JPH09501301A - キチンデアセチラーゼをコード化するｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 キチンのキトサンへの転化の触媒反応を行う（すなわち、キチンデアセチラーゼ活性を有する）ムコル ロウキシイ（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）中に存在する酵素のＤＮＡ配列が開示される。前記ＤＮＡ配列は本発明のキチンデアセチラーゼと幾らかの相同性を示すリゾビウムのＮｏｄＢ蛋白質をコード化することがある。

Description

【発明の詳細な説明】 キチンデアセチラーゼをコード化するＤＮＡ 発明の背景 キチンはセルロースに次ぎ世界で最も豊富で、簡単に取得でき、そして再生可 能な生物学的材料である。キチンは多種多様な生物体により合成される天然産物 である。年間数兆トンものこの材料が産生されている。キチンは炭水化物ポリマ ー、すなわちβ（１→４）結合したＮ−アセチルグルコサミンのＮ−アセチル化 ポリマー、すなわちポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンである。植物においてキチ ンはセルロースに代わる細胞壁構成成分であるか、あるいは時としてセルロース と同時に存在する。動物においては、キチンは通常ある上皮組織表面上の角質と して編成されている。構造的にはセルロースに類似するものの、キチンは明らか に異なる化学特性を有する。キチンは極端な不溶性材料であるため工業上の適用 性が制限されている。 キチンの脱アセチル化誘導体であるキトサンは広範囲で興味深い多数の実際的 適用法を有するずっと扱い易い材料である。キトサンは陽性に帯電しており、そ のため蛋白質沈殿物および金属キレート剤として使用することができる。これは 、溶液、ゲル、膜、フィルム、もしくは線維として製剤することができる。この ような製剤は、例えば貴金属の再生、作物保護、クロマトグラフィー、および酵 素固定の分野において有用である。キトサンは生物学的に良性な非免疫原性材料 であるため、農学、食品、薬剤、および化粧品工業における利用にとって理想的 なものとなっ ている。このキトサンは、コラーゲンおよびケラチンのような他の天然のポリマ ーと複合体を形成して独特な生物医学的な特性を有する材料を形成することが可 能である。例えばこのような材料を、創傷治癒促進剤、人口皮膚および血管の構 成成分、抗凝血剤、ならびに薬剤放出を制御するための賦形剤として使用するこ とができる。 最近では世界中で産生される大部分のキトサンは甲殻類の甲羅材料から調製さ れている。キチンは約２０−５０％の乾燥重量の甲殻類の角質を含み、残りのも のは主に炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、およびその他の蛋白質である。キ チンは最初に礎甲殻類の甲羅を希釈した酸およびアルカリで処理して蛋白質と無 機物を除去することにより単離される。その後に生のキチンを高温下で濃厚なア ルカリに対してさらすことによって脱アセチル化させてキトサンを生成する。こ の様式において生成されるキトサンは多くの有用な特徴を有するものの、この生 成過程を効果的に調節することは不可能であり、そのため広範囲にわたる分子量 を有し、かつ脱アセチル化の程度が不均一である材料が生成されてしまうことに なる。このような産物は価値の高いものとはならず、それは多くの恐らく重要と 思われる適用法、具体的には生物医学的な領域における適用法が非常に特異的な 物理学的および化学的特徴を有する均一材料を必要とするためである。発明の要約 本発明は、キチンのキトサンへの転化の触媒反応を行う酵素をコード化する単 離されたＤＮＡ配列に関する。具体的な態様は、緊縮ハイブリッド形成条件下で 配列番号１に示されるＤＮＡ配列とハイブリダイズする能力を特徴とするＤＮＡ 配列を含む。本発明はまた、上記特異性を有す る酵素、もしくはその生物学的活性部分をコード化するＤＮＡ発現構築物にも関 する。 本発明はまた、キチンをキチンデアセチラーゼ活性を有する酵素と接触させる ことによってキチンをキトサンへと転化するための方法にも関する。この方法に おいては、この酵素は、この酵素もしくはその生物学的活性部分をコード化する 単離されたＤＮＡ配列をあるＤＮＡ構築物から発現させる組換えＤＮＡ技術によ り産生される。図面の簡単な記述 図１は、フェニルセファロース（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標 ）ＣＬ−４Ｂカラムからの溶出曲線を示す図である。 図２は、Ｑセファロース（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌ ｏｗカラムからの溶出曲線を示す図である。 図３は、Ｓセファロース（Ｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌ ｏｗカラムからの溶出曲線を示す図である。 図４は、キチンデアセチラーゼ活性の温度依存性を示す図である。 図５は、キチンデアセチラーゼ活性のｐＨ依存性を示す図である。 図６は、ムコル ロウキシイ（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）のキチンデアセチ ラーゼのＤＮＡ配列および演繹されるアミノ酸配列を示す図である。このＤＮＡ 配列は配列番号１においても示される。発明の詳細な記述 ｉ） キチンデアセチラーゼの精製 本発明は、キチンデアセチラーゼを産生する生物体の細胞性抽出物からキチン デアセチラーゼを精製するための方法の発見により可能になった。この酵素キチ ンデアセチラーゼは、例えばムコル（Ｍｕｃｏｒ）、 フィコマイセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、アビシディア（Ａｂｉｓｉｄｉａ） 、およびコアネフォラ（Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ）を初めとする多様な属により 産生される。