KR100351345B1

KR100351345B1 - 키틴디아세틸라제를코딩하는dna

Info

Publication number: KR100351345B1
Application number: KR1019950702300A
Authority: KR
Inventors: 게오르그티레오스; 디미트리카페초포울로스
Original assignee: 인스티튜트 포 몰리큘라 바이올로지 앤드 바이오테크놀로지/포오쓰
Priority date: 1992-12-07
Filing date: 1993-12-07
Publication date: 2003-12-31
Also published as: DE69333185T2; ATE248919T1; EP0673425A1; AU5698494A; DK0673425T3; ES2206466T3; WO1994013815A1; EP0673425B1; US5525502A; KR950704498A; CA2151257A1; JPH09501301A; AU663991B2; DE69333185D1

Abstract

본 발명은 키틴의 키토산으로의 전환을 촉매하는(즉 키틴 탈아세틸화제 활성을 갖는), 뮤코르 로욱시에 존재하는 효소의 DNA 서열에 관한 것이다. 이 DNA 서열은 리조비알 NodB 단백질을 코드화할 수 있으며, 이것은 본 발명의 키틴 탈아세티화제와 약간의 상동성을 갖는다.

Description

키틴 디아세틸아제를 코딩하는 DNA

발명의 배경

키틴은 셀룰로오스 다음으로 전세계적으로 가장 풍부하고, 쉽게 얻을 수 있으며, 반복 사용가능한 생물학적 물질이다. 키틴은 광범위한 유기체에 의해 합성되는 천연 생성물이다. 년간 수 억만 톤의 이 물질이 생산된다. 키틴은 탄수화물 중합체, β(1→4) 결합된 N-아세틸글루코사민의 N-아세틸화된 중합체, 또는 폴리-N-아세틸 글루코사민이다. 식물에서, 키틴은 셀룰로오스를 대체하거나 또는 때로는 셀룰로오스와 함께 발생하는 세포벽 구성성분이다. 동물에서는, 키틴은 통상 상피 조직의 표면에서 큐티클로서 조직된다. 키틴은 구조적으로는 셀룰로오스와 유사하지만, 분명하게 상이한 화학적 성질을 갖는다. 키틴은 매우 불용성 물질이며, 따라서 산업적인 이용성은 제한된다.

키틴의 아세틸이탈된 유도체인 키토산은 광범위하고 인상적인 실제 응용배열을 갖는 훨씬 더 다루기 쉬운 물질이다. 키토산은 양으로 하전되어 있어서, 단백질 침전제 및 금속 킬레이트제로서 사용될 수 있다. 키토산은 용액, 겔, 막, 필름 또는 섬유로서 제형될 수 있다. 그러한 제형은 예를 들면, 귀금속 회수, 농작물 보호, 크로마토그래피 및 효소 고정화의 분야에 유용하다. 키토산은 농업, 식품, 약물 및 화장품 산업에서 사용하는 것을 이상적으로 만드는, 생물학적으로 유리하고 면역원성이 아닌 물질이다. 키토산은 독특한 생물학적 성질을 가지는 물질을 형성하기 위하여 콜라겐 및 케라틴과 같은 다른 천연 중합체와 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들면, 그러한 물질들은 상처 치유 가속화제, 인공 피부 및 혈관의 성분, 항응혈제 및 제어된 약물 방출 비히클로서 사용될 수 있다.

현재 세계적으로 생산되는 많은 양의 키토산은 갑각류 동물의 껍질 물질로부터 제조된다. 키틴은 약 20-50 건조 중량 %의 갑각류 동물의 큐티클을 포함하며, 그 나머지는 주로 탄산 칼슘, 인산 칼슘 및 다른 단백질로 구성된다. 키틴은 먼저 기저 갑각류 동물의 껍질을 묽은 산 및 알칼리로 처리하여 단백질 및 미네랄을 제거함으로써 단리된다. 미가공의 키틴은 그런 다음 고온에서 농축 알칼리에 대해 노출되어 아세틸이탈됨으로써 키토산이 생성된다. 이런 방식으로 제조된 키토산이 많은 유용한 성질을 가지고 있긴 하지만, 제조 과정을 효과적으로 조절하는 것은 불가능하며, 그로써 광범위한 분자량 범위 및 균일하지 않은 아세틸이탈 정도를 갖는 물질의 제조가 유도된다. 그런 생성물은 별로 가치가 없다. 왜냐하면, 특히 생의학 분야에서와 같이 많은 잠재적으로 중요한 적용은 매우 특이한 물리적 및 화학적 성질을 갖는 균일한 물질을 필요로 하기 때문이다.

발명의 요약

본 발명은 키틴이 키토산으로 전환되는 것을 촉매하는 효소를 코딩하는 단리된 DNA 서열에 관한 것이다. 그것에 대한 특정 구체에는 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 번호: 1로 표시되는 DNA 서열에 혼성화하는 능력을 특징으로 하는 DNA 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 상술된 특이성을 갖는 효소, 또는 그것의 생물학적 활성 부분들을 코딩하는 DNA 발현 구성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 키틴을 키틴 디아세틸라제 활성을 갖는 효소와 접촉시킴에 의해 키틴을 키토산으로 전환시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법에서, 효소는 효소, 또는 그것의 생물학적 활성 부분을 코딩하는 단리된 DNA 서열이 DNA 발현 구성물로부터 발현되는 재조합 DNA 기법에 의해 생성된다.

제 1도는 페닐 세파로스^?CL-4B 컬럼으로부터의 용출 프로필을 나타내는 다이아그램이다.

제 2도는 Q 세파로스^?패스트 플로우 컬럼으로부터의 용출 프로필을 나타내는 다이아그램이다.

제 3도는 S 세파로스^?패스트 플로우 컬럼으로부터의 용출 프로필을 나타내는 다이아그램이다.

제 4도는 키틴 디아세틸라제 활성의 온도 의존성을 나타내는 다이아그램이다.

제 5도는 키틴 디아세틸라제 활성의 pH 의존성을 나타내는 다이아그램이다.

