ES2290041T3 - Vectores, celulas y procedimientos para la produccion de desoxirribonucleotidos de piridina. - Google Patents
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Abstract
Una construcción de ADN que comprende una unidad transcripcional que comprende: a) un gen nrdA de la reductasa del ribonucleótido de T4; b) un gen nrdB de la reductasa del ribonucleótido de T4; y c) un gen nrdC de tiorredoxina de T4 caracterizada porque el gen nrdA del T4 tiene una mutación en la secuencia que codifica la región que enlaza al dTTP en la reductasa del oligonucleótido T4 que no altera la funcionalidad básica de la enzima y de manera que la reductasa del ribonucleótido de T4 ha reducido el enlace al dTTP comparado con la enzima silvestre.
Description
Vectores, células y procedimientos para la
producción de desoxirribonucleótidos de piridina.
La presente invención se refiere a la producción
de pirimidinas, purinas y sus derivados, por ejemplo,
desoxirribonucleóxidos, usando células modificadas genéticamente
que comprenden nuevas construcciones de ADN.
La timidina es útil como intermedio
farmacéutico, particularmente, para la síntesis química de
azidotimidina ("AZT," vendida bajo el nombre comercial
ZIDOVUDINE). Aunque la AZT del tipo ZIDOVUDINE era una de las
primeras terapias desarrolladas contra el VIH del SIDA, continúa
teniendo un uso importante y expandido (Langreth, R., The Wall
Street Journal, Nov. 21, 1995, pág. B12). La AZT del tipo
ZIDOVUDINE es particularmente valiosa cuando se usa en terapias de
combinación como una combinación con lamivudine (también conocida
como 3TC), vendida bajo nombre comercial EPIVIR. Esta combinación
de lamivudine y 3TC se vende bajo el nombre comercial
COMBIVIR. Aunque el virus VIH puede mutar para crear resistencia a
AZT o a 3TC, la combinación nucleótido-análogo de
tipo COMBIVIR es particularmente eficaz porque la transcriptasa
inversa no puede evidentemente ser resistente a ambos nucleósidos
análogos al mismo tiempo (Larder, B.A. et al., Science
269: 696-699, 1995). El AZT de tipo ZIDOVUDINE es
también útil junto con fármacos de tipo inhibidor de la proteasa del
VIH (Waldholz, M., The Wall Street Journal, 30 de enero,
1996, pág. B1), y en el tratamiento de mujeres embarazadas
infectadas con el VIH para reducir la frecuencia de infección del
feto al nacer. En 1997, aproximadamente 600.000 niños murieron por
SIDA contraído, a través de sus madres, al nacer. El AZT de tipo
ZIDOVUDINE tomado durante varios meses antes del nacimiento puede
reducir en dos tercios la transmisión del virus a los niños. La
timidina producida por síntesis química usada en la fabricación de
AZT tiene un coste muy significativo.
En el documento U.S. 5.213.972 (McCandliss y
Anderson, en adelante "la patente '972"), se describe un
procedimiento para la producción de desoxirribonucleósido de
pirimidina (PdN) (véanse, en particular, los ejemplos 7 a 14 de la
patente '972). Se enseña un microorganismo con capacidad para
replicarse que comprende y que expresa una secuencia de ADN que
codifica un desoxirribonucleótido de pirimidina fosfohidrolasa que
transforma un monofosfato de PdN en un desoxirribonucleósido de
pirimidina. Más particularmente, McCandliss y Anderson,
supra, describen un procedimiento de fermentación que puede
ser usado para producir timidina que supone la expresión de
desoxitimidilato-fosfohidrolasa (dTMPasa) del
Bacillus bacteriófago PBS1. Este tipo de enzima se ha
encontrado en la naturaleza expresado por bacteriófagos que no
contienen timidina en su ADN, pero en vez de eso incorpora
compuestos como desoxiuridina o
hidroximetil-desoxiuridina.
En la fermentación de timidina descrita en la
patente '972, las enzimas que degradan la timidina
(timidina-fosforilasa y
uridina-fosforilasa) han sido eliminadas por
mutación de manera que se acumula timidina. Así, el uso de enzima
dTMPasa ayuda a crear el camino para permitir la síntesis de
timidina. La expresión de dTMPasa sóla, sin embargo, puede no
asegurar un nivel comercialmente viable de producción de timidina.
En consecuencia, hay una necesidad continua de realzar la
producción de timidina mediante células que expresan dTMPasa para
fabricar la producción de timidina por fermentación comercialmente
viable, disminuyendo el coste de la producción respecto a los
procedimientos actuales de síntesis química.
El camino bioquímico para la producción de
desoxinucleótido de pirimidina, por ejemplo, en E. coli es
muy regulado a los niveles de transcripción y de translación así
como al nivel de proteína por mecanismos que incluyen atenuación,
inhibición de la alimentación y activación de la enzima. Neuhard, J.
y R.A. Kelln, Biosynthesis and Conversion of Pyrimidines, Capítulo
35 [In] Neidhardt, F.C. et al. [eds] "Escherichia
coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology",
Segunda Edición, Vol. I, pág. 580-599, ASM Press,
Washington D.C., 1996. La expresión de dTMPasa y la eliminación de
la rotura de timidina por mutaciones en los genes deoA
(timidina-fosforilasa), udp
(uridina-fosforilasa) y tdk
(timidina-quinasa) y, por tanto, resultando
productos de expresión que dan como resultado la síntesis de
timidina en E. coli pero no a un nivel comercialmente
viable.
La biosíntesis de purinas y pirimidinas supone
el paso normal de reducir un difosfato de ribonucleósido (en
algunas especies trifosfato) en su correspondiente análogo desoxi.
En el proceso global, la reducción del resto ribosa a
2-desoxirribosa requiere un par de átomos de
hidrógeno que son finalmente donados por NADPH y H^{+}. Sin
embargo, el dador electrónico inmediato no es el NADPH sino la forma
reducida de una proteína estable al calor llamada tiorredoxina o
glutarredoxina y al menos otra fuente no identificada ya que el
sistema reductasa-ribonucleótido de E. coli
todavía trabaja en los mutantes dobles trxA (tiorredoxina) y
grx (glutarredoxina) (Neuhard y Kelln, supra). Los
equivalentes reductores de la tiorredoxina reducida son
transferidos al difosfato de ribonucleósido reductasa que transporta
el proceso de reducción. La manipulación de, por ejemplo, pudo
probarse que esta etapa era útil en la mejora de la producción
comercial de los desoxinucleósidos de purina y pirimidina.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar nuevas construcciones de ADN, por ejemplo, vectores y
microorganismos modificados genéticamente que comprenden dichos
vectores, particularmente para usar en la producción de cantidades
recuperables, especialmente cantidades, comercialmente útiles, de
desoxinucleósidos de pirimidina y purina.