恐らく有用と思われる他の属には、チゴルヒンクス（Ｚｙｇｏｒｈ ｙｎｃｈｕｓ ）、アクチノムコル（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）、キルキネラ（Ｃ ｉｒｃｉｎｅｌｌａ ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、コレトトリクム（Ｃｏ ｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ）、およびリゾムコル（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）があ る。 キチンデアセチラーゼの好ましい源は真菌類の菌糸体の細胞壁である。このよ うな菌糸体は発酵工場の副産物として大量に産生される。標準的発酵槽によるム コル ロウキシイ（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）の増殖は刊行物に記載されてい る。ムコル ロウキシイ（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）のような真菌類の利用に より数々の利点が提供される。この生物体は安価な栄養源を使用して増殖させる ことができる。この生物体は大容量の発酵系において高細胞密度（培養培地のリ ットル当たりの細胞乾燥重量のグラム数）にまで増殖させることができる。高細 胞密度を達成するのに必要な培養時間は１２時間／バッチ程の短いものである。 最初に細胞抽出物をキチンデアセチラーゼを産生する生物体から調製する。例 えばその生物体が真菌類（ムコル ロウキシイ（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）を 一例とする）である場合には、菌糸体細胞を抽出用緩衝液の存在下で破壊する。 この抽出用緩衝液は、酵素活性を維持し、かつその抽出を容易にさせるためにプ ロテアーゼ阻害剤、他の変性性酵素阻害剤、および安定剤を含むことができる。 不溶性材料は、濾過もしくは遠心を例とする方法により抽出混合物の液相から除 去する。 この細胞性抽出物を熱サイクル段階に供すると、所望されない蛋白質 （例えば、キチンデアセチラーゼ以外の蛋白質）の沈殿がもたらされる。例えば 、以下の実施例に記載されるように、この抽出物を約５０℃で約１５−２０分の 期間インキュベートすることができる。沈殿した蛋白質をその後、濾過もしくは 遠心を例とする方法により除去する。 高塩濃度を有する溶液中の蛋白質の可溶性特性は広範囲にわたり変化すること が良く知られている。この溶解度の違いを活用して、高イオン強度下での沈殿に より溶液中での蛋白質の分離を達成することができる。この目的には多くの塩を 使用することができるが、感知できる程ｐＨを変えることがなく、溶解度が高く 、そして蛋白質を不安定化させることがないという事実のために硫酸アンモニウ ムが好ましい。 発明者らは、約２．１Ｍの硫酸アンモニウム濃度がキチンデアセチラーゼを沈 殿させることなく上記液相から多種多様な蛋白質を効果的に沈殿させることを発 見した。約２．１Ｍの硫酸アンモニウム濃度で沈殿する蛋白質は標準法（例えば 、濾過もしくは遠心）によりその溶液から除去される。 硫酸アンモニウム沈殿の後に回収される液相を疎水性相互作用クロマトグラフ ィーに供する。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、巨大分子が非帯電性ゲル マトリックスに結合させてある疎水性基との疎水性相互作用の強度を変化させる ことに基づく巨大分子の精製のために広く利用されている。この技術は通常中程 度に高い濃度の抗−カオトロピック塩の存在下において実施する（塩促進性吸着 クロマトグラフィー）。数々の因子が疎水性吸着剤上の蛋白質およびペプチドの クロマトグラフィー挙動に影響を及ぼす。これらの因子には、リガンド構造、リ ガンド密度、試料の特徴、流速、塩析効果、イオン強度、温度、およびｐＨがあ る。疎水性カラム樹脂の例はフェニルセファロース（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅ）（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗである。疎水性吸着剤に結合する材 料をカラム全体に、例えば水を通すことによりカラムから除去する。 疎水性相互作用クロマトグラフィーの後には、キチンデアセチラーゼを含むこ の溶液をイオン交換クロマトグラフィーにより更に精製する。イオン交換体はイ オンが静電的に結合する化学的に結合させた荷電基を有する固体支持体である。 陰性荷電基は陽性イオンを交換するであろうし、そしてカチオン交換体である。 陽性荷電基は陰性イオンを交換するであろうし、そしてアニオン交換体である。 イオン交換体は、強イオンもしくは弱イオン交換体としての特徴を有することが できる。強イオン交換体は広範囲のｐＨにわたって機能をなし、そしてそのため イオン化用に非常に低いもしくは高いｐＨを必要とする弱イオン化物質を単離す るのに有用である。 疎水性カラムから回収される物質のｐＨを約８に調整し、そして強イオン交換 カラム（例えば、Ｑセファロース（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標） Ｆａｓ ｔ Ｆｌｏｗ）に通す。各分画を回収し、そして以下の実施例の項に記載される 要領でキチンデアセチラーゼ活性についてのアッセイを行う。キチンデアセチラ ーゼ活性を保持する分画を合わせ、そして合わせた分画のｐＨを約３．５に調整 する。その後にこの溶液を強カチオン交換樹脂を含むカラム（例えば、Ｓセファ ロース（Ｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標） Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）に通し、そ して素通り分画を回収する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したと ころ、この素通り分画は電気泳動的に均一な蛋白質種を含む。本明細書 において用いられる用語「本質的に純粋な」は、ゲル電気泳動により分析する際 に単一バンドとして実質的に分離するキチンデアセチラーゼ調製物を意味する。 第二の精製法においては、本発明者らは、キチンデアセチラーゼとの特異的反 応性を示す精製済み免疫グロブリンを利用した。所望の特性を有する免疫グロブ リンは、本質的に純粋なキチンデアセチラーゼで動物を免疫することにより産生 することができる。