CZ301565B6 - Konstrukt DNA, hostitelská bunka a zpusob výroby pyrimidindeoxyribonukleosidu - Google Patents

Abstract

Konstrukt DNA obsahující transkripcní jednotku, která obsahuje gen ribonukleotidreduktázy T4 nrdA, gen ribonukleotidreduktázy T4 nrdB a gen thioredoxinu T4 nrdC, pricemž gen T4 nrdA má mutaci v sekvenci kódující vazebnou oblast pro dTTP na ribonukleotidreduktáze T4, která nenarušuje základní funkcnost enzymu, takže ribonukleotidreduktáza T4 má sníženou vazbu dTTP ve srovnání s enzymem standardního typu. Hostitelská bunka obsahující konstrukt DNA uvedený výše a zpusob produkce pyrimidindeoxyribonukleosidu, zejména thymidinu, kultivací této bunky.

Description

Konstrukt DNA, hostitelská buňka a způsob výroby pyrimidindeoxyribonukleosidů

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká výroby pyrimidinů, purinú ajejich derivátů, například deoxyribonukleosidů, s použitím geneticky modifikovaných buněk obsahujících nové konstrukty DNA.

Dosavadní stav techniky

Thymidin je použitelný jako farmaceutický meziprodukt, zvláště pro chemickou syntézu azidothymidinu („AZT“, dodávaný pod obchodní známkou ZIDOVUDINE). Ačkoli AZT typu ZIDOVUDINE byl jedním z prvních způsobů léčení vyvinutých pro HIV/AIDS, má trvale dúie15 žité použití, které má stále větší rozsah (Langreth, R., The Wall Street Journal, 21. listopad 1995, str. B12). AZT typu ZIDOVUDINE je cenný zvláště při použití v kombinačních terapiích, jako je kombinace s lamivudinem (známý také jako 3TC), známá pod obchodní známkou EP1VIR. Tato kombinace lamivudinu a 3TC se provádí pod obchodní známkou COMBIVIR. 1 když může virus HIV mutovat na formu rezistentní buď k AZT, nebo 3TC, kombinace nukleotidových analogů typu COMBAVIR je zvláště účinná, protože reverzní transkriptázy zřejmě nemůže být odolná k oběma nukleosidovým analogům současně (Larder, B. A. a další, Science 269: 696 - 699, 1995). AZT typu ZIDOVUDINE je také použitelný s léčivy typu inhibitorů HIV proteázy (Waldholz, M., The Wall Street Journal, 30. ledna 1996, str. Bl), a pri léčení těhotných žen infikovaných HIV pro snížení frekvence infekce plodu při narození. V roce 1997 zemřelo přibližně

600 000 dětí na AIDS, kterým se nakazily od svých matek pri narození. AZT typu

ZIDOVUDINE, jestliže se bere několik měsíců před narozením, může snížit přenos viru na děti o dvě třetiny. Velmi podstatné náklady při výrobě AZT tvoří thymidin vyráběný chemickou syntézou.

V patentu US 5 213 972 (McCandliss & Anderson, dále „patent '972“), se popisuje způsob výroby pyrimidinového deoxyribonukleosídu (PdN) (viz zvláště příklady 7 až 14 patentu '972). Popisuje se mikroorganismus schopný replikace, který obsahuje a exprimuje sekvenci DNA kódující pyrimidindeoxyribonukleosid-fosfohydrolázu, která převádí PdN monofosfát na pyrimidinový deoxyribonukleosid. McCandliss & Anderson, výše, popisují zvláště fermentační metodu, která může být použita pro výrobu thymidinu, a která zahrnuje expresi deoxythymidylátfosfohydrolázy (dTMPáza) bakteriofágem PBS1 Bacillus. Tento typ enzymu byl podle výzkumů v přírodě exprimován bakteriofágy, které ve své DNA neobsahují thymidin, ale namísto něj inkorporují sloučeniny jako deoxyurídin nebo hydroxymethyldeoxyurídín.

Při fermentaci thymidinu popsané v patentu '972, byty mutací odstraněny enzymy degradující thymidin (thymidinfosforyiáza a uridinfosforyláza), takže dochází ke hromadění thymidinu. Použití enzymu dTMPázy napomáhá k vytvoření biochemické cesty umožňující syntézu thymidinu. Samotná exprese dTMPázy však nemusí zajistit produkci thymidinu schůdnou v komerčním měřítku.

Proto existuje trvalá potřeba zvýšení produkce thymidinu buňkami exprimujícími dTMPázu pro zajištění fermentační produkce thymidinu v komerčně proveditelném měřítku, snížením výrobních nákladů proti současně používaným metodám chemické syntézy.

Biochemická cesta produkce pyrimidinových deoxynukleotidů, například v E. coli, je ve velké míře regulována na úrovních transkripce a translace stejně jako na proteinové úrovni mechanismy zahrnujícími oslabení (atenuaci), zpětnovazebnou inhibicí a aktivaci enzymu (Neuhard, J. a R. A. Kelln, Biosynthesis and Conversion of Pyrimidines, kapitola 35 [v] Neidhardt, F. C. a další [ec] „Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology“, druhé vydání, díl I, str. 580-599, ASM Press, Washington D.C., 1996). Exprese dTMPázy a odstranění rozkladu

-1CZ 301565 B6 thymidinu použitém mutací v genech deo\ (thymidinfosforyláza), udp (uridinfosfatáza) a tdk (thymidinkináza) a dosažená exprese produktů vedou k syntéze thymidinu v E. coli, ale nikoliv v komerčně přístupném měřítku.

Podstata vynálezu

Biosyntéza purinů a pyrimidinů zahrnuje společný krok redukce ribonukleosiddifosfátu (u některých druhů trifosfátu) na odpovídající deoxyanalog. V syntéze jako celku vyžaduje redukce ribó10 zové části na 2-deoxyribózu pár atomů vodíku, které jsou nakonec poskytnuty NADPH a lT. Bezprostředním dárcem elektronů však není NADPH, ale redukovaná forma teplotně stabilního proteinu nazývaného thioredoxin nebo glutaredoxin a alespoň jeden další neidentifikovaný zdroj, protože ribonukleotidreduktázový systém E. coli stále ještě pracuje v dvojitých mutantech trxÁ (thioredoxin) grx (glutaredoxin) (Neuhard a Kelln, výše). Redukční ekvivalenty redukovaného thioredoxinu jsou převedeny na ribonukleosiddifosfátreduktázu, která provádí vlastní redukční proces. Manipulace například s tímto krokem by mohla být užitečná při zlepšování komerčního způsobu výroby purinových a pyrimidinových deoxynukleosidů.

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí nových konstruktů DNA, například vektorů a geneticky modifikovaných mikroorganismů, které obsahují uvedené vektory, zvláště pro použití při produkci izolovatelných množství, zvláště komerčně použitelných množství, pyrimidinových a purinových deoxynukleosidů.

Předmětem předkládaného vynálezu je také poskytnutí způsobů, které představují zlepšení vzhle25 dem k procesům McCandlisse a Andersona, popisovaným výše.

Podle jednoho provedení předkládaného vynálezu se poskytuje konstrukt DNA obsahující transkripční jednotku, která obsahuje gen pro ribonukleotidreduktázu a thioredoxinový gen.

Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje modifikovaná hostitelská buňka obsahující konstrukt DNA podle vynálezu.

Podle ještě dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje kultivační médium obsahující modifikované hostitelské buňky podle vynálezu a způsoby výroby purinu nebo pyrimidinu, napří35 klad thymidinu, které zahrnují použití těchto modifikovaných hostitelských buněk.

V jednom provedení obsahují hostitelské buňky konstrukt DNA, kde tento konstrukt obsahuje transkripční jednotku DNA (např. operon), kde tato jednotka obsahuje sekvence DNA kódující ribonukleotidreduktázu a thioredoxin, ve které tato reduktáza vykazuje menší citlivost k aloste40 rické inhibici než ekvivalent nebo protějšek hostitelské buňky standardního typu.