También es un objeto de la presente invención
proporcionar procesos que representen una mejora sobre los
anteriormente descritos McCandliss y Anderson.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se ha proporcionado una construcción de ADN que comprende
una unidad transcripcional que comprende un gen de reductasa de
ribonucleótido y un gen tiorredoxina.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se ha proporcionado una célula huésped modificada que
comprende una construcción de ADN según la invención.
De acuerdo todavía con otro aspecto de la
presente invención, se ha proporcionado un medio de cultivo que
comprende las células huéspedes modificadas de la invención y
procesos para la producción de una purina o pirimidina, por ejemplo
timidina, que comprende el uso de dichas células huéspedes
modificadas.
En una realización, las células huéspedes
comprenden una construcción de ADN cuya construcción comprende una
unidad de ADN transcripcional (por ejemplo, un operón) cuya unidad
comprende secuencias de ADN que codifican la reductasa del
ribonucleótido y tiorredoxina en la cual dicha reductasa presenta
menos sensibilidad a la inhibición alostérica que una célula
huésped silvestre equivalente o contraparte.
También se proporcionan células huéspedes
modificadas genéticamente que comprenden y que expresan la
construcción y el medio de cultivo que comprenden las células
huéspedes modificadas.
Los respectivos aspectos de la presente
invención describen por primera vez una pluralidad de avances en la
enseñanza del documento U.S 5.213.972 para proporcionar
construcciones mejoradas de ADN y células huéspedes que comprenden
las construcciones para usar en la producción comercial de
desoxiribonucleósidos de pirimidina, particularmente, timidina.
La construcción de la presente invención puede
ser cromosómica o más preferiblemente
extra-cromosómica, por ejemplo localizada en un
vector.
Los vectores de la presente invención incluyen
plásmido, virus, transposones, minicromosoma o fago, preferiblemente
plásmido. El vector que comprende la unidad de transcripción puede
ser introducido en la célula huésped según cualquier procedimiento
conveniente conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo
transducción, electroporación o transformación P1. Células
huéspedes adecuadas útiles en la presente invención incluyen
eucariotas y procariotas (por ejemplo, bacteria). Las procariotas
incluyen E. coli, Salmonella, Pseudomonas, Bacillus, y cepas
y mutantes de los mismos. La preferida es la E.coli debido a
la gran cantidad de información, herramientas genéticas y alelos
mutantes de los que se dispone. Es particularmente preferido que un
procedimiento de transducción esté disponible para la célula
huésped de elección que permita mutaciones que se muevan fácilmente
de una célula huésped a otra y faciliten mutación genética del
huésped sin requerir mutación directa en cualquier momento que se
desee una nueva mutación.
Los autores de la presente invención han
encontrado que el uso de genes nrdA, nrdB and
nrdC del bacteriófago T4 son particularmente útiles para
codificar la reductasa y la tiorredoxina en E. coli. Véase
Sjöberg, B. M. et al., EMBO J.,
5:2031-2036 (1986); Tseng, M.-J., et al.,
J. Biol. Chem. 263:16242-16251 (1988); y
LeMaster, D.M., J. Virol. 59:759-760 (1986).
Más específicamente, una mejora muy significativa en la producción
de timidina E. coli se logró por la clonación y expresión de
genes nrdA y nrdB del bacteriófago T4 que codifican
la reductasa del ribonucleótido junto con el nrdC del T4 que
codifica tiorredoxina ya que la reductasa de ribonucleótido de T4
no puede usar tiorredoxina de E. coli. La reductasa del
ribonucleótido codificada en T4 se encontró que era relativamente
insensible a control por inhibición alostérica in vitro
comparada con la enzima de E. coli (Berglund, O., J. Biol.
Chem. 247:7276-7281, 1972). Por ejemplo, a
diferencia de la enzima de E. coli (Berglund, O., J. Biol.
Chem. 247: 270-7275, 1972) la reductasa de
ribonucleótido de T4 no es inhibida por dATP, sino estimulada en
realidad por dATP y ATP (Berglund, O., J. Biol. Chem.
247:7276-7281, 1972).
Las secuencias de ADN que codifican el
ribonucleótido reductasa (por ejemplo, genes nrdA y
nrdB) y tiorredoxina (por ejemplo, el gen nrdC) son
derivados del fago T4 (Tseng et al (supra)). Véase
Campbell, A.M., Bacteriophages, Capítulo 123, In Neidherdt,
supra; y Mathews, C.K. et al. (eds.) Bacteriaophage
T4, American Society of Microbiology, Washington, D.C., 1983. El
término "derivado de" se entiende que define no sólo una
fuente en sentido de su origen físico sino también para definir
material que tiene características estructurales y/o funcionales
que corresponden a material que se origina en la fuente de
referencia.
Otra característica útil de la enzima del fago
T4 es su especificidad de sustrato. La reductasa de ribonucleótido
normal de E. coli usa UDP como un sustrato sólo de forma
mediocre ya que el K_{m} para UDP es aproximadamente 10 veces
mayor para UDP que para CDP (Neuhard and Kelln, supra). Sin
embargo, la enzima T4 tiene sólo una diferencia de dos veces en la
K_{m} (Berglund, O., J. Biol. Chem. 247:
7276-7281, 1972) entre los sustratos CDP y UDP que
permiten dos vías para la síntesis de dUTP. Aunque ha habido
intentos para obtener la expresión funcional de la reductasa de
ribonucleótido de T4 en E. coli, esfuerzos previos sólo
tuvieron éxito en la expresión de de los componentes de forma
separada y pudo demostrar actividad sólo mezclando in vitro
(Tseng, M.-J., P. He, J.M. Hilfinger y G.R. Greenberg, J.
Bacteriol. 172: 6323-6332, 1990). Aunque no se
limita por la teoría, los autores de la invención creen que quizás
debido a la falta de modelo usual de inhibición de la alimentación,
la expresión de la reductasa de ribonucleótido de T4 en E.
coli es letal y debe ser expresada de forma cuidadosamente
condicional.