所望の特性を有する免疫グロブリンを固体支持体に結合させ て免疫吸着剤を形成することができる。その後この免疫吸着剤を用いて常法によ り未精製抽出物からこの酵素を精製することができる。 本明細書に記載される要領で精製したキチンデアセチラーゼは、キチンをキト サンへと転化するための方法において使用することができる。酵素活性に影響を 及ぼす反応パラメーターは実施例において検討される。本発明の基盤を形成する 発見の前に、当該技術分野においては多様な生物体がキチンを脱アセチル化させ 、そのことによりキチンをキトサンへと転化させる能力を有する酵素を産生する ことが知られていた。一般的にキチンデアセチラーゼと称されるこの酵素は、例 えばムコル（Ｍｕｃｏｒ）、フィコミセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、アブシデ ィア（Ａｂｓｉｄｉａ）、およびコアネフォラ（Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ）を初 めとする多様な属により産生される。おそらく有用と思われる他の属には、チゴ ルヒンクス（Ｚｙｇｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）、アクチノムコル（Ａｃｔｉｎｏｍｕ ｃｏｒ ）、キルキネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ）、コレトトリクム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、およびリゾムコル（Ｒ ｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ）がある。 キチンデアセチラーゼの好ましい源は真菌類の菌糸体の細胞壁である。このよ うな菌糸体は発酵工場の副産物として大量に産生される。標準的発酵槽によるム コル ロウキシイ（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）の増殖が刊行物に記載されてい る。 ｉｉ） 組換えＤＮＡ技術によるキチンデアセチラーゼの産生 組換えＤＮＡ技術によるキチンデアセチラーゼ活性を有する酵素の産生により 、この酵素を天然の状態で産生する生物体からこの酵素を精製することに関する 多様な利点が提供される。例えば、組換え技術を用いることにより大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のように十分な性質決定が行われている系内でその酵素を産生させ ることが可能になる。この細菌性細胞の利用により、ムコル ロウキシイ（Ｍｕ ｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）のような既知のキチンデアセチラーゼ産生体と比較され る産生上の複数の利点が提供される。 組換えＤＮＡ技術によりキチンデアセチラーゼを産生させる目的では、そのデ アセチラーゼをコード化する遺伝子を単離することが第一に必須である。以下に 記載される実施例４は、この遺伝子の単離を達成する目的で実施した実験を記載 している。アミノ末端のアミノ酸配列を通常の生物化学的技術を用いて決定して 既述の要領で調製された酵素の本質的に純粋な調製物の分析を行った。このＤＮ Ａ配列を決定し、そしてそれを配列番号１に示す。配列番号１に開示されるＤＮ Ａ配列は、以下に記載する方法によるか、あるいはポリメラーゼ連鎖増幅反応を 使用することにより単離することができる。このような増幅反応において用いら れるプライマー配列は、以下のＤＮＡ配列表を参照にすることにより決定するこ とができる。 本発明の態様は、キチンデアセチラーゼ活性を有する酵素もしくはその生物学 的活性部分をコード化する単離されたＤＮＡ配列であって、緊縮ハイブリッド形 成条件下で配列番号１に示されるＤＮＡ配列に対してハイブリダイズする能力を 特徴とする前記ＤＮＡ配列を含む。緊縮ハイブリッド形成条件下で、表に列挙さ れる配列に対してハイブリダイズするＤＮＡ配列は表に列挙されるその配列に対 して完璧な相補性を示すか、あるいはかなり相同性が高いかのいずれかである。 本明細書において用いられる「相同な」は、表に列挙される配列とは異なるが、 その差異がコード化される蛋白質の生物学的活性（すなわち、デアセチラーゼ活 性）に実質的な影響を及ぼさないＤＮＡ配列を意味する。有望な一組の緊縮ハイ ブリッド形成条件は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０ ．１５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＮａ−ＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａ−リン酸、ｐＨ ７．０）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液（０．１％のポリビニ ルピロリドン、０．１％のフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ））、４５℃下、である。 その酵素の生物学的活性断片の同定は常法により行うことができる。例えば、 この酵素をコード化する発現構築物の一部分においては欠失を作製することが可 能である。その後この欠失構造物を発現させ、そしてキチンデアセチラーゼ活性 についてアッセイする。 本発明の範囲内に含まれる単離されたＤＮＡ配列を用いて、原核生物もしくは 真核生物のいずれかの宿主細胞内でこのコード化デアセチラーゼを大量に発現さ せることができる。この目的のためにはそのＤＮＡを適切な調節シグナルと共に 原核生物もしくは真核生物のいずれかの発現ベクター内に挿入し、そしてこれを 細胞の形質転換に用いる。適切なベ クターおよび調節シグナルは多様なものがこの目的用に既に開発されており、そ して当業者に良く知られている。 通常の技術を使用することにより、総細胞性蛋白質の内の実質的な割合を占め る程度にまで、例えば大腸菌内で本発明のデアセチラーゼを過剰発現させること ができる。このような実質的なレベルで発現され、かつ簡便なアッセイ系が確立 されている蛋白質の精製は当業者にとっては簡単な作業である。 他の態様においては、本発明はキチンをキトサンへと転化させるための方法に 関する。