KR20020019938A

KR20020019938A - 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드 생산을 위한 벡터, 세포및 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드 생산 방법

Info

Publication number: KR20020019938A
Application number: KR1020017016980A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 마틴 앤더슨; 린 리우; 세르게이 포드코피로프; 바오민 왕
Original assignee: 그레이엄 브레레톤, 레슬리 에드워즈; 글락소 그룹 리미티드
Priority date: 1999-07-01
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2002-03-13
Also published as: DE60035781T2; NO20016270D0; US20050009083A1; EP1190064A1; MXPA02000134A; DE60035781D1; NO20016270L; CZ20014695A3; IL147225A0; WO2001002580A1; EP1190064B1; US7387893B2; AU5547700A; CZ301565B6; JP2003504029A; ATE368743T1; ES2290041T3; US6777209B1

Abstract

본 발명은 신규한 DNA 구조물 및 상기를 포함하는 숙주 세포를 개시하고 있다. DNA 구조물은 리보뉴클레오티드 리덕타제 및 티오레독신 또는 유리딘 키나제 유전자 및(또는) dCTP 데아미나제 유전자를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 전사 단위 (예, 오페론)를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 리보뉴클레오티드 리덕타제 및 티오레독신를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 구조물은 또한 티미딜레이트 신타제 및(또는) 바람직하게는 dCTP 데아미나제와 함께 유리딘 키나제를 코딩하는 서열을 포함하는 전사 단위를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 유라실 DNA 글리코실라제 활성이 억제되거나 없는 숙주 세포는 상기 특성 모두를 갖는 구조물을 포함한다. 상기 숙주의 유라실 DNA 글리코실라제 활성의 억제 및 제거는 숙주 세포ung유전자를 제거하여 달성할 수 있다. 본 발명은 또한 피리미딘 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 티미딘의 제조에 있어 숙주 세포의 사용을 개시하고 있다.

Description

피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드 생산을 위한 벡터, 세포 및 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드 생산 방법 {Vectors, Cells and Processes for Pyrimidine Deoxyribonucleosides Production}

티미딘은 제약 중간체, 특히 아지도티미딘 (azidothymidine) ("AZT", 상표명 ZIDOVUDINE으로 시판됨)의 화학적 합성을 위한 제약 중간체로서 유용하다. ZIDOVUDINE-형의 AZT는 HIV/AIDS를 위해 개발된 최초의 치료제이지만, 이의 사용은 여전히 중요하며 그 용도를 넓혀가고 있다 (문헌 [Langreth, R., The Wall Street Journal, Nov. 21, 1995, pp B12]). ZIDOVUDINE-형의 AZT는 상표명 EPIVIR으로 시판되는 라미부딘 (lamivudine) (3TC로도 공지되어 있음)과의 조합물 등과 같이 조합 치료제로 사용되는 경우 특히 유익하다. AZT와 3TC의 조합물은 상표명 COMBIVIR로 시판된다. HIV 바이러스는 돌연변이를 유발하여 AZT 또는 3TC에 내성을 가질 수 있지만, 역전사 효소는 분명 상기 2 가지 뉴클레오시드 유사체 모두에게 동시에 내성을 가질 수는 없기 때문에, COMBIVIR-형의 뉴클레오티드-유사체 조합물은 특히 효과적이다 (문헌 [Larder, B. A. et al., Science 269:696-699, 1995]). 또한, ZIDOVUDINE-형의 AZT는 HIV 프로테아제 억제제 형의 약물과 함께 사용되는 경우에도 유용하고 (문헌 [Waldholz, M., The Wall Street Journal, Jan. 30, 1996, pp B1]), HIV로 감염된 임산부의 치료에도 유용하여 출산시 태아의 HIV 감염 빈도를 줄일 수 있다. 1997년에는 약 600,000명의 어린이가 출생시 모체에 의해 감염된 AIDS로 사망했다. ZIDOVUDINE-형의 AZT를 출산 전 수 개월 동안 복용하면 아이에게 바이러스가 전달되는 것을 2/3로 줄일 수 있다. 화학적 합성법으로 생산되는, AZT 제조용 티미딘은 매우 고가이다.

미국 특허 제5,213,972호 (McCandliss ＆ Anderson, 이후 본원에서는 "'972 특허"로 지칭함)는 그 전체 내용이 본원에서 참고로 도입되는데, 이 문헌에는 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드 (PdN)의 생산 방법이 구체적으로 개시되어 있다 (특히, '972 특허의 실시예 7 내지 실시예 14 참조). PdN 모노포스페이트를 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드로 전환시키는 피리미딘 데옥시리보뉴클레오티드 포스포히드롤라제를 코딩하는 DNA 서열을 포함하고, 이를 발현하는 복제가능한 미생물이 교시되어 있다. 보다 구체적으로, 문헌 [McCandliss ＆ Anderson, 상기 문헌]에는 바실루스 (Bacillus) 박테리오파지 PBS1으로부터의 데옥시티미딜레이트 포스포히드롤라제 (dTMPase)를 발현시키는 것을 포함하는, 티미딘 생산에 이용될 수 있는 발효 방법이 기재되어 있다. 자연계에서, 상기 유형의 효소는 DNA에 티미딘 대신 데옥시유리딘 또는 히드록시메틸데옥시유리딘과 같은 화합물이 도입된 박테리오 파지에 의해 발현되는 것으로 밝혀졌다.

'972 특허에 기재된 티미딘 발효법에서는 티미딘을 분해하는 효소 (티미딘 포스포릴라제 및 유리딘 포스포릴라제)를 돌연변이법으로 제거시켜 티미딘을 축적시킨다. 그러므로, dTMPase 효소를 사용하면, 티미딘 합성을 가능케하는 경로 생성을 보조할 수 있다. 그러나, dTMPase의 단독 발현만으로는 티미딘을 상업적으로 가능한 수준으로 생산할 수 없다. 그러므로, 현행 화학적 합성 방법에 비해 생산 비용을 감소시키기 위해, dTMPase를 발현하는 세포를 이용한 발효법으로 티미딘 생산량을 상업적으로 가능한 수준으로 향상시키려는 노력이 여전히 요구되고 있다.

예를 들어, 대장균에서 피리미딘 데옥시뉴클레오티드를 생산하기 위한 생화학적 경로는 전사 및 번역 수준에서 뿐 아니라, 감쇠 (attenuation), 피드백 억제 및 효소 활성화 등의 메커니즘에 의해 단백질 수준에서도 고도로 조절된다 (문헌 [Neuhard, J. and R. A. Kelln, Biosynthesis and Conversion of Pyrimidines, Chapter 35 [In] Neidhardt, F. C. et al [eds] "Escherichia coliandSalmonellaCellular and Molecular Biology", Second Edition, Vol. 1, pp 580-599, ASM Press, Washington D.C., 1996]). dTMPase를 발현시키고,deoA (티미딘 포스포릴라제),udp(유리딘 포스포릴라제) 및tdk(티미딘 키나제) 유전자 돌연변이 및 그의 발현 생산물에 의해 티미딘 분해를 억제함으로써 대장균에서 티미딘을 합성할 수 있지만 상업적으로 가능한 수준은 아니다.

발명의 요약

퓨린 및 피리미딘의 생합성 과정은 리보뉴클레오시드 디포스페이트 (일부 종에서는, 트리포스페이트)를 상응하는 데옥시 유사체로 환원시키는 공통적인 단계를 포함한다. 전반적인 과정에서, 리보스 부분을 2-데옥시리보스로 환원시키기 위해서는 결과적으로는 NADPH 및 H⁺가 제공하는 수소 원자 1 쌍이 필요하다. 그러나, 직접적인 전자 제공자는 NADPH가 아니라, 티오레독신 또는 글루타레독신이라 지칭되는 열 안정성 단백질의 환원형 및 1 종 이상의 다른 미확인 공급원인데, 이러한 미확인 공급원이 포함되는 것은 대장균의 리보뉴클레오티드 리덕타제 시스템이trxA (티오레독신)grx(글루타레독신) 이중 돌연변이체에서도 여전히 작동 [Neuhard and Kelln, 상기 문헌]하기 때문이다. 환원된 티오레독신의 환원 당량은 환원 과정을 수행하는 리보뉴클레오시드 디포스페이트 리덕타제로 전달된다. 예를 들어, 상기 단계의 조작은 퓨린 및 피리미딘 데옥시뉴클레오시드의 상업적 생산을 개선하는 데 유용할 수 있다.

본 발명의 목적은 피리미딘 및 퓨린 데옥시뉴클레오시드를 특히 회수가능한 양, 구체적으로는 상업적으로 유용한 양으로 생산하는데 사용하기 위한 벡터 등의 신규 DNA 구조물 및 상기 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 미생물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 문헌 [McCandliss and Anderson, 상기 문헌]에 기재된 방법보다 개선된 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 한 측면은 리보뉴클레오티드 리덕타제 유전자 및 티오레독신 유전자 또는 유리딘 키나제 유전자 및(또는) dCTP 데아미나제 유전자를 포함하는 전사단위를 포함하는 DNA 구조물을 제공한다.

한 실시양태에서, 상기 DNA 구조물은 리보뉴클레오티드 리덕타제 유전자 및 티오레독신 유전자를 포함하는 전사 단위를 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 DNA 구조물은 유리딘 키나제 유전자 및(또는) dCTP 데아미나제 유전자를 포함하는 전사 단위를 포함한다.

바람직하게는, 상기 DNA 구조물은 유리딘 키나제 유전자 및 dCTP 데아미나제 유전자를 포함하는 전사 단위를 포함한다.

가장 바람직하게는, 상기 DNA 구조물은 리보뉴클레오티드 리덕타제 유전자 및 티오레독신 유전자 및 유리딘 키나제 유전자 및 dCTP 데아미나제 유전자를 포함하는 전사 단위를 포함한다.

