JP2003504029A

JP2003504029A - ピリミジンデオキシリボヌクレオシド産生のためのベクター、細胞および方法

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Publication number: JP2003504029A
Application number: JP2001508352A
Authority: JP
Inventors: デイビッド、マーティン、アンダーソン; リン、リウー; セルゲイ、ポドコビロフ; バオミン、ワング
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1999-07-01
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2003-02-04
Also published as: DE60035781T2; US20050009083A1; US7387893B2; CZ20014695A3; NO20016270D0; ES2290041T3; ATE368743T1; CZ301565B6; IL147225A0; MXPA02000134A; KR20020019938A; WO2001002580A1; NO20016270L; AU5547700A; DE60035781D1; EP1190064A1; EP1190064B1; US6777209B1

Abstract

(57)【要約】新規なＤＮＡ構築物およびそれを含んでなる宿主細胞を開示する。ＤＮＡ構築物は、転写単位（例えばオペロン）を含んでなり、その転写単位はリボヌクレオチドレダクターゼおよびチオレドキシン、またはウリジンキナーゼ遺伝子、および／またはｄＣＴＰデアミナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含んでなる。好ましい態様において、該構築物は、リボヌクレオチドレダクターゼおよびチオレドキシンをコードするＤＮＡ配列を含んでなり、かつ、チミジレートシンターゼをコードするＤＮＡ配列、および／または、好適にはｄＣＴＰデアミナーゼと共にウリジンキナーゼをコードするＤＮＡを含んでなる転写単位さらに含んでなる。特に好ましい態様において、本発明による宿主細胞は、上記特徴の全てを含む構築物を含んでなり、ここでこの宿主細胞は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ活性が抑制されているか、または該活性を全く示さないものである。これは宿主細胞のung遺伝子の削除によって達成することができる。ピリミジンデオキシリボヌクレアーゼ、例えばチミジンの産生における宿主細胞の使用も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野本発明は、新規なＤＮＡ構築物を含んでなる遺伝子修飾した細胞を用いるチミ
ジン、プリンおよびそれらの誘導体、例えばデオキシリボヌクレオシドの産生に
関する。

【０００２】背景技術チミジンは、医薬中間体として、特にアジドチミジン（「ＡＺＴ」、ZIDOVUDI
NEの商品名で発売）の化学合成の中間体として有用である。ZIDOVUDINE型ＡＺＴ
は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ用に開発された最初の治療薬の一つであるが、重要かつ多
岐にわたる用途を持ち続けている(Langreth, R., The Wall Street Journal, No
v. 21, 1995, pp B15)。ZIDOVUDINE型ＡＺＴは、EPIVIRという商品名で発売され
ているラミブジンとの配合薬（３ＴＣとしても知られている）のような配合治療
薬で用いられるときには特に重要である。このラミブジンおよび３ＴＣ配合薬は
、COMBIVIRという商品名で発売されている。ＨＩＶウイルスは突然変異を行って
ＡＺＴまたは３ＴＣに対する耐性を形成することができるが、COMBIVIR型ヌクレ
オチド類似体配合薬は、逆転写酵素が両ヌクレオシド類似体に同時に耐性を有す
ることは明らかにできないので、特に有効である(Larder, B.A. et al., Scienc
e 269: 696-699, 1995)。ZIDOVUDINE型ＡＺＴは、ＨＩＶプロテーゼ阻害薬型薬
剤と共同で用いることもでき(Waldholz, M., The Wall Street Journal, Jan. 3
0, 1996, pp B1)、および胎児の出産時の感染の頻度を減少させる目的でのＨＩ
Ｖ感染妊婦の治療にも用いられる。１９９７年には、約６００，０００人の子供
たちが、出産時に母親から感染したＡＩＤＳで死亡した。誕生前数ヶ月間ZIDOVU
DINE型ＡＺＴを投与することにより、ウイルスの乳児への伝達を三分の二だけ減
少させることができる。ＡＺＴの製造に用いられる化学合成によって製造される
チミジンは、かなりの価格である。

【０００３】米国特許第５，２１３，９７２号明細書（McCandliss & Anderson, 以後「’
９７２号特許明細書と表記）では、参考として本明細書に引用されかつ読者が具
体的に指示される全内容、ピリミジンデオキシリボヌクレオシド（ＰｄＮ）の製
造方法が開示されている（特に、’９７２号特許明細書の例７〜１４を参照され
たい）。ＰｄＮモノホスフェートをピリミジンデオキシリボヌクレオシドへ転換
するピリミジンデオキシリボヌクレオチドホスホヒドロラーゼをコードするＤＮ
Ａ配列を含んでなりかつ発現する複製可能な微生物が教示されている。更に詳細
には、McCandliss & Anderson（上記引用）は、BacillusバクテリオファージPBS
1由来のデオキシチミジレートホスホヒドロラーゼの発現を伴うチミジンを産生
するのに用いることができる発酵法を記載している。この種の酵素は、ＤＮＡに
チミジンを含まないが代わりにデオキシウリジンまたはヒドロキシメチルデオキ
シウリジンのような化合物を組込んでいるバクテリオファージによって天然で発
現されることが分かっている。

【０００４】該’９７２号特許明細書に記載のチミジン発酵では、チミジンを分解する酵素
（チミジンホスホリラーゼおよびウリジンホスホリラーゼ）が突然変異によって
除去されており、チミジンが蓄積するようになっている。従って、ｄＴＭＰアー
ゼ酵素を用いることにより、チミジンを合成できる経路の作成が容易になる。し
かしながら、ｄＴＭＰを単独で発現させても、商業的に存立できるレベルのチミ
ジン製造を確保できないことがある。従って、現在用いられている化学合成法に
比較して生産コストを引き下げることによって商業的に存立できる発酵によるチ
ミジンを製造する目的で、ｄＴＭＰアーゼを発現することによって、チミジンの
産生を増すことが絶えず求められている。

【０００５】例えば、E. coliでのチミジンデオキシヌクレオチド産生の生化学的経路は、
減衰、フィードバック阻害、および酵素活性化などの機構によって転写および翻
訳のレベル並びにタンパク質レベルで硬度に調節される。Neuhard, J. and R.A.
Kelln, ピリミジンの生合成および転換(Biosynthesis and Conversion of Pyri
midines), 第３５章, Neidhardt, F.C. et al.（監修）「大腸菌およびサルモネ
ラの細胞および分子生物学(Escherichia coli and Salmonella Cellular and Mo
lecular Biology)」，第２版，第１巻，pp 580-599, ASM Press, ワシントンD.C
., １９９６年。deoA（チミジンホスホリラーゼ）、udp（ウリジンホスホリラー
ゼ）およびtdk（チミジンキナーゼ）遺伝子によるｄＴＭＰアーゼの発現および
チミジン分解の除去、および生成する発現生成物は、E. coliにおけるチミジン
合成を生じるが、商業的に存立可能なレベルではない。

【０００６】

【発明の概要】

プリンおよびピリミジンの生合成は、リボヌクレオシドジホスフェート（いく
つかの種では、トリホスフェート）を相当するデオキシ類似体へ還元する広く知
られた段階を伴う。全般的工程では、リボース残基の２−デオキシリボースへの
還元には、究極的にＮＡＤＰＨおよびＨ^＋によって付与される一対の水素原子を
必要とする。しかしながら、E. coliリボヌクレオチドレダクターゼ系はtrxA（
チオレドキシン）grx（グルタレドキシン）二重突然変異体（Neuhard and Kelln
, 上記引用）でも働くので、直接の電子供与対はＮＡＤＰＨではなく、熱に安定
なタンパク質の還元形態である。還元したチオレドキシンの還元性同等物をリボ
ヌクレオシドジホスフェートレダクターゼに移して、還元工程を行う。例えば、
この段階を操作することにより、プリンおよびピリミジンデオキシヌクレオシド
の使用行的生産の改良に有用であることを確かめることができた。

【０００７】本発明の目的は、新規なＤＮＡ構築物、例えば、特にピリミジンおよびプリン
デオキシリボヌクレオシドを回収可能な量、特に商業上有用な量での生産に用い
るためのベクターおよびこのベクターを含んでなる遺伝子修飾した微生物を提供
することである。

【０００８】本発明のもう一つの目的は、上記のMcCandliss and Andersonと比較して改良
されている方法を提供することである。

【０００９】本発明の一態様によれば、リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子およびチオレ
ドキシン遺伝子またはウリジンキナーゼ遺伝子、および／またはｄＣＴＰデアミ
ナーゼ遺伝子を含んでなる、転写単位を含んでなるＤＮＡ構築物が提供される。

