JP3418764B2 - エピメラーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、アシルグルコサミン２−エピメラーゼ及び
その誘導体、該酵素をコードするDNA分子、該DNA分子を
組み込んでなる組換え体ベクター、該ベクターを保有す
る形質転換体及び該エピメラーゼの製造方法に関する。

本発明は、新規ポリペプチド、レニン結合活性を有す
るアシルグルコサミン２−エピメラーゼ及びその誘導
体、該酵素等をコードするDNA分子、該DNA分子を組み込
んでなる組換え体ベクター、該ベクターを保有する形質
転換体、該エピメラーゼの製造方法、該酵素又はその誘
導体を必須成分とする降圧剤、エピメリ化剤並びにＮ−
アセチルマンノサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸の
製造法に関する。

背景技術 Ｎ−アセチルノイラミン酸は、近年医薬品原料として
注目されている。このＮ−アセチルノイラミン酸は、Ｎ
−アセチルマンノサミンとピルビン酸とから、Ｎ−アセ
チルノイラミン酸リアーゼを用いて酵素的に合成できる
ことが知られている。しかし、Ｎ−アセチルマンノサミ
ンは高価かつ大量の入手が困難であるため、安価なＮ−
アセチルグルコサミンとピルピン酸をアシルグルコサミ
ン２−エピメラーゼ及びＮ−アセチルノイラミン酸リア
ーゼの存在下で反応させてＮ−アセチルノイラミン酸を
得る方法が提案されている〔ウド・クラーグル（Udo Kr
agl）ら、アンゲバンデ・ヘミ−インターナショナル・
エディション・イン・イングリッシュ（Angewandte Che
mi−International Edition in English），30,827−82
8（1991）〕。この方法は、アシルグルコサミン２−エ
ピメラーゼがＮ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチル
マンノサミンにエピメリ化することを利用している。し
かしながら、この方法で用いられているアシルグルコサ
ミン２−エピメラーゼは動物組織中に微量しか存在して
おらず、また、その大量生産技術も確立されていないた
め、実用的に使用できるものではない。

一方、テシマ（Teshima）ら〔クリニカル・ケミスト
リー（Clinical Chemistry），34,2291−2294（198
8）〕は、Ｎ−アセチルノイラミン酸の定量にアシルグ
ルコサミン２−エピメラーゼが有効であることを示して
おり、さらに林ら（特開昭60−186300号公報）は、Ｎ−
アセチルヘキソサミンの定量にも該酵素が有用であるこ
とを示している。

以上のように、アシルグルコサミン２−エピメラーゼ
は非常に重要な酵素であり、その効率的な製造法の確立
が切望されてきた。

アシルグルコサミン２−エピメラーゼは、動物の組織
に存在することが知られており、例えばアシス・ダッタ
（Asis Datta）〔メソッズ・イン・エンザイモロジー
（Methods in Enzymology），41,407−412（1975）〕
は、ブタの腎臓にアシルグルコサミン２−エピメラーゼ
が存在することを報告している。また、ブタ腎臓の他に
もヒトやラットの腎臓、肝臓、粘膜細胞、顎下腺、大腸
及び小腸粘膜、唾液腺等に広く存在することも知られて
いる。

しかしながら、動物組織からアシルグルコサミン２−
エピメラーゼを精製するのはきわめて困難であり、現在
までのところ粗製物の状態でしか得られていない。例え
ばゴーシュ（Ghosh）ら〔メソッズ・イン・エンザイモ
ロジー（Methods in Enzymology），８,191−195（196
6）〕や、アシス・ダッタ〔メソッズ・イン・エンザイ
モロジー（Methods in Enzymology），41,407−412（19
75）〕は、いずれもアシルグルコサミン２−エピメラー
ゼの単離精製を試みているが、ゴーシュの報告では精製
の程度が低く、アシス・ダッタも比活性で６ユニット/m
g蛋白質程度までの精製である。

すなわち、これらの従来技術はブタの腎皮質をホモジ
ナイザーで抽出した粗抽出液をプロタミン濃縮、ベント
ナイト処理、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィ
ー及びリン酸カルシウムゲル吸着等の通常の精製手段を
組み合わせることだけでは、アシルグルコサミン２−エ
ピメラーゼの精製が困難であることを示している。

本発明者は、上記従来の精製方法に加えてさらにゲル
濾過、ヒドロキシアパタイト及び疎水性ゲル等の各種ク
ロマトグラフィーや、クロマトフォーカシングの操作を
行ったが、酵素活性の分散化や酵素の失活により酵素活
性を示さなくなることなどのため、該酵素を純粋な形で
回収することはできなかった。アシルグルコサミン２−
エピメラーゼは、腎臓中に微量しか存在しないことも精
製が困難である原因の１つである。

近年、遺伝子組換え技術の進歩により微生物などを用
いて異種蛋白質を比較的容易に得ることが可能になって
きた。しかしながら、この方法を用いるためには目的と
する蛋白質を単離することが必要であり、精製度の低い
蛋白しか得られていないアシルグルコサミン２−エピメ
ラーゼの場合には、該酵素を特定するための材料、例え
ばDNAプローブや抗体を作成することはできない。この
ような場合には代替手段として部分精製酵素をSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動し、ポリビニリデンジフル
オリド（PVDF）膜にブロッティングした後、アミノ酸配
列の解析を行い、そのアミノ酸配列を基にDNAプローブ
を合成して、目的遺伝子の検出を行うことが常法であ
る。しかしながら、本酵素の場合には、この方法でもア
ミノ酸配列を決定することができない。何故なら、アシ
ルグルコサミン２−エピメラーゼは、Ｎ末端が何らかの
残基でブロックされているためである。

以上のように、アシルグルコサミン２−エピメラーゼ
に関しては、通常、遺伝子組換えの手段として用いられ
る方法のいずれも用いることができず、従って遺伝子組
み換え技術による本酵素の製造の道は閉ざされたままで
あった。

本発明は、アシルグルコサミン２−エピメラーゼを大
量且つ安価に製造する方法を提供することを目的とす
る。

また本発明は、アシルグルコサミン２−エピメラーゼ
を提供することを目的とする。

さらに本発明は、アシルグルコサミン２−エピメラー
ゼをコードするDNA分子を提供することを目的とする。

さらにまた本発明は、アシルグルコサミン２−エピメ
ラーゼをコードするDNA分子を組み込んだ組換え体ベク
ターを提供することを目的とする。

さらにまた本発明は、アシルグルコサミン２−エピメ
ラーゼをコードするDNA分子を組み込んだ組換え体ベク
ターを細部に導入してなる形質転換体を提供することを
目的とする。

さらにまた本発明は、降圧剤を提供することを目的と
する。

さらにまた本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミンをＮ
−アセチルマンノサミンに変換する新規エピメリ化剤を
提供することを目的とする。

さらにまた、本発明は、Ｎ−アセチルマンノサミンの
製造法を提供することを目的とする。

さらにまた、本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸の
製造法を提供することを目的とする。

さらにまた、本発明は、新規ポリペプチドを提供する
ことを目的とする。

図面の簡単な説明 図１は、アシルグルコサミン２−エピメラーゼの塩基
配列とアミノ酸配列を示す図である。

図２は、プラスミドpEPI1の制限地図を示す図であ
る。

なお、図２中、□は、ベクターDNAであるpBluescript
を示し、■は、挿入されたDNAを示す。また、AGEはアシ
ルグルコサミン２−エピメラーゼをコード化している遺
伝子の領域を示し、Placは、lacプロモーターを示して
いる。

図３は、組換え体プラスミドで形質転換された細胞と
非形質転換細胞の抽出液をそれぞれＮ−アセチルマンノ
サミンを基質とした反応液中で反応し、その反応液をPM
P化の後HPLCで分析したクロマトグラムを示す図であ
る。図３中のGlcNAcは、PMP化されたＮ−アセチルグル
コサミンを示し、ManNAcは、PMP化されたＮ−アセチル
マンノサミンを示している。