Poskytují se také geneticky modifikované hostitelské buňky, které obsahují a exprimují konstrukt, a kultivační médium obsahující modifikované hostitelské buňky.

Příslušná provedení předkládaného vynálezu poprvé popisují řadu výhod ve srovnání s poznatky uvedenými v US 5 213 972, pro poskytnutí zlepšených konstruktů DNA a hostitelských buněk obsahujících konstrukty pro použití při komerční výrobě pyrimidinových deoxyribonukleosídů, zvláště thymidinu.

so Výhodná provedení vynálezu

Konstrukt podle předkládaného vynálezu může být chromosomální nebo výhodněji extrachromosomální, například umístěný na vektoru.

-2CZ 301565 B6

Mezi vektory podle předkládaného vynálezu patří plasmid, virus, transposony, minichromosom nebo fág, s výhodou plasmid. Vektor obsahující transkripční jednotku může být zaveden do hostitelské buňky jakoukoli vhodnou metodou známou odborníkům v oboru, například Pl transdukcí, elektroporaci nebo transformací. Mezi vhodné hostitelské buňky použitelné v rámci předklá5 daného vynálezu patří eukaryoty a prokaiyoty (např. bakterie). Mezi prokaryoty patří kmeny E. coli, Salmonella, Pseudomonas, Bacillus, a jejich mutanty. E. coli je výhodná pro velké množství dostupných informací, genetických nástrojů a mutantních alel. Zvláště výhodné je, že pro zvolenou hostitelskou buňku je dostupný způsob transdukce, aby byl umožněn snadný přenos mutací z jedné hostitelské buňky do další, a aby byla umožněna genetická mutace hostitele bez potřeby io přímé mutace v případech, kdy se požaduje nová mutace.

Autoři předkládaného vynálezu zjistili, že použití genů bakteriofága T4 nrdA, nrdB a nrdC je zvláště vhodné pro kódování reduktázy a thioredoxinu v E. coli, viz Sjoberg, Β. M. a další, EMBO J., 5: 2031 - 2036 (1986); Tseng, M.-J., a další, J. Biol. Chem. 263: 16242- 16251 (1988); a LeMaster, D. M., J. Virol. 59: 759 - 760 (1986). Velmi významného zlepšení produkce thymidinu v E. coli bylo konkrétněji dosaženo klonováním a expresí genů nrdA a nrdB bakteriofága T4 kódujících ribonukleotidreduktázu společně s nrdC T4 kódující thioredoxin, protože ribonukleotidreduktáza bakteriofága T4 nemůže využívat thioredoxin E. coli. Bylo zjištěno, že ribonukleotid-reduktáza T4 je relativně necitlivá na řízení alosterickou inhibici in vitro ve srov20 nání s tímto enzymem E. coli (Berglund, O., J. Biol. Chem. 247: 7276 - 7281, 1972). Například na rozdíl od enzymu E. coli (Berglund, O., J. Biol. Chem. 247: 270- 7275, 1972) není ribonukleotidreduktáza T4 inhibována dATP, ale ve skutečnosti je účinkem dATP a ATP stimulována (Berglund, O., J. Biol. Chem. 247: 7276 - 7281, 1972).

Sekvence DNA kódující ribonukleotidreduktázu (napr. geny nrdA a nrdB) a thioredoxin (např. gen nrdC) jsou s odvozené od fága T4 Tseng a další, výše, viz Campbell, A. M., Bacteriophages, kapitola 123, vNeidherdt, výše; a Mathews, C. K. a další (ed.) Bacteriophage T4, American Society of Microbiology, Washington, D.C., 1983. Termín „odvozený od“ je zamýšlený z hlediska definice nejen zdroje ve smyslu jeho fyzického počátku, ale také z hlediska definice materiálu, který má strukturní a/nebo funkční vlastnosti odpovídající materiálu pocházejícímu z referenčního zdroje.

Další použitelná vlastnost T4 fágových enzymů je substrátová specifická. Normální ribonukleotídreduktáza E. coli využívá UDP jako substrát pouze velmi omezeně, protože konstanta K_m pro

UDP je přibližně desetinásobně vyšší pro UDP než CDP (Neuhard a Kelln, výše).

Enzym T4 má však pouze dvojnásobný rozdíl v hodnotě K_m (Berglund, O., J. Biol. Chem. 247: 7276 - 7281,1972) mezi substráty CDP a UDP, což umožňuje dvě cesty k syntéze dUTP. I když byly prováděny pokusy pro dosažení funkční exprese ribonukleotidreduktázy T4 v E. coli, dosa40 vadní úsilí mělo úspěch pouze při expresi oddělených složek a mohlo prokázat aktivitu pouze míšením in vitro (Tseng, M.-J., P. He, J. M. Hilfinger, a G. Greenberg, J. Bacteriol. 172: 6323 6332, 1990). Ačkoli si autoři nepřejí být vázáni teorií, předpokládají, že patrně v důsledku nepřítomnosti obvyklého systému zpětnovazební inhibice je exprese ribonukleotidreduktázy T4 v E. coli letální, a exprese musí probíhat pouze opatrně za určitých podmínek.

Vektory podle předkládaného vynálezu s výhodou obsahují regulační prvek (například promotor jako je lambda P_L, operátor, aktivátor, represor, jako je represor lambda, zvláště varianta citlivá na teplotu, a/nebo zesilující sekvence), vhodné terminační sekvence, iniciační sekvence a vazebná místa ribosomů. Vektor může dále obsahovat markér umožňující selekci. Regulační prvky (zvláště represor lambda) mohou být alternativně umístěny na chromosomu hostitelské buňky. Výhodné je, jestliže geny nrdA a nrdB jsou uspořádány ve vektoru ve směru translace (vzhledem ke Čtecímu rámci) od genu nrdC. Je zvláště výhodné, jestliže nrdB je uspořádán ve směru translace vzhledem k nrdA. Nejvýhodnější uspořádání tedy představuje vektor, jehož součástí je operou obsahující nrdCAB.

-3CZ 301565 B6

Ribonukleotidreduktáza T4 nepodléhá in vivo zpětnovazebnímu řízení (J. Ji, R. G. Sargent, a C. K. Mathews, J. Biol. Chem. 266: 16289 - 16292, 1991; a Berglund výše) pro další podporu redukce ribonukleosiddifosfátu, například pro produkci thymidinu, je gen kódující regulační podjednotku nrd A modifikován, například použitím mutace, za vytvoření enzymu schopného zvýšit produkci thymidinu působením například snížené citlivosti na alosterickou inhibici, například inhibici meziproduktem enzymu, nebo inhibici produktem, který vzniká při dalším biochemickém zpracování.

Pro konstrukci mutantů T4 nrd A může být použita místně specifická mutageneze pro modifikaci io nebo změnu (například substituci) bází genu kódujících aminokyseliny, o kteiých se předpokládá, že mění například vazebné místo dTTP, které se účastní alosterické regulace. Analýza aminokyselinové sekvence ribonukleotidreduktázy T4 odhalila segment, u kterého se zdá, že dobře vyhovuje postulované konvenční sekvenci, o které se předpokládá, že se účastní vazby dTTP (E.

M. Mclntosh a R. H. Haynes, Mol, Cell. Biol. 6: 1711 - 1721, 1986). Mutace může být v této oblasti ribonukleotidreduktázy T4 provedena použitím mutageneze zaměřené na určité oligonukleotidy. Obecný přístup může být modelován podle snahy autorů More a další (More, J, T., J, M. Cíesla, L-M. Changchien, G. F. Maley a F. Maley, Biochemistry 33: 2104 - 2112,1994) pro snížení vazby deoxycytidylátdeaminázy na dTTP, ačkoli v oboru jsou známé i jiné metody, viz příklady v odkazech. Zdá se, že velmi užitečná je mutace ⁷⁹Ala na Ile, v T4 nrdA. Například pro20 duktivita thymidinu u kmenů obsahujících mutant ⁷⁹Ala na Ile v T4 nrdA byla při fermentaČních testech na třepačkách podstatně zvýšena. Jak je ukázáno dále, autoři předkládaného vynálezu dosáhli alespoň 25% zvýšení proti rodičovskému kmenu bez této jediné změny.

