DE68916708T2 - Herstellung eines Desoxyribonucleosids. - Google Patents
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Description
- Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des Desoxyribonucleosids Thymidin und/oder seiner entsprechenden Base Thymin.
- Thymidinmonophosphat (TMP) ist ein von allen Mikroorganismen während der DNA-Produktion gebildetes Nucleotid. Das entsprechende Nucleosid Thymidin ist ein Zwischenprodukt bei der Herstellung von Azidothymidin, dem aktiven Bestandteil in einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung des Autoimmun-Mangelsyndroms (AIDS). Thymidin ist ein Pyrimidinnucleosid und wird gegenwärtig chemisch hergestellt, obwohl die enzymatische Produktion eines Thyinidin enthaltenden Polysaccharids mit einem Mutantenstamm von Bacillus subtilis in der japanischen Patentanmeldung Nr. 39-16345, veröffentlicht am 11. August 1964, vorgeschlagen wurde. Weder der verwendete Mutantenstamm, noch der Stamm, von dem dieser abgeleitet ist, scheinen in einer anerkannten Stammsammlung niedergelegt worden zu sein und der Mutantenstamm ist in der Veröffentlichung Nr. 39-16345 nur als Mutantenstamm 2901 gekennzeichnet. Es scheint gegenwärtig kein Fermentationsverfahren zur Herstellung van Thymidin oder Thymin selbst zu geben. Zusätzlich zu Pyrimidinnucleosiden gibt es Nucleoside der Purinklasse. Die Herstellung eines entsprechenden Nucleotids der Purinklasse, Guanosin-5'- monophosphat durch Fermentation unter Verwendung eines Stamms von Brevibacterium helvolum wurde in US Patent Nr. 32 49 511, veröffentlicht am 3. Mai 1966, vorgeschlagen.
- Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von Thymidin und/oder Thymin bereitgestellt, umfassend die aerobe Züchtung eines Thymidin und/oder Thymin produzierenden Bakterienstamms der Gattung Brevibacterium in einem Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und andere Nährstoffe enthält, bei geeigneten Züchtungsbedingungen, Akkumulation des produzierten Thymidins und/oder Thymins direkt im Medium und danach Trennung des produzierten und akkumulierten Thymidins und/oder Thymins von dem Medium.
- Jeder geeignete Stamm der Gattung Brevibacterium kann in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, aber Thymidin und/oder Thymin produzierende Stämme von Brevibacterium helvolum werden bevorzugt.
- Ein insbesondere geeigneter Stamm ist Stamm 431, der von Brevibacterium helvolum ATCC 19390 mit dem in Beispiel 1 der Beschreibung genau beschriebenen Verfahren abgeleitet wurde. ATCC 19390 wird in US Patent Nr. 35 86 606 erwähnt, das ein Verfahren zur Herstellung von Ribotiden von 2-substituierten 6-Hydroxypurinen durch Fermentation beschreibt. Eine Kultur von Stamm 431 wurde bei National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), PO Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen, AB9 8DG, Schottland, Vereinigtes Königreich am 28. April 1988 niedergelegt und ihr wurde die Zugangsnummer NCIMB 40014 gegeben.
- Weitere insbesondere geeignete Stämme sind Brevibacterium helvolum-Stämme L-17 (abgeleitet von Stamm NCIMB 40014) und 2.977 (abgeleitet von Stamm ATCC 19390), wobei L-17 wie in Beispiel 3 der Beschreibung beschrieben und 2.977 mit einem Verfahren, das im wesentlichen das gleiche ist, das zur Derivatisierung von L-17 verwendet wurde, abgeleitet ist. Kulturen von L-17 und 2.977 wurden bei NCIMB am 21. Februar 1989 niedergelegt und ihnen wurden jeweils die Zugangsnummer 40117 und 40116 gegeben.
- Erfindungsgemäß werden auch biologisch reine Kulturen von Brevibacterium helvolum-Stamm NCIMB 40014 und davon abgeleitete Varianten und Mutanten zur Verfügung gestellt.
- Biologisch reine Kulturen von Brevibacterium helvolum-Stämmen NCIMB 40117 und 40116 und davon abgeleitete Varianten und Mutanten sind in der mitanhängigen UK Patentanmeldung Nr. 8906624.5, eingereicht am 22. März 1989, definierter Erfindungsgegenstand.