본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 DNA 구조물을 포함하는 변형된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 본 발명의 변형된 숙주 세포를 포함하는 배양 배지 및 상기 변형된 숙주 세포를 사용하는 것을 포함하는, 퓨린, 또는 티미딘 등의 피리미딘 생산 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 바람직하게는 야생형 숙주 세포 등가물 또는 대응물에 비해 알로스테릭 억제에 대한 감수성이 약한 리보뉴클레오티드 리덕타제 및 티오레독신을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 전사 단위 (예를 들면, 오페론)를 포함하는 DNA 구조물을 포함하며, (a) (바람직하게는 숙주 세포 등가물에 대한 이종) 티미딜레이트 신타제를 코딩하는 DNA 서열을 포함하며, 바람직하게는 상기 DNA 구조물 상에 위치한 전사 단위 (예를 들면, 오페론), (b) 유리딘 키나제 및 바람직하게는 dCTP 데아미나제를 코딩하는 DNA 서열을 포함하며, 바람직하게는 상기 DNA 구조물 상에 위치한 전사 단위 (예를 들면, 오페론), 및 (c) 저해되거나 결여된 유라실 DNA 글리코실라제 활성중 하나 이상의 특징을 추가로 포함한다.

다른 실시양태에서, 피리미딘 및 그의 유도체, 특히, 티미딘 등의 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드를 회수가능한 양으로 생산하는데 사용하기 위한 상기 DNA 구조물은 유리딘 키나제 및(또는) dCTP 데아미나제를 코딩하는 (바람직하게는 이종) DNA 서열을 포함하는 전사 단위 (예를 들면, 오페론)를 포함한다.

또한, 상기 구조물을 포함하고 이를 발현하는, 유전적으로 변형된 숙주 세포 및 상기 변형된 숙주 세포를 포함하는 배양 배지를 제공한다.

이러한 측면은 부분적으로 유리딘 키나제 및(또는) dCTP 데아미나제를 코딩하는 DNA를 포함하고, 경우에 따라서는 미국 특허 제5,213,972호에서 제안된 바와 같이 티미딘 생산에 필요한 유전자를 추가로 포함하는 숙주 세포에서 티미딘 생산이 상당히 개선된다는 발견을 근거로 한다.

본 발명의 각 측면은 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드, 특히 티미딘의 상업적 생산에 이용하기 위한 개선된 DNA 구조물 및 상기 구조물을 포함하는 숙주 세포를 제공하기 위해, 미국 특허 제5,213,972호에 교시된 사항을 다수 진보시켜 최초로 개시하는 것이다.

본 발명의 다른 목적, 특성 및 이점은 하기의 설명으로 명백할 것이다. 그러나, 이는 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내는 것이며, 단지 예시하기 위해서임이 이해되어야 한다. 당업자라면, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형과 변화가 가능함이 명백할 것이다.

본 발명의 바람직한 실시양태

본 발명의 구조물은 염색체 상에 있거나, 더욱 바람직하게는 염색체 외부 (extrachromosomal), 예를 들면, 벡터 상에 위치할 수 있다.

본 발명의 벡터에는 플라스미드, 바이러스, 트란스포손, 미니염색체 또는 파지 등이 있으며, 플라스미드인 것이 바람직하다. 전사 단위를 포함하는 벡터는 P1 형질도입법, 전기천공법 또는 형질전환법 등과 같이 당업자에게 공지된 임의의 통상적인 방법에 따라 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명에 유용한 적합한 숙주 세포로는 진핵 세포 및 원핵 세포 (예를 들면, 박테리아) 등이 있다. 원핵 세포로는 대장균, 살모넬라 (Salmonella), 슈도모나스 (Pseudomonas), 바실루스 (Bacillus) 균주 및 그의 돌연변이체 등이 있다. 이용가능한 돌연변이 대립유전자, 유전적 도구 (tool) 및 정보의 다양성 때문에, 대장균인 것이 바람직하다. 선택된 숙주 세포에서 형질도입 방법이 이용가능하여, 돌연변이를 한 숙주 세포에서 다른 숙주 세포로 쉽게 이동시키고, 새로운 돌연변이를 원할 때마다 직접 돌연변이시키지 않으면서 숙주의 유전적 돌연변이가 용이한 것이 특히 바람직하다.

본 발명자들은 박테리오파지 T4nrdA,nrdB 및nrdC 유전자를 이용하는 것이 대장균에서의 리덕타제 및 티오레독신 코딩에 특히 유용함을 알아냈다 (문헌 [Sjoeberg, B. M. et al., EMBO J., 5:2031-2036 (1986)], 문헌 [Tseng, M.-J., et al., J. Biol. Chem. 263:16242-16251 (1988)], 및 문헌 [LeMaster, D. M., J.Virol. 59:759-760 (1986)] 참조). 보다 구체적으로, T4 리보뉴클레오티드 리덕타제는 대장균 티오레독신을 이용할 수 없기 때문에 상기 리보뉴클레오티드 리덕타제를 코딩하는 T4 박테리오파지nrdA 및nrdB 유전자를 T4 티오레독신을 코딩하는 T4nrdC와 함께 클로닝하여 발현시킴으로써 대장균에서의 티미딘 생산을 크게 개선시켰다. T4 리보뉴클레오티드 리덕타제는 대장균 효소와 비교할 때, 시험관내 알로스테릭 억제에 의한 제어에 비교적 불감성인 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Berglund, O., J. Biol. Chem. 247:7276-7281, 1972]). 예를 들어, 대장균 효소와는 달리 (Berglund, O., J. Biol. Chem. 247:270-7275, 1972) T4 리보뉴클레오티드 리덕타제는 dATP에 의해 억제되는 것이 아니라, 사실상 dATP 및 ATP에 의해 자극된다 (문헌 [Berglund, O., J. Biol. Chem. 247:7276-7281, 1972]).

리보뉴클레오티드 리덕타제 (예를 들면,nrdA 및nrdB 유전자) 및 티오레독신 (예를 들면,nrdC 유전자)을 코딩하는 DNA 서열은 바람직하게는 숙주 세포 DNA에 대해 이종이며, 바람직하게는 T 파지 (바람직하게는 대장균 T 박테리오파지), 특히 T "짝수" 파지, 예를 들면, T2, T4 또는 T6으로부터 유래한 것이다 (문헌 [Campbell, A. M., Bacteriophages, Chapter 123, In Neidherdt, 상기 문헌], 및 문헌 [Mathews, C. K. et al. (eds.) Bacteriaophage T4, American Society of Microbiology, Washington D.C., 1983] 참조). 용어 "-로부터 유래한"이란, 그의 물리적 출처를 의미하는 공급원 뿐 아니라, 구조적 및(또는) 기능적 특성이 그 공급원에서 기원한 물질에 상응하는 물질도 정의하고자 한다.

T 짝수 파지 효소의 다른 유용한 특성은 그의 기질 특이성이다. 통상의 대장균 리보뉴클레오티드 리덕타제의 UDP에 관한 K_m은 CDP에 관한 것보다 약 10 배 높기 때문에 (문헌 [Neuhard and Kelln, 상기 문헌]), 이 효소는 UDP를 기질로서 단지 조금만 사용한다. 그러나, T4 효소는 dUTP를 합성하는 두 가지 경로에서 기질 CDP와 UDP에 관한 K_m차이가 단지 2 배에 불과하다 (문헌 [Berglund, O., J. Biol. Chem. 247:7276-7281, 1972]). 대장균에서 T4 리보뉴클레오티드 리덕타제의 기능적 발현물을 얻기 위한 시도가 있었지만, 예전의 이러한 노력들은 성분들의 별개 발현에만 성공하여, 시험관내 혼합에 의해서만 활성이 있음을 증명할 수 있었다 (문헌 [Tseng, M.-J., P. He, J. M. Hilfinger, and G. R. Greenberg, J. Bacteriol. 172:6323-6332, 1990]). 이론에 구애받는 것은 아니지만, 본 발명자들은 아마도 통상의 피드백 억제 양상이 없기 때문에 대장균에서의 T4 리보뉴클레오티드 리덕타제 발현은 치명적이므로, 이는 주의깊게 조건 발현되어야 한다고 생각한다. 또한, 프로세싱되어 성숙한 형태를 생산하게 될 전구체 형태의 리덕타제 및(또는) 티오레독신을 코딩하는 유전자도 고려된다. 상기 프로세싱은 여러가지 중간체 형태를 거쳐 진행될 수 있다.

본 발명의 벡터는 바람직하게는 조절 요소 (예를 들면, 프로모터, 예를 들면, 람다 P_L, 오퍼레이터, 활성인자, 리프레서 (repressor), 예를 들면, 람다 리프레서, 특히 온도 감수성 변이체, 및(또는) 인핸서), 적절한 종결 서열, 개시 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 상기 벡터는 선택가능한 마커를 추가로 포함할 수 있다. 별법으로, 조절 요소 (특히, 람다 리프레서)는 숙주 세포 염색체 상에위치할 수 있다.nrdA 및nrdB가 벡터에서nrdC의 하류 (리딩 프레임의 측면에서)에 배열되어 있는 것이 바람직하다. 특히,nrdB가nrdA의 하류에 배열되어 있는 것이 바람직하다. 그러므로, 가장 바람직한 배열체는nrdCAB를 포함하는 오페론을 포함하는 벡터이다.