特許請求される方法においてはキトサンをキチンデアセチラーゼ活性を 有する酵素と接触させるが、その酵素は、その酵素もしくはその生物学的活性部 分をコード化する単離されたＤＮＡ配列をあるＤＮＡ発現構築物から発現させる 組換えＤＮＡ技術により産生される。本発明のこの態様の範囲には、緊縮ハイブ リッド形成条件下で配列番号１に示されるＤＮＡ配列に対してハイブリダイズす る能力を特徴とするＤＮＡの利用ばかりでなく、リゾビウムのｎｏｄＢ蛋白質を コード化するＤＮＡ配列に対してハイブリッドダイズする能力を特徴とする単離 されたＤＮＡ配列も含まれる。ＮｏｄＡＢＣ遺伝子座に関連するＤＮＡ配列情報 が既に公開されており、そしてデータベース業者に提供されている。このような 刊行物の例には、 本発明は以下に示される実施例により更に詳細に説明される。 実施例 実施例１：キチンデアセチラーゼを精製するための第一方法 ムコル ロウキシイ（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）の発酵 ムコル ロウキシイ（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ ２４９０５）から 取得した。この真菌類は、１６リットルのバッチでＢａｒｔｎｉｃｋｉ−Ｇａｒ ｃｉａおよびＮｉｃｋｅｒｓｏｎ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ８４：８４１−８５ ８（１９６２））により記載される要領で最少培地中で増殖させた。培地をリッ トルあたり２×１０⁸の胞子で接種し、そして２８℃で２４時間滅菌済みの空気 での通気を行った。菌糸体は中間対数期に濾過により回収した。培養物はリット ル当たり約２０グラム（湿潤重量）の菌糸体を生じた。キチンデアセチラーゼの抽出および精製 ４００グラムの菌糸体は、６００グラムのガラス製ビーズと、５０ｍＭのトリ ス ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭのＮａＣｌ、および０．２ｍＭのＰＭＳ Ｆを含む７００ｍｌの抽出用緩衝液とを氷上で一時間混ぜ合わせることにより抽 出した。抽出完了後にはこのガラス製ビーズを沈殿させて除去し、そしてこの抽 出物を４℃、８０００ｇで３０分間遠心した。この上清（７５０ｍｌ）を未精製 抽出物として引用する。 その後この未精製抽出物を５０℃に設定した水浴中で３０分間インキュベート し、そして沈殿物質を４℃、８０００ｇでの３０分間の遠心によ り除去した。５０℃でのインキュベーションからの上清を硫酸アンモニウム中で ２．１Ｍに調節し、そして沈殿した蛋白質を１０，０００ｇ、４５分間の遠心に より除去した。その後上清（８５０ｍｌ）を、２．１Ｍの硫酸アンモニウムを含 む２０ｍＭのトリス ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化させてあるフェニルセファ ロース（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）ＣＬ−４Ｂのカラム（４ ４×２３０ｍｍ）に通した。このカラムを既述の緩衝液で洗浄した後、保持され ている蛋白質を硫酸アンモニウムの減少濃度の直線勾配液２１００ｍｌで溶出さ せた。流速は２５０ｍｌ／時間であり、そして１４ｍｌの各分画を回収した。こ の溶出曲線を図１に示す。キチンデアセチラーゼ活性は分画１９５−２９５に検 出され、これらを更に精製を行うために合わせた。その後に２８０ｎｍでのＵＶ モニターによる蛋白質含有量の決定を行った。 キチンデアセチラーゼ活性は、Ｎ−アセチル基で放射ラベル化した部分的にＯ −ヒドロキシエチル化させたキチン（グリコールキチン）を基質として用いて評 定した。基質の調製法ならびにアッセイ条件は、以下に示す改変を加えながらも ＡｒａｋｉおよびＩｔｏ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５５：７１−７８（ １９７５））により記載される要領に従った。このアッセイ混合物はｐＨ４．５ （５０℃）の２５ｍＭのグルタミン酸ナトリウムにより緩衝化してある０．１ｍ ｇ／ｍｌのＢＳＡを含む。インキュベーション時間は５０℃においては３０分で あった。 前段階からの部分精製済みキチンデアセチラーゼの試料を２０ｍＭのトリス ＨＣｌ（ｐＨ８）に対して透析し、そしてその後同一緩衝液で平衡化させてある Ｑセファロース（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（２６ ×３４０ｍｍ）のカラムに通した。このカラ ムを洗浄した後、２０ｍＭのトリス ＨＣｌ（ｐＨ８）で緩衝化したＮａＣｌの 直線濃度勾配液（２０００ｍｌ、０−０．７５Ｍ）の設定を行った。流速は３０ ０ｍｌ／時間であり、そして１１．５ｍｌの各分画を回収した。この溶出曲線を 図２に示す。キチンデアセチラーゼ活性は〜０．１３ＭのＮａＣｌに相当する分 画１０５−１５０に検出された。これらの分画を更に進んだ操作を加えるために 合わせた。 合わせた分画を２５ｍｌのギ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に対して透析 し、そしてこの試料を同一緩衝液で平衡化させてあるＳセファロース（Ｓ Ｓｅ ｐｈａｒｏｓｅ）（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（２６×３４０ｍｍ）にか けた。このカラムは２５０ｍｌ／時間の流速で既述の緩衝液中のＮａＣｌ（２０ ００ｍｌ、０−１．２Ｍ）の直線濃度勾配液を用いて溶出させた。１２ｍｌの各 分画を回収した。この溶出曲線を図３に示す。大半のキチンデアセチラーゼ活性 はそのカラムには保持されず、そして電気泳動的に均一な形態で素通り分画に検 出された。精製済み酵素の特徴決定 ａ）分子量 この精製概略の結果を表１にまとめてある。この方法により精製された酵素を 天然の状態およびＳＤＳ−ＰＡＧＥの両方により検査したところ電気泳動的に均 一であることが判明した。濃度勾配（５−２０％）ＳＤＳポリアクリルアミドゲ ル上ではこの酵素のバンドは〜７５ｋＤａの分子量に相当する距離に遊走した。 精製済みキチンデアセチラーゼをセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）（商標） Ｓ−２００ ＨＲ上でのゲル濾過に供した際には、これは〜８０ｋＤａの見かけ のサイズを有する単一ピークとして溶出され、このことにより天然の酵素は単量 体として 存在することが示された。 