MXPA02000134A - Vectores, celulas y procesos para la produccion de desoxirribonucleosidos de pirimidina. - Google Patents

Abstract

Se describen las nuevas construcciones de ADN y las celulas huesped que comprenden las mismas. Las construcciones de ADN comprenden una unidad de transcripcion (por ejemplo operon) que comprende las secuencias de ADN que codifican para la ribonucleotido- reductasa y la tiorredoxina o un gen de la uridina-cinasa y/o un gen de la dTCP-desaminasa. En las modalidades preferidas, las construcciones que comprenden las secuencias de ADN que codifican para la ribonucleotido-reductasa y la tiorredoxina, comprenden ademas las secuencias de ADN que codifican para la timidilato-sintasa y/o las unidades de transcripcion que comprenden las secuencias que codifican para la uridina-cinasa preferentemente junto con la dCTP-desaminasa. En modalidades particularmente preferidas, las celulas huesped comprenden construcciones que tienen todas las caracteristicas anteriores en donde la celula huesped muestra actividad de uracilo-ADN- glucosilasa reprimida o ausente. Esto puede ser logrado mediante la eliminacion del gen ung de la celula huesped. Se describe tambien el uso de las celulas huesped en la fabricacion de los desoxirribonucleotidos de pirimidina, por ejemplo timidina.

Description

VECTORES, CÉLULAS Y PROCESOS PARA LA PRODUCCIÓN DE DESOXIRRIBONUCLEÓSIDOS DE PIRIMIDINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere la producción de pirimidinas, purinas y derivados de las mismas, por ejemplo desoxirribonucleósidos, utilizando células genéticamente modificadas que comprenden las novedosas construcciones de ADN.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La timidina es útil como un intermediario farmacéutico, particularmente para la síntesis química de la azidotimidina ("AZT", vendida bajo el nombre comercial ZIDOVUDINE) . Aunque el AZT tipo ZIDOVUDINE fue una de las primeras terapias desarrolladas para el VIH/SIDA, ésta continúa teniendo importancia y uso extenso (Langreth, R. , The Wall Street Journal , 21 de noviembre de 1995, pp. B12) .

La AZT tipo ZIDOVUDINE es particularmente valiosa cuando se utiliza en terapias de combinación tales como una combinación con lamivudina (también conocida como 3TC) , vendida bajo el nombre comercial EPIVIR. Esta combinación de lamvudina y 3TC es vendida bajo el nombre comercial COMBIVIR. Aunque el REF 135368 tt*á~?.¡-t*4* -A*i? J&i,^aairffri.rf^^^ateaa!^a^.J. ... ^*A.___^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^g^°¿^^jg*g^ ¡gg j^^^^^^^^^^^^^^^^^ virus del VIH puede mutar para formar resistensia para el AZT o 3TC, la combinación con el análogo de nucleótido tipo COMBIVIR es particularmente efectiva debido a que la transcriptasa inversa aparentemente no puede estar resistente a ambos análogos de nucleósido al mismo tiempo (Larder, B.A. et al., Science 269: 696-699, 1995). AZT tipo ZIDOVUDINE es también útil en conjunto con los fármacos tipo inhibidores de la proteasa del VIH ( aldholz, M. , The Wall Street Journal , 30 de enero de 1996, pp. Bl) , y en el tratamiento de mujeres embarazadas infectadas con VIH, con el fin de reducir la frecuencia de infección del feto al nacer. En 1997 aproximadamente 600,000 niños murieron de SIDA contraído de sus madres al' nacer. AZT tipo ZIDOVUDINE tomado por varios meses antes del nacimiento puede reducir la transmisión del virus a infantes en dos tercios. La timidina producida mediante síntesis química utilizada en la fabricación de AZT es de un costo muy significativo. En la Patente de los Estados Unidos No. 5,213,972 (McCandliss & Anderson, de aquí en adelante "la patente '972", la descripción completa de la cual se incorpora por referencia en la presente, y a la cual es referido específicamente el lector, describe un proceso para la producción de desoxirribonucleósido de pirimidina (PdN) (ver en particular los Ejemplos 7 al 14 de la patente '972) . Es mostrado un microorganismo replicable que comprende y que expresa una secuencia de ADN que codifica para una fosfohidrolasa de desoxirribonucleótido de pirimidina que convierte un monofosfato de PdN a un desoxirribonucleósido de pirimidina. Más particularmente, McCandliss & Anderson, 5 supra, describen un método de fermentación que puede ser utilizado para producir timidina que involucra la expresión de la fosfohidrolasa de desoxitimidilato (dTMPasa) proveniente de un bacteriófago PBS1 de Bacillus . Este tipo de enzima ha sido encontrado en la naturaleza expresado por 10 bacteriófagos que no contienen timidina en su ADN, sino más bien incorpora compuestos como desoxiuridina o hidroximetil- desoxiuridina . En la fermentación de la timidina, descrita en la patente v972, las enzimas que degradan la timidina (timidina- 15 fosforilasa y uridina-fosforilasa) han sido removidas mediante mutación, de modo que la timidina se acumula. De este modo, el uso de la enzima dTMPasa ayuda a crear la vía para permitir la síntesis de la timidina. Una expresión de dTMPasa sola, no obstante, no puede asegurar un nivel 20 comercialmente viable de producción de timidina. En consecuencia, existe una necesidad continua para aumentar la producción de timidina por las células que expresan dTMPasa, con el fin de hacer comercialmente viable la producción de timidina mediante fermentación, al disminuir los costos de producción relacionados a los métodos de síntesis química actuales . La vía bioquímica para la producción del desoxinucleótido de pirimidina, por ejemplo, en E. coli es altamente regulada a niveles de la transcripción y de la traducción, así como al nivel de proteínas por los mecanismos que incluyen la atenuación, la inhibición de la retroalimentación y la activación de enzimas. Neuhard, J y R.A. Kelln, Biosynthesis and Conversión of Pirimidines, Capítulo 35 [In] Neidhardt, F.C. et al. (eds.] nEscherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology" , Segunda Edición, Vol. I, pp. 580-599, ASM Press, Washington D.C., 1996. La 'expresión de dTMPasa y la eliminación del rompimiento de la timidina por mutaciones en los genes deoA (timidina-fosforilasa) , udp (uridina-fosforilasa) y td.k (timidina-cinasa) y por lo tanto los productos de expresión resultantes dan como resultado la síntesis de timidina en E. coli pero no a un nivel comercialmente viable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La biosíntesis de las purinas y las pirimidinas involucra un paso común de reducir un difosfato de ribonucleósido (en algunas especies el trifosfato) a su análogo desoxi correspondiente. En el proceso completo la reducción de la porción ribosa a 2-desoxirribosa requiere un par de átomos de hidrógeno que son al final donados por NADPH y H+. No obstante, el donador de electrones inmediato no es NADPH sino la forma reducida de una proteína estable al calor llamada tiorredoxina o glutarredoxina, y al menos otra fuente no identificada ya que el sistema de la ribonucleótido-reductasa de E. coli funciona todavía en los mutantes dobles de trxA (tiorredoxina) grx (glutarredoxina) (Neuhard y Kelln, supra) . Los equivalentes reductores de la tiorredoxina reducida son transferidos a la ribonucleósido-difosfato-reductasa que lleva a cabo el proceso de reducción. La manipulación de, por ejemplo, este paso podría probar ser útil en el 'mejoramiento de la producción comercial de desoxinucleósidos de purina y pirimidina. Un objetivo de la presente invención es proporcionar las nuevas construcciones de .ADN, por ejemplo los vectores y los microorganismos genéticamente modificados que comprenden dichos vectores, partisularmente para el uso en la produssión de cantidades recuperables, especialmente cantidades comercialmente útiles, de desoxinucleósidos de pirimidina y purina. Es también un objetivo de la presente invención proporcionar los procesos que representan un mejoramiento sobre McCandliss y Anderson descritos anteriormente. >.¡t De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una construcción de ADN que comprende una unidad transcripcional que comprende un gen de la ribonucleótido-reductasa y un gen de la tiorredoxina, o un gen de la uridina-cinasa y/o un gen de la dCTP-desaminasa. En una modalidad, la construcción de ADN comprende una unidad transcripcional que comprende un gen de la ribonucleótido-redustasa y un gen de la tiorredoxina. En otra modalidad más, la construcción de ADN comprende una unidad transcripcional que comprende un gen de uridina-cinasa y/o un gen de la dCTP-desaminasa. Preferentemente, la construcción de ADN comprende una unidad transcripcional que incluye un gen de la uridina-cinasa y un gen de la dCTP-desaminasa . Más preferentemente, la construcción de ADN comprende una unidad transcripcional que comprende un gen de la ribonucleótido-reductasa y un gen de la tiorredoxina y un gen de la uridina-cinasa y un gen de la dCTP-desaminasa . De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona una célula huésped modificada que comprende una construcción de ADN de acuerdo a la invención. De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un medio de cultivo que comprende las células huésped modificadas de la invención, y los procesos para la producción de una purina o una pirimidina, por ejemplo timidina, que comprende el uso de dichas células huésped modificadas. En una modalidad, las células huésped comprenden una construcción de ADN cuya construcción comprende una unidad de ADN de transcripción (por ejemplo operón) cuya unidad comprende las secuencias de ADN que codifican para la ribonucleótido-reductasa y la tiorredoxina en la cual la reductasa preferentemente muestra menor sensibilidad a la inhibición alostérica que una contraparte o equivalente de célula huésped de tipo silvestre, en donde dicha célula comprende además una o más de las siguientes características: a) una unidad de trascripción (por ejemplo operón) , preferentemente localizada sobre la construcción de ADN, que comprende las secuencias de ADN que codifican para (y preferentemente heterólogas con respecto a la célula huésped equivalente) timidilato-sintasa; b) una unidad de transcripción (por ejemplo operón) , preferentemente localizada sobre la construcción de ADN, que comprende las secuencias de ADN que codifisan para la uridina-cinasa y preferentemente para la dCTP-desaminasa; y c) la actividad de uracilo-ADN-glucosilasa reprimida o ausente . En otra modalidad más, la construcción de ADN para el uso en la producción de cantidades recuperables de 7 itá . __.it *-*-*" * pirimidina y derivados de la misma, en particular desoxirribonucleósidos de pirimidina tales como timidina, comprende una unidad de transcripción (por ejemplo operón) cuya unidad comprende secuencias de ADN (preferentemente heterólogas) que codifican para la uridina-cinasa y/o para la dCTP-desaminasa . Las células huésped genéticamente modificadas que comprenden y expresan la construcción y el medio de cultivo que incluye las células huésped modificadas, son también proporcionados . Este aspecto está basado, en parte, en la observación de que las células huésped que comprenden el ADN que codifica para la uridina-cinasa y/o para dCTP-desaminasa, opcionalmente junto con genes adicionales como es sugerido en la Patente de los Estados Unidos No. 5,213,972 requeridos para la producción de timidina, conducen a un mejoramiento significativo en la producción de timidina. Los aspectos respectivos de la presente invención describen por primera vez una pluralidad de avances en la enseñanza de la Patente de los Estados Unidos No. 5,213,972, para proporcionar construcciones mejoradas de ADN y las células huésped que comprenden las construcciones, para el uso en la producción comercial de desoxirribonucleósidos de pirimidina, particularmente timidina.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se volverán aparentes a partir de la siguiente descripción. Se debe entender, no obstante, que éstas representan modalidades preferidas de la invención y son a manera de ilustración únicamente. Diversas modificaciones y cambios dentro del espíritu y alcance de la invención se volverán aparentes para aquellos expertos en la técnica.

MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN La construcción de la presente invención puede ser cromosómica ó más preferentemente extracromosómica, por ejemplo localizada sobre un vector. Los vectores de la presente invención incluyen plásmidos, virus, transposones, minicromosomas o fagos, preferentemente plásmidos. El vector que comprende la unidad de transcripsión puede ser introducido dentro de la célula huésped de acuerdo a cualquier método conveniente conocido por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, la transducsión de Pl, la electroporación o la transformación. Las células huésped adecuadas, útiles en la presente invención, incluyen eucariotes y procariotes (por ejemplo Bacterias) . Los procariotes incluyen E. coli , Salmonella, Pseudomonas, Bacillus, cepas y mutantes de los mismos. Se prefiere E. coli debido a la gran cantidad de información, herramientas genéticas y alelos mutantes que están disponibles. Se prefiere particularmente que esté disponible un método de transducción para las células huésped de elección, para hacer posible que las mutaciones sean fácilmente movidas de una célula huésped a otra y faciliten la mutación genética del huésped, sin requerir mutación directa siempre que se desee una nueva mutación. Los presentes inventores han encontrado que el uso de los genes nrdA, nrdB y nrdC del bacteriófago T4 son particularmente útiles para codificar la reductasa y la tiorredoxina en E. coli . Ver Sjóberg, B.M. et al., EMBO J. , 5: 2031-2036 " (1986) ; Tseng, M.-J., et al., J. Biol . Chem. 263: 16242-26251 (1988); y LeMaster, D.M., J. Virol . 59: 759-760 (1986) . Más específicamente, un mejoramiento muy significativo en la producción de timidina de JE?, coli fue logrado a través de la clonasión y expresión de los genes nrdA y nrdB del basteriófago T4 que codifican para la ribonucleótido-reductasa junto con nrdC de T4 que codifica para la tiorredoxina, ya que la ribonucleótido-reductasa de T4 no puede utilizar tiorredoxina de E. coli . La ribonucleótido-reductasa codificada por T4 se encontró que es relativamente insensible al control por la inhibición alostérica in vi tro, en comparación a la enzima de E. coli (Berglund, O., J. Biol . Chem. 247: 7276-7281, 1972). Por ejemplo, de manera contraria a la enzima de £7. coli (Berglund, O., J. Biol . Chem. 247: 270-7275, 1972) la ribonucleótido-reductasa de T4 no es inhibida por dATP, sino efectivamente estimulada por dATP y ATP (Berglund, 0., J. Biol . Chem. 247: 7276-7281, 1972). Las secuencias de ADN que codifican para la ribonucleótido-reductasa (por ejemplo los genes de nrdA y nrdB) y tiorredoxina (por ejemplo el gen nrdC) son preferentemente heterólogas con respecto al ADN de la célula huésped y preferentemente derivadas del fago T (preferentemente el bacteriófago T de E. coli ) , particularmente los fagos T "uniformes" por ejemplo T2 , T4 o T6. ver Campbell, A.M. , Bacteriophages, Capítulo 123, en Neidherdt, supra ; y Mathews, C.K. et al. (eds.) Bacteriophage T4, American Society of Microbiology, Washington, D.C., 1983. El término "derivado de" se pretende que defina no solamente una fuente en el sentido de su origen físico, sino también que defina el material que tiene características estructurales y/o funcionales que correspondan al material que se origina de la fuente de referencia. Otra característica útil de la enzima del fago uniforme T es su especificada de sustrato. La ribonucleótido-reductasa de E. coli , normal, utiliza UDP como un sustrato sólo pobremente, ya que la Kp, para UDP es aproximadamente 10 veces mayor para UDP que para CDP (Neuhard y Kelln, supra) . No obstante, la enzima T4 tiene únicamente una diferencia de dos veces en Km (Berglund, 0., J". Biol . Chem. 247: 7276-7281, 1972) entre los sustratos CDP y UDP, permitiendo dos rutas para la síntesis de dUTP. Aunque han 5 existido intentos para obtener la expresión funcional de la ribonucleótido-reductasa de T4 en E. coli , esfuerzos previos fueron únicamente exitosos en expresar los componentes separadamente y pudieron demostrar la actividad únicamente mediante la mezcla in vi tro (Tseng, M.- 7, P. He, J.M. 10 Hilfinger, y G.R. Greenberg, J. Bacteriol . 172: 63-23, 1990). Mientras que no se está comprometido con ninguna teoría, los inventores creen que quizás debido a la falta del patrón usual de inhibición de la retroalimentación, la expresión de la ribonucleótido-reductasa de T4 en E. coli es letal, y debe 15 ser cuidadosamente expresada condicionalmente. Se consideran además los genes que codifican para las formas precursoras de la reductasa y/o la tiorredoxina, que son procesados para producir una forma madura. Tal procesamiento puede proceder vía diversas formas intermediarias. 20 Los vectores de la presente invención comprenden preferentemente un elemento regulador (por ejemplo, el promotor tal como lambda PL, operador, activador, represor tal como represor lambda, particularmente una variante sensible a la temperatura, y/o el aumentador) , las secuencias 25 de terminación, las secuencias de inicio apropiadas y los iimí TfJiWiiH'**"-»»s*-sitios de enlace al ribosoma. El vector puede además comprender un marcador seleccionable. Alternativamente, los elementos reguladores (particularmente el represor lambda) pueden estar localizados sobre el cromosoma de la célula huésped. Se prefiere que nrdA y nrdB estén acomodados en el vector corriente abajo (3') (en términos de la estructura de lectura) a partir de nrdC . En particular, se prefiere que nrdB esté acomodado corriente abajo (3') a partir de nrdA. De este modo, un arreglo más preferido es un vector que comprende un operón que incluye nrdCAB . La ribonucleótido-reductasa de T4 no está desprovista del control de la retroalimentación in vivo (J. Ji. R.G. Sargent, y C.K. Mathews, J. Biol . Chem. 266: 16289-16292, 1991; y Berglund supra) . Para promover la reducción del difosfato de ribonucleósido además, por ejemplo, para la producción de timidina, el gen que codifica para la subunidad reguladora, nrdA, puede ser modificado por ejemplo mediante un procedimiento mutasional para orear una enzima capaz de realizar la producsión incrementada de timidina debido por ejemplo a una sensibilidad reducida a la inhibición alostérica por ejemplo la inhibición por el producto inmediato de la enzima o la inhibición por un producto que resulta de un evento corriente abajo (3') . Con el fin de construir los mutantes de nrdA de T4 , puede ser utilizada la mutagénesis dirigida al sitio para modificar o cambiar (por ejemplo sustituir) las bases de los genes que codifican para los aminoácidos sospechosos de alterar por ejemplo el sitio de enlace a dTTP, involucrado en la regulación alostérica. El análisis de la secuencia de 5 aminoácidos de la ribonucleótido-reductasa de T4 reveló un segmento que parece ajustarse perfectamente con una secuencia de consenso postulada que se piensa está involucrada en el enlace a dTTP (E.M. Mclntosh y R.H. Haynes, Mol . Cell . Biol . 6: 1711-1721, 1986). Pueden ser realizados varios cambios en 10 esta región de la ribonucleótido-reductasa T4 utilizando la mutagénesis dirigida al oligonucleótido. El procedimiento general puede ser modelado después del esfuerzo de More et al. (More, J.T., J.M. Ciesla, L. M. Changchien, G.F. Maley y F. Maley, Biochemistry 33: 2104-2112, 1994) para reducir el 15 enlace de dTTP de la desoxisitidilato-desaminasa. Una mutación, 79Ala a lie, en el nrdA de T4 pareció ser muy útil. Por ejemplo, la productividad de la timidina de las cepas que contienen el mutante 79Ala a lie en nrdA de T4 evaluadas mediante un método de fermentación en matraz agitado, fue 20 significativamente incrementada. Como se demuestra más adelante, los presentes inventores lograron al menos un incremento del 25% sobre la cepa progenitora sin el cambio simple. Aunque el 79Ala a lie es un ejemplo exitoso, 25 aquellos expertos en la técnica se darán cuenta ahora que aÍÉ¡¡^¡¿íÍÍÍíM¡ttlaáaÍa§fa¿.A* J. **?* **.*. .. .... . , -A . . —A» - . . ~ , , A „ ,„„ ,.fc, . j. t-j.il muchos otros cambios de aminoácidos en esta región son ahora posibles para obtener el efecto deseado, que es el desorganizar putativamente el enlace a dTTP, pero no perturbar la funcionalidad básica de la enzima. Por ejemplo, 5 puede ser utilizada la sustitución de 79Ala con otros aminoácidos que muestran cadenas laterales similares a lie (por ejemplo leucina, valina) . Las modificaciones en la posición 79 en conjunto con otras modificaciones (por ejemplo mutaciones) dentro de la región de consenso postulada, son 10 también consideradas. La supresión de una o más posiciones de aminoácidos en la región de consenso y la introducción del ADN sintético en la región, son otros procedimientos disponibles para aquellos expertos en la técnica. En otro aspecto más de la presente invención, se 15 proporciona una célula huésped que comprende una construcsión, cuya construcción (por ejemplo vector) comprende una unidad transcripcional que incluye las secuencias de ADN que codifican para la ribonucleótido- reductasa y la tiorredoxina, heterólogas, cuya reductasa es 20 menos sensible a la inhibición alostérica que el equivalente o sontraparte de célula huésped de tipo silvestre. Será aparente para aquellos expertos en la técnica, que la determinación de la sensibilidad relativa de una reductasa heteróloga candidata para la inhibición alostérica, en 25 comparación al equivalente de célula huésped de tipo M¿»iJiatoJ¿Mll8MM¿¿WJB>-C l jt 1J..A fejy. ., , „^»^. .. A . . < A...-.- A ...I . A.AHA--A. .. , J. -A «J«¿...Li. silvestre, es un asunto de experimentación y observación rutinaria. Las unidades de transcripción que comprenden las secuencias de ADN por ejemplo los genes nrdA, nrdB y nrdC son preferentemente operones en donde los genes nrd están acomodados en tándem. Esto permite la transcripción de estos genes como un transcrito de ARNm simple. Con el fin de minimizar el gasto de energía improductiva por la célula huésped y minimizar además el tamaño del plásmido, se prefiere que el operón contenga únicamente las secuencias genéticas requeridas en la codificación de la reductasa y la tiorredoxina (incluyendo cualesquiera elementos reguladores o de control) .- Éste puede necesitar la eliminación del ADN superfluo (por ejemplo, el intrón inusual en el gen prdB del fago T4 , Sjoberg, B-M. , et al. EMBO J. 5: 2031-2036, 1986). En otras modalidades preferidas, los vectores de la presente invención para el uso por ejemplo en la producción de timidina comprenden además las secuencias de ADN que codifican para la timidilato-sintasa (por ejemplo el gen td) . Ver por ejemplo Chu, F. K. Et al., Proc . Nati . Acad. Sci . , EUA, 81: 3049-3053 (1984); Chu, F. K. et al., J". Bacteriol . 169: 4368-4375 (1987). El propósito de utilizar esta enzima es mejorar el control sobre los niveles de desoxiuridina producida, y en particular el nivel de impureza relativa de la desoxiuridina con relación a la timidina. La enzima dTMPasa no es completamente específica para dTMP. Con una Km más alta que para dTMP, la dTMPasa de PBS1 utilizará también dUMP como sustrato para producir desoxiuridina (Price, A.R., Methods in Enzymol . 51: 285-290, 1978). La desoxiuridina crea un problema significativo para la purificación de la timidina. Por lo tanto, una manera para reducir la producción de desoxiuridina es convertir eficientemente dUMP a dTMP mediante el incremento del nivel o la efectividad de timidilato-sintasa tal que la concentración interna de dUMP permanece siempre muy baja. El gen de la timidilato-sintasa ( d) puede ser heterólogo con respecto a la célula huésped y se prefiere que td sea derivado de (en el sentido definido anteriormente) el bacteriófago T, por ejemplo el fago T "uniforme" y en particular td del fago T4. Aunque td puede ser localizado en su propia unidad de transcripción, se prefiere que td esté localizado en la misma unidad de transcripción, por ejemplo el operón como los genes nrd. Además, se prefiere que td esté losalizado en el mismo operón corriente abajo (3') (en términos de la estructura de lectura) a partir de los genes nrd. McCandliss y Anderson, supra, amplificaron el gen de la timidilato-sintasa de E. coli en los plásmidos pCG138 y pCG148 (ver Tabla 5, de la patente N 972) y se encontró que es parcialmente efectivo en la reducsión de la desoxiuridina.

