin codiert, enthält, wobei die Reductase weniger sensitiv gegenüber allosterischer Inhibition ist als die äquivalente oder entsprechende Wildtyp-Wirtszelle. Es wird für den Fachmann offensichtlich sein, dass die Bestimmung der relativen Sensitivität eines heterologen Reductase-Kandidaten gegenüber allosterischer Inhibition im Vergleich zur äquivalenten Wildtyp-Wirtszelle eine Angelegenheit von Routineexperimenten und Beobachtung ist. Transkriptionseinheiten, die DNA-Sequenzen, z. B. nrdA-, nrdB- und nrdC-Gene, enthalten, sind vorzugsweise Operons, wobei die nrd-Gene hintereinander angeordnet sind. Dies erlaubt die Transkription dieser Gene als einzelnes mRNA-Transkript. Um unproduktiven Energieaufwand durch die Wirtszelle und außerdem die Plasmidgröße zu minimieren, wird bevorzugt, dass das Operon nur genetische Sequenzen enthält, die in der Codierung von Reductase und Thioredoxin (einschließlich jeglicher Regulations- und Kontrollelemente) benötigt werden. Das kann die Entfernung von überflüssiger DNA (zum Beispiel das seltene Intron im Phagen T4-nrdB-Gen, Sjoberg, B-M., et al., EMBO J. 5: 2031–2036, 1986) nötig machen.
In bevorzugten Ausführungsformen vorliegender Erfindung, sind jegliche hierin gezeigten Vorteile in eine Wirtszelle eingebracht. Daher wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine modifizierte Wirtszelle bereitgestellt, in welcher die Zelle ein DNA-Konstrukt (z. B. Vektor) enthält, das eine Transkriptions DNA-Einheit (z. B. Operon) beinhaltet, welche Einheit DNA-Sequenzen umfasst, die eine modifizierte T4-Ribonucleotidreductase und Thioredoxin codieren, in welcher diese Reductase weniger Sensitivität gegenüber allosterischer Inhibition als die äquivalente oder entsprechende Wildtyp-Wirtszelle zeigt.
Modifizierte Wirtszellen gemäß vorliegender Erfindung sind besonders nützlich in der kommerziellen Produktion von Pyrimidindesoxynucleosiden. In einer besonders nützlichen Anwendung der vorliegenden Erfindung, können E. coli-Wirtszellen, die ein nach vorliegender Erfindung (besonders in Verbindung mit den Lehren des '972-Patents) modifiziertes Plasmid enthalten (beherbergen), in der kommerziellen Produktion von Thymidin verwendet werden. Die nach vorliegender Erfindung modifizierten Wirtszellen können außerdem, von z. B. PBS1 erhaltene dTMPase und die im '972-Patent gezeigten Mutationen, z. B. deoA, tdk-1 und udp-1, enthalten.
Generell wird ein Fermentationsverfahren verwendet, das das Eintauchen der Zellen in ein Kulturmedium, das in einem geeigneten Gefäß enthalten ist, einschließt. Nach Züchtung unter geeigneten Bedingungen wird das produzierte Thymidin geerntet und, wenn nötig, bis zum pharmazeutischen Grad nach Standardprotokollen gereinigt (angereichert). Das gereinigte Thymidin kann in der Herstellung von Medikamenten, z. B. Arzneimitteln wie AZT verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die vorliegende Erfindung ist nur beispielhaft erklärt und in Bezug auf die folgenden Figuren, die folgendes erläutern:
1 erläutert schematisch den Konstruktionsweg von pCG366. Es sollte beachtet werden, dass die Plasmide nicht maßstabsgerecht gezeichnet sind.
2 erläutert schematisch den Konstruktionsweg von pCG374 und pCG375.
3 stellt eine Karte für das Plasmid pCG532 dar.
4 veranschaulicht das Wachstum und die Thymidinproduktion durch den rekombinanten E. coli-Stamm CMG2451 (Ung⁺) und CMG2492 (Ung^·), die ein Plasmid pCG366 (nrdCAB td) nach Beispiel 10 beherbergen.
5 veranschaulicht die Thymidinproduktion in einem 30 Liter-Fermenter durch E. coli CMG2451 (pCG532).
6 erläutert TdR und UdR (mg/l), die nach dem Reinigungsprotokoll von Beispiel 12 erhalten wurden.
Beispiel 1
Clonierung von T4-nrdCAB-Genen und Demonstration der Aktivität
Die Bakteriophage T4-nrdAB-Gene wurden durch Durchführung der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit isolierter T4-Phagen-DNA cloniert. Die Primer für die nrdA-Gen-PCR waren:
Die Restriktionsstelle XbaI wurde am Anfang des nrdA in die amplifizierte DNA und ClaI wurde am 3'-Ende von nrdA eingeführt. Die Primer für die PCR-Amplifizierung des nrdB-Gens waren:
Die ClaI-Restriktionsstelle wurde demnach am Anfang des nrdB eingeführt und ApaI wurde am Ende des nrdB in die amplifizierte DNA eingeführt. Die PCR-Fragmente wurden, wie in 1 dargestellt, gemäß dem Fachmann bekannten Techniken, in Plasmidvektoren cloniert. Die clonierten nrdAB-Gene wurden durch einen Enzym-aktivitätstest bestätigt. Das T4-nrdC-Gen wurde in Plasmid pDL51 herstellendes pKC30 cloniert (Le Master, D. M., J. Virology 59: 759–760, 1986) und wurde von D. LeMaster (Abt. für Biochem., Univ. Wisconsin, Madison, WI) bereitgestellt. Das Gen wurde in ein Plasmid mit nrdAB-Genen, wir in 1 veranschaulicht, sub-cloniert.
Die Quellen der in 1 verwendeten Ausgangsmaterialien und Hintergrundinformation sind in Tabelle 1 aufgelistet.

