DE69008400T2 - Herstellung von 2-Desoxyuridin. - Google Patents
Herstellung von 2-Desoxyuridin.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-Desoxyuridin und einen neuen Bakterienstamm, der für seine Herstellung verwendet wird.
- 2-Desoxyuridin kann als Grundstock für Zusammensetzungen verwendet werden, die als Arzneimittel Verwendung finden. Es weist folgende Struktur auf:
- In der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 344937 der gleichen Anmelder wurde die Herstellung des neuen Brevibacterium-Stammes NCIMB 40014 aus dem in der US- Patentschrift 3586606 erwähnten Stamm ATCC 19390 beschrieben. NCIMB 40014 kann in einem Fermentationsverfahren zur Herstellung von Desoxyribonucleosidthymidin und/oder seiner entsprechenden Base Thymin verwendet werden.
- Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von 2-Desoxyuridin zur Verfügung gestellt, das die aerobe Züchtung eines 2-Desoxyuridin produzierenden Bakterienstammes der Gattung Brevbacterium in einem Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und andere Nährstoffe unter geeigneten Züchtungsbedingungen enthält, sowie eine Ansammlung des hergestellten 2-Desoxyuridins direkt in dem Medium und eine anschließende Trennung des produzierten und angesammelten 2-Desoxyuridins von dem Medium umfaßt.
- Jeder geeignete Stamm der Gattung Brevibacterium kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, aber die 2-Desoxyuridin produzierenden Bakterienstämme von Brevibacterium helvolum sind bevorzugt. Ein besonders geeigneter Stamm ist der vom Brevibacterium helvolum NCIMB 40014 mittels des in Beispiel 1 dieser Beschreibung im Detail beschriebenen Verfahrens abgeleitete Stamm L-17. Die Ableitung des Stammes NCIMB 40014 aus dem Stamm ATCC 19340 (erwähnt in der US- Patentschrift 3586606, die ein Verfahren zur Herstellung von Ribotiden der 2-substituierten-6-Hydroxypurine mittels Fermentation beschreibt) wird im Detail in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 344937 der gleichen Anmelder beschrieben. Ein weiterer geeigneter Stamm, ebenfalls vom Stamm ATTC 19390 abgeleitet, ist der Brevibacterium helvolum- Stamm 2,977. Kulturen der Stämme L-17 und 2,977 wurden in der National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), 23 St Machan Drive, Aberdeen, AB2 IRY, Schottland, Vereinigtes Königreich am 21. Februar 1989 hinterlegt und es wurde ihnen die Zugangsnummern NCIMB 40117 beziehungsweise NCIMB 40116 gegeben. Stamm NCIMB 40014 wurde am 28 April 1988 hinterlegt.
- Erfindungsgemäß werden auch biologisch reine Kulturen des Brevibacterium helvolum-Stammes NCTMB 40117 und des Brevibacterium helvolum-Stammes NCIMB 40116 und aus diesen Stämmen gewonnene Mutanten und Varianten zur Verfügung gestellt.
- Das erfindungsgemäße Verfahren ist am wirkungsvollsten, wenn es als Fed-Batch-Verfahren oder als Batch- Verfahren ausgeführt wird, aber es sind auch kontinuierliche Verfahren möglich. Bevorzugterweise ist die Kohlenstoffquelle Glukose, aber es können andere Kohlenstoffquellen, wie andere Zucker und Alkohole, verwendet werden. Bevorzugt liegt der pH- Wert im Bereich von 5 bis 9, insbesondere 6 bis 8, wobei ein pH-Wert in der Nähe von 7 besonders geeignet ist. Eine Base wie Ammonoiumhydroxid kann zu dem Kulturmedium gegeben werden, um den pH-Wert auf dem gewünschten Niveau zu halten.
- Geeigneterweise liegt die Temperatur in dem Bereich von 20 ºC bis 35 ºC, wobei Temperaturen im Bereich von 25 ºC bis 30 ºC bevorzugt sind. Ein sehr geeignetes Herstellungsmedium für das erfindungsgemäße Verfahren wird in Tabelle 1 dargelegt. Tabelle 1 Bestandteil Konzentration pro l Hefeextrakt Trinatriumcitrat 2H&sub2;O Na-Molybdat . 2H&sub2;O Thiamin Calciumpantothenat Biotin Folsäure Glucose um 150 g zu ergeben
- Nach der Herstellung und Anhäufung des 2-Desoxyuridins kann es von der überstehenden Flüssigkeit in der Kultur durch jedes geeignete Mittel, wie Ionenaustausch, Flüssigextraktion und hydrophobe Chromatographie abgetrennt werden, wobei der Ionenaustausch bevorzugt ist. Ein geeignetes Ionenaustausch-Trennverfahren für das 2-Desoxyuridin besteht darin, diesen gelösten Stoff auf einem Ionenaustauscherharz zu adsorbieren und das 2-Desoxyuridin spezifisch unter Verwendung von Wasser zu eluieren.
- Das produzierte 2-Desoxyuridin kann bei der Herstellung einer Anzahl medizinischer und biochemischer Arzneimittel-Produkte verwendet werden.
- Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele beschrieben:
- Der Stamm L-17 wurde aus dem Stamm NCIMB 40014 mittels der Behandlung einer Kultur des Stammes NCIMB 40014 mit 5-Fluor-2-desoxyuridin und Auswahl derjenigen Zellen, die gegenüber hohen Konzentrationen dieses Pyrimidinanalogen resistent waren, unter Erzeugung des Stammes L-17 hergestellt. Der Stamm L-17 weist eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Produktion von 2-Desoxyuridin auf, wobei dieses Produkt sich in dem Kulturmedium ansammelt.
- Es wurde das in Tabelle 2 dargelegte Impfmedium hergestellt und in einem Schüttelgefäß mit einer Kultur des wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten Stammes Brevibacterium L17 geimpft. Tabelle 2 Bestandteil Konzentration pro l 0,5M Phosphatpuffer Fisons Spurenelementmischung Hefeextrakt
- Das geimpfte Medium wurde bei einer Rührerdrehzahl von 150 rpm, bei einer Temperatur von 28 ºC und einem pH-Wert von 7 geschüttelt. 200 ml des geimpften Mediums wurden danach in einen Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 3 Litern überführt und das in Tabelle 1 dargelegte Medium wurde hinzugegeben. Die Züchtung fand bei einem pH-Wert von 7 (durch Zugabe einer 50%-igen Ammoniumhydroxidlösung aufrechterhalten), einer Temperatur von 25 ºC und bei einer Spannung, bei der kein Sauerstoff gelöst wurde (DOT), statt. Eine Rührerdrehzahl von 500 rpm wurde während der Züchtung beibehalten. Während der Züchtung wurde die Glucosekonzentration in dem Medium überwacht und weitere 200 g/l Glucose wurde in den Fermenter eingeführt.
- Es wurde gefunden, daß das Produkt 2,3 g/l 2-Desoxyuridin enthielt.
- Das produzierte 2-Desoxyuridin wurde mittels eines Ionenaustausch-Trennverfahrens auf die nachstehend beschriebene Weise von dem Kulturmedium abgetrennt.
- Die Zellen wurden aus dem Fermenterprodukt unter Verwendung einer Zentrifuge entfernt. Die das 2-Desoxyuridin enthaltende Flüssigkeit wurde auf eine mit einem SP207-Harz (Mitsubishi Chemical Company, London, UK) gefüllte Adsorptionskolonne (Durchmesser 2,6 cm, Länge 50 cm) geleitet. Die Kolonne wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 Kolonnenvolumen pro Stunde mit Wasser mit einem pH-Wert von 7 eluiert. Eine mit 2-Desoxyuridin angereicherte Fraktion wurde eluiert, nachdem drei Kolonnenvolumen die Kolonne passiert hatten.
- Stamm 2,977 wurde mittels eines Zwei-Stufen- Verfahrens aus ATCC 19390 hergestellt.
- In einer ersten Stufe wurde ATCC mit UV-Licht behandelt und der resultierenden Kultur wurde der Folat- Antagonist Trimethoprim zugesetzt. Es wurden unter Herstellung des Stammes Nr. 2,602 Zellen ausgewählt, die gegenüber dem Trimethoprim produzierenden Stamm resistent waren. Stamm 2,602 wurde danach gezüchtet und mit UV-Licht behandelt und zu der resultierenden Kultur wurde 5-Fluor-2-desoxyuridin gegeben.
- Unter Herstellung des 2,977 wurden Zellen ausgewählt, die gegenüber hohen Konzentrationen an 5-Fluor-2-desoxypyridin resistent waren.
- Die Herstellung ist im wesentlichen die gleiche wie sie zuvor für den Stamm L-17 (siehe Beispiel 1) beschrieben wurde.
Claims (10)
1. Verfahren zur Herstellung von 2-Desoxyuridin, das die
aerobe Züchtung eines 2-Desoxyuridin produzierenden
Bakterienstammes der Gattung Brevibacterium in einem Kulturmedium, das
eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und andere Nährstoffe
unter geeigneten Züchtungsbedingungen enthält, sowie eine
Ansammlung des produzierten 2-Desoxyuridins direkt in dem
Medium und eine anschließende Trennung des produzierten und
angesammelten 2-Desoxyuridins von dem Medium umfaßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Stamm ein Stamm
der Gattung Brevibacterium helvolum ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Stamm
Brevibacterium helvolum NCIMB 40117 oder Brevibacterium
helvolum NCTMB 40116 ist.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei
die Kohlenstoffquelle Glukose ist.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei
der Stamm bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 9 gezüchtet
wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der pH-Wert im Bereich
von 6 bis 8 liegt.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei
der Stamm bei einer Temperatur im Bereich von 20 ºC bis 35 ºC
gezüchtet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Temperatur im
Bereich von 25º bis 30ºC liegt.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei
das 2-Desoxyuridin mittels Adsorption an ein
Ionenaustauscherharz abgetrennt und danach mit Wasser von dem Harz spezifisch
eluiert wird.
10. Biologisch reine Kulturen des Brevibacterium helvolum-
Stammes NCIMB 40117 und des Brevibacterium helvolum-Stammes
NCIMB 40116 und von aus diesen Stämmen gewonnenen Varianten
und Mutanten.
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