KR20060010706A - Ｃｍｐ-ｎ-아세틸뉴라민산의 제조 방법 - Google Patents

Ｃｍｐ-ｎ-아세틸뉴라민산의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20060010706A
KR20060010706A KR1020057000945A KR20057000945A KR20060010706A KR 20060010706 A KR20060010706 A KR 20060010706A KR 1020057000945 A KR1020057000945 A KR 1020057000945A KR 20057000945 A KR20057000945 A KR 20057000945A KR 20060010706 A KR20060010706 A KR 20060010706A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
neuac
cmp
synthase
glcnac
dna
Prior art date
Application number
KR1020057000945A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100922085B1 (ko
Inventor
노구치도시타다
하마모토도모키
Original Assignee
야마사 쇼유 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2002208987A external-priority patent/JP3833584B2/ja
Application filed by 야마사 쇼유 가부시키가이샤 filed Critical 야마사 쇼유 가부시키가이샤
Publication of KR20060010706A publication Critical patent/KR20060010706A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100922085B1 publication Critical patent/KR100922085B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/305—Pyrimidine nucleotides

Abstract

본 발명은, N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), 피루브산 및 시티딘 5'-모노인산 (CMP) 을 함유하는 반응계에, 효모균체, N-아세틸글루코사민-6인산 2-에피머라아제 (GlcNAc-6P 2-에피머라아제), N-아세틸뉴라민산 리아제 (NeuAc 리아제) 및 CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제 (CMP-NeuAc 신타아제) 를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 CMP-N-아세틸뉴라민산 (CMP-NeuAc) 의 제조 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 및 시티딘 5'-모노인산 (CMP) 을 함유하는 반응계에, 효모균체, N-아세틸글루코사민-6인산 2-에피머라아제 (GlcNAc-6P 2-에피머라아제), N-아세틸뉴라민산 신타아제 (NeuAc 신타아제) 및 CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제 (CMP-NeuAc 신타아제) 를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는, CMP-N-아세틸뉴라민산 (CMP-NeuAc) 의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