図４は、純化したブタの腎臓由来のアシルグルコサミ
ン２−エピメラーゼと細胞抽出液をSDS−電気泳動し、
ウエスタンブロット後の免疫染色を示す図である。

図４中、レーン１は純化したブタ腎臓由来のアシルグ
ルコサミン２−エピメラーゼである。レーン２は、エシ
ェリヒア・コリの抽出液である。レーン３は、pEPI1で
形質転換したエシェリヒア・コリの抽出液である。レー
ン４は、pEP114で形質転換したエシェリヒア・コリの抽
出液である。

図５は、部分精製酵素をヒドロキシアパタイトカラム
に通液した後、溶出したときのパターンを示す図であ
る。実線は280nmの紫外線吸収から測定できる蛋白質の
溶出を示し、破線はアシルグルコサミン２−エピメラー
ゼ活性を示した。集めた画分を矢印で示した。

発明の開示 本発明者は、上記従来技術に鑑み鋭意検討を重ねた結
果、アシルグルコサミン２−エピメラーゼを抗体の製造
が可能となる程度まで精製し、該抗体を用いた遺伝子組
換えの方法によりアシルグルコサミン２−エピメラーゼ
のクローン化及び製造を行った。また、得られたアシル
グルコサミン２−エピメラーゼの生物活性について種々
検討した結果、意外にもアシルグルコサミン２−エピメ
ラーゼはレニン結合活性を有することが判明した。本発
明は、以上の知見に基づき完成されたものである。

すなわち、本発明は、下記の項1.〜項22.に記載のア
シルグルコサミン２−エピメラーゼ及びその誘導体、該
酵素をコードするDNA分子、該DNA分子を組み込んでなる
組換え体ベクター、該ベクターを保有する形質転換体お
よび該酵素の製造方法、並びに該酵素を有効成分とする
降圧剤、エピメリ化剤及びＮ−アセチルノイラミン酸お
よびＮ−アセチルマンノサミンの製造法を提供するもの
である。

項1.実質的に純粋なアシルグルコサミン２−エピメラー
ゼ。

項2.下記式（Ａ）のアミノ酸配列又はその一部が置換又
は欠失されたアミノ酸配列を含むアシルグルコサミン２
−エピメラーゼ又は該酵素活性を有する誘導体（但し、
下記のアミノ酸配列の一部が置換又は欠失されたアミノ
酸配列は、アシルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を
有する）： 項3.アシルグルコサミン２−エピメラーゼをコードする
DNA分子。

項4.上記式（Ａ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列
又はその一部が置換又は欠失されたアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を含む項３に記載のDNA分子 （但し、上記式（Ａ）のアミノ酸配列の一部が置換又は
欠失されたアミノ酸配列をコードする塩基配列は、アシ
ルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有するポリペプ
チドをコードする）。

項5.下記式（Ｘ）の塩基配列を有する請求項４に記載の
DNA分子。

項6.アシルグルコサミン２−エピメラーゼをコードする
DNA分子が組み込まれた組換え体ベクター。

項7.前記DNA分子が、前記式（Ａ）のアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列又はその一部が置換又は欠失されたア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を含む項６に記載の組
換え体ベクター。

（但し、上記式（Ａ）のアミノ酸配列の一部が置換又は
欠失されたアミノ酸配列をコードする塩基配列は、アシ
ルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有するポリペプ
チドをコードする。） 項8.前記DNAが、前記式（Ｘ）の塩基配列に含む項７に
記載の組換え体ベクター。

項9.項３に記載のDNA分子を含む組換え体ベクターを細
胞に導入してなる形質転換体。

例10.アシルグルコサミン２−エピメラーゼをコードす
るDNA分子を組み込んだ組換え体ベクターを細胞に導入
して形質転換体とし、該形質転換体を培地に培養し、培
養物中にアシルグルコサミン２−エピメラーゼを生成蓄
積させ、該培養物からアシルグルコサミン２−エピメラ
ーゼを採取するアシルグルコサミン２−エピメラーゼの
製造方法。

項11.レニン結合活性を有するアシルグルコサミン２−
エピメラーゼ。

項12.下記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリペプ
チドを必須成分とする項11に記載のエピメラーゼ。

（１）前記式（Ａ）で表されるアミノ酸配列を必須配列
とするポリペプチド； （２）前記式（Ａ）で表されるアミノ酸配列の10位、13
位、21位、23位、27位、33位、45位、47位、51位、71
位、72位、76−79位、93位、94位、101位、110位、120
位、136位、137位、139位、141位、142位、145位、149
位、155位、159位、162位、163位、171位、173位、174
位、176位、178位、187位、195位、199−202位、205
位、208位、212位、224位、232位、234位、237位、243
位、249位、258−261位、263位、266位、267位、269
位、270位、272位、275位、282位、287−289位、300
位、301位、309位、317位、318位、328位、329位、334
位、337位、348位、363位、364位、371位、392位、393
位、395位、399位、401位及び402位からなる群から選ば
れる少なくとも１つの位置が置換又は欠失されたポリペ
プチド；あるいは （３）式（Ａ）で表されるポリペプチドのＮ末端又はＣ
末端にPro Ala Pro Ser Pro Ala Pro Thr Pro Ala Cys
Arg Gly Ala Glu;Pro Ala Pro Leu Gly Ser Leu Pro Al
a Val Pro Thr Arg Glu Gly Ser Lys;またはLys Gly As
n Lys Ser Trp Gln Aspが付加したポリペプチド。； （但し、前記式（Ａ）の一部が置換又は欠失されたポリ
ペプチドは、アシルグルコサミン２−エピメラーゼ活性
を有する。） 項13.下記（１）〜（３）のいずれかのポリペプチド
（但し、一般式（Ｒ−１）、（Ｒ−２）及び（Ｒ−３）
で表されるポリペプチドを除く）。

（１）前記式（Ａ）で表されるアミノ酸配列を必須配列
とするポリペプチド； （２）前記式（Ａ）で表されるアミノ酸配列の10位、13
位、21位、23位、27位、33位、45位、47位、51位、71
位、72位、76−79位、93位、94位、101位、110位、120
位、136位、137位、139位、141位、142位、145位、149
位、155位、159位、162位、163位、171位、173位、174
位、176位、178位、187位、195位、199−202位、205
位、208位、212位、224位、232位、234位、237位、243
位、249位、258−261位、263位、266位、267位、269
位、270位、272位、275位、282位、287−289位、300
位、301位、309位、317位、318位、328位、329位、334
位、337位、348位、363位、364位、371位、392位、393
位、395位、399位、401位及び402位からなる群から選ば
れる少なくとも１つの位置が置換又は欠失されたポリペ
プチド；あるいは （３）前記式（Ａ）で表されるポリペプチドのＮ末端又
はＣ末端にPro Ala Pro Ser Pro Ala Pro Thr Pro Ala
Cys Arg Gly Ala Glu;Pro Ala Pro Leu Gly Ser Leu Pr
o Ala Val Pro Thr Arg Glu Gly Ser Lys;またはLys Gl
y Asn Lys Ser Trp Gln Aspが付加したポリペプチド； 項14.項13に記載のポリペプチドをコードするDNA分子。

項15.前記式（Ｘ）で表される塩基配列を有する項14に
記載のDNA分子。

項16.項14又は15に記載のアシルグルコサミン２−エピ
メラーゼをコードするDNA分子が組み込まれた組換え体
ベクター。

項17.項16に記載の組換え体ベクターを細胞に導入して
なる形質転換体。

項18.項12に記載のレニン結合活性を有するアシルグル
コサミン２−エピメラーゼをコードするDNA分子を組み
込んだ組換え体ベクターを細胞に導入して形質転換体と
し、該形質転換体を培地に培養し、培養物中にアシルグ
ルコサミン２−エピメラーゼを生成蓄積させ、該培養物
からアシルグルコサミン２−エピメラーゼを採取するこ
とを特徴とするレニン結合活性を有するアシルグルコサ
ミン２−エピメラーゼの製造方法。

項19.項11又は12に記載のアシルグルコサミン２−エピ
メラーゼ又はその誘導体を必須成分とする降圧剤。

項20.レニン結合活性を有する蛋白質を必須成分とす
る、Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルマンノ
サミンへの変換を行うエピメリ化剤。