【００１０】一つの態様では、ＤＮＡ構築物は、リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子およ
びチオレドキシン遺伝子を含んでなる転写単位を含んでなる。

【００１１】もう一つの態様では、ＤＮＡ構築物は、ウリジンキナーゼ遺伝子および／また
はｄＣＴＰデアミナーゼ遺伝子を含んでなる転写単位を含んでなる。

【００１２】好ましくは、ＤＮＡ構築物は、ウリジンキナーゼ遺伝子およびｄＣＴＰデアミ
ナーゼ遺伝子を含んでなる転写単位を含んでなる。

【００１３】最も好ましくは、本発明のもう一つの態様は、リボヌクレオチドレダクターゼ
遺伝子およびチオレドキシン遺伝子およびウリジンキナーゼ遺伝子およびｄＣＴ
Ｐデアミナーゼ遺伝子を含んでなる転写単位を含んでなる。

【００１４】本発明のもう一つの態様によれば、本発明によるＤＮＡ構築物を含んでなる修
飾した宿主細胞が提供される。

【００１５】本発明の更にもう一つの態様によれば、本発明の修飾した宿主細胞を含んでな
る培地、および上記の修飾した宿主細胞の使用を含んでなるプリンまたはピリミ
ジン、例えば、チミジンの産生法が提供される。

【００１６】一態様では、宿主細胞はＤＮＡ構築物を含んでなり、該構築物が転写ＤＮＡ単
位（例えば、オペロン）を含んでなり、該単位がリボヌクレオチドレダクターゼ
とチオレドキシンをコードするＤＮＡ配列を含んでなり、上記レダクターゼは好
ましくは野生型の宿主細胞同等物または対応物よりアロステリック阻害に対する
感受性が低く、かつ上記細胞は、下記の特徴の１つ以上を含んでなる。 (a)好ましくは、上記ＤＮＡ構築物に配置された転写単位（例えば、ウリジン
）が、（好ましくは宿主細胞同等物に対して異種の）チミジレートシンターゼを
コードするＤＮＡ配列を含んでなり、 (b)好ましくは、上記ＤＮＡ構築物に配置された転写単位（例えば、ウリジン
）が、ウリジンキナーゼをコードするＤＮＡ配列、および好ましくはｄＣＴＰデ
アミナーゼを含んでなり、 (c)ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ活性が抑制されているか、または該活性が
ない。

【００１７】もう一つの態様では、回収可能な量のピリミジンおよびその誘導体、特にピリ
ミジンデオキシヌクレオシド、例えばチミジンの産生に用いられるＤＮＡ構築物
は、転写単位（例えば、オペロン）であって、ウリジンキナーゼおよび／または
ｄＣＴＰデアミナーゼをコードする（好ましくは、異種）ＤＮＡ配列を含んでな
る単位を含んでなる。

【００１８】構築物を含んでなりかつ発現する遺伝子修飾した宿主細胞、および修飾した宿
主細胞を含んでなる培地も提供される。

【００１９】この態様は、部分的には、ウリジンキナーゼおよび／またはｄＣＴＰデアミナ
ーゼをコードするＤＮＡを、場合によっては米国特許第５，２１３，９７２号明
細書に示唆されているようにチミジン産生に必要な他の遺伝子と共に含んでなる
宿主細胞により、チミジン産生が著しく改良されるという観察結果に基づいてい
る。

【００２０】本発明のそれぞれの態様は、改良されたＤＮＡ構築物と、この構築物を含んで
なる宿主細胞であって、ピリミジンデオキシリボヌクレオシド、特にチミジンの
商業生産に使用するものを提供する目的で米国特許第５，２１３，９７２号明細
書の教示について複数の進歩を初めて開示している。

【００２１】本発明の他の目的、態様および利点は、下記の説明から明らかになるであろう
。しかしながら、これらは本発明の好ましい態様を表しており、例示のためだけ
のものであることを理解すべきである。本発明の精神および範囲内での様々な修
飾および変更は、当業者に明らかになるであろう。

【００２２】

【発明の具体的な態様】

本発明の構築物は、染色体性、または更に好ましくは、例えばベクター上に配
置された染色体外性であることができる。

【００２３】本発明のベクターとしては、プラスミド、ウイルス、トランスポゾン、ミニク
ロモソームまたはファージ、好ましくはプラスミドが挙げられる。転写単位を含
んでなるベクターは、当業者に知られている任意の好都合な方法、例えばＰ１形
質導入、電気穿孔、または形質転換に準じて宿主細胞に導入することができる。
本発明で用いられる適当な宿主細胞としては、真核生物および原核生物（例えば
、Bacterium)が挙げられる。原核生物としては、E. coli、Salmonella、Pseudom
onas、Bacillus株およびそれらの突然変異体が挙げられる。E. coliは、大量の
情報、遺伝子ツール、および突然変異体対立遺伝子を利用することができるため
、好ましい。形質導入の方法を用いて、選択した宿主細胞が突然変異を一方の宿
主細胞から別の宿主細胞へ容易に移動させることができ、かつ新たな突然変異が
所望なときには宿主の遺伝子突然変異を促進し、直接突然変異を必要としないこ
とが特に好ましい。

【００２４】本発明は、バクテリオファージT4nrdA、nrdBおよびnrdC遺伝子の使用がE. col
i でレダクターゼおよびチオレドキシンをコードするのに特に有用であることを
見いだした。Sjoeberg, B. M. et al., EMBO J., 5:2031-2036 (1986); Tseng,
M.-J., et al., J. Biol. Chem., 263: 16242-16251 (1988);およびLeMaster, D
.M., J. Virol. 59:759-760 (1986)を参照されたい。更に具体的には、T4リボヌ
クレオチドレダクターゼはE. coliチオレドキシンを用いることができないので
、E. coliチミジン産生では、リボヌクレオチドレダクターゼをコードするT4バ
クテリオファージnrdAおよびnrdB遺伝子をチオレドキシンをコードするT4nrdCと
共にクローニングと発現をすることによって著しく向上した。T4によってコード
されるリボヌクレオチドレダクターゼは、E. coli酵素と比較してイン・ビトロ
ではアロステリック阻害による制御に比較的不感受性であることを見いだした(B
erglund, O., J. Biol. Chem. 247:7276-7281, 1972)。例えば、E. coli酵素(Be
rglund, O., J. Biol. Chem. 247:270-7275, 1972)とは異なり、T4リボヌクレオ
チドレダクターゼはｄＡＴＰによって阻害されないが、ｄＡＴＰおよびＡＴＰに
よって実際に刺激される(Berglund, O., J. Biol. Chem. 247:7276-7281, 1972)
。

【００２５】リボヌクレオチドレダクターゼをコードするＤＮＡ配列（例えば、nrdAおよび
nrdB遺伝子）およびチオレドキシンをコードするＤＮＡ配列（例えば、nrdC遺伝
子）は、好ましくは宿主細胞ＤＮＡに関して異種性であり、好ましくはＴファー
ジ（好ましくは、E. coliバクテリオファージ）、特にＴ「偶数」ファージ、例
えばＴ２、T4またはＴ６由来である。Campbell, A.M., バクテリオファージ(Bac
teriophages), 第１２３章, Neidherdt, 上記引用; およびMathews, C.K. et al
. （監修）バクテリオファージT4(Bacteriophage T4), American Society of Mi
crobiology, ワシントンＤ．Ｃ．, １９８３年を参照されたい。「由来」という
用語は、その物理的起源の意味における供給源を定義するだけでなく、参照供給
源に由来する材料に相当する構造および／または機能的特徴を有する材料をも定
義しようとするものである。

【００２６】Ｔ偶数ファージ酵素のもう一つの有用な特徴は、その基質特異性である。通常
のE. coliリボヌクレオチドレダクターゼでは、ＵＤＰに対するＫ_ｍはＣＤＰよ
りＵＤＰについて約１０倍高いので（Neuhard and Kelln, 上記引用）、ＵＤＰ
を基質としてごく稀にしか用いない。しかしながら、T4では、ＣＤＰとＵＤＰ基
質の間のＫ_ｍの差が２倍しかないので(Berglund, O., J. Biol. Chem. 247:7276
-7281, 1972)、ｄＵＴＰ合成には二つの経路を用いることができる。E. coliに
おけるT4リボヌクレオチドレダクターゼの機能発現を得るため、様々な試みがな
されてきたが、以前の努力は成分を個別に発現することでしか報われず、イン・
ビトロで混合することによってしか活性を示すことができなかった(Tseng, M.-J
., P. He, J.M. Hilfinger, and G.R. Greenberg, J. Bacteriol. 172: 6323-63
32, 1990)。理論によって束縛されるものではないが、理論によって束縛される
ものではないが、本発明者らは、おそらくはフィードバック阻害の通常のパター
ンが欠落しているため、E. coliにおけるT4リボヌクレオチドレダクターゼの発
現は致死性であり、注意深く条件付きで発現しなければならないと考えている。
更に、成熟形態を産生する目的で加工されるレダクターゼおよび／またはチオレ
ドキシンの前駆体形態をコードする遺伝子も考えられる。このような加工は、様
々な中間体形態を介して進むことがある。

