DE1802754B2

DE1802754B2 - Verfahren zur herstellung von 9-beta-d-ribofuranosid-5-mono-, -diund -tri-phosphaten von 2-substituierten 6-hydroxypurinen

Info

Publication number: DE1802754B2
Application number: DE19681802754
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Sagamihara Tanaka Haruo Machida Hagino Hiroshi Hachioji Nakayama, (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-10-13
Filing date: 1968-10-10
Publication date: 1973-02-15
Also published as: DE1802754A1; US3586606A; FR1584941A; GB1200826A; DE1802754C3

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das 6-Hydroxypurin nach Ablauf der halben Züchtungsdauer dem Medium zufügt.

XOH,C

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 9-/?-D-Ribofuranosid-5'-mono-, -di- und -triphosphaten von 2-substituierten 6-Hydroxypurinen der allgemeinen Formel

OH

in der R die Reste -CH₃, -CH₂ -CH₃, -SH. -S-CH₃, —S—CH₂-CH₃, — NH-CH₃ oder

— N

und X die Reste
O

CH₃

XOH₇C

35

OH OH

oder

— P —OH — P-O- P— OH
OH OH OH

OOO

Il Il Il

— p — o—p — o — p — oh

I I I

OH OH OH

in der R die Reste -CH₁. -CH₂-CH,. -SH. -S-CH₃. -S-CH₂-CH₃, -NH-CH₃ oder

— N

45 CH₃

CH,

bedeutet, durch Züchten von Mikroorganismen in Gegenwart der entsprechenden Base als Vorläufer, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium sp. ATCC 21 084 oder Arthrobacter sp. ATCC 21 085 unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von 4,0 bis 9,5 in einem wäßrigen 55 oder Nährmedium züchtet, welches ein 2-substituiertes 6-Hydroxypurin der allgemeinen Formel

und X die Reste

— P—OH

OH

— P —O—P —OH

OH

— P — O — P — O— P— OH

60 OH

OH

R-C
\

C-N⁷
.' H

CH

in der R die oben angegebene Bedeutung besitzt.

bedeutet, durch Züchten von Mikroorganismen in Gegenwart der entsprechenden Base als Vorläufer. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium sp. ATCC 21 084 oder Arthrobacter sp. ATCC 21 085 unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 4.0 bis 9,5 in einem wäßrigen Nährmedium züchtet.

welches ein 2-substituiertes 6-Hydroxypurin der allgemeinen Formel

OH

I c

R-C

C—Ν^κ
\ / H

CH

in der R die oben angegebene Bedeutung besitzt, enthält und die gebildeten Verbindungen der angegebenen allgemeinen Formel 1 in üblicher Weise aus der Kulturbrühe isoliert.

2 - Dimethylamine - 6 - hydroxypurin - 9 - β - D - ribofuranosid-5'-diphosphorsäure ist in der RNS von Hefen gefunden worden (Journal of Biological Chemistry, Vol. 234, S. 1525 [1959]; Journal of the American Chemical Society, Vol. 87 [1965], S. 3752); auch 2 - Methylamino - 6 - hydroxypurin - 9 - β - D - ribofuranosid-5'-diphosphorsäure ist in RNS nachgewiesen worden (ζ. B. Biochemica Biophysica Acta. Vol. 61 [1962], S. 340). Es ist bekannt, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel I Strukturanaloge der Nucleinsäuren aufbauenden Nucleotide sind, daß einige von ihnen einen angenehmen und aromaartigen Geschmack besitzen und daß die synergistische Geschmackswirkung derselben mit auf Natriumglutamat größer ist als diejenige von Inosinsäure oder Guanylsäure (»Summery of Lectures of the 1967 General Meeting of the Japan Agricultural Chemical Society« [1967], S. 187 bis 188). In diesem Schrifttum wird auch die Herstellung dieser Verbindungen durch chemische Syntheseverfahren beschrieben. Diese Verfahren sind jedoch für industrielle Zwecke ungeeignet, und zwar auf Grund der anzuwendenden kostspieligen Rohmaterialien und der komplizierten Verfahrensdurchführung.