Für die Konstruktion von pGC198 und pCG301 (siehe 1 und Tabelle 1) wurde ein synthetischer transkriptioneller Terminator verwendet. Speziell das Plasmid pBC sk⁺, das von Stratagene (La Jolla, Kalifornien) erhalten wurde, wurde mit dem Restriktionsenzym ApaI und Asp718 I gespalten. Dann wurde synthetische DNA, die die ECOTGP-Transkriptions-Terminationssequenz (d'Aubenton Carafa et al., J. Mol. Biol. 216: 839–843, 1990) enthält, unter Ersetzen der Originalsequenz, zwischen die Endonukleasestellen Apa I und Asp718 ligiert. Tabelle 1: Stammbaum von Plasmid pCG366 und pCG532 und Materialquellen

Plasmid	Gen(e) Promotor		Vektor-Ursprung	Marker	Herleitung
PACYC177	amp kan		p15A	amp kan	Chang and Cohen (1978) J. Bacteriol. 134: 1141–1156. ATCC 37031
pBC sk⁺	Cam	Plac	ColE1	Cam	Stratagene. 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037
pBluescript II ks	Amp	Plac	ColE1	Amp	Stratagene. 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037. ATCC 87047
pBR322	amp tet		colE1	amp tet	Bolivar et al. (1977) Gene 2: 95–113.
pDL51	T4 nrdC		colE1	Amp	LeMaster, J. Virol. 59: 759–760, 1986
pKC30	Amp	λP_L	colE1	Amp	Shimatake and Rosenberg. (1981) Nature 292: 128. ATCC 37286
PKTdΔI	T4 td		colE1	Amp	West et al. (1986) J. B. C. 261: 13446–13450.
pT7/T3/18	Amp	phage T7/T3	colE1	Amp	Life Technologies. INC., 9800 Medical Center Dr., Rockville, MD 20897.
pTZ18U	Amp		colE1	Amp	Bio-Rad, 2000 Alfred Nobel Dr., Hercules, Ca 94547.
pUC18	Amp	Plac	colE1	Amp	Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33: 103–119. ATCC 37253
pUC19	Amp	Plac	colE1	Amp	Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33: 103–119. ATCC 37254
pCG173	λP_L vector	λP_L	colE1	Amp	λP_L in pBluescript II ks
pCG196	T4 nrdC		colE1	Amp	T4 nrdC in pUC19
pCG198	Cam	Plac	colE1	Cam	synthetischer Transkriptionsterminator in pBC sk⁺
pCG301	λP_L vector	λP_L	colE1	Cam	λP_L in pCG198
pCG308	T4 nrdC	λP_L	colE1	Cam	T4 nrdC in pCG301, LeMaster, J. Virpl. 59: 759–760. 1986
pCG312	T4 nrdA	PT7	colE1	Amp	T4 nrdA in pT7/T3/18
pCG318	NrdB	PT7	colE1		T4 nrdB in pBluescript II ks
pCG323	NrdAC	λP_L	colE1	Cam	T4 nrdAC in pCG301
pCG326	NrdABC	λP_L	colE1	Cam	T4 nrdABC in pCG301
pCG332	NrdAB	λP_L	colE1	Cam	T4 nrdAB in pCG301
pCG334	NrdAB	λP_L	colE1	Cam	T4 nrdAB in pCG301
pCG337	NrdCAB	λP_L	colE1	Cam	T4 nrdCAB in pCG301
pCG343	NrdCAB	λP_L	colE1	Cam	T4 nrdCAB in pCG301
pCG356	Td	λP_L	colE1	Cam	T4 td in pCG301
pCG358	dcd, udk		colE1 (pUC18)	Amp	E. coli dcd, udk in pUC18
pCG360	NrdCAB, td	λP_L	colE1	Cam	T4 nrdCAB td in pCG301
pCG365	NrdCAB, td	λP_L	colE1 (pBR322)	Cam Tel	T4 nrdCAB, td in pBR322, Amp⁵
pCG374	dcd, udk		p15A	amp	E. coli dcd, udk in pACYC177
pCG376	λP_L	λP_L	p15A	amp	pACYC177 mit λP_L & MCS von pCG301
pCG464	T4 nrdA XbaI/HindIII Fragment		(pTZ18U) colE1	Amp	XbaI/HindIII-Fragment mit nrdA-Sequenz, cloniert in XbaI/HindIII-Stellen von pTZ18U (BioRad Laboratorien)
pCG492	T4 nrdA XbaI/HindIII Fragment		(pTZ18U) colE1	Amp	pCG464 mit Mutation in T4 nrdA-Sequenz, die 79Ala→Ile Änderung verursacht
pCG494	NrdCAB td	λP_L	colE1 (pBR322)	Cam Tel	KpnI/AflII-Fragment von pCG494, inseriert in pCG366, nrdA die Mutation 79Ala→Ile zufügend
pCG532	NrdCAB, td, udk, Dcd	λP_L	colE1 (pBR322)	Cam	udk, dcd, cloniert in pCG494