Vectores de la presente invención comprenden,
preferiblemente, un elemento regulador (por ejemplo, promotor tal
como lambda P_{L}, operador, activador, represor como represor
lambda, particularmente una variante sensible a la temperatura, y/o
realzador), apropiadas secuencias de terminación, secuencias de
iniciación y sitios de enlace de ribosomas. El vector puede
comprender, además, un marcador seleccionable. Alternativamente,
elementos reguladores (particularmente represor lambda) pueden ser
localizados en el cromosoma de la célula huésped. Se prefiere que
nrdA y nrdB estén dispuestos en el vector aguas abajo
(en términos de marco de lectura) del nrdC. En particular,
se prefiere que nrdB esté dispuesto aguas abajo del
nrdA. Así, la disposición más preferida es un vector que
comprende un operón que comprende nrdCAB.
La reductasa de ribonucleótido de T4 no está
libre de control de alimentación in vivo (J. Ji, R.G. Sargent
y C.K. Mathews, J.Biol.Chem. 266:
16289-16292, 1991; y Berglund supra). Para
fomentar más la reducción del difosfato de ribonucleótido, por
ejemplo para la producción de timidina, el gen que codifica la
subunidad reguladora, nrdA, es modificado, por ejemplo, por
una propuesta mutacional para crear una enzima capaz de una
incrementada producción de timidina debido, por ejemplo, a una
reducida sensibilidad a inhibición alostérica, por ejemplo,
inihibición por el producto inmediato de la enzima o inhibición por
un producto resultante de un caso aguas abajo.
Para construir mutantes nrdA de T4,
pueden usarse mutagénesis dirigida al sitio para modificar o cambiar
(por ejemplo, sustituir) bases de genes que codifican aminoácidos
sospechosos de alterar por ejemplo sitios de enlace de dTTP
involucrados en regulación alostérica. El análisis de secuencia de
aminoácidos de la reductasa de ribonucleótido de T4 reveló un
segmento que parece ajustar bien con una secuencia de consenso
postulada pensada para estar involucrada en el enlace dTTP (E.M.
Mclntosh y R.H. Haynes, Mol. Cell. Biol. 6:
1711-1721, 1986). En esta región de la reductasa de
ribonucleótido de T4 puede hacerse una mutación usando mutagénesis
dirigida al oligonucleótido. La propuesta general puede ser modelada
después del esfuerzo de More et al. (More, J.T., J. M.
Ciesla, L.-M. Changchien, G.F. Maley y F. Maley, Biochemistry
33: 2104-2112, 1994) para reducir el enlace a dTTP
del desoxicitidilato de la desaminasa, aunque en la técnica se
conocen otros procedimientos, por ejemplo Burks et al (1997)
Proc. Natl. Acad. Sci. 94, pág. 412 a 417; Caldwell y Joyce (1992)
PCR Methods Applic 2, pág. 28-33; Stemmer (1994)
Proc. Natl. Acad. Sci. 91, pág.10747-10751;
Cunningham y Wells (1989) Science 244, pág. 1081 a 1085 y Krishnan
et al (1994) FEBS Lett 353, pág.185 a 188. Una mutación,
^{79}Ala a Ile, en el nrdA de T4 pareció ser muy útil. Por
ejemplo, la productividad de timidina de cepas que contenían el
mutante ^{79}Ala a Ile en el nrdA de T4 evaluado por un
procedimiento de fermentación en matraz con vibración se incrementó
significativamente. Como se demuestra más adelante, los autores de
la presente invención lograron incrementar en al menos un 25% sobre
la cepa parental sin este sencillo cambio.
Aunque el ^{79}Ala a Ile es un ejemplo de
éxito, los expertos en la técnica se darán cuenta ahora de que para
obtener el efecto deseado en esta región son ahora posibles muchos
cambios de otros aminoácidos, siendo ése para alterar
suspuestamente el enlace a dTTP, pero no para alterar la
funcionabilidad básica de la enzima. Por ejemplo, puede utilizarse
la sustitución de ^{79}Ala por otros aminoácidos que representan
cadenas laterales similares a Ile (por ejemplo, leucina y
valina).
En otro aspecto de la presente invención se ha
proporcionado una célula huésped que comprende una construcción
cuya construcción (por ejemplo, vector) comprende una unidad
transcripcional que comprende secuencias de ADN que codifican la
reductasa del ribonucleótido heterólogo y tiorredoxina cuya
reductasa es menos sensible a inhibición alostérica que la célula
huésped silvestre equivalente o contraparte. Para los expertos en la
técnica será evidente que determinar la sensibilidad relativa de
una reductasa heteróloga candidato a la inhibición alostérica
comparada con la célula huésped silvestre equivalente es un asunto
de experimentación y observación rutinarias.
Unidades de transcripción que comprenden
secuencias de ADN, por ejemplo, genes nrdA, nrdB y
nrdC son preferiblemente operones en los que los genes
nrd están dispuestos en tándem. Esto permite la transcripción
de estos genes como una transcripción simple de mRNA. Para
minimizar el gasto de energía improductiva por la célula huésped y
minimizar además el tamaño del plásmido, se prefiere que el operón
contenga sólo las secuencias genéticas requeridas en la
codificación de reductasa y tiorredoxina (que incluyen cualquier
elemento regulador o de control). Esto puede necesitar la
separación de ADN superfluo (por ejemplo, el intrón inusual en el
gen nrdB del fago T4, Sjoberg, B-M., et
al EMBO J.5: 2031-2036, 1986).
En realizaciones preferidas de la presente
invención, cada uno de los avances enseñados en la presente memoria
se incorpora en una célula huésped. Así, en una realización de la
presente invención particularmente preferida, se proporciona una
célula huésped modificada en la que la célula comprende una
construcción de ADN (por ejemplo vector) que comprende una unidad
de transcripción de ADN (por ejemplo operón) cuya unidad comprende
secuencias de ADN que codifican una reductada de ribonucleótido de
T4 modificada y tiorredoxina en la que dicha reductasa presenta
menos sensibilidad a inhibición alostérica que la célula huésped
silvestre equivalente o contraparte.
Las células huéspedes modificadas según la
presente invención son particularmente útiles en la producción
comercial de desoxinucleósidos de pirimidina. En un uso
particularmente ventajoso de la presente invención, pueden usarse
en la producción comercial de timidina, células huéspedes de E.
coli que comprenden (hospedaje) un plásmido modificado según la
presente invención (particularmente junto con las enseñanzas de la
patente '972). Así, las células huéspedes modificadas según la
presente invención pueden comprender además dTMPasa derivada de,
por ejemplo, PBS1 y las mutaciones enseñadas en la patente '972, por
ejemplo deoA, tdk- 1 y udp-1.