T4 리보뉴클레오티드 리덕타제는 생체내 피드백 제어가 결여되어 있지 않다 (문헌 [J. Ji, R. G. Sargent, and C. K. Mathews, J. Biol. Chem. 266:16289-16292, 1991], 및 문헌 [Berglund, 상기 문헌]). 예를 들면 티미딘 생산을 위한 리보뉴클레오시드 디포스페이트의 환원을 촉진하기 위해, 조절 서브유닛을 코딩하는 유전자인nrdA를 돌연변이적 접근법 등으로 변형시켜 예를 들면, 효소의 직접적인 산물에 의한 억제 또는 하류 사건으로부터의 생성물에 의한 억제 등과 같은 알로스테릭 억제에 대한 감수성 감소로 티미딘 생산을 증가시킬 수 있는 효소를 생성할 수 있다.

T4nrdA 돌연변이체를 제작하기 위해서, 위치 지정 돌연변이유발법을 이용하여 예를 들어 알로스테릭 조절에 관여하는 dTTP 결합 부위를 변화시킬 것으로 예상되는 아미노산을 코딩하도록 유전자 염기를 변형 또는 변화 (예를 들면, 치환)시킬 수 있다. T4 리보뉴클레오티드 리덕타제의 아미노산 서열 분석으로 dTTP 결합에 관여할 것으로 여겨지는 추정 컨센서스 서열에 잘 부합되는 것으로 보이는 절편을 밝혀냈다 (문헌 [E.M. Mcintosh and R. H. Haynes, Mol. 세포. Biol. 6:1711-1721, 1986]). T4 리보뉴클레오티드 리덕타제 내의 상기 영역에서 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이유발법을 이용하여 몇 가지를 변화시킬 수 있다. 통상적인 접근법은데옥시시티딜레이트 데아미나제의 dTTP 결합을 감소시키기 위한 모어 (More) 등의 시도 (문헌 [More, J. T., J. M. Ciesla, L.-M. Changchien, G. F. Maley and F. Maley, Biochemistry 33:2104-2112, 1994])를 모델로 할 수 있다. T4nrdA에서⁷⁹Ala의 Ile으로의 돌연변이가 매우 유용한 것으로 여겨진다. 예를 들어, T4nrdA에서⁷⁹Ala의 Ile으로의 돌연변이를 함유하는 균주를 진탕 플라스크 발효시켰을 때, 티미딘 생산성은 상당히 증가되었다. 하기에서 증명한 바와 같이, 본 발명자들은 이러한 단일 변화 없이도 티미딘 생산성을 모(母)균주보다 25％ 증가시켰다.

⁷⁹Ala의 Ile으로의 돌연변이는 성공적인 한 예이지만, 당업자라면, dTTP 결합만을 파괴하고 효소의 기본적인 기능성은 파괴되지 않도록 이 영역 내의 많은 다른 아미노산을 변화시켜 원하는 효과를 얻을 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어,⁷⁹Ala를 Ile과 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 (예를 들면, 루이신, 발린)으로 치환시킬 수 있다. 또한, 컨센서스 영역이라 예측되는 영역 내의 위치 79를 다른 변형법 (예를 들면, 돌연변이법)으로 변형시키는 것도 고려된다. 컨센서스 영역 내의 아미노산 위치 하나 이상을 결실시키고 합성 DNA를 상기 영역으로 도입하는 것은 당업자에게 이용가능한 다른 접근법이다.

본 발명의 다른 측면에서는, 야생형 숙주 세포 등가물 또는 대응물에 비해 알로스테릭 억제에 대한 감수성이 약한 이종 리보뉴클레오티드 리덕타제 및 티오레독신을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 전사 단위를 포함하는 구조물 (예를 들면,벡터)을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 당업자라면, 야생형 숙주 세포 등가물과 비교한 후보 이종 리덕타제의 알로스테릭 억제에 대한 상대적인 감수성을 측정하는 것은 통상적인 실험 및 관찰에 의한 것임이 명백할 것이다.

nrdA,nrdB 및nrdC 유전자 등의 DNA 서열을 포함하는 전사 단위는nrd유전자들이 일렬로 배열된 오페론인 것이 바람직하다. 이는 상기 유전자가 단일 mRNA 전사체로서 전사되도록 한다. 숙주 세포에 의한 비생산적인 에너지 소비를 최소화하고, 추가로 플라스미드의 크기를 최소화하기 위해, 상기 오페론은 리덕타제 및 티오레독신의 코딩에 필요한 유전 서열 (임의의 조절 요소 또는 제어 요소 포함)만을 함유하는 것이 바람직하다. 이를 위해서는, 여분의 DNA (예를 들어, 파지 T4nrdB 유전자 내의 독특한 인트론, 문헌 [Sjoberg, B-M., et al., EMBO J. 5:2031-2036, 1986)의 제거가 필요할 수 있다.

다른 바람직한 실시양태에서, 티미딘의 생산 등에 사용하기 위한 본 발명의 벡터는 티미딜레이트 신타제 (예를 들면,td유전자)를 코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Chu, F. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3049-3053 (1984)], 문헌 [Chu, F. K. et al., J. Bacteriol. 169:4368-4375 (1987)] 참조). 상기 효소를 이용하는 목적은 생산된 데옥시유리딘의 수준, 특히 티미딘에 대한 데옥시유리딘 불순물 수준에 대한 제어를 개선시키는 것이다. 상기 dTMPase 효소는 dTMP에 대해 완벽하게 특이적이지 않다. dUMP에 대한 K_m이 dTMP에 대한 것보다 높다면, PBS1 dTMPase는 기질로서 dUMP를 사용하여 데옥시유리딘을 생산할 것이다 (문헌 [Price, A. R., Methods in Enzymol. 51:285-290, 1978]). 데옥시유리딘은 티미딘 정제에 상당한 문제점을 야기한다. 그러므로, 데옥시유리딘 생산을 감소시키기 위한 한 가지 방법은 티미딜레이트 신타제의 수준 또는 효율을 증가시켜 dUMP를 dTMP로 효과적으로 전환케 하여 dUMP의 내부 농도가 항상 매우 낮은 수준으로 유지되도록 하는 것이다.

티미딜레이트 신타제 유전자 (td)는 숙주 세포에 대해 이종일 수 있고, 상기td는 T 박테리오파지, 예를 들면, T "짝수" 파지로부터 유래한 (상기에서 정의한 의미로서) 것이 바람직하고, 특히 T4 파지td인 것이 바람직하다.td는 그의 고유 전사 단위에 위치할 수 있지만,td가nrd유전자와 동일 전사 단위, 예를 들면 동일 오페론에 위치하는 것이 바람직하다. 또한,td가nrd유전자로부터 동일 오페론의 하류 (리딩 프레임의 측면에서)에 위치하는 것이 바람직하다.

문헌 [McCandliss and Anderson, 상기 문헌]에서는 플라스미드 pCG138 및 pCG148에 있는 대장균 티미딜레이트 신타제 유전자를 증폭시켜 ('972 특허의 표 5 참조), 이것이 데옥시유리딘 감소에 부분적으로 효과적임을 밝혀냈다. T4 티미딜레이트 신타제는 훨씬 더욱 효과적인데, 대장균 효소가 어떤 유형의 알로스테릭 조절에 의해서도 제어되지 않는다 [Neuhard and Kelln, 상기 문헌]는 사실에 비추어 볼 때 이는 놀라운 것이다. dUMP에 대한 대장균 효소의 K_m4 μM (문헌 [Wahba, A. J. and M. Friedkin, J. Biol Chem. 237:3794-3801]) 및 dUMP에 대한 T4 효소의 K_m2.73 μM (문헌 [Maley, F., L. LaPat-Polasko, V. Frasca and G. F. Maley,Functional domains in T4 Thymidylate Synthase as probed by site-directed mutagenesis, Chapter 29 [In] Karam, J. D. [ed] "Molecular Biology of Bacteriophage T4", American society for Microbiology, Washington D.C., 1994, pp 322-325)은 유사하기 때문에 상기와 같은 효율 상의 커다란 차이를 설명할 수 없다. 이론에 구애받는 것은 아니지만, 본 발명자들은 대장균 thyA가 플라스미드 클론의 발현 수준에 영향을 미칠 수 있는 상류 유전자 (문헌 [Bell-Penderson, D, J. L. Galloway Salvo, and M. Belfort, J. Bacteriol. 173:1193-1200, 1991])로부터 유래한 내부 전사 종결 서열을 가질 것으로 생각한다.

다른 바람직한 실시양태에서, 특히 티미딘 등의 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드의 상업적 생산에 이용하기 위한 본 발명의 숙주 세포는 예를 들어 유리딘 키나제를 코딩하는udk유전자, 바람직하게는 예를 들어 dCTP 데아미나제를 코딩하는 dcd 유전자 등의 DNA 서열을 포함하는 전사 단위 (예를 들면, 오페론)를 포함한다 (예를 들면, 문헌 [Wang, L. and B. Weiss, J. Bacteriol. 174:5647-5653 (1992)], 및 문헌 [Neuhard, J. and L. Taro, J. Bacteriol. 175:5742-5743] 참조)

본 발명의 이러한 측면의 구조물은 바람직하게는 숙주 세포 DNA에 이종이고, 바람직하게는 대장균 박테리오파지, 특히 T "짝수" 파지, 예를 들면, T2, T4 또는 T6으로부터 유래한 리보뉴클레오티드 리덕타제 (nrdA 및nrdB) 및 티오레독신 (nrdC), 또는 그의 전구체 형태를 코딩하는 전사 단위를 추가로 포함할 수 있다.