Dieses Fragment erschuf die ApaI-Erkennungssequenz neu, zerstörte aber die Asp718 I-Erkennungssequenz in dem neuen Plasmid. Die inserierte DNA hatte die folgende Zusammensetzung:
(gezeigt als jeweilige Stränge in SEQ. ID 5 und 6), hergestellt aus zwei Oligonucleotiden.
Plasmid pCG198 wurde, mit pCG173 kombiniert, das den lambda P_L-Promotor von Plasmid pKC30 enthält, cloniert in pBluescript II ks (Stratagene, La Jolla, Kalifornien), wie in 1 gezeigt. Sowohl pCB198 als auch pCG173 wurden mit HindIII und AsnI gespalten und dann ligiert, um das neue Plasmid pCG301 zu erzeugen, das den lambda P_L-Promotor und multiple Restriktionsenzym-Clonierungsstellen enthält, gefolgt von der ECOTGP-Terminator-Sequenz, die von der Tryptophan-Operon-Leader-Peptidregion kopiert wurde.
Die T4-Ribonucleotidreductase-Aktivität wurde durch HPLC durch ein Verfahren, das nicht die Verwendung von Radioisotopen und UDP-Substrat umfasst, gemessen. Der direkte Ribonucleotidreductase-Test enthielt 1 mM NADPH, 1 mM DTT, 0,5 mM dATP, 0,6 mM UDP, 20 mM Tris (pH 8,0) und 5 mM MgCl₂. Unter diesen Bedingungen wird die E. coli-Ribonucleotidreductase gehemmt und nicht nachgewiesen. Die Enzymreaktion (100 μl) wurde durch Zugabe von 10 μl 50% Trichloressigsäure (TCA) gestoppt. Nach 10 Minuten auf Eis wurden die Proben in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde 4 Mal mit Diethylether extrahiert, um die TCA zu entfernen. Fünf ml Trispuffer (1,0 M pH 8,0) wurden zugegeben, gefolgt von 2 μl 40 mg/ml Klapperschlangengift (Sigma) und die Proben wurden 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden dann 3 Minuten auf 70°C erhitzt, gefolgt von Zentrifugation für 5 Minuten, um ein Präzipitat zu entfernen. Die Volumina wurden ausgeglichen, dann durch HPLC mit einem UV-Detektor und Desoxyuridin als Standard analysiert. Die Säule ist eine Spherisorb ODS-2,5 Mikron, 250 × 4,6 mm unter Verwendung einer 12 mM Ammoniumphosphat (pH-Wert 8,0) mobilen Phase und einer Durchflussrate von annähernd 1,0 mL/Minute. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 für das Plasmid pCG343 enthaltende Zellen gezeigt und legen die funktionelle Expression von T4-Ribonucleotidreductase dar. Tabelle 2: Ribonucleotidreductase-Aktivität

Stamm Induktionsbedingung Spezifische Aktivität nmol/10 Min./mg Protein

CMG1093 nicht induziert 0

CMG1093 induziert 0

CMG1093/pCG343 nicht induziert 0

CMG1093/pCG343 induziert 704.7
BEISPIEL 2
Herleitung des Wirtsstammes CMG2451 vom Stamm CMG1115

Der Stamm CMG1115 wird in McCandliss & Anderson ( U. S. Patent 5,213,972 ) vollständig beschrieben. Für die hierin beschriebene Entwicklung war CMG1115 der Ausgangspunkt. Stamm CMG1115 wurde für die Thymidinproduktivität durch eine Wachstumsselektion auf 30 mg/l 5-Fluoruridin enthaltendem Medium verbessert, was den Stamm CMG2401 ergab. Stamm CMG2401 wurde dann durch Wachstum auf 30 mg/l 3'-Azido-3'-desoxythymidin enthaltendem Medium selektiert, was den Stamm CMG2404 ergab. CMG2404 benötigt aufgrund einer von seinem Ursprungselternstamm JM101 geerbten Mutation Δ(lac-pro), zum Wachstum L-Prolin. Eine Hfr-Paarung zwischen CMG2404 und einem Hrf-Stamm CAG5053 (Singer, M. et al., Microbiological Review: 5: 1–24, 1989) wurde nach dem Fachmann bekannten Techniken durchgeführt und ergab Stamm CMG2434, der Lac⁺, Pro⁺ ist. Die upd(Uridinphosphorylase)-Mutation in CMG2434 besaß noch teilweise Uridinphosphorylase-Aktivität, was sich aus der Thyminanhäufung nach Induktion der Thymidinproduktion ergab. Die udp-Mutation wurde wieder von CGSC5128 (E. coli Genetic Stock Center, Yale University) durch Phagen P1-Transduktion nach dem Fachmann bekannten Verfahren eingeführt. Der metE3079::Tn10 vom Stamm CAG18491 wurde zuerst in CMG2434 transduziert, um als positiver Marker für die Transduktion von udp zu dienen. Dann wurde das udp-1 in den metE3079::Tn10-Abkömmling von CMG2434 durch Wachstumsselektion ohne L-Methionin in dem definierten Medium transduziert. Der upd-1-Abkömmling wurde als Stamm CMG2451 bezeichnet. Der Stammbaum von CMG2451 wird in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3: Stammbaum des E. coli Wirtsstammes CMG2451

Stamm	Genotypt	Herleitung
CMG1115	CMG1106 (Tn5::dTMPase kan^R	Tn5::dtMPase-Insertion von pCG132.
CMG2401	CMG1115 FUdR^R	5-Flouro-2'Deoxyuridin-Resistenz
CMG2404	CMG2401 AZT^R	3'-Azido-3'Deoxythymidin-Resistenz
CMG2434	CMG2404 Lac⁺ Pro⁺	ReparaturΔ(lac-proAB) durch Konjugation mit CAG5053^b.
CMG2448	CMG2434 metE3079::Tn10	metE3079::Tn10 von CAG18491^b.
CMG2451	CMG2448 udp-1 metE⁺ tet^S	udp-1 von CGSC5128^c und ersetzt metE3979::Tn10.