Ačkoli ⁷⁹Ala na Ile je úspěšný příklad, odborníci v oboru nyní zjistí, že je možno získat požado25 váný efekt s mnoha dalšími změnami aminokyselin v této oblasti, kde tento efekt spočívá v domnělém přerušení vazby dTTP, ale nikoli zamezení základní funkci enzymu. Může být použita například substituce ⁷⁹Ala jinými aminokyselinami, které mají podobné postranní řetězce jako Ile(Ieucin, valin).

V dalším provedení předkládaného vynálezu se poskytuje hostitelská buňka obsahující konstrukt, kde tento konstrukt (například vektor) obsahuje transkripční jednotku obsahující sekvence DNA kódující heterologní ribonukleotidreduktázu a thioredoxin, kde tato reduktáza má menší citlivost na alosterickou inhibici než ekvivalent nebo protějšek hostitelské buňky standardního typu.

Odborníkům v oboru bude zřejmé, že určení relativní citlivostí sledované heterologní reduktázy na alosterickou inhibici ve srovnání s ekvivalentem hostitelské buňky standardního typu, je předmětem rutinního experimentování a pozorování.

Transkripční jednotky obsahující sekvence DNA, např. geny nrdA, nrdB a nrdC, jsou s výhodou operony, ve kterých jsou geny nrd uspořádány v tandemu. To umožňuje transkripci těchto genů ve formě transkriptu jediné mRNA. Aby se minimalizovaly neproduktivní výdaje energie hostitelskou buňkou a dále pro minimalizaci velikosti plasmidů, je výhodné, aby operon obsahoval pouze genetické sekvence vyžadované pro kódování reduktázy a thioredoxinu (včetně kterýchkoli regulačních nebo kontrolních prvků). To může vyžadovat odstranění nadbytečné DNA (například neobvyklého intronu v genu wrt/B, fága T4, viz Sjóberg, B-M., a další, EMBO J. 5: 2031 -2036, 1986).

Ve výhodných provedeních předkládaného vynálezu jsou do hostitelské buňky zahrnuty všechny popsané výhodné vlastnosti. Ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu se tedy poskytuje modifikovaná hostitelská buňka, ve které buňka obsahuje konstrukt DNA (např. vektor) obsahující transkripční jednotku DNA (např. operon), kde tato jednotka obsahuje sekvence DNA kódující modifikovanou T4 ribonukleotidreduktázu a thioredoxin, ve kterých má uvedená reduktáza nižší citlivost na alosterickou inhibici než ekvivalent nebo protějšek hostitelské buňky standardního typu.

-4CZ 301565 B6

Hostitelské buňky modifikované podle předkládaného vynálezu jsou použitelné zvláště při komerční výrobě pyrimidinových deoxynukleosidů. Ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu mohou být použity hostitelské buňky E. coli obsahující (nesoucí) plasmid modifikovaný podle předkládaného vynálezu (zvláště ve spojení s poznatky patentu '972) pro komerční výrobu thymidinu. Hostitelské buňky modifikované podle předkládaného vynálezu mohou tedy dále obsahovat dTMPázu odvozenou od napr. PBS1 a mutace popisované v patentu '972, například deoÁ, tdk-1 a udp-1.

Obecně se používá způsob fermentace, který zahrnuje submerzní kultivaci buněk v médiu ve io vhodné nádobě. Po kultivaci za vhodných podmínek se vyrobený thymidin izoluje (sklidí) a čistí (obohatí), pokud je to nutné, s použitím standardních protokolů za vytvoření preparátu s farmaceutickou čistotou. Čištěný thymidin může být potom použit při výrobě léků, např. farmaceutických prostředků, jakoje AZT.

Přehled obrázků na výkresech

Předkládaný vynález je ilustrován na příkladech a s odkazy na následující obrázky, ve kterých: Obr. 1 schematicky znázorňuje způsob konstrukce plasmidu pCG366. Je třeba zdůraznit, že plasmidy nejsou znázorněny v měřítku.

Obr. 2 schematicky znázorňuje způsob konstrukce plasmidů pCG374 a pCG375.

Obr. 3 znázorňuje mapu plasmidu pCG352.

Obr. 4 znázorňuje průběh růstu a produkce thymidinu rekombinantním kmenem E. coli CMG2451 (Ung⁺) a CMG2492 (Ung~) nesoucím plasmid pCG366 (wďCAB td) podle příkladu 10.

Obr. 5 znázorňuje produkci thymidinu v tricetilitrovém fermentoru bakterií £ coli CMG2451 (pCG532).

Obr. 6 znázorňuje koncentrace TdR a UdR (mg/1) získané s použitím protokolu čištění podle příkladu 12.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Klonování genů nrt/CAB T4 a demonstrace jejich aktivity

Geny wďAB bakteriofága T4 byly klonovány použitím polymerázové řetězové reakce (PCR) s izolovanou DNA fága T4. Jako primery pro PCR genu nre/A byly použity:

5’-TAT TCT AGA CGA TTT TCA AGT TGA GGA CTT ATG C-3’ (SEQ ID No. 1); a

5’-TAT ATC GAT AAT TCA TTA CAA TTT ACA CGC TGC AC-3’ (SEQ ID No. 2).

Restrikční místo Xbal bylo zavedeno na začátku genu nrdA v amplifikované DNA, a místo ště45 pění Cldl bylo zavedeno na 3' konci nrdA. Primery pro amplifikaci PCR genu nrd& byly následující:

-5CZ 301565 B6

5’-TAT ATC GAT AAA TGT AAA TTT AAG GAT TCT AAA TG-3’ (SEQ ID No. 3) a

5’-TAT GTC GAC TCC TTA AAA GTA TTT TTT AAA ACT C-3’ (SEQ ID No. 4).

Restrikční místo Cla\ bylo tedy zavedeno na začátku nrdB, a místo Apal bylo zavedeno na konci 5 nrdQ v amplifikované DNA. Fragmenty PCR byly klonovány do plasmidových vektorů, jak je znázorněno v obr. 1 způsoby známými odborníkům v oboru. Struktura klonovaných genů wc/AB byla potvrzena testem enzymatické aktivity. Gen nrdC T4 byl klonován do plasmidu pKC30 za vytvoření plasmidu pDL51 (LeMaster, D. M., J. Viroly 59: 759- 760, 1986) a byl dodán

D. LeMasterem (Dept. of Biochem., Univ. Wisconsin, Madison, WI). Gen byl subklonován do 10 plasmidu obsahujícího geny nrc/AB, jak je znázorněno na obr. 1. Zdroje výchozích materiálů a další základní informace používané v obr. 1 jsou uvedeny v tabulce 1.

Pro konstrukci pCG198 a pCG301 byl použit syntetický terminátor transkripce (viz obr. 1 a tabulka 1). Konkrétně, plasmid pBC sk⁺ získaný od firmy Stratagene (La Jolla, Califomia) byl is štěpen restrikčním enzymem Apa\ a Asp! 181. Potom byla syntetická DNA obsahující sekvenci ukončení transkripce ECOTGP (ďAubenton Carafa a další, J. Mol. Biol. 216: 839-843, 1990) vložena jako náhrada původní sekvence mezi Štěpící místa restrikčních endonukleáz Apal a

Aspll 81. Tento fragment znovu vytvořil rozpoznávací místo ΛραΙ, ale došlo ke zničení rozpoznávací sekvence Aspl 181 v novém plasmidu. Vložená DNA měla následující složení:

5’-CGAGC CCGCCTAATG AGCGGGCTTT TTT TT-3’

3’-CCGGGCTCG GGCGGATTAC TCGCCCGAAA AAAAACATG-5’ (ukázáno jako řetězce v SEQ ID No. 5, popřípadě 6) vytvořené ze dvou oligonukleotidů.

