CZ20014695A3

CZ20014695A3 - Konstrukt DNA, hostitelská buňka a způsob výroby

Info

Publication number: CZ20014695A3
Application number: CZ20014695A
Authority: CZ
Inventors: David Martin Anderson; Lin Liu; Sergey Podkovyrov; Boamin Wang
Original assignee: Glaxo Group Limited
Priority date: 1999-07-01
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2002-04-17
Also published as: JP2003504029A; AU5547700A; ES2290041T3; DE60035781T2; MXPA02000134A; WO2001002580A1; EP1190064B1; US6777209B1; NO20016270D0; ATE368743T1; US20050009083A1; IL147225A0; NO20016270L; KR20020019938A; EP1190064A1; DE60035781D1; CZ301565B6; US7387893B2

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká výroby pyrimidinů, purinů a jejich derivátů, například deoxyribonukleosidů, s použitím geneticky modifikovaných buněk obsahujících nové konstrukty DNA.

Dosavadní stav techniky

Thymidin je použitelný jako farmaceutický meziprodukt, zvláště pro chemickou syntézu azidothymidinu („AZT“, dodávaný pod obchodní známkou ZIDOVUDINE). Ačkoli AZT typu ZIDOVUDINE byl jedním z prvních způsobů léčení vyvinutých pro HIV/AIDS, má trvale důležité použití, které má stále větší rozsah (Langreth, R., The Wall Street Journal, 21. listopad 1995, str. B12). AZT typu ZIDOVUDINE je cenný zvláště při použití v kombinačních terapiích, jako je kombinace s lamivudinem (známý také jako 3TC), známá pod obchodní známkou EPIVIR. Tato kombinace lamivudinu a 3TC se prodává pod obchodní známkou COMBIVIR. I když může virus HIV mutovat na formu rezistentní buď k AZT nebo 3TC, kombinace nukleotidových analogů typu COMBIVIR je zvláště účinná, protože reverzní transkriptáza zřejmě nemůže být odolná k oběma nukleosidovým analogům současně (Larder, B. A. a další, Science 269: 696 - 699, 1995). AZT typu ZIDOVUDINE je také použitelný s léčivy typu inhibitorů HIV proteázy (Waldholz, M., The Wall Street Journal, 30. ledna 1996, str. B1), a při léčení těhotných žen infikovaných HIV pro snížení frekvence infekce plodu při narození. V roce 1997 zemřelo přibližně 600 000 dětí na AIDS, kterým se nakazily od svých matek při narození. AZT typu ZIDOVUDINE, jestliže se bere několik měsíců před narozením, může snížit přenos viru na děti o dvě třetiny. Velmi podstatné náklady při • · výrobě AZT tvoří thymidin vyráběný chemickou syntézou.

V US patentu 5,213,972 (McCandliss & Anderson, dále „patent ‘972“), jehož celý obsah se tímto zařazuje odkazem, a na který se zvláště poukazuje, se popisuje způsob výroby pyrimidinového deoxyribonukleosidu (PdN) (viz zvláště příklady 7 až 14 patentu ‘972). Popisuje se mikroorganismus schopný replikace, který obsahuje a exprimuje sekvenci DNA kódující pyrimidindeoxyribonukleotid-fosfohydrolázu, která převádí PdN monofosfát na pyrimidinový deoxyribonukleosid. McCandliss & Anderson, výše, popisují zvláště fermentační metodu, která může být použita pro výrobu thymidinu, a která zahrnuje expresi deoxythymidyiátfosfohydrolázy (dTMPáza) bakteriofágem PBS1 Bacillus. Tento typ enzymu byl podle výzkumů v přírodě exprimován bakteriofágy, které ve své DNA neobsahuji thymidin, ale namísto něj inkorporují sloučeniny jako deoxyuridin nebo hyd roxymethyldeoxyuridin.

Při fermentaci thymidinu popsané v patentu ‘972, byly mutací odstraněny enzymy degradující thymidin (thymidinfosforyláza a uridinfosforyláza), takže dochází ke hromadění thymidinu. Použití enzymu dTMPázy napomáhá k vytvoření biochemické cesty umožňující syntézu thymidinu. Samotná exprese dTMPázy však nemusí zajistit produkci thymidinu schůdnou v komerčním měřítku.

Proto existuje trvalá potřeba zvýšení produkce thymidinu buňkami exprimujícími dTMPázu pro zajištění fermentační produkce thymidinu v komerčně proveditelném měřítku, snížením výrobních nákladů proti současně používaným metodám chemické syntézy.

Biochemická cesta produkce pyrimidinových deoxynukleotidů, například v E. coli, je ve velké míře regulována na úrovních transkripce a translace stejně jako na proteinové úrovni mechanismy zahrnujícími oslabení (atenuaci), zpětnovazebnou inhibici a aktivaci enzymu (Neuhard, J. a R. A. Kelln, Biosynthesis and Conversion of

Pyrimidines, kapitola 35 [v] Neidhardt, F. C. a další [ed] „Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology“, druhé vydání, díl I, str. 580 - 599, ASM Press, Washington D.C., 1996). Exprese dTMPázy a odstranění rozkladu thymidinu použitím mutací v genech deoA (thymidinfosforyláza), udp (uridinfosforyláza) a tdk (thymidinkináza) a dosažená exprese produktů vedou k syntéze thymidinu v E. coli, ale nikoliv v komerčně přístupném měřítku.

Podstata vynálezu

Biosyntéza purinů a pyrimidinú zahrnuje společný krok redukce ribonukleosiddifosfátu (u některých druhů trifosfátu) na odpovídající deoxyanalog. V syntéze jako celku vyžaduje redukce ribózové části na

2-deoxyribózu pár atomů vodíku, které jsou nakonec poskytnuty NADPH a H⁺. Bezprostředním dárcem elektronů však není NADPH, ale redukovaná forma teplotně stabilního proteinu nazývaného thioredoxin nebo glutaredoxin a alespoň jeden další neidentifikovaný zdroj, protože ribonukleotidreduktázový systém E. coli stále ještě pracuje v dvojitých mutantech írxA (thioredoxin) grx (glutaredoxin) (Neuhard a Kelln, výše). Redukční ekvivalenty redukovaného thioredoxinu jsou převedeny na ribonukleosiddifosfátreduktázu, která provádí vlastní redukční proces. Manipulace například s tímto krokem by mohla být užitečná při zlepšování komerčního způsobu výroby purinových a pyrimidinových deoxynukleosidů.

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí nových konstruktů DNA, například vektorů a geneticky modifikovaných mikroorganismů, které obsahují uvedené vektory, zvláště pro použití při produkci izolovatelných množství, zvláště komerčně použitelných množství, pyrimidinových a purinových deoxynukleosidů.

Předmětem předkládaného vynálezu je také poskytnutí způsobů,

-4 které představují zlepšení vzhledem k procesům McCandlisse a Andersona, popisovaným výše.

Podle jednoho provedení předkládaného vynálezu se poskytuje konstrukt DNA obsahující transkripční jednotku, která obsahuje gen pro ribonukleotidreduktázu a thioredoxinový gen nebo uridinkinázový gen a/nebo dCTP deaminázový gen.

V jednom provedení obsahuje konstrukt DNA transkripční jednotku, která obsahuje ribonukleotidreduktázový gen a thioredoxinový gen.

V dalším provedení obsahuje konstrukt DNA transkripční jednotku, která obsahuje uridinkinázový gen a/nebo dCTP deaminázový gen.

Konstrukt DNA s výhodou obsahuje transkripční jednotku, která obsahuje uridinkinázový gen a dCTP deaminázový gen.

Nejvýhodněji obsahuje konstrukt DNA transkripční jednotku, která obsahuje ribonukleotidreduktázový gen a thioredoxinový gen a uridinkinázový gen a dCTP deaminázový gen.

Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje modifikovaná hostitelská buňka obsahující konstrukt DNA podle vynálezu.

Podle ještě dalšího provedení předkládaného vynálezu se poskytuje kultivační médium obsahující modifikované hostitelské buňky podle vynálezu a způsoby výroby purinu nebo pyrimidinu, například thymidinu, které zahrnují použití těchto modifikovaných hostitelských buněk.

V jednom provedení obsahují hostitelské buňky konstrukt DNA, kde tento konstrukt obsahuje transkripční jednotku DNA (např. operon), kde tato jednotka obsahuje sekvence DNA kódující

5· · · · ♦ · · · “ · · · · · · • · · · · ······· ·· · ribonukleotidreduktázu a thioredoxin, ve které tato reduktáza s výhodou vykazuje menší citlivost k alosterické inhibici než ekvivalent nebo protějšek hostitelské buňky standardního typu, přičemž uvedená buňka dále zahrnuje jednu nebo více následujících vlastností:

(a) transkripční jednotku (např. operon), s výhodou umístěnou na tomto konstruktu DNA, obsahující sekvence DNA kódující (a s výhodou heterologní vzhledem k ekvivalentní hostitelské buňce) thymidylátsyntázu;

(b) transkripční jednotku (např. operon), s výhodou umístěnou na tomto konstruktu DNA, obsahující sekvence DNA kódující uridinkinázu a s výhodou dCTP deaminázu; a (c) reprimovanou nebo nepřítomnou aktivitu uráčil DNA glykosylázy.

V dalším provedení obsahuje konstrukt DNA pro použití při výrobě izolovatelných množství pyrimidinů a jejich derivátů, zvláště pyrimidindeoxyribonukleosidů jako je thymidin, transkripční jednotku (např. operon), kde tato jednotka obsahuje (s výhodou heterologní) sekvence DNA kódující uridinkinázu a dCTP deaminázu.

Poskytují se také geneticky modifikované hostitelské buňky, které obsahují a exprimují konstrukt, a kultivační médium obsahující modifikované hostitelské buňky.