제 6도는 뮤코르 로욱시(Mucor rouxii) 의 DNA 서열 및 추론된 아미노산 서열을 나타내는 다이아그램이다. DNA 서열은 또한 SEQ ID NO: 1로 표시된다.

i) 키틴 디아세틸아제의 정제

본 발명은 키틴 디아세틸라제를 생성하는 유기체의 세포 추출물로부터 키틴디아세틸라제를 정제하는 방법을 발견함으로써 가능하게 되었다. 효소 키틴 디아세틸라제는 다양한 속, 예를 들면, 뮤코르 속, 피코마이세스 속(Phycomyces), 아브시디아 속(Absidia), 및 코아네포라 속 (Choanephora)에 의해 생성된다. 다른 잠재적으로 유용한 속으로는 지고르힌쿠스 속(Zygorhynchus), 악티노뮤코르 속(Actinomucor), 키르시넬라 속(Circinella), 리조푸스 속(Rhizopus), 콜레토트리쿰 속(Colletotrichum) 및 리조뮤코르 속(Rhizomucor)이 있다.

키틴 디아세틸라제에 대한 바람직한 공급원은 진균류 균사체의 세포벽이다. 그런 균사체는 발효 산업의 부산물로서 다량으로 생산된다. 표준 발효기에서의 뮤코르 로욱시의 성장은 문헌에 기재되어 있다. 뮤코르 로욱시와 같은 진균의 사용은 많은 장점을 제공한다. 유기체는 값싼 영양분을 사용하여 성장할 수 있다. 그것은 또 대규모의 발효 시스템에서 높은 세포밀도(배양 배지 리터당 세포의 건조 중량 그램)로 성장할 수 있다. 높은 세포 밀도를 얻기 위한 배양 시간은 12시간/배치로 낮다.

초기에 세포 추출물은 키틴 디아세틸라제를 생성하는 유기체로부터 제조되었다. 예를 들어, 만약 유기체가 진균(예컨대, 뮤코르 로욱시)이면, 균사체가 추출 완충액중에서 파괴된다. 추출 완충액은 프로테아제 억제제, 다른 분해 효소 억제제 및 효소 활성을 유지하고 그것의 추출을 용이하게 하기 위한 안정제를 포함할 수 있다. 비-가용성 물질은 예를 들어, 여과 또는 원심분리에 의하여 추출 혼합물의 액상으로부터 제거된다.

세포 추출물은 바람직하지 않은 단백질(즉, 키틴 디아세틸라제이외의 단백질)의 침전을 유도할 열 순환 단계에 들어간다. 예를 들어, 하기 실시예에 의해 설명되는 바와 같이, 추출물은 약 50℃ 에서 약 15 내지 30분의 기간동안 인큐베이션될 수 있다. 침전된 단백질은 계속해서 예컨대 여과 또는 원심분리에 의하여 제거된다.

고염 농도를 갖는 용액중에서의 단백질의 용해도 성질은 광범위하게 달라진다는 것은 잘 알려져 있다. 용해도의 이러한 차이는 높은 이온 강도에서의 침전에 의하여 용액중에서 단백질을 분리하기 위하여 이용될 수 있다. 많은 염들이 이 목적에 사용될 수 있지만, 황산 암모늄이 pH를 상당히 변경시키지 않고, 매우 가용적이며, 단백질을 탈안정화시키지 않는다는 점에서 바람직하다.

본 발명자들은 약 2.1 M 농도의 황산 암모늄이 키틴 디아세틸라제를 침전시키지 않으면서 상술된 액상으로부터 매우 다양한 단백질들을 효과적으로 침전시키는 것을 측정하였다. 약 2.1 M 농도의 황산 암모늄중에서 침전하는 단백질들은 표준 기법(예컨대, 여과 또는 원심분리)에 의하여 용액으로부터 제거된다.

황산 암모늄 침전후에 회수되는 액상은 계속해서 소수성 상호 반응 크로마토그래피를 적용받는다. 소수성 상호 반응 크로마토그래피는 하전되지 않은 겔 매트릭스에 부착되어 있는 소수성 기와 마크로분자들의 소수성 상호 반응의 강도의 변화를 토대로 하여 마크로분자를 정제하기 위하여 널리 사용된다. 이 기법은 통상 적당히 높은 농도의 항-카오트로픽 염의 존재하에 수행된다(염 촉진된 흡착 크로마토그래피). 여러 인자들이 소수성 흡착제에 대한 단백질 및 펩티드의 크로마토그래피적 행동 방식에 영향을 미친다. 이들 인자들로는 리간드 구조, 리간드 밀도, 샘플 특성, 유속, 염석 효과, 이온 강도, 온도 및 pH를 들 수 있다. 소수성 컬럼 수지의 실예는 페닐세파로스^?6 패스트 플로우이다. 소수성 흡착제에 결합된 물질은 예를 들어, 컬럼위를 통과시킴으로써 컬럼으로부터 제거된다.

소수성 상호 반응 크로마토그래피에 이어서, 키틴 디아세틸라제를 함유하고 있는 용액은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. 이온 교환기는 이온이 정전기적으로 결합되는 화학적으로 하전된 기를 가지고 있는 고체 지지체이다. 음으로 하전된 기는 양이온을 교환시킬 것이고 따라서 양이온 교환기이다. 양으로 하전된 기는 음이온을 교환시킬 것이고 따라서 음이온 교환기이다. 이온 교환기들은 강 또는 약 이온 교환기로서 특징지어질 수 있다. 강 이온 교환기들은 넓은 pH 범위에 걸쳐서 작용하며, 따라서 이온화를 위해 매우 낮은 또는 높은 pH를 필요로 하는 약하게 이온화된 물질을 분리하는데 유용하다.

소수성 컬럼으로부터 제거된 물질의 pH는 약 8로 조정되며 강한 음이온 교환 컬럼 (예컨대 Q 세파로스^?패스트 플로우) 위로 통과한다. 분획들은 수집되어 하기 실시예 단원에서 설명되는 바와 같이 키틴 디아세틸라제 활성에 대하여 검정된다. 키틴 디아세틸라제 활성을 가지고 있는 분획들은 모아져서 이 모아진 분획의 pH가 약 3.5로 조정된다. 그런 다음 이 용액이 강한 양이온 교환 수지를 함유하고 있는 컬럼(예컨대, S 세파로스^?패스트 플로우)을 통과하게 되고 통과한 흐름액이 수집된다. 이것을 플리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석하였을 때, 흐름 통과 분획은 전기영동적으로 균일한 단백질 종을 함유한다. 용어 "본질적으로 순수한"이란본원에서는, 겔 전기영동에 의해 분석되는 때 실질적으로 단일 밴드로서 용해되는 키틴 디아세틸라제 제제를 말한다.