Generalmente, se emplea un procedimiento de
fermentación que supone sumergir las células en un medio de cultivo
contenido dentro de un recipiente adecuado. Después de cultivar en
condiciones apropiadas, la timidina producida se recolecta y se
purifica (se enriquece), si es necesario, hasta calidad farmacéutica
según protocolos estándar. La timidina purificada puede usarse
luego en la producción de medicamentos, por ejemplo composiciones
farmacéuticas como AZT.
La presente invención es ilustrada sólo a modo
de ejemplo y con referencia a las siguientes figuras en las
que:
La Fig.1 ilustra, esquemáticamente, una vía para
la construcción de pCG366. Debe observarse que los plásmidos no
están dibujados a escala.
La Fig.2 ilustra, esquemáticamente, una vía para
la construcción de pCG374 y pCG375.
La Fig.3 ilustra un mapa del plásmido
pCG532.
La Fig.4 ilustra el crecimiento y producción de
timidina por una cepa recombinante de E. coli CMG2451
(Ung^{+}) y CMG2492 (Ung^{-}) que hospeda un plásmido pCG366
(nrdCAB td) según el Ejemplo 10.
La Fig.5 ilustra la producción de timidina en un
fermentador de 30 litros mediante E. coli CMG2451
(pCG532).
La Fig.6 ilustra TdR y UdR (mg/l) obtenida según
el protocolo de purificación del Ejemplo 12.
Los genes nrdAB del bacteriófago T4
fueron clonados realizando la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) con el ADN aislado del fago T4. Los cebadores del gen
nrdA de la PCR fueron: 5'-TAT TCT AGA
CGA TTT TCA AGT TGA GGA CTT ATG C-3' (Seq. id. 1); y
5'-TAT ATC GAT AAT TCA TTA CAA TTT ACA CGC TGC
AC-3' (Seq. id. 2).
El sitio de restricción XbaI se introdujo
en el principio del nrdA en el ADN amplificado, y el
ClaI se introdujo en el extremo 3' del nrdA. Los
cebadores de amplificación del gen nrdB de la PCR fueron:
| 5'-TAT ATC GAT AAA TGT AAA TTT AAG GAT TCT AAA TG-3' | (Seq. id. 3) y |
| 5'-TAT GTC GAC TCC TTA AAA GTA TTT TTT AAA ACT C-3' | (Seq. id. 4). |
El sitio de restricción ClaII era, así,
introducido en el principio del nrdB y el ApaI era
introducido en el extremo del nrdB en el ADN amplificado.
Los fragmentos de la PCR fueron clonados en vectores plásmidos como
se ilustra en la Fig. 1 según técnicas conocidas por los expertos en
la técnica. Los genes clonados nrdAB fueron confirmados por
el ensayo de actividad de la enzima. El gen nrdC del T4 se
clonó en pKC30 produciendo plásmido pDL51 (LeMaster, D.M., J.
Virology 59: 759-760, 1986) y fue suministrado
por D. LeMaster (Dept of Biochem., Univ. Wisconsin, Madison, WI).
El gen fue sub-clonado en un plásmido con genes
nrdAB como se ilustra en la Figura 1. Las fuentes de los
materiales de partida y la información de fondo usada en la Figura
1 se listan en la Tabla 1.
Un finalizador transcripcional sintético se usó
para la construcción de pCG198 y pCG301 (véanse la Fig. 1 y la
Tabla 1). Específicamente, se sometió a digestión el plásmido pBC
sk^{+} obtenido a partir de Stratagene (La Jolla,
California) con las enzimas de restricción Apa I y Asp718 I.
El ADN sintético que contiene la secuencia de terminación de la
transcripción ECOTGP (d' Aubenton Carafa et. al., J. Mol.
Biol. 216: 839-843, 1990) fue luego ligada
reemplazando la secuencia original entre sitios
\newpage
endonucleasa Apa I y Asp718 I. Este
fragmento volvió a crear la secuencia de reconocimiento Apa
I, pero destruyó la secuencia de reconocimiento Asp 718 1 en el
nuevo plásmido. El ADN insertado tenía la siguiente
composición
5'-CGAGC CCGCCTAATG AGCGGGCTTT
TTT TT -3'
3'-CCGGGCTCG GGCGGATTAC
TCGCCCGAAA AAAAACATG -5'
(mostrados como trenzas respectivas
en las seq. Id. 5 y 6) producidas a partir de dos
oligonucleótidos.
El plásmido pCG198 se combinó con pCG173 que
contiene el promotor lambda P_{L} del plásmido pKC30 clonado en
pBluescript II ks (Stratagene, La Jolla, California) como se
muestra en la Figura 1. Tanto pCB198 como pCG173 fueron sometidos a
digestión con Hind III y Asn I después fueron ligados
para crear nuevo plásmido pCG301 que contenía el promotor lambda
P_{L}, múltiples sitios de clonación de la enzima de restrición y
seguido por la secuencia de terminador ECOTGP copiada de la región
del péptido líder del operón del triptófano.
La actividad de la reductasa de ribonucleótido
de T4 se midió mediante HPLC por un procedimiento que no supone el
uso de radioisótopos y de sustrato UDP. El ensayo directo de la
reductasa del ribonucleótido contenía NADPH 1 mM, DTT 1
mM, dATP 0,5 mM, UDP 0,6 mM, Tris (pH 8,0) 20
mM y MgCl_{2} 5 mM. En estas condiciones, la
reductasa de ribonucleótido de E. coli se inhibe y no es
detectada. La reacción de la enzima (100 \muL) se detuvo por la
adición de 10 \muL de ácido tricloroacético al 50% (TCA). Después
de 10 minutos en hielo, las muestras son centrifugadas en una
microcentrífuga. El sobrenadante es extraído 4 veces con éter
dietílico para separar el TCA. Se añadían cinco ml del tampón Tris
(1,0 M, pH 8,0) seguido de 2 \mul de veneno de serpiente
de cascabel con una concentración de 40 mg/ml (Sigma), y la muestra
se incubó a 37ºC durante 60 minutos. Las muestras se calentaron
luego durante 3 minutos a 70ºC seguido por centrifugación durante 5
minutos para separar el precipitado. Los volúmenes son ecualizados,
luego se analizaron por HPLC con un detector de UV y desoxiuridina
como patrón. La columna es una Spherisorb ODS-2, 5
micras, 250 mm x 4,6 mm que usa una fase móvil de fosfato amónico
12 mM (pH 5,0) y un caudal de aproximadamente 1,0 ml/minuto.