【００２７】本発明のベクターは、好ましくは調節要素（例えば、λＰＬ、オペレーター、
アクチベーター、λリプレッサーのようなリプレッサー、特に温度感受性変異体
、および／またはエンハンサー）、適当な終止配列、開始配列、およびリボソー
ム結合部位を含んでなる。ベクターは、更に選択可能なマーカーを含んでなるこ
とができる。あるいは、調節要素（特に、λリプレッサー）を、宿主細胞染色体
上に配置することができる。nrdAおよびnrdBは、nrdCの（リーディングフレーム
に関して）下流のベクターに配置するのが好ましい。特に、nrdBはnrdAの下流に
配置するのが好ましい。従って、最も好ましい配置は、nrdCABを含んでなるオペ
ロンを含んでなるベクターである。

【００２８】 T4リボヌクレオチドレダクターゼは、イン・ビボでのフィードバック制御が欠
けていない（J. Ji, R.G. Sargent, and C.K. Mathews, J. Biol. Chem. 266: 1
6289-16292, 1991;およびBerglund, 上記引用）。例えば、酵素の直接的生成物
による阻害または下流の事象から生じる生成物による阻害などのアロステリック
阻害に対する感受性が減少しているため、例えば、チミジン産生の目的でリボヌ
クレオシドジホスフェート還元を更に促進するには、調節サブユニットnrdAをコ
ードする遺伝子を、例えばチミジン産生を増加させることができる酵素を作成す
るための突然変異法によって修飾することができる。

【００２９】 T4nrdA突然変異体を構築するため、位置指定突然変異誘発を用いて、アロステ
リック調節に関与するｄＴＴＰ結合部位などを変更すると思われるアミノ酸をコ
ードする遺伝子塩基を修飾または変更（例えば、置換）することができる。T4リ
ボヌクレオチドレダクターゼのアミノ酸配列を分析したところ、ｄＴＴＰ結合に
関与すると考えられる仮定のコンセンサス配列と良好に適合すると思われるセグ
メントが明らかになった(E.M. McIntosh and R.H. Havnes, Mol. Cell. Biol. 6
: 1711-1721, 1986)。T4リボヌクレオチドレダクターゼのこの領域において、オ
リゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いていくつかの変更を行うことができる
。一般的方法は、More et al. (More, J.T., J.M.Ciesia, L.-M. Changchien, G
.F. Maley and F. Maley, Biochemistry 33: 2104-2112, 1994)の成果に準じて
行い、デオキシシチジレートデアミナーゼのｄＴＴＰ結合を減少させることがで
きる。T4nrdAにおける⁷⁹AlaからIleへの突然変異が、極めて有用であると思われ
る。例えば、フラスコ振盪発酵法によって評価したT4nrdAにおける⁷⁹AlaからIle
への突然変異体を含む株のチミジン生産性は、著しく増加した。下記のように、
本発明者らは、この単一の変更のない親株に比較して少なくとも２５％増加した
。

【００３０】 ⁷⁹AlaからIleへは一つの成功例であるが、当業者であれば、多くの他のアミノ
酸をこの領域へ変更することにより、ｄＴＴＰ結合を推定的に崩壊させるが酵素
の基本的機能は崩壊させないという所望な効果を得ることができることを理解さ
れるであろう。例えば、⁷⁹AlaをIleと同様な側鎖を示す他のアミノ酸（例えば、
ロイシン、バリン）による置換を用いることができる。仮定のコンセンサス領域
内での他の修飾（例えば、突然変異）と共同での７９位の修飾を考えることもで
きる。コンセンサス領域での１以上のアミノ酸位置の欠失、および合成ＤＮＡの
この領域への導入は、当業者が利用可能な他の方法である。

【００３１】本発明のもう一つの好ましい態様では、構築物を含んでなる宿主細胞であって
、この構築物（例えば、ベクター）が異種リボヌクレオチドレダクターゼおよび
チオレドキシンをコードするＤＮＡ配列を含んでなる転写単位を含んでなり、こ
のレダクターゼは野生型宿主細胞同等物または対応物よりアロステリック阻害に
対する感受性が低いものが提供される。野生型宿主細胞同等物に比較してアロス
テリック阻害に対する候補の異種レダクターゼの相対感受性を測定することは、
日常的実験および観察の問題であることは、当業者には明らかになるであろう。

【００３２】ＤＮＡ配列を含んでなる転写単位、例えば、nrdA、nrdBおよびnrdC遺伝子は、
好ましくはnrd遺伝子が縦一列に配置されているオペロンである。これにより、
単一ｍＲＮＡ転写産物としてこれらの遺伝子を転写することができる。宿主細胞
による無効エネルギー支出を最小限にしかつ更にプラスミドサイズを最小限にす
るためには、オペロンがレダクターゼおよびチオレドキシン（任意の調節または
制御要素を含む）のコーディングに必要な遺伝子配列のみを含むことが好ましい
。これには、余計なＤＮＡ（例えば、ファージT4nrdB遺伝子の異常イントロン,
Sjoberg, B-M., et al., EMBO J. 5: 2031-2036, 1986）。

【００３３】他の好ましい態様では、例えば、チミジンの産生に用いる本発明のベクターは
、更にチミジレートシンターゼをコードするＤＮＡ配列（例えば、td遺伝子）を
含んでなる。例えば、Chu, F.K. et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 81: 30
49-3053 (1984); Chu, F.K. et al., J. Bacteriol. 169: 4368-4375 (1987)を
参照されたい。この酵素の使用目的は、産生したデオキシウリジンのレベル、特
にチミジンに対するデオキシウリジンの相対不純物レベルに対する制御を改良す
るためである。ｄＴＭＰ酵素は、ｄＴＭＰに完全に特異的ではない。ｄＴＭＰに
対するより高いＫ_ｍでは、PBS1dTMＰアーゼはｄＵＭＰも基質として用い、デオ
キシウリジンを産生する(Price, A.R., Methods in Enzymol. 51: 285-290, 197
8)。デオキシウリジンは、チミジンの精製について重要な問題を生じる。従って
、デオキシウリジン産生を減少させる一つの方法は、チミジレートシンターゼの
レベルまたは有効性を増加させることによってｄＵＭＰをｄＴＭＰへ効率的に転
換し、ｄＵＭＰの内部濃度が常に極めて低いままになるようにすることである。

【００３４】チミジレートシンターゼ遺伝子(td)は宿主細胞に関して異種性であり、tdはＴ
バクテリオファージ、例えば、Ｔ「偶数」ファージに由来し、特にT4ファージtd
であるのが好ましい。tdはそれ自身の転写単位に配置されることがあるが、tdは
nrd遺伝子と同じ転写単位、例えばオペロンに配置されるのが好ましい。更に、t
dは、nrd遺伝子の下流（リーディングフレームに関して）の同じオペロンに配置
されるのが好ましい。

【００３５】 McCandliss and Anderson（上記引用）は、プラスミドpCG138およびpCG148でE
. coliチミジレートシンターゼ遺伝子を増幅し（’９７２号特許明細書の表５を
参照）、デオキシウリジンの減少に部分的に有効であることを見いだした。T4チ
ミジレートシンターゼは遙かに有効であり、このことは、E. coli酵素がいかな
る種類のアロステリック調節によっても制御されるとは考えられないことを考慮
すれば驚くべきことである（Neuhard and Kelln, 上記引用）。ｄＵＭＰについ
てのE. coli酵素Ｋ_ｍ，４μM（Wahba, A.J. and M. Friedkin, J. Biol. Chem.
237:3794-3801)、およびｄＵＭＰについてのT4酵素のＫ_ｍ，２．７３μM（Maley
, F., L. Lapat-Polasko, V. Frasca and G.F. Maley, 位置指定突然変異誘発に
よって解明されるT4チミジレートシンターゼにおける機能ドメイン(Functional
domains in T4 Thymidylate Synthase as probed by site-directed mutagenesi
s), 第２９章: Karam, J.D.（監修）「バクテリオファージT4の分子生物学(Mole
cular Biology of Bacteriophage T4)」, American Society for Microbiology,
ワシントンD.C., 1994, pp 322-325）は同様であり、有効性における大きな差
を説明することはできない。理論によって束縛されるものではないが、本発明者
らは、E. coli thyAが、プラスミドクローンでの発現レベルをもたらすことがで
きる上流の遺伝子由来の内部転写終止配列を有すると考えている(Bell-Penderso
n, D, J.L. Galloway Salvo, and M. Belfort, J. Bacteriol. 173: 1193-1200,
1991)。