項21.N−アセチルグルコサミンにレニン結合活性を有す
る蛋白質を作用させることを特徴とするＮ−アセチルマ
ンノサミンの製造法。

項22.N−アセチルグルコサミンとピルビン酸にレニン結
合活性を有する蛋白質及びＮ−アセチルノイラミン酸リ
アーゼを作用させることを特徴とするＮ−アセチルノイ
ラミン酸の製造法。

なお、上記の蛋白質（Ｒ−１）、（Ｒ−２）及び（Ｒ
−３）は、レニン結合活性を有することは知られていた
が（H.Inoue et al.,J.Biochem.,110,p.493−500（199
1））、アシルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有
することは全く知られていなかった。従って、本発明の
Ｎ−アセチルマンノサミンの製造法及びＮ−アセチルノ
イラミン酸の製造法に用いられる「レニン結合活性を有
する蛋白質」には、上記の蛋白質（Ｒ−１）、（Ｒ−
２）及び（Ｒ−３）が包含される。

本発明は、上記蛋白質（Ｒ−１）、（Ｒ−２）及び
（Ｒ−３）からなる群から選ばれる少なくとも１種を作
用させることを特徴とするＮ−アセチルマンノサミンの
製造法を提供するものである。

また、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミンとピルビ
ン酸に上記蛋白質（Ｒ−１）、（Ｒ−２）及び（Ｒ−
３）からなる群から選ばれる少なくとも１種及びＮ−ア
セチルノイラミン酸リアーゼを作用させることを特徴と
するＮ−アセチルノイラミン酸の製造法を提供するもの
である。

本発明のエピメリ化剤の必須成分である「レニン結合
活性を有する蛋白質」には、上記の蛋白質（Ｒ−１）、
（Ｒ−２）及び（Ｒ−３）が包含される。

従って、本発明は、上記蛋白質（Ｒ−１）、（Ｒ−
２）及び（Ｒ−３）からなる群から選ばれる少なくとも
１種を必須成分とする、Ｎ−アセチルグルコサミンから
Ｎ−アセチルマンノサミンへの変換を行うエピメリ化剤
を提供するものである。

本発明の新規ポリペプチドは、アシルグルコサミン２
−エピメラーゼとして有用である。

なお、上記項１〜10は、アシルグルコラミン２−エピ
メラーゼ活性のみを有していればよく、レニン結合活性
の有無とは無関係のものであり、以下“第１発明”と称
する。

また、上記項11〜22は、アシルグルコラミン２−エピ
メラーゼ活性とレニン結合活性の両方を有するものであ
り、以下“第２発明”と称する。

また、“本発明”は、第１発明及び第２発明の両方を
含むものである。

第１発明のアシルグルコサミン２−エピメラーゼは、
少なくともその一部のものは、アシルグルコサミン２−
エピメラーゼ活性とレニン結合活性の両方を有するが、
該エピメラーゼはレニン結合活性の有無にかかわらず、
アシルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する蛋白
質を全て含む。

本発明において、アシルグルコサミン２−エピメラー
ゼをコードするDNA分子を組み込んだプラスミドで形質
転換される細胞としては、大腸菌、枯草菌、緑膿菌、放
線菌及び乳酸菌などの細菌、かびや酵母及び他の真核微
生物、マウス細胞、ラット繊維芽細胞およびCOS細胞等
の哺乳類由来の培養細胞、及び植物細胞などのプラスミ
ドが安定に保持され、機能する細胞であれば、本願に例
示した細胞に限定されない。

本発明で、アシルグルコサミン２−エピメラーゼをコ
ードするDNA分子を組み込んだプラスミドを上記細胞に
導入する方法としては、当業者であれば細胞の種類に応
じて適宜適切な方法を選択することができ、例えば大腸
菌の場合ではハナハン（Hanahan）の方法［DNAクローニ
ング（DNA Cloning）、第１巻、p109−136（1985）］な
どにより行うことができる。

本発明は、アシルグルコサミン２−エピメラーゼを初
めて実質的に不純物を含まない形態で単離し、その製造
方法を開示したものであり、該エピメラーゼの少なくと
も一部がレニン結合活性を有することも本発明で初めて
明らかにされた。アシルグルコサミン２−エピメラーゼ
活性及びレニン結合活性を有するものであれば、そのア
ミノ酸配列に関わらず第２発明の範囲に包含される。例
えば、本発明では、図１に示すアミノ酸配列及び塩基配
列を有するアシルグルコサミン２−エピメラーゼをコー
ドするDNA分子の5'末端及び／又は3'末端をエキソ型ヌ
クレアーゼなどにより数個から百数十個程度切断して短
くしたDNA分子および該DNAによりコードされるＮ末端又
はＣ末端の数個ないし数十個のアミノ酸が削除された該
酵素の誘導体も、該酵素活性を保持している限り本発明
の範囲に含まれる。また、公知の方法により部分的突然
変異を起こさせ、該アミノ酸配列の内部の１個又はそれ
以上を突然変異により他のアミノ酸に置換し又は欠失さ
せたポリペプチドも、アシルグルコサミン２−エピメラ
ーゼ活性を有する限り、本発明の範囲に包含される。

置換及び／又は欠失の可能な位置としては、例えば、
前記一般式（Ａ）で表されるポリペプチドの10位、13
位、21位、23位、27位、33位、45位、47位、51位、71
位、72位、76−79位、93位、94位、101位、110位、120
位、136位、137位、139位、141位、142位、145位、149
位、155位、159位、162位、163位、171位、173位、174
位、176位、178位、187位、195位、199−202位、205
位、208位、212位、224位、232位、234位、237位、243
位、249位、258−261位、263位、266位、267位、269
位、270位、272位、275位、282位、287−289位、300
位、301位、309位、317位、318位、328位、329位、334
位、337位、348位、363位、364位、371位、392位、393
位、395位、399位、401位及び402位が例示されるが、こ
れらに限定されない。

さらに、本発明は、アシルグルコサミン２−エピメラ
ーゼ活性を有するポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末
端にさらに数個から数十個のアミノ酸を付加したものも
アシルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する限り
包含する。

本発明で用いられるアシルグルコサミン２−エピメラ
ーゼをコードする核酸分子の供与体としては、特に限定
されるものではないが、例えばブタ腎臓やヒトやラット
の腎臓、肝臓、粘膜細胞、顎下腺、大腸および小腸の粘
膜、唾液腺などの該酵素活性を有する動物組織等が挙げ
られる。これらの動物組織から該核酸分子を得る。核酸
分子としては、DNAとRNAが挙げられるが、好ましくはRN
Aである。

アシルグルコサミン２−エピメラーゼをコードするRN
Aは、チョムックジンスキー（Chomczynki）らの方法
〔アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical B
iochemistry），162,156−159,（1987）〕に従って取得
することができる。該RNA分子は、さらに、モレキュラ
ー・クローニング（Molecular Cloning）第２版、第１
巻、第7.26項〜7.29項に記載の方法によりポリアデニル
酸テール（ポリＡテール）を有するRNAとしても得るこ
とができる。そして、このポリＡテールを有するRNAを
用いることにより容易にアシルグルコサミン２−エピメ
ラーゼをコードするcDNAを得ることができる。

RNAからcDNAへの変換は、例えばカレント・プロトコ
ールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current
Protocols in Molecular Biology）、第１巻、5.5.1−
5.5.10（1990）に従い行うことができる。また、市販の
cDNA合成キット（例えば、アマーシャム社製、ストラタ
ジーン社製など）を用いて行うこともできる。

cDNAは、ある種のベクター、例えばファージベクター
やプラスミドベクターに挿入することによって、cDNAラ
イブラリーを構築することができる。cDNAライブラリー
の構築は、モレキュラー・クローニング（Molecular Cl
oning）第２版、第２巻、第8.1項〜8.86項に記載の方法
等により行うことができる。