Los resultados se muestran en la Tabla 2 para células que contienen
plásmido pCG343 que muestra la expresión funcional de la reductasa
de ribonucleótido de T4.
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\vskip1.000000\baselineskip
La cepa CMG1115 se describe completamente en
McCandliss y Anderson (Patente de EE.UU. 5.213.972). La CMG1115 fue
el punto de partida para desarrollar lo descrito en la presente
memoria. La cepa CMG1115 se mejoró para la productividad de
timidina mediante la selección por crecimiento en un medio de
cultivo que contenía 30 mg/l de 5-fluorouridina que
produjo cepa CMG2401. La cepa CMG2401 se seleccionó luego por
crecimiento en un medio de cultivo que contenía 30 mg/l de
3'-azido-3'-desoxitimidina
que producía cepa CMG2404. La CMG2404 requiere
L-prolina por crecimiento debido a la mutación no
heredada \Delta(lac-pro) a partir de
su padre original JM101. El emparejamiento Hfr entre CMG2404 y una
cepa Hfr CAG5053 (Singer, M. et al. Microbiological
Review: 5:1-24,1989) se realizó según técnicas
conocidas por los expertos en la técnica y produjo cepa CMG2434 que
es Lac^{+}, Pro^{+}. La mutación udp (uridina
fosforilasa) en CMG2434 tenía todavía actividad parcial uridina
fosforilasa que era evidente basado en la acumulación de timina
después de la inducción de producción de timidina. La mutación
udp se reintrodujo a partir de CGSC5128 (E. coli
Genetic Stock Center, Yale University) mediante transducción del
fago P1 según técnicas conocidas por los expertos en la técnica. El
metE3079::Tn10 de la cepa CAG18491 se transdujo
primero en CMG2434 para servir como un marcador de selección
positiva en la transducción de udp. Luego se transdujo el
udp-1 en el metE3079::Tn10
derivado de CMG2434 por selección por crecimiento sin
L-metionina en el medio de cultivo definido. El
derivado udp-1 se denominó cepa CMG2451. La
genealogía de CMG2451 se resume en la Tabla 3.
El gen td de T4 se clonó en
pKTd\Deltal por West et al. (J. Biol. Chem
261:13446-13450, 1986) sin el intron par de base
1017. El gen td se subclonó en pCG301 usando dos
oligonucleótidos como enlazadores con las siguientes secuencias:
5'-GAT CCG GAG GAT AAA TGA AAC AAT ACC AAG ATT TAA
T-3' (sec. id 7) y; 5'-TAA ATC TTG
GTA TTG TTT CAT TTA TCC TCC G-3' (seq. id. 8).
El plásmido resultante fue pCG356. El gen
td del pCG356 se subclonó luego en el pCG343 para crear
pCG360 (Fig. 1). El gen de resistencia a la tetraciclina y el
origen de replicación del plásmido pBR322 (Bolivar, F. et
al., Gene 2: 95-113, 1977) se subclonaron
en el pCG360 y se formó pCG366. La actividad
timidilato-sintasa se midió por el procedimiento
espectrofotométrico de Wahba y Friedkin (J. Biol.Chem. 236:
PC11-PC12, 1961). Los resultados se muestran en la
Tabla 4.
La fermentación de matraz con vibración se usó
para evaluar la productividad de timidina de diferentes
recombinantes de E. coli. El caldo de fermentación en matraz
con vibración y los procedimientos usados aquí, y en otros
ejemplos, se describe en el Ejemplo 6 de más adelante. En este caso,
se siembra un volumen de 20 ml por matraz con 2 ml de cultivo
semillero y se incuban en un vibrador a 30ºC. A aproximadamente 10
OD 600 nm, los matraces son transferidos a un vibrador a 37ºC
durante 30 minutos para inducir suavemente el promotor \lambda
P_{L}. Luego, los matraces se transfirieron a un vibrador a 35ºC
para continuar la fermentación. Durante la fermentación se
suministró la glucosa necesaria y el pH se ajustó a aproximadamente
7 con amoníaco según el color del rojo de fenol. La concentración
de timidina se midió mediante HPLC usando una columna de Spherisorb
ODS-2, 5 micras, 250 mm x 4,6 mm, y una fase móvil
de fosfato amónico 25 mM (pH 3,3) con un caudal de aproximadamente
1,5 ml/minuto.
La cepa CMG2451/pCG366 (nrdCAB y td de
T4) se comparó con CMG2451/pCG343 (nrdCAB de T4) en la
fermentación de matraz con vibración. La Tabla 5 muestra que la
concentración de desoxiuridina se reducía y se transformaba en
timidina en la cepa CMG2451/pCG366 debido al gen td de
T4.
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La mutación se introdujo usando mutagénesis
dirigida al sitio basada en un procedimiento descrito por Kunkel
(Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:
488-492,1985). Todos los materiales para la
construcción del mutante que incluyen ADN fagomido pTZ18U, fago
cooperador M13K07, cepas bacterianas de E. coli CJ236 y
MV1190, ADN polimerasa de T7 y ADN ligasa de T4 fueron
proporcionados en el equipo de mutagénesis in vitro
Muta-Gene de Bio-Rad Laboratories
(Hercules, CA). En primer lugar, el fragmento de ADN XbaI/HindIII
que contiene el gen nrdA del bacteriófago T4 se aisló del
plásmido pCG312 (ChemGen Corp., Tabla 1 anterior). El fragmento de
ADN XbaI/HindIII se clonó en los sitios
XbaI/HindIII del vector fagomido pTZ18U usando
protocolos estándar (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T.,
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva
York, 1989). El fagómido pCG464 que realiza el inserto se introdujo
en la CJ236 de E. coli. Esta cepa es deficiente en dUTPasa
(dut) y N-glucosilasa (ung) de uracilo
que da como resultado una sustitución ocasional de uracilo por
timina en el ADN recientemente sintetizado. ADN de una cadena de
pCG464 que contenía uracilo se aisló a partir de CJ236 según el
Manual de Instrucciones de Laboratorios Bio-Rad.
Este ADN (0,2 pMol) se hibridó con 6 pMol de cebador
fosforilado
5'-AGC AAA CAT TAA ACA GCG TGC
AATTAC ATA TTG ATA ATC AGG TTC-3'
(secuencia id. 9) que contenía la
secuencia de la mutación deseada (subrayada) que codifica la Ile en
lugar de la ^{79}Ala
original.