Tento aspekt je částečně založen na pozorování, že hostitelské buňky obsahující DNA kódující uridinkinázu a/nebo dCTP deaminázu, popřípadě spolu s dalšími geny navrhovanými v US 5,213,972, vyžadovanými pro produkci thymidinu, poskytují významné zlepšení produkce thymidinu.

Příslušná provedení předkládaného vynálezu poprvé popisují řadu výhod ve srovnání s poznatky uvedenými v US 5,213,972, pro • · · poskytnutí zlepšených konstruktů DNA a hostitelských buněk obsahujících konstrukty pro použití při komerční výrobě pyrimidinových deoxyribonukleosidů, zvláště thymidinu.

Další provedení, znaky a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé z následujícího popisu. Je však třeba rozumět, že tato výhodná reprezentativní provedení vynálezu jsou uvedena pouze pro účely ilustrace. Různé modifikace a změny v rámci podstaty vynálezu budou zřejmé odborníkům v oboru.

Výhodná provedení vynálezu

Konstrukt podle předkládaného vynálezu může být chromosomální nebo výhodněji extrachromosomální, například umístěný na vektoru.

Mezi vektory podle předkládaného vynálezu patří plasmid, virus, transposony, minichromosom nebo fág, s výhodou plasmid. Vektor obsahující transkripční jednotku může být zaveden do hostitelské buňky jakoukoli vhodnou metodou známou odborníkům v oboru, například P1 transdukcí, elektroporací nebo transformací. Mezi vhodné hostitelské buňky použitelné v rámci předkládaného vynálezu patří eukaryoty a prokaryoty (např. bakterie). Mezi prokaryoty patří kmeny E. coli, Salmonella, Pseudomonas, Bacillus, a jejich mutanty. E. coli je výhodná pro velké množství dostupných informací, genetických nástrojů a mutantních alel. Zvláště výhodné je, že pro zvolenou hostitelskou buňku je dostupný způsob transdukce, aby byl umožněn snadný přenos mutací z jedné hostitelské buňky do další, a aby byla umožněna genetická mutace hostitele bez potřeby přímé mutace v případech, kdy se požaduje nová mutace.

Autoři předkládaného vynálezu zjistili, že použití genů bakteriofága T4 nrdA, nrdB a nrdC je zvláště vhodné pro kódování reduktázy a thioredoxinu v E. coli, viz Sjóberg, B. M. a další, EMBO J., • · · · · ·

5: 2031 - 2036 (1986); Tseng, M.-J., a další, J. Biol. Chem. 263: 16242 - 16251 (1988); a LeMaster, D. M., J. Virol. 59: 759 - 760 (1986). Velmi významného zlepšení produkce thymidinu v E. coli bylo konkrétněji dosaženo klonováním a expresí genů nrdA. a nrdB bakteriofága T4 kódujících ribonukleotidreduktázu společně s nrdC T4 kódující thioredoxin, protože ribonukleotidreduktáza bakteriofága T4 nemůže využívat thioredoxin E. coli. Bylo zjištěno, že ribonukleotid-reduktáza T4 je relativně necitlivá na řízení alosterickou inhibicí in vitro ve srovnání s tímto enzymem E. coli (Berglund, O., J. Bioi. Chem. 247: 7276 - 7281,1972). Například na rozdíl od enzymu E. coli (Berglund, O., J. Biol. Chem. 247: 270 - 7275, 1972) není ribonukleotidreduktáza T4 inhibována dATP, ale ve skutečnosti je účinkem dATP a ATP stimulována (Berglund, O., J. Biol. Chem. 247: 7276 - 7281, 1972).

Sekvence DNA kódující ribonukleotidreduktázu (např. geny nróA a nrdB) a thioredoxin (např. gen nrc/C) jsou s výhodou heterologní vzhledem k DNA hostitelské buňky, a s výhodou se odvozují od fága T (s výhodou bakteriofága T E. coli), zvláště T „sudých“ fágů, například T2, T4 nebo T6, viz Campbell, A. M., Bacteriophages, kapitola 123, v Neidherdt, výše; a Mathews, C. K. a další (ed.) Bacteriophage T4, American Society of Microbiology, Washington, D.C., 1983. Termín „odvozený od“ je zamýšlený z hlediska definice nejen zdroje ve smyslu jeho fyzického počátku, ale také z hlediska definice materiálu, který má strukturní a/nebo funkční vlastnosti odpovídající materiálu pocházejícímu z referenčního zdroje.

Další použitelná vlastnost T sudých fágových enzymů je substrátová specificita. Normální ribonukleotidreduktáza E. coli využívá UDP jako substrát pouze velmi omezeně, protože konstanta Km pro UDP je přibližně desetinásobně vyšší pro UDP než CDP (Neuhard a Kelln, výše).

Enzym T4 má však pouze dvojnásobný rozdíl v hodnotě K_m(Berglund, O., J. Biol. Chem. 247: 7276 - 7281, 1972) mezi substráty CDP a UDP, což umožňuje dvě cesty k syntéze dUTP. I když byly prováděny pokusy pro dosažení funkční exprese ribonukleotidreduktázy T4 v E. coli, dosavadní úsilí mělo úspěch pouze při expresi oddělených složek a mohlo prokázat aktivitu pouze míšením in vitro (Tseng, M.-J., P. He, J. M. Hilfinger, a G. R. Greenberg, J. Bacteriol. 172: 6323 - 6332, 1990). Ačkoli si autoři nepřejí být vázáni teorií, předpokládají, že patrně v důsledku nepřítomnosti obvyklého systému zpětnovazební inhibice je exprese ribonukleotidreduktázy T4 v E. coli letální, a exprese musí probíhat pouze opatrně za určitých podmínek. Dále jsou zdůrazněny geny, které kódují prekurzorové formy reduktázy a/nebo thioredoxinu, které jsou v buňce zpracovány za poskytnutí zralé formy. Toto zpracování může probíhat přes různé meziprodukty.

Vektory podle předkládaného vynálezu s výhodou obsahují regulační prvek (například promotor jako je lambda P_L, operátor, aktivátor, represor, jako je represor lambda, zvláště varianta citlivá na teplotu, a/nebo zesilující sekvence), vhodné terminační sekvence, iniciační sekvence a vazebná místa ribosomů. Vektor může dále obsahovat markér umožňující selekci. Regulační prvky (zvláště represor lambda) mohou být alternativně umístěny na chromosomu hostitelské buňky. Výhodné je, jestliže geny nrd/\ a nrdB jsou uspořádány ve vektoru ve směru translace (vzhledem ke čtecímu rámci) od genu nrdC. Je zvláště výhodné, jestliže nrdB je uspořádán ve směru translace vzhledem k nrdk. Nejvýhodnější uspořádání tedy představuje vektor, jehož součástí je operon obsahující nrdCAB.

Ribonukleotidreduktáza T4 nepodléhá in vivo zpětnovazebnému řízení (J. Ji, R. G. Sargent, a C. K. Mathews, J. Biol. Chem. 266: 16289 - 16292, 1991; a Berglund výše) pro další podporu redukce ribonukleosiddifosfátu, například pro produkci thymidinu, může být gen kódující regulační podjednotku nrdA modifikován, například použitím • · · 4 mutace, za vytvoření enzymu schopného zvýšit produkci thymidinu působením například snížené citlivosti na alosterickou inhibici, například inhibici meziproduktem enzymu, nebo inhibici produktem, který vzniká při dalším biochemickém zpracování.

Pro konstrukci mutantů T4 nrdA může být použita místně specifická mutageneze pro modifikaci nebo změnu (například substituci) bází genu kódujících aminokyseliny, o kterých se předpokládá, že mění například vazebné místo dTTP, které se účastní alosterické regulace. Analýza aminokyselinové sekvence ribonukleotidreduktázy T4 odhalila segment, u kterého se zdá, že dobře vyhovuje postulované konvenční sekvenci, o které se předpokládá, že se účastní vazby dTTP (E. M. Mclntosh a R. H. Haynes, Mol. Cell. Biol. 6: 1711 - 1721, 1986). Některé změny mohou být v této oblasti ribonukleotidreduktázy T4 provedeny použitím mutageneze zaměřené na určité oligonukleotidy. Obecný přístup může být modelován podle snahy autorů More a další (More, J. T., J. M. Ciesla, L.-M. Changchien, G. F. Maley a F. Maley, Biochemistry 33: 2104 - 2112, 1994) pro snížení vazby deoxycytidylátdeaminázy na dTTP. Zdá se, že velmi užitečná je mutace ⁷⁹Ala na lle, v T4 nrdk. Například produktivita thymidinu u kmenů obsahujících mutant ⁷⁹Ala na lle v T4 nrc/A byla při fermentačních testech na třepačkách podstatně zvýšena. Jak je ukázáno dále, autoři předkládaného vynálezu dosáhli alespoň 25% zvýšení proti rodičovskému kmenu bez této jediné změny.

Ačkoli ⁷⁹Ala na lle je úspěšný příklad, odborníci v oboru nyní zjistí, že je možno získat požadovaný efekt s mnoha dalšími změnami aminokyselin v této oblasti, kde tento efekt spočívá v domnělém přerušení vazby dTTP, ale nikoli zamezení základní funkci enzymu. Může být použita například substituce ⁷⁹Ala jinými aminokyselinami, které mají podobné postranní řetězce jako lle (leucin, vaiin). Jsou možné také modifikace v poloze 79 ve spojení s jinými modifikacemi (například mutacemi) v postulované konvenční oblasti. Další přístupy, • · · « «

- 10 «I Μ • 41 · ♦ „ · tl ·

I · které mohou odborníci v oboru používat, jsou delece jedné nebo více poloh aminokyselin v konvenční oblasti a zavedení syntetické DNA do této oblasti.