ＣＭＰ-Ｎ-아세틸뉴라민산의 제조 방법{PROCESSES FOR PRODUCING CMP-N-ACETYLNEURAMINIC ACID}
본 발명은 당쇄 합성의 중요한 원료인 CMP-N-아세틸뉴라민산 (CMP-NeuAc) 의 개량된 제조 방법에 관한 것이다.
최근, 당쇄에 관한 구조 및 기능에 관한 연구가 급속하게 진행되어, 생리활성을 갖는 올리고당, 당 지질, 당 단백질 등의 의약품 또는 기능성 소재로서의 용도 개발이 주목받고 있다. 그 중에서도, 말단에 N-아세틸뉴라민산 (NeuAc) 을 함유하는 시알산함유 당쇄는, 세포접착이나 바이러스 감염시 수용체가 되는 등 중요한 기능을 갖는 당쇄이다.
시알산함유 당쇄는 일반적으로 시알산 전이효소의 촉매작용에 의해 합성된다. 시알산 전이효소는 CMP-N-아세틸뉴라민산 (CMP-NeuAc) 을 당공급체로 하여 당쇄 등의 수용체에 시알산을 전이하는 효소이다.
그러나, 당공급체로서 사용하는 CMP-NeuAc 는 매우 비싸고 또한 양적으로도 시약 수준의 적은 양으로밖에 공급되지 않는 것이 현실이다.
CMP-NeuAc 의 제조 방법으로는, 시티딘 5'-트리인산 (CTP) 과 NeuAc 를 기질로 하여 CMP-NeuAc 신타아제의 촉매에 의해 합성하는 방법 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 44, 59-67(1995)) 이 알려져 있는데, 그 원료가 되는 CTP 및 NeuAc 는 비싸기 때문에 그것을 직접 원료로 하여 합성된 CMP-NeuAc 도 비싼 시약이 될 수밖에 없다.
최근, 고이즈미 등에 의해 오로틴산에서 우리딘 5'-트리인산 (UTP) 으로 변환하는 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) 균체, UTP 에서 CTP 로 변환하는 반응을 촉매하는 CTP 합성효소를 생산하는 재조합 대장균 및 CMP-NeuAc 합성효소를 생산하는 재조합 대장균을 조합하고, 오로틴산과 NeuAc 를 원료로 하여 CMP-NeuAc 를 합성하는 방법이 개발되었다 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 257-261, (2000)). 그 방법은, 비싼 CTP 를 사용하지 않는 방법이기는 하지만, 복수 종의 균체를 조제하지 않으면 안되는 등 공정이 번잡한 동시에 그것을 실시하기 위한 대형의 설비를 준비해야만 하며, 또 여전히 비싼 NeuAc 를 원료로 하고 있는 점에서도 실용적인 방법이라고는 하기는 어려웠다.
한편, NeuAc 의 제조 방법에 관해서는, 시알산의 다량체인 콜로민산을 미생물로부터 회수하고 이것을 화학분해하여 회수하는 방법이 알려져 있지만, 최근에 와서 효소를 이용한 방법이 개발되었다.
효소를 이용한 방법으로는, (1) NeuAc 리아제 또는 NeuAc 신타아제를 사용하여 N-아세틸만노사민 (ManNAc) 에서 제조하는 방법 (J. Am. Chem. Soc., 110, 6481(1988), J. Am. Chem. Soc., 110, 7159 (1988), 일본 공개특허공보 평10-4961호), (2) 알칼리 조건하에서 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 을 N-아세틸만노사민 (ManNAc) 으로 변환시키고, 여기에 NeuAc 리아제 또는 NeuAc 신타아제를 작용시켜 NeuAc 를 제조하는 방법 (일본 공개특허공보 평5-211884호, Biotechnology And Bioengineering, Vol.66, No.2 (1999), Enzyme Microb. Technol., Vol. 20(1997)), (3) GlcNAc 에서 ManNAc 로의 변환을 촉매하는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 2-에피머라아제와 NeuAc 리아제 또는 NeuAc 신타아제를 사용하여 GlcNAc 에서 제조하는 방법 (WO95/26399, 일본 공개특허공보 평3-180190호, 일본 공개특허공보 2001-136982호) 이 보고되어 있다.
그러나, (1) 의 방법은 원료인 ManNAc 가 비싸고, (2) 의 방법은 저렴한 GlcNAc 을 원료로 하는 방법이기는 하지만, GlcNAc 과 ManNAc 의 혼합물에서 ManNAc 를 정제하는 공정이 번잡하다는 문제가 있었다. 또, 하기에 나타내는 바와 같이 (3) 의 방법에서 사용하는 GlcNAc2-에피머라아제는 ATP 가 필요하기 때문에, 비싼 ATP 를 첨가하거나 또는 미생물을 사용하여 ATP 의 전구체인 아데닌에서 ATP 를 생성시킬 필요가 있어, 이 방법도 만족할 만한 방법이라 하기는 어려웠다.
<(3) 의 방법>
ATP 또는 그 전구체 피루브산 또는 포스포에놀피루브산
↓ ↓
GlcNAc → ManNAc → NeuAc
(a) (b)
(a) : GlcNAc2-에피머라아제
(b) : NeuAc 리아제 또는 NeuAc 신타아제
본 발명자들은 GlcNAc 를 기질로 한 대장균의 생체내 효소에 의한 NeuAc 합성을 검토한 바, NeuAc 는 거의 합성되지 않았지만 GlcNAc 가 GlcNAc 6-인산(GlcNAc-6P) 으로 변환된 점에서, 아래에 나타내는 경로에 의한 GlcNAc 로부터의 NeuAc 합성계의 구축을 시도하였다.
그 결과, GlcNAc-6P 2-에피머라아제 (EC5.1.3.9) 및 NeuAc 리아제 또는 NeuAc 신타아제 활성을 증강시키면 NeuAc 를 고수율로 생성할 수 있는 것과, 그 합성계에는 비싼 ATP 를 필요로 하지 않는다는 것을 알아내었다.
(c) ①
GlcNAc → GlcNAc 6-인산 → ManNAc 6-인산
(c) ② 또는 ③
→ ManNAc → NeuAc
(d)
(c) : 생체 반응
(d) : 피루브산 또는 포스포에놀피루브산
① : GlcNAc-6P 2-에피머라아제
② : NeuAc 리아제
③ : NeuAc 신타아제
다음에, CMP-NeuAc 합성 반응을 하기 위한 CTP 합성계에 대하여, 저렴한 CMP 를 원료로 한 미생물에 의한 CTP 로의 변환계를 상기 NeuAc 합성계와 조합하기 위 해 여러 가지 미생물을 사용하여 검토하였다. 그렇게 하면, 대장균 등의 효모 이외의 미생물을 사용하였을 때에는 CMP-NeuAc 가 조금 밖에 합성되지 않았던 데 반하여, 효모균체를 사용하면 고수율로 CMP-NeuAc 를 합성할 수 있다는 것을 알아내었다. 특히, NeuAc 신타아제 반응에 필요한 포스포에놀피루브산 (PEP) 은 효모균체 내의 것을 이용할 수 있어 반응계에 새롭게 첨가할 필요가 없다는 새로운 장점도 확인하여 본 발명을 완성시켰다.
즉 본 발명은, N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), 피루브산 및 시티딘 5'-모노인산 (CMP) 을 함유하는 반응계에 효모균체, N-아세틸글루코사민-6인산 2-에피머라아제 (GlcNAc-6P 2-에피머라아제), N-아세틸뉴라민산 리아제 (NeuAc 리아제) 및 CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제 (CMP-NeuAc 신타아제) 를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는, CMP-N-아세틸뉴라민산 (CMP-NeuAc) 의 제조 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은, N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 및 시티딘 5'-모노인산 (CMP) 을 함유하는 반응계에 효모균체, N-아세틸글루코사민-6인산 2-에피머라아제 (GlcNAc-6P 2-에피머라아제), N-아세틸뉴라민산 신타아제 (NeuAc 신타아제) 및 CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제 (CMP-NeuAc 신타아제) 를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는, CMP-N-아세틸뉴라민산 (CMP-NeuAc) 의 제조 방법에 관한 것이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 CMP-NeuAc 의 합성 반응 경로를 모식적으로 나타내면, 이하의 (A) NeuAc 리아제를 사용한 방법과 (B) NeuAc 신타아제를 사용한 방법이다. 또, (B) 의 반응계에 필수적인 포스포에놀피루브산 (PEP) 은 배지 중의 글루코오스로부터 효모 및 대장균의 생체 (대사) 반응에 의해 합성, 공급되기 때문에, 반응계에 포스포에놀피루브산 (PEP) 을 첨가할 필요는 없다.
(A) NeuAc 리아제를 사용한 방법
Figure 112005002765919-PCT00001
(B) NeuAc 신타아제를 사용한 방법
Figure 112005002765919-PCT00002
상기 모식도 (A) 및 (B) 에서의 기호는 이하의 것을 의미한다.
① : GlcNAc-6P 2-에피머라아제
② : NeuAc 리아제
③ : CMP-NeuAc 신타아제
④ : NeuAc 신타아제
(1) 효소 등의 조제
상기 (A) 및 (B) 의 반응계에 첨가하는 N-아세틸글루코사민-6인산 2-에피머라아제 (GlcNAc-6P 2-에피머라아제) 란, 상기 ① 의 GlcNAc 6-인산에서 ManNAc 6-인산으로의 변환 반응을 촉매하는 활성을 갖는 것을 의미하고, 상기 (A) 의 반응계에 첨가하는 N-아세틸뉴라민산 리아제 (NeuAc 리아제) 란, 상기 ② 의 ManNAc 와 피루브산을 기질로 하여 NeuAc 를 합성하는 반응을 촉매하는 활성을 갖는 것을 의미하고, 상기 (B) 의 반응계에 첨가하는 N-아세틸뉴라민산 신타아제 (NeuAc 신타아제) 란, 상기 ④ 의 ManNAc 와 포스포에놀피루브산 (PEP) 을 기질로 하여 NeuAc 를 합성하는 반응을 촉매하는 활성을 갖는 것을 의미하고, 상기 (A) 및 (B) 의 반응계에 첨가하는 CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제 (CMP-NeuAc 신타아제) 란, 상기 ③ 의 NeuAc 와 CTP 를 기질로 하여 CMP-NeuAc 를 합성하는 반응을 촉매하는 활성을 갖는 것을 의미한다.