El ADN complementario de la cadena se sintetizó
usando ADN polimerasa de T7 como se describe en el protocolo de
Bio-Rad. Los productos de reacción se transformaron
en MV1190 de E. coli que contenía una
N-glucosilasa de uracilo silvestre, que degrada la
cadena parental que contiene uracilo, enriqueciendo así la cadena
mutante. La secuenciación de ADN directo usando el Sistema de
Secuenciación de ADN Silver Sequence de Promega Corp. (Madison, WI)
identificó plásmidos que contenían la mutación deseada. Parecía que
los cuatro transformantes analizados contenían plásmidos con la
mutación. Uno de ellos fue designado pCG492 y se usó para otros
experimentos. Para comprobar si la mutación afecta a la síntesis de
la timidina se introdujo en el plásmido de producción pCG366
(ChemGen Corp., Tabla 1 y Figura 1). Para ésto, el fragmento de ADN
KpnI/AflII de pCG366 que contiene la parte 5' del gen
nrdA se reemplazó por el fragmento KpnI/AflII
de pCG492 que contiene la mutación. El nuevo plásmido pCG494 se
introdujo en la cepa de producción CMG2451 (ChemGen Corp., Ejemplo
2 y Tabla 4 anteriores). El efecto de la mutación de nrdA de
T4 se evaluó por comparación con la producción de timidina por
CMG2451 (pCG494) y CMG2451 (pCG366) como se muestra en el Ejemplo 6
siguiente.
Los matraces deflectores de 250 ml que contenían
25 ml de medio de cultivo para la producción fueron sembrados con 2
ml de un cultivo semillero recién desarrollado en caldo LB con el
apropiado antibiótico añadido. Los cultivos se desarrollaron en un
vibrador a 30ºC a 250 rpm. Cuando la OD_{600} alcanzó
aproximadamente 5, los matraces se trasfirieron a un vibrador a
37ºC durante 30 min. Luego los matraces se transfirieron a un
vibrador a 35ºC para continuar la fermentación. El medio de cultivo
para la producción tiene la siguiente composición (g/l): Ardamine
YEP-S (Red Star Yeast & Products, Milwaukee, WI)
- 10; CaCO_{3} -10; MgSO_{4} - 0,4; rojo de fenol - 0,24; PP90BT
(DMV International, Fraser, N.Y.) - 4,5; sorbitol - 20;
cloranfenicol - 0,03; elementos traza (x 1.000) - 1 ml/l. La
formulación de los elementos traza (x 1000) es la siguiente (g/l):
ácido bórico - 0,05; cloruro cálcico - 20; sulfato de cobalto -
0,05; sulfato de cobre - 0,01; sulfato ferroso - 20; cloruro
férrico - 20; sulfato de manganeso - 0,5; molibdato sódico - 0,1; y
sulfato de cinc - 0,1. En el momento de la inducción se añaden 10
gramos por litro de Ardamine YEP-S. Durante la
fermentación se añadió glucosa a una media de cada dos horas (2,5
g/l). El pH en los matraces se mantuvo a aproximadamente 7,0 por la
adición de NH_{4}OH 4 N así estimado por el color del
colorante indicador rojo de fenol. La OD_{600} se leyó después de
diluir la muestra 1:10 en H_{2}SO_{4} 10 mM para dfisolver las
sales en el medio de cultivo. La concentración de timidina se midió
por HPLC C-18 de fase inversa con una columna
Spherisorb ODS-2 de Alltech y detector
espectrofotométrico Shimadzu a 260 nm. La fase móvil fue
NH_{4}H_{2}PO_{4} 25 mM (pH 3,3) en agua a la
velocidad constante de 1,5 ml/min.
Los resultados de la producción de timidina
mediante CMG2451 (pCG366) y CMG2451 (pCG494) después de 2, 17 y 25
horas después de inducción se presentan en la Tabla 6. Hubo dos
repeticiones de los matraces en este experimento y la variabilidad
entre matraces duplicados no superó el 15%. Los resultados muestran
que el mutante nrdA de T4 se comportó mejor que la cepa
nrdA silvestre. Esto fue confirmado en varios
experimentos independientes con matraces con vibración con las
mismas cepas bacterianas.
\vskip1.000000\baselineskip
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El gen dcd o el operón dcd udk
fueron clonados en el vector pACYC177. Este vector con el origen de
replicación p15a es diferente de plásmidos basados en co/E1
como pCG366 y, por eso, es compatible y puede ser mantenido en el
mismo huésped con plásmidos basados en co/E1. Los detalles de
las construcciones de plásmido que dan como resultado pCG374
(udk dcd) o pCG375 (dcd) se muestran en la Figura 2. Los
genes en estos plásmidos se expresan a partir del promotor nativo
de E. coli del operón udk dcd.
Usando selección para resistencia a la
ampicilina, se introdujeron plásmidos pCG374 y pCG375 en CMG2451
(pCG366) para probar el efecto sobre la producción de timidina en
el procedimiento de fermentación en matraz con vibración descrito
en el Ejemplo 6. Los resultados en varios puntos en el tiempo se
muestran en la Tabla 7. Aunque la actividad específica (timidina
por OD de células) es similar tanto con el gen udk como sin
él, las células con el gen udk en el segundo plásmido pCG374
crecían a una densidad de células superior y producían
significativamente más timidina (5,8 g/l comparada con 3,0 g/l para
la cepa con sólo el segundo plásmido dcd). Este resultado no
se preveía, ya que no está claro por qué la uirdina fosforilasa
podía tener este efecto.
Basado en este dato y otra información, el gen
udk se escogió para introducirlo junto con gen dcd de
E coli en la construcción de plásmido pCG532 (véanse el
Ejemplo 8 y la Figura 3).
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Los genes udk y dcd de E.
coli codifican kinasa y desaminasa dCTP, respectivamente, de
ribonucleótido pirimidina. Ambos genes fueron cartografiados para
un fragmento BamHI/PstI de ADN de 3,4 kb del fago 355 lambda
de la biblioteca genómica Kohara (Kohara, Y., Akiyama, K. e Isono,
K., Cell 50, 495-508, 1987). Parece que el
udk está situado aguas arriba del dcd y transcrito en
la misma dirección que el dcd (Neuhard, J. y Tarpo, L.,
J. Bacteriol. 175: 5742-5743, 1993). Los
genes fueron clonados en plásmido de producción en dos etapas.