-6CZ 301565 B6

Tabulka 1

Genealogie plasmidů pCG366 a pCG532 a zdroje materiálů

Plasmid	Gen (geny)	Promotor	Počátek vektoru	Markér	Odvození
PACYC177	amp kan		p15A	amp kan	Chang a Cohen (1978) J, Bacteriol 134: 1141-1156. ATCC 37031
pBCpBCsk*	Cam	P/ac	Co/E1	Cam	Stratagene, 11011 Noríh Torrey Ptnes Road, La Jolla, CA 92037
pBluescript II ks	Amp	P/ac	co/£1	Amp	Stratagene, 11011 North Torrey Ptnes Road, La Jolla, CA 92037. ATCC 87047
pBR322	amp tet		co/£1	amp tet	Bolivar a další, (1977) Gene 2: 95-113
pDL51	T4 nrdC		co/E1	Amp	LeMaster, J. Virol. 59: 759 - 760,1986
pKC30	Amp	IPl	CO/É1	Amp	Shimatake a Rosenberg (1981), Nátuře 292: 128. ATCC 37286
PKTdAl	T4 W		co/E1	Amp	West a další (1986), J.B.C. 261: 13446- 13450
PT7/T3/18	Amp	fág T7/T3	C0/E1	Amp	Life Technologies, INC., 9800 Medical Center Dr., Rockville, MD 20897
pTZ18U	Amp		C0/E1	Amp	Bio-Rad, 2000 Alfred Nobel Dr., Hercules, CA 94547
pUC18	Amp	P/ac	CO/H1	Amp	Yanisch-Perron a další (1985), Gene 33: 103 - 119 ATCC 37253
pUC19	Amp	P/ac	co/E1	Amp	Yanisch-Perron a další (1985), Gene 33: 103- 119 ATCC 37254
pCG173	XPL vektor	XPL	co/E1	Amp	λΡ(. v pBluescript tl ks

-7CZ 301565 B6

Tabulka 1 - pokračování

pCGl96	T4 nrdC		co/E1	Amp	T4 nrc/C v p(JC19
pCG198	Cam	Pfac	co/51	Cam	Syntetický terminátor transkripce v pBC sk+
pCG301	λΡι vektor	λΡι	colEI	Cam	LPl v pCG198
pCG308	T4 nrdC	XPL	colE1	Cam	T4 nrdCvpCG301, LeMaster, J. Virol. 59: 759 - 760,1986
pCG312	T4 nrdA	PT7	colEI	Amp	T4 nrdA v pT7/T3/18
pCG318	NrdB	PT7	co/£1		T4 nrdB v pBluscript 11 ks
pCG323	NrdAC	XPl	co/E1	Cam	T4 nrdAC v pCG3Q1
pCG326	NrdABC	XPl	co/51	Cam	T4 nrtíABC v pCG301
pCG332	Nrd AB	XPl	cp/E1	Cam	T4 nrdAB v pCG301
pCG334	NrdAB	XPl	C0/E1	Cam	T4 nrdAB v pCG301
pCG337	NrdCAB	XPl	co/H1	Cam	T4 nrdCAB v pCG301
pCG343	NrdCAB	XPL	co/£1	Cam	T4 nrdCAB v pCG301
PCG356	Td	λΡι.	co/E1	Cam	T4 td v PCG301
pCG358	dcd, udk		co/ei (pUC18)	Amp	E.coli dcd. udfcvpUC18
pCG360	NrdCAB, td	λΡι	co/E1	Cam	T4 nrdCAB v pCG301
pCG366	NrdCAB, td	XPl	co/E1 (pBR322)	Cam Tet	T4 nrdCAB, td v pBR322, Amps
pCG374	dcd, udk		P15A	amp	E.coli dcd, udk v pACYC!77
PCG376	vektor	XPl	p15A	amp	PACYC177 s XPL & MCS PCG301
PCG464	T4 nrd A Xóat/Hin dlll fragment		(pTZ18U) co/E1	Amp	Xůal/H/ndlII fragment se sekvencí nrdA klonovanou do míst XbaVHindM plasmtdu pTZ18U (BíoRad Laboratories)

-8CZ 301565 B6

Tabulka 1 - pokračování

pCG492	T4 nrdA Xbal HindM fragment		{pTZ18 U co/E1)	Amp	PCG464 s mutací v sekvenci T4 nrdA způsobujíc! změnu 79Ala->//e
pCG494	WrcfCAB td	λΡί	co/£1 (pBR322)	Cam Tef	Kpn\/Afi\\ fragment z pCG494 vložený do pCG366 s přidáním mutace 79Ala->lle do nrdA
PCG532	NrdCAB, td udk, Dcd	λΡι	CO/H1 (pBR322)	Cam	udk, dcd klonovaná do pCG494

Plasmid pCG198 byl kombinován s pCG173 obsahujícím promotor lambda P_L z plasmidu pKC30 klonovaného do pBluescript II ks (Stratagene, La Jolla, Califomia), jak je ukázáno na obr, 1. Jak plasmid pCB198, tak i pCG173 byly štěpeny HindlW a Λ$ηΙ, potom spojeny za vytvoření nového plasmidu pCG301 obsahujícího promotor lambda P_L, větší počet restrikčních klonovacích míst a dále terminační sekvenci ECOTGP zkopírovanou z původní peptidové oblasti tryptofanového operonu.

T4 ribonukleotidreduktázová aktivita byla měřena HPLC metodou, při které se nepoužívají radioisotopy ani substrát UDP. Test pro přímé stanovení ribonukleotidreduktázy obsahoval 1 mM NADPH, 1 mM DTT, 0,5 mM dATP, 0,6 mM UDP, 20 mM Tris (pH 8,0) a 5 mM MgCl₂. Za těchto podmínek je ribonukleotidreduktáza E. coli inhibována a není detekována. Enzymatická reakce (100 μΐ) byla zastavena přidáním 10 μΐ 50% kyseliny trichloroctové (TCA). Po 10 min na ledu se vzorky centrifugují v mikrocentrifuze. Supematant byl extrahován čtyřikrát diethyletherem pro odstranění TCA. Bylo přidáno 5 ml pufru Tris (1,0 M pH 8,0) a potom 2 μΙ jedu chřestýše (40 mg/ml, Sigma), a vzorek byl inkubován při 37 °C 60 min. Vzorky byly potom zahřívány 3 min při 70 °C a potom centrifugovány 5 min pro odstranění sraženiny. Provede se standardiza20 ce objemů a potom analýza HPLC s UV detektorem a deoxyuridinem jako standardem. Jako kolona se použije Spherisorb ODS-2, 5 pm, 250 mm x 4,6 mm s použitím 12 mM fosforečnanu amonného (pH 5,0) jako mobilní fáze a průtokem přibližně 1,0 ml/min. Výsledky jsou ukázány v tabulce 2 pro buňky obsahující plasmid pCG343, přičemž je jasně ukázána funkční exprese T4 ribonukleotidreduktázy.