이들 효소활성을 갖는 것으로는, 해당 활성을 갖는 세포 (형질 전환체를 포함함) 또는 그 처리물을 예시할 수 있고, 조제의 간편성 등의 관점에서 미생물에서 유래된 것을 사용하는 것이 좋다. 미생물에서 유래된 GlcNAc-6P 2-에피머라아제, N-아세틸뉴라민산 리아제, N-아세틸뉴라민산 신타아제 및 CMP-NeuAc 신타아제는 공지된 효소이며, 통상적인 방법에 의해 조제할 수 있다.
또, 해당 효소활성을 증강시키기 위한 수단으로서, 그 효소유전자군 (J. Bacteriol., 181, 47-54, 1999, J. Bacteriol., 181, 4526-4532, 1999, Nucleic Acids. Res., 13, 8843-8852, 1985, Agric. Biol. Chem., 50, 2155-2158, 1986, FEMS Microbiol. Lett., 75, 161-166, 1992, J.Biol. Chem., 271, 15373-15380, 1996, J.Biol. Chem., 264, 14769-14774, 1989, J.Bacteriol., 177, 312-319, 1995, Mol. Microbiol., 35, 1120-1134, 2000) 을 클론화하고, 균체 내에서 이것을 대량 발현시킨 미생물을 사용하는, 이른바 재조합 DNA 수법을 사용하는 것이 바람직하다.
또, 본 발명에서는 2개 이상의 유전자를 공(共)발현시켜 얻어지는 균체 또는 그 처리물을 사용할 수도 있으며, 특히 GlcNAc-6P 2-에피머라아제와 N-아세틸뉴라민산 리아제 각각의 효소활성을 증강시킨 형질 전환체 또는 GlcNAc-6P 2-에피머라아제와 N-아세틸뉴라민산 신타아제 각각의 효소활성을 증강시킨 형질 전환체의 사용이 바람직하지만, 이것에 한정되지 않는다.
유전자의 클로닝, 클론화한 DNA 단편을 사용한 발현 벡터의 조제, 발현 벡터를 사용한 목적으로 하는 효소활성을 갖는 효소단백질의 조제 등은 분자생물학의 분야에 속하는 기술자에게는 주지된 기술이고, 구체적으로는, 예를 들어 「Molecular Cloning」(Maniatis 등 편, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York(1982)) 에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
예를 들어, 보고되어 있는 염기서열을 기초로 하여 프로브를 합성하고, 미생물의 염색체 DNA 로부터 목적으로 하는 효소활성을 갖는 효소단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 클로닝하면 된다. 클론화에 사용하는 숙주는 특별 히 한정되지 않지만, 조작성 및 간편성으로부터 대장균으로 하는 것이 바람직하다.
클론화한 유전자의 고발현계를 구축하기 위해서는, 예를 들어 맥삼-길버트법 (Methods in Enzymology, 65, 499(1980)) 또는 다이디옥시 체인 터미네이터법 (Methods in Enzymology, 101, 20(1983)) 등을 응용하여 클론화한 DNA 단편의 염기서열을 해석하여 그 유전자의 코딩영역을 특정하고, 숙주 미생물에 따라 그 유전자가 균체 속에서 발현할 수 있게 발현제어 시그널 (전사개시 및 번역개시 시그널) 을 그 상류에 연결한 재조합 발현 벡터를 제작한다.
벡터로는, 여러 가지 플라스미드 벡터, 파지 벡터 등을 사용할 수 있지만, 대장균 균체 내에서 복제가능하고 적당한 약제 내성 마커와 특정한 제한효소 절단 부위를 갖고, 균체 내의 카피수가 많은 플라스미드 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 pBR322 (Gene, 2, 95(1975)), pUC18, pUC19 (Gene, 33, 103(1985)) 등을 들 수 있다.
제작한 재조합 벡터를 사용하여 대장균을 형질 전환한다. 숙주가 되는 대장균으로는, 예를 들어 재조합 DNA 실험에 사용되는 K12주, C600균, JM1O5균, JM1O9 균 (Gene, 33, 103-119(1985)) 등을 사용할 수 있다. 피루브산의 NeuAc 합성 이외에서의 대사를 줄이기 위하여 피루브산 대사에 관한 lip 유전자 변이 등이 도입된 대장균 (예를 들어 W1485lip2 (ATCC25645))을 숙주로서 사용할 수도 있다.
대장균을 형질 전환하는 방법은 이미 많은 방법이 보고되어 있고, 저온하, 염화칼슘 처리하여 균체 내에 플라스미드를 도입하는 방법 (J. Mol. Biol., 53, 159(1970)) 등에 의해 대장균을 형질 전환할 수 있다.
얻어진 형질 전환체는, 해당 미생물이 증식할 수 있는 배지 속에서 증식시키고, 다시 클론화한 목적으로 하는 효소활성을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 균체 내에 해당 효소단백질이 대량으로 축적될 때까지 배양한다. 형질 전환체의 배양은 탄소원, 질소원 등의 해당 미생물의 증식에 필요한 영양원을 함유하는 배지를 사용하여 통상적인 방법에 따라 실시하면 된다. 예를 들어, 배지로서 부용(bouillon) 배지, LB 배지 (1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 식염) 또는 2×YT 배지 (1.6% 트립톤, 1% 효모 추출물, 0.5% 식염) 등의 대장균 배양에 상용되고 있는 배지를 사용하여 30∼50℃ 의 배양온도로 10∼50시간 정도 필요에 따라 통기교반하면서 배양할 수 있다. 또, 벡터로서 플라스미드를 사용한 경우에는, 배양 중 플라스미드의 탈락을 막기 위해 적당한 항생 물질 (플라스미드의 약제 내성 마커에 따라 엠피실린, 카나마이신 등) 의 약제를 적당량 배양액에 첨가하여 배양한다.
목적으로 하는 효소활성을 갖는 균체로는, 상기 방법으로 얻어지는 배양액에서 원심분리, 막분리 등의 고액(固液) 분리 수단으로 회수한 것을 예시할 수 있다. 또, 회수한 균체를 기계적 파괴 (워링 블렌더, 프렌치프레스, 호모게나이저, 모르타르 등에 의한), 동결 융해, 자기 소화, 건조 (동결 건조, 바람 건조 등에 의한), 효소 처리 (라이소자임 등에 의한), 초음파 처리, 화학 처리 (산, 알칼리 처리 등에 의한) 등의 일반적인 처리법에 따라 처리하여 얻어지는 처리물, 또는 그 균체 처리물에서 목적으로 하는 효소활성을 갖는 분획을 통상적인 효소의 정제수단 (염석 처리, 등전점 침전 처리, 유기용매 침전 처리, 투석 처리, 각종 크로마토그래피 처리 등) 을 실시하여 얻어지는 조효소 또는 정제효소도 균체 처리물로서 이용할 수 있다.
다음에 CMP 에서 CTP 로의 변환에 사용하는 효모로는, 시판되는 빵 효모 또는 와인 효모이면 되고, 균체 제조의 과정을 생략할 수 있다는 점에서 매우 유리하다. 또한, 효모 생균체, 효모 건조균체 어떤 형태도 이용할 수 있지만, 반응수율, 취급의 용이성 등의 점에서는 건조 효모균체를 사용하는 것이 바람직하다.
(2) CMP-NeuAc 의 합성
CMP-NeuAc 합성 반응에 사용하는 GlcNAc, 피루브산 및 CMP 은 시판되고 있으며, 이 시판품을 사용할 수 있다. 사용농도로는, 예를 들어 각각 1∼5000mM, 바람직하게는 10∼1000mM 의 범위에서 적절히 설정할 수 있다.
(NeuAc 리아제를 사용한 방법)
CMP-NeuAc 의 합성 반응은, GlcNAc, CMP 및 피루브산을 함유하는 반응계에 GlcNAc-6P 2-에피머라아제, NeuAc 리아제 및 CMP-NeuAc 신타아제를 반응액 1㎖당 각각 0.2㎎ 이상, 바람직하게는 2∼100㎎, 건조 효모를 1∼20% (w/v) 첨가하고 50℃ 이하, 바람직하게는 15∼40℃ 에서 1∼150시간 정도 필요에 따라 교반하면서 반응시켜 실시할 수 있다.
또, 상기 반응에서는 GlcNAc 및 피루브산을 함유하는 반응계에 GlcNAc-6P 2-에피머라아제 및 NeuAc 리아제를 첨가하여 50℃ 이하, 바람직하게는 15∼40℃ 에서 1∼50시간 정도 반응시켜 NeuAc 를 합성하고, 이어서 CMP, 효모균체 및 CMP-NeuAc 신타아제를 첨가하여 5∼50시간 정도 반응시켜 CMP-NeuAc 를 합성하는 2단계로 반 응시킴으로써 CMP-NeuAc 의 합성수율을 향상시킬 수 있다. 또, CMP 는 미리 NeuAc 합성시에 반응계에 첨가해 두어도 상관없다.
(NeuAc 신타아제를 사용한 방법)
CMP-NeuAc 의 합성 반응은, GlcNAc 및 CMP 를 함유하는 반응계에 GlcNAc-6P 2-에피머라아제, NeuAc 신타아제 및 CMP-NeuAc 신타아제를 반응액 1㎖당 각각 0.2㎎ 이상, 바람직하게는 2∼100㎎, 건조 효모를 1∼20% (w/v) 첨가하여 50℃ 이하, 바람직하게는 15∼40℃ 에서 1∼150시간 정도 필요에 따라 교반하면서 반응시킴으로써 실시할 수 있다.
상기 어떤 CMP-NeuAc 합성계에서도 필요에 따라 무기인산, 마그네슘 및 에너지원을 첨가하는 것이 바람직하다.
무기인산으로는 인산칼륨 등을 그대로 사용할 수도 있지만, 바람직하게는 인산 완충액의 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 사용농도는, 예를 들어 1∼1000mM, 바람직하게는 10∼400mM 의 범위에서 적절히 설정할 수 있다. 또한, 인산 완충액의 형식으로 사용하는 경우, 완충액의 pH 는 5∼10 의 범위에서 적절히 설정하면 된다.
마그네슘으로는, 황산마그네슘, 질산마그네슘, 염화마그네슘 등의 무기산의 마그네슘염, 시트르산마그네슘 등의 유기산의 마그네슘염을 사용할 수 있고, 그 사용농도로는 1∼1000mM 의 범위에서 적절히 설정할 수 있다.
에너지원으로는, 글루코오스, 프룩토오스, 자당 등의 당류, 아세트산, 시트르산 등의 유기산을 사용할 수 있고, 그 사용농도로는 1∼5000mM, 바람직하게는 10 ∼1000mM 의 범위에서 적절히 설정할 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 CMP-NeuAc 는 당뉴클레오티드의 통상적인 단리 정제 수단 (이온교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 염석, 친화 크로마토그래피 등) 을 사용하여 단리 정제할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 나타내어 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들에 조금도 한정되지 않는다. 또, 실시예에서의 DNA 의 조제, 제한효소에 의한 절단, T4 DNA 리가아제에 의한 DNA 연결 및 대장균의 형질 전환법은 모두 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」 (Sambrook 등 편, Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1989)) 에 따라 실시하였다. 또, 제한효소, AmpliTaq DNA 폴리머라아제, T4 DNA 리가아제는 다카라바이오(주) 에서 입수하였다.