La timidilato-sintasa de T4 es mucho más efectiva, lo cual es sorprendente a la luz del hecho de que la enzima de E. coli no se piensa que sea controlada por ningún tipo de regulación alostérica (Neuhard y Kelln, supra) . La enzima de E. coli Kp, 5 para dUMP, 4 µM (Wahba, A. J. Y M. Friedkin, J. Biol . Chem. 237: 3794-3801), y la enzima Km de T4 para dUMP, 2.73 µM (Maley, F., L. LaPat-Polasko, V. Frasca y G.F. Maley, Functional domains in T4 Thumidylate Synthase as probed by site-directed mutagenesis, Capítulo 29 [In] Karam, J.D. [ed] 10 "Molecular Biology of Bacteriophage T4", American Society for Microbiology, Washington, DC, 1994, pp. 322-325), son similares y no pueden explicar la gran diferencia en la efectividad. -Mientras que no se desee estar comprometido con ninguna teoría, los inventores creen que t yA de E. coli 15 tiene una secuensia de terminasión de la transcripción, interna, derivada de un gen corriente arriba (5') que podría estar afectando el nivel de expresión de los clones plasmídicos (Bell-Penderson, D, J.L. Galloway Salvo, y M. Belfort, J". Bacteriol . 173: 1193-1200, 1991). 20 En otras modalidades preferidas, las células huésped de la presente invención, particularmente para el uso en la producción comercial de desoxirribonucleósidos de pirimidina, por ejemplo timidina, comprenden una unidad de transcripción (por ejemplo operón) cuya unidad comprende las 25 secuencias de ADN por ejemplo el gen udk que codifica para la _ti_M_ _W_í_ÉÍ_i- -——á?¿ ,?.¿k ¿.¿.¿,^¡.¿.,-1...-. ¿.A. , ., _ . ,. „ . „ .... ..... *. —-»a.^^,>, «,. —... •&, *. * t ? uridina-cinasa y preferentemente las secuencias de ADN por ejemplo el gen dcd que codifica para la dCTP-desaminasa. Ver por ejemplo Wang, L. Y B. Weiss, J. Bacteriol . 174: 5647-5653 (1992); y Neuhard, J. Y. Tarp0, J7 Bacteriol . 175: 5742-5743. La construcción de este aspecto de la invención puede además comprender una unidad de transcripción que codifica para la ribonucleótido-reductasa (nrdA y nrdB) y la triorredoxina (nrdC) , o las formas precursoras de las mismas que son preferentemente heterólogas con respecto al ADN en la célula huésped y preferentemente derivadas del bacteriófago de E. coli , particularmente los fagos T "uniformes" por ejemplo T2 , T4 o T6. La uridina-cinasa produce UMP y CMP a partir de uridina e histidina utilizando GTP (o dGTP) como el donador de fosfato. La reacsión es inhibida por UTP y CTP (J. Neuhard y R.D. Kelln, Biosynthesis and Conversions of Pyrimidines, Capítulo 35 [in] F.C. Neidhart et al. [eds.], "Escherichia Coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology", Segunda Edición, ASM press, Washington, D.C.). Los presentes inventores han encontrado que el uso de la uridina-cinasa particularmente junto con la desaminasa de dCTP conduce a un mejoramiento marcado en la producción de la timidina por las células huésped que incorporan estos cambios, junto con las enseñanzas de la patente ? 972 anteriormente descrita. Esta observación es muy inesperada ya que la uridina-cinasa, con base en la información actual, no tiene papel directo en la biosíntesis de la pirimidina de novo, además que su uso podría ser benéfico en procesos comerciales para la producción de los desoxirribonucleósidos de pirimidina. Se prefiere que los genes udk y dcd estén acomodados en tándem en el mismo operón. Además, se considera que los genes que codifican para las formas precursores del gen ud.k y dcd son procesados para producir una forma madura. Tal procesamiento puede proceder vía las diversas formar intermedias. Los genes udk y dcd pueden ser introducidos dentro de la construcción (por ejemplo vector) de cualquier fuente adecuada mediante métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica por ejemplo la transducción, electroporación o transformación de Pl . La enzima uracilo-ADN-glucosilasa, codificada por el gen ung, es responsable de la degradación del ADN que tiene uracilo incorporado, en lugar de timidina. Donde las células huésped de la presente invensión son utilizadas en la producción comercial por ejemplo de timidina, la concentración celular interna de dTTP puede ser disminuida como resultado de la utilización de dTMP (un precursor de dTTP) en la producción de la timidina. En consecuencia, los presentes inventores han reconocido que existe potencialmente una mayor propensión para la incorporación de uracilo en el ADN del huésped que puede ser letal para un huésped de tipo silvestre, debido a que la actividad de la uracilo-ADN-glucosilasa provoca demasiados rompimientos de hebra simple en el ADN de la célula huésped. De este modo, las células huésped útiles de la presente invención pueden además mostrar actividad reprimida (en comparación a la célula no modificada) o ninguna actividad de la uracilo-ADN-glucosilasa. Esta represión o ausencia puede ser lograda a través de diversas formas aparentes para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, el antagonismo (ya sea total o parcial) de los productos de expresión del gen ungr, es uno de tales procedimientos, por la introducción de un antagonista de la enzima funcional (o precursor de la misma) en la célula huésped. Otros procedimientos incluyen la manipulación de la expresión del gen ung, por ejemplo mediante modificación de los elementos reguladores de la expresión del gen ung o la introducción de mutaciones dentro del gen ung mismo, tal que la expresión del producto del gen ung muestra poca o ninguna actividad y/o proteína de uracilo-ADN-glucosilasa . Otro prosedimiento más es suprimir el gen ung (o las partes funsionalmente srítisas del mismo) del ADN de la sélula huésped. La ausencia o el bajo nivel de la actividad de la uracilo-ADN-glucosilasa puede ser una característica de la célula huésped sin la necesidad de manipulación adicional. En modalidades preferidas de la presente invención, cada uno de los avances mostrados en la presente son kt?l l ?„ tll*. ?lJ ?? i incorporados en una célula huésped. Los genes nrd, td, udk y dcd pueden estar localizados sobre construcciones separadas, pero se prefiere que éstos estén todos localizados sobre la misma construcción por ejemplo el mismo vector. De este modo, en una modalidad particularmente preferida de la presente invención, una célula huésped modificada es proporcionada, en la cual la célula comprende una construcción de ADN (por ejemplo vector) que comprende una unidad de ADN de transcripción (por ejemplo operón) cuya unidad comprende las secuencias de ADN que codifican para (preferentemente un fago T uniforme, por ejemplo T4) una ribonucleótido-reductasa modificada y la tiorredoxina, en las cuales la • reductasa preferentemente muestra menos sensibilidad a la inhibición alostérica que la contraparte o equivalente de célula huésped de tipo silvestre, en donde dicha sonstrucción comprende además: a) una unidad de transcripción (por ejemplo operón) que codifica para (preferentemente heteróloga con respecto al equivalente o contraparte de la célula huésped) la timidilato-sintasa y; b) una unidad de transcripción (por ejemplo operón) , que codifica para la uridina-cinasa y preferentemente para dCTP-desaminasa; y en las cuales la sélula huésped muestra actividad reprimida o ausente de la uracilo-ADN-glucosilasa. ?kt -.i. i..t ?t? iÍkÁ?¿¿*í- l ^km.ik!lx.~ .