Tabulka 2

Aktivita ribonukleotidreduktázy

Kmen	Podmínky indukce	Specifická aktivita nmol/10 min/mg proteinu
CMG1093	neindukováno	0
CMG1093	indukováno	0
CMG1093/pCG343	neindukováno	0
CMG1093/pCG343	indukováno	704,7

9CZ 301565 B6

Příklad 2

Vytvoření derivátu hostitelského kmenu CMG2451 z kmenu CMG1115

Kmen CMG1115 se úplně popisuje v McCandliss & Anderson (patent US 5 213 972). Kmen CMG1115 byl vylepšen pro produkci thymidinu selekcí na růst v médiu obsahujícím 30 mg/1 5fluorouridinu, za vzniku kmene CMG2401. Potom byla provedena selekce kmenu CMG2401 na růst na médiu s obsahem 30 mg/1 3 -azido-3'-deoxythymidinu za vzniku kmene CMG2402. CMG2404 vyžaduje pro růst L-prolin v důsledku zděděné mutace Á(lac-pro) z původního rodii o čovského kmene JM 101. Bylo provedeno párování Hfr mezi CMG2404 a Hfr kmenem CAG5053 (Singer, M. a další, Microbiological Review: 5: 1 - 24, 1989) způsobem známým odborníkům v oboru za získání kmene CMG2434 s fenotypem Lac⁺, Pro*. Mutace udp (uridinfosforyláza) vCMG2434 stále ještě měla částečnou uridinfosforylázovou aktivitu, která byla zřejmá z pozorovaného hromadění thyminu po indukci produkce thymidinu. Mutace udp byla znovu zavedena z CGSC5128 (E. coli Genetic Stock Center, Yale University) transdukcí fágem Pl způsobem známým odborníkům v oboru. /weřE3O79::TnJ0 z kmene CAG 18491 byl nejprve transdukován do CMG2434, kde sloužil jako pozitivní selekční markér pro transdukcí udp. Potom byl udp~\ transdukován do jnefE3O79::TnJ0 derivátu CMG2434 selekcí na růst bez L-methioninu v definovaném médiu. Derivát udp-1 byl pojmenován jako kmen CMG2451. Genealogie

CMG2451 je shrnuta v tabulce 3.

Tabulka 3

Genealogie hostitelského kmene E. coli CMG2451

Kmen	Genotyp	Derivát1
CMG1115	CMG1106 (Tn5::dTMPáza kanR)	Vložená Tn5::dTMPáza z pCG132
CMG2401	CMG1115 FUdRR	Resistence na 5-fluor-2'deoxyuridin
CMG2404	CMG2401 AZTr	Resistence na 3'-azído-3'deoxythymídin
CMG2434	CMG2404 Lac+ Pro*	Oprava Á(/ac~proAB) konjugací s CAG5053Ď
CMG2448	CMG2434 meíE3O79::Tnf0	znefE3079::Tn 10 z CAG18491Í
CMG2451	CMG2448 udp-1 mefE+tets	udp-1 z CGSC5128c a náhrada meíE3O79;:Tnf0

^a Mutace byly vždy zaváděny do kmenů E. coli transdukcí fágem Pl. Jestliže mutace měla selektivní markér, bylo použito přímé transdukce PI. Jestliže mutace selektivní markér neměla, bylo použito kontransdukce Pl s vložením blízkého Tn/0. ^b Singer, M., a další Microbiological Review: 53: 1 - 24, 1989.

Všechny kmeny CGSC byly získány z E. coli Genetic Stock Center, Yale University, P.O.Box 208104, New Heaven, CT 06520-8104.

-10CZ 301565 B6

Příklad 3

Klonování a exprese genu T4 td do plasmidů produkujícího thymidin

Gen T4 td byl klonován do pKTdAI Western a dalšími (J. Biol. Chem. 261: 13446 - 13450, 1986), bez intronuo délce 1017 párů bází. Gen td byl subklonován do pCG301 použitím dvou oligonukleotidů jako propojujících sekvencí (linkerů) s následujícími sekvencemi:

5'-GAT CCG GAG GAT AAA TGA AAC AAT ACC AAG ATT TAA T-3’ (SEQ ID No. 7) a;

5'-TAA ATC TTG GTA TTG TTT CAT TTA TCC TCC G-3’ (SEQ ID No. 8).

Výsledkem byl plasmid pCG356. Gen td z pCG356 byl potom subklonován do pCG343 za vytvoření pCG360 (obr. 1). Do plasmidů pCG360 byl subklonován gen resistence na tetracyklin a počátek replikace plasmidů z pBR322 (Bolivar, F. a další, Gene 2: 95 - 113, 1977) za vytvoření pCG366. Aktivita thymidylátsyntázy byla měřena spektrofotometrickou metodou Wahba a

Friedkin (J. Biol. Chem. 236: PCI 1 - PC 12, 1961). Výsledky jsou ukázány v tabulce 4.

Tabulka 4

Aktivita thymidylátsyntázy

Kmen	Specifická aktivita
	AOD340/mg proteinu/min
CMG1093	-0,72
CMGlO93/pKTdDI	3,24
CMG1093/pCG356	3,45
CMG1093/pCG360	1,43

Příklad 4

Údaje z fermentace na třepačce ukazující vliv genu T4 tdna. produkci thymidinu a snížení množství deoxyuridinu

Pro vyhodnocování produktivity thymidinu v různých rekombinantech E. coli byla používána fermentace na třepačkách. Půda pro fermentaci na třepačkách a používané metody v tomto a dalších příkladech se popisují v následujícím příkladu 6. V tomto případě bylo 20 ml půdy na baňku zaočkováno 2 ml očkovací kultury a byla provedena inkubace na třepačce při 30 °C. Pri dosažení

OD při 600 nm přibližně 10 byly baňky převedeny do třepačky při 37 °C na 30 min pro mírnou indukci promotoru XP_L. Potom byly baňky převedeny do třepačky s teplotou 35 °C, kde fermentace pokračovala. V průběhu fermentace byla podle potřeby přidávána glukóza a pH bylo nastaveno na přibližně 7 amoniakem na základě změny zbarvení fenolčervení. Koncentrace thymidinu

-11CZ 301565 B6 byla měřena HPLC s použitím kolony Spherisorb ODS-2, 5 gm, 250 mm x 4,6 mm, a 25 mM fosforečnanu amonného (pH 3,3) jako mobilní fáze, s průtokem přibližně 1,5 ml/min.

Kmen CMG245 l/pCG366 (T4 wdCAB, td) byl fermentací na třepačkách porovnáván s kmenem 5 CMG2451/pCG343 (T4 m/CAB). Tabulka 5 ukazuje, že u kmene CMG2451/pCG366 došlo ke snížení koncentrace deoxyuridinu a konverzi na thymidin v důsledku přítomnosti genu T4 td.

Tabulka 5 io

Vliv thymidylátsyntázy na produkci thymidinu po 66 hodinách

Kmen	Thymidin (mg/l)	Deoxyuridin (mg/l)	% deoxyuridinu
CMG2451/pCG343	1198	1728	144,2
CMG2451/pCG366	3327	206	6,2

Příklad 5

Konstrukce T4 ribonukleotidreduktázové mutanty ⁷⁹Ala na Ile

Mutace byla zavedena místně specifickou mutagenezí založenou na metodě popsané Kunkelem (Kunkel, T. A., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 488 - 492, 1985). Všechny materiály pro konstrukci mutanty včetně fágmidové DNA pTZ18U, pomocného fága M13KO7, bakteriálních kmenů E. coli 0236 a MV1190, T7 DNA polymerázy a T4 DNA ligázy byly poskytnuty v soupravě Muta-Gene in vitro mutagenesis kit firmy Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Nejdříve byl fragment DNA Xbal/Hindlll obsahující gen nrdA gen bakteriofága T4 izolován z plasmidu pCG312 (ChemGen Corp, tabulka 1, výše). Fragment DNA Xbal/Hindlll byl klonován do restrikčních míst XbaMHindWX fágmidového vektoru pTZ18U použitím standardních protokolů (Sambrook, J., Fritsch, E. F. a Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Fágmid pCG464 nesoucí inzert byl vložen do E. coli CJ236. Tento kmen je deficientní na dUTPázu (dut) a uracil-N-glycosylázu (ung), což vede k příležitostné substituci uracilu za thymin v nově syntetizované DNA. Jednořetězcová DNA plasmidu pCG464 obsahující uráčil byla izolována z CJ236 podle příručky Bio-Rad Laboratories Instructional Manual. Tato DNA (0,2 pmol) byla teplotně hybridizována s 6 pmol fosforylovaného příměru

5-AGC AAA CAT TAA ACA GCG TGC AATTAC ATA TTG ATA ATC AGG TTC-3' (SEQ ID No. 9) obsahujícího sekvenci požadované mutace (podtrženo) kódující Ile namísto původního ⁷⁹Ala.