유리딘 키나제는 포스페이트 제공자로서 GTP (또는 dGTP)를 이용하여 유리딘 및 시티딘으로부터 UMP 및 CMP를 생산한다. 이 반응은 UTP 및 CTP에 의해 억제된다 (문헌 [J. Neuhard and R. D. Kelln, Biosynthesis and Conversions of Pyrimidines, Chapter 35 [in] F. C. Neidhart et al. [eds], "Escherichia ColiandSalmonellaCellular and Molecular Biology", Second Edition, ASM press, Washington D.C.]). 본 발명자들은 유리딘 키나제를 특히 dCTP 데아미나제와 함께 사용하면 상기에서 요약한 '972의 교시 사항과 더불어 이러한 변화를 도입한 숙주 세포에 의한 티미딘 생산이 두드러지게 개선된다는 것을 알아냈다. 현재의 정보를 기초로 할때, 유리딘 키나제는 피리미딘의 데 노보 (de novo) 생합성에서 직접적인 역할이 없기 때문에 이러한 관찰은 전혀 예기치 못한 것이었고, 또한, 이의 사용은 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드 생산을 위한 상업적 과정에 유익할 것이다.udk및 dcd 유전자는 동일 오페론에 일렬로 배열되는 것이 바람직하다. 또한, 프로세싱되어 성숙한 형태를 생산하게 될 전구체 형태를 코딩하는udk및dcd유전자도 고려된다. 상기 프로세싱은 여러가지 중간체 형태를 거쳐 진행될 수 있다.udk및dcd유전자는 P1 형질도입법, 전기천공법 또는 형질전환법 등과 같이 당업자에게 공지된 방법에 따라, 임의의 적당한 공급원으로부터 구조물 (예를 들면, 벡터)내로 도입될 수 있다.

ung유전자에 의해 코딩되는 효소인 유라실 DNA 글리코실라제는 티미딘 대신 유라실이 도입되어 있는 DNA의 분해를 담당한다. 본 발명의 숙주 세포가 티미딘 등의 상업적 생산에 이용되는 경우, 티미딘 생산에 dTMP (dTTP의 전구체)를 이용함으로써 dTTP의 세포내 농도가 감소될 수 있다. 그러므로, 본 발명자들은 잠재적으로 더 강력하게 숙주 DNA로 유라실이 도입되려는 경향은 숙주 세포 DNA에 너무 많은 단일 가닥화된 파손을 초래하는 유라실 DNA 글리코실라제 활성 때문에 야생형 숙주에게 치명적일 수 있다는 것을 깨달았다. 그러므로, 본 발명에 유용한 숙주 세포는 또한 유라실 DNA 글리코실라제 활성이 (미변형 세포에 비해) 저해되거나 전혀 없는 것일 수도 있다. 상기 활성의 저해 또는 부재는 당업자에게 명백한 여러가지 방법을 통해 달성될 수 있다. 이러한 접근법의 한 예로는 상기 기능적 효소 (또는 그의 전구체)의 길항제를 숙주 세포에 도입하여ung유전자 발현 생성물에 관한 (전반적 또는 부분적) 길항작용을 이용하는 것이다. 다른 접근법으로는 예를 들어,ung유전자 발현의 조절 요소를 변형시키거나ung유전자 그 자체에 돌연변이를 도입하여ung유전자의 발현 생성물이 유라실 DNA 글리코실라제 단백질 및(또는) 활성이 거의 없거나 전혀 없도록ung유전자 발현을 조작하는 것 등이 있다. 다른 접근법은 숙주 세포 DNA로부터ung유전자 (또는 기능적으로 중요한 그의 일부)를 결실시키는 것이다. 추가의 조작 없이도 숙주 세포가 유라실 DNA 글리코실라제 활성이 전혀 없거나 낮은 수준인 것을 특징으로 하게 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본원에서 교시된 사항을 각각 진보시켜 숙주 세포로 도입한다. 상기nrd,td,udk및dcd유전자는 별개의 구조물 상에 위치할 수 있지만, 이것들 모두가 동일 구조물, 예를 들면, 동일 벡터 상에 위치하는 것이 바람직하다. 그러므로, 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 바람직하게는 야생형 숙주 세포 등가물 또는 대응물에 비해 알로스테릭 억제에 대한 감수성이 약한 (바람직하게는 T 짝수 파지, 예를 들면, T4의) 변형된 리보뉴클레오티드 리덕타제 및 티오레독신을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 전사 단위 (예를 들면, 오페론)를 포함하고, 다음을 추가로 포함하는 DNA 구조물을 포함하면서, 유라실 DNA 글리코실라제 활성이 저해되거나 억제된 숙주 세포를 제공한다. (a) (바람직하게는 숙주 세포 등가물 또는 대응물에 대한 이종) 티미딜레이트 신타제를 코딩하는 전사 단위 (예를 들면, 오페론), 및 (b) 유리딘 키나제 및 바람직하게는 dCTP 데아미나제를 코딩하는 전사 단위 (예를 들면, 오페론),

본 발명에 따라 변형된 숙주 세포는 피리미딘 데옥시뉴클레오시드의 상업적 생산에 특히 유용하다. 본 발명의 특히 유리한 점은 (특히, '972 특허에 교시된 사항과 함께) 본 발명에 따라 변형된 플라스미드를 포함 (함유)하는 대장균 숙주 세포를 이용하여 티미딘을 상업적으로 생산할 수 있다는 것이다. 그러므로, 본 발명에 따라 변형된 숙주 세포는 PBS1 등으로부터 유래한 dTMPase 및deoA,tdk-1, 및udp-1 등과 같이 '972 특허에 교시된 돌연변이체를 추가로 포함할 수 있다.

통상적으로, 적절한 용기에 들어있는 배양 배지 내에 세포를 배양하는 것을 포함하는 발효 방법을 이용한다. 적절한 조건 하에서 배양한 다음, 생산된 티미딘을 수거하고 정제 (풍부하게)하는데, 필요에 따라서는 표준 프로토콜에 따라 제약 등급으로 정제한다. 그 다음, 정제된 티미딘을 사용하여 AZT와 같은 제약 조성물 등의 의약을 제조할 수 있다.

본 발명은 신규 DNA 구조물을 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 사용한 피리미딘, 퓨린, 및 데옥시리보뉴클레오시드 등과 같은 그의 유도체 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명은 실시예에 의해 단지 설명될 뿐이며, 하기의 도를 참조로 한다:

도 1은 pCG366의 제작 경로를 개략적으로 나타낸다. 플라스미드는 일정 비율로 그려진 것이 아님을 알아야 한다.

도 2는 pCG374 및 pCG375의 제작 경로를 개략적으로 나타낸다.

도 3은 플라스미드 pCG532의 맵을 나타낸다.

도 4는 실시예 10에 따른 플라스미드 pCG366 (nrdCABtd)을 함유하는 재조합 대장균 균주 CMG2451 (Ung⁺) 및 CMG2492 (Ung^-)의 배양 및 이에 의한 티미딘 생산을 나타낸다.

도 5는 30 ℓ 발효조에서 대장균 CMG2451 (pCG532)에 의한 티미딘 생산을 나타낸다.

도 6은 실시예 12의 정제 프로토콜에 따라 얻어진 TdR 및 UdR (mg/L)을 나타낸다.

실시예 1

T4 nrd CAB 유전자의 클로닝 및 활성 증명

박테리오파지 T4nrdAB 유전자는 단리된 파지 T4 DNA로 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하여 클로닝하였다.nrdA 유전자의 PCR 프라이머는

5'-TAT TCT AGA CGA TTT TCA AGT TGA GGA CTT ATG C-3' (서열 1); 및

5'-TAT ATC GAT AAT TCA TTA CAA TTT ACA CGC TGC AC-3' (서열 2)

였다.

제한 부위 XbaI은 증폭된 DNA의 시작부위에 도입하고, ClaI은nrdA의 3' 말단에 도입하였다.nrdB 유전자의 PCR 증폭 프라이머는

5'-TAT ATC GAT AAA TGT AAA TTT AAG GAT TCT AAA TG-3' (서열 3) 및

5'-TAT GTC GAC TCC TTA AAA GTA TTT TTT AAA ACT C-3' (서열 4)

였다.

따라서, 제한 부위 ClaI이nrdB의 시작 부위에 도입되었으며, ApaI이 증폭된 DNA의nrdB 말단에 도입되었다. PCR 단편을 당업계에 공지된 기술에 따라 도 1에 도시된 바와 같이 클로닝하였다. 클로닝한nrdAB 유전자는 효소 활성 분석법으로 확인하였다. T4nrdC 유전자를 pKC30에 클로닝하여 플라스미드 pDL51을 제조하고 [LeMaster, D. M., J. Virology 59: 759-760,1986], T4nrdC 유전자는 디. 르마스터 (D. LeMaster) (Dept of Biochem., Univ. Wisconsin, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터 제공받았다. 유전자를 도 1에 도시된nrdAB 유전자를 포함하는 플라스미드로 서브클로닝하였다. 도 1에 사용된 출발 물질의 공급원 및 기본 정보는 표 1에 나타내었다.

합성 전사 종결자를 사용하여 pCG198 및 pCG301을 제작하였다 (도 1 및 표 1 참조). 구체적으로, 스트라타진 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)으로부터 구입한 플라스미드 pBC sk⁺를 제한 효소 ApaI 및 Asp718I로 절단하였다. 이어서, ECOTGP 전사 종결 서열 [d'Aubenton Carafa et al., J. Mol. Biol. 216: 839-843,1990]를 함유하는 합성 DNA를 라이게이션시켜 ApaI 및 Asp718I 엔도뉴클레아제 부위 사이의 본래 서열을 대체하였다. 상기 단편은 새로운 플라스미드에서 ApaI 인식 서열을 재생하였으나 Asp718I을 제거하였다. 삽입된 DAN는 두개의 올리고뉴클레오티드로부터 생성된 다음 조성을 갖는다.

5'-CGAGC CCGCCTAATG AGCGGGCTTT TTT TT-3' (서열 5)

3'-CCGGGCTCG GGCGGATTAC TCGCCCGAAA AAAAACATG-5' (서열 6).