V dalším provedení předkládaného vynálezu se poskytuje hostitelská buňka obsahující konstrukt, kde tento konstrukt (například vektor) obsahuje transkripční jednotku obsahující sekvence DNA kódující heterologní ribonukleotidreduktázu a thioredoxin, kde tato reduktáza má menší citlivost na alosterickou inhibici než ekvivalent nebo protějšek hostitelské buňky standardního typu.

Odborníkům v oboru bude zřejmé, že určení relativní citlivosti sledované heterologní reduktázy na alosterickou inhibici ve srovnání s ekvivalentem hostitelské buňky standardního typu, je předmětem rutinního experimentování a pozorování.

Transkripční jednotky obsahující sekvence DNA, např. geny nrd A, nrdB a nrdC, jsou s výhodou operony, ve kterých jsou geny nrd uspořádány v tandemu. To umožňuje transkripci těchto genů ve formě transkriptu jediné mRNA. Aby se minimalizovaly neproduktivní výdaje energie hostitelskou buňkou a dále pro minimalizaci velikosti plasmidu, je výhodné, aby operon obsahoval pouze genetické sekvence vyžadované pro kódování reduktázy a thioredoxinu (včetně kterýchkoli regulačních nebo kontrolních prvků). To může vyžadovat odstranění nadbytečné DNA (například neobvyklého intronu v genu nrdB, fága T4, viz Sjoberg, B-M., a další, EMBO J. 5: 2031 - 2036, 1986).

V dalších výhodných provedeních obsahují vektory podle předkládaného vynálezu pro použití například při produkci thymidinu navíc sekvence DNA kódující thymidylátsyntázu (např. gen řd), viz např. Chu, F. K., a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 3049 - 3053 (1984); Chu, F. K., a další, J. Bacteriol. 169: 4368 - 4375 (1987). Účel použití tohoto enzymu je zlepšení kontroly hladin vyprodukovaného deoxyuridinu vzhledem k thymidinu. Enzym dTMPáza není zcela specifický pro dTMP. S vyššími hodnotami K_m než v případě dTMP, • » ·

- 11 bude dTMPáza PBS1 využívat jako substrát pro produkci deoxyuridinu také dUMP (Price, A. R., Methods in Enzymol. 51: 285 - 290, 1978). Deoxyuridin představuje významný problém pro čištění thymidinu. Proto je jeden způsob pro snížení produkce deoxyuridinu účinné převedení dUMP na dTMP zvýšením hladiny nebo účinnosti thymidylátsyntázy, takže vnitřní koncentrace dUMP zůstává za všech okolností velmi nízká.

Gen pro thymidylátsyntázu (řd) může být heterologní vzhledem k hostitelské buňce a je výhodné, jestliže je td odvozen (ve smyslu definovaném výše) z bakteriofága T, například T „sudého“ fága, a zvláště td fága T4. Ačkoli td může být umístěn ve své vlastní transkripční jednotce, je výhodné, jestliže je td umístěn ve stejné transkripční jednotce, například operonu, jako geny nrd. Navíc je výhodné, jestliže je gen td umístěn ve stejném operonu ve směru translace (z hlediska čtecího rámce) vzhledem ke genům nrd.

McCandliss a Anderson, výše, amplifikovali gen E. coli pro thymidylátsyntázu v plasmidech pCG138 a pCG148 (viz tabulka 5, patentu ‘972), přičemž bylo zjištěno, že se dosáhne zvláště účinného omezení deoxyuridinu. Thymidylátsyntáza T4 je mnohé m účinnější, což je překvapující vzhledem ke skutečnosti, že se nepředpokládá, že enzym E. coli je řízen jakýmkoli typem alosterické regulace (Neuhard a Kelln, výše). Konstanta K_m E. coli enzymu pro dUMP, 4 μΜ (Wahba, A. J. a M. Friedkin, J. Biol. Chem. 237: 3794 - 3801), a konstanta K_menzymu T4 pro dUMP, 2,73 μΜ (Maley, F., L. LaPat-Polasko, V. Frasca a G. F. Maley, Functional domains in T4 Thymidylate Synthase as probed by site-directed mutagenesis, kapitola 29, [v] Karam, J. D. [ed] „Molecular Biology of Bacteriophage T4“, American society for Microbiology, Washington, DC, 1994, str. 322 - 325), jsou podobné a nemohou vysvětlit značný rozdíl v účinnosti. Aniž by si autoři přáli být vázáni teorií, předpokládají, že gen řňyA E. coli má vnitřní sekvenci ukončení transkripce odvozenou z genu proti směru translace, která by mohla mít vliv na hladinu exprese v plasmidových klonech (Bell« · · · · ·

Penderson, D., J. L. Galloway Salvo, a M. Belfort, J. Bacteriol. 173: 1193 - 1200, 1991).

V dalších výhodných provedeních obsahují hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu, zvláště pro použití při komerční výrobě pyrimidinových deoxyribonukleosidů, např. thymidinu, transkripční jednotku (např. operon), kde tato jednotka obsahuje sekvence DNA, například gen udk kódující uridinkinázu, a s výhodou sekvence DNA, například gen dcd kódující dCTP deaminázu, viz např. Wang, L. a B. Weiss, J. Bacteriol. 174: 5647 - 5653 (1992); a Neuhard, J. a L. Tarpo, J. Bacteriol. 175: 5742 - 5743.

Konstrukt podle tohoto provedení vynálezu může dále obsahovat transkripční jednotku kódující ribonukleotidreduktázu (nrdk a nrdB) a thioredoxin (nrdC), nebo jejich prekurzorové formy, které jsou s výhodou heterologní vzhledem k DNA hostitelské buňky, a s výhodou se odvozují od bakteriofága E. coli, zvláště T „sudých“ fágů, například T2, T4 nebo T6.

Uridinkináza produkuje UMP a CMP z uridinu a cytidinu použitím GTP (nebo dGTP) a donoru fosfátu. Tato reakce je inhibována UTP a CTP (J. Neuhard a R. D. Kelln, Biosynthesis and Conversions of Pyrimidines, kapitola 35, [v] F. C. Neidhart a další [ed], „Escherichia Coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology“, druhé vydání, ASM press, Washington DC). Autoři předkládaného vynálezu zjistili, že použití uridinkinázy zvláště společně s dCTP deaminázou vede ke značnému zlepšení produkce thymidinu hostitelskými buňkami nesoucími tyto změny spolu s informacemi patentu '972 výše. Toto pozorování je zcela neočekávané, protože uridinkináza nemá na základě současných informací žádnou přímou úlohu při biosyntéze pyrimidinů de novo, a navíc by bylo její použití prospěšné při komerčních způsobech výroby pyrimidinových deoxyribonukleosidů. Je výhodné, pokud jsou geny udk a dcd uspořádány v tandemu ve stejném operonu. Navíc je třeba zdůraznit geny, které kódují •» ··· prekurzorové formy genů udk a dcd, které jsou zpracovány za vytvoření zralé formy. Takové zpracování může probíhat přes různé meziprodukty. Geny udk a dcd mohou být zaváděny do konstruktu (např. vektor) z jakéhokoli vhodného zdroje způsoby, které jsou odborníkům v oboru dobře známy, například transdukcí P1, elektroporací nebo transformací.

Enzym uráčil DNA glykosyláza, kódovaný genem ung, je odpovědný za degradaci DNA, která obsahuje namísto thyminu uráčil. Jestliže se hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu použijí při komerční výrobě například thymidinu, vnitřní buněčná koncentrace dTTP může být snížena v důsledku využívání dTMP (prekurzor dTTP) při produkci thymidinu. Autoři předkládaného vynálezu tedy zjistili, že existuje potenciálně vyšší sklon pro inkorporaci uracilu do hostitelské DNA, která může být pro hostitele standardního typu letální v důsledku aktivity uráčil DNA glykosylázy, která způsobí příliš velké množství jednořetězcových zlomů v DNA hostitelské buňky. Hostitelské buňky použitelné v předkládaném vynálezu se tedy mohou vyznačovat reprimovanou (ve srovnání s nemodifikovanou buňkou) nebo nepřítomnou aktivitou uráčil DNA glykosylázy. Tato represe nebo nepřítomnost může být dosažena různými způsoby, které budou odborníkům v oboru zřejmé. Například antagonismus (buď celkový nebo částečný) produktů exprese genů ung může být jedním takovým přístupem dosaženým zavedením antagonisty funkčního enzymu (nebo jeho prekurzoru) do hostitelské buňky. Mezi další přístupy patří manipulace genové exprese genu ung například modifikací řídících pvků exprese genu ung nebo zavedením mutací do samotného genu ung, takže produkt exprese genu ung vykazuje malou nebo žádnou aktivitu proteinu uráčil DNA glykosylázy. Další přístup je odstranit gen ung (nebo jeho části kritické pro funkci) z DNA hostitelské buňky. Nepřítomnost nízké hladiny uracíl DNA glykosylázové aktivity může být vlastností hostitelské buňky bez potřeby další manipulace.

* · · · · • · · ···· · < · · • * · · · · ·

U. · · · ····· • · ·· ··· ···· · ······· · · ···

Ve výhodných provedeních předkládaného vynálezu jsou do hostitelské buňky zahrnuty všechny popsané výhodné vlastnosti. Geny nrd, td, udk a dcd mohou být umístěny na oddělených konstruktech, ale je výhodné, jsou-li umístěny na stejném konstruktu, například vektoru. Ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu se tedy poskytuje modifikovaná hostitelská buňka, ve které buňka obsahuje konstrukt DNA (např. vektor) obsahující transkripční jednotku DNA (např. operon), kde tato jednotka obsahuje sekvence DNA kódující (s výhodou T sudý fág, například T4) modifikovanou ribonukleotidreduktázu a thioredoxin, ve kterých má uvedená reduktáza s výhodou nižší citlivost na alosterickou inhibici než ekvivalent nebo protějšek hostitelské buňky standardního typu, kde uvedený konstrukt dále obsahuje;

(a) transkripční jednotku (např. operon) kódující (s výhodou heterologní vzhledem k ekvivalentu nebo protějšku hostitelské buňky) thymidylátsyntázu; a (b) transkripční jednotku (např. operon), kódující uridinkinázu a s výhodou dCTP deaminázu;

a kde tato hostitelská buňka vykazuje reprimovanou nebo nepřítomnou aktivitu uráčil DNA glykosylázy.