ｂ）炭水化物含量 幾つかの証拠によりキチンデアセチラーゼは糖蛋白質であることが示唆される 。電気泳動後、その酵素のバンドはポリアクリルアミドゲル上で過ヨウ素酸塩− シッフ試薬（Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）により陽性染色を生じる。こ の酵素はコンカナバリンＡ−セファロース（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ−Ｓ ｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）４Ｂのカラムにより保持され、そしてα−メチルマ ンノシドの濃度勾配液での溶出により約２５ｍＭに相当する位置に単一バンドと して回収された。表 ２に示されるように、その酵素の直接的炭水化物分析により、その蛋白質は６残 基のフコース、８５残基のマンノース、および２２残基のＮ−アセチルグルコサ ミンを分子当たりに含んでおり、それらがその分子量の約３０％を占めている。 シアル酸および他の糖は有意な量では見いだされなかった。 単糖の分析は気−液クロマトグラフィーおよび気−液クロマトグラフィー−質 量分析法により実施した。試料を４Ｍのトリフルオロ酢酸内で、１００℃で４時 間加水分解した。分子当たりの炭水化物のモル比は直接的な炭水化物およびアミ ノ酸組成分析により評定した。 ｃ）インビトロでの翻訳産物の免疫沈降法 キチンデアセチラーゼポリペプチド鎖のサイズを別の様式で決定する目的で、 その酵素をコード化するｍＲＮＡをインビトロで翻訳させ、その後に免疫沈降さ せた。ｍＲＮＡは液体窒素内での粉砕により初期対数期に回収した菌糸体（１５ ｇの湿潤重量）から抽出した。ｍＲＮＡはＣｈｉｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉ ｏｃｈｅｍ． １８：５２９４−５２９９（１９７９））のチオシアン酸グアニ ジウム法、およびその後の 超遠心による塩化セシウム中でのペレット化により精製した。ポリ（Ａ）⁺ＲＮ Ａ（〜１２０μｇ）は、ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ ６９：１４０８−１４１２（１９７２））により記載 される要領でオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムに３回通すことにより単離した 。全ｍＲＮＡのインビトロ翻訳は、製造業者の説明書に従ってヌクレアーゼ処理 済みウサギ網状赤血球溶菌物を使用して実施した。インビトロ翻訳産物は³⁵Ｓ− メチオニンでラベル化した。 ポリクローナル抗血清は純粋なキチンデアセチラーゼ（５００μｇ、ＰＢＳ中 １ｍｇ／ｍｌ）を等量のフロインド（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）の完全アジュバンドと 共に乳化させることにより調製した。この混合物をウサギに皮下注射し、その後 に前免疫血清を取得した。この動物は、４週間後および６週間後にフロインドの 不完全アジュバンド中の２００μｇの酵素でやはり皮下注射により再免疫化およ び採血を行った。得られる抗血清をＥＬＩＳＡおよび酵素活性阻害アッセイによ り抗−キチンデアセチラーゼ抗体の存在についてモニターした。 インビトロでの翻訳反応が完了した後、１０μｌの前免疫血清を添加し、そし てこの反応物を室温で３０分間インキュベートした。抗原−抗体複合体は、その 反応物に添加した１０μｌのプロテインＡ−セファロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商標）に対して吸着させた後に遠心により回収した。 その後に特異的ポリクローナル抗血清（１０μｌ）をその上清に添加し、そして この後にこれを既述の要領でインキュベートした。新規の抗原−抗体複合体を遠 心によりプロテインＡ−セファロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ ｅ）（商 標）を用いて回収し、そしてその後に２０倍容の２５ｍＭトリス ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌでの再懸濁およびペレット化により３回洗浄し た。免疫沈降物はＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング用緩衝液中で５分間沸騰させ、 そしてゲル電気泳動により分析した。このゲルを１０％酢酸、３０％メタノール 中で３０分間固定化させ、ＥＮ³ＨＡＮＣＥ（商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社）中で３０分間インキュベートし、そして乾燥および露出を 行った。 インビトロ翻訳産物は１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析し、そ の後にオートラジオグラフィーにかけた。特異的抗血清により免疫沈降させた物 質は〜４９０００ｋＤａの分子量に相当する一本のバンドを示し、これによりい ずれの翻訳後修飾も受ける以前のポリペプチド鎖のサイズが示される。 ｄ）酵素活性の特徴決定 酵素活性の至適温度は、既述の要領で基質としてラベル化グリコールキチンを 用いたところ〜５０℃であると評定された。キチンデアセチラーゼの温度依存性 を図１のグラフに示す。至適ｐＨは重複する緩衝液を組み合わせて用いてテスト したところ図２のグラフにより示されるように〜４．５であると評定された。化 学的処理により部分的に脱アセチル化させた１ｍｇのキトサン（８１％）と共に １時間インキュベートした際に、キチンデアセチラーゼ（５ｍＵ）は〜５．３％ の脱アセチル化の度合いの増加に相当する０．２２μモルの酢酸を放出させた。 この酵素は微細結晶状のキチン（コロイド性キチン）およびカルボキシメチルキ チン（可溶性誘導体）についても活性を示した。 ｅ）アミノ酸組成 キチンデアセチラーゼのアミノ酸組成を表３に示す。塩基性アミノ酸は総アミ ノ酸のわずか〜８％のみを占めており、この値は平均と比較すると〜４０％下回 っている。 