構築されたcDNAライブラリーから、アシルグルコサミ
ン２−エピメラーゼをコードするcDNAを保有する形質転
換体を選択する手段が必要である。この酵素は、上述の
ように上記文献記載の精製手段では、遺伝子組換えの分
野で必要とされる程度にまで精製された酵素は得られな
い。本発明者は、以下のような方法を用いて抗体産生が
可能な程度にまで純化したアシルグルコサミン２−エピ
メラーゼを得た。

先ず、アシス・ダッタ〔メソッズ・イン・エンザイモ
ロジー（Methods in Enzymology），41,407−412（197
5）〕の方法に準じて、アシルグルコサミン２−エピメ
ラーゼを部分的に精製する。この後の精製工程は、精製
の過程で活性を有する画分が分散していくため、活性が
高く、蛋白質量の少ない画分、すなわち、溶出した試料
の比活性（蛋白質1mg当たりの活性）が、カラムに通液
前の試料の比活性よりも高い画分のみを得ることとし
た。具体的には、上記部分精製試料についてヒドロキシ
アパタイトカラム及びイオン交換カラムクロマトグラフ
ィーをこの順に行い、分散して溶出される該酵素の活性
の最も高い画分の一部を取り出し、さらにイオン交換カ
ラムによる分離を２回繰り返すことにより、該酵素が純
化されることを見出した。得られた酵素画分をさらに、
逆相カラム（マイクロボンダスフェア−C4（ミリポア社
製））を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に
より精製し、実質的に不純物を含まない純化された該酵
素蛋白質を得ることができる。逆相HPLCで精製すると酵
素は失活しやすいために酵素の精製には殆ど用いられて
いない。アシルグルコサミン２−エピメラーゼの場合に
おいても酵素活性は失われるが、抗体の生産を惹起する
能力は維持される。このため、HPLCで精製したアシルグ
ルコサミン２−エピメラーゼをウサギに免疫することに
より、該酵素蛋白質に特異的に反応する抗体を得ること
ができる。

上記の精製工程により、例えばブタの腎皮質5.6kgか
ら、10.5mgの精製された該酵素蛋白質を得ることができ
る。

本発明のアシルグルコサミン２−エピメラーゼをコー
ドするDNA分子は、構築したcDNAから単離することがで
きる。単離の方法は、ベクターとしてλgt11やλZAP等
の発現ベクターを使用することにより、抗体を用いた検
出が可能である。アシルグルコサミン２−エピメラーゼ
をコードするDNAを保有する形質転換体は、イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドにさらされること
によりアシルグルコサミン２−エピメラーゼを産生す
る。これを抗体に結合させ、さらにアルカリホスファタ
ーゼが結合した抗ウサギ抗体を結合させ５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリルリン酸溶液とニトロブルーテ
トラゾリウム溶液を反応させることにより、該酵素をコ
ードするDNAを保有する組換え体を選択し、取得するこ
とができる。

得られたアシルグルコサミン２−エピメラーゼをコー
ドするDNAがプラスミドDNA中に挿入されている場合に
は、該DNAを有する大腸菌をそのまま適当な培地中で培
養することにより、アシルグルコサミン２−エピメラー
ゼを得ることができる。また、λZAPをベクターとして
使用した場合、取得したDNAを含有するファージとf1ヘ
ルパーファージを同時感染させることにより、該DNAを
含むプラスミドへと切り出すことも可能である。これら
一連の操作により、例えば式（Ｘ）で表される1.2kbpの
アシルグルコサミン２−エピメラーゼをコードするDNA
を含有する新規な組換え体プラスミドを取得することが
できる。

次に、上記の様にして得られたアシルグルコサミン２
−エピメラーゼをコードするDNA断片が挿入されたプラ
スミドを用いて大腸菌等の細胞を形質転換する。形質転
換された細胞からアシルグルコサミン２−エピメラーゼ
を生産するには、下記のようにして形質転換された細胞
を培養し、培養細胞を得る。

培養条件は、形質転換される細胞の種類により異な
り、当業者であれば、細胞の種類に応じて、容易に培養
条件を定めることができる。例えば、大腸菌の場合に
は、通常の固体培養法で培養してもよいが、液体培養法
を用いて培養するのが望ましい。また、大腸菌の場合を
例に取ると、培養に使用する培地としては、炭素源、窒
素源、無機化合物その他の栄養成分を含み、細菌の培養
に一般的に用いられている合成培地、半合成培地、或い
は天然培地のいずれも使用することができる。上記培地
に使用できる炭素源としては、ブドウ糖、果糖、転化
糖、澱粉、糖化液、ソルビトール、グリセロールなどの
糖質液や、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸
等を例示することができる。窒素源としては、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、酒石酸アンモニ
ウム、酢酸アンモニウム、尿素等を例示できる。炭素源
としても窒素源としても利用できるものとしては、ペプ
トン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー
などを例示できる。無機化合物としては、リン酸一カリ
ウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸
二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、
塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二
鉄、塩化第二鉄、硫酸マンガン、塩化マンガンなどを例
示できる。

形質転換された細胞の培養時間及び培養温度は特に制
限されないが、例えば該細胞が大腸菌の場合、通常20℃
〜42℃前後、好ましくは30℃〜37℃前後で、通常４〜48
時間、好ましくは８〜14時間培養する。このような条件
下で、通常の振盪培養或いは通気攪拌培養にて培養す
る。

本発明のアシルグルコサミン２−エピメラーゼをコー
ドするDNAを適当なベクターと連結し、適当な宿主細胞
に形質転換すると、形質転換された宿主細胞の内部又は
外部の該酵素濃度を高めることができ、該酵素を効率的
に生産することができる。

本発明に用いられるベクターは、以下の要素を備えて
いる。すなわち、形質転換される宿主細胞内で該酵素を
コードするDNAを発現させる正しい配向と配置を備えた
プロモーター及び翻訳活性化配列を備えている。これら
の要素を備べたベクターであれば、どのようなベクター
であってもよいが、好ましいベクターとしては適当な選
択マーカーを有し、多コピーのものが好適で、例えばpB
luescript,pUC18,pUC19,pKK223−３及びpTrc99A等が挙
げられる。これらのベクターを使用した場合、イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを培養液の培地
に、0.01mM〜100mM、好ましくは0.1mM〜10mM程度添加す
ることにより、アシルグルコサミン２−エピメラーゼの
細胞内濃度を増大させることができる。また、熱誘発性
の発現ベクターであるpPL−lambdaも使用することがで
きる。このベクターを使用した場合、培養液の温度を40
〜45℃に上昇させることにより、アシルグルコサミン２
−エピメラーゼの細胞内濃度を増大させることができ
る。

さらに、宿主細胞のアシルグルコサミン２−エピメラ
ーゼの細胞内濃度を増大させる手段として、アシルグル
コサミン２−エピメラーゼをコードするDNAの末端DNAを
削除することによっても、該酵素の生産性を増大させ、
且つ効率化することができる。例えば、該DNA分子の5'
末端及び／又は3'末端をエキソ型ヌクレアーゼなどによ
りアシルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を失わない
程度に分解することにより、アシルグルコサミン２−エ
ピメラーゼの産生能をさらに高めることもできる。ま
た、部位指定突然変異やランダムな突然変異を導入する
ことによって、内部DNAを置換又は欠失させることによ
り、該酵素の生産能を高めることもできる。例えば、該
DNA分子をpBluescriptやM13のような１本鎖になり得る
ベクターに導入し、該DNA分子を含む１本鎖DNAを調製す
る。この１本鎖DNAに変異しようとする配列を含むか又
は欠失した配列を含むオリゴヌクレオチドをアニールし
た後、これをプライマーとして、デオキシリボヌクレオ
シド３リン酸、ATP、DNAポリメラーゼのクレノー断片及
びT4リガーゼ存在下でプライマー伸長反応を行うことに
より、部分的突然変異を導入することができる。