^a Mutationen wurden zeitweise durch Phagen P1-Transduktion in E. coli-Stämme eingeführt. Wenn die Mutation einen selektiven Marker besaß, wurde direkte P1-Transduktion verwendet. Wenn die Mutation keinen selektiven Marker aufwies, wurde P1-Kotransduktion mit der nahegelegenen Tn10-Insertion verwendet.
^b Singer, M., et al., Microbiological Rewiew 53: 1–24, 1989.
^c Alle CGSC Stämme können vom E. coli Genetic Stock Center, Yale University, P. O. Box 208104, New Haven, CT 06520-8104, erhalten werden.

BEISPIEL 3
Clonierung und Expression von T4 td-Genen in ein Thymidin-Produktionsplasmid
Das T4 td-Gen wurde in pKTdΔI durch West et al., (J. Biol. Chem. 261: 13446–13450, 1986) ohne das 1017-Basenpaare-Intron cloniert. Das td-Gen wurde in pCG301 unter Verwendung von zwei Oligonucleotiden als Linker mit den folgenden Sequenzen, subcloniert:
Das resultierende Plasmid war pCG356. Das td-Gen von pC356 wurde dann in pCG343 subcloniert, um pCG360 zu erstellen (1). Das Tetracyclinresistenz-Gen und der Plasmid-Replikationsursprung von pBR322 (Bolivar, F. et al., Gene 2: 95–113, 1977) wurde in pCG360 subcloniert und bildete pCG366. Die Thymidylatsynthase-Aktivität wurde durch die spektrophotometrische Methode von Wahba und Friedkin (J. Biol. Chem. 236: PC11-PC12, 1961) gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4: Tymidylatsynthase-Aktivität

Stamm Spezifische Aktivität ΔOD340/mgg Protein/Min.

CMG1093 –0.72

CMG1093/pKTdDI 3.24

CMG1093/pCG356 3.45

CMG1093/pCG360 1.43
BEISPIEL 4
Schüttelflaschendaten, die den Wert des T4 td-Gens für die Thymidinproduktion und Desoxyuridinreduktion zeigen
Die Schüttelflaschen-Fermentation wurde verwendet, um die Thymidinproduktivität verschiedener E. coli-Rekombinanten zu evaluieren. Das Schüttelflaschen-Fermentationsmedium und die hier und in anderen Beispielen verwendeten Verfahren, werden nachstehend in Beispiel 6 beschrieben. In diesem Fall wurden 20 ml Volumen pro Flasche mit 2 ml Saatkultur inokuliert und in einem 30°C-Schüttler inkubiert. Bei einer OD 600 nm von etwa 10, wurden die Flaschen für 30 Minuten in einen 37°C-Schüttler überführt, um den λP_L-Promotor sanft zu induzieren. Dann wurden die Flaschen in einen 35°C-Schüttler überführt, um die Fermentation fortzusetzen. Glucose wurde während der Fermentation wie erforderlich zugefüttert und der pH-Wert mit Ammoniak auf etwa 7, entsprechend der Farbe von Phenolrot, eingestellt. Die Thymidinkonzentration wurde durch HPLC unter Verwendung einer Spherisorb ODS-2,5 Mikron, 250-mm × 4,6 mm Säule und einer mobilen Phase mit 25 mM Ammoniumphosphat (pH 3,3) mit einer Flussrate von circa 1,5 ml/Minute gemessen.
Der Stamm CMG2451/pCG366 (T4 nrdCAB, td) wurde mit CMG2451/pCG343 (T4 nrdCAB) in der Schüttelflaschen-Fermentation verglichen. Tabelle 5 zeigt, dass die Desoxyuridin-Konzentration reduziert war und sich im Stamm CMG2451/pCG366 aufgrund des T4 td-Gens in Thymidin umwandelte. Stunden Tabelle 5: Thymidinproduktions-Effekt der Thymidylat-Synthase nach 66 Stunden