두번째 정제 방법에서, 본 발명자들은 키틴 디아세틸라제와 특이적으로 반응하는 정제된 면역글로불린을 사용하였다. 원하는 성질을 갖는 면역 글로불린은 본질적으로 순수한 키틴 디아세틸라제를 가지고 있는 동물을 면역시킴으로써 생성될 수 있다. 원하는 성질을 갖는 면역글로불린은 면역흡착제를 형성하기 위하여 고체 지지체에 부착될 수 있다. 그런 다음 면역 흡착제는 종래 방법에 의하여 미정제 추출물로부터 효소를 정제하기 위하여 사용될 수 있다.

상술된 바와 같이 제조된 키틴 디아세틸라제는 키틴은 키토산으로 전환시키기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 효소 활성에 영향을 주는 반응 파라미터들은 하기에서 논의된다. 본 발명의 기초를 이루는 발견전에 당해 기술 분야에서는 다양한 유기체가 키틴을 아세틸이탈시키고, 이로써 키틴을 키토산으로 전환시키는 능력을 가지고 있는 효소를 생성한다는 것이 알려져 있었다. 이 효소, 일반적으로 키틴 디아세틸라제로 언급되는 효소는 예를 들면 뮤코르 속, 피코마이세스 속, 아브시디아 속, 및 코아네포라 속을 포함하는 다양한 속에 의해 생성된다. 다른 잠재적으로 유용한 속으로는 지고르힌쿠스 속, 악티노뮤코르 속, 키르시넬라 속, 리조푸스 속, 콜레토트리쿰 속 및 리조뮤코르 속이 있다.

키틴 디아세틸라제에 대한 바람직한 공급원은 진균류 균사체의 세포벽이다. 이런 균사체는 발효 산업의 부산물로서 다량으로 생산된다. 표준발효기에서의 뮤코르 로욱시의 성장은 문헌에 기재되어 있다.

ii) 재조합 DNA 기법에 의한 키틴 디아세틸라제 제조

재조합 DNA 기법에 의하여 키틴 디아세틸라제 활성을 갖는 효소를 제조하는 것은 이 효소가 자연적으로 생성되는 유기체로부터 효소를 정제하는 것을 능가하는 많은 장점을 제공한다. 예를 들면, 재조합 기법을 사용함으로써 대장균과 같은 특성 확인이 잘 되어 있는 시스템에서 효소를 제조하는 것이 가능하다. 이런 박테리아 세포의 사용은 뮤코르 로욱시와 같은 잘알려져 있는 키틴 디아세틸라제 생성기와 비교하여 더 좋은 장점들을 제공한다.

재조합 DNA 기법에 의하여 키틴 디아세틸라제를 제조하기 위해서는, 먼저 디아세틸라제를 코딩하는 유전자를 단리하는 것이 필요하다. 하기에 설명하는 실시예 4는 상기 유전자의 단리를 이루기 위해 수행된 실험을 설명한다. 아미노 말단 아미노산 서열은 상술된 바와 같이 제조된 효소의 본질적으로 순수한 제제를 분석하기 위한 종래의 생화학적 기법을 사용하여 측정되었다. DNA 서열도 측정되었고 서열 번호: 1로 표시된다. 서열 번호: 1에 개시된 DNA 서열은 하기 설명되는 방법에 의해, 또는 중합효소 사슬 반응 증폭 방법을 사용함에 의해 단리될 수 있다. 그러한 증폭 반응에 사용될 프라이머 서열은 하기 열거되는 DNA 서열을 참조하여 측정될 수 있다.

본 발명의 범주는 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 번호: 1로 표시되는 DNA 서열에 혼성화화는 능력에 의해 특징지어지는, 키틴 디아세틸라제 활성을 가지고 있는 효소, 또는 그것의 생물학적 활성 부분을 코딩하는 단리된 DNA 서열을 포함한다. 엄격한 혼성화 조건하에서 열거된 서열들과 혼성화하는 DNA 서열들은 열거된서열에 완전히 상보성이거나 또는 고도로 상동성이다. 본원에서 사용되는 상동성이란 열거된 서열과는 상이하지만, 그 차이가 실질적으로는 코딩된 단백질의 생물학적 활성(즉, 디아세틸라제 활성)에는 영향을 미치지 않는 DNA 서열을 말한다. 엄격한 혼성화 조건의 가능한 한 세트는 50%의 포름아미드, 5×SSPE(1×SSPE는 0.15 M NaCl, 1 mM Na-EDTA, 10 mM Na-인산염, pH 7.0 이다), 5×덴하르드트 용액(0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 피콜), 45℃ 이다.

효소의 생물학적 활성 단편의 확인은 종래 기법에 의하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 효소를 코딩하는 발현 구성물의 부분에서 결실이 생성될 수 있다. 그런 다음 결실 구성물이 발현되고 키틴 디아세틸라제 활성에 대하여 검정된다.

본 발명의 범주에 포함되는 단리된 DNA 서열들은 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 코딩된 디아세틸라제를 다량으로 발현시키기 위하여 사용될 수 있다. 이 목적을 위해, DNA가 적절한 조절 신호를 가지고 있는 원핵 또는 진핵 발현 벡터 안으로 삽입되고, 세포를 형질전환시키기 위해 사용된다. 다양한 적절한 벡터들 및 조절 신호들이 상기 목적을 위해 이미 개발되어 있으며 당업자들에게는 잘 알려져 있다.

종래 기법을 사용함으로써 본 발명의 디아세틸라제는 예를 들어, 대장균에서 총 세포 단백질의 실질적인 비율로 존재할 수 있는 정도로 과잉 발현될 수 있다. 이렇게 실질적인 비율로 발현되고, 이것에 대한 간단한 검정시스템이 수립되어 있는 단백질의 정제는 당업자에게 알려져 있다.