Aus der USA.-Patentschrift 3 308 036 war es bereits bekannt, daß bei der Züchtung bestimmter Mikroorganismen in Gegenwart verschiedener Purine als Vorläufer die entsprechenden Nucleosid-5'-. mono-, -di- und -triphosphate in der Kulturbrühe angereichert werden und daraus nach üblichen Arbeitsweisen isoliert werden können.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann als Züchtungsmedium jedes Nährmedium verwendet werden, welches 2-substituierte 6-Hydroxypurine der allgemeinen Formel (II) enthält, und im Extremfall kann das erfindungsgemäße Ziel sogar erreicht werden, indem man Mikroorganismenzellen zu einer wäßrigen Lösung hinzugibt, welche nur Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (II) enthält und die Züchtung durchführt, da auch in diesem Falle Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in der Kulturflüssigkeit gebildet werden. Jedes Nährmedium ist erfindungsgcmäß brauchbar, solange es die für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismenstammes notwendigen Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe umfassen eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen. In einigen Fällen ist es außerdem vorteilhaft und erwünscht, Phosphorsäureverbindungen, wie Pheny!phosphorsäure, Ribose-1-phosphorsäure, Inosinsäure, Adenylsäure oder Guanylsäure dem Medium zuzufügen.

Die 2-substituierten 6-Hydroxypurine der allgemeinen Formel (II) können zu Beginn der Züchtung oder zu irgendeinem Zeitpunkt während der Züchtung, beispielsweise nach Ablauf der halben Züchtungsdauer, dem Medium zugefügt werden. Darüber hinaus kann die Zugabe auf einmal oder in Abständen in kleinen Anteilen erfolgen.

Die zu dem Medium hinzugesetzte Menge der 2-substituierten 6-Hydroxypurine kann in recht weiten

ro Grenzen variiert werden. Wenn man die Züchtung mit einer großen Menge an Mikroorganismenzellen durchführt und die 6-Hydroxypurine zu einem Zeitpunkt zufügt, zu dem die Mikroorganismen nur langsam wachsen, können die Verbindungen in hoher Konzentration zugesetzt werden. Wenn man andererseits die 6-Hydroxypurine im Anfangsstadium der Fermentation dem Medium zufügt, in dem ein starkes Wachstum der Mikroorganismen vor sich geht, ist es erwünscht, die Verbindungen abstandsweise in kleinen Mengen zuzufügen, da das Wachstum der Mikroorganismen gehemmt werden kann, wenn man eine zu große Menge davon auf einmal hinzugibt.

Die Züchtungsbedingungen entsprechen, abgesehen von den oben bereits angegebenen speziellen Anforderungen, den in der Fermentationstechnik üblicherweise angewendeten Arbeitsweisen. So wird die Züchtung des Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen, wie z. B. aerobem Schütteln der Kultur oder durch Rühren und Belüften einer Submerskultur, bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 4,0 bis 9,5 durchgeführt. Nach 2 bis 7 Tagen der Züchtung unter diesen Bedingungen werden große Mengen an 9-/i-r>-Ribofuranosid-5'-mono-, -di- und -triphosphaten von 2-substituierten 6-Hydroxypurinen in der erhaltenen Kulturflüssigkeit sowie auch in den Mikroorganismenzellen angereichert gefunden.

Nach Abschluß der Züchtung können die erfindungsgemäß produzierten Ribotide aus der Kulturflüssigkeit und den Zellkörpern auf übliche Weise iso-

4η liert und gereinigt werden. Sie können aus den Mikroorganismenzellen z. B. mit Perchlorsäure oder warmem Alkohol extrahiert werden. Die in der Kulturflüssigkeit angereicherten Ribotide können mit Hilfe von Arbeitsweisen, wie Behandlung mit Ione.iaustauscherharzen, Adsorption an Kohlepulver, Extraktion mit Lösungsmitteln, Chromatographie oder Ausfällung gewonnen werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Prozentangaben beziehen sich auf Gramm pro Milliliter Wasser.