Primero, un fragmento de ADN
BamHI/PstI de 3,4 kb de lambda 355 se clonó en un
sitio de clonación múltiple de plásmido pUC18
(Yamisch-Perron, C., Vieira, J. y Messing, J.,
Gene 33: 103-109,1985) (plásmido pCG358).
Luego, el fragmento fue escindido de la región polienlazadora de
pCG358 con BamHI y SphI y se clonó en lugar de un
fragmento de BglII/SphI de 0,7 kb (que contenía una
porción de gen con resistencia a la tetraciclina) de plásmido de
producción pCG494. El plásmido pCG532 final de 14,7 kb contiene el
origen de la replicación del grupo de compatibilidad colE1,
el gen con resistencia al cloranfenicol, los genes udk y
dcd y los genes nrdCAB del bacteriófago T4 (codifica
tiorredoxina y dos subunidades de la reductasa del ribonucleótido,
respectivamente) y los genes td del T4 (codifica timidilato
sintasa) bajo control del promotor P_{L} del lambda bacteriófago.
El gen nrdA del T4 del pCG532 era cambiado previamente
mediante mutagénesis dirigida al sitio (^{79}Ala a ile).
Un terminador transcripcional sintético es
localizado aguas abajo del gen td para impedir la lectura
transcripcional en la región de replicación. El mapa genético del
plásmido pCG532 es ilustrado en la Figura 3.
El plásmido pCG532 que contiene los genes
udk y dcd de E. coli fue introducido en la cepa
de producción CMG2451. La nueva cepa CMG2451 (pCG532) se ensayó
junto con cepa madre CMG2451 (pCG494) en los experimentos en matraz
con vibración para comparar la producción de timidina. Los
resultados de dos experimentos independientes se muestran en la
Tabla 8. El primer experimento se realizó como se ha descrito
anteriormente y las muestras se tomaron a 17 horas después de la
induction. En el segundo experimento, las células fueron inducidas a
una OD superior (aproximadamente 9) y las muestras fueron tomadas a
3 horas después de la inducción para análisis. En ambos casos, la
cepa que contenía los genes de udk y dcd clonados se
comportó mejor que la cepa madre.
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Una cepa negativa de ADN glucosilasa de uracilo
se construyó mediante la introducción de una mutación
ung::Tn10 (Varshney, U., et al., J. Biol.
Chem. 263:7776-7784, 1988) en CMG2451 huésped
usando transducción P1 como se ha descrito anteriormente, y se
denominó CMG2492. Se introdujo plásmido pCG366 en CMG2492. En la
Figura 4 que usa el procedimiento del matraz descrito en el Ejemplo
6 se muestra un experimento de comparación entre una cepa Ung^{-}
y una Ung^{+} para la síntesis de timidina en matraces con
vibración. Las células se desarrollaron en matraces de 250 ml a
30ºC, y la síntesis de timidina se indujo cambiando la temperatura
a 37ºC durante 30 min y luego cambiando a 35ºC. El huésped Ung^{-}
sin ADN glucosilasa de uracilo se mantuvo desarrollándose por más
tiempo y se produjo un 30% más de timidina.
Se usaron las siguientes condiciones para
producir timidina en un fermentador de 30 litros (B. Braun Biotec
Biostat C) con cepa CMG2451/532. El cultivo semillero (500 ml) se
desarrolló en un matraz de 4 l con vibración con deflectores en
medio de cultivo LB (5 g/l de extracto de levadura Difco, 10 g/l de
triptona Difco, 5 g/l de NaCl) con 30 mg/l de cloranfenicol y 25
mg/l de kanamicina a 30ºC hasta que se alcanzó OD 600 nm de 2,37
con un pH final de 6,69.
El lote inicial en el fermentador (12 litros)
que contenía la composición listada en la Tabla 9 se esterilizó a
121ºC durante 55 minutos. Después de enfriar, se añadió una solución
sometida a autoclave de forma separada (500 ml) se añadió para
ajustar el lote a 20 g/l de sorbitol y 3,0 g/l de MgSO_{4}\cdot7
H_{2}O. Antes de la siembra también se añadió una solución
estéril filtrada (200 ml) diseñada para ajustar el lote inicial a
30 mg/l de cloranfenicol, 25 mg/l de kanamicina, 1 mg/l de
d-biotina, 10 mg/l de tiamina y 10 mg/l de ácido
nicotínico.
Se prepararon tres soluciones de alimentación:
a) 562 g/l de Cerelose 2001 (dextrosa monohidratada) con 2 mg/l de
biotina, 20 mg/l de tiamina, 20 mg/l de ácido nicotínico y 30 mg/l
de cloranfenicol; b) 717 g/l de sorbitol con 4 mg/l de biotina, 40
mg/l de tiamina, 40 mg/l de ácido nicotínico y 60 mg/l de
cloranfenicol; y c) mezcla de nitrógeno en crudo que contenía 360
g/l de Amberex 695 AG (Red Star Yeast & Products, Milwaukee,
Wisc.), 6 g/l de PP90M (DMV International, Fraser, NY) con elementos
traza x1 y 0,1 ml/l de Mazu DF10PMOD11 (BASF). Las soluciones de
alimentación se esterilizaron durante 40 a 50 minutos bajo una
presión de vapor de 1,2654 kg/cm^{2}.
Las condiciones de funcionamiento fueron las
siguientes: Temperatura inicial 31ºC; rpm 600; caudal de aire 3
lpm; pH 6,8; presión 0 bar. El oxígeno disuelto se controló a una
saturación del 25% usando un bucle de servocontrol de caudal de
aire. Las rpm se incrementaron a 750 rpm a 8 horas, 850 rpm a 9
horas y 950 rpm al tiempo de cambio de la temperatura desde 31 a
35,5ºC a 9,2 horas cuando el cultivo alcanzó una OD de 37,8.
Comenzando a las 9,7 horas, se aplicó una contrapresión hasta un
máximo de 0,6 bar para ayudar en la transferencia de oxígeno dentro
del cultivo. La velocidad del cambio de la temperatura para
inducción de la síntesis de timidina fue de 0,2ºC por minuto.