다른 측면으로, 본 발명은 키틴을 키토산으로 전환시키는 방법에 관한 것이다. 특허 청구되는 방법에서, 키토산은 효소, 또는 이것의 생물학적 활성 부분을코딩하는 단리된 DNA 서열이 DNA 발현 구성물로부터 발현되는 재조합 DNA 기법에 의하여 제조되는, 키틴 디아세틸라제 활성을 가지고 있는 효소와 접촉된다. 발명의 이 범주는 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 번호: 1로 표시되는 DNA 서열에 혼성화하는 능력에 의해 특징지어지는 DNA를 사용하는 것 뿐만 아니라, 리조비알 nodB 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 혼성화하는 능력에 의해 특징지어지는 단리된 DNA 서열을 포함한다. nodB 유전자좌에 관련되는 DNA 서열 정보는 공개되어 있고 데이타베이스 서비스에 제출되어 있다. [이러한 간행물의 예는 다음과 같다 : Goethals et al.,Mol. Gen. Genet. 219; 289-298 (1989); Krishnan et al.,Plant Microb. Interact.; Surin et al.,Mol. Microbiol. 2: 173-283 (1988); Rossen et al.,Nucl. Acids Res. 12: 9497 (1984); Evans et al.,Gene 43: 95-101 (1986); Shearman et al.,EMBO J. 5: 647 (1986); Toeroek et al.,Nucl. Acids Res. 12: 9509 (1984); Egelhoff et al.,DNA 4: 241 (1985); Schofield et al.,Nucl. Acids Res. 14: 2891 (1986); Scott,Nucl. Acids Res. 14: 2905 (1986); 및 Vasquez et al.,J. Bacteriol. 173: 1250 (1991)].

본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하기로 한다.

실시예 1 : 키틴 디아세틸라제를 정제하기 위한 제 1의 방법

뮤코르 로욱시의 발효

뮤코르 로욱시를 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (ATCC 24905) 으로부터 얻었다. 이 진균을 바르트닉키-가르시아 및 닉커슨에 의해 설명된 바와 같이 [Bartnicki-Garcia and Nickerson,Bacteriol. 84: 841-858 (1962)], 16리터의 배치에서 최소 배지에서 성장시켰다. 배지를 리터당 2×10⁸의 포자로 접종시키고, 교반한 다음 멸균 공기로 24시간 동안 28℃에서 통기시켰다. 균사체를 중간 로그상에서 여과에 의하여 수확하였다. 배양 결과 리터당 약 20 g 의 균사체(습식 중량)를 수득했다.

키틴 디아세틸아제의 추출 및 정제

400 g 의 균사체를 600 g 의 유리 비드와, 50 mM 의 프리스 HCl(pH 7.8), 100 mM 의 NaCl 및 0.2 mM 의 PMSF를 함유하고 있는 700 ml의 추출 완충액을 1시간 동안 얼음위에서 블렌딩시켜 추출하였다. 추출을 완료한 후, 유리 비드를 정착시키고 제거한 다음, 추출물을 4℃에서 30분 동안 8000 g로 원심분리하였다. 상층액(750 ml)을 미정제 추출물이라 했다.

다음, 미정제 추출물을 50℃로 고정시켜 놓은 수조에서 30분 동안 인큐베이션하고 침전된 물질을 4℃ 에서 30분 동안 8000 g로 원심분리하여 제거하였다. 50℃ 인큐베이션으로부터의 상층액을 황산 암모늄으로 2.1 M 농도로 만들고 침전된 단백질을 10,000 g 에서 45분 동안 원심분리하여 제거하였다. 다음, 상층액(850 ml)을 2.1 M의 황산 암모늄을 함유하는 20 mM의 트리스 HCl(pH 7.5)로 평형시킨 페닐 세파로스^?CL-4B 컬럼(44×230 mm)위에 통과시켰다. 컬럼을 상기한 완충액으로 세척한 후, 보유된 단백질들을 황산 암모늄 농도가 감소되는 2100 ml의 선형 구배로 용출시켰다. 유속은 250 ml/h이었고, 14 ml씩의 분획을 수집하였다. 용출 프로필은 제 1도에 도시된다. 키틴 디아세틸라제 활성은 분획 195-295에서 검출되었고,이것들을 모아서 추가로 정제하였다. 단백질 함량은 UV모니터에서 280 nm 에서 나타났다.

키틴 디아세틸라제 활성을 기질로서 N-아세틸 기가 방사성 표지된 부분적으로 O-히드록시에틸화된 키틴(클리콜 키틴)을 사용하여 평가하였다. 기질 제제 뿐만 아니라 검정 조건은 아라키와 이토의 방법[Araki and Ito,Eur. J. Biochem. 55: 71-78 (1975)]을 아래와 같이 변형시켜서 사용하였다. 검정 혼합물은 pH 4.5의 25 mM 글루탐산 나트륨에 의해 완충된 0.1 mg/ml BSA 를 함유하였다(50℃). 인큐베이션 시간은 50℃에서 30분이었다.

전 단계에서 부분적으로 정제된 키틴 디아세틸라제 활성 샘플을 20 mM 의 트리스 HCl (pH 8)에 대하여 투석한 후, 동일한 완충액으로 평형시켜 놓은 Q 세파로스^?패스트 플로우 컬럼 (26×340 mm) 위를 통과시켰다. 컬럼을 세척한 후, 20 mM 트리스 HCl (pH B)로 완충시킨 NaCl의 선형 구배(2000 ml, 0-0.75 M)를 만들었다. 유속은 300 ml/h 이었고 11.5 ml 씩의 분획을 모았다. 용출 프로필은 제 2도에 도시된다. 키틴 디아세틸라제 활성을 약 0.13 M NaCl에 상응하는 분획 105 내지 150에서 검출하였다. 이들 분획을 추가의 처리를 위해 풀링시켰다.