【００３６】他の好ましい態様では、特にピリミジンデオキシリボヌクレオシド、例えばチ
ミジンの商業生産に用いられる本発明の宿主細胞は、ＤＮＡ配列、例えばウリジ
ンキナーゼをコードするudk遺伝子、および好ましくはＤＮＡ配列、例えばｄＣ
ＴＰデアミナーゼをコードするdcd遺伝子を含んでなる転写単位（例えば、オペ
ロン）を含んでなる。例えば、Wang, L. and B. Weiss, J. Bacteriol. 174: 56
47-5653 (1992); およびNeuhard, J. and L. tarpph, J. Bacteriol. 175: 5742
-5743を参照されたい。

【００３７】本発明のこの態様の構築物は、更にリボヌクレオチドレダクターゼ（nrdAおよ
びnrdB）およびチオレドキシン(nrdC)をコードする転写単位またはその前駆体形
態であって、好ましくは宿主細胞ＤＮＡに関して異種性でありかつ好ましくはE.
coliバクテリオファージ、特にＴ「偶数」ファージ、例えばＴ２、T4またはＴ
６由来のものを含んでなることもできる。

【００３８】ウリジンキナーゼは、ＧＴＰ（またはｄＧＴＰ）をホスフェート供与体として
用いてウリジンおよびシチジンからＵＭＰおよびＣＭＰを産生する。反応は、Ｕ
ＴＰおよびＣＴＰによって阻害される（J. Neuhard and R.D. Kelln, ピリミジ
ンの生合成および転換(Biosynthesis and Conversion of Pyrimidines), 第３５
章: F.C. Neihart et al. （監修）「大腸菌およびサルモネラの細胞および分子
生物学(Escherichia Coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology)」
, 第２版, ASM press, ワシントンD.C.）。本発明者らは、ウリジンキナーゼを
特にｄＣＴＰデアミナーゼと共に使用すると、これらの変更を上記引用の’９７
２号特許明細書の教示と共に組込んでいる宿主細胞によってチミジンの産生が著
しく改良されることを見いだした。ウリジンキナーゼは、最新の情報に基づけば
、ピリミジンのデ・ノボでの生合成に直接的役割は持たず、更にその使用はピリ
ミジンデオキシリボヌクレオシドの生産のための商業的工程に有益であるので、
この観察は全く予想外のものであった。udkおよびdcd遺伝子を、同一オペロンに
縦一列に配置するのが好ましい。更に、成熟形態を生成するように加工されてい
るudkおよびdcd遺伝子の前駆体形態をコードする遺伝子も考えられる。このよう
な加工は、様々な中間体形態を介して進むことがある。udkおよびdcd遺伝子は、
当業者に周知の方法、例えばＰ１形質導入、電気穿孔または形質転換によって任
意の適当な供給源から構築物（例えば、ベクター）に導入することができる。

【００３９】 ung遺伝子によってコードされる酵素ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは、チミ
ンの場所にウラシルを組込んだＤＮＡの分解に関与している。本発明の宿主細胞
をチミジンなどの症状生産に用いる場合には、ｄＴＴＰの内部細胞濃度はチミジ
ンの産生においてｄＴＭＰ（ｄＴＴＰの前駆体）を用いた結果として低下させる
ことができる。従って、本発明者らは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ活性が宿
主細胞ＤＮＡで余りにも多くの一本鎖開裂を引起すため野生型宿主には致死的で
あることがある宿主ＤＮＡへのウラシル組込みの傾向が潜在的に大きいことを認
めている。従って、本発明で有用な宿主細胞は、更にウラシルＤＮＡグリコシラ
ーゼ活性が（未修飾細胞と比較して）抑制されておりまたはこの活性を全く示さ
ないことがある。この抑制または非存在は、当業者に明らかな様々な方法によっ
て達成することができる。例えば、ung遺伝子発現生成物の（完全なまたは部分
的な）拮抗作用は、機能酵素（またはその前駆体）の拮抗物質を宿主細胞に導入
することによる一つの方法である。他の方法としては、例えば、ung遺伝子発現
の調節要素を修飾しまたはung遺伝子自身に突然変異を導入してung遺伝子生成物
発現がウラシルＤＮＡグリコシラーゼタンパク質および／または活性をほとんど
または全く示さないようにすることによるung遺伝子発現の操作が挙げられる。
もう一つ方法は、ung遺伝子（またはその機能的に重要な部分）を宿主細胞ＤＮ
Ａから削除することである。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ活性が存在しないこ
とまたは低レベルであることは、更に操作の必要がない宿主細胞の特徴であるこ
とがある。

【００４０】本発明の好ましい態様では、本明細書で教示された進歩のそれぞれが、宿主細
胞に組込まれている。nrd、td、udkおよびdcd遺伝子は別々の構築物に配置する
ことができるが、それらを総て同一の構築物、例えば、ベクターに配置するのが
好ましい。従って、本発明の特に好ましい態様では、修飾された宿主細胞であっ
て、この細胞は転写ＤＮＡ単位（例えば、オペロン）を含んでなるＤＮＡ構築物
（例えば、ベクター）を含んでなり、該単位が修飾したリボヌクレオチドレダク
ターゼとチオレドキシンをコードするＤＮＡ配列（好ましくは、Ｔ偶数ファージ
、例えば、T4）を含んでなり、上記レダクターゼは好ましくは野生型の宿主細胞
同等物または対応物よりアロステリック阻害に対する感受性が低く、かつ上記構
築物は、 (a)（好ましくは、宿主細胞同等仏又は対応物に関して異種の）チミジレート
シンターゼをコードする転写単位、 (b)ウリジンキナーゼ、および好ましくはｄＣＴＰデアミナーゼをコードする
転写単位を含んでなり、宿主細胞のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ活性が抑制され、またはないものが
提供される。

【００４１】本発明によって修飾された宿主細胞は、ピリミジンデオキシリボヌクレオシド
の商業生産に特に有用である。本発明の特に有利な用途では、（特に’９７２号
明細書の教示と共同して）本発明により修飾されたプラスミドを含んでなる（収
容している）E. coli宿主細胞を、チミジンの商業生産に用いることができる。
従って、本発明によって修飾された宿主細胞は、PBS1などに由来するｄＴＭＰア
ーゼ、および’９７２号明細書に教示された突然変異、例えば、deoA、tdk-1お
よびudp-1を更に含んでなることができる。

【００４２】一般に、適当な容器内に入れた培地に細胞を浸漬することを伴う発酵法が用い
られる。適当な条件下で培養した後、生成したチミジンを回収して、必要ならば
標準的プロトコールに準じて医薬級まで精製（濃縮）する。次に、精製チミジン
を、医薬品、例えば、ＡＺＴのような医薬組成物の製造に用いることができる。

【００４３】

【実施例】例１ T4 nrdCAB遺伝子のクローニングおよび活性の証明バクテリオファージT4 nrdAB遺伝子を、単離したファージT4ＤＮＡを用いるポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによってクローニングした。ＰＣＲnr
dA遺伝子のプライマーは、下記の通りであった。 5'-TAT TCT AGA CGA TTT TCA AGT TGA GGA CTT ATG C-3' （配列番号：１）；お
よび 5'-TAT ATC GAT AAT TCA TTA CAA TTT ACA CGC TGC AC-3' （配列番号：２）。

【００４４】増幅したＤＮＡにおけるnrdAの開始時に、制限部位XbaIを導入し、ClaIをnrdA
の３′末端に導入した。nrdB遺伝子のＰＣＲ増幅のプライマーは、下記の通りで
あった。 5'-TAT ATC GAT AAA TGT AAA TTT AAG GAT TCT AAA TG-3'（配列番号：３）、お
よび 5'-TAT GTC GAC TCC TTA AAA GTA TTT TTT AAA ACT C-3'（配列番号：４）。

【００４５】このようにして、制限部位ClaIはnrdBの始めに導入され、ApaIは増幅ＤＮＡの
nrdBの終わりに導入された。ＰＣＲ断片は、当業者に知られている手法に従って
図１に示されているようにプラスミドベクターにクローニングした。クローニン
グしたnrdAB遺伝子は、酵素活性分析法によって確かめた。T4 nrdC遺伝子はpKC3
0産生プラスミドpDL51にクローニングされ(LeMaster, D.M., J. Virology 59: 7
59-760, 1986)、D. LeMasterによって供給された(Dept of Biochem., Univ. Wis
consin, マジソン, ウィスコンシン)。遺伝子は、図１に示すように、nrdAB遺伝
子を用いてプラスミドにサブクローニングした。図１で用いた出発材料の供給源
およびバックグラウンド情報を、表１に示す。