그리고, 반응액 중의 CMP-NeuAc 의 정량은 HPLC 법에 의해 실시하였다. 구체적으로는, 분리에는 YMC 사 제조 ODS-HS302 칼럼을 사용하고, 용출액으로서 1mM 테트라부틸암모늄황산염, 50mM 아세트산마그네슘 용액을 사용하였다. 또, NeuAc 등의 당의 정량에는 HPAE-PAD 법에 의한 HPLC 에 의해 실시하였다. 구체적으로는, 분리, 검출에는 다이오넥스사 제조 CarboPac PA1 칼럼, ED40 을 사용하고, 용출액으로서 A 액 (0.1N NaOH) 과 B 액(0.1N NaOH, 0.5M 아세트산나트륨) 을 사용하여, A 액-B 액의 그래디언트에 의해 실시하였다.
(실시예 1)
(1) N-아세틸뉴라민산 리아제를 코딩하는 nanA 유전자의 클로닝
헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) (H.influenzae) Rd 주의 염색체 DNA (ATCC51907D) 를 주형으로 하여, 이하에 나타내는 2 종류의 프라이머 DNA 를 통상적인 방법에 따라 합성하고, PCR 법에 의해 H.influenzae 의 N-아세틸뉴라민산 리아제 (nanA) 유전자를 증폭하였다.
프라이머 (A) : 5'-CACCATGGCGAAGATATTGCCGCTCAAACTA-3'
(서열번호 1)
프라이머 (B) : 5'-CCGAATTCATTTATGACAAAAATTTCGCTTTCAAG-3'
(서열번호 2)
PCR 에 의한 nanA 유전자의 증폭은, 반응액 100㎕ (50mM 염화칼륨, 10mM 트리스염산 (pH8.3), 1.5mM 염화마그네슘, 0.001% 젤라틴, 주형 DNA 0.1㎍, 프라이머 DNA (A), (B) 각각 0.2μM, AmpliTaq DNA 폴리머라아제 2.5유닛) 를 Perkin-Elmer Cetus Instrument 사 제조 DNA Thermal Cycler 를 사용하여 열변성 (94℃, 1분), 어닐링 (55℃, 1.5분), 폴리머라이제이션 (72℃, 3분) 의 단계를 25회 반복함으로써 실시하였다.
유전자 증폭후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1：1) 혼합액으로 처리하고 수용성 분획에 2배 용량의 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시켰다. 침전 회수한 DNA 를 문헌 (Molecular Cloning, 상기 서술) 의 방법에 따라 아가로스겔 전기영동에 의해 분리하여, 1.2kb 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 그 DNA 를 제한효소 NcoI 및 EcoRI 로 절단하고, 마찬가지로 제한효소 NcoI 및 EcoRI 로 소화한 플라스 미드 pTrc99A (Pharmacia Biotech.사에서 입수) 와 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결하였다. 연결반응액을 사용하여 대장균 JM109 주 (ATCC53323) 를 형질 전환하여, 얻어진 엠피실린 내성 형질 전환체로부터 플라스미드 pTrcnanA 를 단리하였다. pTrcnanA 는 pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 NcoI-EcoRI 절단 부위에 H. influenzae 의 nanA 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.
(2) GlcNAc-6P 2-에피머라아제를 코딩하는 nanE 유전자의 클로닝
H. influenzae Rd 주의 염색체 DNA 를 주형으로 하여, 이하에 나타내는 2 종류의 프라이머 DNA 를 통상적인 방법에 따라 합성하고, PCR 법에 의해 H. influenzae 의 GlcNAc-6P 2-에피머라아제 (nanE) 유전자를 증폭하였다.
프라이머 (C) : 5'-GGTCTAGATTTAAATGAGGGGTGTTATATGT-3'
(서열번호 3)
프라이머 (D) : 5'-TCGTCGACTTATCTTGCAGATTTCACTGAATTAGCAAACCA-3'
(서열번호 4)
PCR 에 의한 nanE 유전자의 증폭은, 반응액 100㎕ (50mM 염화칼륨, 10mM 트리스염산 (pH8.3), 1.5mM 염화마그네슘, 0.001% 젤라틴, 주형 DNA 0.1㎍, 프라이머 DNA (C), (D) 각각 0.2μM, AmpliTaq DNA 폴리머라아제 2.5유닛) 를 Perkin-Elmer Cetus Instrument 사 제조 DNA Thermal Cycler 를 사용하여 열변성 (94℃, 1분), 어닐링 (55℃, 1.5분), 폴리머라이제이션 (72℃, 3분) 의 단계를 25회 반복함으로써 실시하였다.
유전자 증폭후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1：1) 혼합액으로 처리하고 수용 성 분획에 2배 용량의 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시켰다. 침전 회수한 DNA 를 문헌의 방법 (Molecular Cloning, 상기 서술) 에 따라 아가로스겔 전기영동에 의해 분리하여, 720b 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 그 DNA 를 제한효소 XbaI 및 SalI 로 절단하고, 마찬가지로 제한효소 XbaI 및 SalI 로 소화한 플라스미드 pTrc99A 와 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결하였다. 연결반응액을 사용하여 대장균 JM109 주를 형질 전환하여, 얻어진 엠피실린 내성 형질 전환체로부터 플라스미드 pTrc-nanE 를 단리하였다. pTrc-nanE 는 pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 XbaI-SalI 절단 부위에 H. influenzae 의 nanE 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.
(3) nanA, nanE 유전자 공발현 플라스미드의 구축
상기 (1) 에서 얻어진 pTrcnanA 플라스미드를 제한효소 NcoI, EcoRI 로 절단하고, nanA 유전자를 포함하는 NcoI-EcoRI 단편을 아가로스겔 전기영동을 사용하여 회수하였다. 이것을 동일하게 NcoI, EcoRI 로 소화한 상기 (2) 에서 얻어진 pTrc-nanE 플라스미드와 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결하였다. 이 연결반응액을 사용하여 대장균 JM109 주를 형질 전환하여, 얻어진 엠피실린 내성 형질 전환체에서 플라스미드 pTrcAE 를 단리하였다. pTrcAE 는 pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 NcoI-SalI 절단 부위에 H. influenzae 의 nanA, nanE 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.
(4) NeuAc 의 합성
대장균 W1485lip2 (ATCC25645) 에 상기 (3) 에서 구축한 플라스미드 pTrcAE 를 유지시키고, 이것을 100㎍/㎖ 의 엠피실린을 함유하는 2×YT 배지 500㎖ 에 식균하여 37℃ 에서 진탕배양하였다. 균체수가 1×108개/㎖ 에 이른 시점에서 배양액에 최종농도 0.2mM 이 되도록 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 를 첨가하고, 다시 37℃ 에서 26시간 진탕배양을 계속하였다. 배양 종료후, 원심분리 (9,000×g, 10분) 에 의해 25㎖ 배양액분의 균체 50㎎ 을 회수하고, 여기에 100mM GlcNAc, 20mM 염화마그네슘, 50mM 글루코오스, 300mM 피루브산나트륨, 0.5% (v/v) 자일렌을 함유하는 200mM 인산칼륨 완충액 (pH8.0) 5㎖ 를 첨가하고 28℃ 에서 교반하면서 반응하였다. 14, 24시간 후에 110㎎ 의 피루브산나트륨을 첨가하고, 48시간에 반응액을 100℃, 5분간 열처리함으로써 반응을 정지시켰다. 얻어진 반응액을 당 분석용 HPLC (HPAE-PAD, 다이오넥스사) 로 분석한 바, 43.7mM 의 NeuAc 의 생성이 확인되었다.
또, 대조균 (pTrc99A 플라스미드를 유지하는 대장균 W1485lip2) 을 사용하여 동일한 반응을 실시하였지만, NeuAc 의 생성을 검출할 수는 없었다 (0.5mM 이하의 생성).
(5) CMP-NeuAc 신타아제를 코딩하는 neuA 유전자의 클로닝
H. influenzae Rd 주의 염색체 DNA 를 주형으로 하여, 이하에 나타내는 2 종류의 프라이머 DNA 를 통상적인 방법에 따라 합성하고, PCR 법에 의해 H. influenzae 의 CMP-NeuAc 신타아제 (neuA) 유전자를 증폭하였다.
프라이머 (E) : 5'-TGCCATGGTGAAAATAATAATGACAAGAA-3'
(서열번호 5)
프라이머 (F) : 5'-AACTGCAGTGCAGATCAAAAGTGCGGCC-3'
(서열번호 6)
PCR 에 의한 neuA 유전자의 증폭은, 반응액 100㎕ (50mM 염화칼륨, 10mM 트리스염산 (pH8.3), 1.5mM 염화마그네슘, 0.001% 젤라틴, 주형 DNA 0.1㎍, 프라이머 DNA (E), (F) 각각 0.2μM, AmpliTaq DNA 폴리머라아제 2.5유닛) 를 Perkin-Elmer Cetus Instrument 사 제조 DNA Thermal Cycler 를 사용하여 열변성 (94℃, 1분), 어닐링 (55℃, 1.5분), 폴리머라이제이션 (72℃, 3분) 의 단계를 25회 반복함으로써 실시하였다.