풀링시킨 분획을 25 mM의 포름산 나트륨 완충액(pH 3.5)에 대해 투석하고, 샘플을 S 세파로스^?패스트 플로우 컬럼(26×280 mm)상에 로딩하였다. 컬럼을 상기 언급한 완충액중의 NaCl의 선형 구배(2000 ml, 0-1.2 M)로 250 ml/h의 유속으로 용출시켰다. 12 ml씩의 분획을 수집하였다. 용출 프로필을 제 3도에 도시한다. 대부분의 키틴 디아세틸라제 활성은 컬럼에 보유되지 않았고 전기영동적으로 균일한 형태로 흐름 통과 분획에서 검출되었다.

정제된 효소의 특성 확인

a) 분자량

정제 스켐의 결과를 하기 표 1에 요약했다. 이 과정으로 정제한 효소는 천연 및 SDS-PAGE에 의해서도 시험되는 바와 같이, 전기영동적으로 균일한 것으로 판단되었다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 구배(5-20%)상에서 효소 밴드는 약 75 kDa의 분자량에 상응하는 거리로 이동하였다. 정제된 키틴 디아세틸라제를 세파크릴^?S-200 HR 상에서 겔 여과시켰을 때 효소는 약 80 kDa의 겉보기 크기를 가지는 단일 피크로서 용출되었고, 그것은 천연 효소가 단량체로서 존재하는 것을 나타낸다.

표 1

키틴 디아세틸라제의 정제

b) 탄수화물 함량

키틴 디아세틸라제가 당단백질이라는 것을 시사하는 여러 증거가 있다. 전기영동 후, 효소 밴드는 폴리아크릴아미드 겔상에서 페리오데이트-쉬프 시약을 사용하였을때 포지티브 염색되었다. 효소는 콘카나발린 A-세파로스^?4B 컬럼에 의해 보유되었고, 약 25 mM에 상응하는 위치에서 α-아밀만노시드의 구배를 사용한 용출에 의하여 단일 피크로서 회수되었다. 하기 표 2에서 알 수 있는 것처럼, 효소의 직접적인 탄수화물 분석은 단백질이 6 잔기의 푸코오스, 85 잔기의 만노오스 및 22 잔기의 N-아세틸글루코사민을 분자당 함유하며 이것은 단백질의 분자량의 약 30%를 차지한다는 것을 나타냈다. 시알산 및 다른 당들은 현저한 양으로 발견되지 않았다.

단당 분석은 기체-액체 크로마토그래피 및 기체-액체 크로마토그래피-질량 스펙트로메트리에 의해 수행하였다. 샘플을 4 M 트리플루오로아세트산중에서 100℃에서 4시간 동안 수행하였다. 분자당 탄수화물의 몰비는 직접적인 탄수화물 및 아미노산 조성 분석에 의해 평가하였다.

표 2

c) 시험관내 번역 생성물의 면역침전

다른 방식으로 키틴 디아세틸라제 폴리펩티드의 크기를 측정하기 위하여, 효소를 코딩하는 mRNA를 시험관내 번역시킨 후, 면역침전시켰다. 균사체(15g, 습식 중량)로부터 추출된 mRNA를 액체 질소 중에서 갈음으로써 초기 로그기(log phase)에서 수확하였다. mRNA를 키르윈 등의 구아니디움티오시아네이트 방법[Chirwin,et al.,Biochem. 18: 5294-5299 (1979)]에 의해 정제한 후 염화 세슘 중에서 한외여과하여 펫릿화하였다. 폴리 (A)⁺RNA (약 120㎍)를 아비브와 레더의 방법에 의해 기재된 바와 같이 올리고 (dT)-셀룰로오스 컬럼에 3회 통과시켜 단리하였다[Aviv and Leder,Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69: 1408-1412 (1972)]. 총 mRNA 의 시험관내 번역은 제조업자의 지시에 따라 누클레아제로 처리된 토끼 망상세포 용해물을 사용하여 수행하였다. 시험관내 번역 생성물은³⁵S-메티오닌으로 표지하였다.

폴리클로날 항혈청을 동일 부피의 프로인트 완전 배지를 사용하여 순수한 키틴 디아세틸라제(500 ㎍, PBS 중의 1 mg/ml)를 유화시킴으로써 제조하였다. 혼합물을 토끼에 예비면역 혈청을 얻은 후 피내 주사하였다. 프로인트 불완전 배지중에서 200 ㎍의 효소로 동물을 재면역시키고 4주 및 6주 후에 출혈시킨 다음 또한 피내 주사하였다. 수득된 항혈청을 ELISA 및 효소 활성 억제 검정에 의해 항-키틴 디아세틸라제 항체의 존재에 대해 모니터링하였다.

시험관내 번역 반응을 완료시킨 후, 10 ㎕의 예비면역 혈청을 첨가하고 반응액을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 반응액에 첨가된 10㎕의 단백질 A-세파로스^?에 대해 흡착시킨 후 단백질 항원-항체 복합체를 원심분리하여 제거하였다.그런 다음 특이한 폴리클로날 항혈청(10 ㎕)을 상층액에 첨가하고 계속해서 상술한 바와 같이 인큐베이션하였다. 새로운 항원-항체 복합체를 원심분리에 의하여 단백질 A-세파로스^?를 사용하여 수집한 후, 20 부피의 25 mM 트리스 HCl(pH 7.5), 150 mM의 NaCl을 사용하여 재현탁에 의하여 3회 세척하고 펠릿화하였다. 면역침전을 5분 동안 SDS-PAGE 로딩 완충액중에서 끊인 후, 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 겔을 30분 동안 10%의 아세트산, 30%의 메탄올중에 고정시킨 후, 30분 동안 EN³HANCE^?(New England Nuclear)중에서 인큐베이션한 다음, 건조시키고 노출시켰다.