Las células huésped modificadas de acuerdo a la presente invención son particularmente útiles en la producción comercial de desoxinucleósidos de pirimidina. En un uso particularmente ventajoso de la presente invención, las células huésped de E. coli que comprenden (que albergan) un plásmido modificado de acuerdo a la presente invención (particularmente en conjunto con las enseñanzas de la patente ? 972) pueden ser utilizadas en la producción comercial de timidina. De este modo, las células huésped modificadas de acuerdo a la presente invención pueden además comprender la dTMPasa derivada por ejemplo de PBS1 y las mutaciones mostradas en la patente x972, por ejemplo deoA, tdk- 1 y udp-1. En general, un método de fermentación es empleado, el cual involucra el sumergir las células en un medio contenido dentro de un recipiente adecuado. Después del cultivo bajo condiciones apropiadas, la timidina producida es cosechada y purificada (enriquecida) , si es necesario, hasta el grado farmacéutico de acuerdo a los protocolos estándares. La timidina purificada puede ser luego utilizada en la producción de medicamentos, por ejemplo las composiciones farmacéuticas tales como AZT.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención es ilustrada a manera de ejemplo únicamente y con referencia a las siguientes figuras en las cuales: La Figura 1 ilustra, esquemáticamente, una ruta para la construcción de pCG366. Se debe notar que los plásmidos no están dibujados a escala. La Figura 2 ilustra, esquemáticamente, una ruta para la construcción de pCG374 y pCG375. La Figura 3 ilustra un mapa para el plásmido pCG532. La Figura 4 ilustra el desarrollo y la producción de timidina por la cepa de E. coli recombinante CMG2451 (Ung+) y CMG2492 (Ung") que hospeda un plásmido pCG366 (nrdCAB td) de acuerdo al Ejemplo 10. La Figura 5 ilustra la producción de timidina en un fermentador de 30 litros, por E. coli CMG2451 (pCG532) . La Figura 6 ilustra TdR y UdR (mg/litro) obtenidas de acuerdo al protocolo de .purificación del Ejemplo 12.

Ejemplo 1 Clonación de los genes nrdCAB de T4 y demostración de la actividad Los genes nrdAB del bacteriófago T4 fueron clonados mediante la realización de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con el ADN aislado del fago T4. Los cebadores para el gen nrdA de PCR fueron: 5' -TAT TCT AGA CGA TTT TCA AGT TGA GGA CTT ATG C-3' (SEQ ID NO. 1) ; y 5' -TAT ATC GAT AAT TCA TTA CAA TTT ACÁ CGC TGC AC-3' (SEQ ID NO. 2) . El sitio de restricción Xbal fue luego introducido al comienzo del nrdA en el ADN amplificado, y Clal fue introducido en el extremo 3' de nrdA. Los cebadores para la amplificación por PCR de los genes nrdB fueron: 5' -TAT ATC GAT AAA TGT AAA TTT AAG GAT TCT AAA TG-3' (SEQ ID NO. 3) y 5' -TAT GTC GAC TCC TTA AAA GTA TTT TTT AAA ACT C-3' (SEQ ID NO. 4) . El sitio de restricción ClaJ fue de este modo introducido al somienzo del nrdB, y Apal fue introdusido al final de nrdB en el ADN amplifisado. Los fragmentos de PCR fueron slonados en vectores plasmídicos somo se ilustra en la Figura 1, de acuerdo a las técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia. Los genes nrdAB clonados fueron confirmados mediante el ensayo de actividad enzimática. El gen nrdC de T4 fue clonado dentro de pKC30 que produce el ?.A plásmido pDL51 (LeMaster, D.M. , J. Virology 59: 759-760, 1986) y fue suministrado por D. LeMaster (Dept of Biochem., Univ. Wisconsin, Madison, Wl) . El gen fue subclonado entro de un plásmido con los genes nrdAB como se ilustra en la Figura 1. Las fuentes de los materiales iniciales y la información antecedente utilizada en la Figura 1, se listan en la Tabla 1. Un terminador transcripcional sintético fue utilizado para la construcción de pCG198 y pCG301 (ver Figura 1 y Tabla 1) . Específicamente, el plásmido pBC sk+ obtenido a partir de Stratagene (La Jolla, California) fue digerido con la enzima de restricción Apal y Aspllßl . El ADN sintético que contiene la secuensia de terminación de la transcripsión ECOTGP (d'Aubenton Carafa et al., J. Mol . Biol . 216: 839-843, 1990) fue luego ligado reemplazando la secuencia original entre los sitios de endonucleasa Apal y Asp718I.