Hostitelské buňky modifikované podle předkládaného vynálezu jsou použitelné zvláště při komerční výrobě pyrimidinových deoxynukleosidů. Ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu mohou být použity hostitelské buňky E. coli obsahující (nesoucí) plasmid modifikovaný podle předkládaného vynálezu (zvláště ve spojení s poznatky patentu ‘972) pro komerční výrobu thymidinu. Hostitelské buňky modifikované podle předkládaného vynálezu mohou tedy dále obsahovat dTMPázu odvozenou od např. PBS1 a mutace popisované v patentu ‘972, například deoA, tdk-l a udp-l.

- 15 Obecně se používá způsob fermentace, který zahrnuje submerzní kultivaci buněk v médiu ve vhodné nádobě. Po kultivaci za vhodných podmínek se vyrobený thymidin izoluje (sklidí) a čistí (obohatí), pokud je to nutné, s použitím standardních protokolů za vytvoření preparátu s farmaceutickou čistotou. Čištěný thymidin může být potom použit při výrobě léků, např. farmaceutických prostředků, jako je AZT.

Přehled obrázků na výkresech

Předkládaný vynález je ilustrován na příkladech a s odkazy na následující obrázky, ve kterých:

Obr. 1 schematicky znázorňuje způsob konstrukce plasmidů pCG366. Je třeba zdůraznit, že plasmidy nejsou znázorněny v měřítku.

Obr. 2 schematicky znázorňuje způsob konstrukce plasmidů pCG374 a pCG375.

Obr. 3 znázorňuje mapu plasmidů pCG532.

Obr. 4 znázorňuje průběh růstu a produkce thymidinu rekombinantním kmenem E coli CMG2451 (Ung⁺) a CMG2492 (Ung') nesoucím plasmid pCG366 (nrc/CAB tď) podle příkladu 10.

Obr. 5 znázorňuje produkci thymidinu v třicetilitrovém fermentoru bakterií E. coli CMG2451 (pCG532).

Obr. 6 znázorňuje koncentrace TdR a UdR (mg/l) získané s použitím protokolu čištění podle příkladu 12.

• ·

- 16 Příklady provedení vynálezu

Přiklad 1

Klonování genů nrdCAB T4 a demonstrace jejich aktivity

Geny nrdAB bakteriofága T4 byly klonovány použitím polymerázové řetězové reakce (PCR) s izolovanou DNA fága T4. Jako primery pro PCR genu nrdA byly použity:

5’-TAT TCT AGA CGA TTT TCA AGT TGA GGA CTT ATG C-3’ (SEQ ID No. 1); a

5’-TAT ATC GAT AAT TCA TTA CAA TTT ACA CGC TGC AC-3’ (SEQ ID No. 2).

Restrikční místo Xba\ bylo zavedeno na začátku genu nrdk v amplifikované DNA, a místo štěpení C/al bylo zavedeno na 3’ konci nrdA. Primery pro amplifikaci PCR genu nrdB byly následující:

5’-TAT ATC GAT AAA TGT AAA TTT AAG GAT TCT AAA TG-3’ (SEQ ID No. 3) a

5’-TAT GTC GAC TCC TTA AAA GTA TTT TTT AAA ACT C-3’ (SEQ ID No. 4).

Restrikční místo C/al bylo tedy zavedeno na začátku nrdB, a místo Apal bylo zavedeno na konci nrdB v amplifikované DNA. Fragmenty PCR byly klonovány do plasmidových vektorů, jak je znázorněno v obr. 1 způsoby známými odborníkům v oboru. Struktura klonovaných genů nrdAB byla potvrzena testem enzymatické aktivity. Gen nrdC T4 byl klonován do plasmidu pKC30 za vytvoření plasmidu pDL51 (LeMaster, D. M., J. Virology 59: 759 - 760, 1986) a abyl dodán D. LeMasterem (Dept. of Biochem., Univ. Wisconsin, Madison, Wl). Gen byl subklonován do plasmidu obsahujícího geny nrdAB, jak je znázorněno na obr. 1. Zdroje výchozích materiálů a další základní informace používané v obr. 1 jsou uvedeny v tabulce 1.

- 17 Pro konstrukci pCG198 a pCG301 byl použit syntetický terminátor transkripce (viz obr. 1 a tabulka 1). Konkrétně, plasmid pBC sk⁺ získaný od firmy Stratagene (La Jolla, California) byl štěpen restrikčním enzymem Apal a Asp718l. Potom byla syntetická DNA obsahující sekvenci ukončení transkripce ECOTGP (ďAubenton Carafa a další, J. Mol. Biol. 216: 839 - 843, 1990) vložena jako náhrada původní sekvence mezi štěpící místa restrikčních endonukleáz Apa\ a Asp718l. Tento fragment znovu vytvořil rozpoznávací místo Apal, ale došlo ke zničení rozpoznávací sekvence Asp718l v novém plasmidu. Vložená DNA měla následující složení: 5’-CGAGC CCGCCTAATG AGCGGGCTTT TTT TT-3’

3’-CCGGGCTCG GGCGGATTAC TCGCCCGAAA AAAAACATG-5’ (ukázáno jako řetězce v SEQ ID No. 5, popřípadě 6) vytvořené ze dvou oligonukleotidů.

• · · · • 4

- 18 Tabulka 1

Genealogie plasmidů pCG366 a pCG532 a zdroje materiálů

Plasmid	Gen (geny)	Promotor	Počátek vektoru	Markér	Odvození
PACYC177	amp kan		p15A	amp kan	Chang a Cohen (1978) J. Bacteriol 134: 1141-1156. ATCC 37031
pBCpBCsk+	Cam	Plac	ColE1	Cam	Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037
pBluescript II ks	Amp	Plac	colEI	Amp	Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037. ATCC 87047
pBR322	amp tet		colEÁ	amp tet	Bolivar a další, (1977) Gene 2: 95 - 113
pDL51	T4 nrdC		colEl	Amp	LeMaster, J. Virol. 59: 759 - 760, 1986
pKC30	Amp	λΡ\|_	colEt	Amp	Shimatake a Rosenberg (1981), Nátuře 292: 128. ATCC 37286
PKTdAl	T4 td		co/EI	Amp	West a další (1986), J.B.C. 261: 13446 - 13450
pT7/T3/18	Amp	fág T7/T3	colEl	Amp	Life Technologies, INC., 9800 Medical Center Dr., Rockville, MD 20897
pTZ18U	Amp		colEA	Amp	Bio-Rad, 2000 Alfred Nobel Dr., Hercules, CA 94547
pUC18	Amp	Plac	colEI	Amp	Yanisch-Perron a další (1985), Gene 33: 103 - 119 ATCC 37253
pUC19	Amp	Plac	colEt	Amp	Yanisch-Perron a další (1985), Gene 33: 103 - 119 ATCC 37254
pCG173	XP_L vektor	XP_L	colEl	Amp	λΡι. v pBluescript II ks

• ·

- 19 Tabulka 1 - pokračování

pCG196	T4 nrdC		co/E1	Amp	T4 nrdC v pUC19
pCG198	Cam	Plac	CO/E1	Cam	Syntetický terminátor transkripce v pBC sk+
pCG301	XP_L vektor	λΡι	co/£1	Cam	ÁP_L v pCG198
pCG308	T4 nrdC	λΡι,	colE1	Cam	T4 nrdC v pCG301, LeMaster, J. Virol. 59: 759 - 760, 1986
pCG312	T4 nrdA	PT7	colE1	Amp	T4 nrdA v pT7/T3/18
pCG318	NrdB	PT7	colEl		T4 nrdB v pBluscript II ks
pCG323	NrdAC	λΡι	colEt	Cam	T4 nrdAC v pCG301
pCG326	NrdABC	λΡι.	colE1	Cam	T4 nrdABC v pCG301
pCG332	NrdAB	XP_L	colEl	Cam	T4 nrdAB v pCG301
pCG334	NrdAB	λΡι.	C0ÍE1	Cam	T4 nrdAB v pCG301
pCG337	NrdCAB	λΡι.	C0IE1	Cam	T4 nrdCAB v pCG301
pCG343	NrdCAB	λΡι.	colE1	Cam	T4 nrdCAB v pCG301
pCG356	Td	λΡι	co/E1	Cam	T4 řdv pCG301
,pCG358	dcd, udk		colE1 (pUC18)	Amp	E.coli dcd, udk v pUC18
pCG360	NrdCAB, td	XP_L	colEl	Cam	T4 nrdCAB v pCG301
pCG366	NrdCAB, td	λΡι	C0/E1 (pBR322)	Cam Tet	T4 nrdCAB, td v pBR322, Amp^s
pCG374	dcd, udk		p15A	amp	E.coli dcd, udk v pACYC177
pCG376	λΡι. vektor	λΡι	p15A	amp	pACYC177 s λΡχ & MCS pCG301
pCG464	T4 nrdA Xdal/Hin dlll fragment		(pTZ18U) co/E1	Amp	XĎal/H/ndlll fragment se sekvencí nrdA klonovanou do míst Xba\IHind\\\ plasmidu pTZ18U (BioRad Laboratories)

• ·

-20 Tabulka 1 - pokračování

pCG492	T4 nrdA Xbal HindM fragment		(pTZ18 U colEI)	Amp	PCG464 s mutaci v sekvenci T4 nrd A způsobující změnu ⁷⁹Aia->//e
pCG494	WrdCAB td	XPl	colEA (pBR322)	Cam Tet	Kpnt/AflU fragment z pCG494 vložený do pCG366 s přidáním mutace ⁷⁹Ala—>lle do nrdA
pCG532	NrdCMi, td udk, Dcd	XP_l	colEl (pBR322)	Cam	udk, dcd klonované do pCG494

Plasmid pCG198 byl kombinován s pCG173 obsahujícím promotor lambda P_L z plasmidu pKC30 klonovaného do pBluescript II ks (Stratagene, La Jolla, California), jak je ukázáno na obr. 1. Jak plasmid pCB198, tak i pCG173 byly štěpeny Hind\\\ a Asn\, potom spojeny za vytvoření nového plasmidu pCG301 obsahujícího promotor lambda P_L, větší počet restrikčních klonovacích míst a dále terminační sekvenci ECOTGP zkopírovanou z původní peptidové oblasti tryptofanového operonu.