- Das Verfahren der Erfindung wird am wirksamsten als gespeistes Absatz- oder Absatzverfahren durchgeführt, aber kontinuierliche Verfahren sind möglich. Die Kohlenstoffquelle ist vorzugsweise Glucose, aber andere Kohlenstoffquellen, wie andere Zucker und Alkohole können verwendet werden. Vorzugsweise liegt der pH im Bereich von 5 bis 9, insbesondere von 6 bis 8, wobei ein pH von oder um 7 insbesondere geeignet ist. Eine Base wie Ammoniumhydroxid kann dem Kulturmedium zur Aufrechterhaltung des pH im erforderlichen Bereich zugegeben werden. Geeigneterweise liegt die Temperatur im Bereich von 20 bis 35ºC, wobei Temperaturen im Bereich von 25 bis 30ºC bevorzugt sind. Ein insbesondere geeignetes Herstellungsmedium für das Verfahren der Erfindung ist in Tabelle 1 angegeben. TABELLE 1 Bestandteil Konzentration pro l Hefeextrakt Tri-Natriumcitrat Na-molybdat 2H&sub2;O Thiamin Calciumpantothenat Biotin Folsäure Glucose
- Ein weiteres geeignetes Herstellungsmedium für das Verfahren der Erfindung ist in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2 Bestandteil Konzentration pro l Hefeextrakt Tri-Natriumcitrat Spurenelemente-Mischung (Fisons Co.) Thiamin Calciumpantothenat Biotin Folsäure Glucose
- Nach Produktion und Akkumulation von Thymidin und/oder Thymin kann dieses von der überstehenden Flüssigkeit in der Kultur mit jeder geeigneten Maßnahme, z.B. Ionenaustausch, flüssige Extraktion und hydrophobe Chromatographie getrennt werden, wobei Ionenaustausch bevorzugt ist. Ein geeigntes Ionenaustausch-Trennungsverfahren für Thymidin und/oder Thymin ist die Adsorption dieser gelösten Stoffe auf einem Ionenaustauschharz und die Elution des Thymidins und/oder Thymins unter spezifischer Verwendung von Wasser und Methanol.
- Das produzierte Thymidin kann zur Herstellung von Azidothymidin und anderen medizinischen und biochemischen Arzneimittelprodukten verwendet werden.
- Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.
- Stamm 431 wurde mit einem dreistufigen Verfahren aus ATCC 19390 hergestellt. In einem ersten Schritt wurde ATCC 19390 mit UV-Licht behandelt und der entstehenden Kultur wurde das Pyrimidinanalog 5-Fluoruracil zugegeben. Es wurden dann die Zellen ausgewählt, die resistent gegenüber 5-Fluoruracil waren, wodurch sich Stamm 190 ergab. Stamm 190 wurde danach gezüchtet und mit UV-Licht und anschließend mit 5-Fluoruracil behandelt und 5-Fluoruracil-resistente Zellen wurden wiederum ausgewählt, wodurch sich Stamm 295 ergab. Stamm 295 wurde mit UV-Licht behandelt und anschließend wurden die Zellen, die verringertes Wachstum auf Thymidin als einziger Kohlenstoffquelle zeigten, ausgewählt. Diese Selektion ergab Stamm 431. Stamm 431 zeigte eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Produktion von Thymidin und/oder Thymin, wobei diese Produkte sich im Kulturmedium ansammelten.
- Das in Tabelle 2 angegebene Impfmedium wurde hergestellt und in einer Schüttelflasche mit einer Kultur von Stamm Brevibacterium 431, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, angeimpft. TABELLE 3 Bestandteil Konzentration pro l Tri-Natriumcitrat 2H&sub2;O
- Das angeimpfte Medium wurde mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 150 U/min bei einer Temperatur von 28ºC und einem pH von 7 geschüttelt. 200 ml des angeimpften Mediums wurden dann in einen Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 4 l übergeführt und das in Tabelle 1 angegebene Medium wurde zugegeben. Dann fand die Anzüchtung bei einem pH von 7 (beibehalten durch Zugabe einer 50%igen Ammoniumhydroxid-Lösung), einer Temperatur von 30ºC und bei einem gelösten Sauerstoffdruck (DOT) von 0 statt. Es wurde eine Schüttelgeschwindigkeit von U/min während der Anzüchtung beibehalten. Während der Anzüchtung wurde die Glucosekonzentration in dem Medium überwacht und bei Abnahme auf eine Konzentration unterhalb von 5 g/l wurde weitere Glucose zugegeben, um die Konzentration auf 50 g/l zu steigern. Nach 7-tägiger Fermentation wurden 0,26 g/l Thymidin und 2,6 g/1 Thymin produziert und die Produkte wurden durch Hochleistungsflüssigkeitchromatographie (HPLC) identifiziert.
- Stamm L-17 wurde aus Stamm NCIMB 40014 hergestellt durch Behandlung einer Kultur von Stamm NCIMB 40014 mit 5-Fluor-2- deoxyuridin und Auswahl der Zellen, die resistent gegenüber hohen Konzentrationen dieses Pyrimidinanalogs waren, wodurch sich Stamm L-17 ergab.
- Stamm L-17 zeigt eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Produktion von Thymidin und/oder Thymin, wobei die Produkte sich im Kulturmedium ansammelten.