一方、アシルグルコサミン２−エピメラーゼは、培養
によって得られる細胞から抽出することができる。抽出
は、細胞からの通常の酵素抽出法に従い行うことができ
る。例えば、超音波処理、各種機械的処理、酵素処理な
どの方法により細胞を破砕し、不溶物を遠心分離などに
より分離した上清に該酵素を回収することができる。回
収された粗酵素は、一般的な酵素精製法を適宜選択、組
み合わせることにより、精製することができる。例え
ば、除核酸処理、硫安処理、珪藻土処理、イオン交換ク
ロマトグラフィー等により、純化されたアシルグルコサ
ミン２−エピメラーゼを大量に得ることができる。

なお、図１に示すDNA分子を組み込んだ、図２のpEPI1
を含む大腸菌株は、平成６年３月11日に通産省工業技術
院生命工学技術研究所に寄託され、受託番号:FERM BP−
4602が付された。

本発明者は、第２発明で得られたブタ腎臓由来の一般
式（Ａ）のポリペプチドの生物活性について種々検討し
た結果、該酵素はアシルグルコサミン２−エピメラーゼ
活性だけでなく、レニン結合活性をも有することが明ら
かになった。ここでレニン結合活性とは、該ポリペプチ
ドがレニンに結合し、レニン活性を阻害することを言
う。一般式（Ａ）のポリペプチドは、本発明のアシルグ
ルコサミン２−エピメラーゼの製造法に従い得られた。
一方、ブタ腎臓由来の一般式（Ｒ−３）のレニン結合蛋
白は井上らの方法（H.Inoue et al.,J.Biochem.,110,p.
493−500,（1991））に従い得られた。精製方法の異な
る両蛋白質（Ａ）及び（Ｒ−３）は、149位、289位、31
7位及び318位の４個のアミノ酸を除いて同一の配列を有
する極めて類似した蛋白質である。一方、以下の実施例
で示されるように、本発明で得られた蛋白質（Ａ）及び
ラット腎臓由来のエピメラーゼは、いずれもレニン結合
活性を有している。このことから、少なくとも一部の蛋
白質についてはアシルグルコサミン２−エピメラーゼ活
性とレニン結合活性は不可分のものであり、蛋白質
（Ａ）と構造の類似した公知のレニン結合蛋白質（Ｒ−
１）、（Ｒ−２）および（Ｒ−３）はいずれもエピメラ
ーゼ活性を有していると考えられる。

従って、レニン結合蛋白が、アシルグルコサミン２−
エピメラーゼ活性を有するときには、レニン結合蛋白は
Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルマンノサミ
ンへの変換を触媒するエピメリ化剤として使用すること
もできる。

一般式（Ａ）の蛋白質は、10位、13位、21位、23位、
27位、33位、45位、47位、51位、71位、72位、76−79
位、93位、94位、101位、110位、120位、136位、137
位、139位、141位、142位、145位、149位、155位、159
位、162位、163位、171位、173位、174位、176位、178
位、187位、195位、199−202位、205位、208位、212
位、224位、232位、234位、237位、243位、249位、258
−261位、263位、266位、267位、269位、270位、272
位、275位、282位、287−289位、300位、301位、309
位、317位、318位、328位、329位、334位、337位、348
位、363位、364位、371位、392位、393位、395位、399
位、401位及び402位のいずれかの部位において公知の蛋
白である（Ｒ−１）、（Ｒ−２）および（Ｒ−３）と異
なっている。しかしながら、これら蛋白質は、いずれも
レニン結合活性及びエピメラーゼ活性を有しているた
め、これらの部位は活性の発現に必須ではなく、置換又
は欠失が可能である。また、Ｎ末端、Ｃ末端に数個から
数十個のアミノ酸が付加しても蛋白質の活性発現には影
響しない。なお、本発明者は実際に一般式（Ａ）のポリ
ペプチドのＮ末端にLys Gly Asn Lys Ser Trp Gln Asp
のアミノ酸を付加したエピメラーゼを得ているが、該エ
ピメラーゼが十分な酵素活性を有することは確認されて
いる。

本発明は、動物の組織に存在するアシルグルコサミン
２−エピメラーゼをコードするDNA分子を分離し、該DNA
分子を有する組換えプラスミドを作成し、このプラスミ
ドを大腸菌などの宿主細胞内に導入して細胞を形質転換
し、該形質転換体を培養することにより、アシルグルコ
サミン２−エピメラーゼを細胞内に大量に且つ効率的に
生産させ、これを採取する方法を開示する。

レニンは、血液中のアンギオテンシノーゲンを加水分
解してアンギオテンシンＩを産生する。アンギオテンシ
ンＩはさらにアンギオテンシンＩ変換酵素によってアン
ギオテンシンIIとなり、末梢血管の平滑筋を直接収縮さ
せ、強い昇圧作用を発現する。また、副腎皮質球状層に
作用し、アルドステロンの分泌を促進する。このよう
に、レニン・アンギオテンシン系は、血圧の調節に重要
な役割を果たしており、現在レニン・アンギオテンシン
系の阻害剤が開発され、その薬剤が高血圧治療薬（降圧
剤）として広く利用されている。本発明のアシルグルコ
サミン２−エピメラーゼは、レニンに結合しその活性を
阻害することから、降圧剤として有用である。

レニン結合蛋白質は、アシルグルコサミン２−エピメ
ラーゼ活性を有する。従って、レニン結合蛋白質は、例
えばＮ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサ
ミンに変換するエピメリ化剤として使用できる。すなわ
ち、レニン結合蛋白質をＮ−アセチルグルコサミンに作
用させると、Ｎ−アセチルマンノサミンが得られる。さ
らにまた、レニン結合蛋白質をＮ−アセチルノイラミン
酸リアーゼとともに、Ｎ−アセチルグルコサミン及びピ
ルビン酸に作用させると、まず、レシン結合蛋白質によ
りＮ−アセチルグルコサミンがＮ−アセチルマンノサミ
ンに変換され、次いで、Ｎ−アセチルノイラミン酸リア
ーゼの作用によりＮ−アセチルマンノサミンとピルビン
酸が結合してＮ−アセチルノイラミン酸が得られる。

本発明によれば、以下のような優れた効果が達成され
る。

（１）高度に精製されたアシルグルコサミン２−エピメ
ラーゼを安価且つ大量に製造することができる。

（２）微生物を出発原料とするため、動物組織を原料と
する従来法と異なり、原料供給いの制約を受けることな
く、必要なときに必要な場所で所望量の生産が可能であ
る。

（３）アシルグルコサミン２−エピメラーゼの生産量が
高いため、容易に該酵素を単離できる。

（４）高純度のアシルグルコサミン２−エピメラーゼを
安価に得ることができるため、該酵素を用いてＮ−アセ
チルノイラミン酸やＮ−アセチルマンノサミンを安価に
製造できる。

（５）高純度のアシルグルコサミン２−エピメラーゼを
得ることができるため、Ｎ−アセチルノイラミン酸やＮ
−アシルヘキソサミンの定量に利用できる。

（６）本発明のレニン結合活性を有する蛋白質を用いる
ことにより降圧剤を得ることができる。

（７）レニン結合活性を有する蛋白質は、アシルグルコ
サミン２−エピメラーゼ活性をも有するため、該蛋白質
は、Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルマンノ
サミンへのエピメリ化剤として使用できる。

（８）レニン結合活性を有する本発明の蛋白質と、Ｎ−
アセチルノイラミン酸リアーゼを、場合によりアルカリ
性条件下にＮ−アセチルグルコサミン及びピルビン酸と
反応させることにより、効率よくＮ−アセチルノイラミ
ン酸を得ることができる。

発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ ブタの腎臓由来のアシルグルコサミン２−エピメラーゼ （１）ブタの腎臓由来のアシルグルコサミン２−エピメ
ラーゼの精製 新鮮なブタの腎皮質（5.6kg）に3mMのリン酸緩衝液
（pH7.6）12リットルを加えてホモジナイザーで均一化
した。連続遠心分離（10,000rpm、200ml/分）により上
清（11リットル）を得た後、上清と等量の冷却した蒸留
水を加えてよく攪拌し、連続遠心分離（10,000rpm、200
ml/分）によって得られた上清を腎臓抽出液とした。こ
の腎臓抽出液をアシス・ダッタの方法〔メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），41,40
7−412（1975）〕に従ってプロタミン濃縮、ベントナイ
ト処理、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィー処
理及びリン酸カルシウムゲル処理により、アシルグルコ
サミン２−エピメラーゼの精製を行い、387mgの部分精
製酵素を得た。