Tabla 1: Genealogía del Plásmido pCG366 y pCG532 y Fuente de los Materiales rii a -, __. _i Ua í¡ Jl. „é. j 10 15 20 25 ¡íg( it___Éíí_- >é A¿ Jk j ?. _.é,_Hí _í A^Á Este fragmento recreó la secuencia de reconocimiento Apal, pero destruyó la secuencia de reconocimiento Asp718I en el nuevo plásmido. El ADN insertado tuvo la siguiente composición 5'-CGAGC CCGCCTAATG AGCGGGCTTT TTT TT-3' 3'-CCGGGCTCG GGCGGATTAC TCGCCCGAAA AAAAACATG-5' (mostrado como hebras respectivas en la SEQ ID NO. 5 y 6) produsidos a -partir de dos oligonusleótidos . El plásmido pCG198 fue combinado con pCG173 que contiene el promotor PL lambda proveniente del plásmido pKC30 clonado dentro de pBluescript II ks (Stratagene, La Jolla, California) como se muestra en la Figura 1. pCB198 y pCG173 fueron digeridos son HindIII y Asnl fue luego ligado para orear el nuevo plásmido pCG301 que sontiene el promotor lambda PL, los múltiples sitios de clonación de la enzima de restricsión, y seguido por la sesuencia terminadora ECOTGP copiada a partir de la región del péptido guía del operón de triptofano. La actividad de la ribonucleótido-reductasa de T4 fue medida mediante HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) mediante un método que no involucra el uso de radioisótopos y el sustrato UDP. El ensayo directo de ribonucleótido-reductasa contenía NADPH 1 mM, DTT 1 mM, dATP 0.5 mM, UDP 0.6 mM, Tris 20 mM (pH 8.0) y cloruro de magnesio 5 5 mM. Bajo estas condiciones la ribonucleótido-reductasa de E. coli es inhibida y no es detectada. La reacción enzimática (100 µl) fue detenida por la adición de 10 µl de ásido tricloroacético al 50% (TCA) . Después de 10 minutos sobre hielo, las muestras son centrifugadas en una 10 microcentrífuga. El sobrenadante fue extraído 4 veces con éter dietílico para eliminar el TCA. Se agregaron cinco ml de amortiguador Tris (1.0 M, pH 8.0) seguido por 2 µl de veneno de víbora de cascabel a 40 mg/ml (Sigma) , y la muestra fue incubada a 37°C por 60 minutos. Las muestras fueron 15 luego calentadas por 3 minutos a 70°C, seguidas por centrifugación por 5 minutos para eliminar el precipitado. Los volúmenes son igualados, luego analizados mediante HPLC con un detestor de UV y desoxiuridina como el estándar. La columna es una Spherisorb ODS-2 de 5 micrómetros, 250 mm x 20 4.6 mm utilizando una fase móvil de fosfato de amonio 12 mM (pH 5.0) y una velocidad de flujo de aproximadamente 1.0 ml/minuto. Los resultados se muestran en la Tabla 2 para las células que contienen el plásmido pCG343, demostrando la expresión funcional de la ribonusleótido-reductasa de T4. 25 Tabla 2 : Actividad de Ribonucleótido-Reductasa Ejemplo 2 Derivación de la Cepa Huésped CMG2451 a partir de la Cepa CMG1115 La cepa CMG1115 es completamente descrita en McCandliss & Anderson (Patente de los Estados Unidos No. 5,213,972). CMG1115 fue el punto inicial para el desarrollo descrito en la presente. La cepa CMG1115 fue mejorada para la produstividad de timidina mediante la selección para el crecimiento sobre medio que contenía 30 mg/litro de 5- fluorouridina que produjo la cepa CMG2401. La cepa CMG2401 fue luego seleccionada para el crecimiento sobre medio que contenía 30 mg/litro de 3 ' -azido-3 ' -desoxitimidina que produjo la cepa CMG24024. CMG2404 requiere L-prolina para el crecimiento debido a la mutación heredada ( lac-pro) a partir de su progenitor original JM101. Hfr que se acopla entre CMG2404 y un Hfr cepa CAG5053 (Singer, M. et al. Microbiological Review: 5: 1-24, 1989) se realizó de acuerdo a las técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia y produjo la cepa CMG2434 que es Lac+, Pro+. La mutación udp (uridina-fosforilasa) en CMG2434 todavía tuvo actividad de uridina-fosforilasa parcial que fue evidente con base en la acumulación de timidina después de la inducción de la producción de timidina. La mutación udp fue reintroducida a partir de CGSC5128 (E. coli Genetic Stock Center, Yale University) mediante transducción del fago Pl de acuerdo a las técnisas conocidas por aquellos expertos en la materia. El metE3079 : :TnlO proveniente de la cepa CAG18491 fue primeramente' transducido en CMG2434 para servir como un marcador de selección positivo para la transducción de udp. Luego el udp-1 fue transducido dentro del derivado metE3079: :TnlO de CMG2434 mediante la selección para el crecimiento sin L-metionina en el medio definido. El derivado udp-1 fue llamado cepa CMG2451. La genealogía de CMG2451 es resumida en la Tabla 3.

Tabla 3: Genealogía del Huésped E. coli Cepa CMG2451 a Las mutaciones fueron a veces introducidas en las cepas de E. coli mediante transducción del fago Pl . Si la mutación tiene un marcador selectivo, se utilizó transducción directa de Pl . Si la mutación no tiene marcador selectivo, se utilizó la transducción de Pl con la inserción TnlO cercana. b Singer, M., et al. Microbiological Review: 53: 1-24, 1989. c Todas las cepas de CGSC pueden ser obtenidas para E. coli Genetic Stock Center, Yale University, P.O. Box 208104, New Haven, CT 06520-8104. ll U il j.t feft al t,i ^ ,„ » » Ejemplo 3 Clonación y expresión del gen td de T4 dentro del plásmido de producción de timidina El gen td de T4 fue clonado dentro de pKTd?l por West et al. (J. Biol . Chem. 261: 13446-13450, 1986) sin el intrón de 1017 pares de bases. El gen td fue subclonado dentro de pCG301 utilizando dos oligonucleótidos como enlazadores con las siguientes secuencias: 5' -GAT CCG GAG GAT AAA TGA AAC AAT ACC AAG ATT TAA T-3' (SEQ ID NO. 7) y; 5' -TAA ATC TTG GTA TTG TTT CAT TTA TCC TCC G-3' (SEQ ID NO. 8) . El plásmido resultante fue pCG356. El gen td proveniente de pCG356 fue luego subclonado dentro de pCG343 para crear pCG360 (Figura 1) . El gen de resistencia a la tetraciclina y el origen de replicación del plásmido proveniente de pBR322 (Bolívar, F. Et al., Gene 2: 95-113, 1977) fue subclonado dentro de pCG360 y formó pCG366. La actividad de timidilato-sintasa fue medida mediante el método espectrofotométrico de Wahba y Friedkin (J. Biol . Chem . 236: PC11-PC12, 1961) . Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Actividad de Timidilato-Sintasa Ejemplo 4 Datos de matraz con agitación que muestran el valor del gen td de T4 sobre la producción de timidina y la reducción de desoxiuridina' Se utilizó la fermentación de matraz con agitación para evaluar la productividad de timidina de diferentes recombinantes de E. coli . El caldo de fermentación en matraz agitado y los métodos utilizados aquí, y en otros ejemplos, se describen en el Ejemplo 6 más adelante. En este caso se inocularon 20 ml por matraz con 2 ml de cultivo de siembra y se incubaron en un agitador a 30°C. Aproximadamente a 10 DO 600 nm, los matraces fueron transferidos a un agitador a 37°C por 30 minutos para inducir levemente al promotor ? P . Luego los matraces fueron transferidos a un agitador a 35°C para continuar la fermentación. La glucosa fue alimentada * ' • ' ' . .« t t A??.ik ttttiu* - k - durante la fermentación, como fuera necesario, y el pH s ajustó a aproximadamente 7 con amoniaco de acuerdo al color del rojo de fenol. La concentración de timidina fue medida mediante HPLC utilizando una columna Spherisorb ODS-2, de 5 micrómetros, 250 mm x 4.6 mm, y una fase móvil de fosfato de amonio 25 mM (pH 3.3) con una velocidad de flujo de aproximadamente 1.5 ml/minuto. La cepa CMG245l/pCG366 (nrdCAB de T4 , td) fue comparada con CMG2451/pCG343 (nrdCAB de T4) en la fermentación en matraz agitado. La Tabla 5 muestra que la concentración de desoxiuridina fue reducida, y convertida a timidina en la cepa CMG245l/pCG366 debido al gen td de T4.