精製済みキチンデアセチラーゼのアミノ酸組成を、１００℃での６ＭのＨＣｌ を用いる２４時間の加水分解の後に決定した。この値は２つの異なる試料の決定 値の平均である。この蛋白質の分子当たりの残基数は、ｍＲＮＡのインビトロ翻 訳からの免疫沈降産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥから得られる４９０００Ｄａという推 定分子量に基づいている。 実施例２：キチンデアセチラーゼとの反応性を示す抗体の産生および精製 雌成体のニュージーランド（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）ウサギをムコル ロウ キシイ（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）から実施例１に記載の要領で精製した５０ ０μｇ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）の精製済みキチンデアセチラーゼで免疫化した 。この酵素は総容量１ｍｌ中で等量のフロインドの完全アジュバンドと乳化させ 、そしてこれをその動物に皮下投与した。フロイドの不完全アジュバンド中で乳 化させた１５０μｇのキチンデアセチラーゼの更に３回分のブースター用量を４ 週間の間隔を空けて投与した。耳縁静脈からのテスト血液を用いてＥＬＩＳＡに より血清抗体をモニターした。対照血清は免疫化前に採取した。 産生される抗血清の特異性をキチンデアセチラーゼ阻害アッセイにおいて分析 した。キチンデアセチラーゼ活性は水溶性キチン誘導体であるグリコール［アセ チル−³Ｈ］キチンから遊離する［³Ｈ］−酢酸の放射活性を測定することにより アッセイした。この反応混合物は４８μｇのグリコール［アセチル−³Ｈ］キチ ン、１ｍＭの塩化マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含み、そしてこれ を５０μｌの総容量中２５ｍＭのグルタミン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）により 緩衝化させた。５０℃で１５分間インキュベートした後、１６μｌのＨＣｌ、４ μｌの酢酸、および８０μｌの水の添加によりこの反応を停止させた。酢酸エチ ル（０．５ｍｌ）をこの混合物に添加し、そしてこの溶液をボルテックスミキサ ーで５分間激しく混合させ、そして１４，０００ｒｐｍで遠心した。トルエンを 基にする４．５ｍｌの液体シンチレーションカクテルを２００μｌの有機相溶液 に添加し、そして渦巻きを作るようにして撹拌 させた。この溶液をバイアルビンに移し、そして液体シンチレーション計数機内 での放射活性についての測定を行った。既述の条件下では一単位の酵素は、グリ コールキチンから分当たり１．０μモルの酢酸を放出させた。比活性は蛋白質の ミリグラム当たりの酵素の単位として特定した。蛋白質はウシ血清アルブミンを 標準として使用して、いわゆるローリー（Ｌｏｗｒｙ）法によりアッセイした。 抗体力価は非競合的ＥＬＩＳＡを用いてモニターした。キチンデアセチラーゼ を、０．０５Ｍの炭酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムを含む２μｇ／ｍｌの 「コーティング用」緩衝液（ｐＨ９．６）で一晩４℃でインキュベートすること によりマイクロタイターウエル（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社、Ｄｅｎｍａｒ ｋ）上に固定化させた。各ウエルをＴｗｅｅｎ ８０の０．０５％水溶液で洗い 出し、その後に蒸留水で２度洗浄した。この後にウエル当たり２００μｌの遮断 剤を室温で１時間インキュベートした。この遮断剤は、１００ｍｌの０．０１０ Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に溶解させた１ｇのウシ血清アルブミンであった。 各ウエルを既述のように洗い出した。セイヨウカラシ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ）のパーオキシダーゼに対して複合体形成させてある抗−ウサギＩｇＧを用いて 固定化済みキチンデアセチラーゼに結合する特異的ＩｇＧを間接的に検出した。 この複合体を０．０１０ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に１０，０００倍に希釈し 、そしてウエル当たり１００μｌで室温において１時間インキュベートした。各 ウエルを既述の要領でＨ₂Ｏ／Ｔｗｅｅｎ ８０溶液で洗い出し、その後蒸留水 で２度洗浄した。各ウエルを吸引し、そして以下に記載の要領で使用直前に作成 した１００μｌの基質／色素原溶液と共にインキュベートした。ウエル当たり５ ０ μｌの４Ｍ硫酸の添加により１５分後にこの反応を停止させた。ＥＬＩＳＡ計測 器を使用して４５０ｎｍでの吸光度を計測した。特定される量の精製済みキチン デアセチラーゼの酵素活性は、様々な量の抗血清と共にインキュベートした後に 測定した。これらの実験により、この抗血清の構成成分はキチンデアセチラーゼ と特異的に反応することが立証された。 ＩｇＧは、製造業者の説明書に従って、臭化シアノゲン活性化セファロース（ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌｔｄ．社）に対して固定化 させたキチンデアセチラーゼを使用してウサギ血清から親和性精製した。１０ミ リグラムの精製済みキチンデアセチラーゼを含む溶液を、０．１Ｍの重炭酸ナト リウムおよび０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む２リットルの「カップリング用緩 衝液」（ｐＨ８．３）に対して透析した。カップリング用緩衝液で平衡化させて 予め膨潤させてある臭化シアノゲン活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ４Ｂを、両端つないで循環させる方式により４℃で一晩キチンデアセチラーゼ（ １．４ｍｇ蛋白質／ゲル（ｍｌ））と混合させた。この混合物をシンタード（ｓ ｃｉｎｔｅｒｅｄ）ガラス製漏斗に移し、そして吸引下で吸引乾燥させた。この 溶液を回収し、そして蛋白質についてのアッセイを行ってカップリング効率を評 定した。