시험관내 번역 생성물을 12%의 SDS 폴리아크릴아미드상에서 분석한 후, 자동 방사선 사진법에 의해 분석하였다. 특이한 항혈청에 의해 면역침전된 물질은 약 49000 kDa에 상응하는 하나의 밴드를 보였고 이것은 어떠한 후-번역 변형전의 폴리펩티드 사슬의 크기를 나타낸다.

d) 효소 활성의 특성 확인

효소 활성의 최적 온도는, 상술된 바와 같이 기질로서 표지된 글리콜키틴을 사용하여 약 50℃인 것으로 평가했다. 키틴 디아세틸라제 활성의 온도 의존성은 제 1도에 그래프로 도시되어 있다. 최적 pH는 제 2도에 그래프로 도시한 바와 같이, 중복하는 완충액의 조합으로 시험한 결과 약 4.5인 것으로 평가되었다. 키틴 디아세틸라제(5 mU)는 부분적으로 화학적으로 아세틸이탈된 키토산(81%) 1 mg과 1 시간 동안 인큐베이션되었을 경우, 아세틸이탈 정도가 약 5.3% 증가된 것에 상응하는 0.22 μmol의 아세트산을 방출하였다. 효소는 또한 미정질 키틴(콜로이드상 키틴)및 카르복시메틸 키틴(가용성 유도체)에 대해 활성이었다.

e) 아미노산 조성

키틴 디아세틸라제의 아미노산 조성은 하기 표 3에 나타낸다. 염기성 아미노산은 총 아미노산의 단지 약 8%만을 차지하였고 이 값은 평균보다 약 40% 더 낮았다.

정제된 키틴 디아세틸라제의 아미노산 조성을, 100℃에서 6M HCl을 사용하여 24시간 가수분해한 후에 측정하였다. 이 값은 2가지 상이한 샘플 측정의 척도이다. 단백질의 분자당 잔기들의 수는 mRNA의 시험관내 번역으로부터의 면역침전된 생성물의 SDS-PAGE로부터의 49000 Da의 평가된 분자량을 토대로 하였다.

표 3

실시예 2 : 키틴 디아세틸라제와 반응하는 항체들의 제조 및 정제

성숙한 웅성 백색 뉴질랜드 토끼를, 진균 뮤코르 로욱시로부터 실시예 1에서 설명한 바와 같이 제조한 500 ㎍(PBS 중의 1 mg/ml)의 정제된 키틴 디아세틸라제로 면역화시켰다. 효소를 동일 부피의 프로인트 완전 보조제로 총 1 ml의 부피중에서 유화시키고, 동물에 피내 투여하였다. 추가로 프로인트 불완전 보조제에 유화시킨 키틴 디아세틸라제의 150 ㎍으로 3회의 추가 면역을 4주 간격으로 투여하였다. 가장자리의 귀 정맥으로부터 출혈시킨 시험 혈액을 사용하여 ELISA에 의해 혈청 항체 역가를 모니터링하였다. 대조 혈청을 면역전에 취하였다.

제조된 항혈청의 특이성을 키틴 디아세틸라제 억제 검정법으로 분석하였다. 키틴 디아세틸라제 활성은 수용성 키틴 유도체인 클리콜[아세틸-³H] 키틴으로부터 이탈된 [³H]-아세트산의 방사능을 측정함으로써 측정하였다. 반응 혼합물은 48 ㎍의 글리콜[아세틸-³H] 키틴, 1 mM의 염화 마그네슘, 0.1 mg/ml의 BSA를 함유하였고 총 50 ㎕의 부피중의 25 mM의 글루탐산 나트륨(pH 4.5)으로 완층시켰다. 50℃에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 16 ㎕의 NCl, 4 ㎕의 아세트산 및 80 ㎕의 물을 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. 이 혼합물에 0.5 ml의 에틸아세테이트를 첨가하고, 용액을 볼택스 믹서로 5분 동안 격렬하게 혼합한 다음, 14,000 rpm에서 원심분리하였다. 4.5 ml의 톨루엔-기저 액체 신틸레이션 칵테일을 200 ㎕의 유기 상 용액에 첨가하고 잘 저었다. 용액을 바이알에 옮기고 액체 신틸레이션 카운터로 방사능에 대하여 측정하였다. 1 유니트의 효소가 상술된 조건하에서 분당 글리콜 키틴으로부터 1.0 μmol의 아세트산을 방출한다. 비활성은 단백질 mg 당 효소의 유니트로서 규정하였다. 단백질은 소위 로우리(Lowry) 방법에 의하여 표준으로서 소 혈청 알부민을 사용하여 검정하였다.

항체 역가를 비-경합 ELISA로 모니터링하였다. 키틴 디아세틸라제를 마이크로역가 플레이트(Maxi Sorp, Nunc, Denmark) 상에서 0.05 M 탄산 나트륨과 중탄산 나트륨을 함유하고 있는 "코팅" 완충액(pH 9.6) ml당 2 ㎍으로 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하여 고정시켰다. 웰들을 0.05%의 트원 80 수용액으로 세척한 후, 증류수로 2회 세척하였다. 다음, 웰당 200 ㎕의 블록킹제를 넣고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 블록킹제는 100 ml의 0.010 M PBS(pH 7.4) 중에 용해된 1 g의 소 혈청 알부민이었다. 웰들을 상기와 같이 세척하였다. 양고추냉이 과산화효소에 컨쥬게이션된 항-토끼 IgG를 사용하여 고정된 키틴 디아세틸라제에 결합된 특이성 IgG를 간접적으로 검출하였다. 컨쥬게이트를 0.010 M PBS(pH 7.4) 중에 10,000 배로 희석하고 웰당 100 ㎕로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 상기와 같이 물/트윈 80으로 세척한후, 증류수로 2회 세척하였다. 웰을 흡인시키고 사용직진에 제조한 100 ㎕의 기질/발색단 용액과 함께 다음과 같이 인큐베이션하였다: 반응을 웰당 50 ㎕의 4 M 황산을 첨가함으로써 15분 후에 중지시켰다. 흡광도는 450 nm에서 ELISA 판독기를 사용하여 읽었다. 규정된 양의 정제된 키틴 디아세틸라제의 효소 활성은 다양한 양의 항혈청과 인큐베이션한 후에 측정하였다. 이들 실험으로 항혈청의 성분이 키틴 디아세틸라제와 특이적으로 반응하였음을 확인하였다.