T4 ribonukleotidreduktázová aktivita byla měřena HPLC metodou, při které se nepoužívají radioisotopy ani substrát UDP. Test pro přímé stanovení ribonukleotidreduktázy obsahoval 1 mM NADPH, 1 mM DTT, 0,5 mM dATP, 0,6 mM UDP, 20 mM Tris (pH 8,0) a 5 mM MgCI₂. Za těchto podmínek je ribonukleotidreduktáza E. coli inhibována a není detekována. Enzymatická reakce (100 μΙ) byla zastavena přidáním 10 μΙ 50% kyseliny trichloroctové (TCA). Po 10 min na ledu se vzorky centrifugují v mikrocentrifuze. Supernatant byl extrahován čtyřikrát diethyletherem pro odstranění TCA. Bylo přidáno 5 ml pufru Tris (1,0 M pH 8,0) a potom 2 μΙ jedu chřestýše (40 mg/ml, Sigma), a vzorek byl inkubován při 37 °C 60 min. Vzorky byly potom zahřívány 3 min při 70 °C a potom centrifugovány 5 min

- 21 pro odstranění sraženiny. Provede se standardizace objemů a potom analýza HPLC s UV detektorem a deoxyuridinem jako standardem. Jako kolona se použije Spherisorb ODS-2, 5 pm, 250 mm x 4,6 mm s použitím 12 mM fosforečnanu amonného (pH 5,0) jako mobilní fáze a průtokem přibližně 1,0 ml/min. Výsledky jsou ukázány v tabulce 2 pro buňky obsahující plasmid pCG343, přičemž je jasně ukázána funkční exprese T4 ribonukleotidreduktázy.

Tabulka 2

Aktivita ribonukleotidreduktázy

Kmen	Podmínky indukce	Specifická aktivita nmol/10 min/mg proteinu
CMG1093	neindukováno	0
CMG1093	indukováno	0
CMG1093/pCG343	neindukováno	0
CMG1093/pCG343	indukováno	704,7

Příklad 2

Vytvoření derivátu hostitelského kmenu CMG2451 z kmenu CMG1115

Kmen CMG1115 se úplně popisuje v McCandliss & Anderson (US patent 5,213,972). Kmen CMG1115 byl vylepšen pro produkci thymidinu selekcí na růst v médiu obsahujícím 30 mg/l 5-fluorouridinu, za vzniku kmene CMG2401. Potom byla provedena selekce kmenu CMG2401 na růst na médiu s obsahem 30 mg/l 3’-azido-3’deoxythymidinu za vzniku kmene CMG2404. CMG2404 vyžaduje pro růst L-prolin v důsledku zděděné mutace A(/ac-pro) z původního rodičovského kmene JM101. Bylo provedeno párování Hfr mezi CMG2404 a Hfr kmenem CAG5053 (Singer, M. a další, Microbiological Review'. 5: 1 - 24, 1989) způsobem známým odborníkům v oboru za

získání kmene CMG2434 s fenotypem Lac⁺, Pro⁺. Mutace udp (uridinfosforyláza) v CMG2434 stále ještě měla částečnou uridinfosforylázovou aktivitu, která byla zřejmá z pozorovaného hromadění thyminu po indukci produkce thymidinu. Mutace udp byla znovu zavedena z CGSC5128 (E. coli Genetic Stock Center, Yale University) transdukcí fágem P1 způsobem známým odborníkům v oboru. meřE3079::Tn)0 z kmene CAG18491 byl nejprve transdukován do CMG2434, kde sloužil jako pozitivní selekční markér pro transdukcí udp. Potom byl udp-Ί transdukován do meřE3079::Tn70 derivátu CMG2434 selekcí na růst bez L-methioninu v definovaném médiu. Derivát udp-Ί byl pojmenován jako kmen CMG2451. Genealogie CMG2451 je shrnuta v tabulce 3.

Tabulka 3

Genealogie hostitelského kmene E. co//CMG2451

Kmen	Genotyp	Derivát³
CMG1115	CMG1106 (Tn5::dTMPáza kan^R)	Vložená Tn5::dTMPáza z pCG132
CMG2401	CMG1115 FUdR^R	Resistence na 5-fluor-2’deoxyuridin
CMG2404	CMG2401 AZT^r	Resistence na 3’-azido-3’deoxythymidin
CMG2434	CMG2404 Lac⁺ Pro⁺	Oprava A(/ac-proAB) konjugací s CAG5053^b
CMG2448	CMG2434 meíE3079::Tní0	meíE3079::Tn70 z CAG18491^b
CMG2451	CMG2448 udp-1 mefE⁺tet^s	udp-1 z CGSC5128⁰ a náhrada mefE3O79::Tn70

a

Mutace byly vždy zaváděny do kmenů E. coli transdukcí fágem P1. Jestliže mutace měla selektivní markér, bylo použito přímé

transdukce P1. Jestliže mutace selektivní markér neměla, bylo použito kotransdukce P1 s vložením blízkého TníO.

^b Singer, M., a další, Microbiological Review: 53: 1 - 24, 1989.

^c Všechny kmeny CGSC byly získány z E. coli Genetic Stock

Center, Yale University, P.O.Box 208104, New Haven, CT

06520-8104.

Příklad 3

Klonování a exprese genu T4 td do plasmidů produkujícího thymidin

Gen T4 td byl klonován do pKTdÁl Western a dalšími (J. Biol. Chem. 261: 13446 - 13450, 1986), bez intronuo délce 1017 párů bází. Gen td byl subklonován do pCG301 použitím dvou oligonukleotidů jako propojujících sekvencí (linkerů) s následujícími sekvencemi:

5'-GAT CCG GAG GAT AAA TGA AAC AAT ACC AAG ATT TAA T-3’ (SEQ ID No. 7) a;

5’-TAA ATC TTG GTA TTG TTT CAT TTA TCC TCC G-3’ (SEQ ID No. 8).

Výsledkem byl plasmid pCG356. Gen td z pCG356 byl potom subklonován do pCG343 za vytvoření pCG360 (obr. 1). Do plasmidů pCG360 byl subsklonován gen resistence na tetracyklin a počátek replikace plasmidů z pBR322 (Bolivar, F. a další, Gene 2: 95 - 113, 1977) za vytvoření pCG366. Aktivita thymidylátsyntázy byla měřena spektrofotometrickou metodou Wahba a Friedkin (J. Biol. Chem. 236: PC11 - PC12, 1961). Výsledky jsou ukázány v tabulce 4.

Tabulka 4

Aktivita thymidylátsyntázy

Kmen

Specifická aktivita

	AOD₃₄o/mg proteinu/min
CMG1093	- 0,72
CMG1093/pKTdDI	3,24
CMG1093/pCG356	3,45
CMG1093/pCG360	1,43

Příklad 4

Údaje z fermentace na třepačce ukazující vliv genu T4 td na produkci thymidinu a snížení množství deoxyuridinu

Pro vyhodnocování produktivity thymidinu v různých rekombinantech E. coli byla používána fermentace na třepačkách. Půda pro fermentaci na třepačkách a používané metody v tomto a dalších příkladech se popisují v následujícím příkladu 6. V tomto případě bylo 20 ml půdy na baňku zaočkováno 2 ml očkovací kultury a byla provedena inkubace na třepačce při 30 °C. Při dosažení OD při 600 nm přibližně 10 byly baňky převedeny do třepačky při 37 °C na 30 min pro mírnou indukci promotoru λΡ|_. Potom byly baňky převedeny do třepačky s teplotou 35 °C, kde fermentace pokračovala. V průběhu fermentace byla podle potřeby přidávána glukóza a pH bylo nastaveno na přibližně 7 amoniakem na základě změny zbarvení fenolčerveni. Koncentrace thymidinu byla měřena HPLC s použitím kolony Spherisorb ODS-2, 5 pm, 250 mm x 4,6 mm, a 25 mM fosforečnanu amonného (pH 3,3) jako mobilní fáze, s průtokem přibližně 1,5 ml/min.

Kmen CMG2451/pCG366 (T4 nróCAB, td) byl fermentaci na třepačkách porovnáván s kmenem CMG2451/pCG343 (T4 nrdCAB). Tabulka 5 ukazuje, že u kmene CMG2451/pCG366 došlo ke snížení koncentrace deoxyuridinu a konverzi na thymidin v důsledku přítomnosti genu T4 td.