도 1에 나타낸 바와 같이 플라스미드 pCG198을 플라스미드 pKC30으로부터 pBluescript 11 ks (Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)로 클로닝된 람다 P_L프로모터를 함유하는 pCG173과 결합시켰다. pCB198 및 pCG173 모두를 HindIII 및 AsnI으로 절단시킨 후 람다 P_L프로모터, 다수의 제한 효소 클로닝 부위에 이어 트립토판 오페론 리더 펩티드 영역으로부터 복사된 ECOTGP 종결자 서열을 함유하는 새로운 플라스미드 pCG301을 생성하였다.

T4 리보뉴클레오티드 리덕타제 활성은 방사선 동위원소 및 UDP 기질을 사용하지 않는 방법으로 HPLC에 의해 측정하였다. 직접적인 리보뉴클레오티드 리덕타제 분석법은 1 mM NADPH, 1 mM DTT, 0.5 mM dATP, 0.6 mM UDP, 20 mM Tris (pH 8.0) 및 5 mM MgCl₂를 포함하였다. 상기 조건하에서, 대장균 리보뉴클레오티드 리덕타제는 억제되어 검출되지 않았다. 효소 반응 (100 ㎕)은 50% 트리클로로아세트산 (TCA) 10 ㎕를 첨가하여 정지시켰다. 빙상에서 10분 후에, 시료를 마이크로원심분리기로 원심분리하였다. 상등액을 디에틸에테르로 4회 추출하여 TCA를 제거하였다. Tris 완충액 (1.0 M pH 8.0) 5 ㎖를 첨가한 후 40 mg/㎖ 방울뱀 독액 (rattle snake venom, 시그마(Sigma) 제품) 2 ㎕를 첨가하고, 시료를 37℃에서 60분간 인큐베이션하였다. 이어서 시료를 70℃에서 3분간 가열시킨 후 5분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 부피를 균일하게 한 후 UV 검출기가 장착된 HPLC, 및 표준 물질로서 데옥시유리딘을 이용하여 분석하였다. 컬럼은 12 mM 암모늄 포스페이트 (pH 5.0) 이동상 및 1.0 ㎖/분 유속을 사용하는 스페리소브 (Spherisorb) ODS-2, 5 마이크론, 250 mm × 4.6 mm였다. 결과는 표 2에 나타내었으며, 플라스미드 pCG343을 함유하는 세포가 T4 리보뉴클레오티드 리덕타제를 기능적으로 발현하였음을 증명하였다.

리보뉴클레오티드 리덕타제 활성
균주	유도조건	비활성nmol/10분/mg 단백질
CMG1093	비유도	0
CMG1093	유도	0
CMG1093/pCG343	비유도	0
CMG1093/pCG343	유도	704.7

실시예 2

균주 CMG1115로부터 숙주 균주 CMG2451의 유도

균주 CMG1115는 문헌 [McCandliss & Anderson (미국 특허 제5,213,972호)]에 충분히 기재되어 있다. CMG1115를 본원에 기재된 발명의 출발점으로 사용하였다. 균주 CMG1115를 30 mg/ℓ의 5-플루오르유리딘 함유 배지에서의 성장에 대해 선별함으로써 티미딘 생산성을 향상시켜, 균주 CMG2401을 얻었다. 이어서, 균주 CMG2401을 30 mg/ℓ의 3'-아지도-3'-데옥시티미딘 함유 배지에서의 성장에 대해 선별하여 균주 CMG2404를 얻었다. CMG2404는 본래 모균주인 JM101로부터 유전된 돌연변이 △(lac-pro)로 인해 성장시 L-프롤린을 요구한다. CMG2404와 Hfr 균주 CAG5053 (Singer, M. et al. Microbiological Review: 5: 1-24,1989)를 당업계에 공지된 기술에 따라 Hfr 교배시켜 Lac⁺, Pro⁺인 균주 CMG2434를 얻었다. CMG2434의udp(유리딘 포스포릴라제) 돌연변이는 여전히 유리딘 포스포릴라제 활성을 부분적으로 가지며, 이것은 티미딘 생산을 유도한 후 티미딘 축적을 기초로 하여 입증된다.udp돌연변이는 당업계의 공지된 기술에 따라 파지 P1 형질도입에 의해 CGSC5128 (이. 콜라이 제네틱 스톡 센터 (E.coli Genetic Stock Center, Yale University)로부터 재도입될 수 있다. 우선 균주 CAG18491로부터metE3079:: Tn10를 CMG2434로 형질도입시켜udp의 형질도입에 대한 양성 선택 마커로 사용한다. 이어서,udp-1을 균주 CMG2434의metE3079:: Tn10 유도체로 형질도입하여, 소정의 배지에서 L-메티오닌없이 성장하는 것을 선별하였다.udp-1 유도체를 균주 CMG2451로 명명하였다. CMG2451의 계보를 표 3에 요약하였다.

대장균 숙주 균주 CMG2451의 계보
균주	유전자형	유래^a
CMG1115	CMG1116 (Tn5::dTMPase kan^R)	G132로부터 Tn5::dTMPase 삽입
CMG2401	CMG1115 FUdR^R	5-플루오로-2'데옥시유리딘 내성
CMG2404	CMG2401 AZT^R	3'-아지도-3'데옥시티미딘 내성
CMG2434	CMG2404 Lac⁺Pro⁺	CAG5053^b와의 접합에 의한 리페어△(lac-proAB)
CMG2448	CMG2434metE3079:: Tn10	CAG18491^b로부터metE3079::Tn10
CMG2451	CMG2448udp-1metE⁺tet^s	CGSC5128^c로부터udp-1 및 대체된metE3079::Tn10

a. 경우에 따라, 돌연변이를 파지 P1 형질도입에 의해 대장균 균주에 도입하였다. 돌연변이가 선택 마커인 경우, 직접 P1 형질도입에 사용하였다. 돌연변이가 선택 마커가 아닌 경우, Tn10를 인접하게 삽입하여 P1 동시 형질도입을 사용하였다.

b. 문헌 [Singer, M., et al. Microbiological Review: 53: 1-24,1989]

c. 모든 CGSC 이. 콜라이 제네틱 스톡 센터 (E.coli Genetic Stock Center, Yale University, P.O. Box 208104, New Haven, CT 06520-8104)로부터 입수하였다.

실시예 3

티미딘 생산 플라스미드로의 T4 td 유전자 클로닝 및 발현

T4td유전자를 1017 염기쌍의 인트론 없이 문헌 [West et al. (J. Biol. Chem 261: 13446-13450,1986)]에 따라 pKTd△I에 클로닝하였다.td유전자를 링커로서 다음 서열의 두개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 서브클로닝하였다:

5'-GAT CCG GAG GAT AAA TGA AAC AAT ACC AAG ATT TAA T-3' (서열 7); 및

5'-TAA ATC TTG GTA TTG TTT CAT TTA TCC TCC G-3' (서열 8).

생성된 플라스미드는 pCG356이었다. 이어서, pCG356으로부터td유전자를 pCG343에 서브클로닝하여 pCG360을 제조하였다 (도 1). pBR322 (Bolivar, F. et al., Gene 2: 95-113,1977)으로부터 테트라사이클린 내성 유전자 및 플라스미드 복제 기점을 pCG360에 서브클로닝하여 pCG366을 형성하였다. 티미딜레이트 신타제 활성을 문헌 [Wahba 및 Friedkin (J. Biol. Chem. 236: PC11-PC12,1961)]의 분광분석법에 의해 측정하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.

티미딜레이트 신타제 활성
균주	비활성△OD340/mg 단백질/분
CMG1093	-0.72
CMG1093/pKTdDI	3.24
CMG1093/pCG356	3.45
CMG1093/pCG360	1.43

실시예 4

티미딘 생산 및 데옥시유리딘 감소시 T4 td 효과를 나타내는 진탕 플라스크 데이타

진탕 플라스크 발효를 이용하여 상이한 대장균 재조합체의 티미딘 생산성을 평가하였다. 본 실시예 및 다른 실시예에서 사용한 진탕 플라스크 발효 브로쓰 및 방법은 하기 실시예 6에 기재하였다. 이때, 플라스크 당 20 ㎖ 부피를 2 ㎖ 씨드 (seed) 배양으로 접종하고 30℃ 진탕 배양기에서 배양하였다. OD 600nm가 약 10이 되었을 때, 플라스크를 37℃ 진탕 배양기로 옮겨 30분 동안 λP_L프로모터를 마일드하게 유도하였다. 이어서, 플라스크를 35℃ 진탕 배양기로 옮겨 발효를 계속하였다. 필요한 때 발효시 글루코스를 첨가하고 페놀 레드 색깔에 따라 암모니아로 pH를 약 7로 적정하였다. 티미딘 농도는 스페리소브 (Spherisorb) ODS-2, 5 마이크론, 250-mm ×4.6 mm 컬럼, 및 25 mM 암모늄 포스페이트 (pH 3.3) 이동상, 유속 약 1.5 ㎖/분을 사용하는 HPLC에 의해 측정하였다.

균주 CMG2451/pCG366 (T4nrdCAB,td)를 진탕 플라스크 발효에 있어 CMG2451/pCG343 (T4nrdCAB)과 비교하였다. 표 5는 데옥시유리딘 농도가 감소되어 었으며, 데옥시유리딘이 균주 CMG2451/pCG366에서 T4td유전자로 인해 티미딘으로 전환되었다는 것을 보여준다.