- Das in Tabelle 4 angegebene Impfmedium wurde hergestellt und in einer Schüttelflasche mit einer Kultur von Stamm Brevibacterium L-17, die wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurde, angeimpft. TABELLE 4 Bestandteil Konzentration pro l 0,5 M Phosphatpuffer Fisons Spurenelemente-Mischung Hefeextrakt
- Das angeimpfte Medium wurde mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 150 U/min bei einer Temperatur von 28ºC und einem pH von 7 geschüttelt. 200 ml des angeimpften Mediums wurden dann in einen Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 3 l übergeführt und das in Tabelle 1 angegebene Medium wurde zugegeben. Dann fand die Anzüchtung bei einem pH von 7 (beibehalten durch Zugabe einer 50%igen Ammoniumhydroxidlösung) einer Temperatur von 25ºC und bei einem gelösten Sauerstoffdruck (DOT) von 0 statt. Während der Anzüchtung wurde eine Schüttelgeschwindigkeit von 500 U/min beibehalten. Während der Anzüchtung wurde die Glucosekonzentration in dem Medium überwacht und weitere 200 g/l wurden in den Fermenter eingefüllt.
- Es wurde festgestellt, daß das Produkt 1,9 g/l Thymidin und 2,0 g/l Thymin enthielt.
- Das produzierte Thymidin und Thymin wurde von dem Kulturmedium durch lonenaustauschtrennung auf folgende Weise abgetrennt:
- Die Zellen wurden von dem Fermentationsprodukt unter Verwendung einer Zentrifuge abgetrennt. Die Flüssigkeit, die das Thymidin und Thymin enthielt, wurde auf eine mit XAD4-Harz (Röhm & Haas, Crawley, UK) gefüllte Adsorptionssäule (Durchmesser 2,6 cm, Länge 50 cm) gegeben. Die Säule wurde mit Wasser, pH 7 mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 Säulenvolumina pro Stunde eluiert. Eine thyminreiche Fraktion wurde mit Wasser eluiert, nachdem 5 Säulenvolumina durch die Säule gelaufen waren. Dann wurde die Säule mit Methanol eluiert. Nach 1 Säulenvolumen Methanol wurde eine Thymidinfraktion eluiert.
- Stamm 2.977 wurde in einem zweistufigen Verfahren aus ATCC 19390 hergestellt.
- Im ersten Schritt wurde ATCC 19390 mit UV-Licht behandelt und der entstehenden Kultur wurde der Folat-Antagonist Trimethoprim zugegeben. Es wurden die Zellen ausgewählt, die resistent gegenüber Trimethoprim waren, wodurch sich Stamm Nr. 2.602 ergab. Stamm Nr. 2.602 wurde danach gezüchtet und mit UV-Licht behandelt und der entstehenden Kultur wurde 5-Fluor- 2-deoxyuridin zugegeben. Es wurden die Zellen ausgewählt, die resistent gegenüber hohen Konzentrationen von 5-Fluor-2- deoxyuridin waren, wodurch sich Stamm 2.977 ergab.
- Die Herstellung ist im wesentlichen die gleiche, die oben für Stamm L-17 (siehe Beispiel 3) beschrieben wurde.
Claims (10)
1. Verfahren zur Herstellung von Thymidin und/oder Thymin,
umfassend die aerobe Züchtung eines Thymidin und/oder Thymin
produzierenden Bakterienstammes der Gattung Brevibacterium in
einem Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle
und andere Nährstoffe enthält, bei geeigneten
Kulturbedingungen, die Akkumulation des produzierten Thymidins und/oder
Thymins direkt im Medium und danach die Trennung des
produzierten und akkumulierten Thymidins und/oder Thymins von dem
Medium.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Bakterienstamm ein
Stamm der Art Brevibacterium helvolum ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Bakterienstamm
einer der Stämme Brevibacterium helvolum NCIMB 40014, 40116
oder 40117 oder eine von einem dieser Stämme abgeleitete
Variante oder Mutante ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das als
Absatz- oder gespeistes Absatzverfahren ausgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die
assimilierbare Kohlenstoffquelle Glucose ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der
Bakterienstamm bei einem pH im Bereich von 5 bis 9 gezüchtet
wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der
Bakterienstamm bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 35ºC
gezüchtet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das
produzierte und akkumulierte Tyhmidin und/oder Thymin vom
Nedium durch Ionenaustausch getrennt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das produzierte und
akkumulierte Thymidin und/oder Thymin auf einem
Ionenaustauschharz adsorbiert und spezifisch mit Verwendung von Wasser und
Methanol eluiert wird.
10. Biologisch reine Kulturen von Brevibacterium helvolum-
Stamm NCIMB 40014 und davon abgeleitete Varianten und
Mutanten.
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