- 25 Tabulka 5

Vliv thymidylátsyntázy na produkci thymidinu po 66 hodinách

Kmen	Thymidin (mg/l)	Deoxyuridin (mg/l)	% deoxyuridinu
CMG2451/pCG343	1198	1728	144,2
CMG2451/pCG366	3327	206	6,2

Příklad 5

Konstrukce T4 ribonukleotidreduktázové mutanty ⁷⁹Ala na lle

Mutace byla zavedena místně specifickou mutagenezí založenou na metodě popsané Kunkelem (Kunkel, T. A., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82; 488 - 492, 1985). Všechny materiály pro konstrukci mutanty včetně fágmidové DNA pTZ18U, pomocného fága M13KO7, bakteriálních kmenů E. coli CJ236 a MV1190, T7 DNA polymerázy a T4 DNA ligázy byly poskytnuty v soupravě Muta-Gene in vitro mutagenesis kit firmy Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Nejdříve byl fragment DNA Xba\IHind\\\ obsahující gen nrdA gen bakteriofága T4 izolován z plasmidu pCG312 (ChemGen Corp, tabulka 1, výše). Fragment DNA Xba\IHind\\\ byl klonován do restrikčních míst Xba\IHind\\\ fágmidového vektoru pTZ18U použitím standardních protokolů (Sambrook, J., Fritsch, E. F. a Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Fágmid pCG464 nesoucí inzert byl vložen do E. coli CJ236. Tento kmen je deficientní na dUTPázu {dut) a uracil-N-glycosylázu (ung), což vede k příležitostné substituci uracilu za thymin v nově syntetizované DNA. Jednořetězcová DNA plasmidu pCG464 obsahující uráčil byla izolována z CJ236 podle příručky Bio-Rad Laboratories instructional Manual. Tato DNA (0,2 pmol) byla teplotně hybridizována s 6 pmol fosforylovaného primeru

- 26 5’-AGC AAA CAT TAA ACA GCG TGC AATTAC ATA TTG ATA ATC AGG TTC-3’ (SEQ ID No. 9) obsahujícího sekvenci požadované mutace (podtrženo) kódující lle namísto původního ⁷⁹Ala.

Komplementární řetězec DNA byl syntetizován pomocí T7 DNA polymerázy podle popisu v protokolu Bio-Rad. Reakční produkty byly transformovány do E. coli MV1190 obsahující uracil-N-glycosylázu standardního typu, která degraduje rodičovský řetězec obsahující uráčil, čímž dochází k obohacování na mutantní řetězec. Plasmidy obsahující požadovanou mutaci byly detekovány přímým sekvenováním DNA použitím sekvenačního systému Silver Sequence DNA Sequencing System firmy Promega Corp. (Madison, Wl). Zdálo se, že všechny čtyři analyzované transformanty obsahovaly plasmidy s mutací. Jeden z nich byl označen pCG492 a použit pro další experimenty. Pro kontrolu, zda tato mutace ovlivňuje syntézu thymidinu, byl zaveden do produkčního plasmidů pCG366 (ChemGen Corp., tabulka 1 a obr. 1). K tomuto účelu byl fragment DNA Kpn\IAfl\\ z pCG366 obsahující 5'-část genu nrdA nahrazen fragmentem Kpnl/AflW z pCG492, který obsahuje mutaci. Nový plasmid pCG494 byl zaveden do produkčního kmene OMG2451 (ChemGen Corp., příklad 2 a tabulka 4 výše). Vliv mutace T4 nrdA byl vyhodnocen porovnáním produkce thymidinu kmenem CMG2451 (pCG494) a CMG2451 (pCG366), jak je ukázáno v příkladu 6 dále.

Příklad 6

Fermentace na třepačkách pro testování produkce thymidinu použitím

CMG2451 (pCG366) a CMG2451 (pCG494)

250 ml baňky s přepážkami obsahující 25 ml produkčního média byly zaočkovány 2 ml čerstvě narostlé kultury v médiu LB s přídavkem vhodného antibiotika. Kultury byly pěstovány při 30 °C na třepačce při 250 ot/min. Když dosáhla OD₆oo přibližně 5, baňky byly převedeny do třepačky 37 °C na 30 min. Potom byly baňky převedeny do třepačky ·· · · · · · · · ·· • · · » · · ·

Q7 ·· · · ·····

- Z / - · · ·· ♦ ♦ · ···« · ······* ·· ·· · °C, kde fermentace pokračovala. Produkční médium mělo následující složení (g/l): Ardamine YEP-S (Red Star Yeast & Products, Milwaukee, Wl) - 10; CaCO₃ - 10; MgSO₄ - 0,4; fenolčerveň - 0,24; PP90BT (DMV International, Fraser, N.Y.) - 4,5; sorbitol - 20; chloramfenikol - 0,03; stopové prvky (1000 x) - 1 ml/l. Stopové prvky (1000 x) měly následující složení (g/l): kyselina boritá - 0,05; chlorid vápenatý - 20; síran kobaltnatý - 0,05; síran měďnatý - 0,01; síran železnatý - 20; chlorid železitý - 20; síran manganatý - 0,5; molybdenan sodný - 0,1; a síran zinečnatý - 0,1. V čase indukce bylo přidáno 10 g/l Ardamine YEP-S. Glukóza byla v průběhu fermentace přidávána v průměru každé dvě hodiny (2,5 g/l). pH v baňkách bylo udržováno na hodnotě přibližně 7,0 přidáváním 4N NH4OH, při posuzování podle zbarvení indikátoru fenolčerveni. Οϋβοο byla odečítána po zředění vzorku 1 : 10 v 10 mM H2SO4 pro rozpuštění solí přítomných v médiu. Koncentrace thymidinu byla měřena C-18 HPLC s reverzními fázemi na koloně Alltech Spherisorb ODS-2 a s použitím spektrofotometrického detektoru Shimadzu při 260 nm. Jako mobilní fáze byl použit 25 mM NH4H2PO4 (pH 3,3) ve vodě s konstantním průtokem 1,5 ml/min.

Výsledky produkce thymidinu kmeny CMG2451 (pCG366) a CMG2451 (pCG494) po 2, 17 a 25 hod po indukci jsou ukázány v tabulce 6. Při tomto experimentu byly použity dvě opakování experimentů v baňkách, přičemž variabilita mezi zdvojenými baňkami nepřesáhla 15 %. Výsledky ukazují, že mutanta T4 nrd/\ dosahovala lepších výsledků než kmen standardního typu nrdk. To bylo potvrzeno v několika nezávislých experimentech na třepačkách se stejnými bakteriálními kmeny.

Tabulka 6

Produkce thymidinu CMG2451 (pCG366) a CMG2451 (pCG494)

Kmen hod hod hod

	Specifická aktivita (mg/l/OD)
CMG2451 (pCG366)	6,1	32,5	43,1
CMG2451 (pCG494)	8,5	36,1	51,4

Příklad 7

Fermentace na třepačkách pro zjištění vlivu genu udk E. coli na produkci thymidinu

Gen dcd nebo operon dcd udk byly klonovány do vektoru pACYC177. Tento vektor s počátkem replikace p15a je odlišný od plasmidů založených na co/E1 jako je pCG366, a je tedy kompatibilní a může být udržován ve stejném hostiteli s plasmidy založenými na co/E1, Podrobnosti konstrukce plasmidů vedoucích k pCG374 (udk dcd) nebo pCG375 (dcd) jsou ukázány na obr. 2. Geny na těchto plasmidech jsou exprimovány z nativního promotoru E. coli operonu udk dcd.

Použitím selekce na ampicilinovou resistenci byly zavedeny plasmidy pCG374 a pCG375 do CMG2451 (pCG366) pro testování vlivu na produkci thymidinu při fermentaci na třepačkách popsané v příkladu 6. Výsledky v několika časových bodech jsou ukázány v tabulce 7. I když specifická aktivita (thymidin na OD buněk) je podobná jak v přítomnosti, tak i bez genu udk, buňky s genem udk na druhém plasmidů pCG374 rostly na vyšší buněčnou densitu a produkovaly podstatně větší množství thymidinu (5,8 g/l ve srovnání s 3,0 g/l pro kmen, ve kterém byl na druhém plasmidů přítomen pouze gen dcd). Tyto výsledky byly nečekané, protože není jasné, proč by mohla mít uridinfosforyláza tento účinek.

Na základě těchto údajů a dalších informací byl gen udk vybrán pro zavedení spolu s genem E. coli dcd při konstrukci plasmidů pCG532 (viz příklad 8 a obr. 3).

-29Tabulka 7

Porovnání vlivu druhých plasmidů s geny dcd nebo dcd udk na produkci thymidinu na pozadí CMG2451 (pCG366)

Čas (hod)	OD₆qo	Thymidin (mg/l)	Specifický thymidin (mg/l/OD)
Základní kmen a plasmid	CMG241 (pCG366)	CMG2451 (pCG366)	CMG2451 (pCG366)	CMG2451 (pCG366)	CMG2451 (pCG366)	CMG2451 (pCG366)
Druhý plasmid na bázi pACYC 177	pCG374 s dcd udk	pCG375 s dcd	pCG374 s dcd udk	pCG375 s dcd	pCG374 s dcd udk	pCG375 s dcd
8 hod	29,112	29,94	889	884	30,5	29,5
18 hod	40,206	32,946	1721	1608	42,8	48,8
42 hod	48,348	33,96	4020	2740	83,1	80,7
66 hod	57,498	28,614	5804	3012	100,9	105,3

Příklad 8

Klonování operonu E. coli udk dcd do produkčního plasmidu pCG494

Geny udk a dcd E. coli kódují pyrimidinribonukleotidkinázu, popřípadě dCTP deaminázu. Oba geny byly mapovány do fragmentu 3,4 kb BamPl/Pst\ DNA fága lambda 355 genomové knihovny Kohary (Kohara, Y., Akiyama, K. a Isono, K., Cell 50, 495 - 508, 1987). Zdá se, že udk je umístěn ve směru translace ve směru k dcd a přepisuje se ve stejném směru jako dcd (Neuhard, J. a Tarpo, L., J. Bacteriol. 175: 5742 - 5743, 1993). Tyto geny byly klonovány do produkčního plasmidu ve dvou krocích. Nejprve byl klonován fragment DNA 3,4 kb SamHl/Psfl z lambda 355 do vícenásobného klonovacího místa plasmidu pUC18 (Yamisch-Perron, C., Vieira, J. a Messing, J., Gene

- 30 33: 103 - 109, 1985) (plasmid pCG358). Potom byl fragment vyříznut z polylinkerové oblasti pCG358 pomocí SamHI a Sphl a klonován namísto fragmentu 0,7 kb Bglll/Sphl (obsahujícího část genu resistence na tetracyklin) produkčního plasmidu pCG494. Konečný plasmid 14,7 kb pCG532 obsahuje počátek replikace skupiny kompatibility co/E1, gen resistence na chloramfenikol, geny udk a dcd a nrdCAB bakteriofága T4 (kóduje thioredoxin, popřípadě dvě podjednotky ribonukieotídkinázy) a T4 td (kóduje thymidylátsyntázu) pod řízením promotoru P_L bakteriofága lambda. Gen nrdA fága T4 v pCG532 byl dříve změněn místně specifickou mutagenezí (⁷⁹Ala na lle).