66시간에 티미딜레이트 신타제의 티미딘 생산 효과
균주	티미딘 (mg/ℓ)	데옥시유리딘(mg/ℓ)	% 데옥시유리딘
CMG2451/pCG343	1198	1728	144.2
CMG2451/pCG366	3327	206	6.2

실시예 5

⁷⁹ Ala에서 Ile로의 T4 리보뉴클레오티드 리덕타제 돌연변이체의 제작

돌연변이를 문헌 [Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492,1985)]에 기재된 방법에 기초한 위치 지정 돌연변이유발법을 이용하여 도입하였다. pTZ18U 파지미드 DNA, M13KO7 헬퍼 파지, 박테리아 균주 대장균 CJ236 및 MV1190, T7 DNA 폴리머라제 및 T4 DNA 리가제 등의 돌연변이체 제작에 사용한 모든 재료는 바이오-라드 라보라토리스 (Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)로부터 구입한 Muta-Gene 시험관내 돌연변이유발 키트에 제공되어 있다. 먼저, T4 박테리오파지의nrdA 유전자를 함유하는 Xbal/HindIII DNA 단편을 플라스미드 pCG312 (ChemGen Corp., 상기 표 1)로부터 단리하였다. XbaI/HindIII DNA 단편을 표준 프로토콜 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)]을 이용하여 pTZ18U 파지미드 벡터의 XbaI/HindIII 부위에 클로닝하였다. 삽입체를 포함하는 파지미드 pCG464를 대장균 CJ236에 도입하였다. 상기 균주는 dUTPase (dut) 및 유라실-N-글리코실라제 (ung)가 결여되어 새로 합성된 DNA에 티미딘을 유라실로 경우에 따라 치환시킨다. 유라실을 함유하는 pCG464의 단일 가닥 DNA는 바이오-라드 라보로토리스 사용 방법에 따라 CJ236으로부터 단리하였다. 상기 DNA (0.2 pMole)를 본래⁷⁹Ala 대신에 Ile를 코딩하는 목적하는 돌연변이 (밑줄) 서열을 함유하는 인산화된 프라이머 5'-AGC AAA CAT TAA ACA GCG TGCAATTAC ATA TTG ATA ATC AGG TTC-3' (서열 9) 6 pMole과 어닐링시켰다.

상보 가닥 DNA를 바이오-라드 프로토콜에 기재된 바와 같이 T7 DNA 폴리머라제를 사용하여 합성하였다. 반응 산물을 유라실을 함유하는 모 가닥을 분해하는 야생형 유라실-N-글리코실라제를 함유하는 대장균 MV1190에 형질전환시켜, 돌연변이 가닥을 증가시켰다. 프로메가 (Promega Corp, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터 구입한 실버 시퀀스 DNA 시퀀싱 시스템 (Silver Sequence DNA Sequencing System)을 이용한 직접적인 DNA 서열분석으로 목적하는 돌연변이를 함유하는 플라스미드를 확인하였다. 4개의 분석된 모든 형질변환체가 돌연변이를 갖는 플라스미드를 포함한 것으로 나타났다. 이중 하나를 pCG492로 명명하고 이후의 실험에 사용하였다. 돌연변이가 티미딘 합성에 영향을 주는지를 확인하기 위해서 생산 플라스미드 pCG366 (ChemGen Corp., 표 1 및 도 1)에 도입하였다. 이를 위해,nrdA 유전자의 5'-부분을 함유하는 pCG366의 KpnI/AflII DNA 단편을 돌연변이를 함유하는 pCG492로부터 KpnI/AflII 단편으로 대체하였다. 새로운 플라스미드 pCG494를 생산 균주 CMG2451 (ChemGen Corp., 상기 실시예 2 및 표 4)에 도입하였다. T4nrdA 돌연변이의 효과를 하기 실시예 6 에 나타낸 CMG2451 (pCG494) 및 CMG2451 (pCG366)에 의한 티미딘 생산과 비교하여 평가하였다.

실시예 6

CMG2451 (pCG366) 및 CMG2451 (pCG494)을 이용한 티미딘 생산을 위한 진탕 플라스크 발효

생산 배지 25 ㎖를 함유하는 250 ㎖ 배플 플라스크에 적합한 항생제를 첨가한 LB 브로쓰에서 새로 배양한 씨드 (seed) 배양물 2 ㎖로 접종하였다. 배양물을 30℃ 진탕 배양기 250 rpm에서 배양하였다. OD₆₀₀이 약 5에 이르면, 플라스크를 37℃ 진탕 배양기에 30분간 옮겨 두었다. 이어서 플라스크를 35℃ 진탕 배양기에서 계속하여 발효시켰다. 생산 배지의 조성 (g/ℓ)은 다음과 같다: 아다민 (Ardamine) YEP-S (레드 스타 이스트 & 프로덕츠 (Red Star Yeast & Products) 미국 위스콘신주 밀워키 소재)-10; CaCO₃-10; MgSO₄-0.4; 페놀 레드-0.24; PP90BT(DMV International, Fraser, N.Y.)-4.5; 소르비톨-20; 클로르암페니콜-0.03; 미량 요소 (1000 ×)-1 ㎖/ℓ. 미량 원소 (1OOO ×) 조성물은 붕산-0.05; 염화칼슘-20; 황산코발트-0.05; 황산구리-0.01; 황산철 (I)-20; 염화철 (II)-20; 황산마그네슘-0.5; 몰리브덴산나트륨-0.1; 및 황산아연-0.1였다. 유도시 아다민 YEP-S를 1리터 당 10 그람 첨가하였다. 글루코스는 평균 매 2시간마다 (2.5 g/ℓ) 발효하는 동안 첨가하였다. 플라스크 내 pH는 4N NH₄0H를 첨가하여 페놀 레드 지시 염료로 판단하여 약 7.0을 유지하였다. 시료를 배지 내에 염을 용해시킨 10 mM H₂SO₄에 1:10으로 희석한 후 OD₆₀₀을 측정하였다. 티미딘 농도는 알테크 스페리소브 (Alltech Spherisorb) ODS-2 컬럼 및 시마주 (Shimadzu) 분광분석 검출기 260 nm가 장착된 역상 C-18 HPLC로 측정하였다. 이동상은 1.5 ㎖/분의 일정한 속도로 물 중의 25 mM NH₄H₂PO₄(pH 3.3)였다.

유도 후 2, 17 및 25 시간 후에 CMG2451 (pCG366) 및 CMG2451 (pCG494)에 의한 티미딘 생산 결과를 표 6에 나타내었다. 이 실험을 2개의 플라스크로 반복하였으며 두개의 플라스크 사이의 차이는 15%를 넘지 않았다. 결과는 T4nrdA 돌연변이체가 야생형nrdA 균주보다 더 많이 생산하였음을 나타내었다. 이것은 동일한 박테리아 균주를 이용한 몇몇 독립적인 플라스크 실험에서 확인되었다.

CMG2451 (pCG366) 및 CMG2451 (pCG494)에 의한 티미딘 생산
균주	2시간	17시간	25시간
균주	비활성(mg/ℓ/OD)
CMG2451 (pCG366)	6.1	32.5	43.1
CMG2452 (pCG494)	8.5	36.1	51.4

실시예 7

티미민 생산에 대한 대장균 udk 유전자의 효과를 증명하기 위한 진탕 플라스크 발효

dcd유전자 또는dcd udk오페론을 pACYC177 벡터에 클로닝하였다. p15a 복제 기점을 갖는 상기 벡터는 pCG366와 같은 colE1 기재 플라스미드와는 상이하므로 상용성이며, colE1 기재 플라스미드를 포함하는 동일한 숙주 내에서 유지될 수 있다. pCG374 (udk dcd) 또는 pCG375 (dcd)를 생성하는 플라스미드 제작에 대한 상세한 내용은 도 2에 도시하였다. 이들 플라스미드 상의 유전자는udk dcd오페론의 대장균 프로모터로부터 발현된다.

암피실린 내성 선별법을 이용하여 플라스미드 pCG374 및 pCG375를 CMG2451 (pCG366) 내로 도입하여 실시예 6에 기재된 진탕 플라스크 발효법으로 티미딘 생산에 대한 효과를 시험하였다. 몇몇 시점에서의 결과를 표 7에 나타내었다. 비활성 (세포 OD 당 티미딘)은udk유전자가 존재하는 경우나 존재하지 않는 경우 모두 유사하였으나, 제2 플라스미드 pCG374상에udk유전자를 갖는 세포가 밀도 높은 세포 밀도로 성장하였으며 훨씬 더 많은 티미딘 (dcd만의 제2 플라스미드를 포함하는 균주의 경우 3.0 g/ℓ에 비해 5.8 g/ℓ)을 생산하였다. 유리딘 포스포릴라제가 이러한 영향을 주었는지 분명하지 않았기 때문에 이러한 결과는 예상하지 못하였다.

상기 데이타 및 다른 정보를 기초로 하여,udk유전자를 선택하여 대장균dcd유전자와 함께 도입하여 플라스미드 pCG532를 제작하였다 (실시예 8 및 도 3참조).

CMG2451 (pCG366)의 기본적인 티미딘 생산에 대한dcd또는dcd udk를 포함하는 제2 플라스미드의 효과 비교
시간 (hr)	O.D.600	티미딘 (mg/ℓ)	비 티미딘 (mg/ℓ/OD)
기본 균주 및 플라스미드	CMG2451(pCG366)	CMG2451(pCG366)	CMG2451(pCG366)	CMG2451(pCG366)	CMG2451(pCG366)	CMG2451(pCG366)
제2 pACYC 177 기재 플라스미드	dcd udk를 포함하는 pCG374	dcd를 포함하는 pCG375	dcd udk를 포함하는 pCG374	dcd를 포함하는pCG375	dcd udk를 포함하는 pCG374	dcd를 포함하는pCG375
8 hr	29.112	29.94	889	884	30.5	29.5
18 hr	40.206	32.946	1721	1608	42.8	48.8
42 hr	48.348	33.96	4020	2740	83.1	80.7
66 hr	57.498	28.614	5804	3012	100.9	105.3

실시예 8

생산 플라스미드 pCG494로의 대장균 udk dcd 오페론의 클로닝

대장균의udk및dcd유전자는 피리미딘 리보뉴클레오티드 키나제 및 dCTP 데아미나제를 각각 코딩한다. 두 유전자 모두를 람다 파지 355의 코하라 (Kohara) 게놈 라이브러리 [Kohara, Y., Akiyama, K. and Isono, K., Cell 50,495-508,1987]의 3.4 kb BamHI/PstI DNA 단편에 맵핑하였다.udk는dcd상류에 존재하고dcd와 동일한 방향으로 전사되는 것으로 나타났다 [Neuhard, J. and Tarpo, L., J. Bacteriol. 175: 5742-5743,1993]. 유전자를 생산 플라스미드에 두 단계로 클로닝하였다.