Tabla 5: Producsión de Timidina-Efesto de la Timidilato- Sintasa a las 66 horas í .^í i i.U ¿ ^^,, Ejemplo 5 Construcción del mutante de ribonucleótido-reductasa de T4 5 La mutación fue introducida mediante el uso de la mutagénesis dirigida al sitio basada en un método descrito por Kunkel (Kunkel, T.A., Proc . Nati . Acad. Sci . , EUA, 82: 488-492, 1985) . Todos los materiales para la construcción del mutante incluyendo el ADN fagémido pTZ18U, el fago 10 cooperador M13K07, las cepas bacterianas E. coli CJ236 y MV1190, la ADN-polimerasa T7 y la ADN-ligasa T4 fueron proporcionadas sobre el mutagen en el equipo de mutagénesis in vi tro de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA) . Al principio, el fragmento de ADN de Xbal/HindIII que contenía 15 el gen nrdA del bacteriófago T4 fue aislado del plásmido pCG312 (ChemGen Corp., Tabla 1 anterior) . El fragmento de Xbal/HindIII fue clonado dentro de los sitios Xbal/HindIII del vector fagémido pTZ18U utilizando los protocolos estándares (Sambrook, J. , Fritsch, E.F. y Maniatis, T., 20 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989) . El fagémido pCG464 que lleva el inserto fue introducido dentro de E. coli CJ236. Esta cepa es deficiente por dUTPasa (dut) y uracilo-N-glucosilasa ( ung) que da como resultado una sustitución ocasional de uracilo por timina en 25 el ADN recién sintetizado. Un ADN de una sola hebra de pCG464 que contenía uracilo fue aislado de CJ236 de acuerdo al Manual de Instrucciones de Bio-Rad Laboratories. Este ADN (0.2 pmol) fue recocido con 6 pmol del cebador fosforilado 5 ' -AGC AAA CAT TAA ACÁ GCG TGC AATTAC ATA TTG ATA ATC AGG TTC-3' (SEQ ID NO. 9) que contenía la secuencia de la mutación deseada (subrayada) que codifica para lie en vez de 79Ala original . El ADN de hebra complementaria fue sintetizado mediante el uso de la ADN-polimerasa T7 como se describe en el protocolo de Bio-Rad. Los productos de reacción fueron transformados en E. coli MV1190 que contenía una uracilo-N-glucosilasa de tipo silvestre, la cual degrada la hebra progenitora que contiene uracilo, enriqueciendo de este modo el mutante directo. El secuenciamiento de ADN directo utilizando el Sistema de Secuenciamiento de ADN Silver Sequence de Promega Corp. (Madison, Wl) identificó los plásmidos que contenían la mutación deseada. Paresió que los cuatro transformantes analizados contenían plásmidos con la mutación. Uno de ellos fue designado pCG492 y utilizado para los experimentos posteriores. Para verificar si la mutación afecta la síntesis de la timidina, éste fue introducido dentro del plásmido de producción pCG366 (ChemGen Corp., Tabla 1 y Figura 1) . Para esto, el fragmento de ADN de Kpnl/AflII de pCG366 que contenía la parte 5' del gen nrdA fue reemplazado con el fragmento Kpnl/AflII proveniente de pCG492 que contiene la mutación. El nuevo plásmido pCG494 fue introducido dentro de la cepa de producción CMG2451 (ChemGen Corp., Ejemplo 2 y Tabla 4 anteriores). El efecto de la mutación nrdA de T4 fue evaluado mediante la comparación de la producción de timidina por CMG2451 (pCG494) y CMG2451 (pCG366) como se muestra en el Ejemplo 6 siguiente.

Ejemplo 6 Fermentación en matraz agitado para la producción de timidina utilizando CMG2451 (pCG366) y CMG2451 (pCG494) Matraces deflectores de 250 ml que contenían 25 ml de medio de ' producsión fueron inoculados con 2 ml de un cultivo de siembra recién desarrollado en caldo de LB con antibiótico apropiado agregado. Los cultivos fueron desarrollados en un agitador a 30°C a 250 rpm. Cuando la OD600 alcanzó aproximadamente 5, los matraces fueron transferidos a un agitador a 37°C por 30 minutos. Luego los matraces fueron transferidos a un agitador a 35°C para continuar la fermentación. El medio de producción tiene la siguiente composición (g/1) : Ardamine YEP-S (Red Star Yeast & Products, Milwaukee, WI)-10; CaCO3-10; MgSO4-0.4; rojo de fenol -0.24; PP90BT (DMV International, Fraser, N.Y.) -4.5; sorbitol-20; cloranfenicol-0.03 ; elementos en trazas (1000X)-1 mg/l. La formulación de elementos en trazas (1000X) es la * . siguiente (g/1): ácido bórico-0.05; cloruro de calcio-20; sulfato de cobalto-0.05; sulfato de cobre-0.01; sulfato ferroso-20; cloruro férrico-20; sulfato de manganeso-0.5 ; molibdenato de sodio-0.1; y sulfato de zinc-0.1. Al tiempo de la inducción se agregaron 100 g por litro de Ardamine YEP-S. La glucosa fue alimentada durante la fermentación en un promedio de cada dos horas (2.5 g/1). El pH en los matraces fue mantenido a aproximadamente 7.0 a través de la adición de hidróxido de amonio 4 N como se juzgó por el color del colorante indicador rojo de fenol. La D060o fue leída después de la dilución de muestra 1:10 en ácido sulfúrico 10 M para disolver las sales en el medio. La concentración de timidina fue medida mediante HPLC de fase inversa en C-18 con una columna Alltesh Spherisorb ODS-2 y un detector espectrofotométrico Shimadzu a 260 nm. La fase móvil fue una de NH4H2P04 25 mM (pH 3.3) en agua a la velocidad constante de 1.5 ml/minuto. Los resultados de la producción de timidina por CMG2451 (pCG366) y CMG2451 (pCG494) después de 2 , 17 y 25 horas después de la inducción se presentan en la Tabla 6. Existieron dos repeticiones de los matraces en este experimento y la variabilidad entre los matraces por duplisado no excedió 15%. Los resultados muestran que el mutante nrdA de T4 funcionó mejor que la cepa nrdA de tipo silvestre. Esto fue confirmado en varios experimentos independientes en matras de agitación con las mismas cepas bacterianas .

Tabla 6: Producción de timidina por CMG2451 (pCG366) y CMG2451 (pCG494) Cepa 2 horas 17 horas 25 horas Actividad específica (mg/l/DO) CMG2451 (pCG366) 6.1 32.5 43.1 CMG2452 (pCG494) 8.5 36.1 51.4 Ejemplo 7 Fermentación én Matraz con Agitación para Demostrar el Efecto del Gen udk de E. coli sobre la Producsión de timidina El gen dcd o el operón udk de dcd fueron clonados dentro del vector pACYC177. Este vector con el origen pl5a de replicasión es diferente de los plásmidos basados en cslEl tales como pCG366 y de este modo es compatible y puede ser mantenido en el mismo huésped con los plásmidos basados en col El . Los detalles de las construcciones plasmídicas que dan como resultado pCG374 ( udk dcd) o pCG375 ( dcd) se muestran en la Figura 2. Los genes sobre estos plásmidos son expresados a partir del promotor de E. coli nativo del operón udk dcd.

Utilizando selección para la resistencia a la ampicilina, los plásmidos pCG374 y PCG375 fueron introducidos dentro de CMG2451 (pCG366) para probar el efecto sobre la producción de timidina en el método de fermentación en matraz con agitación descrito en el Ejemplo 6. Los resultados a diferentes puntos de tiempo se muestran en la Tabla 7. Aunque la actividad específica (timidina por DO de células) es similar con y sin el gen udk, las células con el gen udk sobre el segundo plásmido pCG374 se desarrollaron a una densidad celular mayor y produjeron significativamente mas timidina (5.8 g/1 en comparación a 3.0 g/1 para la cepa con el dcd únicamente el segundo plásmido) . Este resultado no fue anticipado, ya que no es claro porqué la uridina-fosforilasa pudo tener este efecto. Con base en estos datos y otra información, el gen udk fue elegido para la introducción junto con el gen dcd de E. coli en la construcción del plásmido pCG532 (ver Ejemplo 8 y Figura 3) .

Tabla 7 : Comparación del e ecto de los segundos plásmidos con dcd o dcd udk sobre la producción de timidina en el antecedente de CMG2451 (pCG366) 10 15 20 tJ*M^a" to-"'--Ejemplo 8 Clonación del operón udk dcd de E. coli dentro del plásmido de producción pCG494 Los genes udk y dcd de E. coli codifican para la pirimidina-ribonucleótido-cinasa y la dCTP-desaminasa, respectivamente. Ambos genes fueron trazados en mapa a un fragmento de ADN BamHI/PstI de 3.4 kb del fago lambda 355 de la biblioteca genómica Kohara (Kohara, Y., Akiyama, K. e Isono, K., Cell 50, 495-508, 1987). Parece que udJ está localizado corriente arriba (5') de dcd y es transcrito en la misma direcsión que dcd (Neuhard, J. y Tarpo, L., J. Bacteriol . 175: 5742-5743, 1993). Los genes fueron clonados dentro del plásmido de producción mediante dos pasos. En primer lugar, un fragmento de ADN BamHl/PstI de 3.4 kb proveniente del fago lambda 355 fue clonado dentro del sitio de clonación múltiple del plásmido pUC18 (Yamisch-Perron, C, Vieira, J. y Messing, J. , Gene 33: 103-109, 1985) (plásmido pCG358) . Luego, el fragmento fue extirpado de la región poliligadora de pCG358 con BamHl y Sphl y clonado en lugar de un fragmento BglII/Sphl de 0.7 kb (que contiene una porción del gen de resistencia a la tetraciclina) del plásmido de producción pCG494. El plásmido final pCG532 de 14.7 kb contiene el origen de replicación del grupo de compatibilidad colEl , el gen de resistencia al cloranfenicol, los genes udk y dcd y los genes nrdCAB del bacteriófago T4 (codifican para la tiorredoxina y dos subunidades de la ribonucleótido-redustasa, respectivamente) y el td de T4 (codifica para la timidilato-sintasa) bajo el control del promotor PL del bacteriófago lambda. El gen nrdA de T4 de pCG532 fue previamente cambiado mediante mutagénesis dirigida al sitio (79Ala a He) . Un terminador transcripcional sintético está localizado corriente abajo (3') del gen de td para prevenir la lectura transcripcional en la región de replicación. El mapa genético del plásmido pCG532 se ilustra en la Figura 3.