유전자 증폭후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1：1) 혼합액으로 처리하고 수용성 분획에 2배 용량의 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시켰다. 침전 회수한 DNA 를 문헌의 방법 (Molecular Cloning, 상기 서술) 에 따라 아가로스겔 전기영동에 의해 분리하여, 720b 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 그 DNA 를 제한효소 NcoI 및 PstI 로 절단하고, 마찬가지로 제한효소 NcoI 및 PstI 로 소화한 플라스미드 pTrc99A 와 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결하였다. 연결반응액을 사용하여 대장균 JM109 주를 형질 전환하여, 얻어진 엠피실린 내성 형질 전환체로부터 플라스미드 pTrcsiaBNP 를 단리하였다. pTrcsiaBNP 는 pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 NcoI-PstI 절단 부위에 H. influenzae 의 neuA 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.
(6) CMP-NeuAc 신타아제의 조제
플라스미드 pTrcsiaBNP 를 유지하는 대장균 JM109 균을 100㎍/㎖ 의 엠피실린을 함유하는 2×YT 배지 100㎖ 에 식균하여 37℃ 에서 진탕배양하였다. 4×108개/㎖ 에 이른 시점에서 배양액에 최종농도 0.25mM 이 되도록 IPTG 를 첨가하고, 다시 37℃ 에서 6시간 진탕배양을 계속하였다. 배양 종료후, 원심분리 (9,000×g, 10분) 에 의해 균체를 회수하고, 5㎖ 의 완충액 (100mM 트리스염산 (pH7.8), 10mM MgCl2) 에 현탁하였다. 초음파 처리하여 균체를 파쇄하고, 다시 원심 분리 (20,000×g, 10분) 에 의해 균체 잔류를 제거하였다.
이렇게 하여 얻어진 상청 분획을 효소액으로 하여, 이 효소액에서의 CMP-NeuAc 신타아제 활성을 측정한 결과를 대조균 (pTrc99A 를 유지하는 대장균 K-12 주 JM109) 와 함께 하기 표 1 에 나타낸다. 또, 본 발명에서의 CMP-NeuAc 신타아제 활성의 단위 (유닛) 는, 이하에 나타내는 방법으로 5'-CMP 와 N-아세틸뉴라민산으로부터의 CMP-NeuAc 의 합성 활성을 측정, 산출한 것이다.
(CMP-NeuAc 신타아제 활성의 측정과 단위의 산출법)
50mM 트리스염산 완충액 (pH8.0), 20mM 염화마그네슘, 5mM CTP 및 10mM N-아세틸뉴라민산에 CMP-NeuAc 신타아제를 첨가하여 37℃ 에서 5분 반응시킨다. 또, CMP-NeuAc 신타아제 대신에 pTrc99A 를 유지하는 대장균 JM109 주의 균체 파쇄액을 사용하여 동일하게 반응시켜 이것을 컨트롤로 하였다.
반응액에 2배량의 70% 에탄올을 첨가하여 반응을 정지시키고, 이것을 희석한 후 HPLC 에 의해 분석하였다. 분리에는 YMC 사 제조 HS-302칼럼을 사용하고, 용출액으로서 50mM 아세트산마그네슘과 1mM 테트라부틸암모늄 수용액의 혼합액을 사용하였다. HPLC 분석결과로부터 반응액 중의 CMP-NeuAc 양을 산출하고, 37℃ 에서 1분간에 1μM 의 CMP-NeuAc 를 합성하는 활성을 1단위 (유닛) 로 하여 CMP-NeuAc 신타아제 활성을 산출하였다.
균/플라스미드 CMP-NeuAc 신타아제 활성 (유닛/㎎ protein)
JM109/pTrc99A <0.01
JM109/pTrcsiaBNP 2.45
(7) CMP-NeuAc 의 합성
대장균 K-12 주 ME8417 (FERM BP-6847 : 평성 11년 8월 18일 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 (일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 주오 다이 6 (우편번호 305-8566)) 에 상기 (3) 으로 구축한 플라스미드 pTrcAE 를 유지시키고, 이것을 100㎍/㎖ 의 엠피실린을 함유하는 2×YT 배지 500㎖ 에 식균하여 37℃ 에서 진탕배양하였다. 균체수가 4×108개/㎖ 에 이른 시점에서 배양액에 최종농도 0.2mM 이 되도록 IPTG 를 첨가하고, 다시 37℃ 에서 8.5시간 진탕배양을 계속하였다. 배양 종료후, 원심분리 (9,000×g, 10분) 에 의해 25㎖ 배양액분의 균체 50㎎ 을 회수하고, 여기에 50mM CMP, 100mM GlcNAc, 20mM 염화마그네슘, 50mM 글루코오스, 250mM 피루브산나트륨, 0.5% (v/v) 자일렌을 함유하는 200mM 인산칼륨 완충액 (pH 8.0) 5㎖ 를 첨가하고 28℃ 에서 교반하면서 반응하였다.
반응개시 24시간 후에 건조 빵 효모 (오리엔탈효모사 제조) 250㎎, 상기 (6) 에서 조제한 CMP-NeuAc 신타아제 (3.4유닛/㎖ 반응액) 및 1M 염화마그네슘 용액 100㎕ 를 첨가하여 합계 62시간 반응시켰다. 또, 반응개시 14시간 후에 110㎎ 의 피루브산나트륨을, 24, 38시간 후에 110㎎ 피루브산나트륨, 180㎎ 글루코오스를, 48시간 후에 55㎎ 피루브산나트륨, 180㎎ 글루코오스를 각각 첨가하였다.
반응액 상청을 HPLC 에 의해 분석하였더니, 21.4mM 의 CMP-NeuAc 가 생성되는 것이 확인되었다.
(비교예 1)
(1) CMP 키나아제를 코딩하는 cmk 유전자의 클로닝
대장균 JM109 주의 염색체 DNA 를 사이토와 미우라의 방법 (Biochim. Biopys. Acta., 72, 619(1963)) 으로 조제한 염색체 DNA 를 주형으로 하여, 이하에 나타내는 2 종류의 프라이머 DNA 를 통상적인 방법에 따라서 합성하고, PCR 법에 의해 대장균의 CMP 키나아제 (cmk) 유전자를 증폭하였다.
프라이머 (G) : 5'-TTGAATTCTAAGGAGATAAAGATGACGGCAATT-3'
(서열번호 7)
프라이머 (H) : 5'-TTGAGCTCTGCAAATTCGGTCGCTTATGCG-3'
(서열번호 8)
PCR 에 의한 cmk 유전자의 증폭은, 반응액 100㎕ (50mM 염화칼륨, 10mM 트리스염산 (pH8.3), 1.5mM 염화마그네슘, 0.001% 젤라틴, 주형 DNA 0.1㎍, 프라이머 DNA (G), (H) 각각 0.2μM, AmpliTaq DNA 폴리머라아제 2.5유닛) 를 Perkin-Elmer Cetus Instrument 사 제조 DNA Thermal Cycler 를 사용하여 열변성 (94℃, 1분), 어닐링 (55℃, 1.5분), 폴리머라이제이션 (72℃, 3분) 의 단계를 25회 반복함으로써 실시하였다.
유전자 증폭후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1：1) 혼합액으로 처리하고 수용성 분획에 2배 용량의 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시켰다. 침전 회수한 DNA 를 문헌의 방법 (Molecular Cloning, 상기 서술) 에 따라 아가로스겔 전기영동에 의해 분리하여, 720kb 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 그 DNA 를 제한효소 EcoRI 및 SacI 로 절단하고, 마찬가지로 제한효소 EcoRI 및 SacI 로 소화한 플라스미드 pTrc99A 와 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결하였다. 연결반응액을 사용하여 대장균 JM109 주를 형질 전환하여, 얻어진 엠피실린 내성 형질 전환체로부터 플라스미드 pTrcCMKAB 를 단리하였다. pTrcCMKAB 는 pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 EcoRI-SacI 절단 부위에 대장균의 cmk 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.
(2) cmk, neuA 유전자 공발현 플라스미드의 구축
실시예 1 에서 얻어진 pTrcsiaBNP 플라스미드를 제한효소 NcoI, EcoRI 로 절단하고, neuA 유전자를 포함하는 NcoI-EcoRI 단편을 아가로스겔 전기영동을 사용하여 회수하였다. 이것을 동일하게 NcoI, EcoRI 로 소화한 상기 비교예 (1) 의 pTrcCMKAB 플라스미드와 T4 리가아제를 사용하여 연결하였다. 이 연결 반응액을 사용하여 대장균 JM109 주를 형질 전환하여, 얻어진 엠피실린 내성 형질 전환체로부터 플라스미드 pTrcSBCK 를 단리하였다. pTrcSBCK 는 pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 NcoI-SacI 절단 부위에 H. inf1uenzae 의 neuA 유전자 및 대장균의 cmk 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.
(3) CMP-NeuAc의 합성
실시예 1 에서 조제한 대장균 ME8417/pTrcAE 의 25㎖ 배양분의 집균체 50㎎ 에, 100mM GlcNAc, 20mM 염화마그네슘, 50mM 글루코오스, 250mM 피루브산나트륨, 0.5% (v/v) 자일렌을 함유하는 200mM 인산칼륨 완충액 (pH8.0) 2.5㎖ 를 첨가하고 28℃ 에서 교반하면서 24시간 반응하였다.
상기 (2) 에서 구축한 플라스미드 pTrcSBCK 를 유지하는 대장균 ME8417 주의 25㎖ 배양분의 집균체 50㎎ 에 100mM CMP, 20mM 염화마그네슘, 250mM 피루브산나트륨을 함유하는 200mM 인산칼륨 완충액 (pH8.0) 2.5㎖ 를 첨가 후 초음파 처리하였다.
반응개시 24시간 후 상기 초음파 처리액 2.5㎖ 를 첨가하고, 다시 28℃ 에서 교반하면서 반응하였다. 또, 반응개시 14, 24시간 후에 55㎎, 38시간 후에 110㎎ 의 피루브산나트륨을 첨가하였다.
합계 48시간 반응 후, 반응액 상청을 HPLC 에 의해 분석하였더니, CMP-NeuAc 의 생성량은 6.28mM 이었다.
(실시예 2)
(1) N-아세틸뉴라민산 신타아제를 코딩하는 neuB1 유전자의 클로닝
캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 1652 주의 염색체 DNA 를 주형으로 하여, 이하에 나타내는 2 종류의 프라이머 DNA 를 통상적인 방법에 따라 합성하여 PCR 법에 의해 N-아세틸뉴라민산 신타아제 (neuB1) 유전자를 증폭하였다.