먼저, 람다 355의 3.4 kb BamHI/PstI DNA 단편을 플라스미드 pUC18 (Yamisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J., Gene 33: 103-109,1985)의 다수 클로닝 부위에 클로닝 (플라스미드 pCG358)하였다. 이어서, BamHI 및 SphI으로pCG358의 폴리링커 영역으로부터 단편을 절단하여 생산 플라스미드 pCG494의 0.7 kb BglII/SphI 단편 (테트라사이클린 내성 유전자의 일부를 함유)을 대체하여 클로닝하였다. 최종 14.7 kb 플라스미드 pCG532는 colE1 상용성 군의 복제 기점, 클로르암페니콜 내성 유전자,udk및dcd유전자 및 박테리오파지 람다의 P_L프로모터 조절하에 있는 T4 박테리오파지nrdCAB (티오레독신 및 리보뉴클레오티드 리덕타제의 두개 서브유닛을 각각 코딩) 및 T4td(티미딜레이트 신타제 코딩) 유전자를 함유하였다. pCG532의 T4nrdA 유전자는 위치 지정 돌연변이유발법에 의해 먼저 변경시켰다 (⁷⁹Ala에서 Ile).

합성 전사 종결자는td유전자의 하류에 위치하여 복제 영역으로 전사하여 통과하는 것을 방해한다. 플라스미드 pCG532의 유전자 지도는 도 3에 도시하였다.

실시예 9

CMG2451 (pCG494) 및 CMG2451 (pCG532)에 의한 티미딘의 진탕 플라스크 발효

대장균의udk및dcd유전자를 함유하는 플라스미드 pCG532를 생산 균주 CMG2451에 도입하였다. 새로운 균주 (pCG494)를 모균주 CMG2451 (pCG494)와 진탕 플라스크 실험으로 시험하여 티미딘 생산을 비교하였다. 두개의 독립적인 실험을 표 8에 나타내었다. 제1 실험을 상기한 바와 같이 수행하고 시료를 유도 후 17시간에 취하였다. 제2 실험에서, 세포를 높은 OD (약 9)에서 유도시키고 분석을 위해 유도 후 3시간에 시료를 취하였다. 두 경우에 모두, 클로닝한udk및dcd유전자를 함유하는 균주가 모균주보다 더 많은량을 생산하였다.

CMG2451 (pCG494) 및 CMG2451(pCG532)에 의한 티미딘의 발효
실험 1
균주	O.D 600	TdR (mg/ℓ)	비활성 (mg/ℓ/OD)
CMG2451 (pCG494)	16.5	599	36.3
CMG2451 (pCG532)	17.5	867	49.5

실험 2
균주
CMG2451 (pCG494)	8.5	149	17.5
CMG2451 (pCG532)	8.4	192	22.8

실시예 10

ung 돌연변이의 첨가 및 진탕 플라스크 발효시 티미딘 생산에 대한 그의 효과

유라실 DNA 글리코실라제 음성 균주를 상기한 P1 형질도입을 이용하여ung:: Tn1O (Varshney, U., et al., J. Biol. Chem. 263: 7776-7784,1988) 돌연변이를 숙주 CMG2451에 도입하여 제작하고, CMG2492로 명명하였다. 플라스미드 pCG366을 CMG2492에 도입하였다. 실시예 6에 기재된 플라스크 방법을 이용하여 진탕 플라스크에서 티미딘 합성에 대한 Ung^-및 Ung⁺균주의 비교 실험을 도 4에 나타내었다. 세포를 30℃에서 250 ㎖ 플라스크 중에서 배양하고 37℃으로 변화시켜 30분간 티미딘 합성을 유도한 후 35℃로 변화시켰다. 유라실 DNA 글리코실라제가 결여된 Ung^-숙주가 더 오래 성장하였으며 티미딘은 30% 더 생산하였다.

실시예 11

균주 CMG2451 (pCG532)을 이용한 30 리터 발효조에서 티미딘 생산

다음 조건을 사용하여 균주 CMG2451/532로 30 리터 발효조 (B. Braun BiotecBiostat C)에서 티미딘을 생산하였다. 씨드 배양 (500 ㎖)을 30 mg/ℓ 클로르암페니콜 및 25 mg/ℓ 카나마이신이 첨가된 LB 배지 (5 g/ℓ 디프코 (Difco) 효모 추출물, 10 g/ℓ 디프코 (Difco) 트립톤, 5 g/ℓ NaCl) 중의 4 리터 배플 진탕 플라스크에서 OD 600 nm 2.37, 최종 pH 6.69에 이를 때까지 30℃에서 배양하였다.

표 9에 열거한 조성을 함유하는 발효조 (12 리터) 내의 초기 배치를 121℃에서 55분간 멸균하였다. 냉각시킨 후 별도로 오토클레이브한 (500 ㎖)를 첨가하여 배치를 20 g/ℓ 소르비톨 및 3.0 g/ℓMgS0₄7H₂0가 되도록 조정하였다. 초기 배치를 30 mg/ℓ 클로르암페니콜, 25 mg/ℓ 카나마이신, 1 mg/ℓ d-비오틴, 10 mg/ℓ 티아민 및 10 mg/ℓ 니코틴산이 되도록 조절되도록 멸균 여과 용액 (200 ㎖)를 첨가한 후 접종하였다.

세가지 공급 용액을 제조하였다: a) 2 mg/ℓ 비오틴, 20 mg/ℓ 티아민, 20 mg/ℓ 니코틴산, 및 30 mg/ℓ 클로르암페니콜을 포함한 세렐로스 (Cerelose) 2001 (덱스트로스 일수화물) 562 g/ℓ; b) 4 mg/ℓ 비오틴, 40 mg/ℓ 티아민, 40 mg/ℓ 니코틴산, 및 60 mg/ℓ 클로르암페니콜을 포함한 소르비톨 717 g/ℓ; 및 c) 360 g/ℓ 암버렉스 (Amberex) 695 AG (레드 스타 이스트 & 프로덕츠 (Red Star Yeast & Products) 미국 위스콘신주 밀워키 소재)를 함유하는 질소 조혼합물, 1 × 미량 원소를 포함한 6 g/ℓ PP90M (DMV 인터내셔날 (DMV International), 미국 뉴욕주 프라서 소재) 및 0.1 ㎖/ℓ 마주 (Mazu) DF1 OPMOD11 (BASF). 공급 용액을 18 PSI 증기압하에서 40 내지 50분간 멸균하였다.

30 ㎖ 발효조 중의 초기 배치 조성
성분	농도 (g/ℓ또는 ㎖/ℓ)
소듐 헥사메타포스페이트	4
KH₂PO₄	4
(NH₄)₂HP0₄	4
CaCl₂	0.4
시트르산	0.5
Amberex 695 (레드 스타 이스트 & 프로덕츠 (Red Star Yeast & Products) 미국 위스콘신주 밀워키 소재)	20
PP90M (DMV 인터내셔날 (DMV International), 미국 뉴욕주 프라서 소재)	15
트립톤(디프코 (Difco), 미국 미시건주 디트로이트 소재)	5
1000 ×미량 원소 (실시예 7 참조)	1 ㎖/ℓ
CaCO₃	5
글리신	1.83
Mazu DF10PMOD11 제포제 (BASF 0.2 mL/ℓ스페셜티 프로덕츠 (Speciality Products), 일리노이주 거니 소재)	0.2 ㎖/ℓ

작동 조건은 초기 온도 31℃; RPM 600; 기류 3 LPM; pH 6.8; 압력 0 Bar였다. 용존 산소는 기류 속도 제어 루프를 이용하여 25% 포화도로 조절하였다. RPM을 8시간에 750 RPM으로, 9시간에 850 RPM, 배양이 OD 37.8에 이르렀을 때인 9.2 시간에 31℃에서 35℃로 변화시키고 950 RPM으로 증가시켰다. 9.7 시간에 시작하여 백 (back) 압력을 배양물로 산소 전달을 이용하여 최대 0.6 Bar를 인가하였다. 티미딘 합성 유도를 위한 온도 변화율을 1분에 0.2℃였다.

세포 질량이 OD 600 nm (50 mM H₂SO₄to중에 희석하여 염을 용해시킨 후에 측정)이 20에 이른 후 세포 질량이 각각 OD 5 증가시 소르비톨 공급 용액 (b)를 85 ㎖ 배치를 공급하였다. 16.7 시간에 소르비톨 배치 공급을 정지시키고 25%로 설정된 발효조 (B. Braun fermentor)의 DO PID 제어 루프 조절하에 덱스트로스 일수화물 (글루코스) 공급 (a)을 개시하였다. 간단히 언급하자면, 용존 산소는 25% 미만일 때 당 공급을 중지시키고, 용존 산소가 25%보다 큰 경우 당 공급을 개시하였다. 프로토콜 자체는 글루코스 농도를 낮게 유지하지만, 배양물에 매우 장시간 동안 글루코스가 고갈되지 않도록 하였다. 조 질소 (500 ㎖)를 11 시간, 16.2 시간, 21.2 시간, 28.2 시간, 33.2 시간 및 40.5 시간에 공급하였다.

발효 동안 세포 질량, 티미딘 및 데옥시유리딘 축적을 도 5에 나타내었다.