このゲルをカップリング用緩衝液で完全に洗浄し、そして既述の容量で トリス−ＨＣｌ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）と室温で２時間混合させた。こ のゲルを吸引乾燥させ、そしてカップリング用緩衝液で洗浄した。このゲルに対 して非共有結合的に吸着した蛋白質は、低ｐＨ（０．１Ｍの酢酸ナトリウム、０ ．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ４．０）および高ｐＨ（０．１Ｍのトリス、０． ５Ｍ の塩化ナトリウム、ｐＨ８．３）の交換用緩衝液でこのゲルを洗浄することによ り除去した。キチンデアセチアーゼを結合させてあるセファロース（Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅ）４Ｂをミニカラムに移し、そして０．０２５Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐ Ｈ７．４）で洗浄するが、これは４℃で保存する際には０．０２％のアジ化ナト リウムを含ませる。溶液中の抗体濃度は、１ｃｍの経路長のセルを用い、１ｍｇ ｍｌ^-1蛋白質について１．４の抗体用平均吸光度係数を用いてＡ₂₈₀を測定す ることにより評定することができる。 様々な血液から得られるキチンデアセチラーゼに対するウサギ抗血清を硫酸アン モニウムの４０％飽和液により分離目的での沈殿を生じさせた。免疫グロブリン 含有性沈殿物を溶解させ、大容量の０．０２５Ｍのトリス（ｐＨ７．４）、０． ２Ｍの塩化ナトリウムに対して透析し、そしてその後にキチンデアセチラーゼを 結合させてあるセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂカラム（プロテアーゼ 阻害剤を含む）に通した。このゲルを１０倍カラム容量の０．０２５Ｍのトリス 、０．１Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）で、回収した分画が２８０ｎｍに無 視できる程度の測定値を示すようになるまで洗浄した。非特異的に結合した蛋白 質を０．０２５Ｍのトリス、１Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で溶出させた。 ＩｇＧのバッチを２倍カラム容量の０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．８ ）で溶出させた。高親和性ＩｇＧの更に別のバッチを２倍カラム容量の０．２Ｍ グリシン−塩酸（ｐＨ２．２）で溶出させた。本明細書で用いられる用語「親和 性」は、ポリクローナル抗体を用いる際の機能的親和性（結合力）を意味する。 全ての分画を即座に１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でｐＨ７．０に調節し た。この２つのＩｇ Ｇ分画集団を別々に合わせ、そして限外濾過法により濃縮した後に０．０２５Ｍ のトリス（ｐＨ７．４）に対して透析した。この精製済み特異的ＩｇＧはＳＤＳ −ＰＡＧＥにおいて特徴的なウサギＩｇＧパターンを示す。純粋な特異的ＩｇＧ は、０．０１０Ｍのトリス、０．１Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）中＞１ｍ ｇ／ｍｌの濃度で−２０℃に保存する。 キチンデアセチラーゼの臭化シアノゲン活性化済みセファロース（Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅ）４Ｂへのカップリングは９０％の効率で行われ、１．４ｍｇのキチン デアセチラーゼ／ゲル（ｍｇ）のキチンデアセチラーゼ結合化セファロース（Ｓ ｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂを生じた。ここに示される方法により、約２．０−６． ５ｍｇの純粋な特異的ＩｇＧがｐＨ２．８の溶出に関しては１０ｍｌの抗血清毎 に単離された（硫酸アンモニウム沈殿後の総蛋白質の２．０％−５．０％）。単 離された特異的ＩｇＧの総量は硫酸アンモニウム沈殿後の総蛋白質の４．５％− ８．０％に相当する。抗−キチンデアセチラーゼ抗体用のキチンデアセチラーゼ 結合化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂの結合能は１．４ｍｇ ＩｇＧ ／ゲル（ｍｇ）であると決定された。実施例３：キチンデアセチラーゼを精製するための第二方法 実施例１に記載した要領に従って調製した凍結菌糸体（２グラム）を解凍し、 細かく切り刻み、そして改良型ガラス−ビーズ製粉機を使用して０．５ｍＭのＰ ＭＳＦ、０．１ｍＭのＮＥＭ、および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍｌの０ ．０５Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で均一化させた（湿潤菌糸体 のグラム当たり２グラムのガラスビーズ）。全ての段階は４℃で実施した。この 作業によりホモジネートを 生じ、これを４℃で３０分間１０，０００ｒｐｍで遠心した。上清（１２．２ｍ ｌ；４．６ｍｇ／ｍｌ；５６．０ｍｇ）を未精製抽出物として引用する。その後 この抽出物を５０℃に設定した水浴中で１５分間インキュベートし、そして氷中 で迅速に冷却させた。沈殿した蛋白質は４℃、４５分間の３５，０００ｒｐｍの 遠心により除去した。 実施例２に記載される純粋な低親和性ウサギＩｇＧの内の５ミリグラムをカッ プリング用緩衝液（ｐＨ８．３）に対して透析し、そして膨潤させてある５ｍｌ のＣＮＢｒ−活性化済みセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂと混合させて 免疫吸着剤を調製した。このＩｇＧをキチンデアセチラーゼのカップリングにつ いて記載される方法により結合させた。ＩｇＧの活性化セファロース（Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅ）４Ｂへの結合は８５％の効率で行われ、１ｍｇ ＩｇＧ／ゲル（ｍ ｇ）のＩｇＧ結合化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を生じた。この免疫吸 着剤をキチンデアセチラーゼ精製に用いた。 既述の上清（１１．５ｍｌ；０．