IgG를 제조업자의 지시에 따라 브롬화 시아노겐-활성화된 세파로스 4B(파마시아 주식회사)에 고정된 키틴 디아세틸라제를 사용하여 토끼 혈청으로부터 친화성-정제하였다. 10 mg의 정제된 키틴 디아세틸라제를 함유하는 용액을, 0.1 M의 중탄산 나트륨 및 0.5 M의 염화 나트륨을 함유하는 2 리터의 "커플링 완충액"(pH 8.3)에 대해 투석하였다. 커플링 완충액으로 평형화시켜 놓은 미리 팽창시켜 놓은 브롬화 시아노겐-활성화된 세파로스 4B를 키틴 디아세틸라제(겔 ml당 1.4 mg의 단백질)와 밤새 4℃에서 회전시킴으로써 혼합하였다. 이 혼합물을 소결된 유리 깔때기에 옮기고 진공하에서 건조하게 흡인시켰다. 유체를 회수하여 커플링 효율을 평가하기 위하여 단백질에 대해 검정하였다. 겔을 커플링 완충액으로 철저하게 세척하고 상기와 같이 2시간 동안 실온에서 트리스-HCl 완충액(0.1 M, pH 8.0)과 혼합하였다. 겔을 건조하게 흡인시키고 커플링 완충액으로 세척하였다. 겔에 비공유적으로 흡착된 단백질을, 겔을 낮은 pH의 완충액(0.1 M 아세트산 나트륨, 0.5 M 염화 나트륨, pH 4.0) 및 높은 pH의 완충액(0.1 M 트리스, 0.5 M 염화 나트륨, pH 8.3)으로 번갈아 세척함으로써 제거하였다. 키틴 디아세틸라제-결합된 세파로스 4B를 미니 컬럼에 옮기고 0.02%의 아지드화 나트륨을 함유하고 있는 0.025 M 트리스-HCl(pH 7.4)로 세척하면서 4℃에서 보관하였다. 용액중의 항체의 농도는 1 cm 경로 길이 셀을 사용하여 1 mg/ml의 단백질에 대하여 1.4의 항체에 대한 평균 흡광도 계수를 사용하여 A₂₈₀을 측정함으로써 평가할 수 있다.

다양한 출혈물로부터 수득한 키틴 디아세틸라제에 대한 토끼 항혈청을 40% 포화 황산 암모늄을 사용하여 별도로 침전시켰다. 면역글로불린을 함유한 침전물을용해시키고 0.025 M 트리스, 0.2 M 염화 나트륨 (pH 7.4)에 대하여 집중적으로 투석한 후, 계속해서 키틴 디아세틸라제-결합된 세파로스 4B 컬럼(프로테아제 억제제를 포함하고 있음)을 통과시켰다. 겔을 10 컬럼 부피의 0.025 M 트리스, 0.1 M 염화 나트륨(pH 7.4)으로, 수집된 분획들이 280 mm에서 무시해도 좋을 만한 판독값을 제공할 때까지 세척하였다. 비-특이적으로 결합된 단백질들은 0.025 M 트리스, 0.1 M 염화 나트륨(pH 7.4)으로 용출시켰다. IgG의 배치는 2 컬럼 부피의 0.1 M 글리신-염산 완충액(pH 2.8)으로 용출시켰다. 친화성이 더 높은 IgG의 추가의 배치는 2배 컬럼 부피의 0.2 M 글리신-염산, pH 2.2로 용출시켰다. 본원에서 사용된 용어, 친화성은 폴리클로날 항체를 사용함에 따른 기능적 친화성(아비디티)을 말한다. 모든 분획들을 1M 트리스-HCl(pH 9.0)을 사용하여 즉시 pH 7.0으로 조정하였다. IgG 분획들의 2개의 집단을 별도로 모아서 한외여과에 의해 농축한 후, 0.025 M의 트리스(pH 7.4)에 대해 투석하였다. 정제된 특이성 IgG는 SDS-PAGE에서 특징적인 토끼 IgG 패턴을 나타냈다. 순수한 특이성 IgG를 -20℃에서 0.010 M 트리스, 0.1 M 염화 나트륨(pH 7.4)중에서 1 mg/ml 이상의 농도로 보관했다.

브롬화 시아노겐-활성화된 세파로스 4B에 대한 키틴 디아세틸라제의 커플링은 90% 효과적이었으며, 겔의 ml 당 1.4 mg 의 키틴 디아세틸라제에서 키탄디아세틸라제-결합된 세파로스 4B를 생성하였다. 본 발명의 방법에 의해 약 2.0-6.5 mg 의 순수한 특이성 IgG를 매 10 ml의 항혈청으로부터 pH 2.8의 용출(황산 암모늄 침전 후 총 단백질의 2.0% 내지 5.0%)을 사용하여 단리하였다. 단리된 총 특이성 IgG는 황산 암모늄 침전 후 총 단백질의 4.5% 내지 8.0%를 나타냈다. 항-키틴 디아세틸라제 항체에 대한 키틴 디아세틸라제-결합된 세파로스 4B의 결합 능력을 겔 ml당 1.4 mg 의 IgG에서 측정하였다.

실시예 3 : 키틴 디아세틸라제를 정제하기 위한 제 2의 방법

실시예 1에서 제조된 바와 같은 냉동된 균사체 2 g을 해동시킨 후 갈아서 0.5 mM PMSF, 0.1 mM NEM 및 150 mM NaCl를 함유하고 있는 0.05 M 트리스-HCl 완층액(pH 7.4) 10 ml 중에서 즉석의 유리-비드 밀러(젖은 균사체 g당 유리 비드 2 g)를 사용하여 균질화시켰다. 모든 단계들은 4℃에서 수행하였다. 그 결과 생성된 균질화물을 10,000 rpm으로 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상층액(12.2 ml; 4.6 mg/ml; 56.0 mg)을 미정제 추출물이라 하였다. 다음, 추출물을 50℃로 설정한 수조에서 15분 동안 인큐베이션한 다음 얼음위에서 신속하게 냉각시켰다. 침전된 단백질을 35,000 rpm으로 45분 동안 4℃에서 원심분리하였다.

실시예 2에서 설명한 바와 같은 순수한 저친화성의 토끼 IgG 5 mg을 커플링 완충액(pH 8.3)에 대해 투석한 후, 5 ml의 팽창된 CNBr-활성화된 세파로스 4B와 혼합시켜 면역흡착제를 제조하였다. IgG를 키틴 디아세틸라제 커플링에 대하여 기재된 방법에 의하여 커플링시켰다. 활성화된 세파로스 4B에 대한 IgG의 커플링은 85%의 효율을 나타냈고, 겔 1 ml 당 1 mg의 IgG에서 IgG-결합된 세파로스를 생성하였다. 이 면역흡착제는 키틴 디아세틸라제 정제에 사용하였다.