실시예 12

발효 브로쓰로부터 티미딘의 정제

도웩스 옵티포어 (Dowex Optipore) L-285 (다우 케미칼 캄파니 (Dow Chemical Company))를 탈이온수에 현탁시켜 48 mm 직경의 유리 컬럼에 채워 약 500 ㎖의 베드 부피를 제조하였다. 컬럼을 5% NaOH 500 ㎖로 세척하고 용출액이 pH 7.0이 될 때까지 탈이온수로 세척하였다.

티미딘 (TdR) 농도 4.890 g/ℓ 및 데옥시유리딘 (UdR) 농도 1.040 g/ℓ를 포함하는 500 ㎖ 발효 브로쓰를 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 베드 부피 2배의 탈이온수로 세척하였다. TdR 및 UdR을 베드 부피 2배의 5% 알콜 시약 (에탄올 90.5%, 메탄올 4.5%, 이소프로필 알콜 5%)에 이어 베드 부피 2배의 10% 알콜 시약 및 베드 부피 2배의 15% 알콜 시약으로 용출하였다. 25 ㎖ 분획 중의 TdR 및 UdR은 도 6에 나타내었다. 컬럼을 5% NaOH, 이어서 탈이온수로 pH 7.0이 되도록 세척하여 재생시키고 상기 과정을 반복하였다. 2회의 별도 시행으로부터 분획 91 내지 160을 함께 모아 회전 진공 증발기를 사용하여 건조시켰다. 티미딘을 최소량의 열수에 재용해시키고 4℃에서 결정화하였다. 이어서, 결정을 2회 재결정화시키고 55℃ 오븐 내에서 15 시간 동안 건조 시켰다. 총 979.8 mg의 결정성 티미딘을 제약 중간체로서 사용하기에 적합한 99%를 넘는 순도로 수득하였다.

데옥시유리딘 및 티미딘을 모두 함유하는 인접 분획을 모액과 함께 모아 회전 진공 증발기로 알콜을 감소시켜 최종 부피 1200 ㎖가 되도록 하였다. 상기 1200 ㎖ 용액 중의 TdR의 총량은 3571 mg였다. 총 회수율 (TdR 인접 분획의 3571 mg을 포함하여) 93.1% 였다.

Claims

리보뉴클레오티드 리덕타제 유전자 및 티오레독신 유전자 또는 유리딘 키나제 유전자 및(또는) dCTP 데아미나제 유전자를 포함하는 전사 단위를 포함하는 DNA 구조물.
제1항에 있어서, 전사 단위가 리보뉴클레오티드 리덕타제 유전자 및 티오레독신 유전자를 포함하는 DNA 구조물.
제1항에 있어서, 전사 단위가 유리딘 키나제 유전자 및(또는) dCTP 데아미나제 유전자를 포함하는 DNA 구조물.
제1항에 있어서, 전사 단위가 유리딘 키나제 유전자 및 dCTP 데아미나제 유전자를 포함하는 DNA 구조물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 염색체 외부 (extrachromosomal)의 벡터인 DNA 구조물.
제5항에 있어서, 벡터가 플라스미드, 바이러스, 트란스포손, 미니염색체 또는 파지인 DNA 구조물.
제6항에 있어서, 벡터가, 리보뉴클레오티드 리덕타제 유전자가nrdA 유전자 및(또는)nrdB 유전자이고, 티오레독신 유전자가nrdC 유전자이며, 이 유전자들이 하나의 오페론에 배열되어 있는 플라스미드인 DNA 구조물.
제7항에 있어서, 전사 단위가nrdA 유전자 및nrdB 유전자를 포함하는 DNA 구조물.
제8항에 있어서,nrdA 및nrdB 유전자가nrdC 유전자의 하류에 위치한 DNA 구조물.
제8항에 있어서,nrdC 유전자가nrdA 유전자의 상류에 있고,nrdA 유전자가nrdB 유전자의 상류에 있는 DNA 구조물.
제6항에 있어서, 조절 요소를 추가로 포함하는 DNA 구조물.
제11항에 있어서, 조절 요소가 프로모터, 오퍼레이터, 종결 서열, 개시 서열 및 리보솜 결합 부위로 구성된 군에서 선택된 것인 DNA 구조물.
제12항에 있어서, 프로모터가 람다 P_L프로모터 또는 이로부터의 유도체인 DNA 구조물.
제12항에 있어서, 종결 서열이 합성 종결자인 DNA 구조물.
제7항에 있어서, 상기 단위에 의해 코딩되는 리보뉴클레오티드 리덕타제가 미변형nrdA 유전자를 포함하는 단위에 의해 코딩되는 리보뉴클레오티드 리덕타제에 비해 알로스테릭 억제에 대한 감수성이 약하도록nrdA 유전자가 변형된 DNA 구조물.
제15항에 있어서,nrdA 유전자가 dTTP 결합 부위에서 변형된 DNA 구조물.
제15항에 있어서,nrdA 유전자가nrdA 발현 생성물의 위치 79에서 Ala을 Ile으로 변화시켜 코딩하도록 변형된 DNA 구조물.
제7항에 있어서,nrdA,nrdB 및nrdC 유전자가 T 파지로부터 유래된 것인 DNA 구조물.
제18항에 있어서, T 파지가 T 짝수 파지인 DNA 구조물.
제19항에 있어서, T 짝수 파지가 T4 파지인 DNA 구조물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 티미딜레이트 신타제 유전자를 추가로 포함하는 DNA 구조물.
제21항에 있어서, 티미딜레이트 신타제 유전자가td유전자인 DNA 구조물.
제22항에 있어서,td유전자가nrdA,nrdB 및nrdC 유전자와 동일 벡터 상에 위치한 DNA 구조물.
제22항에 있어서,td유전자가nrdA,nrdB 및nrdC 유전자와 동일 오페론 상에 위치한 DNA 구조물.
제24항에 있어서,td유전자가nrdA,nrdB 및nrdC 유전자의 하류 (리딩 프레임의 측면에서)에 위치한 DNA 구조물.
제22항에 있어서,td유전자가 T 파지로부터 유래된 것인 DNA 구조물.
제26항에 있어서,td유전자가 T 짝수 파지로부터 유래된 것인 DNA 구조물.
제27항에 있어서,td유전자가 T4 파지로부터 유래된 것인 DNA 구조물.
제2항에 있어서, 유리딘 키나제 유전자 및(또는) dCTP 데아미나제 유전자를 추가로 포함하는 DNA 구조물.
제29항에 있어서, 유리딘 키나제 유전자 및 dCTP 데아미나제 유전자 모두를 포함하는 DNA 구조물.
제1항, 제3항, 또는 제4항에 있어서, 유리딘 키나제 유전자가udk유전자인 DNA 구조물.
제1항, 제3항, 또는 제4항에 있어서, dCTP 데아미나제 유전자가dcd유전자인 DNA 구조물.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조물을 포함하는 변형된 숙주 세포.
제33항에 있어서, 유라실 DNA 글리코실라제 활성이 저해되거나 전혀 없는 변형된 숙주 세포.
제34항에 있어서, 유라실 DNA 글리코실라제 활성을 코딩하는 숙주 세포 DNA 서열 하나 이상이 유라실 DNA 글리코실라제 활성이 저해되거나 낮은 수준으로 나타내는 발현 생성물을 코딩하도록 변형된, 변형된 숙주 세포.
제35항에 있어서, 숙주 세포 DNA 서열이ung유전자인 변형된 숙주 세포.
제34항에 있어서, 유라실 DNA 글리코실라제 활성을 코딩하는 숙주 세포 DNA 서열 하나 이상이 제거된, 변형된 숙주 세포.
제33항에 있어서, 진핵 세포 또는 원핵 세포인 변형된 숙주 세포.
제38항에 있어서, 대장균, 살모넬라 (Salmonella), 슈도모나스 (Pseudomonas), 바실루스 (Bacillus) 및 사카로마이세스 (Saccharomyces)로 구성된 군에서 선택된, 변형된 숙주 세포.
야생형 리덕타제 등가물에 비해 알로스테릭 억제에 대한 감수성이 약한 리보뉴클레오티드 리덕타제 유전자 및 티오레독신 유전자를 포함하는 DNA 전사 단위를 포함하는 DNA 구조물을 포함하며,

(a) 숙주 세포의 티미딜레이트 신타제 유전자에 이종인 티미딜레이트 신타제유전자를 포함하며, 상기 DNA 구조물 상에 위치한 전사 단위,

(b) 유리딘 키나제 유전자를 포함하며, 상기 DNA 구조물 상에 위치한 전사 단위,

(c) dCTP 데아미나제 유전자를 포함하며, 상기 DNA 구조물 상에 위치한 전사 단위, 및

(d) 저해되거나 결여된 유라실 DNA 글리코실라제 활성중 하나 이상의 특징을 추가로 포함하는, 변형된 숙주 세포.
제40항에 있어서, 리보뉴클레오티드 리덕타제 유전자가 dTTP 결합 부위에서 변형된, 변형된 숙주 세포.
제41항에 있어서, 리보뉴클레오티드 리덕타제 유전자가nrdA 유전자이고, 상기 변형이nrdA 발현 생성물의 위치 79에서 Ala이 Ile으로 변화된, 변형된 숙주 세포.
제38항에 있어서, DNA 구조물이 유리딘 키나제 유전자 및 dCTP 데아미나제 유전자를 모두 포함하는 변형된 숙주 세포.
제40항에 있어서, (a) 내지 (d)의 특징 각각을 포함하는 변형된 숙주 세포.
제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드의 생산 방법.
제45항에 있어서, 데옥시리보뉴클레오시드가 티미딘인 방법.
제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 아지도티미딘의 제조 방법.
제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 포함하는 배양 배지.