Ejemplo 9 Fermentación en matraz agitado de timidina por CMG2451 (pCG494) y CMG2451 (pCG532) El plásmido pCG532 que contiene los genes udk y dcd de E. coli fue introducido dentro de la cepa de producción CMG2451. La nueva cepa CMG2451 (pCG532) fue probada junto con la cepa progenitora CMG2451 (pCG494) en experimentos con matraz de agitación para somparar la produsción de timidina. Los resultados de dos experimentos independientes se muestran en la Tabla 8. El primer experimento fue realizado como se describe anteriormente y las muestras fueron tomadas a las 17 horas después de la inducción. En el segundo experimento las .. ... . t ». células fueron inducidas a una DO mayor (aproximadamente 9) y las muestras fueron tomadas a las 3 horas después de la inducción para el análisis. En ambos casos la cepa que contenía los genes udk y dcd clonados funcionaron mejor que la cepa progenitora.

Tabla 8: Fermentación de timidina mediante timidina por CMG2451 (pCG494) y CMG2451 (pCG532) t?- - ¿t ti 4 a,$¿I ' í; Ejemplo 10: Adición de la mutación ungr y su efecto sobre la producción de timidina en la fermentación en matraz con agitación 5 Una cepa negativa a la uracilo-ADN-glucosilasa fue construida mediante la introducción de una mutación ung: :TnlO (Varshney, U. , et al., J. Biol . Chem. 263: 7776-7784, 1988) dentro del huésped CMG2451 utilizando la transducción de Pl como se describe anteriormente, y fue llamado CMG2492. El 10 plásmido pCG366 fue introducido dentro de CMG2492. Un experimento de comparación entre la cepa Ung" y Ung+ para la síntesis de la timidina en matraces agitados se muestra en la Figura 4 utilizando el método del matraz descrito en el Ejemplo 6. Las células fueron desarrolladas en matraces de 15 250 ml a 30°C, y la síntesis de la timidina fue inducida mediante el cambio de temperatura a 37°C por 30 minutos, luego, cambiando a 35°C. El Ung" huésped sin uracilo-ADN- glusosilasa mantuvo el crecimiento por más tiempo y elaboró 30% más timidina. 20 Ejemplo 11 Producción de Timidina en un Fermentador de 30 litros con la cepa CMG2451 (pCG532) 5 Se utilizaron las siguientes condiciones para producir la timidina en un fermentador de 30 litros (B. Braun Biotec Biostat C) con la cepa CMG2451/532. El cultivo de siembra (50 ml) fue desarrollado en un matraz con agitación deflector de 4 litros en el medio LB (5 g/1 de extracto de 10 levadura Difco, 10 g/1 de triptona Difco, 5 g/1 de cloruro de sodio) con 30 mg/l de cloranfenisol y 25 mg/l de kanamisina a 30°C hasta que la DO 600 nm 2.37 fue alcanzada con un pH final de 6.69. El lote inicial en el fermentador (12 litros) que 15 contenía la composisión listada en la Tabla 9 fue esterilizado a 121°C por 55 minutos. Después del enfriamiento se agregó una solución separadamente esterilizada en autoclave (500 ml) para ajustar el lote a 20 g/1 de sorbitol y 3.0 g/1 de sulfato de magnesio 20 heptahidratado. También se agregó antes de la inoculación 200 ml de una solución esterilizada por filtración, diseñada para ajustar el lote inicial a 30 mg/l de cloranfenicol, 25 mg/l de kanamicina, 1 mg/l de d-biotina, 10 mg/l de tiamina y 10 mg/l de ácido nicotínico. -rttfwit-lftMllHrt r -"i-if'ií .. . ~ ?¿L? *?. , . . *.

Se prepararon tres soluciones de alimentación: a) Cerelose 2001 (monohidrato de dextrosa) 562 g/1 con 2 mg/l de biotina, 20 mg/l de tiamina, 20 mg/l de ácido nicotínico, y 30 mg/l de cloranfenicol; b) sorbitol 717 gl con 4 mg/l de 5 biotina, 40 mg/l de tiamina, 40 mg/l de ácido nicotínico, y 60 mg/l de cloranfenicol; y c) mezcla de nitrógeno crudo que contiene 360 g/1 de Amberex 695 AG (Red Star Yeast & Products, Milwaukee, Wisc), 6 g/1 de PP90M (DMV International, Fraser, NY) con IX de elementos en trazas y 10 0.1 ml/l de Mazu DF10PMOD11 (BASF) . Las soluciones de alimentación fueron esterilizadas por 40 a 50 minutos bajo una presión de vapor de 1.26 kg/cm2 (18 PSI) .

Tabla 9: Composición de lote inicial en fermentador de 30 15 litros 20 25 ^jH¡lg^!l . ^i * i Las condiciones de operación fueron como sigue: temperatura inicial 31°C; RPM 600; flujo de aire 3 LPM; pH 6.8; presión 0 Barias. El oxígeno disuelto fue controlado a 25% de saturación utilizando un circuito de control de la velocidad de flujo de aire. La RPM fue incrementada a 750 RPM a las 8 horas, 850 RPM a las 9 horas y 950 RPM al tiempo del cambio de temperatura de 31°C a 35.5°C a 9.2 horas cuando el cultivo alcanzó 37.8 de DO. Comenzando a las 9.7 horas, fue aplicada contrapresión hasta un máximo de 0.6 Barias para ayudar a la transferencia del oxígeno hacia el cultivo. La velocidad de cambio de temperatura para la inducción de la síntesis de la timidina fue de 0.2°C por minuto. Después de que la masa celular alcanzó 20 DO a 600 nm (lectura después de la dilución en ácido sulfúrico 50 mM para disolver las sales) , alimentaciones de lote de 85 ml de la solución de alimentación de sorbitol (b) se realizaron por cada incremento de 5 DO en la masa celular. Una alimentación de lote de sorbitol a las 16.7 horas fue detenida y se inicio 5 la alimentación de monohidrato de dextrosa (glucosa) (a) bajo el control del circuito DO PID del fermentador B. Braun con un punto de ajuste de 25%. Simplemente iniciado cuando el oxígeno disuelto estuvo por debajo de 25% de alimentación de azúcar se detuvo, y cuando la DO fue mayor de 25% de la 10 alimentación de azúsar fue ensendido . El protocolo autorregula la concentración de glucosa manteniendo la concentración baja, pero no permite que el cultivo sea privado de glucosa por un periodo de tiempo muy prolongado. Las alimentaciones de nitrógeno crudo de 500 ml fueron 15 realizadas a las 11 horas, 16.2 horas, 21.2 horas, 28.2 horas, 33.2 horas y 40.5 horas. La masa celular, la acumulación de timidina y desoxiuridina durante la fermentación se muestran en la Figura 5. 20 Ejemplo 12 Purificación de la Timidina a partir del Medio de Fermentación Se suspendió Dowex Optipore L-285 (The Dow Chemical Company) en agua desionizada y se empaquetó en una columna de vidrio de 48 mm de diámetro, haciendo un volumen de lecho de aproximadamente 500 ml . La columna fue lavada con 500 ml de hidróxido de sodio al 5%, luego se lavó con agua desionizada hasta que el efluente fue de pH 7.0. 500 ml de caldo de fermentación con la concentración de timidina (TdR) de 4.890 g/1 y la concentración de desoxiuridina (UdR) de 1.040 g/1 se cargó sobre la columna. La columna ' se lavó con dos volúmenes de lecho de agua desionizada. Se eluyeron TdR y UdR con dos volúmenes de lecho de 5% de alcohol reactivo (etanol 90.5%, metanol 4.5%, alcohol isopropílico 5%) seguido por dos volúmenes de lecho de alcohol reactivo al 10% y dos volúmenes de lecho de alcohol reactivo al 15%. La TdR y la UdR en las fracciones de 25 ml es mostrada en la Figura 6. La columna fue regenerada mediante lavado con hidróxido de sodio al 5%, luego con agua desionizada a pH 7.0 y el procedimiento se repitió. Las fracciones 91-160 fueron combinadas entre sí a partir de las dos corridas separadas y se secaron utilizando un evaporador rotatorio a vacío. La timidina fue disuelta -«. »^fc * ? í nuevamente en una cantidad mínima de agua caliente y se cristalizó a 4°C. Luego los cristales fueron recristalizados dos veces y se secaron en un horno a 55°C por 15 horas. Se obtuvo un total de 979.8 mg de timidina cristalina con una pureza mayor de 99% que debería ser adecuada para el uso como un intermediario farmacéutico. Las fracciones colaterales que contenían la desoxiuridina y la timidina fueron combinadas con licores madre y reducidas por un evaporador rotatorio a vacío hasta un volumen final de 1200 ml con alcohol reducido. La cantidad total de TdR en esta solución de 1200 ml fue de 3571 mg. La recuperación total (incluyendo los 3571 mg de las fracciones colaterales de TdR) fue de 93.1%.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Glaxo Group Limited Anderson, David M 5 Liu, Lin Podkovyrov, Sergey Wang, Baomin <120> Vectores, células y procesos para la producción de 10 desoxirribonucleósidos de pirimidina <130> P1049 <140> <141> 15 <150> US 09/345492 <151> 1999-07-01 <150> US 60/141827 20 <151> 1999-07-01 <160> 9 <170> Patentln Ver. 2.1 25 - -"^*-*-—--• <210> 1 <211> 34 <212> ADN <213> Sesuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador <400> 1 10 tattctagac gattttcaag ttgaggactt atgc 34 <210> 2 <211> 35 <212> ADN 15 <213> Secuensia Artificial <220> <223> Descripsión de la Secuencia Artificial: Cebador <400> 2 20 tatatcgata attcattaca atttacacgc tgcas 35 <210> 3 <211> 35 <212> ADN 25 <213> Sesuensia Artifisial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador <400> 3 tatatcgata aatgtaaatt taaggattct aaatg 35 <210> 4 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador <400> 4 tatgtcgact ccttaaaagt attttttaaa actc 34 <210> 5 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: inserto de ADN <220> <223> Parte de un inserto de ADN de doble hebra. La parte no sobresaliente de la SEQ ID NO. 6 es el complemento <400> 5 cgagcccgcc taatgagcgg gctttttttt 30 <210> 6 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Inserto de ADN <220> <223> Parte de un inserto de ADN de doble hebra. La SEQ ID NO. 5 es el complemento de la parte no sobresaliente de la secuencia <220> <221> características_misc . <222> (1) .. (4) <223> Sobresaliente j»k.:k. ti ¿ ,t ,.í.?t2 k-.~¡.. -kt..Mtt^.!t - i? . <220> <221> características_misc, <222> (35) .. (38) <223> Sobresaliente <400> 6 gtacaaaaaa aagcccgctc attaggcggg ctcgggcc 38 <210> 7 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 7 gatccggagg ataaatgaaa caataccaag atttaat 37 <210> 8 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> í _ A - * ,Jto— - ... - , i r& 1. <223> Secuensia Artificial: Oligonucleótido: <400> 8 taaatcttgg tattgtttca tttatcctcc g 31 <210> 9 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador <400> 9 agcaaacatt aaacagsgtg caattacata ttgataatsa ggtts 45 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (48)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una construcción de ADN, caracterizada porque comprende una unidad transcripcional que comprende un gen de la ribonucleótido-reductasa y un gen de la tiorredoxina o un gen de la uridina-cinasa, y/o un gen de la dCTP-desaminasa.

2. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una unidad transcripcioríal que comprende un gen de la ribonucleótido-reductasa y un gen de la tiorredoxina.

3. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una unidad transcripcional que incluye un gen de la uridina-cinasa y/o un gen de la dCTP-desaminasa.

4. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una unidad transcripcional que incluye un gen de la uridina-cinasa y un gen de la dCTP-desaminasa.

5. Una construcción de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque la construcción es un vector extracromosómico. il ? » J»« &*Jt I

6. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el vector es un plásmido, virus, transposón, minicromosoma o fago.

7. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el vector es un plásmido, en donde el gen de la ribonucleótido-reductasa es un gen de nrdA y/o un gen de nrdB, y en donde el gen de la tiorredoxina es un gen de nrdC y los genes están acomodados en un operón.

8. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la unidad transcripcional comprende un gen nrdA y un gen nrdB.

9. ' Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque los genes nrdA y nrdB están localizados con dirección hacia abajo (3') del gen nrdC.

10. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el gen nrdc está con dirección hacia arriba (5') del gen nrdA, y el gen nrdA está con dirección hacia arriba (5') del gen nrdB.

11. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque comprende además un elemento regulador.

12. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el elemento regulador se selecciona del grupo que consiste de un promotor, un operador, una secuencia de terminación, una secuencia de iniciación, una secuencia de iniciación y un sitio de enlace al ribosoma.

13. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el promotor es el promotor P o un derivado del mismo.

14. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la secuencia de terminación es un terminador sintético.

15. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el gen nrdA es modificado tal que la ribonucleótido-reductasa codificada por la unidad es menos sensible a la inhibición alostérica que la ribonucleótido-reductasa codificada por la unidad que comprende un gen nrdA no modificado.

16. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el gen nrdA es modificado en un sitio de enlace a dTTP.

17. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el gen nrdA es modificado para codificar un cambio Ala-a-Ile en la posición 79 en el producto de expresión de nrdA.

18. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque los genes nrdA, nrdB y nrdC son derivados de un fago T. 19. Una construcción de AD? de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el fago T es un fago

T uniforme.

20. Una construcción de AD? de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el fago T uniforme es un fago T4.

21. Una construcción de AD? de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque la construcción comprende además un gen de la timidilato- sintasa.

22. Una construcción de AD? de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el gen de la timidilato-sintasa es el gen td.

23. Una construcción de AD? de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el gen td está localizado sobre el mismo vector que los genes nrdA, nrdB y nrdC.

24. Una construcción de AD? de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el gen td está localizado en el mismo operón que los genes nrdA, nrdB y nrdC .

25. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el gen td está localizado con dirección hacia abajo (3') (en términos de la estructura de lectura) a partir de los genes nrdA, nrdB y nrdC .

26. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el gen td es derivado de un fago T.

27. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el gen td es derivado de un fago T uniforme.

28. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el gen td es derivado del fago T4.

29. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque comprende un gen de la uridina-cinasa y un gen de la dCTP-desaminasa.

30. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la construcción de ADN comprende un gen de a uridina-cinasa y un gen de la dCTP-desaminasa.

31. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1, 3 ó 4, caracterizada porque el gen de la uridina-cinasa es un gen udk.

32. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1, 3 ó 4, caracterizada porque el gen de la dCTP-desaminasa es un gen dcd.

33. Una célula huésped modificada, caracterizada porque comprende una construcción de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

34. Una célula huésped modificada, de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la célula huésped muestra actividad de uracilo-ADN-glucosilasa reprimida o ausente.

35. Una célula huésped modificada, de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque una o más secuencias de ADN de la célula huésped que codifican para la actividad de la uracilo-ADN-glucosilasa han sido modificadas para codificar los productos de expresión que muestran niveles reprimidos, bajos o nulos de la actividad de uracilo- ADN-glucosilasa .

36. Una célula huésped modificada, de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la secuencia de ADN de la célula huésped es un gen ung.

37. Una célula huésped modificada, de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque una o más secuencias de ADN de la célula huésped que codifican para la actividad de uracilo-ADN-glucosilasa han sido eliminadas.

38. Una célula huésped modificada, de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la célula es un eucariote o un procariote.

39. Una célula huésped modificada, de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la célula huésped se selecciona del grupo que consiste de E. coli , Salmonella, Pseudomonas, Bacillus y Saccharomyces .

40. Una célula huésped modificada que comprende una construcción de ADN, cuya construcción incluye una unidad de ADN de transcripción, cuya unidad comprende un gen de la ribonucleótido-reductasa y un gen de la tiorredoxina, en donde la ribonucleótido-reductasa muestra menos sensibilidad a la inhibición atmosférica que el equivalente de tipo silvestre de la reductasa, y caracterizada la célula huésped porque comprende además una o más de las siguientes característisas : a) una unidad de transcripción localizada sobre la construcción de ADN, que comprende un gen de la timidilato-sintasa heterólogo al gen de la timidilato-sintasa de la célula huésped; b) una unidad de transcripción localizada sobre la construcción de ADN, que comprende un gen de la uridina-cinasa; tA..fct c) una unidad de transcripción localizada sobre la construcción de ADN que comprende un gen de la dCTP-desaminasa; y d) actividad de la uracilo-ADN-glucosilasa reprimida o ausente .

41. Una célula huésped modificada, de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el gen de la ribonucleótido-reductasa es modificado en un sitio de enlace a dTTP.

42. Una célula huésped modificada, de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la ribonucleótido-reductasa es el gen nrdA y la modificación es un cambio Al-a a He en la posición 79 en el producto de expresión nrdA.

43. Una célula huésped modificada, de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la construcción de ADN comprende el gen de la uridina-cinasa y el gen de la dCTP-desaminasa.

44. Una célula huésped modificada, de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la célula comprende cada una de las características (a) a (d) .

45. Un proceso para la producción de los desoxirribonucleósidos de pirimidina, caracterizado el proceso porque comprende el cultivo de una célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-44. J.? *??.i -i .^ >»«~

46. Un proceso de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el desoxirribonucleósido es timidina.

47. Un proceso para la fabricación de la azidotimidina, caracterizado porque comprende el cultivo de una célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicasiones 33-44.

48. Un medio de cultivo, caracterizado porque comprende una célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-44. faH>f t