Stamm Thymidin (mg/l) Desoxyuridin (m/l) %Desoxyuridin

CMG2451/pCG343 1198 1728 144.2

CMG2451/pCG366 3327 206 2
BEISPIEL 5
Konstruktion der ⁷⁹Ala zu Ile-T4-Ribonucleotidreductase-Mutante
Die Mutation wurde unter Verwendung von zielgerichter Mutagenese, basierend auf dem von Kunkel (Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488–492, 1985) beschriebenen Verfahren, eingeführt. Alle Materialien für die Mutantenkonstruktion, einschließlich pTZ18U-Phagemid-DNA, M13KO7-Helferphage, Bakterienstämme E. coli CJ236 und MV1190, T7-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase wurden in dem Muts-Gene-in vitro-Mutagenese-Kit von Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA) bereitgestellt. Zuerst wurde das XbaI/HindIII DNA-Fragment, das das nrdA-Gen des Bakteriophagen T4 enthält, von dem Plasmid pCG312 (ChemGen Corp., vorstehende Tabelle 1) isoliert. Das XbaI/HindII-DNA-Fragment wurde in die XbaI/HindIII-Stellen des pTZ18U-Phagemidvektors unter Verwendung von Standardprotokollen (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborstory, New York, 1989) cloniert. Das Insert-tragende Phagemid pCG464 wurde in E. coli CJ236 eingeführt. Dieser Stamm hat einen Mangel an dUTPase (dut) und Uracil-N-Glycosylase (ung), was eine gelegentliche Substitution von Uracil für Thymin in neu synthetisierter DNA ergibt. Uracil enthaltende Einzelstrang-DNA von pCG464 wurde von CJ236 nach dem Anweisungshandbuch von Bio-Rad Laborstories isoliert. Diese DNA (0,2 pMol) wurde mit 6 pMol phosphoryliertem Primer aneliert:
(SEQ. ID. 9), der die Sequenz der gewünschten, Ile statt ursprünglich ⁷⁹Ala codierenden Mutation (unterstrichen) enthält.
Der komplementäre DNA-Strang wurde unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase, wie in dem Bio-Rad-Protokoll beschrieben, synthetisiert. Die Reaktionsprodukte wurden in E. coli-MV1190, der eine Wildtyp-Uracil-N-Giykosylase enthält, die den Uracil-haltigen Elternstrang degradiert und so den mutierten Strang anreichert, transformiert. Direkte DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Silber-Sequenz-DNA-Sequenziersystems von Promega Corp. (Madison, WI) identifizierte Plasmide, die die gewünschte Mutation enthalten. Es schien, dass alle vier analysierten Transformanten das Plasmid mit der Mutation enthielten. Einer von ihnen wurde als pCG492 bezeichnet und für weitere Experimente verwendet. Um zu prüfen, ob die Mutation die Thymidinsynthese beeinflusst, wurde sie in das Produktionsplasmid pCG366 (ChemGen Corp., Tabelle 1 und 1) eingeführt. Dazu wurde das KpnI/AflII-Fragment von pCG366, das den 5'-Teil des nrdA-Gens enthält, durch das KpnI/AflII-Fragment von pCG492, das die Mutation enthält, ersetzt. Das neue Plasmid pCG494 wurde in den Produktionsstamm CMG2451 (ChemGen Corp., Beispiel 2 und Tabelle 4, vorstehend) eingeführt. Der Effekt der T4-nrdA-Mutation wurde durch den Vergleich der Thymidinproduktion von CMG2451 (pCG494) und CMG2451 (pCG366), wie in Beispiel 6 nachstehend gezeigt, evaluiert.
BEISPIEL 6
Schüttelflaschen-Fermentation für die Thymidinproduktion unter Verwendung von CMG2451 (pCG366) und CMG2451 (pCG494)
Die 250-ml Baffle-Flaschen, die 25 ml Produktionsmedium enthalten, wurden mit 2 ml einer frisch gewachsenen Saatkultur in LB-Medium mit geeignetem Antibiotikazusatz inokuliert. Die Kulturen wurden in einem 30°C-Schüttler bei 250 UpM gezüchtet. Wenn der OD₆₀₀-Wert etwa 5 erreichte, wurden die Flaschen für 30 Min. in einen 37°C-Schüttler überführt. Dann wurden die Flaschen in einen 35°C-Schüttler überführt, um die Fermentation fortzusetzen. Das Produktionsmedium hatte folgende Zusammensetzung (g/l): Ardamin YEP-S (Red Star Yeast & Products, Milwaukee, WI) – 10; CaCO₃ – 10; MgSO₄ – 0,4; Phenolrot – 0,24; PP90BT (DMV International Fraser, N. Y.) – 4,5; Sorbit – 20; Chloramphenicol – 0,03; Spurenelemente(1000X) – 1 ml/l. Die Spurenelemente(1000X)-Rezeptur ist folgende (g/l): Borsäure – 0,05; Calciumchlorid – 20; Kobaltsulfat – 0,05; Kupfersulfat – 0,01; Eisensulfat – 20; Eisenchlorid – 20; Mangansulfat – 0,5; Natriummolybdänat – 0,1 und Zinksulfat – 0,1. Zur Zeit der Induktion wurden 10 Gramm pro Liter Ardamin YEP-S zugegeben.
Während der Fermentation wurde durchschnittlich alle zwei Stunden Glucose (2,5 g/l) gefüttert. Der pH-Wert in den Flaschen wurde durch die Zugabe von 4 N NH₄OH, beurteilt durch die Färbung des Indikatorfarbstoffes Phenolrot, bei etwa 7,0 gehalten. Die OD₆₀₀ wurde nach einer Probenverdünnung von 1:10 in H₂SO₄, um Salze in dem Medium aufzulösen, abgelesen. Die Thymidinkonzentration wurde durch Umkehrphasen C-18 HPLC mit einer Alltech Spherisorb ODS-2 Säule und einem spektrophotometrischen Detektor von Shimadzu bei 260 nm, gemessen. Die mobile Phase war eine 25 mM NH₄H₂PO₄-Lösung in Wasser (pH-Wert 3,3) bei einer konstanten Rate von 1,5 ml/Min.
Die Ergebnisse der Thymidinproduktion bei CMG2451 (pCG366) und CMG2451 (pCG494) 2, 17 und 25 Stunden nach Induktion werden in Tabelle 6 präsentiert. Es gab zwei Wiederholungen der Flaschen in diesem Experiment und die Variabilität zwischen den Flaschenduplikaten überstieg 15% nicht. Die Ergebnisse zeigen, dass der T4 nrdA-Mutant besser als der Wildtyp nrdA-Stamm arbeitete. Dies wurde in mehreren unabhängigen Schüttelflaschenexperimenten mit den gleichen Bakterienstämmen bekräftigt. Tabelle 6: Thymidinproduktion durch CMG2451 (pCG366) und CMG2451 (pCG494)

Stamm 2 Stunden 17 Stunden 25 Stunden

Spezifische Aktivität (mg/l/OD)