【００４６】合成転写ターミネーターを、pCG198およびpCG301の構築に用いた（図１および
表１を参照されたい）。具体的には、Stratagene （ラホーヤ, カリフォルニア
）から入手したプラスミドpBC sk⁺を、制限酵素ApaIおよびAsp718Iで消化した。
次に、ECOTGP転写終止配列を含む合成ＤＮＡ(d' Aubenton Carafa et al., J. M
ol. Biol. 216: 839-843, 1990)を連結して、最初の配列をApaIとAsp718Iエンド
ヌクレアーゼ部位の間で置換した。この断片はApaI認識配列を再現したが、新た
なプラスミドのAsp718I認識配列を破壊した。挿入したＤＮＡは、２個のオリゴ
ヌクレオチドから生成した下記の組成を有していた。 5' -CGAGC CCGCCTAATG AGCGGGCTTT TTT TT -3' 3'CCGGGCTCG GGCGGATTAC TCGCCCGAAA AAAAACATG -5' （配列番号：５および６でそれぞれの鎖として示す）

【００４７】

【表１】

【００４８】プラスミドpCG198を、図１に示すように、pBluescript II ks (Stratagene,
ラホーヤ, カリフォルニア)にクローニングしたプラスミドpKC30由来のλＰ_Ｌプ
ロモーターを含むpCG173と組合わせた。pCG198およびpCG173は両方ともHindIII
およびAsnIで消化した後、連結してλＰ_Ｌプロモーター、多重制限酵素クローニ
ング部位、および続いてトリプトファンオペロンリーダーペプチド領域からコピ
ーしたECOTGPターミネーター配列を含む新たなプラスミドpCG301を生成した。

【００４９】 T4リボヌクレオチドレダクターゼ活性を、放射性同位元素およびUDP基質の使
用を伴わない方法によるＨＰＬＣによって測定した。直接リボヌクレオチドレダ
クターゼ分析では、１mM ＮＡＤＰＨ、１mM ＤＴＴ、０．５mM ｄＡＴＰ、０
．６mM ＵＤＰ、２０mMトリス（ｐＨ８．０）および５mM ＭｇＣｌ_２を含んで
いた。これらの条件下では、E. coliリボヌクレオチドレダクターゼが阻害され
、検出されない。酵素反応（１００μl）を、５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）
１０μlを加えることによって停止した。氷上で１０分後、試料をミクロ遠心分
離機で遠心分離する。上清をジエチルエーテルで４回抽出し、ＴＣＡを除去する
。トリス緩衝液（１．０M，ｐＨ８．０）５mlを加えた後、４０mg/mlガラガラヘ
ビ毒(Sigma)２μlを加え、試料を３７℃で６０分間インキュベーションした。次
に、試料を７０℃で３分間加熱した後、５分間遠心分離して、沈澱物を除去した
。容積を等しくした後、ＵＶ検出器およびデオキシウリジンを標準物質として用
いてＨＰＬＣによって分析する。カラムはSpherisorb ODS-2, ５ミクロン，２５
０mm×４．６mmであり、１２mMリン酸アンモニウム（ｐＨ５．０）移動相、およ
び約１．０ml／分の流速を用いる。結果は、T4リボヌクレオチドレダクターゼの
機能発現を示すプラスミドpCG343を含む細胞について、表２に示している。

【００５０】

【表２】

【００５１】例２ CMG1115株から宿主株CMG2451の誘導 CMG1115株は、McCandliss & Anderson （米国特許第５，２１３，９７２号明
細書）に詳細に記載されている。CMG1115は、本明細書に記載の開発の出発点で
あった。CMG1115株は、CMG2401株を生成する５−フルオロウリジン３０mg/lを含
む培地で増殖させる目的で選択することによってチミジン生産性が改良された。
次に、CMG2401株を、CMG2404株を生成する３′−アジド−３′−デオキシチミジ
ン３０mg/lを含む培地で増殖させる目的で選択した。CMG2404は、元の親JM101か
ら突然変異Δ(lac-pro)の遺伝により、増殖にはＬ−プロリンを必要とする。CMG
2404とHfr株CAG5053との間のHfr交配は、当業者に知られている手法によって行
い、Lac⁺, Pro⁺であるCMG2434株を生成した。CMG2434におけるudp（ウリジンホ
スホリラーゼ）突然変異は、未だ部分的ウリジンホスホリラーゼ活性を有してお
り、これはチミジン産生の誘発後にチミンの蓄積により明らかであった。udp突
然変異を、当業者に知られている手法に従ってファージP1形質導入によってCGSC
5128 (E. coli Genetic Stock Center, イェール大学)から再導入した。CAG1849
1株からのmetE3079::Tn10を最初にCMG2434に形質導入し、udpの形質導入のため
の正の選択マーカーとして用いた。次いで、udp-1を、定義した培地でメチオニ
ンなしで増殖用に選択することによってCMG2434のmetE3079::Tn10誘導体に形質
導入した。udp-1誘導体を、CMG2451株と命名した。CMG2451の系統を、表３にま
とめる。

【００５２】

【表３】

【００５３】例３ T4td遺伝子のチミジン産生プラスミドへのクローニングおよび発現 T4td遺伝子は、West et al. (J. Biol. Chem. 261: 13446-13450, 1986によっ
て、１０１７塩基対のイントロンなしでpKTdΔIにクローニングした。td遺伝子
を、下記の配列 5'-GAT CCG GAG GAT AAA TGA AAC AAT ACC AAG ATT TAA T-3' (配列番号：７)、
および 5'-TAA ATC TTG GTA TTG TTT CAT TTA TCC TCC G-3' （配列番号：８）を有するリンカーとして２種類のオリゴヌクレオチドを用いてpCG301にサブクロ
ーニングした。

【００５４】生成するプラスミドは、pCG356であった。次に、pCG356からのtd遺伝子をpCG3
43にサブクローニングして、pCG360を作成した（図１）。テトラサイクリン耐性
遺伝子およびpBR322からのプラスミド複製起点(Bolivar, F. et al., Gene 2: 9
5-113, 1977)をpCG360にサブクローニングし、pCG366を形成した。チミジレート
シンターゼ活性は、Wahba and Friedkin (J. Biol. Chem. 236: PC11-PC12, 196
1)の分光光度法によって測定した。結果を表４に示す。

【００５５】

【表４】

【００５６】例４チミジン産生およびデオキシウリジン還元についてのT4 td遺伝子の有用性を示
す振盪フラスコデータ振盪フラスコ発酵を用いて、別のE. coli組換え体のチミジン生産性を評価し
た。この例および他の例で用いた振盪フラスコ発酵液および方法は、下記の例６
に記載されている。この場合に、２０ml容積／フラスコに種培養物２mlを接種し
、３０℃振盪装置でインキュベーションした。約１０OD, ６００nmにおいて、フ
ラスコを３７℃の振盪装置に移して３０分間振盪し、λＰ_Ｌプロモーターを控え
めに誘導した。次いで、フラスコを３５℃振盪装置に移して、発酵を継続した。
発酵中に必要に応じてグルコースを供給し、ｐＨをフェノールレッドの色によっ
てアンモニアで約７に調節した。チミジン濃度を、Spherisorb ODS-2, ５ミクロ
ン，２５０mm×４．６mmカラム、および流速が約１．５ml／分の２５mMリン酸ア
ンモニウム（ｐＨ３．３）移動相を用いてＨＰＬＣによって測定した。

【００５７】株CMG2451/pCG366 (T4 nrdCAB, td)を、浸透フラスコ発酵においてCMG2451/pC
G343 (T4 nrdCAB)と比較した。表５は、デオキシウリジン濃度が減少し、T4 td
遺伝子により株CMG2451/pCG366でチミジンに転換されることを示している。