Beispiel 1

Corynebacterium sp. ATCC 21 084 bzw. Arthrobacter sp. ATCC 21 085 wird als Einsaatmikroorganismus verwendet und in einem Einsaatkulturmedium gezüchtet, welches 1% Pepton, 2% Glucose, 1% Hefeextrakt, 0,3% NaCl und 30 μβ/l Biotin enthält, und zwar 24 Stunden lang bei 30⁰C. Der Mikroorganismus wird dann in einem Verhältnis von 10 Volumprozent in ein Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:

Glukose 100 g

Harnstoff 6 g

K₂HPO₄ 10 g

KH₁PO₄ 10 g

MgSO₄ -7H₂O 1Oe

5 I 6

CaCl₂ · 2 H₂O 0,1 g 48 Stunden nach Beginn der Züchtung wird 2-Me-

Biotin 30 μg thyl - 6 - hydroxypurin in einer Konzentration von

Calciumpantothenat 2 mg 2 mg/ml zu der Fermentationsflüssigkeit hinzuge-

Thiamin 5 mg geben, und die Züchtung wird weitere 48 Stunden lang

Pepton 5g 5 fortgesetzt. Als Ergebnis sind 2,4 mg/ml bzw. 1,9 mg/ml

2 - Methyl - 6 - hydroxypurin - 9 - β - D - ribofuranosid-

Das Fermentationsmedium wird in 1 1 Wasser zube- 5'-diphosphat in der Fermentationsflüssigkeit ange-

reitet und sein pH-Wert mit NaOH auf 8,0 eingestellt. reichert worden.

Danach wird das Fermentationsmedium in Kolben Das produzierte Ribotid wird an einem stark basi-

abgefüllt, und diese werden 10 Minuten lang bei to sehen Polystyrol-Anionenaustauscherharz (Ameisen-

1 kg/cm² in einem Autoklav sterilisiert. säure-Form) adsorbiert und anschließend mit Ameisen-

20-ml-Anteile des Gemisches aus Einsaatkultur und säure eluiert. Die das Ribotid enthaltenden Fraktionen

Fermentationsmedium werden jeweils in 250-ml- werden neutralisiert und an Kohlepulver adsorbiert;

Erlenmeyerkolben eingefüllt und vor der Verwendung danach wird mit 50%igem Äthanol, der 3% HN₄OH

sterilisiert. Die Züchtung wird dann unter aerobem 15 enthält, eluiert. Durch Verdampfung des Lösungs-

Schütteln der Kolben bei 30° C durchgeführt. mittels wird das Ribotid als Pulver gewonnen.

Beispiel 2

Die Züchtung wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, an Stelle des im Beispiel 1 eingesetzten 2-Methyl-6-hydroxypurins werden jedoch jeweils die in der Tabelle angegebenen Basen zugesetzt. Die erhaltenen Ausbeuten an den den eingesetzten Basen entsprechenden 9-;/-n-Ribofuranosid-5'-phosphaten sind in der Tabelleangegeben.

Zugesetzte B;ise
(2 mg mli

2-Äthyl-6-hydroxypurin

2-Methylthio-6-hydroxypurin ....

2-Äthylthio-6-hydroxypurin

2-Methyiamino-6-hydroxypurin .. 2-Dimethylamino-6-hydroxypurin 2-Mercapto-6-hydroxypurin

Corynebacterium sp. ATCC 2KW4 [ Arthrobacler sp. ATCC 21085

Ausbeute an dem der zuec-vetzten Base entsprechenden 9-/f-D-Ribofuranosid-5'-pri.>vphorsäureeslern (mg'ml)

-5'-ITKlIlO-	-5'-di-	-y-tri-	-5'-mono-	-5'-di-	-5'-tri-
2,2	1,9	2,1	2,0	1,85	1,9
2,2	2,1	2,3	1,9	2,4	2,5
3.0	3,4	3.1	2,7	3,0	3,2
1,0	0,7	0,9	0,8	0,85	1,1
0,4	0.4	1,2	0,4	0,4	1,0
1,2	1,0	0.9	1,0	0,9	1,2

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstelung von 9-/i-D-Ribofuranosid-5'-mono-, -di- und -triphosphaten von 2-substituierten 6-Hydroxypurinen der allgemeinen Formel

OH

enthält, und Verbindungen der allgemeinen Formel I in üblicher Weise aus der Kulturbrühe isoliert.