CMG2451 (pCG366) 6.1 32.5 43.1

CMG2452 (pCG494) 8.5 36.1 51.4
BEISPIEL 7
Schüttelflaschen-Fermentation zur Demonstration der Wirkung des E. coli-udk-Gens auf die Thymidinproduktion
Das dcd-Gen oder dcd udk-Operon wurden in den Vektor pACYC177 cloniert. Dieser Vektor mit dem Replikationsursprung p15a, unterscheidet sich von colE1 basierten Plasmiden wie pCG366 und ist daher kompatibel und kann im gleichen Wirt mit colE1 basierten Plasmiden gehalten werden. Die Details der Plasmidkonstruktionen, die in pCG374 (udk dcd) oder pCG375 (dcd) resultieren, werden in 2 gezeigt. Die Gene auf diesen Plasmiden werden vom nativen E. coli-Promotor des udk dcd-Operons exprimiert.
Unter Verwendung von Selektion auf Ampicillinresistenz, wurden die Plasmide pCG374 und pCG375 in CMG2451 (pCG366) eingeführt, um die Wirkung auf die Thymidinproduktion in dem Schüttelflaschen-Fermentationsverfahren zu testen. Obwohl die spezifische Aktivität (Thymidin pro OD der Zellen) sowohl mit, als auch ohne das udk-Gen ähnlich ist, wuchsen die Zellen mit dem udk-Gen auf dem zweiten Plasmid pCG374 zu einer höheren Zelldichte und produzierten signifikant mehr Thymidin (5,8 g/l, verglichen zu 3,0 g/l für den Stamm mit dem dcd zweiten Plasmid allein). Dieses Ergebnis wurde nicht erwartet, da es nicht klar ist, warum die Uridinphosphorylase diesen Effekt haben könnte.
Basierend auf diesen Daten und anderen Informationen, wurde das udk-Gen zur Einführung zusammen mit dem E. coli dcd-Gen in der Konstruktion von Plasmid pCG532 (siehe Beispiel 8 und 3) ausgewählt.

Tabelle 7: Vergleich der Wirkung des zweiten Plasmids mit dcd oder dcd udk auf die Thymidinproduktion im CMG2451 (pCMG366)-Hintergrund.

Zeit (Stunden)	O.D.600		Thymidin (mg/l)		Spezifisches Thymidin (mg/l/OD)
Basis Stamm und Plasmid	CMG 241 (pCG 366)	CMG 2451 (pCG 366)	CMG2451 (pCG366)	CMG2451 (pCG366)	CMG2451 (pCG366)	CMG2451 (pCG366)
Zweites pACYC 177 basierendes Plasmid	PCG 374 mit dcd udk	pCG375 mit dcd	pCG374 mit dcd udk	pCG375 mit dcd	pCG374 mit dcd udk	PCG375 mit dcd
8 hr	29.112	29.94	889	884	30.5	29.5
18 hr	40.206	32.946	1721	1608	42.8	48.8
42 hr	48.348	33.95	4020	2740	83.1	80.7
66 hr	57.498	28.614	5804	3012	100.9	105.3

BEISPIEL 8
Clonierung des E. coli udk dcd-Operons in das Produktionsplasmid pCG494
Die udk- und dcd-Gene von E. coli codieren die Pyrimidinribonucleotid-Kinase beziehungsweise die dCTP-Deaminase. Beide Gene wurden auf einem 3,4 kB BamHI/PstI DNA-Fragment des lambda-Phagen 355 der Kohora-genomischen Genbank (Kohora, Y., Akiyama, K. und Isono, K., Cell 50: 495–508, 1987) kartiert. Es scheint, dass udk stromaufwärts von dcd lokalisiert ist und in der selben Richtung wie dcd transkribiert wird (Neuhard, J. und Tarpo, L., J. Bacteriol. 175: 5742–5743, 1993). Die Gene wurden in zwei Schritten in die Produktionsplasmide cloniert. Zuerst, wurde ein 3,4 kB BamHI/PstI-DNA-Fragment von lambda 355 in die multiple Clonierungsstelle von Plasmid pUC18 (Yamisch-Perron, C., Vieira, J. und Messing, J., Gene 33: 103–109, 1985) cloniert (Plasmid pCG358). Dann wurde das Fragment aus der Polylinker-Region von pGC358 mit BamHI und SphI ausgeschnitten und an Stelle eines 0,7 kB BglII/SphI-Fragments (das einen Teil des Tetracyclin-Resistenzgens enthält) des Produktionsplasmids pCG494 cloniert. Das endgültige 14,7 kB-Plasmid pCG532 enthält den colE1 Gruppenkompatibilitäts-Replikationsursprung, das Chloramphenicol-Resistenzgen, die udk- und die dcd-Gene und das T4-Bakteriophagen nrdCAB (codieren Thioredoxin beziehungsweise zwei Untereinheiten der Ribonucleotidreductase) und die T4-td-Gene (codieren Thymidylatsynthase) unter der Kontrolle des P_L-Promotors des Bakteriophagen lambda. Das T4 nrdA-Gen von pCG532 wurde vor kurzem durch zielgerichtete Mutagenese (⁷⁹Ala zu Ile) verändert.
Stromabwärts des td-Gens befindet sich ein synthetischer transkriptioneller Terminator, um transkriptionelles Durchlesen in den Replikationsbereich zu verhindern. Die genetische Karte von Plasmid pCG532 ist in 3 erklärt.
BEISPIEL 9
Schüttelflaschen-Fermentation von Thymidin durch CMG2451 (pCG494) und CMG2451 (pCG532)

Das Plasmid pCG532, das die udk- und die dcd-Gene von E. coli enthält, wurde in den Produktionsstamm CMG2451 eingeführt. Der neue Stamm CMG2451 (pCG532) wurde zusammen mit dem Elternstamm CMG2451 (pCG494) in Schüttelflaschen-Experimenten getestet, um die Thymidinproduktion zu vergleichen. Die Ergebnisse von zwei unabhängigen Experimenten werden in Tabelle 8 gezeigt. Das erste Experiment wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt und es wurden 17 Stunden nach Induktion Proben genommen. Im zweiten Experiment, wurden die Zellen bei einer höheren OD (etwa 9) induziert und 3 Stunden nach Induktion Proben zur Analyse genommen. In beiden Fällen arbeitete der die clonierten udk- und dcd-Gene enthaltende Stamm besser als der Elternstamm. Tabelle 8: Thymidin-Fermentation von Thymidin durch CMG2451 (pCG494) und CMG2451 (pCG532)