Ve směru translace vzhledem ke genu td je umístěn syntetický terminátor transkripce, aby se zabránilo přechodu transkripce do replikační oblasti. Genetická mapa plasmidu pCG532 je znázorněna na obr. 3.

Příklad 9

Fermentace na třepačkách CMG2451 (pCG494) a CMG2451 (pCG532) pro získání thymidínu

Plasmid pCG532 obsahující geny udk a dcd E. coli byl zaveden do produkčního kmene CMG2451. Nový kmen CMG2451 (pCG532) byl testován spolu s rodičovským kmenem CMG2451 (pCG494) v experimentech na třepačkách pro porovnání z hlediska produkce thymidínu. Výsledky ze dvou nezávislých experimentů jsou ukázány v tabulce 8. První experiment byl proveden podle výše uvedeného popisu a vzorky byly odebírány 17 hod po indukci. Ve druhém experimentu byly buňky indukovány při vyšší OD (přibližně 9) a vzorky pro analýzu byly odebírány 3 hod po indukci. V obou případech se kmen obsahující klonované kmeny udk a dcd choval lépe než rodičovský gen.

• · » · ·

• · · * ·

Tabulka 8

Fermentace pro získáni thymidinu kmeny CMG2451 (pCG494) a

CMG2451 (pCG532)

Expriment 1
Kmen	OD 600	TdR (mg/l)	Specifická aktivita (mg/l/OD)
CMG2451 (pCG494)	16,5	599	36,3
CMG2451 (pCG532)	17,5	867	49,5

Experiment 2
Kmen
CMG2451 (pCG494)	8,5	149	17,5
CMG2451 (pCG532)	8,4	192	22,8

Příklad 10

Přidání další mutace uny a její vliv na produkci thymidinu při fermentaci na třepačkách

Byl zkonstruován negativní řetězec uráčil DNA glykosylázy zavedením mutace ung;:Tn10 (Varshney, U., a další, J. Biol. Chem. 263: 7776 - 7784, 1988) do hostitele CMG2451 použitím transdukce P1 jak bylo popsáno výše, přičemž produkt byl nazván CMG2492. Plasmid pCG366 byl zaveden do CMG2492. Srovnávací experiment mezi kmeny Ung' a Ung⁺ pro syntézu thymidinu na třepačkách je ukázán na obr. 4, kde se používalo metody kultivace na třepačkách popsané v příkladu 6. Buňky byly pěstovány v baňkách 250 ml při 30 °C a syntéza thymidinu byla indukována posunem teploty na 37 °C 30 min a potom přechodem na 35 °C. Hostitel Ung bez uráčil DNA glykosylázy vydržel růst déle a vyprodukoval o 30 % více thymidinu.

Příklad 11

Produkce thymidinu ve 30 litrovém fermentoru s kmenem CMG2451 (PCG532)

Pro produkci thymidinu ve 30 litrovém fermentoru (B. Braun Biotec Biostat C) s kmenem CMG2451/532 byly použity následující podmínky. Očkovací kultura (500 ml) byla pěstována ve čtyřlitrové třepané baňce s přepážkami v médiu LB (5 g/l kvasničný extrakt Difco, 10 g/l trypton Difco, 5 g/l NaCI) s přídavkem 30 mg/l chloramfenikolu a 25 mg/l kanamycinu při 30 °C až do dosažení OD při 600 nm 2,37. Konečné pH bylo 6,69. První dávka ve fermentoru (12 I) obsahující směs uvedenou v tabulce 9 byla sterilizována při 121 °C 55 min. Po ochlazení byl přidán odděleně autoklávovaný roztok (500 ml) pro úpravu koncentrací v půdě na 20 g/l sorbitolu a 3,0 g/l MgSO4.7H2O. Před zaočkováním byl přidán filtrací sterilizovaný roztok (200 ml) navržený tak, aby byly nastaveny počáteční koncentrace na 30 mg/l chloramfenikolu, 25 mg/l kanamycinu, 1 mg/l d-biotinu, 10 mg/l thiaminu a 10 mg/l kyseliny nikotinové.

Byly připraveny tři doplňovací roztoky: a) Cerelose 2001 (monohydrát dextrózy) 562 g/l s 2 mg/l biotinu, 20 mg/l thiaminu, 20 mg/l kyseliny nikotinové a 30 mg/l chloramfenikolu; b) sorbitol 717 g/l s 4 mg/l biotinu, 40 mg/l thiaminu, 40 mg/l kyseliny nikotinové a 60 mg/l chloramfenikolu; a c) surová směs bohatá na dusík obsahující 360 g/l materiálu Amberex 695 AG (Red Star Yeast & Products, Milwaukee, Wisc.), 6 g/l PP90M (DMV International, Fraser, NY) s 1 x stopovými prvky a 0,1 ml/l Mazu DF1 OPMOD11 (BASF). Doplňovací roztoky byly sterilizovány 40 až 50 min při tlaku páry 0,12 MPa.

Tabulka 9

Složení výchozí půdy v 30 litrovém fermentoru

Složka	Koncentrace (g/l nebo ml/l)
Hexametafosfát sodný	4

- 33 • ♦ » • · • r « · • · · · ·

KH2PO4	4
(NH₄)₂HPO₄	4
Cad₂	0,4
Kyselina citrónová	0,5
Amberex 695 (Red Star Yeast & Products, Milwaukee, Wl)	20
PP90M (DMV International, Fraser, NY)	15
Trypton (Difco, Detroit, Ml)	5
1000 x stopové prvky (viz příklad 7)	1 ml/l
CaCO₃	5
Glycin	1,83
Odpěňovač Mazu DF10PMOD11 Defoamer (BASF Speciality Products, Gurnee, IL)	0,2 ml/l

Pracovní podmínky byly následující: počáteční teplota 31 °C; otáčky 600 ot/min; průtok vzduchu 3 l/min; pH 6,8; tlak 0 MPa. Koncentrace rozpuštěného kyslíku byla řízena na nasycení 25 % pomocí smyčky pro řízení průtoku. Otáčky byly zvyšovány na 750 ot/min v 8 hod, 850 ot/min v 9 hod a 950 ot/min v době přesunu teploty z 31 na 35,5 °C v čase 9,2 hod, kdy kultura dosáhla OD 37,8. Počínaje časem 9,7 hod byl protitlak nastaven na maximum 0,06 MPa, aby se pomohlo přenosu kyslíku do kultury. Rychlost přechodu teploty pro indukci syntézy thymidinu byla 0,2 °C/min.

Po dosažení hustoty biomasy 20 OD při 600 nm (odečítáno po zředění 50 mM H₂SO₄ pro rozpuštění solí byly přidávány dávky 85 ml doplňovacího roztoku sorbitolu (b) na každé zvýšení koncentrace biomasy o 5 OD. V čase 16,7 hod bylo přidávání sorbitolu zastaveno a bylo zahájeno přidávání monohydrátu dextrózy (glukóza) (a) za řízení kontrolní smyčkou pro rozpuštěný kyslík typu PID na fermentoru B. Braun, nastaveném na 25 %. Jednoduše řečeno, když byla koncentrace rozpuštěného kyslíku nižší než 25 %, bylo zastaveno · » · 4 « » * • 4 4 • · · · « 9 t • · C * » · ř • · · * · přidávání cukru, a jestliže byla koncentrace rozpuštěného kyslíku vyšší než 25 %, přidávání cukru pokračovalo. Samotný tento protokol udržuje koncentraci glukózy na nízké hodnotě, ale nedovolí hladovění kultury na glukózu po velmi dlouhou dobu. Doplnění surového dusíku (500 ml) bylo prováděno v čase 11 hod, 16,2 hod, 21,2 hod, 28,2 hod,

33,2 hod a 40,5 hod.

Průběh koncentrací a akumulace biomasy, thymidinu a deoxyuridinu při fermentaci je ukázán na obr 5.

Příklad 12

Čištění thymidinu z fermentační půdy

Materiál Dowex Optipore L-285 (The Dow Chemical Company) byl suspendován v deionizované vodě a byl nanesen do skleněné kolony o průměru 48 mm za vytvoření lože o objemu přibližně 500 ml. Kolona byla promyta 500 ml 5% NaOH, a potom promývána deionizovanou vodou až do dosažení pH efluentu 7,0.