Komplementární řetězec DNA byl syntetizován pomocí T7 DNA polymerázy podle popisu v protokolu Βίο-Rad. Reakční produkty byly transformovány do E. coli MV1190 obsahující uracil-N-glycosylázu standardního typu, která degraduje rodičovský řetězec obsahující uráčil, čímž dochází k obohacování na mutantní řetězec. Plasmidy obsahující požadovanou mutaci byly detekovány přímým sekvenováním DNA použitím sekvenačního systému Silver Sequence DNA Sequencing System firmy Promega Corp. (Madison, Wl). Zdálo se, že všechny čtyři analyzované transformanty obsahovaly plasmidy s mutací. Jeden z nich byl označen pCG492 a použit pro další experimenty. Pro kontrolu, zda tato mutace ovlivňuje syntézu thymidinu, byl zaveden do produkčního plasmidu pCG366 (ChemGen Corp., tabulka 1 a obr. 1). K tomuto účelu byl fragment DNA KpnVAlflX z pCG366 obsahující 5'-část genu nrdA nahrazen fragmentem KpnVAlflX z pCG492, který obsahuje mutaci. Nový plasmid pCG494 byl zaveden do produkčního kmene

- 12CZ 301565 B6

CMG2451 (ChemGen Corp., příklad 2 a tabulka 4 výše). Vliv mutace T4 nrdA byl vyhodnocen porovnáním produkce thymidinu kmenem CMG2451 (pCG494) a CMG2451 (pCG366), jak je ukázáno v příkladu 6 dále.

Příklad 6

Fermentace na třepačkách pro testování produkce thymidinu použitím CMG2451 (pCG366) a CMG2451 (pCG494) ío

250 ml baňky s přepážkami obsahující 25 ml produkčního média byly zaoČkovány 2 ml čerstvě narostlé kultury v médiu LB s přídavkem vhodného antibiotika. Kultury byly pěstovány při 30 °C na třepačce při 250 ot/min. Když dosáhla OD^o přibližně 5, baňky byly převedeny do třepačky 37 ^ŮC na 30 min. Potom byly baňky převedeny do třepačky 35 °C, kde fermentace pokračovala.

Produkční médium mělo následující složení (g/1): Ardamine YEP-S (Red Star Yeast &. Products, Milwaukee, WI) - 10; CaCO₃ - 10; MgSO₄ - 0,4; fenolčerveň - 0,24; PP90BT (DMV International, Fraser, N.Y.) - 4,5; sorbitol - 20; chioramfenikol - 0,03; stopové prvky (1000 x) - 1 ml/1. Stopové prvky (1000 x) měly následující složení (g/1): kyselina boritá - 0,05; chlorid vápenatý 20; síran kobaltnatý - 0,05; síran měďnatý - 0,01; síran železnatý - 20; chlorid železitý - 20;

síran manganatý - 0,5; molybdenan sodný - 0,1; a síran zinečnatý - 0,1. V čase indukce bylo přidáno 10 g/1 Ardamine YEP-S. Glukóza byla v průběhu fermentace přidávána v průměru každé dvě hodiny (2,5 g/1). pH v baňkách bylo udržováno na hodnotě přibližně 7,0 přidáváním 4N NH4OH, při posuzování podle zbarvení indikátoru fenolčerveni. OD₆₀₀ byla odečítána po zředění vzorku 1 ; 10 v 10 mM H₂SO₄ pro rozpuštění solí přítomných v médiu. Koncentrace thymidinu byla měřena C-18 HPLC s reverzními fázemi na koloně Alltech Spherisorb ODS-2 a s použitím spektrofotometrického detektoru Shimadzu při 260 nm. Jako mobilní fáze byl použít 25 mM NH4H2PO4 (pH 3,3) ve vodě s konstantním průtokem 1,5 ml/min.

Výsledky produkce thymidinu kmeny CMG2451 (pCG366) a CMG2451 (pCG494) po 2, 17 a

25 h po indukci jsou ukázány v tabulce 6. Při tomto experimentu byly použity dvě opakování experimentů v baňkách, přičemž variabilita mezi zdvojenými baňkami nepřesáhla 15 %. Výsledky ukazují, že mutanta T4 nrdA dosahovala lepších výsledků než kmen standardního typu nrdA.. To bylo potvrzeno v několika nezávislých experimentech na třepačkách se stejnými bakteriálními kmeny.

Tabulka 6

Produkce thymidinu CMG2451 (pCG366) a CMG2451 (pCG494)

Kmen	2h	17 h	25 h
	Specifická aktivita (mg/l/OD)
CMG2451 (pCG366)	6,1	32,5	43,1
CMG2451 (pCG494)	6,5	36,1	51,4

Příklad 7 *

Fermentace na třepačkách pro zjištění vlivu genu udkE. coli na produkci thymidinu

-13CZ 301565 B6

Gen dcd nebo operon dcd udk byly klonovány do vektoru pACYC177. Tento vektor s počátkem replikace pl 5a je odlišný od plasmidů založených na co/El jako je pCG366, a je tedy kompatibilní a může být udržován ve stejném hostiteli s plasmidy založenými na coZEl. Podrobnosti konstrukce plasmidů vedoucích k pCG374 (udk dcd) nebo pCG375 (dcd) jsou ukázány na obr. 2.

Geny na těchto plasmidech jsou exprimovány z nativního promotoru £. coli operonu udk dcd.

Použitím selekce na ampicilinovou resistenci byly zavedeny plasmidy pCG374 a pCG375 do CMG2451 (pCG366) pro testování vlivu na produkci thymidinu při fermentaci na třepačkách popsané v příkladu 6. Výsledky v několika časových bodech jsou ukázány v tabulce 7. I když io specifická aktivita (thymidin na OD buněk) je podobná jak v přítomnosti, tak i bez genu udk, buňky s genem udk na druhém plasmidu pCG374 rostly na vyšší buněčnou densitu a produkovaly podstatně větší množství thymidinu (5,8 g/1 ve srovnání s 3,0 g/1 pro kmen, ve kterém byl na druhém plasmidu přítomen pouze gen dcd). Tyto výsledky byly nečekané, protože není jasné, proč by mohla mít uridinfosforyláza tento účinek,

Na základě těchto údajů a dalších informací byl gen udk vybrán pro zavedení spolu s genem E. coli dcd při konstrukci plasmidu pCG532 (viz příklad 8 a obr. 3).

Tabulka 7

Porovnání vlivu druhých plasmidů s geny dcd nebo dcd udk na produkci thymidinu na pozadí CMG2451 (pCG366)

Čas (h)	ODe0o	Thymidin (mg/))	Specifický thymidin (mg/l/OD)
Základní kmen a plasmid	CMG241 (PCG366)	CMG2451 (pCG366)	CMG2451 (pCG366)	CMG2451 (pCG366)	CMG2451 (pCG366)	CMG2451 (pCG366)
Druhý plasmid na bázi pACYC 177	pCG374 s dcd udk	PCG375 s dcd	PCG374 s dcd udk	pCG375 s dcd	pCG374 s dcd udk	pCG375 s dcd
8 h	29,112	29,94	889	884	30,5	29,5
18 h	40,206	32,946	1721	1608	42,8	48,8
42 h	48,348	33,96	4020	2740	83,1	80,7
66 h	57,498	28,614	5804	3012	100,9	105,3