Experiment 1
Stamm	O.D 600	TdR (mg/L)	Spezifische Aktivität (mg/l/OD)
CMG2451(pCG494)	16.5	599	36.3
CMG2451(pCG532)	17.5	867	49.5

Experiment 2
Stamm
CMG2451(pCG494)	8.5	149	17.5
CMG2451(pCG532)	8.4	192	22.8

BEISPIEL 10
Hinzufügung einer ung-Mutation und ihre Wirkung auf die Thymidinproduktion in der Schüttelflaschen-Fermentation
Durch die Einführung einer ung::Tn10 (Varshney, U., et al., J. Biol. Chem. 236: 7776–7784, 1988)-Mutation in den Wirt CMG2451 unter Verwendung einer, wir vorstehend beschrieben P1-Transduktion, wurde ein Uracil-DNA-Glycosylase-negativer Stamm konstruiert und als CMG2492 bezeichnet. Das Plasmid pCG366 wurde in CMG2492 eingeführt. Ein Vergleichsexperiment zwischen dem Ung^–- und Ung⁺-Stamm für Thymidinsynthese in Schüttelflaschen unter Verwendung der in Beispiel 6 beschriebenen Flaschenmethode, wird in 4 gezeigt Die Zellen wurden in 250 ml-Flaschen bei 30°C gezüchtet und die Thymidinsynthese wurde durch Änderung der Temperatur auf 37°C für 30 Min., dann Änderung auf 35°C induziert. Der Ung^–-Wirt ohne Uracil-DNA-Glycosylase wuchs länger und stellte 30% mehr Thymidin her.
BEISPIEL 11
Thymidinproduktion in einem 30 Liter-Fermenter mit dem Stamm CMG2451 (pCG532)
Die folgenden Bedingungen wurden verwendet, um Thymidin in einem 30-Liter-Fermentor (B. Braun Biotec Biostat C) mit dem Stamm CMG2451/532 zu produzieren. Die Saat-Kultur (500 ml) wurde in einer 4 Liter Baffle-Schüttel-Flasche in LB-Medium (5g/l Difco Hefeextrakt, 10 g/l Difco Trypton, 5 g/l NaCl) mit 30 mg/l Chloramphenicol und 25 mg/l Kanamycin bei 30°C gezüchtet, bis eine OD 600 nm von 2,37 mit einem End-pH-Wert von 6,69 erreicht war. Die Anfangscharge im Fermenter (12 Liter), die die in Tabelle 9 aufgelistete Zusammensetzung enthält, wurde 55 Minuten bei 121°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde eine gesondert autoklavierte Lösung (500 ml) zugegeben, um die Charge auf 20 g/l Sorbit und 3,0 g/l MgSO₄·7 H₂O anzugleichen. Außerdem wurde vor Inokulation eine sterilgefilterte Lösung (200 ml) zugegeben, die dazu konzipiert war, die Anfangscharge auf 30 mg/l Chloramphenicol, 25 mg/l Kanamycin, 1 mg/l D-Biotin, 10 mg/l Thiamin und 10 mg/l Nicotinsäure einzustellen.

Es wurden Versorgungs-Lösungen hergestellt: a) Cerelose 2001 (Dextrose-monohydrat) 562 g/l mit 2 mg/l Biotin, 20 mg/l Thiamin, 20 mg/l Nicotinsäure und 30 mg/l Chloramphenicol; b) Sorbit 717 g/l mit 4 mg/l Biotin, 40 mg/l Thiamin, 40 mg/l Nicotinsäure und 60 mg/l Chloramphenicol; und c) Rohstickstoff-Gemisch, das 360 g/l Amberex 695 AG (Red Star Yeast & Products, Milwaukee, Wisc.), 6 g/l PP90M (DMV International, Fraser, NY) mit 1X Spurenelementen und 0,1 ml/l Mazu DF10PMOD11 (BASF). Die Versorgungs-Lösungen wurden für 40 bis 50 Minuten unter 18 PSI Dampfdruck sterilisiert. Tabelle 9: Zusammensetzung der Anfangscharge im 30 I-Fermenter

Komponente	Konzentration (g/l oder ml/l)
Natriumhexametaphosphat	4
KH₂PO₄	4
(NH₄)₂HPO₄	4
CaCl₂	0.4
Zitronensäure	0.5
Amberex 695 (Red Star Yeast & Products, Milwaukee, WI)	20
PP90M (DMV International, Fraser, NY)	15
Trypton (Difco, Detroit, MI)	5
1000X Spurenelemente (siehe Beispiel 7)	1 ml/l
CaCO₃	5
Glycin I	1.83
Mazu DF10PMOD11 Entschäumer (BASF Spezialprodukte, Gurnee, IL)	0.2 ml/l