Na kolonu bylo naneseno 500 ml fermentační půdy s koncentrací thymidinu (TdR) 4,890 g/l a koncentrací deoxyuridinu (UdR) 1,040 g/l. Kolona byla promyta dvěma objemy lože deionizované vody. TdR a UdR byly eluovány dvěma objemy lože 5% alkoholu (ethanol 90,5 %, methanol 4,5 %, isopropylalkohol 5 %) a potom dvěma objemy lože 10% alkoholu a dvěma objemy lože 15% alkoholu. Koncentrace TdR a UdR ve 25 ml frakcích je ukázána na obr. 6. Kolona byla regenerována promytím 5% NaOH, potom deionizovanou vodou na pH7,0 a postup byl opakován. Frakce 91 160 byly spojeny ze dvou oddělených izolací a sušeny ve vakuové odparce. Thymidin byl znovu rozpuštěn v minimálním množství horké vody a krystalizován při 4 °C. Potom byly krystaly rekrystalizovány ještě dvakrát a sušeny v sušárně při 55 °C 15 hod. Celkem bylo získáno 979,8 mg krystalického thymidinu s čistotou vyšší než 99 %, která by měla být vhodná pro použití jako farmaceutický meziprodukt.

- 35 « · 9999 > ·* ·« « « * ♦ · · « · * · » «. « <' «««··*· »· «· ·

Vedlejší frakce obsahující deoxyuridin i thymidin byly spojeny s matečnými louhy a zahuštěny na rotační vakuové odparce na konečný objem 1200 ml s koncentrovaným alkoholem. Celkové množství TdR v těchto 1200 ml roztoku bylo 3571 mg. Celkový izolovaný výtěžek (včetně 3571 mg vedlejších frakcí TdR) byl 93,1 %.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Konstrukt DNA obsahující transkripční jednotku, která obsahuje gen pro ribonukleotidreduktázu a gen pro thioredoxin nebo gen pro uridinkinázu a/nebo gen pro dCTP deaminázu.
2. Konstrukt DNA podle nároku 1, obsahující transkripční jednotku, která obsahuje gen pro ribonukleotidreduktázu a gen pro thioredoxin.
3. Konstrukt DNA podle nároku 1, obsahující transkripční jednotku, která obsahuje gen pro uridinkinázu a/nebo gen pro dCTP deaminázu.
4. Konstrukt DNA podle nároku 1, obsahující transkripční jednotku, která obsahuje gen pro uridinkinázu a gen pro dCTP deaminázu.
5. Konstrukt DNA podle některého z nároků 1 až 4, kde tento konstrukt je extrachromosomální vektor.
6. Konstrukt DNA podle nároku 5, kde vektorem je plasmid, virus, transposon, minichromosom nebo fág.
7. Konstrukt DNA podle nároku 6, kde vektorem je plasmid, přičemž genem pro ribonukleotidreduktázu je gen nrc/A a/nebo

- 37 gen nrdB, a kde genem pro thioredoxin je gen nrdC, přičemž uvedené geny jsou uspořádány v operonu.
8. Konstrukt DNA podle nároku 7, kde transkripční jednotka obsahuje gen nrdA a gen nrdB.
9. Konstrukt DNA podle nároku 8, kde geny nrdA a nrdB jsou umístěny ve směru translace vzhledem ke genu nrdC.
10. Konstrukt DNA podle nároku 8, kde gen nrdC je umístěn proti směru translace vzhledem ke genu nróA a gen nrdA je proti směru translace vzhledem ke genu nrdB.
11. Konstrukt DNA podle nároku 6, který dále obsahuje regulační prvek.
12. Konstrukt DNA podle nároku 11, kde tento regulační prvek je zvolen ze skupiny zahrnující promotor, operátor, terminační sekvenci, iniciační sekvenci a vazebné místo ribosomu.
13. Konstrukt DNA podle nároku 12, kde promotorem je promotor lambda Pl nebo jeho derivát.
14. Konstrukt DNA podle nároku 12, kde terminační sekvencí je syntetický terminátor.
15. Konstrukt DNA podle nároku 7, kde gen nrdk je modifikovaný, takže ribonukieotidreduktáza kódovaná touto jednotkou je

- 38 méně citlivá na alosterickou inhibicí než ribonukleotidreduktáza kódovaná jednotkou obsahující nemodifikovaný gen nrdJ\.
16. Konstrukt DNA podle nároku 15, kde gen nrc/A je modifikován na vazebném místě dTTP.
17. Konstrukt DNA podle nároku 15, kde gen nrdA je modifikován tak, že kóduje záměnu Ala na lle v poloze 79 expresního produktu genu nrdA.
18. Konstrukt DNA podle nároku 7, kde geny nrdA, nrdB a nrdC jsou odvozeny z fága T.
19. Konstrukt DNA podle nároku 18, kde fágem T je T sudý fág.
20. Konstrukt DNA podle nároku 19, kde T sudým fágem je fág T4.
21. Konstrukt DNA podle některého z nároků 1 až 4, kde tento konstrukt dále obsahuje gen pro thymidylátsyntázu.
22. Konstrukt DNA podle nároku 21, kde genem pro thymidylátsyntázu je gen td.
23. Konstrukt DNA podle nároku 22, kde gen td je umístěn na stejném vektoru jako geny nrdA, nrdB a nrdC.

- 39
24. Konstrukt DNA podle nároku 22, kde gen td je umístěn na stejném operonu jako geny nrdA, nrdQ a nrdC.
25. Konstrukt DNA podle nároku 24, kde gen td je umístěn ve směru translace z hlediska čtecího rámce vzhledem ke genům nrdA, nrdB a nrdC.
26. Konstrukt DNA podle nároku 22, kde gen td je odvozen od fága T.
27. Konstrukt DNA podle nároku 22, kde gen td je odvozen od T sudého fága.
28. Konstrukt DNA podle nároku 22, kde gen td je odvozen od fága T4.
29. Konstrukt DNA podle nároku 2, který dále obsahuje gen pro uridinkinázu a/nebo gen pro dCTP deaminázu.
30. Konstrukt DNA podle nároku 29, kde tento konstrukt DNA obsahuje jak gen pro uridinkinázu, tak i gen pro dCTP deaminázu.
31. Konstrukt DNA podle některého z nároků 1, 3 nebo 4, kde genem pro uridinkinázu je gen udk.
32. Konstrukt DNA podle některého z nároků 1, 3 nebo 4, kde genem pro dCTP deaminázu je gen dcd.

- 40
33. Modifikovaná hostitelská buňka obsahující konstrukt DNA podle některého z předcházejících nároků.
34. Modifikovaná hostitelská buňka podle nároku 33, kde tato hostitelská buňka vykazuje reprimovanou nebo žádnou aktivitu uráčil DNA glykosylázy.
35. Modifikovaná hostitelská buňka podle nároku 34, kde jedna nebo více sekvencí DNA hostitelské buňky kódující aktivitu uráčil DNA glykosylázy byla modifikována pro kódování expresních produktů vykazujících reprimonou, nízkou nebo žádnou aktivitu uráčil DNA glykosylázy.
36. Modifikovaná hostitelská buňka podle nároku 35, kde sekvence DNA hostitelské buňky je gen ung.
37. Modifikovaná hostitelská buňka podle nároku 34, kde jedna nebo více sekvencí DNA hostitelské buňky kódující aktivitu uráčil DNA glykosylázy byla odstraněna.
38. Modifikovaná hostitelská buňka podle nároku 33, kde tato buňka je eukaryot nebo prokaryot.
39. Modifikovaná hostitelská buňka podle nároku 38, kde tato hostitelská buňka je zvolena ze skupiny E. coli, Salmonella, Pseudomonas, Bacillus a Saccharomyces.

-41
40. Modifikovaná hostitelská buňka obsahující konstrukt DNA, kde tento konstrukt obsahuje transkripční jednotku DNA, kde tato jednotka obsahuje gen pro ribonukleotidreduktázu a gen pro thioredoxin, kde tato ribonukleotidreduktáza vykazuje nižší citlivost k alosterické inhibici než ekvivalent reduktázy standardního typu, a kde tato hostitelská buňka dále obsahuje jeden nebo více z následujících znaků:

(a) transkripční jednotku umístěnou na tomto konstruktu DNA, která obsahuje gen pro thymidylátsyntázu heterologní vzhledem ke genu pro thymidylátsyntázu hostitelské buňky;

(b) transkripční jednotku umístěnou na tomto konstruktu DNA, která obsahuje gen pro uridinkinázu;

(c) transkripční jednotku umístěnou na tomto konstruktu DNA, která obsahuje gen pro dCTP deaminázu; a (d) reprimovanou nebo nepřítomnou aktivitu uráčil DNA glykosylázy.
41. Modifikovaná hostitelská buňka podle nároku 40, kde gen pro ribonukleotidreduktázu je modifikovaný na vazebném místě dTTP.
42. Modifikovaná hostitelská buňka podle nároku 41, kde genem pro ribonukleotidreduktázu je gen nrdA a modifikace je záměna Ala na Ile v poloze 79 v expresním produktu nrdA.
43. Modifikovaná hostitelská buňka podle nároku 38, kde konstrukt DNA obsahuje jak gen pro uridinkinázu, tak i gen pro dCTP deaminázu.

-42
44. Modifikovaná hostitelská buňka podle nároku 40, kde tato buňka obsahuje každý ze znaků uvedených v odstavcích (a) až (d).
45. Způsob výroby pyrimidinových deoxyribonukleosidů, vyznačující se tím, že se provádí kultivace hostitelské buňky podle některého z nároků 33 až 44.
46. Způsob podle nároku 45, vyznačující se tím, ž e deoxyribonukleosidem je thymidin.
47. Způsob výroby azidothymidinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle některého z nároků 33 až 34.
48. Kultivační médium, vyznačující se tím, že obsahuje hostitelskou buňku podle některého z nároků 33 až