【００５８】

【表５】

【００５９】例５ ⁷⁹ AlaからIle T4リボヌクレオチドレダクターゼ突然変異体の構築 Kunkelによって記載された方法に基づく位置指定突然変異誘発を用いることに
よって、突然変異を導入した(Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82
: 488-492, 1985)。pTZ18UファージミドＤＮＡ、M13KO7ヘルパーファージ、細菌
株E. coli CJ236およびMV1190、T7ＤＮＡポリメラーゼ、およびT4ＤＮＡリガー
ゼを包含する突然変異体構築のための総ての材料は、Bio-Rad Laboratories（He
rcules, カリフォルニア）製のMuta-Gene in vitro 突然変異誘発キットで提供
された。最初に、T4バクテリオファージのnrdA遺伝子を含むXbaI/HindIIIＤＮＡ
断片を、プラスミドpCG312 (ChemGen Corp., 上記の表１)から単離した。XbaI/H
indIIIＤＮＡ断片を、標準的プロトコールを用いてpTZ18Uファージミドベクター
のXbaI/HindIII部位にクローニングした(Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Man
iatis, T., 分子クローニング(Molecular Cloning), Cold Spring Harbor Labor
atory, ニューヨーク, １９８９年)。インサートを運ぶファージミドpCG464を、
E. coli CJ236に導入した。この株はｄＵＴＰアーゼ(dut)およびウラシル−Ｎ−
グリコシラーゼ(ung)を欠き、新たに合成したＤＮＡのチミンがウラシルによっ
て偶発的に置換される。ウラシルを含むpCG464の一本鎖ＤＮＡは、Bio-Rad Labo
ratories Instructional Manualに準じてCJ236から単離した。このＤＮＡ（０．
２pM）を、元の⁷⁹Alaの代わりにIleをコードする所望な突然変異（下線）の配列
を含むホスホリル化プライマー 5'-AGC AAA CAT TAA ACA GCG TGC AATTAC ATA TTG ATA ATC AGG TTC-3'（配列番
号：９）でアニールした。

【００６０】相補鎖ＤＮＡは、Bio-Radのプロトコールに記載の方法でT7ＤＮＡポリメラー
ゼを用いることによって合成した。反応生成物を野生型ウラシル−Ｎ−グリコシ
ラーゼを含むE. coli MV1190に形質転換し、これはウラシル含有の親鎖を分解し
、従って突然変異体鎖の濃度が高くなる。Promega Corp. （マジソン, ウイスコ
ンシン）製Silver Sequence DNA Sequencing Systemを用いる直接ＤＮＡ配列決
定により、所望の突然変異を含むプラスミドを同定した。分析した４種類総ての
形質転換体が、突然変異を有するプラスミドを含んでいた。それらの一つをpCG4
92と命名して、更に実験に用いた。突然変異がチミジン合成に影響を与えるかど
うかをチェックするため、これを産生プラスミドpCG366 （ChemGen Corp., 表１
および図１））に導入した。このため、nrdA遺伝子の５′部分を含むpCG366のKp
nI/AflIIＤＮＡ断片を、突然変異を含むpCG492由来のKpnI/AflII断片で置換した
。新たなプラスミドpCG494を、生産株CMG2451（ChemGen Corp., 上記の例２およ
び表４）に導入した。T4 nrdA 突然変異の効果を、下記の例６に示すようにCMG2
451 (pCG494)およびCMG2451 (pCG366)によりチミジン産生の比較によって評価し
た。

【００６１】例６ CMG2451 (pCG366)およびCMG2451 (pCG494)を用いるチミジン生産のための振盪フラスコ発酵産生培地２５mlを含む２５０mlのバッフルフラスコに、適当な抗生物質を加え
たＬＢブロスに新たに増殖した種培養物２mlを接種した。培養物を、３０℃の振
盪装置中で２５０rpmにて増殖させた。ＯＤ_６００が約５に達したときに、フラ
スコの内容物を３７℃の振盪装置に移し、３０分間増殖した。その後、フラスコ
の内容物を３５℃振盪装置に移して、発酵を継続した。生産培地は下記の組成（
g/l）を有した：Ardamine YEP-S (Red Star Yeast & Products, ミルウォーキー
, ウィスコンシン)，１０；ＣａＣＯ_３，１０；ＭｇＳＯ_４，０．４；フェノー
ルレッド，０．２４；PP90BT (DMV International, フレーザー，ニューヨーク)
，４．５；ソルビトール，２０；クロラムフェニコール，０．０３；微量元素（
１０００×），１ml/l。微量元素（１０００×）の処方は下記の通りである：ホ
ウ酸，０．０５；塩化カルシウム，２０；硫酸コバルト，０．０５；硫酸銅，０
．０１；硫酸第一鉄，２０；塩化第二鉄，２０；硫酸マグネシウム，０．５；モ
リブデン酸ナトリウム，０．１；および硫酸亜鉛，０．１。誘導時に、Ardamine
YEP-S１０g/lを加えた。グルコースを、発酵中に平均２時間毎に供給した（２
．５g/l）。フラスコのｐＨは、フェノールレッド指示薬染料の色によって判断
しながら４ＮＮＨ_４ＯＨを加えて約７．０に保持した。ＯＤ_６００は、試料を
１０mM Ｈ２ＳＯ４中で１：１０に希釈して、塩を培地に溶解した後に読取った
。チミジン濃度を、Alltech SpherisorbODS-2カラムおよび２６０nmでのShimadz
u分光光度検出器を用いて逆相C-18 ＨＰＬＣによって測定した。移動相は２５mM
ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４（ｐＨ３．３）／水であり、流速は１．５ml／分の一定であ
った。

【００６２】誘導後２、１７および２５時間後のCMG2451 (pCG366)およびCMG2451 (pCG494)
によるチミジン産生の結果を、表６に示す。この実験では、フラスコを２回反復
し、２個のフラスコ間の変動性は１５％を超過しなかった。これらの結果は、T4
nrdA突然変異体が野生型nrdA株より良好に機能したことを示している。これは
、同一細菌株を用いる数個の独立した振盪フラスコ実験で確かめられた。

【００６３】

【表６】

【００６４】例７ E. coli udk遺伝子のチミジン産生に対する効果を示すための振盪フラスコ発酵 dcd遺伝子またはdcd udkオペロンを、pACYC177ベクターにクローニングした。
p15複製起点を有するこのベクターはpCG366のようなcolE1に基づくプラスミドと
は異なり、従ってcolE1に基づくプラスミドと適合性でありかつ同一宿主に保持
することができる。pCG374 (udk dcd)またはpCG375 (dcd)を生じるプラスミド構
築物の詳細を、図２に示す。これらのプラスミド上の遺伝子は、udk dcdオペロ
ンの天然のE. coliプロモーターから発現される。

【００６５】アンピシリン耐性に対する選択を用いて、プラスミドpCG374およびpCG375をCM
G2451 (pCG366)に導入し、例６に記載の振盪フラスコ発酵法でのチミジン産生に
ついての効果を試験した。数時点での結果を、表７に示す。特異活性（細胞のＯ
Ｄ当たりのチミジン）はudk遺伝子があってもまたはなくともいずれも同様であ
るが、第二のプラスミドpCG374上にudk遺伝子がある細胞はより高い細胞密度に
増殖し、顕著に多量のチミジンを産生した（dcdのみの第二のプラスミドを有す
る株について３．０g/lであるのと比較して５．８g/l）。この結果は、ウリジン
ホスホリラーゼがこの効果を有する理由が明らかでないので、予想されたもので
はなかった。

【００６６】このデーターおよび他の情報に基づいて、udk遺伝子を選択し、プラスミドpCG
532の構築においてE. coli dcd遺伝子と共に導入した（例８および図３を参照さ
れたい）。

【００６７】

【表７】

【００６８】例８ E. coli udk dcdオペロンの産生プラスミドpCG494へのクローニング E. coliのudkおよびdcd遺伝子は、それぞれピリミジンリボヌクレオチドキナ
ーゼおよびｄＣＴＰデアミナーゼをコードする。いずれの遺伝子も、Koharaゲノ
ムライブラリーのλファージ３５５の３．４kb BamHI/PstI ＤＮＡ断片にマッピ
ングした(Kohara, Y., Akiyama, K. and Isono, K., Cell 50, 495-508, 1987)
。udkはdcdの上流に配置されており、dcdと同じ方向に転写されると思われる(Ne
uhard, J. and Tarpo, L., J. Bacteriol. 175: 5742-5743, 1993)。これらの遺
伝子を、二段階で産生プラスミドにクローニングした。最初に、λ３５５からの
３．４kb BamHI/PstI ＤＮＡ断片をプラスミドpUC18の多重クローニング部位に
クローニングした(Yamisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J., Gene 33
: 103-109, 1985)（プラスミドpCG358）。次に、この断片をBamHIおよびSphIでp
CG358のポリリンカー領域から切除し、産生プラスミドpCG494の（テトラサイク
リン耐性遺伝子の部分を含む）０．７kb BglII/SphI断片の場所にクローニング
した。最終的な１４．７kbのプラスミドpCG532はcolE1適合性基、クロラムフェ
ニコール耐性遺伝子、udkおよびdcd遺伝子、およびT4バクテリオファージnrdCAB
（それぞれ、チオレドキシンおよびリボヌクレオチドレダクターゼの２個のサブ
ユニットをコードする）、およびT4 td（チミジレートシンターゼをコードする
）の遺伝子をバクテリオファージλのＰ_Ｌプロモーターの制御下で含む。pCG532
のT4 nrdA遺伝子は、（⁷⁹AlaからIleへの）位置指定突然変異誘発によって予め
変更した。