次に、該部分精製酵素を10mMのリン酸緩衝液（pH7.
6）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（内径26m
m×長さ95mm;和光純薬社製）に通液し、同緩衝液で溶出
した。本処理により該酵素活性を有する画分は広く分散
した状態で溶出された（図５参照）。該酵素活性を有す
る第12〜17画分（18ml×６＝108ml）を硫酸アンモニウ
ムにより塩析処理し、硫酸アンモニウム０から80重量％
飽和沈殿画分を集め、20mMのリン酸緩衝液（pH7.6）で
透析を行い、透析酵素75.6mgを得た。さらに、以下に示
す条件でイオン交換クロマトグラフィーを行うことによ
り、該酵素をさらに精製した。

まず、イオン交換体の１種であるＱ−セファロース
（フォルマシア社製）を内径26mm×長さ100mmのカラム
に充填し、20mMのリン酸緩衝液（pH7.6、500ml）を通し
て平衡化した。次いで、上記部分精製酵素75.6mgを該カ
ラムに吸着させ、100mMから300mMの塩化カリウムを含む
リン酸緩衝液（pH7.6）の直線的濃度勾配溶出法にて溶
出した。塩化カリウムの濃度が180mM付近に溶出される
蛋白質の主ピーク（198ml）を集めて濃縮及び透析を行
った。この透析処理酵素23.0mgをモノＱカラム（フォル
マシア社製）に通液することにより、該カラム中に吸着
させた。次いで吸着された酵素を200mMから300mMの塩化
カリウムを含むリン酸緩衝液（pH7.6）の直線的濃度勾
配溶出法により溶出した。塩化カリウム濃度が220mM付
近に溶出される蛋白質のピークを集めて、ゲル濾過カラ
ムによる脱塩を行った。得られた該酵素15.9mgの活性
は、比活性で21ユニット/mg蛋白質で、前述のアシス・
ダッタの報告にある活性（６ユニット/mg蛋白質）より
も3.5倍もの純度の高い酵素が得られた。さらに、低分
子量の物質や微量の不純物を除くため、逆相カラムを用
いたHPLCによる精製を行った。逆相カラムは、マイクロ
ボンダスフェアー５μC4−300オングストローム（内径
3.9mm×長さ150mm）（ミリポア社製）を使用し、0.1％
（V/V）のトリフルオロ酢酸（TFA）水溶液で平衡化した
このカラムへ、精製酵素2mgを注入した。カラム内に保
持された該精製酵素は、０から80％（V/V）のアセトニ
トリルを含む0.1％（V/V）のTFA水溶液の直線的温度勾
配溶出法により溶出し、280nmの紫外線吸収から測定で
きる蛋白質の主ピークを集めて減圧乾燥した。同操作を
６回繰り返すことにより得られた酵素（10.5mg）は、活
性を失っていたが実質的に不純物を含まない純化された
蛋白質であった。

（２）アシルグルコサミン２−エピメラーゼに特異的に
結合する抗体 純化した5.2mgのアシルグルコサミン２−エピメラー
ゼを、生後９週齢のウサギ（日本白色種）に免疫し、部
分採血及び全採血により、約150mlの抗血清を得た。該
抗血清から日本生化学会編、新生化学実験講座12、分子
免疫学III、（1992）、第24頁の記載を参考にして、プ
ロテインＡセファロース（ファルマシア社製）を用いて
IgGを精製した。

実施例２ アシルグルコサミン２−エピメラーゼのcDNAのクローン
化 （１）ブタの腎臓からのmRNAの取得 ブタの腎臓から腎皮質を切り取り、腎皮質2gから上記
のチョムックジンスキー（Chomczynski）らの方法〔ア
ナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Bioch
emistry），162,156,（1987）〕により4.9mgのRNAを取
得した。さらに、このRNAをオリゴdTセルロースカラム
に吸着、溶出することにより、67μｇのポリＡテールを
有するRNAを取得した。

（２）cDNAライブラリーの作成 上記で得られたポリＡテールを有するRNA（５μｇ）
から、ストラタジーン社製のZAP−cDNA合成キットを用
いて、cDNAライブラリーを作成した。得られたライブラ
リーは、4.5×10¹²プラーク形成単位であった。

（３）アシルグルコサミン２−エピメラーゼ遺伝子のス
クリーニング アシルグルコサミン２−エピメラーゼをコードするDN
Aを有する組換え体のスクリーニングは、実施例１記載
の抗体と、ストラタジーン社製のピコブルーイムノスク
リーニングキットを用いた免疫染色法により行った。

上記方法により、約120万個のプラークをスクリーニ
ングしたところ、64個の陽性ファージを取得した。この
陽性ファージのうち、任意に12株を選択し、エシェリヒ
ア・コリにf1ヘルパーファージとともに感染することに
より、プラスミドへの切り出しを行った。このプラスミ
ドを有するエシェリヒア・コリのうち、アシルグルコサ
ミン２−エピメラーゼ活性を有する株を選び出し、プラ
スミドを取り出したところ、1.4kbpの挿入断片を有する
組換えプラスミドpEPI1（4.3kbp）を取得した。pEPI1の
制限酵素地図を図２に示す。

このpEPI1（4.3kbp）を導入した組換え大腸菌は、FER
M BP−4602の受託番号で、通産省工業技術院生命工学工
業技術研究所に1994年３月11日に寄託された。

（４）アシルグルコサミン２−エピメラーゼ活性の測定 エシェリヒア・コリ中のアシルグルコサミン２−エピ
メラーゼ活性を調べるため、プラスミドpEPI1で形質転
換したエシェリヒア・コリXL1−Blueを100mg/リットル
のアンピシリンを含むLB培地（１％ペプトン、0.5％酵
母エキス、１％NaCl、pH7.0）に接種し、振盪すること
により培養を行った。また、より効率よく該酵素を生産
させるために、培養開始時にイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシドを最終濃度が1mMとなるように培
地へ添加した37℃で12時間培養の後、遠心分離（5000rp
m,10分間）により菌体をペレット化した。この菌体を超
音波破砕することによって、細胞抽出液を得ることがで
きる。この細胞抽出液は、40mMのＮ−アセチルマンノサ
ミン（ナカライテスク社製）又は40mMのＮ−アセチルグ
ルコサミン（ナカライテスク社製）、4mMのアデノシン
−三リン酸（興人社製）、10mMの塩化マグネシウムおよ
び100mMのトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）の存在下（最終
容積0.5ml）で37℃、30分間反応した。得られた反応混
合物を沸騰水中で３分間煮沸することにより、反応を停
止した。次いで、この反応混合物から、遠心分離（12,0
00rpm,5分間）によって得られた反応上清液のＮ−アセ
チルマンノサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを測
定することにより、該酵素の活性を測定した。但し、Ｎ
−アセチルマンノサミンとＮ−アセチルグルコサミン
を、そのままHPLCで分離することは困難である。これら
の化合物をホンダ（Honda）ら、〔アナリティカル・バ
イオケミストリー（Analytical Biochemistry），180,3
51−357（1989）に記載〕の方法に従って１−フェニル
−３−メチル−５−ピラゾロン（PMP）誘導体とするた
めに、10μｌの上記反応上清液を1.5ml容のマイクロチ
ューブ（エッペンドルフ社製）に移し、減圧乾燥後、50
μｌの0.5M PMPメタノール溶液と50μｌの0.3M NaOH水
溶液を添加し、70℃で30分間反応した。この反応液を室
温で10分間冷却後、150μｌの0.1M塩酸水溶液で中和し
た。中和した溶液に200μｌのクロロホルムを添加し、
混合することにより、未反応のPMPはクロロホルム層
に、また、誘導体化したＮ−アセチルヘキソサミンは水
層に分離した。クロロホルム層を取り除いた後に、水層
を減圧乾燥した。乾燥物を250μｌの蒸留水に溶解し、
そのうち10μｌをHPLCに注入することにより分離し、定
量した。HPLC分析は、LC−6Aシステム（島津製作所社
製）とカラム〔コスモシール5C18−AR（内径6.0mm×長
さ150mm）（ナカライテスク社製）〕を用いて行い、移
動相は、アセトニトリルと50mMリン酸カリウム緩衝液
（pH7.0）の２対８の混合液であり、この移動相を1ml/
分の流速で送液した。検出は、245nmにおける紫外線の
吸収量により測定した。また、該酵素活性を示す単位は
ユニットであり、１ユニットは、Ｎ−アセチルマンノサ
ミンを基質として反応し、１分間当たりに１μmolのＮ
−アセチルグルコサミンを生成する活性と定義した。