Příklad 8

Klonování operonu E. coli udk dcd do produkčního plasmidu pCG494

- 14CZ 301565 B6

Geny udk a dcd E. coli kódují pyrímidinribonukleotidkinázu, popřípadě dCTP deaminázu. Oba geny byly mapovány do fragmentu 3,4 kb BamiWPsň DNA fága lambda 355 genomové knihovny Kohary (Kohara, Y., Akiyama, K. a Isono, K., Cell 50, 495 - 508, 1987). Zdá se, že udk je umístěn ve směru translace ve směsu k dcd a přepisuje se ve stejném směru jako dcd (Neuhard, J. a Tarpo, L., J. Bacteriol. 175: 5742 - 5743, 1993). Tyto geny byly klonovány do produkčního plasmidu ve dvou krocích. Nejprve byl klonován fragment DNA 3,4 kb BaznHI/Psrl z lambda 355 do vícenásobného klonovacího místa plasmidu pUC18 (Yamisch-Perron, C., Vieira, J. a Messing, J. Gene 33: 103- 109,1985) (plasmid pCG358). Potom byl fragment vyříznut z polylinkerové oblasti pCG358 pomocí BawHI a Sphi a klonován namísto fragmentu 0,7 kb ío BgU/Sphl (obsahujícího část genu resistence na tetracyklin) produkčního plasmidu pCG494. Konečný plasmid 14,7 kb pCG532 obsahuje počátek replikace skupiny kompatibility co/El, gen resistence na chloramfenikol, geny udk a dcd a «rdCAB bakteriofága T4 (kóduje thioredoxin, popřípadě dvě podjednotky ribonukleotidkinázy) a T4 td (kóduje thymidylátsyntázu) pod řízením promotoru P_L bakteriofága lambda. Gen nrdN fága T4 v pCG532 byl dříve změněn místně speci15 fickou mutagenezí (⁷⁹Ala na Ile).

Ve směru translace vzhledem ke genu td je umístěn syntetický terminátor transkripce, aby se zabránilo přechodu transkripce do replikační oblasti. Genetická mapa plasmidu pCG532 je znázorněna na obr. 3.

Příklad 9

Fermentace na třepačkách CMG2451 (pCG494 a CMG2451 (pCG532) pro získání thymidinu

Plasmid pCG532 obsahující geny udk a dcd E. coli byl zaveden do produkčního kmene

CMG2451. Nový kmen CMG2451 (pCG532) byl testován spolu s rodičovským kmenem

CMG2451 (pCG494) v experimentech na třepačkách pro porovnání z hlediska produkce thymidinu. Výsledky ze dvou nezávislých experimentů jsou ukázány v tabulce 8. První experiment byl proveden podle výše uvedeného popisu a vzorky byly odebírány 17 h po indukci. Ve druhém experimentu byly buňky indukovány při vyšší OD (přibližně 9) a vzorky pro analýzu byly odebí30 rány 3 h po indukci. V obou případech se kmen obsahující klonované kmeny udk a dcd choval lépe než rodičovský gen.

Tabulka 8

Fermentace pro získání thymidinu kmeny CMG2451 (pCG494) a CMG2451 (pCG532)

Exprimení 1
Kmen	OD 600	TdR (mg/l)	Specifická aktivita (mg/l/OD)
CMG2451 (pCG494)	16.5	599	36,3
CMG2451 <pCG532)	17,5	867	49,5
Experiment 2
Kmen
CMG2451 (pCG494)	8,5	149	17,5
CMG2451 (pCG532)	8,4	192	22,8

-15CZ 301565 B6

Příklad 10

Přidání další mutace ung a její vliv na produkci thymidínu při fermentaci na třepačkách

Byl zkonstruován negativní řetězec uráčil DNA glykosylázy zavedením mutace ung'.:Tn 10 (Varshney, U., a další, J. Biol. Chem, 263: 7776 - 7784, 1988) do hostitele CMG2451 použitím transdukce Pl jak bylo popsáno výše, přičemž produkt byl nazván CMG2492. Plasmid pCG366 byl zaveden do CMG2492, Srovnávací experiment mezi kmeny Ung' a Ung⁺ pro syntézu thymidinu na třepačkách je ukázán na obr. 4, kde se používalo metody kultivace na třepačkách popsané io v příkladu 6. Buňky byly pěstovány v baňkách 250 ml při 30 °C a syntéza thymidínu byla indukována posunem teploty na 37 °C 30 min a potom přechodem na 35 °C. Hostitel Ung' bez uráčil

DNA glykosylázy vydržel růst déle a vyprodukoval o 30 % více thymidínu.

Příklad 11

Produkce thymidínu ve 30 litrovém fermentoru s kmenem CMG2451 (pCG532)

Pro produkci thymidínu ve 30 litrovém fermentoru (B. Braun Biotec Biostat C) s kmenem

CMG2451/532 byly použity následující podmínky. Očkovací kultura (500 ml) byla pěstována ve čtyřlitrové třepané baňce s přepážkami v médiu LB (5 g/1 kvasničný extrakt Difco, 10 g/1 trypton Difco, 5 g/1 NaCl) s přídavkem 30 mg/l chloramfenikolu a 25 mg/l kanamycinu pří 30 °C až do dosažení OD při 600 nm 2,37. Konečné pH bylo 6,69. První dávka ve fermentoru (121) obsahující směs uvedenou v tabulce 9 byla sterilizována při 121 °C 55 min. Po ochlazení byl přidán odděleně autoklávovaný roztok (500 ml) pro úpravu koncentrací v půdě na 20 g/1 sorbitolu a 3,0 g/1 MgSO₄.7H₂O. Před zaočkováním byl přidán filtrací sterilizovaný roztok (200 ml) navržený tak, aby byly nastaveny počáteční koncentrace na 30 mg/l chloramfenikolu, 25 mg/l kanamycinu, 1 mg/l d-biotinu, 10 mg/l thiaminu a 10 mg/l kyseliny nikotinové.

Byly připraveny tři doplňovací roztoky: a) Cerelose 2001 (monohydrát dextrózy) 562 g/1 s 2 mg/l biotinu, 20 mg/l thiaminu, 20 mg/l kyseliny nikotinové a 30 mg/l chloramfenikolu; b) sorbitol 717 g/1 s 4 mg/l biotinu, 40 mg/l thiaminu, 40 mg/l kyseliny nikotinové a 60 mg/l chloramfenikolu; a c) surová směs bohatá na dusík obsahující 360 g/1 materiálu Amberex 695 AG (Red Star Yeast & Products, Milwaukee, Wisc.), 6 g/1 PP90M (DMV International, Fraser, NY) s 1 x sto35 povými prvky a 0,1 ml/l Mazu DF1 OPMOD11 (BASF). Doplňovací roztoky byly sterilizovány 40 až 50 min při tlaku páry 0,12 MPa.

Tabulka 9 40

Složení výchozí půdy v 30 litrovém fermentoru

-16CZ 301565 B6

Složka	Koncentrace (g/l nebo ml/l)
Hexametafosfát sodný	4
KH2PO4	4
(NH4)2HPO<	4
CaCl2	0,4
Kyselina citrónová	0,6
Amberex 695 (Red Star Yeast & Products, Milwaukee, Wl)	20
PP90M (DMV International, Fraser, NY)	15
Trypton (Difco, Detroit, Ml)	5
1000 x stopové prvky (viz příklad 7)	1 ml/l
CaCO3	5
Glycin	1,83
Odpěňovač Mazu DF10PMOD11 Defoamer (BASF Speciality Products, Gurnee, IL)	0,2 ml/l

Pracovní podmínky byly následující: počáteční teplota 31 °C; otáčky 600 ot/min; průtok vzduchu 3 I/min; pH 6,8; tlak 0 MPa. Koncentrace rozpuštěného kyslíku byla řízena na nasycení 25 % pomocí smyčky pro řízení průtoku. Otáčky byly zvyšovány na 750 ot/min v 8 h, 850 ot/min v 9 h a 950 ot/min v době přesunu teploty z 31 na 35,5 °C v čase 9,2 h, kdy kultura dosáhla OD 37,8. Počínaje časem 9,7 h byl protitlak nastaven na maximum 0,06 MPa, aby se pomohlo přenosu io kyslíku do kultury. Rychlost přechodu teploty pro indukci syntézy thymidinu byla 0,2 °C/min.