프라이머(I) : 5'-TACGATTATTTTCCTGATGCTC-3'
(서열번호 9)
프라이머(J) : 5'-TCTCCAAGCTGCATTAAACGCC-3'
(서열번호 10)
PCR 에 의한 neuB1 유전자의 증폭은, 반응액 100㎕ (50mM 염화칼륨, 10mM 트리스염산 (pH8.3), 1.5mM 염화마그네슘, 0.001% 젤라틴, 주형 DNA 0.1㎍, 프라이머 DNA (I), (J) 각각 0.2μM, AmpliTaq DNA 폴리머라아제 2.5유닛) 를 Perkin-Elmer Cetus Instrument 사 제조 DNA Thermal Cycler 를 사용하여 열변성 (94℃, 1분), 어닐링 (55℃, 1.5분), 폴리머라이제이션 (72℃, 3분) 의 단계를 25회 반복함으로써 실시하였다.
유전자 증폭후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1：1) 혼합액으로 처리하고 수용성 분획에 2배 용량의 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시켰다. 침전 회수한 DNA 를 문헌 (Molecular Cloning, 상기 서술) 의 방법에 따라 아가로스겔 전기영동에 의해 분리하여, 2.2b 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 그 DNA 단편을 주형으로 하여 이하에 나타내는 2 종류의 프라이머 DNA 를 통상적인 방법에 따라 합성하여, 다시 PCR 법에 의해 C. jejuni 의 neuB1 유전자를 증폭하였다.
프라이머 (K) : 5'-AAGGATCCTCTAGTGAGGCTTATGGAA-3'
(서열번호 11)
프라이머 (L) : 5'-GTCTGCAGATTTAATCTTAGAATAATCAGCCC-3'
(서열번호 12)
PCR 에 의한 neuB1 유전자의 증폭은, 반응액 100㎕ (50mM 염화칼륨, 10mM 트리스염산 (pH8.3), 1.5mM 염화마그네슘, 0.001% 젤라틴, 주형 DNA 0.1㎍, 프라이머 DNA (K), (L) 각각 0.2μM, AmpliTaq DNA 폴리머라아제 2.5유닛) 를 Perkin-Elmer Cetus Instrument 사 제조 DNA Thermal Cycler 를 사용하여 열변성 (94℃, 1분), 어닐링 (55℃, 1.5분), 폴리머라이제이션 (72℃, 3분) 의 단계를 25회 반복함으로써 실시하였다.
유전자 증폭후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1：1) 혼합액으로 처리하고 수용성 분획에 2배 용량의 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시켰다. 침전 회수한 DNA 를 아가로스겔 전기영동에 의해 분리하여 1.2kb 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 그 DNA 를 제한효소 BamHI 및 PstI 로 절단하고, 마찬가지로 제한효소 BamHI 및 PstI 로 소화한 플라스미드 pTrc99A (Pharmacia Biotech.사에서 입수) 와 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결하였다. 연결반응액을 사용하여 대장균 JM109 주를 형질 전환하여, 얻어진 엠피실린 내성 형질 전환체로부터 플라스미드 pTrcneuB1 을 단리하였다. pTrcneuB1 은 pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 BamHI-PstI 절단 부위에 C.jejuni 의 neuB1 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다 (FERM BP-8248 : 평성 14년 6월 25일 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 (일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 주오 다이 6 (우편번호 305-8566)).
(2) nanE, neuB1 유전자 공발현 플라스미드의 구축
상기 (1) 에서 얻어진 pTrcneuB1 플라스미드를 제한효소 BamHI 로 절단 후, T4 DNA 폴리머라아제를 사용하여 절단면을 평활화하였다. 이것을 제한효소 PstI 로 절단하고, neuB1 유전자를 포함하는 (BamHI)-PstI 단편을 아가로스겔 전기영동을 사용하여 회수하였다. 계속해서 실시예 1 의 (2) 에서 얻어진 pTrcnanE 플라스미드를 제한효소 SalI 로 절단 후, T4 DNA 폴리머라아제를 사용하여 절단면을 평활화하고, 다시 제한효소 PstI 로 절단하였다. 이것과 상기에서 얻어진 neuB1 유전자를 포함하는 (BamHI)-PstI 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용해 연결하였다. 이 연결반응액을 사용하여 대장균 JM109 주를 형질 전환하여, 얻어진 엠피실린 내성 형질 전환체로부터 플라스미드 pTrcNENB 를 단리하였다. pTrcNENB 는 pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 XbaI-PstI 절단 부위에 H. influenzae 의 nanE 유전자 및 C. jejuni 의 neuB1 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.
(3) CMP-NeuAc 의 합성
대장균 MC1061 주 (ATCC53338) 에 상기 (2) 에서 조제한 플라스미드 pTrcNENB 를 유지시키고, 이 배양균체 50㎎ 에 50mM CMP, 100mM GlcNAc, 30mM 염화마그네슘, 200mM 글루코오스, 100mM 피루브산나트륨, 0.5% (v/v) 자일렌, 4% (w/v) 건조 빵 효모 (오리엔탈효모사 제조) 및 실시예 1 의 (6) 에서 조제한 CMP-NeuAc 신타아제 (1.7유닛/㎖ 반응액) 를 함유하는 175mM 인산칼륨 완충액 (pH8.0) 5㎖ 를 첨가하고 28℃ 에서 교반하면서 72시간 반응하였다. 또, 반응개시 14, 24, 38, 48, 62시간 후에 180㎎ 글루코오스를 각각 첨가하였다.
반응액 상청을 HPLC 에 의해 분석하였더니, 25.6mM 의 CMP-NeuAc 생성이 확 인되었다.
본 발명의 NeuAc 리아제를 사용하는 방법은, 비싼 ATP 를 필요로 하지 않고 저렴한 GlcNAc, CMP 및 피루브산으로부터 효율적으로 CMP-NeuAc 를 제조하는 것이 비로소 가능해지고, CMP-NeuAc 의 대량합성법으로서 매우 의의가 있는 방법이다.
또, 본 발명의 NeuAc 신타아제를 사용하는 방법은, 비싼 ATP 를 필요로 하지 않고, 반응계에 필수적인 포스포에놀피루브산 (PEP) 은 글루코오스로부터 효모 및 대장균의 생체 (대사) 반응에 의해 합성ㆍ공급되기 때문에, 반응계에 포스포에놀피루브산 (PEP) 을 첨가할 필요가 없이 저렴한 GlcNAc 및 CMP 로부터 효율적으로 CMP-NeuAc 를 제조하는 것이 비로소 가능해져, CMP-NeuAc의 대량합성법으로서 매우 의의가 있는 방법이다.
특히, 본 발명의 NeuAc 신타아제를 사용하는 방법은, 본 발명의 NeuAc 리아제를 사용하는 방법에서 사용되는 2단계의 반응을 필요로 하지 않는 점에서 보다 간편하고 우수한 방법이다.
<110> Yamasa Corporation <120> Process for producing CMP-N-acetylneuraminic acid <130> A02-0095 <150> JP2002-208987 <151> 2002-07-18 <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nanA gene <400> 1 caccatggcg aagatattgc cgctcaaact a 31 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nanA gene <400> 2 ccgaattcat ttatgacaaa aatttcgctt tcaag 35 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nanE gene <400> 3 ggtctagatt taaatgaggg gtgttatatg t 31 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of nanE gene <400> 4 tcgtcgactt atcttgcaga tttcactgaa ttagcaaacc a 41 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of neuA gene <400> 5 tgccatggtg aaaataataa tgacaagaa 29 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of neuA gene <400> 6 aactgcagtg cagatcaaaa gtgcggcc 28 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of cmk gene <400> 7 ttgaattcta aggagataaa gatgacggca att 33 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of cmk gene <400> 8 ttgagctctg caaattcggt cgcttatgcg 30 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of neuB1 gene <400> 9 tacgattatt ttcctgatgc tc 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of neuB1 gene <400> 10 tctccaagct gcattaaacg cc 22 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of neuB1 gene <400> 11 aaggatcctc tagtgaggct tatggaa 27 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of neuB1 gene <400> 12 gtctgcagat ttaatcttag aataatcagc cc 32