その結果、Ｎ−アセチルマンノサミンが反応混合物に
含まれている場合には、細胞抽出液の存在下、Ｎ−アセ
チルマンノサミンはＮ−アセチルグルコサミンに変換し
た（図３参照）。同様にＮ−アセチルグルコサミンは、
細胞抽出液の存在下、Ｎ−アセチルマンノサミンに変換
した。各々の反応において、Ｎ−アセチルグルコサミン
対Ｎ−アセチルマンノサミンは、75対25の平衡状態に達
した。上記の細胞抽出液を前記混合物に添加しなかった
ときは、変換が全く見られなかった。その上、純化した
アシルグルコサミン２−エピメラーゼに対する抗体は、
ウエスタンブロットにおいて、約45000ダルトンのバン
ドと反応した（図４参照）。これらの試験結果は、全体
的に見て、クローン化された遺伝子が、アシルグルコサ
ミン２−エピメラーゼ活性に対応する蛋白質を生産して
いることを示している。また、細胞抽出液のアシルグル
コサミン２−エピメラーゼ活性は、培養液１リットル当
たり10ユニットの生産が認められ、比活性は0.03U/mg
と、ブタの腎皮質の抽出液とほぼ同程度である。このこ
とは、従来動物の組織でしか得られなかったアシルグル
コサミン２−エピメラーゼが、プラスミドpEPI1で形質
転換された微生物で生産できることを示している。

（５）アシルグルコサミン２−エピメラーゼの塩基配列
の決定 pEPI1のEcoR IからXho Iの制限酵素切断部位間に挿入
されたアシルグルコサミン２−エピメラーゼをコード化
するDNAを含有する約1.4kbpのDNA断片をサンガー（Sang
er）ら〔Proceedings of The National Academy of Sci
ences of The United States of America,74,5463−546
7（1977）〕に記載の方法を基本原理とするジデオキシ
法により、塩基配列を決定した。pEPI1に使用されてい
るベクターは、１本鎖ベクターとなりうるpBluescript
であるため、このベクターのままディリーションミュー
タントを作成し、常法に従い塩基配列の決定を行った。
アシルグルコサミン２−エピメラーゼをコード化してい
る塩化配列を図１に示した。また、該酵素をコード化し
ている塩基配列から翻訳されて得られるポリペプチドの
アミノ酸配列も同時に示した。

実施例３ 微生物によるアシルグルコサミン２−エピメラーゼの生
産 （１）アシルグルコサミン２−エピメラーゼ高生産プラ
スミドの構築 上記プラスミドpEPI1のディリーションプラスミドを
構築することにより、アシルグルコサミン２−エピメラ
ーゼの微生物による高生産が可能となった。プラスミド
pEPI1（20μｇ）の500μｌ溶液中で100ユニットのSac I
と100ユニットのXba Iの制限酵素を用いて37℃で４時間
切断した。制限酵素処理液を75℃で15分間処理した後、
フェノール／クロロホルム（1:1）で抽出し、エタノー
ルで沈殿した。沈殿物を１μg/μｌになるように滅菌水
に溶解したものを、エキソ／マング・ディリーションキ
ット（ストラタジーン社製）を用いて、数十種のディリ
ーションプラスミドを作成し、このうちプラスミドpEP1
14が、アシルグルコサミン２−エピメラーゼを高生産す
ることを認めた。プラスミドpEP114で形質転換されたエ
シェリヒア・コリXL1−Blueを、100μg/mlのアンピシリ
ン及び1mMのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシドが入ったLB培地で、37℃、12時間培養し、その培
養物のペレットから細胞抽出液を調製した。細胞抽出液
のアシルグルコサミン２−エピメラーゼ活性は、培養液
１リットル当たり約1000ユニットの生産が認められ、比
活性は1.6U/mgと、ブタの腎皮質の抽出液の約53倍の上
昇が認められた。

（２）アシルグルコサミン２−エピメラーゼの生産 プラスミドpEP114は、エシェリヒア・コリ中で、多量
のアシルグルコサミン２−エピメラーゼを生産する有効
な手段を提供する。

エシェリヒア・コリを培養し、アシルグルコサミン２−
エピメラーゼを得ることは、動物組織から得るよりもは
るかに容易である。

培養は、100mg/リットルのアンピシリン及び1mMのイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含むLB
培地（１％ペプトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH
7.0）１リットルを２本の２リットル容振盪フラスコに
入れ、それぞれにプラスミドpEP114で形質転換したエシ
ェリヒア・コリXL1−Blueを接種し、振盪することによ
り行った。37℃で12時間培養を行った後、遠心分離にて
培養物を集め、生理食塩水で２回洗浄した。培養物を、
1mMのEDTA及び0.05％の２−メルカプトエタノールの入
った50mMのリン酸緩衝液（pH7.6）50mlに懸濁し、超音
波発生装置（UR−200P,トミー精工社製）により培養物
を破砕後、遠心分離にて沈殿物を除き、細胞抽出液を得
た。細胞抽出液に、0.03％（W/V）になるようにプロタ
ミン硫酸（ナカライテスク社製）を添加し、遠心分離で
上清を得ることにより、除核酸処理を行った。上清は、
硫酸アンモニウムにより塩析処理し、硫酸アンモニウム
20〜80％飽和画分を集め、上記リン酸緩衝液に対し透析
を行った。透析処理液は、上記リン酸緩衝液で平衡化し
たDEAE−セルロース（ワットマン社製）カラム（直径5c
m×高さ10cm）に通液して吸着させた。吸着した蛋白質
の溶出は、通液している上記リン酸緩衝液に適度な濃度
の塩化カリウムを添加することにより行った。アシルグ
ルコサミン２−エピメラーゼ活性は、75〜100mMの塩化
カリウム濃度で溶出されたため、この活性画分を集め、
メンブランフィルター（分画分子量10000、アミコン社
製）で濃縮及び脱塩した後、上記リン酸緩衝液で平衡化
したＱ−セファロース（ファルマシア社製）カラム（内
径1cm×直径5cm）に通液した。吸着した蛋白質の溶出
は、100mMの塩化カリウムを添加した上記リン酸緩衝液
と、300mMの塩化カリウムを添加した上記リン酸緩衝液
の直線的濃度勾配溶出法により、溶出した。アシルグル
コサミン２−エピメラーゼ活性画分を集め、上記メンブ
ランフィルターで濃縮及び脱塩することにより、純化し
たクローン化アシルグルコサミン２−エピメラーゼを約
700ユニット（33mg）得ることができた。

実施例４ ラット腎臓由来アシルグルコサミン２−エピメラーゼの
精製 ラットの腎臓（300g）を用いて、実施例１（１）と同
様にして、ラット由来のアシルグルコサミン２−エピメ
ラーゼの精製を行った。但し、実施例１（１）にある逆
相カラム（マイクロボンダスフェア−５μC4）による精
製工程は、酵素が失活するため行わず、モノＱカラムで
再度精製することにより、アシルグルコサミン２−エピ
メラーゼ（0.15mg）を得た。