【００６９】合成転写ターミネーターは、td遺伝子の下流に配置され、複製領域への転写リ
ードスルーを防止する。プラスミドpCG532の遺伝子マップを、図３に示す。

【００７０】例９ CMG2451 (pCG494)およびCMG2451 (pCG532)によるチミジンの振盪フラスコ発酵 E. coliのudkおよびdcd遺伝子を含むプラスミドpCG532を、産生株CMG2451に導
入した。新株CMG2451 (pCG532)は、振盪フラスコ実験で親株CMG2451 (pCG494)と
共に試験し、チミジン産生を比較した。２つの独立した実験の結果を、表８に示
す。第一の実験は上記のように行い、試料を誘導後１７時間目に採取した。第二
の実験では、細胞をより高いＯＤ（約９）で誘導し、試料を誘導後３時間目に採
取して分析した。いずれの場合にも、クローニングしたudkおよびdcd遺伝子を含
む株は、親株より良好に機能した。

【００７１】

【表８】

【００７２】例１０ ung突然変異の付加および振盪フラスコ発酵におけるチミジン産生に対するその
効果ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ陰性株を、上記のようなP1形質導入を用いてun
g::Tn10 (Varshney, U., et al., J. Biol. Chem. 263: 7776-7784, 1988)突然
変異を宿主CMG2451に導入することによって構築し、CMG2492と命名した。プラス
ミドpCG366を、CMG2492に導入した。振盪フラスコでのチミジン合成についてのU
ng^-とUng⁺株との比較実験を、例６に記載のフラスコ法を用いて図４に示す。細
胞を２５０mlフラスコ中で３０℃で増殖させ、温度を３７℃に３０分間シフトし
た後、３５℃にシフトすることによってチミジン合成を誘導した。ウラシルＤＮ
Ａグリコシラーゼを持たないUng^-宿主は、より長時間増殖させ、３０％多いチミ
ジンを作成した。

【００７３】例１１ CMG2451 (pCG532)を用いる３０リットル発酵槽でのチミジン産生下記の条件を用いて、CMG2451/532株を用いて３０リットル発酵槽(B. Braun B
iotec Biostat C)でチミジンを産生させた。種培養物（５００ml）を、４リット
ルバッフル振盪フラスコ中で３０mg/lクロラムフェニコールおよび２５mg/lカナ
マイシンを含むＬＢ培地で３０℃で、ＯＤ６００nmが２．３７に達するまで最終
ｐＨ６．６９で増殖させた。

【００７４】表９に挙げた組成物を含む発酵槽（１２リットル）の初期バッチを、１２１℃
で５５分間殺菌した。冷却後、個別にオートクレーブ処理した溶液（５００ml）
を加えて、バッチを２０g/lソルビトールおよび３．０g/lＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ
に調節した。接種前に、初期バッチを３０mg/lクロラムフェニコール、２５mg/l
カナマイシン、１mg/lｄ−ビオチン、１０mg/lチアミン、および１０mg/lニコチ
ン酸に調節するように設計された滅菌濾過溶液（２００ml）も加えた。

【００７５】３種類の供給溶液を調製した：a) Cerelose 2001（デキストロース一水和物）
５６２g/l, ２mg/lビオチン，２０mg/lチアミン，２０mg/lニコチン酸，および
３０mg/lクロラムフェニコール；b) ソルビトール７１７g/l，４mg/lビオチン，
４０mg/lチアミン，４０mg/lニコチン酸，および６０mg/lクロラムフェニコール
；c) ３６０g/l Amberex 695 AG (Red Star Yeast & Products, ミルウォーキー
, ウィスコンシン)，６g/l PP90M (DMV International, フレーザー，ニューヨ
ーク)を含む粗製窒素混合物，１×微量元素，および０．１ml/l Mazu DF10PMOD1
1 (BASF)。供給溶液を、１８PSI水蒸気圧過で０〜５０分間滅菌した。

【００７６】

【表９】

【００７７】操作条件は、下記の通りであった：初期温度３１℃；RPM６００；気流３LPM；
ｐＨ６．８；圧力０バール。溶解酸素を、基流速制御ループを用いて２５％飽和
に制御した。RPMを８時間目に７５０RPMに増加し、９時間目に８５０RPM、培養
物のＯＤが３７．８に達する９．２時間目に３１から３５．５℃への温度シフト
の時点で９５０RPMに増加した。９７時間目の初めに、背圧を最大０．６バール
まで加えて、培養物への酸素移行を促進した。チミジン合成を誘導するための温
度シフトの速度は、０．２℃／分であった。

【００７８】細胞質量が６００nmで２０ＯＤ（５０mM Ｈ_２ＳＯ_４に溶解して塩を溶解した
後の読み）に達した後、細胞質量が５ＯＤ増加する毎にソルビトール供給溶液(b
)を８５mlずつ供給した。１６．７時間目に、ソルビトールのバッチ供給を停止
し、デキストロース一水和物（グルコース）(a)を、設定点が２５％のB. Braun
発酵槽のDO PID制御ループの制御下で供給開始した。簡単に説明すれば、溶解酸
素が２５％を下回るときには、糖供給を停止し、DOが２５％を上回るときには、
糖供給を行うに設定した。プロトコールはグルコース濃度を自己調節して濃度を
低く保つが、培養物を極めて長時間グルコース不足にすることはできない。粗製
窒素を、１１時間目、１６．２時間目、２１．２時間目、２８．２時間目、３３
．２時間目、および４０．５時間目に供給した（５００ml）。

【００７９】発酵中の細胞質量、チミジンおよびデオキシウリジン蓄積量を、図５に示す。

【００８０】例１２発酵ブロスからチミジンの精製 Dowex Optipore L-285 (The Dow Chemical Company)を脱イオン水に懸濁し、
４８mM直径のガラスカラムに充填し、ベッド容積を約５００mlとした。カラムを
５％ＮａＯＨ５００mlで洗浄した後、流出液がｐＨ７．０となるまで脱イオン水
で洗浄した。

【００８１】チミジン（ＴｄＲ）濃度が４．８９０g/lでありかつデオキシウリジン（Ｕｄ
Ｒ）濃度が１．０４０g/lの発酵ブロスをカラムに載荷した。カラムを、二ベッ
ド容積の脱イオン水で洗浄した。ＴｄＲおよびＵｄＲを、５％試薬アルコール（
エタノール９０．５％、メタノール４．５％、イソプロピルアルコール５％）の
二ベッド容積の後，１０％試薬アルコールの二ベッド容積、および１５％試薬ア
ルコールの二ベッド容積によって溶出した。２５ml画分におけるＴｄＲおよびＵ
ｄＲを、図６に示す。カラムを５％ＮａＯＨで洗浄した後、脱イオン水でｐＨ７
．０まで洗浄することによって再生し、この手続きを繰返した。画分９１〜１６
０を２つの別個の実験からのものを一緒にプールし、ロータリーエバポレーター
を用いて乾燥した。チミジンをできるだけ少量の熱水に再溶解し、４℃で結晶さ
せた。次いで、結晶生成物を２回再結晶し、５５℃オーブンで１５時間乾燥した
。総量が９７９．８mgの結晶性チミジンが得られ、純度は９９％を上回り、医薬
中間体として用いるのに適していた。

【００８２】デオキシウリジンおよびチミジンを含む側画分を母液と共にプールし、真空ロ
ータリーエバポレーターによって減少したアルコールと共に最終容積１２００ml
まで減少した。（ＴｄＲ側画分３５７１mgを含む）総回収率は、９３．１％であ
った。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 pCG366の構築の経路を模式的に表したものである（プラスミドは縮尺通りに描
かれていないことに留意すべきである）。

【図２】 pCG374およびpCG375の構築の経路を模式的に表したものである。

【図３】プラスミドpCG532のマップを示す。

【図４】例１０によるプラスミドpCG366 (nrdCAB td)を有する組換えE. coli株CMG2451
(Ung+)およびCMG2492 (Ung-)による増殖およびチミジン産生を示す。