Die Betriebsbedingungen waren die folgenden: Ausgangstemperatur 31°C; UpM 600; Luftstrom 3 LPM; pH-Wert 6,8; Druck 0 Bar. Der gelöste Sauerstoff wurde bei 25% Sättigung, unter Verwendung eines Luftdurchsatz-Regelkreises kontrolliert. Die UpM wurden auf 750 UpM nach 8 Stunden, 850 UpM nach 9 Stunden und 950 UpM zum Zeitpunkt der Temperaturänderung von 31 auf 35°C nach 9,2 Stunden, wenn die Kultur eine OD von 37,8 erreichte, gesteigert. Beginnend nach 9,7 Stunden, wurde Gegendruck bis zu einem Maximum von 0,6 Bar angelegt, um den Sauerstofftransport in die Kultur zu fördern. Die Rate der Temperaturänderung zur Induktion der Thymidinsynthese betrug 0,2°C pro Minute.
Nachdem die Zellmasse 20 OD bei 600 nm erreichte (abgelesen nach Verdünnung in 50 mM H₂SO₄, um Salze zu lösen), wurden schubweise 85 ml Fütterungen der Sorbitol Versorgungs-Lösung (b) für einen Anstieg der Zellmasse von je 5 OD durchgeführt. Nach 16,7 Stunden wurde die schubweise Sorbitolfütterung gestoppt und Dextrose Monohydrat (Glukose) Fütterung (a) unter Kontrolle des DO PID Regelkreises des B. Braun-Fermenters mit einem Sollwert von 25% begonnen.
Einfach angegeben, wenn der gelöste Sauerstoff unter 25% lag, war die Zuckerfütterung ausgeschaltet und wenn der DO größer als 25% war, wurde die Zuckerfütterung angestellt. Das Protokoll reguliert selbst die Glucosekonzentration und hält die Konzentration niedrig, aber erlaubt der Kultur nicht über eine sehr anhaltende Zeitdauer nach Glucose zu hungern. Fütterungen mit Rohstickstoff (500 ml) wurden nach 11 Stunden, 16,2 Stunden, 21,2 Stunden, 28,2 Stunden, 33,2 Stunden und 40,5 Stunden durchgeführt.
Die Zellmasse, die Anreicherung von Thymidin und Desoxyuridin während der Fermentation werden in 5 gezeigt.
BEISPIEL 12
Reinigung von Thymidin vom Fermentationsmedium
Dowex Optipore L-285 (The Dow Chemical Company) wurde in deionisiertem Wasser resuspendiert und in eine Glassäule mit 48 mm Durchmesser gepackt, und ein Bett von etwa 500 ml Volumen hergestellt. Die Säule wurde mit 500 ml 5% NaOH, dann mit deionisiertem Wasser gewaschen, bis der Ausfluss einen pH-Wert von 7,0 aufwies.
500 ml Fermentations-Medium mit einer Thymidinkonzentration von 4,890 g/l und einer Desoxyuridin (UdR)-Konzentration von 1,040 g/l wurden auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit deionisiertem Wasser mit zwei Bettvolumina gewaschen. TdR und UdR wurden durch zwei Bettvolumina 5% Reagenzalkohol (Ethanol 90,5%, Methanol 4,5%, Isopropylalkohol 5%), gefolgt von zwei Bettvolumina 10% Reagenzalkohol und zwei Bettvolumina 15% Reagenzalkohol eluiert. Das TdR und UdR in den 25 ml-Fraktionen wird in 6 gezeigt. Die Säule wurde durch Waschen mit 5% NaOH, dann mit deionisiertem Wasser bis pH-Wert 7,0 regeneriert und das Verfahren wurde wiederholt. Die Fraktionen 91–160 von den zwei einzelnen Läufen wurden vereinigt und unter Verwendung eines Vakuum-Rotationsverdampfers getrocknet. Das Thymidin wurde erneut in einer minimalen Menge heißen Wassers gelöst und bei 4°C auskristallisiert. Dann wurden die Kristalle zwei Mal umkristallisiert und 15 Stunden in einem 55°C-Ofen getrocknet. Insgesamt wurden 979,8 mg kistallines Thymidin erhalten mit einer Reinheit von mehr als 99%, das für die Verwendung als Arzneimittelzwischenprodukt geeignet sein sollte.
Die Seitenfraktionen, die sowohl Desoxyuridin, als auch Thymidin enthalten, wurden mit Mutterlauge vereinigt und durch einen Vakuum-Rotationsverdampfer mit reduziertem Alkohol bis zu einem Endvolumen von 1200 ml reduziert. Die Gesamtmenge TdR in dieser 1200 ml Lösung betrug 3571 mg. Die Gesamtausbeute (einschließlich der 3571 mg der TdR-Seitenfraktionen) war 93,1%. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Konstrukt, umfassend eine Transkriptionseinheit, die umfasst: (a) ein T4nrdA-Ribonucleotidreduktasegen; (b) ein T4nrdB-Ribonucleotidreduktasegen; und (c) ein T4nrdC-Thioredoxingen; dadurch gekennzeichnet, dass das T4nrdA-Gen eine Mutation in der Sequenz hat, die die dTTP-Bindungsregion auf der T4-Ribonucleotidreduktase codiert, wobei die Mutation nicht die Grundfunktionalität des Enzyms zerstört, sodass die T4-Ribonucleotidreduktase im Vergleich mit dem Wildtyp-Enzym eine verringerte dTTP-Bindung hat.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die T4nrdA-Sequenz, die die dTTP-Bindungsregion auf der T4-Ribonucleotidreduktase codiert
ist.
DNA-Konstrukt wie in den Ansprüchen 1 oder 2 beansprucht, wobei die Mutation in der DNA-Sequenz, die die dTTP-Bindungsregion codiert, Alanin an Position 79 in der T4nrdA-Aminosäuresequenz durch Isoleucin, Valin oder Leucin ersetzt.
DNA-Konstrukt wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei die Mutation in der DNA-Sequenz, die die dTTP-Bindungsregion codiert, Alanin an der Position 79 in der T4nrdA-Aminosäuresequenz durch Isoleucin ersetzt.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 4, wobei die Mutation in der DNA-Sequenz, die die dTTP-Bindungsregion codiert, ein Austausch von GCT (Alanin) durch ATT (Isoleucin) in Codon 79 ist:
Wirtszelle, umfassend das DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus E. coli, Salmonella, Pseudomonas, Bacillus und Saccharomyces.
Verfahren zur Herstellung von Pyrimidin-Desoxyribonucleosiden, umfassend das Züchten einer Wirtszelle nach Anspruch 6 oder 7.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Desoxyribonucleosid Thymidin ist.