実施例５ アシルグルコサミン２−エピメラーゼによるレニン活性
の阻害（１） 40μｌの緩衝液Ａ（0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH
6.5）、1mM EDTA、１μＭロイペプチン、0.05％牛血清
アルブミン）中に、2.5mUの市販のレニン（シグマ社
製）及び０−25pmolの実施例３で得られたクローン化ア
シルグルコサミン２−エピメラーゼを加え、37℃で１時
間反応した。反応後、960μｌの冷却した緩衝液Ａを加
え、全量を1mlとした。250μｌの緩衝液Ａ中に、得られ
た反応希釈液の一部（25μｌ）と0.4mg/mlのアンギオテ
ンシノーゲン（シグマ社製）及び終濃度2.5mMになるよ
うにフッ化フェニルメチルスルホニルを加え、37℃で30
分間反応した。該溶液を沸騰水中で３分間処理して反応
を停止し、遠心分離（14000rpm、10分）後、上清液に遊
離するアンギオテンシンＩを定量した。結果を表１に示
す。

実施例６ アシルグルコサミン２−エピメラーゼによるレニン活性
の阻害（２） 実施例３で得られたクローン化アシルグルコサミン２
−エピメラーゼの代わりに実施例４で得られたラットの
アシルグルコサミン２−エピメラーゼを用いた他は、実
施例５と同様にして、アシルグルコサミン２−エピメラ
ーゼによるレニンの阻害活性を測定した。結果を表２に
示す。

実施例７ レニンとアシルグルコサミン２−エピメラーゼの結合反
応（１） 100μｌの緩衝液Ａ中に、25mUのレニン（シグマ社
製）及び140pmolの実施例３で得られたクローン化アシ
ルグルコサミン２−エピメラーゼを加え、37℃で１時間
反応した。

上記の100μｌの反応液を、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー［カラム,Superose 12HR 10/30;移動相,50mMリン酸
ナトリウム緩衝液（pH7.5）−150mM塩化ナトリウム；流
速1ml/分；検出、紫外線（280nm）］により分画し、各
画分のレニン活性を測定することにより、レニンの分子
量変化を測定した。

上記ゲル濾過クロマトグラフィーで溶出された画分
は、実施例５の方法に準じてレニン活性を測定した。そ
の結果、アシルグルコサミン２−エピメラーゼ無添加の
場合は、レニンの分子量に相当する約40000ダルトンの
位置にレニン活性が溶出された。しかし、アシルグルコ
サミン２−エピメラーゼを添加した場合は、約60000ダ
ルトンの位置にレニン活性が溶出し、該酵素がレニンに
結合して高分子化することが認められた。

本実験で得られた高分子化したレニンの分子量は、Ta
kahashiら［J.Biochem.,93,1583−1594（1983）］が報
告したレニン結合蛋白質とレニンの複合体である高分子
型（HMW）レニンのゲル濾過クロマトグラフィーによる
分子量（約60000ダルトン）とよく一致した。よって、
アシルグルコサミン２−エピメラーゼはレニン結合活性
を有していた。

実施例８ レニンとアシルグルコサミン２−エピメラーゼの結合反
応（２） 実施例３で得られたクローン化アシルグルコサミン２
−エピメラーゼの代わりに実施例４で得られたラットの
アシルグルコサミン２−エピメラーゼを用いた他は、実
施例７と同様にしてゲル濾過クロマトグラフィーによる
分子量の測定を行った。その結果、実施例７と同様にレ
ニンの分子量が約60000ダルトンに高分子化した。

実施例９ レニン結合活性を有する蛋白質を用いたＮ−アセチルマ
ンノサミンの製造法 安価なＮ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルマ
ンノサミンの製造を行った。10gのＮ−アセチルグルコ
サミン、5mgの実施例３で得たレニン結合活性を有する
蛋白質、4mM ATP及び10mM MgCl₂の水溶液100mlをpH7.5
に調整し、37℃で24時間反応した。反応液は減圧濃縮
し、シロップを得た。得られたシロップに40mlのエタノ
ールを加えて沸騰水浴中10分間加温した後、４℃で３時
間放置した。Ｎ−アセチルグルコサミンは不溶性、Ｎ−
アセチルマンノサミンは可溶性であることから沈殿物
（Ｎ−アセチルグルコサミン）を濾過により取り除き、
濾液を減圧濃縮することにより純度91％以上のＮ−アセ
チルマンノサミン2gを得た。

実施例10 レニン結合活性を有する蛋白質を用いたシアル酸の製造 安価なＮ−アセチルグルコサミンとピルビン酸からレ
ニン結合活性を有する蛋白質とＮ−アセチルノイラミン
酸リアーゼを作用させ、Ｎ−アセチルノイラミン酸の製
造を行った。

5mM ATP及び5mM MgCl₂を含む50mMのトリス塩酸緩衝液
（pH7.5）にＮ−アセチルグルコサミン22g及びピルビン
酸11gを溶解し、この溶液に15mgの実施例３で得たレニ
ン結合活性を有する蛋白質及び、500ユニットのＮ−ア
セチルノイラミン酸リアーゼを加えて全量を0.5リット
ルとし、30℃、48時間反応を行った。反応後の反応液中
には12.4gのＮ−アセチルノイラミン酸が生成した。Dow
exl1（ダウケミカル社製）によるイオン交換クロマトグ
ラフィーにより反応物を単離し、濃縮後、凍結乾燥によ
り10.3gのＮ−アセチルノイラミン酸を得た。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−180190（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 265，Ｎｏ．12（1990）ｐ．6556−6561 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. ９，Ｎｏ．17（1970）ｐ．3363−3370 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 240，Ｎｏ．４（1965）ｐ．1531−1536 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/90 C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 14/825 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を必
   須成分とし、Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチ
   ルマンノサミンへの変換を行うエピメリ化剤； （ａ）アミノ酸配列（Ａ）からなるタンパク質 （ｂ）アミノ酸配列（Ａ）において１又はそれ以上のア
   ミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からな
   り、かつアシルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有
   するタンパク質
2. 【請求項２】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を必
   須成分とし、Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチ
   ルマンノサミンへの変換を行うエピメリ化剤； （ａ）アミノ酸配列（Ｒ−１）からなるタンパク質 （ｂ）アミノ酸配列（Ｒ−１）において１又はそれ以上
   のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列か
   らなり、かつアシルグルコサミン２−エピメラーゼ活性
   を有するタンパク質
3. 【請求項３】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を必
   須成分とし、Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチ
   ルマンノサミンへの変換を行うエピメリ化剤； （ａ）アミノ酸配列（Ｒ−２）からなるタンパク質 （ｂ）アミノ酸配列（Ｒ−２）において１又はそれ以上
   のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列か
   らなり、かつアシルグルコサミン２−エピメラーゼ活性
   を有するタンパク質
4. 【請求項４】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を必
   須成分とし、Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチ
   ルマンノサミンへの変換を行うエピメリ化剤； （ａ）アミノ酸配列（Ｒ−３）からなるタンパク質 （ｂ）アミノ酸配列（Ｒ−３）において１又はそれ以上
   のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列か
   らなり、かつアシルグルコサミン２−エピメラーゼ活性
   を有するタンパク質
5. 【請求項５】下記（１）又は（２）の、Ｎ−アセチルグ
   ルコサミンからＮ−アセチルマンノサミンへの変換を行
   うエピメリ化剤； （１）上記式（Ａ）で表されるアミノ酸配列を必須配列
   とするエピメリ化剤 （２）上記式（Ａ）で表されるポリペプチドのＮ末端又
   はＣ末端にPro Ala Pro Ser Pro Ala Pro Thr Pro Ala
   Cys Arg Gly Ala Glu;Pro Ala Pro Leu Gly Ser Leu Pr
   o Ala Val Pro Thr Arg Glu Gly Ser Lys;またはLys Gl
   y Asr Lys Ser Trp Gln Aspが付加したアミノ酸配列を
   必須配列とし、かつアシルグルコサミン２−エピメラー
   ゼ活性を有する、エピメリ化剤；
6. 【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載のエピメリ
   化剤をＮ−アセチルグルコサミンに作用させてＮ−アセ
   チルマンノサミンを製造する方法。
7. 【請求項７】請求項１〜５のいずれかに記載のエピメリ
   化剤とＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼとを、Ｎ−ア
   セチルグルコサミンとピルビン酸に作用させてＮ−アセ
   チルノイラミン酸を製造する方法。