상기 상층액(11.5 ml; 0.54 mg/ml; 6.2 mg)을 미리 150 mM NaCl을 함유하는 25 mM 트리스-HCl 완충액(완충액 A)으로 평형시켜 놓은 면역흡착제(2×1.6 cm; 5 ml 크기의 컬럼에 충전됨)상에 로딩하였다. 컬럼을 완충액 A로 280 nm에서의 흡광도가 유출물(비-특이적으로 결합된 단백질은 1 M NaCl 중에서 25 mM 트리스-HCl, pH 7.4로 용출되었다)에서 나타나지 않을 때까지 세척하였다. 특이적으로 결합된 키틴 디아세틸라제를 0.2 M 글리신-HCl, pH 2.8 완충액을 사용하여 35 ml/h의 유속에서 용출했다. 용출물을 즉시 1 M 트리스-HCl, pH 9.0을 사용하여 pH 7.0으로 조정하고, 완충액 A에 대해 투석한 다음, 한외여과하여 농축시켰다(300 ㎕; 40 ㎍/ 12 ㎍; 180 mU).

면역흡착에 의한 키틴 디아세틸라제의 침전(표 4)은 흡착된 효소에 대하여 1500 mU/mg의 비활성 및 약 30%의 수율을 생성하였다. SDS-PAGE에 의한 키틴 디아세틸라제 순도의 평가는 단일 밴드를 나타냈다. 종래의 방법에 의한 키틴 디아세틸라제의 정제(표 1)로 3.23 유니트/mg 의 비활성 및 11.8%의 수율을 가지는 순수한 효소를 제조했다. 면역흡착제의 최대 결합 능력을 겔 ml 당 42 ㎍의 키틴 디아세틸라제에서 측정하였다(4%의 항원 결합 부위들은 매트릭스에 대한 공유 고정화후에도 활성 상태를 보유했다).

표 4

면역흡착에 의한 키틴 디아세틸라제의 정제

실시예 4

키틴 디아세틸라제의 정제된 제제에 대하여 종래의 기법에 의하여 아미노산 말단 서열 분석을 수행하였다. 아미노산 서열 정보를 토대로, 변성 올리고누클레오티드를 합성하였고, 키틴 디아세틸라제 mRNA에 대응하는 cDNA 클론을 뮤코르 로욱시 cDNA 라이브러리로부터 단리하였다. cDNA 서열을 측정하고 이 서열을 서열 번호: 1로 나타냈다.

키틴 디아세틸라제의 추론된 아미노산 서열을 사용한 EMBL 데이타 뱅크의 연구는 다양한 리조비알 종의 nodB 단백질과 상당한 유사성을 나타냈다. 모든 공지의 nodB 단백질 서열 및 키틴 디아세틸라제 서열을 사용한 다중 서열 배열은 가장 가치있는 유사성을 나타냈다.

nodB 단백질 서열(약 215 아미노산 길이)은 조사된 모든 리조비알 종 사이에서 잘 보존었으며, 동일성 범위는 37-67%이고, 총 유사성 범위는 55-76%이었다. 키틴 디아세틸라제는 훨씬 더 긴 폴리펩티드(400 아미노산)이며 nodB 유전자 생성물에 상동성(31%까지의 동일성, 50%의 유사성)을 나타내는 영역은 분자의 중심 부분에 위치했다. 아미노 말단(1-121 아미노산) 및 카르복시 말단(약 50%)은 키틴 디아세틸라제에서 보존되어 있었다. 대조적으로, 9개의 예상된 N-글리코실화 부위중 6개가 키틴 디아세틸라제의 비-보존된 도메인에서 발견되었고, 이것은 이들 글리코실화된 도메인들이 세포벽 생합성에서 효소의 특정화된 기능에 중요한 것임을 시사했다.

균등물

당업자들은 단지 기본적인 실험을 사용하며 본원에 기재된 특정 구체예에 대한 많은 균등물이 있음을 알거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이들 및 다른 동등물들은 하기의 특허 청구의 범위에 포함된다.

서열 목록

Claims

a) 키틴 디아세틸라제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 서열 번호: 1의 핵산 서열, 또는 이것의 효소적으로 활성인 단편 또는 유사체,

b) 서열 번호: 1의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 필수 성분으로 하는 핵산 서열, 및

c) 도 6에 도시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열로 구성된 군으로부터 선택된, 단리된 핵산 서열.
제 1 항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
제 2 항의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 세포.
제 3 항에 있어서, 원핵세포임을 특징으로 하는 세포.
제 4 항에 있어서, 대장균(E. coli)임을 특징으로 하는 세포.
제 4 항에 있어서, 진핵세포임을 특징으로 하는 세포.
키틴을 키틴 디아세틸라제 활성을 갖는 효소와 접촉시키는 것을 포함하는,키틴을 키토산으로 전환시켜 키토산을 제조하는 방법으로서, 효소가 효소를 코딩하는 제 1항의 핵산 또는 이것의 생물학적 활성 부분을 재조합 벡터로부터 발현시키는 재조합 DNA 기법에 의해 제조되는 방법.
제 7 항에 있어서, 단리된 핵산이 리조비알 nodB 단백질을 코딩함을 특징으로 하는 제조 방법.
a) 제 1 항의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드, 및

b) 도 6에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드로서, 키틴 디아세틸라제 활성을 갖는 폴리펩티드.
제 9 항에 있어서, 재조합 폴리펩티드임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 10 항의 재조합 폴리펩티드와 키틴을 접촉시켜, 키틴을 키토산으로 전환시키는 것을 포함하는 키토산의 제조 방법.
a) 제 3 항의 형질전환된 세포를 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건에서 배양하여 배양 생성물을 수득하는 단계, 및

b) 단계 a)에서 수득한 배양 생성물로부터 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는 키틴 디아세틸라제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조 방법.