Claims (7)

  1. N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), 피루브산 및 시티딘 5'-모노인산 (CMP) 을 함유하는 반응계에, 효모균체, N-아세틸글루코사민-6인산 2-에피머라아제 (GlcNAc-6P 2-에피머라아제), N-아세틸뉴라민산 리아제 (NeuAc 리아제) 및 CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제 (CMP-NeuAc 신타아제)를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 CMP-N-아세틸뉴라민산 (CMP-NeuAc) 의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 및 피루브산을 함유하는 반응계에, N-아세틸글루코사민-6인산 2-에피머라아제 (GlcNAc-6P 2-에피머라아제) 및 N-아세틸뉴라민산 리아제 (NeuAc 리아제) 를 첨가하여 N-아세틸뉴라민산 (NeuAc) 을 합성하고, 계속하여 이 반응계에 시티딘 5'-모노인산 (CMP), 효모균체 및 시티딘 5'-모노인산N-아세틸뉴라민산 신타아제 (CMP-NeuAc 신타아제) 를 첨가하여 CMP-N-아세틸뉴라민산 (CMP-NeuAc) 을 합성하는 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, GlcNAc-6P 2-에피머라아제, NeuAc 리아제 및 CMP-NeuAc 신타아제로서 세포 (형질 전환체를 포함함) 또는 그 처리물을 사용하는 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, GlcNAc-6P 2-에피머라아제와 NeuAc 리아제 각각의 활성을 증강시킨 형질 전환체와 CMP-NeuAc 신타아제 활성을 갖는 균체 처리물을 사용하는 제조 방법.
  5. N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 및 시티딘 5'-모노인산 (CMP) 을 함유하는 반응계에, 효모균체, N-아세틸글루코사민-6인산 2-에피머라아제 (GlcNAc-6P 2-에피머라아제), N-아세틸뉴라민산 신타아제 (NeuAc 신타아제) 및 CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제 (CMP-NeuAc 신타아제)를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는, CMP-N-아세틸뉴라민산 (CMP-NeuAc)의 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, GlcNAc-6P 2-에피머라아제, NeuAc 신타아제 및 CMP-NeuAc 신타아제로서 세포 (형질 전환체를 포함함) 또는 그 처리물을 사용하는 제조 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, GlcNAc-6P 2-에피머라아제와 NeuAc 신타아제 각각의 활성을 증강시킨 형질 전환체와 CMP-NeuAc 신타아제 활성을 갖는 균체 처리물을 사용하는 제조 방법.
KR1020057000945A 2002-07-18 2003-01-15 Ｃｍｐ-ｎ-아세틸뉴라민산의 제조 방법 KR100922085B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002208987A JP3833584B2 (ja) 2001-07-19 2002-07-18 Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
JPJP-P-2002-00208987 2002-07-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060010706A true KR20060010706A (ko) 2006-02-02
KR100922085B1 KR100922085B1 (ko) 2009-10-16