【図５】 E. coli CMG2451 (pCG532)による３０リットル発酵槽でのチミジン産生を示す
。

【図６】例１２の精製プロトコールによって得られたTdRおよびUdR (mg/l)を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 19/38 Ｃ１２Ｒ 1:86 //(Ｃ１２Ｎ 1/16 1:19 Ｃ１２Ｒ 1:86）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 19/38 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者デイビッド、マーティン、アンダーソンアメリカ合衆国メリーランド州、ロックビル、チェリーデイル、ドライブ、13601 (72)発明者リン、リウーアメリカ合衆国メリーランド州、ガイザーズバーグ、カリプソ、プレイス、18716 (72)発明者セルゲイ、ポドコビロフアメリカ合衆国メリーランド州、ガイザーズバーグ、トリッポン、コート、11216 (72)発明者バオミン、ワングアメリカ合衆国メリーランド州、ガイザーズバーグ、カリプソ、プレイス、18716 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA08 BA10 BA11 CA04 CA06 DA06 DA07 DA09 DA12 EA02 EA03 EA04 FA02 FA07 GA11 HA12 4B064 AF33 CA02 CA06 CA19 CC24 CE15 4B065 AA15X AA26X AA41X AA46X AA79X AA98Y AB01 AC14 CA18 CA23 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子およびチオレドキシン遺伝子、またはウ
リジンキナーゼ遺伝子、および／またはｄＣＴＰデアミナーゼ遺伝子を含んでな
る、転写単位を含んでなる、ＤＮＡ構築物。
【請求項２】リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子およびチオレドキシン遺伝子を含んでな
る、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３】ウリジンキナーゼ遺伝子および／またはｄＣＴＰデアミナーゼ遺伝子を含んで
なる転写単位を含んでなる、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】ウリジンキナーゼ遺伝子およびｄＣＴＰデアミナーゼ遺伝子を含んでなる転写
単位を含んでなる、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】構築物が染色体外ベクターである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮ
Ａ構築物。
【請求項６】ベクターがプラスミド、ウイルス、トランスポゾン、ミニクロモソーム、また
はファージである、請求項５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】ベクターがプラスミドであって、リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子がnrdA
遺伝子および／またはnrdB遺伝子であり、チオレドキシン遺伝子がnrdC遺伝子で
あり、かつこれら上記遺伝子がオペロンに配置されている、請求項６に記載のＤ
ＮＡ構築物。
【請求項８】転写単位がnrdA遺伝子とnrdB遺伝子を含んでなる、請求項７に記載のＤＮＡ構
築物。
【請求項９】 nrdAおよびnrdB遺伝子がnrdC遺伝子の下流に配置されている、請求項８に記載
のＤＮＡ構築物。
【請求項１０】 nrdC遺伝子がnrdA遺伝子の上流にあり、かつnrdA遺伝子がnrdB遺伝子の上流に
ある、請求項８に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１１】調節要素をも含んでなる、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１２】調節要素が、プロモーター、オペレーター、終止配列、介し配列、およびリボ
ソーム結合部位からなる群から選択される、請求項１１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１３】プロモーターがλＰ_Ｌプロモーターまたはその誘導体である、請求項１２に記
載のＤＮＡ構築物。
【請求項１４】終止配列が合成ターミネーターである、請求項１２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１５】 nrdA遺伝子を修飾して、この単位によってコードされるリボヌクレオチドレダ
クターゼが未修飾nrdA遺伝子を含んでなる単位によってコードされたリボヌクレ
オチドレダクターゼよりアロステリック阻害に対する感受性が低い、請求項７に
記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１６】 nrdA遺伝子をｄＴＴＰ結合部位で修飾する、請求項１５に記載のＤＮＡ構築物
。
【請求項１７】 nrdA遺伝子を修飾して、nrdA発現生成物の７９位におけるAlaからIleへの変化
をコードするようにする、請求項１５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１８】 nrdA、nrdBおよびnrdC遺伝子がＴファージに由来する、請求項７に記載のＤＮ
Ａ構築物。
【請求項１９】ＴファージがＴ偶数ファージである、請求項１８に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２０】Ｔ偶数ファージがT4ファージである、請求項１９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２１】構築物が更にチミジレートシンターゼ遺伝子を含んでなる、請求項１〜４のい
ずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２２】チミジレートシンターゼ遺伝子がtd遺伝子である、請求項２１に記載のＤＮＡ
構築物。
【請求項２３】 td遺伝子がnrdA、nrdBおよびnrdC遺伝子と同じベクター上に配置されている、
請求項２２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２４】 td遺伝子がnrdA、nrdBおよびnrdC遺伝子と同じオペロン上に配置されている、
請求項２２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２５】 td遺伝子がnrdA、nrdBおよびnrdC遺伝子の（リーディングフレームに関して）
下流上に配置されている、請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２６】 td遺伝子がＴファージに由来する、請求項２２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２７】 td遺伝子がＴ偶数ファージに由来する、請求項２６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２８】 td遺伝子がT4ファージに由来する、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２９】ウリジンキナーゼ遺伝子および／またはｄＣＴＰデアミナーゼ遺伝子をも含ん
でなる、請求項２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３０】ＤＮＡ構築物がウリジンキナーゼ遺伝子およびｄＣＴＰデアミナーゼ遺伝子を
両方とも含んでなる、請求項２９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３１】ウリジンキナーゼ遺伝子がudk遺伝子である、請求項１、３または４のいずれ
か一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３２】ｄＣＴＰデアミナーゼ遺伝子がdcd遺伝子である、請求項１、３または４のい
ずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３３】請求項１〜３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含んでなる、修飾した
宿主細胞。
【請求項３４】宿主細胞のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ活性が抑制されているか、または該
活性を全く示さない、請求項３３に記載の修飾した宿主細胞。
【請求項３５】ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ活性をコードする１個以上の宿主細胞ＤＮＡ配
列を修飾して、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ活性が抑制された、低レベルであ
るか、または全く示さない発現生成物をコードするようにした、請求項３４に記
載の修飾した宿主細胞。
【請求項３６】宿主細胞ＤＮＡ配列がung遺伝子である、請求項３５に記載の修飾した宿主細
胞。
【請求項３７】ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ活性をコードする１個以上の宿主細胞ＤＮＡ配
列が除去されている、請求項３４に記載の修飾した宿主細胞。
【請求項３８】細胞が真核生物または原核生物である、請求項３３に記載の修飾した宿主細胞
。
【請求項３９】宿主細胞がE. coli, Salmonella, Pseudomonas, BacillusおよびSaccharomyce
sからなる群から選択される、請求項３８に記載の修飾した宿主細胞。
【請求項４０】ＤＮＡ構築物を含んでなる修飾した宿主細胞であって、該構築物が転写ＤＮＡ単位を含んでなり、該単位がリボヌクレオチドレダクタ
ーゼ遺伝子とチオレドキシン遺伝子を含んでなり、上記リボヌクレオチドレダク
ターゼがこのレダクターゼと同等な野生型よりアロステリック阻害に対する感受
性が低く、かつ下記の特徴の１つ以上を含んでなる、宿主細胞。 (a)上記ＤＮＡ構築物に配置された転写単位が、宿主細胞のチミジレートシン
ターゼ遺伝子とは異種のチミジレートシンターゼ遺伝子を含んでなり、 (b)上記ＤＮＡ構築物に配置された転写単位が、ウリジンキナーゼ遺伝子を含
んでなり、 (c)上記ＤＮＡ構築物に配置された転写単位が、ｄＣＴＰデアミナーゼ遺伝子
を含んでなり、 (d)ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ活性が抑制されているか、または該活性が
ない。
【請求項４１】リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子がｄＴＴＰ結合部位で修飾されている、
請求項４０に記載の修飾した宿主細胞。
【請求項４２】リボヌクレオチドレダクターゼがnrdA遺伝子であり、修飾がnrdA発現生成物の
７９位におけるAlaからIleへの変化である、請求項４１に記載の修飾した宿主細
胞。
【請求項４３】ＤＮＡ構築物がウリジンキナーゼ遺伝子とｄＣＴＰデアミナーゼ遺伝子を両方
とも含んでなる、請求項３８に記載の修飾した宿主細胞。
【請求項４４】細胞が(a)〜(d)の特徴を１つずつ含んでなる、請求項４０に記載の修飾した宿
主細胞。
【請求項４５】請求項３３〜４４のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含んでな
る、ピリミジンデオキシリボヌクレオシドを産生する方法。
【請求項４６】デオキシリボヌクレオシドがチミジンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】請求項３３〜４４のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含んでな
る、アジドチミジンの製造方法。
【請求項４８】請求項３３〜４４のいずれか一項に記載の宿主細胞を含んでなる、培地。