Po dosažení hustoty biomasy 20 OD při 600 nm (odečítáno po zředění 50 mM H₂SO₄ pro rozpuštění solí byly přidávány dávky 85 ml doplňovacího roztoku sorbitolu (b) na každé zvýšení koncentrace biomasy o 5 OD. V čase 16,7 h bylo přidávání sorbitolu zastaveno a bylo zahájeno přidávání monohydrátu dextrózy (glukóza) (a) za řízení kontrolní smyčkou pro rozpuštěný kyslík typu PID na fermentoru B. Braun, nastaveném na 25 %. Jednoduše řečeno, když byla koncentrace rozpuštěného kyslíku nižší než 25 %, bylo zastaveno přidávání cukru, a jestliže byla koncentrace rozpuštěného kyslíku vyšší než 25 %, přidávání cukru pokračovalo. Samotný tento protokol udržuje koncentraci glukózy na nízké hodnotě, ale nedovolí hladovění kultury na glukózu po velmi dlouhou dobu. Doplnění surového dusíku (500 ml) bylo prováděno v čase 11 h, 16,2 h, 21,2 h, 28,2 h,33,2ha40,5 h.

Průběh koncentrací a akumulace biomasy, thymidinu a deoxyuridinu při fermentaci je ukázán na obr. 5.

Příklad 12

Čištění thymidinu z fermentační půdy

-17CZ 301565 B6

Materiál Dowex Optipore L-285 (The Dow Chemical Company) byl suspendován v deionizované vodě a byl nanesen do skleněné kolony o průměru 48 mm za vytvoření lože o objemu přibližně 500 ml. Kolona byla promyta 500 ml 5% NaOH, a potom promývána deionizovanou vodou až do dosažení pH efluentu 7,0.

Na kolonu bylo naneseno 500 ml fermentaČní půdy s koncentrací thymidinu (TdR) 4,890 g/1 a koncentrací deoxyuridinu (UdR) 1,040 g/1. Kolona byla promyta dvěma objemy lože deionizované vody. TdR a UdR byly eluovány dvěma objemy lože 5% alkoholu (ethanol 90,5 %, methanol 4,5 %, isopropylalkohol 5 %) a potom dvěma objemy lože 10% alkoholu a dvěma objemy io lože 15% alkoholu. Koncentrace TdR a UdR ve 25 ml frakcích je ukázána na obr. 6. Kolona byla regenerována promytím 5% NaOH, potom deionizovanou vodou na pH7,0 a postup byl opakován. Frakce 91 - 160 byly spojeny ze dvou oddělených izolací a sušeny ve vakuové odparce.

Thymidin byl znovu rozpuštěn v minimálním množství horké vody a krystalizován při 4 °C. Potom byly krystaly rekrystalizovány ještě dvakrát a sušeny v sušárně při 55 ^ĎC 15 h. Celkem bylo získáno 979,8 mg krystalického thymidinu s čistotou vyšší než 99 %, která by měla být vhodná pro použití jako farmaceutický meziprodukt.

Vedlejší frakce obsahující deoxyuridin i thymidin byly spojeny s matečnými louhy a zahuštěny na rotační vakuové odparce na konečný objem 1200 ml s koncentrovaným alkoholem. Celkové množství TdR v těchto 1200 ml roztoku bylo 3571 mg. Celkový izolovaný výtěžek (včetně 3571 mg vedlejších frakcí TdR) byl 93,1 %.

Výpis sekvencí <110> Glaxo Group Limited Anderson, David M Liu, Lin

Podkovyrov, Sergey Wang, Baomin < 120> Vectors, cells and processes for pyrimidine deoxyribonucleosides production <130> P1049 <140>

<141>

<150> US 09/345492 <151> 1999-07-01 <160> 9 < 170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 1 tattctagac gattttcaag ttgaggactt atgc <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

-18CZ 301565 B6 <400> 2 tatategata attcattaca atttacacgc tgcac 35 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: Primer to <400> 3 tatategata aatgtaaatt taaggattct aaatg 35 <210> 4 <211> 34 is <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 4 ₂₀ tatgtcgact ccttaaaagt attttttaaa actc 34 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: DNA insert <220>

<223> Part of a double stranded DNA insert. The non-overhanging part of SEQ ID NO: 6 is the complement <400> 5 cgagcccgcc taatgagcgg gctttttttt 30 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: DNA insert <220>

<223> Part of a double standed DNA insert. SEQ ID NO: 5 is the complement of the non-overhanging part of the sequence <220>

<221> misc_feature <222> (1)...(4) <223> Overhang <220>

<221> misc_feature <222> (35)...(38) so <223> Overhang <400> 6

-19CZ 301565 B6 gtacaaaaaa aagcccgctc attaggcggg ctcgggcc <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artifícial Sequence <220>

<223> Description of Artifícial Sequence: Oligonucleotide <400> 7 gatccggagg ataaatgaaa caataccaag atttaat <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artifícial Sequence <220>

<223> Description of Artifícial Sequence: Oligonucleotide <400> 8 taaatcttgg tattgtttca tttatcctcc g <2l0> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artifícial Sequence <220>

<223> Description of Artifícial Sequence: Primer <400> 9 agcaaacatt aaacagcgtg caattacata ttgataatca ggttc

Claims (9)

1. 35 PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Konstrukt DNA obsahující transkripční jednotku, která obsahuje: a) gen ribonukleotidreduktázy T4 nrdA;

   40 b) gen ribonukleotidreduktázy T4 nrdB; a c) gen thioredoxinu T4 nrdC, vyznačující se tím, že gen T4nrdA má mutaci v sekvenci kódující vazebnou oblast pro dTTP na ribonukleotidreduktáze T4, která nenarušuje základní funkčnost enzymu, takže ribonukleotidreduktáza T4 má sníženou vazbu dTTP ve srovnání s enzymem standardního typu.
2. 2. Konstrukt DNA podle nároku 1, kde sekvence T4nrdA kódující vazebnou oblast pro dTTP ribonukleotidreduktázy T4 je:

   5' -AGC AAA CAT TAA ACA GCG TGC AGC TAC ATA TTG ATA ATC AGG TTC- 3' 3* -TCG TTT GTA ATT TGT CGC ACG TCG ATG TAT AAC TAT TAG TCC AAG- 5' .

   -20CZ 301565 B6
3. 3. Konstrukt DNA podle nároku 1 nebo 2, kde mutace v sekvenci DNA kódující vazebnou oblast pro dTTP nahrazuje alanin v poloze 79 v aminokyselinové sekvenci T4nrdA isoleucinem, valinem nebo leucinem.
4. 4. Konstrukt DNA podle nároku 3, kde mutace v sekvenci DNA kódující vazebnou oblast pro dTTP nahrazuje alanin v poloze 79 v aminokyselinové sekvenci T4nrdA isoleucinem.
5. 5. Konstrukt DNA podle nároku 4, kde mutace v sekvenci DNA kódující vazebnou oblast i o dTTP je změna na kodonu 79 z GCT pro alanin na ATT pro isoleucin:

   5' -ACC AAA CAT TAA ACA GCG TGC AAT TAC ATA TTG ATA ATC ACC TTC- 3'

   3* -TCG TTT GTA ATT TCP CGC ACG TTA ATC TAT AAC TAT TAQ TCC AAG- 5*.
6. 6. Hostitelská buňka obsahující konstrukt DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 5.
7. 7. Hostitelská buňka podle nároku 6, kde tato hostitelská buňka je zvolena ze skupiny, kterou tvoří E, coli, Salmonella, Pseudomonas, BaciUus a Saccharomyces.
8. 8. Způsob produkce pyrimidmdeoxyribonukleosidů, vyznačující se tím, že zahmu20 je kultivaci hostitelské buňky podle nároku 6 nebo 7.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že deoxyribonukleosidem je thymidin.