Después de que la masa celular había alcanzado
una OD de 20 a 600 nm (lectura después de diluir en H_{2}SO_{4}
50 mM para disolver sales), se hicieron alimentaciones de lotes
de 85 ml de solución de alimentación de sorbitol (b) para cada
incremento de 5 en la OD en la masa celular. Se detuvo a una
alimentación de lote de sorbitol de 16,7 horas y se inició una
alimentación de dextrosa monohidratada (glucosa) (a) bajo el control
del bucle de servocontrol DO PID del fermentador B. Braun con un
valor de referencia del 25%. Planteado simplemente, cuando el
oxígeno disuelto era inferior al 25% la alimentación de azúcar
estaba inactiva y cuando DO era mayor del 25% la alimentación de
azúcar estaba activa. El propio protocolo regula la concentración de
glucosa que mantiene la concentración baja, pero no permite que el
cultivo carezca de glucosa durante un período de tiempo muy
prolongado. Las alimentaciones de nitrógeno crudo (500 ml) se
hicieron a 11 horas, 16,2 horas, 21,2 horas, 28,2 horas, 33,2 horas
y 40,5 horas.
La acumulación de masa de células, timidina y
desoxiuridina durante la fermentación se muestran en la Figura
5.
Dowex Optipore L-285 (The Dow
Chemical Company) fue suspendido en agua desionizada y se empaquetó
en una columna de vidrio de diámetro con 48 mM haciendo un
volumen de lecho de aproximadamente 500 ml. La columna se lavó
con 500 ml de NaOH al 5% y luego se lavó con agua desionizada
hasta que el efluente tenía un pH 7,0.
En la columna se cargaron 500 ml de caldo de
fermentación con una concentración de timidina (TdR) de 4,890 g/l
y concentración de desoxiuridina (UdR) de 1,040 g/l. La columna se
lavó con dos volúmenes de lecho de agua desionizada. Las TdR y UdR
se eluyeron mediante dos volúmenes de lecho de alcohol reactivo al
5% (etanol 90,5%, metanol 4,5% y alcohol isopropílico 5%) seguido
por dos volúmenes de lecho de alcohol reactivo al 10% y dos
volúmenes de lecho de alcohol reactivo al 15%. Las TdR y UdR en
fracciones de 25 ml se muestra en la Fig. 6. La columna era
regenerada lavando con NaOH al 5%, luego con agua desionizada a pH
7,0 y el procedimiento se repetía. Las fracciones
91-160 fueron reunidas juntas a partir de las dos
series separadas y se secaron usando un evaporador rotatorio con
vacío. La timidina era redisuelta en una mínima cantidad de agua
caliente y cristalizaba a 4ºC. Luego los cristales fueron
recristalizados dos veces y se secaron en una estufa a 55ºC durante
15 horas. Se obtuvo un total de 979,8 mg de timidina cristalizada
con una pureza mayor del 99% que debería ser adecuado para su uso
como intermedio farmacéutico.
Las fracciones laterales que contienen tanto
desoxiuridina como timidina fueron reunidas con líquidos madres y
reducidas mediante un evaporador rotatorio con vacío hasta un
volumen final de 1.200 ml con alcohol reducido. La cantidad total
de TdR en esta solución de 1.200 ml era de 3.571 mg. La
recuperación total (incluyendo los 3.571 mg de las fracciones
laterales TdR) era del 93,1%.
<110> Glaxo Group Limited
\hskip1cmAnderson, David M
\hskip1cmLiu, Lin
\hskip1cmPodkovyrov, Sergey
\hskip1cmWang, Baomin
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vectores, células y procesos para la
producción de desoxirribonucleósidos de pirimidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P1049
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento US 09/345492
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
01-07-1999
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<150> Documento US 60/141827
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<151>
01-07-1999
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptattctagac gattttcaag ttgaggactt atgc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatatcgata attcattaca atttacacgc tgcac
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatatcgata aatgtaaatt taaggattct aaatg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatgtcgact ccttaaaagt attttttaaa actc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Inserto de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Parte de un inserto de ADN de doble
hélice. La parte no colgante de la SEQ ID NO: 6 es el
complemento
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgagcccgcc taatgagcgg gctttttttt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Inserto de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Parte de un inserto de ADN de doble
hélice. SEQ ID NO: 5 es el complemento de la parte no colgante de la
secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> configuración variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Saliente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> configuración variada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (35)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Saliente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtacaaaaaa aagcccgctc attaggcggg ctcgggcc
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccggagg ataaatgaaa caataccaag atttaat
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaatcttgg tattgtttca tttatcctcc g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcaaacatt aaacagcgtg caattacata ttgataatca ggttc
\hfill45
Claims (9)
1. Una construcción de ADN que comprende una
unidad transcripcional que comprende:
a) un gen nrdA de la reductasa del
ribonucleótido de T4;
b) un gen nrdB de la reductasa del
ribonucleótido de T4; y
c) un gen nrdC de tiorredoxina de T4
caracterizada porque el gen
nrdA del T4 tiene una mutación en la secuencia que codifica
la región que enlaza al dTTP en la reductasa del oligonucleótido T4
que no altera la funcionalidad básica de la enzima y de manera que
la reductasa del ribonucleótido de T4 ha reducido el enlace al dTTP
comparado con la enzima
silvestre.
2. Una construcción de ADN según la
reivindicación 1, en la que la secuencia nrdA del T4 que
codifica la región que enlaza al dTTP en la reductasa de
ribonucleótido de T4 es:
3. Una construcción de ADN según las
reivindicaciones 1 ó 2, en la que la mutación en la secuencia de ADN
que codifica la región que enlaza al dTTP reemplaza la alanina en
la posición 79 en la secuencia de aminoácidos del nrdA de T4
por isoleucina, valina o leucina.
4. Una construcción de ADN según la
reivindicación 3, en la que la mutación en la secuencia de ADN que
codifica la región que enlaza al dTTP reemplaza la alanina en la
posición 79 en la secuencia de aminoácidos del nrdA de T4
por isoleucina.
5. Una construcción de ADN según la
reivindicación 4, en la que la mutación en la secuencia de ADN que
codifica la región que enlaza al dTTP es un cambio de GCT (alanina)
a ATT (isoleucina) en el codón 79:
6. Una célula huésped que comprende la
construcción de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
5.
7. Una célula huésped según la reivindicación 6,
en la que la célula huésped es seleccionada del grupo constituido
por *E. coli, Salmonella, Pseudomonas, Bacillus y
Saccharomyces.
8. Un procedimiento para la producción de
desoxirribonucleósidos de pirimidina que comprende cultivar una
célula huésped según las reivindicaciones 6 ó 7.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8,
en el que el desoxirribonucleósido es timidina.
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