５４ｍｇ／ｍｌ：６．２ｍｇ）を、１５０ｍ ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（緩衝液Ａ ）中で予め平衡化してある免疫吸着剤（寸法２×１．６ｃｍ；５ｍｌのカラムに 充填してある）にかけた。このカラムを、溶出液中に２８０ｎｍの吸光度が全く 観察されなくなるまで緩衝液Ａで洗浄した（非特異的に結合する蛋白質は２５ｍ Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ＭのＮａＣｌで溶出させた）。特異的に結 合したキチンデアセチラーゼを３５ｍｌ／時間の流速で０．２Ｍのグリシン−Ｈ Ｃｌ緩衝液（ｐＨ２．８）を使用して溶出させた。１Ｍのトリス−ＨＣｌ ｐＨ ９．０で溶出液を即座にｐＨ７．０に調節し、緩衝液Ａに対して透析し、そし て限外濾過により濃縮した（３００μｌ；４０μｇ／ｍｌ；１２μｇ；１８０ｍ Ｕ）。 免疫吸着によるキチンデアセチラーゼの精製（表４）により、脱着した酵素に ついての１５００ｍ単位／ｍｇの比活性および約３０％の収率が得られた。ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥによるキチンデアセチラーゼの純度の評定により単一バンドが示さ れた。常法（表１）によるキチンデアセチラーゼの精製により、３．２３単位／ ｍｇの比活性および１１．８％の収率を伴う純粋な酵素が得られた。この免疫吸 着剤の最高結合能は４２μｇのキチンデアセチラーゼ／ゲル（ｍｇ）であると決 定された（４％の抗原結合部位がこのマトリクスへの共有結合的固定化後の抗原 の結合用に利用可能な状態で残されている）。 実施例４ キチンデアセチラーゼの精製済み調製物を常法によるアミノ末端アミノ酸配列 分析に供した。アミノ酸配列情報に基づいて縮重オリゴヌクレオチドを合成し、 そしてキチンデアセチラーゼｍＲＮＡに相当するｃＤＮＡクローンをムコル ロ ウキシイ（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）のｃ ＤＮＡライブラリーから単離した。ｃＤＮＡ配列を決定し、そしてこの配列を配 列番号１に示す。 キチンデアセチラーゼの演繹されるアミノ酸配列を用いるＥＭＢＬデータバン クの検索により、様々なリゾビウム種のｎｏｄＢ蛋白質との有意な配列類似性が 示された。既知のｎｏｄＢ蛋白質配列全てとそのキチンデアセチラーゼ配列とを 用いて複数の配列を整列させると、最も有意な類似性が強調されてきた。 ｎｏｄＢ蛋白質配列（約２１５アミ酸分の長さ）は調査した全てのリゾビウム 種間で良好に保存されていて、３７−６７％の範囲にわたる相同性および５５− ７８％の総体的類似性を示した。キチンデアセチラーゼはもっと長めのポリペプ チドであり（４００アミノ酸）、そしてｎｏｄＢ遺伝子産物に対する相同性を示 す領域（最高３１％までの相同性、５０％の類似性）はその分子の中央部分に存 在する。アミノ末端（１−１２１アミノ酸）およびカルボキシ末端（約５０％） はキチンデアセチラーゼ内で保存されている。それとは対照的に、予想される９ つのＮ−グリコシル化部位の内の６つはキチンデアセチラーゼの非保存性ドメイ ン内に見いだされ、このことによりこれらのグリコシル化ドメインは細胞壁生合 成における酵素の専用機能にとっては重用なものである可能性が示唆される。等価物 当業者は通常の実験程度のものを使用して本明細書に記載される本発明の具体 的態様の多くの等価物に気づくであろうし、あるいはそれらを突き止めることが できるであろう。これらの等価物および他の全ての等価物は以下に示す請求の範 囲に含まれることを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:785） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． キチンのキトサンへの転化の触媒反応を行うムコル ロウキシイ（Ｍｕ ｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）中に存在する酵素をコード化する単離されたＤＮＡ配列 。 ２． 前記ＤＮＡ配列が緊縮ハイブリッド形成条件下で配列番号１に示される ＤＮＡ配列に対してハイブリダイズする能力を特徴とする、前記酵素の生物学的 活性断片をコード化する請求の範囲１の単離されたＤＮＡ配列もしくはその一部 分。 ３． キチンのキトサンへの転化の触媒反応を行うムコル ロウキシイ（Ｍｕ ｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）中に存在する酵素もしくはその生物学的活性部分をコー ド化するＤＮＡ発現構築物。 ４． キチンデアセチラーゼ活性を有する酵素をコード化するＤＮＡ配列を含 み、前記ＤＮＡ配列が緊縮ハイブリッド形成条件下で配列番号１に示されるＤＮ Ａ配列に対してハイブリダイズする能力を特徴とする、請求の範囲３のＤＮＡ発 現構築物。 ５． キチンをキチンデアセチラーゼ活性を有する酵素と接触させ、前記酵素 が、その酵素もしくはその生物学的活性部分をコード化する単離されたＤＮＡ配 列がＤＮＡ発現構築物から発現される組換えＤＮＡ技術により産生されることを 含む、キチンをキトサンへ転化させるための方法。 ６． キチンデアセチラーゼ活性を有する酵素をコード化する単離されたＤＮ Ａ配列が緊縮ハイブリッド形成条件下で配列番号１に示されるＤＮＡ配列に対し てハイブリダイズする能力を特徴とする、請求の範囲５の方法。 ７． 単離されたＤＮＡ配列がリゾビウムのｎｏｄＢ蛋白質をコード化する、 請求の範囲５の方法。 ８． キチンデアセチラーゼ活性を有する酵素をコード化するＤＮＡ配列を含 む組換えＤＮＡ構築物で形質転換させた細胞。 ９． キチンデアセチラーゼ活性を有する酵素をコード化するＤＮＡ配列が緊 縮ハイブリッド形成条件下で配列番号１に示されるＤＮＡ配列に対してハイブリ ダイズする能力を特徴とする、請求の範囲８の細胞。 １０． キチンデアセチラーゼ活性を有する酵素をコード化するＤＮＡ配列がリ ゾビウムのｎｏｄＢ蛋白質をコード化する、請求の範囲８の細胞。 １１． 原核生物性である、請求の範囲８の細胞。 １２． 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）である、請求の範囲１１の細胞。 １３． 真核生物性である、請求の範囲８の細胞。