Family

ID=30767673

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057000945A KR100922085B1 (ko) 2002-07-18 2003-01-15 Ｃｍｐ-ｎ-아세틸뉴라민산의 제조 방법

Country Status (8)

Country Link
US (2) US7955825B2 (ko)
EP (1) EP1541693A4 (ko)
JP (1) JPWO2004009830A1 (ko)
KR (1) KR100922085B1 (ko)
CN (2) CN1301330C (ko)
AU (1) AU2003201882A1 (ko)
CA (1) CA2492838A1 (ko)
WO (1) WO2004009830A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8852891B2 (en) 2006-12-15 2014-10-07 Gene Chem, Inc. N-acetylglucosamine-2-epimerase and method for producing CMP-neuraminic acid using the same
WO2014193183A1 (ko) 2013-05-31 2014-12-04 주식회사 진켐 시알산 유도체의 제조방법

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006271372A (ja) * 2005-03-01 2006-10-12 Yamasa Shoyu Co Ltd 糖鎖の製造法
KR101385051B1 (ko) 2006-02-09 2014-04-24 메디카고 인코포레이티드 식물에서 시알산의 합성
JP5079272B2 (ja) * 2006-06-30 2012-11-21 協和発酵バイオ株式会社 シチジン‐５´‐一リン酸‐ｎ‐アセチルノイラミン酸およびｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法
CN101603023B (zh) * 2009-07-10 2010-10-27 山东大学 一株温控共表达外源基因的重组大肠杆菌及其应用
US8846373B2 (en) * 2011-07-29 2014-09-30 The University Of Wyoming Methods of using a bacterial GlcNAc-6-P 2′- epimerase to promote sialylation of glycoconjugates
US9816107B2 (en) 2011-07-29 2017-11-14 The University Of Wyoming Transgenic insect cells comprising a bacterial GlcNAc-6-P 2′-epimerase
CN103088090B (zh) * 2013-03-01 2014-06-04 南京工业大学 一种n-乙酰葡萄糖胺异构酶在生产n-乙酰甘露糖胺中的应用
EP3892731A1 (en) * 2020-04-08 2021-10-13 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Enzymatic method for preparation of cmp-neu5ac

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61180719A (ja) 1985-02-06 1986-08-13 Mitsui Toatsu Chem Inc ガングリオシドの取得方法
JPH02177891A (ja) 1988-12-28 1990-07-10 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 複合酵素反応によるシチジン‐５′‐モノホスフオシアル酸の合成方法
DE3937891A1 (de) 1989-11-15 1991-05-16 Forschungszentrum Juelich Gmbh Enzymatisches verfahren zur herstellung von n-acetylneuraminsaeure
JP3180190B2 (ja) 1990-01-16 2001-06-25 株式会社日立製作所 ディジタル信号処理方法及びその装置
ATE161051T1 (de) 1991-07-17 1997-12-15 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellung aktivierter sialinsäuren
JP3131655B2 (ja) 1992-02-03 2001-02-05 マルキン忠勇株式会社 Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
JP3418764B2 (ja) 1994-03-25 2003-06-23 マルキンバイオ株式会社 エピメラーゼ
DE4431280A1 (de) * 1994-09-02 1996-03-07 Hoechst Ag Verfahren zur Isolierung und Reinigung von nukleotidaktivierten Zuckern aus biologischen Quellen
US5876980A (en) * 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
ATE222294T1 (de) 1995-04-11 2002-08-15 Neose Technologies Inc Verbesserte verfahren zur enzymatischen synthese von oligosacchariden
JP3944866B2 (ja) 1996-06-18 2007-07-18 マルキンバイオ株式会社 Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、及びこれを用いるｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法
FI105522B (fi) * 1996-08-06 2000-08-31 Sample Rate Systems Oy Järjestely kotiteatteri- tai muussa äänentoistolaitteistossa
AU4220397A (en) * 1996-09-17 1998-04-14 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Processes for producing sugar nucleotides and complex carbohydrates
US6846656B1 (en) 1999-08-30 2005-01-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing N-acetylneuraminic acid
JP3833584B2 (ja) 2001-07-19 2006-10-11 ヤマサ醤油株式会社 Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8852891B2 (en) 2006-12-15 2014-10-07 Gene Chem, Inc. N-acetylglucosamine-2-epimerase and method for producing CMP-neuraminic acid using the same
WO2014193183A1 (ko) 2013-05-31 2014-12-04 주식회사 진켐 시알산 유도체의 제조방법
US9637768B2 (en) 2013-05-31 2017-05-02 Genechem Inc. Method for preparing sialic acid derivative

Also Published As

Publication number Publication date
CN1668756A (zh) 2005-09-14
JPWO2004009830A1 (ja) 2005-11-17
CN100413974C (zh) 2008-08-27
US7955825B2 (en) 2011-06-07
EP1541693A4 (en) 2010-12-15
CA2492838A1 (en) 2004-01-29
AU2003201882A1 (en) 2004-02-09
US20110207179A1 (en) 2011-08-25
EP1541693A1 (en) 2005-06-15
CN1301330C (zh) 2007-02-21
WO2004009830A1 (ja) 2004-01-29
KR100922085B1 (ko) 2009-10-16
US20050260718A1 (en) 2005-11-24
CN1920048A (zh) 2007-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20110207179A1 (en) Process for producing cmp-n-acetylneuraminic acid
Tabata et al. Production of N-acetyl-D-neuraminic acid by coupling bacteria expressing N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase and N-acetyl-D-neuraminic acid synthetase
US9193958B2 (en) Method of enzymatically synthesizing 3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate
KR20130027452A (ko) 뉴클레오시드 합성을 위한 열 안정성 바이오촉매 조합
CN113652385B (zh) 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用
KR101718681B1 (ko) 가용성 단백질 발현량 및 활성이 증대된 헬리코박터 파일로리 유래 α-1,3 푸코실 전달효소의 유전자와 단백질 및 α-1,3 푸코실올리고당 생산에의 응용
EP1816206B1 (en) Method of producing uridine 5 -diphospho-n-acetylgalactosamine
Oh et al. One‐pot enzymatic production of dTDP‐4‐Keto‐6‐Deoxy‐d‐glucose from dTMP and glucose‐1‐phosphate
JP3833584B2 (ja) Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
CN116790649A (zh) 一种酶法合成udp-葡萄糖醛酸和udp-n-乙酰氨基葡萄糖的方法
EP2094840B1 (en) Novel n-acetylglucosamine-2-epimerase and method for producing cmp-neuraminic acid using the same
EP1233072B1 (en) Novel use of uridine diphosphate glucose 4-epimerase
CN111549013A (zh) 一种atp依赖的甘露糖激酶及其在岩藻基乳糖合成中的应用
JP5068956B2 (ja) デオキシリボヌクレオシド一リン酸からのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の製造方法
KR100680765B1 (ko) 3&#39;-아미노-2&#39;,3&#39;-디데옥시구아노신의 제조 방법
CN116925993B (zh) 用于酶催化生产胞苷酸的基因工程改造菌株和方法
JP3830015B2 (ja) ウリジン５’−ジリン酸ガラクトースの製造法
WO2023166035A2 (en) New sialyltransferases for in vivo synthesis of 3&#39;sl and 6&#39;sl

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120924

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee