JP2004141081A - 耐熱性ペクチン酸リアーゼ - Google Patents
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Abstract
【課題】絶対嫌気性好熱菌由来の新規なペクチン酸リアーゼタンパク質，該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含む形質転換体およびその該形質転換体を用いる前記タンパク質の製造方法に関する。
【解決手段】本発明によるクロストリディウム・ステルコラリウムＦＥＲＭ Ｐ−１８７４５株由来のペクチン酸リアーゼＰｅｌ１９Ａは、従来の酵素に比較し強力な分解活性を示し、且つ耐熱性に優れており高温で糖質を処理することができる。
【選択図】 なし
【解決手段】本発明によるクロストリディウム・ステルコラリウムＦＥＲＭ Ｐ−１８７４５株由来のペクチン酸リアーゼＰｅｌ１９Ａは、従来の酵素に比較し強力な分解活性を示し、且つ耐熱性に優れており高温で糖質を処理することができる。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、絶対嫌気性好熱菌由来の新規なペクチン酸リアーゼタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該形質転換体を用いる前記タンパク質の製造方法に関する。
【従来の技術】
【０００２】
ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２）は、ペクチン酸を脱離反応でランダムに分解し、非還元性末端に４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘクス４−エノピラノシルウロン酸単位を持つウロン酸重合体を生成する酵素である。ペクチン酸リアーゼは、バチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）とエルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）の培養液に初めて見いだされて以来、様々な細菌および糸状菌類から単離され、研究されている。食品工業において、果汁の清澄化や柑橘類のひょう嚢の除去等に用いられているが、ペクチン含有廃水の後処理、バイオマスの分解、綿繊維の精錬、洗浄剤への配合等への利用が期待されている。
【０００３】
特に、バチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ１０３株及びバチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ７株由来のペクチン酸リアーゼ［特許文献１］、バチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ１５株由来のペクチン酸リアーゼ［特許文献２］および［特許文献３］、バチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ３５８株由来のペクチン酸リアーゼ［特許文献４］、は、好アルカリ性バチルス属細菌由来の酵素であり、至適ｐＨをアルカリ性側に持つ特徴を有している。アルカリ性側に至適ｐＨを持つことから、洗剤への添加による工業的利用が期待されている。
【０００４】
【特許文献１】
特開平１１−３１８４５７号公報
【特許文献２】
特開２０００−１２５８７７号公報
【特許文献３】
特開２０００−２５３８８８号公報
【特許文献４】
特開２００２−８５０７７号公報
【０００５】
また、ペクチン酸リアーゼをコードする遺伝子については、上記のバチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ１０３株及びバチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ７株由来のペクチン酸リアーゼ［特許文献１］、バチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ１５株由来のペクチン酸リアーゼ［特許文献２］および［特許文献３］、バチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ３５８株由来のペクチン酸リアーゼ［特許文献４］をコードする遺伝子の他、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）［非特許文献１］、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）［非特許文献２］、クロコウジカビ （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ） ［非特許文献３］等由来のものが、既にクローニングされ塩基配列が決定されている。絶対嫌気性細菌由来のものとして、クロストリジウム・セルロボランス（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）由来のものが報告されている［非特許文献４］。
【０００６】
【非特許文献】
【非特許文献１】
アルファーノ，ジェイ．アール，（Ａｌｆａｎｏ，Ｊ．Ｒ）， ハム，ジェイ．エッチ（Ｈａｍ，Ｊ．Ｈ）， コルマー，エイ（Ｃｏｌｌｍｅｒ，Ａ），ジャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）， １９９５年，米国，１７７巻， ｐ４５５３−４５５６，
【非特許文献２】
ホー，エム．シー（Ｈｏ，Ｍ．Ｃ）， ホワイトヘッド，エム．ピー（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｍ．Ｐ），クリーブランド，ティー．エイ（ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｔ．Ｅ）， ディーン，アール．エイ（Ｄｅａｎ，Ｒ．Ａ）， カレント ジェネティックス（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）， １９９５年，ドイツ， ７巻， ｐ１４２−１４９
【非特許文献３】
ベネン，ジェイ．エイ（Ｂｅｎｅｎ，Ｊ．Ａ），ケスター，エイチ．シー（Ｋｅｓｔｅｒ，Ｈ．Ｃ），パレニコバ，エル（Ｐａｒｅｎｉｃｏｖａ．Ｌ），ヴィッサール，ジェイ（Ｖｉｓｓｅｒ，Ｊ），バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０００年、米国，３９巻，ｐ１５５６３−１５５６９
【非特許文献４】
タマル ワイ（Ｔａｍａｒｕ Ｙ），ドイ アールエッチ（Ｄｏｉ ＲＨ），プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ），２００１年，米国，９８巻，ｐ４１２５−４１２９
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来のペクチン酸リアーゼは工業用酵素として入手可能であるが、高価格、低比活性さらに他の糖質分解酵素が混在しているなどの問題があり、活性の強さ、反応時における安定性の観点から好熱性ペクチン酸リアーゼの開発が望まれている。本発明は、絶対嫌気性菌好熱菌由来のより熱に安定な新規なペクチン酸リアーゼタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該形質転換体を用いる前記タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、絶対嫌気性好熱性菌クロストリジウム・ステルコラリウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）にペクチン酸リアーゼ遺伝子（ｐｅｌ９Ａ）が存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の性質を有する組換えタンパク質であり、且つ該組換えタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質。
【００１０】
さらに、本発明は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子である。
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１１】
さらに、本発明は、前記の遺伝子を含有する組換えベクターであり、該組換えベクターを含む形質転換体である。
【００１２】
さらに、本発明は、前記の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物からペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、該タンパク質の製造方法である。
【００１３】
さらに、本発明は、クロストリジウム・ステルコラリウムを培地に培養し、得られる培養物からペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、該タンパク質の製造方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の好適な一実施の形態を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の実施形態によって限定されるものでなく、その要旨を変更することなく様々に改変して実施することができる。また本発明の技術的範囲は均等の範囲にまで及ぶこともある。
【００１５】
本発明者らは、絶対嫌気性好熱性菌クロストリジウム・ステルコラリウムの培養上清に、ペクチン酸リアーゼ活性を見出した。そして、ショットガンクローニングを行ったところ、ペクチン酸リアーゼ活性を有するクローンを見出し、遺伝子の解析の結果、多糖リアーゼファミリー９に属するペクチン酸リアーゼ遺伝子（ｐｅｌ９Ａ遺伝子という）であることがわかった。このｐｅｌ９Ａ遺伝子は、以下のようにしてクローニングすることができる。
【００１６】
１．ｐｅｌ９Ａ遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡライブラリーの調製
クロストリジウム・ステルコラリウムのゲノムＤＮＡは、ＧＳ培地、ＰＹ培地、ＶＬ培地などを用いて、嫌気培養したクロストリジウム・ステルコラリウムから、通常行われる手法により調製することができる。例えば、嫌気条件下で液体培養により得られた菌体を、遠心分離によって回収後、適切な緩衝液（例えばＴＥバッファー）に懸濁し、次いで、界面活性剤（例えばＳＤＳ， ＣＴＡＢ）などによる化学的処理法によって細胞を破壊し、核酸を抽出する。次いで、リボヌクレアーゼ処理によりＲＮＡを分解後、アルコール沈殿させることにより、ゲノムＤＮＡを調製することができる。
【００１７】
次いで、得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素（例えばＳａｕ３ＡＩなど）で消化し、クロロホルム処理後、エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収する。得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動などにより分画後、適切なベクター（例えばλｇｔ１Ｏ、λｇｔ１１などのファージベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔなどのプラスミドベクター、Ｌａｗｒｉｓｔ４などのコスミドベクターなど）に連結する。最後に、連結物を大腸菌（例えばＤＨ５α株、ＸＬ１−ｂ１ｕｅ株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株など）に形質転換することにより、ゲノムＤＮＡライブラリーを調製することができる。なお、本発明において用いたクロストリジウム・ステルコラリウムの微生物受託番号は、［産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番３号）、ＣＩｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ Ｆ−９，ＦＥＲＭ Ｐ−１８７４５］である。
【００１８】
（２）本発明のｐｅｌ９Ａ遺伝子のクローニング
本発明のｐｅｌ９Ａ遺伝子は、ペクチン酸リアーゼ活性を指標として、上記（１）において得られた形質転換体の中からスクリーニングすることができる。形質転換体を寒天平板培地に生育させた後、ペクチン酸を含む軟寒天を重層し、６０℃程度に放置することにより、組換え体より酵素を漏出させると同時に酵素反応を行わせる。その後、１Ｍ塩化カルシウム溶液を注ぐとペクチン酸リアーゼ活性を生産しているコロニーの周辺には透明環が現れるので、ペクチン酸リアーゼ活性を有するクローンを選択できる。さらに、これらクローンの培養菌体破砕物が、ペクチン酸やペクチンに作用するかを調査することにより、ｐｅｌ９Ａを保有するクローンを選択できる。
【００１９】
次いで、常法にしたがって、得られたポジティブ株から挿入ＤＮＡ断片を調製し塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサムーギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は白動塩基配列決定機（例えばＬＩ−ＣＯＲ社製ｍｏｄｅ１４０００Ｌ、ファルマシア社製ＡＬＦＨ型等）を用いて配列決定が行われる。そして決定された塩基配列は、Ｇｅｎｅｔｙｘ， ＤＮＡＳＩＳなどのＤＮＡ解析ソフトを用いてオープンリーデイングフレームの検索がなされ、得られた推定アミノ酸配列について、データベース検索を行うことにより、公知のタンパク質とのホモロジーを調べることができる。
【００２０】
配列番号１に本発明のｐｅｌ９Ａ遺伝了の塩基配列を、配列番号２に本発明のｐｅｌ９Ａタンパク質のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質がペクチン酸リアーゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１−２０個程度、さらに好ましくは１−１０個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１−２０個程度、さらに好ましくは１−１０個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１−２０個程度、さらに好ましくは１−１０個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【００２１】
また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１５−１５０ ｍＭ、好ましくは１５−３０ ｍＭであり、温度が３７−８０℃、好ましくは５０−６５℃での条件をいう。なお、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅ１法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐ１ｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＲＡ社製）、Ｍｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＲＡ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて行うことができる。
【００２２】
一旦、本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００２３】
１．組換えベクターおよび形質転換体の作製
（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＣＢＤ−Ｃ、ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１Ｏ，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥＰ２４、ＹＣｐ５０、ＹＩｐ３０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２４】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、等が挙げられる。
【００２５】
（２）形質組換え体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ１１ｕｓｓｕｂｔｉ１ｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母が挙げられ、ＣＯＳ細胞、ＣＨ０細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ１ｉ） Ｋ１２ ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ１１ｕｓ ｓｕｂｔｉ１ｉｓ） ＭＩ １１４、２０７−２１などが挙げられる。
【００２６】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、１ａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａ１．： Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ１． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ６９， ２１１０， １９７２］やエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２７】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａ１１プロモーター、ｇａ１１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。
【００２８】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法［Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａ１．： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ１．， １９４，１８２， １９９０］、スフェロプラスト法［Ｈｉｎｎｅｎ， Ａ． ｅｔ ａ１．： Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ１． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ７５， １９２９， １９７８］、酢酸リチウム法［Ｉｔｏｈ， Ｈ．： Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．，１５３， １６３， ９８３］等が挙げられる。
【００２９】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ヒトＧＨ３、ヒト肌細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＷプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００３０】
３．本発明のタンパク質の製造
本発明のタンパク質は、本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子又はペクチン酸リアーゼの触媒ドメイン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するもの、または該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に前記変異が導入されたアミノ酸配列を有するものをいう。さらに、これらのタンパク質とセルロース結合タンパク質又はβ一ガラクトシダーゼタンパク質との融合タンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。本発明のタンパク質は、クロストリジウム属に属する細菌又は前記２において得られた形質転換体の培養物から、以下のようにして製造することができる。ここで、「培養物」とは、培養後の培地上清、培養により得られた細胞若しくは細胞の破砕物のいずれをも意昧するものである。クロストリジウム属に属する細菌（例えばクロストリジウム・ステルコラリウム）又は前記２において得られた形質転換体を培養する方法は、それらの細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００３１】
培地としては、前記細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。ここで、炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デキストリン、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、グリセロール、工タノール、プロパノール等のアルコール類、動物油、糖蜜などが用いられる。また、窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ベプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン、コバルト、亜鉛、鉄、モリブデン等の陽イオン、及び硫酸、リン酸、塩酸、硝酸などの陰イオンの塩が用いられる。
【００３２】
また、クロストリジウム属に属する細菌などを嫌気培養する場合にはシステインなどの還元作用を有する物質を培地に添加し、菌の接種は培養器上部の空間に残存する酸素を窒素パージ等で十分除去した後に行うことが好ましい。そして嫌気性菌の培養は、嫌気ボックス、嫌気ジャー、ブチルゴム栓付き試験管などで行う。さらに、形質転換体を培養する場合には、必要に応じて培地にアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を添加してもよい。そして、前記細胞のペクチン酸リアーゼ活性が最高値に達するまで培養を行う。
【００３３】
さらに、クロストリジウム属に属する細菌などを培養する場合には、ペクチン酸やペクチンを添加すると細胞当りのペクチン酸リアーゼ活性を上昇させることができる場合があるため、必要に応じてこれらの物質を添加する。さらに、形質転換体の培養において、その形質転換体が誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換されたものである場合には、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換された微生物を培養するときにはイソプロピルーβ一Ｄ一チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００３４】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％Ｃ０２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、べニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３５】
培養後、本発明のペクチン酸リアーゼタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペクチン酸リアーゼタンパク質を抽出する。菌体の破砕は、超音波、フレンチプレス、ガラスビーズを使用するホモジナイザーなどを用いることができるが、リゾチームや凍結融解法との併用によって行うこともできる。また、本発明のペクチン酸リアーゼタンパク質が菌休外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフイニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００３６】
４．ペクチン酸リアーゼ活性の測定
ペクチン酸リアーゼの活性は以下のようにして測定することができる。すなわち、酵素溶液をペクチン酸やペクチンに作用させて、生成した４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘクス４−エノピラノシルウロン酸を分光光度計を用いて定量することができる。また、反応により生じたオリゴ糖を薄層クロマトグラフィーなどにより検出することも出来る。
【００３７】
５．本発明のタンパク質に対する抗体
本発明においては、本発明のタンパク質に対する抗体を作製することもできる。「抗体」とは、抗原である本発明のペプチドに結合し得る抗体分子全体またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片）を意昧し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。木発明の抗体は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ ｅｔ ａ１．， Ｍｏ１ｅｃｕ１ａｒ Ｃ１ｏｎｉｎｇ， Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）を参照］。
【００３８】
（１）本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体の作製
前記のようにして、遺伝子工学的に作製した本発明のペクチン酸リアーゼタンパク質又はその断片を抗原として、これを哺乳動物、例えばヒト、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは１−５ミリグラムであり、アジュバントを用いるときは２５〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは２〜４週間間隔で、２〜５回、好ましくは３〜４回免疫を行う。そして、最終の免疫口から１２−１６日後に、好ましくは、酵素免疫測定法（ＥＩＡ； ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ； ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００３９】
（２）本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体の作製
（ｉ）抗体産生細胞の採取は前記のようにして、遺伝子工学的に作製した本発明のタンパク質又はその断片を抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは１〜５ミリグラムであり、アジュバントを用いるときは２５〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完令アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは２〜４週間間隔で、２〜５回、好ましくは３〜４回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１２〜１６日後、好ましくは１４日後に抗休産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、抹消血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【００４０】
（ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｓｐ２／Ｏ、ＮＳ−Ｉなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを４：１〜１：４の割合で混合し、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１，５００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００４１】
（ｉｉｉ）ハイブリドーマの選別及ぴクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上にＯ．８個／ウエル程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、約１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって行うことができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。
【００４２】
モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％Ｃ０２濃度）で２〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水または血清を採集する。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４３】
このようにしてポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が得られた後は、これをリガンドとして、固体担体に結合させることによりアフィニティークロマトグラフィーカラムを作製し、そして該カラムを用い、前記の採取源又は他の採取源から、本発明のペクチン酸リアーゼタンパク質を精製することができる。さらにこれらの抗体は本発明のペクチン酸リアーゼタンパク質を検出するためにウエスタンブロッティングに用いることもできる。
【００４４】
【実施例】
［実施例１］ペクチン酸リアーゼ遺伝子のクローニング
（１）染色体ＤＮＡの調製
常法に従って、クロストリジウム・ステルコラリウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）の染色体ＤＮＡを調製した。すなわち、Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ ＦＥＲＭ Ｐ−１８７４５株を、１００ｍｌのＧＳ培地（０．４５％酵母エキス、Ｏ．５％セロビオース、０．１システイン塩酸塩、２．０９％ＭＯＰＳ、Ｏ．１５％ ＫＨ２Ｐ０４、０．２９％Ｋ２ＨＰ０４、Ｏ．１３％（ＮＨ４）２Ｓ０４、Ｏ．２％ＭｇＣｌ２、０．０３％ＣａＣｌ２、Ｏ．ＯＯ０２５％ＦｅＳ０４・７Ｈ２０、ｐＨ７．４）で、６０℃、１日間、嫌気的に培養後、遠心分離することにより菌体を回収した。得られた菌体を１０ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、これに１ｍｌの１０％ＳＤＳおよび０．１ｍｌの２０ミリグラム／ｍｌプロテイナーゼＫを加え、３７℃で１時間保温した。次いで２ｍｌの５ＭＮａＣ１を加えよく撹絆後、１ｍｌの１０％ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）一０．７ＭｎａＣｌを加え、６５℃で１０分間保温した。次いで、同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加えよく攪拌した後、遠心分離した。得られた上清を滅菌済遠心管に移し、２倍容量のエタノールを加え、室温に１０分間放置した。次いで、遠心分離により白沈殿物を回収し、減圧下、デシケーター中で乾燥させた。次いで、１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌとなるようにリボヌクレアーゼＡ溶液を加え、３７℃で３０分間保温した。０．１ｍ１の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ８．Ｏ）及び２．２ｍ１のエタノールを加え、よく混合した後、遠心分離により上清を除去した。沈殿物をデシケーター中で乾燥させた後Ｏ．５ｍ１のＴＥ緩衝液に溶解させることにより染色体ＤＮＡを得た。
【００４５】
（２）ＤＮＡライブラリーの作製
上記（１）において得られたゲノムＤＮＡを用い、クロストリジウム・ステルコラリウムの染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。すなわち、染色休ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分的に切断した後、Ｏ．４％アガロースＨＩ４（宝酒造社製）によるアガロースゲル電気泳動を行い、５〜１０ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ＧｅｎｅＣ１ｅａｎキット（Ｂｉｏ１０１社製）により回収した。さらに、ｄＧおよびｄＡ存在下、Ｋ１ｅｎｏｗ酵素により、５’−突出末端を一部修復合成し、２ヌクレオチド突出末端を持つ染色体ＤＮＡ断片を調製した。
一方、プラスミドｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＸｈｏＩで切断した後、ＧｅｎｅＣ１ｅａｎキットにより回収し、５’−突出末端を一部修復合成し、２ヌクレオチド突出末端を持つプラスミドを得た。調製した上記染色体ＤＮＡ断片と上記プラスミドをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌ＤＨ５α（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ１ｉ ＤＨ５α）に導入した。その際、コンピテントセルおよび形質転換体の調製は塩化カルシウムを用いた常法により実施した。
【００４６】
これらの形質転換休を、アンピシリン（５０μ１／ｍ１）、ＩＰＴＧ（イプロピルチオーβ一Ｄ一ガラクトピラノシド；４０μＭ）、Ｘ−ｇａ１（５一ブロモー４一クロロー３一インドリルーβ一Ｄ一ガラクトピラノシド；４０μｇ／ｍ１）を含むＬＢ寒天平板（ポリベプトン１．Ｏ％、酵母エキスＯ．５％、ＮａＣ１Ｏ．５％、寒天１．５％、ＰＨ７．Ｏ；φ９×１．５センチメートル、丸型シヤーレ）上に塗布し、３７℃で培養し、形成したコロニーのうち、白色のものを約５０００株採取した。
【００４７】
（３）ペクチン酸リアーゼ活性を有するクローンの選択
採取したコロニーをＬＢ寒天平板に接種し、３７℃、一晩培養し、再度コロニーを形成させた後、０．４％ペクチン酸を含む０．５％寒天を重層し、寒天を固化させた後６０℃で２時間保温した。その後、１ＭＣａＣｌ２溶液を注ぎ、コロニーの周りに透明環が現れたコロニーをポジテイブクローンとした。
【００４８】
このポジテイブクローンを、５ｍｌのＬＢ培地（ポリベプトン１．Ｏ％、酵母エキスＯ．５％、ＮａＣ１Ｏ．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃、一晩振とう培養した。遠心分離により回収した菌体を、５ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に懸濁し、２ｘ３０秒の超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離により菌体破砕物を除去し、澄明な液を得た。さらに、６０℃、１５分の加熱処理により大腸菌の酵素を失活させた後、不溶解分を遠心分離で除去し、粗酵素液とした。ペクチン酸リアーゼ活性は、ペクチン酸を基質として確認した。すなわち、Ｏ．５ｍ１の２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８、０．４ｍｌの０．２５ｍＭＣａＣｌ２、１ｍｌの０．４％ペクチン酸ナトリウム水溶液とＯ．１ｍ１の粗酵素を混合し、６０℃で反応させた。２ｍｌの５０ｍＭＨＣｌを加えて反応を止めた後、４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘクス４−エノピラノシルウロン酸残基の生成を２３５ｎｍの吸光度により測定し、ペクチン酸リアーゼ活性を有する形質転換体を１株取得した。
【００４９】
さらに、ジガラクツロン酸およびトリガラクツロン酸に対する作用を調べた。これら基質の加水分解物の確認は１１０℃、３０分熱処理したシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＭＡＣＨＥＲＹ−ＮＡＧＥＬ社製、ＳＩＬ Ｇ−２５）を用いて行い、酵素反応は８μ１の０．４％（ｗｔ／ｖｏ１）各基質溶液、２μ１上記粗酵素液、２μ１の２００ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８を￥ｌｏｃｈ混合し、６０℃、１２時間反応させた。薄層クロマトグラフィーの展開溶媒は１一ブタノール：水：酢酸（５：３：２、ｖｏ１／ｖｏ１）を用いた。展開後は風乾させ、硫酸噴霧、及び１４０℃、５分の処理により発色させた。その結果、該ペクチン酸リアーゼはトリガラクツロン酸に対して作用した。
【００５０】
（４）組換えプラスミドの調製
上記（３）で選択した形質転換体をアンピシリン（５０μ１／ｍ１）を含む１００ｍｌのＬＢ培地にて３７℃、一晩培養、集菌した。滅菌水による洗浄後、５ｍｌの溶液Ｉ（２５ｍＭグルコース、１０ｍＭＥＤＴＡ，２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１（ＰＨ８．Ｏ））に懸濁し、２５ミリグラムのリゾチームを添加し、０℃、３０分間放置した。１０ｍ１の溶液ＩＩ（１Ｎ−ＮａＯＨ、５％ＳＤＳ）を加え、Ｏ℃、５分間放置し、さらに、７．５ｍ１の溶液ＩＩＩ（３Ｍ酢酸ナトリウム（ＰＨ４．８））を加え、Ｏ℃、３０分間放置した。これを遠心し、その上清に５０ｍ１のエタノールを加え、さらに遠心し上清を取り除き５ｍＩの溶液ＩＶ（１０ミリミリリットル酢酸ナトリウム、５０リットルＴｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８．０）とリボヌクレアーゼＡ溶液（１０ミリグラム／ミリリットル）２．５μ１を加え室温で２０分間放置した。これに１２ｍ１のエタノールを加え、遠心によりプラスミドを回収、７０％エタノールで洗浄、乾燥後０．４ｍ１の減菌水に溶解した。こうして得られた組換え体プラスミドをｐＰＥＬ９Ａ−１と名付けた。
【００５１】
（５）挿入断片の塩基配列の決定
上記（４）で得られたｐＰＥＬ９Ａ−１を複数の制限酵素で切断し、制限酵素地図を作製し （図１参照）、また、常法によりサブクローニングを行った。すなわち、制限酵素としてＨｉｎｄＨＩ，ＮｄｅＩ，ＳａｃＩを用い、ｐＰＥＬ９Ａ−１を部分切断後、切断部位をＴ４ＤＮＡリガーゼにより再結合したプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに再度形質転換し、上記（４）と同様の方法で、プラスミドを複数調製した。これらをプライマー蛍光標識法自動ＤＮＡシーケンサー（ＬＩ−ＣＯＲＥ社製、ｍｏｄｅ１４０００Ｌ）により挿入断片の塩基配列を解析した。その結果、３７２０ｂｐの遺伝子配列（配列番号１）およぴ、１２４０個の推定アミノ酸配列（配列番号２）が得られ、この遺伝子をｐｅｌ９Ａと命名した。
【００５２】
次に、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）データベースにより相同性を有する酵素を検索した。本酵素は、多糖リアーゼのファミリー９に分類される触媒ドメインを２つ持つ酵素であり、Ｎ末端側ドメインとＣ末端側ドメインの間の相同性は２１％であった（図２参照）。本酵素はバチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉ１１ｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）のＰｅｌＸと約５３％の相同性を示した。また、本酵素のＣ末端側ドメインはクレブシェラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）ＰｅｌＸと３２％の相同性、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）ｐｅｌと３１％の相同性、バチルス・エスピーＫＳＭ−Ｐ１５ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−Ｐ１５）のＰｅｌと４７％の相同性、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）と４１％の相同性を示した。 （図３，図４，図５参照）。
【００５３】
（６）ペクチン酸リアーゼの精製
（ｉ） 組換えプラスミドの構築
ｐｅｌ９Ａ遺伝子の読み枠をＰＣＲ法で増幅しプラスミドベクターｐＱＥ−３０Ｔに連結した。すなわち、ｐＰＥＬ９Ａ−１を鋳型とし、プライマーとしてプライマー１（ＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＡＴＧＣ）とプライマー２（ＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＧＧＧ）を用いて常法に従いｐｅｌ９Ａ遺伝子を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、同じくＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断した発現ベクタープラスミドｐＱＥ−３０Ｔ（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６３， １５９６−１６０４， １９９９）にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。構築したプラスミド（ｐＰＥＬ９Ａ−２）を常法通り形質転換法にて、大腸菌Ｍ−１５株に導入した。
【００５４】
（ｉｉ）ペクチン酸リアーゼの精製
プラスミドｐＰＥＬ９Ａ−２を保有する大腸菌組換え体を、５００ｍｌのＬＢ培地（ポリベプトン１．Ｏ％、酵母エキスＯ．５％、ＮａＣ１Ｏ．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃、一晩振とう培養した。遠心分離により回収した菌体を、１０ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に懸濁し、５ｘ３０秒の超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離により菌体破砕物を除去し、澄明な液を得た。この粗酵素溶液をＨｉｓＴｒａｐ キレーティングカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に吸着させた後、イミダゾール（ｐＨ７．４）の濃度勾配により蛋白質を溶出させた。回収したペクチン酸リアーゼを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に対して透析しイミダゾールを除いた後、ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ カラム（１ｍｌ）に吸着させた。吸着した蛋白質を食塩の濃度勾配により溶出し、各画分の純度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べ、単一のバンドにまで純化されたペクチン酸リアーゼを得た。
【００５５】
（７）Ｎ末端側ドメイン蛋白質の単独発現と精製
（ｉ）組換えプラスミドの構築
Ｎ末端側ドメインをコードする領域をＰＣＲ法で増幅しプラスミドベクターｐＱＥ−３０Ｔに連結した。すなわち、ｐＰＥＬ９Ａ−１を鋳型とし、プライマーとしてプライマー１（ＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＡＴＧＣ）とプライマー３（ＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＡＣＴＧＴＴＡＣＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＡＴＣＧＧ）を用いて常法に従いＮ末端側ドメインをコードする領域を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、同じくＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断した発現ベクタープラスミドｐＱＥ−３０Ｔ（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６３， １５９６−１６０４， １９９９）にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。構築したプラスミド（ｐＰＥＬ９Ａ−３）を常法通り形質転換法にて、大腸菌Ｍ−１５株に導入した。
【００５６】
（ｉｉ）Ｎ末端側ドメイン蛋白質の精製
プラスミドｐＰＥＬ９Ａ−３を保有する大腸菌組換え体を、５００ｍｌのＬＢ培地（ポリベプトン１．Ｏ％、酵母エキスＯ．５％、ＮａＣ１Ｏ．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃、一晩振とう培養した。遠心分離により回収した菌体を、１０ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に懸濁し、５ｘ３０秒の超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離により菌体破砕物を除去し、澄明な液を得た。この粗酵素溶液をＨｉｓＴｒａｐ キレーティングカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に吸着させた後、イミダゾール（ｐＨ７．４）の濃度勾配により蛋白質を溶出させた。回収したＮ末端側ドメイン蛋白質を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に対して透析しイミダゾールを除いた後、ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ カラム（１ｍｌ）に吸着させた。吸着した蛋白質を食塩の濃度勾配により溶出し、各画分の純度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べ、単一のバンドにまで純化されたＮ末端側ドメイン蛋白質を得た。
【００５７】
（８）Ｃ末端側ドメイン蛋白質の単独発現と精製
（ｉ）組換えプラスミドの構築
Ｃ末端側ドメインをコードする領域をＰＣＲ法で増幅しプラスミドベクターｐＱＥ−３０Ｔに連結した。すなわち、ｐＰＥＬ９Ａ−１を鋳型とし、プライマーとしてプライマー４（ＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＡＣＣＣＴＣＡＡＧＧＴＡＡＣＡＧＴＧＡＧＧＧ）とプライマー２（ＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＧＧＧ）を用いて常法に従いＣ末端側ドメインをコードする領域を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、同じくＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断した発現ベクタープラスミドｐＱＥ−３０Ｔ（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６３， １５９６−１６０４， １９９９）にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。構築したプラスミド（ｐＰＥＬ９Ａ−４）を常法通り形質転換法にて、大腸菌Ｍ−１５株に導入した。
【００５８】
（ｉｉ）Ｃ末端側ドメイン蛋白質の精製
プラスミドｐＰＥＬ９Ａ−４を保有する大腸菌組換え体を、５００ｍｌのＬＢ培地（ポリベプトン１．Ｏ％、酵母エキスＯ．５％、ＮａＣ１Ｏ．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃、一晩振とう培養した。遠心分離により回収した菌体を、１０ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に懸濁し、５ｘ３０秒の超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離により菌体破砕物を除去し、澄明な液を得た。この粗酵素溶液をＨｉｓＴｒａｐ キレーティングカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に吸着させた後、イミダゾール（ｐＨ７．４）の濃度勾配により蛋白質を溶出させた。回収したＣ末端側ドメイン蛋白質を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に対して透析しイミダゾールを除いた後、ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ カラム（１ｍｌ）に吸着させた。吸着した蛋白質を食塩の濃度勾配により溶出し、各画分の純度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べ、単一のバンドにまで純化されたＣ末端側ドメイン蛋白質を得た。
【００５９】
（９）ペクチン酸リアーゼ、Ｎ末端側ドメイン蛋白質及びＣ末端側ドメイン蛋白質の活性の比較
ペクチン酸リアーゼ活性は、ペクチン酸を基質として確認した。すなわち、Ｏ．５ｍ１の２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８、０．４ｍｌの０．２５ｍＭＣａＣｌ２、１ｍｌの０．４％ペクチン酸ナトリウム水溶液とＯ．１ｍ１の粗酵素を混合し、６０℃で反応させた。２ｍｌの５０ｍＭＨＣｌを加えて反応を止めた後、４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘクス４−エノピラノシルウロン酸残基の生成を２３５ｎｍの吸光度により測定した。１分間あたり１μｍｏｌの４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘクス４−エノピラノシルウロン酸を生成する活性を１ユニット（Ｕ）とすると、ペクチン酸リアーゼ、Ｎ末端側ドメイン蛋白質及びＣ末端側ドメイン蛋白質の比活性はそれぞれ５８Ｕ／μｇ、１０Ｕ／μｇ、３０ Ｕ／μｇであった。この結果は、触媒ドメインが２つ連結することにより、酵素活性が相乗的に高まることを示した。また、これら３種の酵素の至適温度は６５℃であった。
【００６０】
【発明の効果】
本発明によるクロストリジウム・ステルコラリウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）ＦＥＲＭ Ｐ−１８７４５株
由来のペクチン酸リアーゼＰｅｌ９Ａは、その分子内に２つの触媒ドメインを有しており、それらが分子内相乗効果を発揮し、従来の単一触媒ドメインからなる酵素に比較し強力な分解活性を示す。またＰｅｌ９Ａは好熱性細菌由来であるため耐熱性に優れており、従来より高温で糖質を処理することができる。
【００６１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＰＥＬ９Ａ−１、ｐＰＥＬ９Ａ−２、ｐＰＥＬ９Ａ−３及びｐＰＥＬ９Ａ−４の制限酵素を示す地図。
【図２】Ｎ末端側ドメインとＣ末端側ドメインとの間の相同性を示す図。
【図３】ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）により相同性を有する酵素を検索した結果を示す図。
【図４】同上。
【図５】同上。
【符号の説明】
Ｃｓ 本発明のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ
Ｂｈ Ｂ． Ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ
Ｋｏ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ
Ｅｒ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ
Ｂ．ｓｐ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．
Ｓｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ
【発明の属する技術分野】
本発明は、絶対嫌気性好熱菌由来の新規なペクチン酸リアーゼタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該形質転換体を用いる前記タンパク質の製造方法に関する。
【従来の技術】
【０００２】
ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２）は、ペクチン酸を脱離反応でランダムに分解し、非還元性末端に４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘクス４−エノピラノシルウロン酸単位を持つウロン酸重合体を生成する酵素である。ペクチン酸リアーゼは、バチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）とエルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）の培養液に初めて見いだされて以来、様々な細菌および糸状菌類から単離され、研究されている。食品工業において、果汁の清澄化や柑橘類のひょう嚢の除去等に用いられているが、ペクチン含有廃水の後処理、バイオマスの分解、綿繊維の精錬、洗浄剤への配合等への利用が期待されている。
【０００３】
特に、バチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ１０３株及びバチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ７株由来のペクチン酸リアーゼ［特許文献１］、バチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ１５株由来のペクチン酸リアーゼ［特許文献２］および［特許文献３］、バチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ３５８株由来のペクチン酸リアーゼ［特許文献４］、は、好アルカリ性バチルス属細菌由来の酵素であり、至適ｐＨをアルカリ性側に持つ特徴を有している。アルカリ性側に至適ｐＨを持つことから、洗剤への添加による工業的利用が期待されている。
【０００４】
【特許文献１】
特開平１１−３１８４５７号公報
【特許文献２】
特開２０００−１２５８７７号公報
【特許文献３】
特開２０００−２５３８８８号公報
【特許文献４】
特開２００２−８５０７７号公報
【０００５】
また、ペクチン酸リアーゼをコードする遺伝子については、上記のバチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ１０３株及びバチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ７株由来のペクチン酸リアーゼ［特許文献１］、バチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ１５株由来のペクチン酸リアーゼ［特許文献２］および［特許文献３］、バチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｐ３５８株由来のペクチン酸リアーゼ［特許文献４］をコードする遺伝子の他、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）［非特許文献１］、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）［非特許文献２］、クロコウジカビ （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ） ［非特許文献３］等由来のものが、既にクローニングされ塩基配列が決定されている。絶対嫌気性細菌由来のものとして、クロストリジウム・セルロボランス（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）由来のものが報告されている［非特許文献４］。
【０００６】
【非特許文献】
【非特許文献１】
アルファーノ，ジェイ．アール，（Ａｌｆａｎｏ，Ｊ．Ｒ）， ハム，ジェイ．エッチ（Ｈａｍ，Ｊ．Ｈ）， コルマー，エイ（Ｃｏｌｌｍｅｒ，Ａ），ジャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）， １９９５年，米国，１７７巻， ｐ４５５３−４５５６，
【非特許文献２】
ホー，エム．シー（Ｈｏ，Ｍ．Ｃ）， ホワイトヘッド，エム．ピー（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｍ．Ｐ），クリーブランド，ティー．エイ（ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｔ．Ｅ）， ディーン，アール．エイ（Ｄｅａｎ，Ｒ．Ａ）， カレント ジェネティックス（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）， １９９５年，ドイツ， ７巻， ｐ１４２−１４９
【非特許文献３】
ベネン，ジェイ．エイ（Ｂｅｎｅｎ，Ｊ．Ａ），ケスター，エイチ．シー（Ｋｅｓｔｅｒ，Ｈ．Ｃ），パレニコバ，エル（Ｐａｒｅｎｉｃｏｖａ．Ｌ），ヴィッサール，ジェイ（Ｖｉｓｓｅｒ，Ｊ），バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０００年、米国，３９巻，ｐ１５５６３−１５５６９
【非特許文献４】
タマル ワイ（Ｔａｍａｒｕ Ｙ），ドイ アールエッチ（Ｄｏｉ ＲＨ），プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ），２００１年，米国，９８巻，ｐ４１２５−４１２９
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来のペクチン酸リアーゼは工業用酵素として入手可能であるが、高価格、低比活性さらに他の糖質分解酵素が混在しているなどの問題があり、活性の強さ、反応時における安定性の観点から好熱性ペクチン酸リアーゼの開発が望まれている。本発明は、絶対嫌気性菌好熱菌由来のより熱に安定な新規なペクチン酸リアーゼタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該形質転換体を用いる前記タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、絶対嫌気性好熱性菌クロストリジウム・ステルコラリウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）にペクチン酸リアーゼ遺伝子（ｐｅｌ９Ａ）が存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の性質を有する組換えタンパク質であり、且つ該組換えタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質。
【００１０】
さらに、本発明は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子である。
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１１】
さらに、本発明は、前記の遺伝子を含有する組換えベクターであり、該組換えベクターを含む形質転換体である。
【００１２】
さらに、本発明は、前記の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物からペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、該タンパク質の製造方法である。
【００１３】
さらに、本発明は、クロストリジウム・ステルコラリウムを培地に培養し、得られる培養物からペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、該タンパク質の製造方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の好適な一実施の形態を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の実施形態によって限定されるものでなく、その要旨を変更することなく様々に改変して実施することができる。また本発明の技術的範囲は均等の範囲にまで及ぶこともある。
【００１５】
本発明者らは、絶対嫌気性好熱性菌クロストリジウム・ステルコラリウムの培養上清に、ペクチン酸リアーゼ活性を見出した。そして、ショットガンクローニングを行ったところ、ペクチン酸リアーゼ活性を有するクローンを見出し、遺伝子の解析の結果、多糖リアーゼファミリー９に属するペクチン酸リアーゼ遺伝子（ｐｅｌ９Ａ遺伝子という）であることがわかった。このｐｅｌ９Ａ遺伝子は、以下のようにしてクローニングすることができる。
【００１６】
１．ｐｅｌ９Ａ遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡライブラリーの調製
クロストリジウム・ステルコラリウムのゲノムＤＮＡは、ＧＳ培地、ＰＹ培地、ＶＬ培地などを用いて、嫌気培養したクロストリジウム・ステルコラリウムから、通常行われる手法により調製することができる。例えば、嫌気条件下で液体培養により得られた菌体を、遠心分離によって回収後、適切な緩衝液（例えばＴＥバッファー）に懸濁し、次いで、界面活性剤（例えばＳＤＳ， ＣＴＡＢ）などによる化学的処理法によって細胞を破壊し、核酸を抽出する。次いで、リボヌクレアーゼ処理によりＲＮＡを分解後、アルコール沈殿させることにより、ゲノムＤＮＡを調製することができる。
【００１７】
次いで、得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素（例えばＳａｕ３ＡＩなど）で消化し、クロロホルム処理後、エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収する。得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動などにより分画後、適切なベクター（例えばλｇｔ１Ｏ、λｇｔ１１などのファージベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔなどのプラスミドベクター、Ｌａｗｒｉｓｔ４などのコスミドベクターなど）に連結する。最後に、連結物を大腸菌（例えばＤＨ５α株、ＸＬ１−ｂ１ｕｅ株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株など）に形質転換することにより、ゲノムＤＮＡライブラリーを調製することができる。なお、本発明において用いたクロストリジウム・ステルコラリウムの微生物受託番号は、［産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番３号）、ＣＩｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ Ｆ−９，ＦＥＲＭ Ｐ−１８７４５］である。
【００１８】
（２）本発明のｐｅｌ９Ａ遺伝子のクローニング
本発明のｐｅｌ９Ａ遺伝子は、ペクチン酸リアーゼ活性を指標として、上記（１）において得られた形質転換体の中からスクリーニングすることができる。形質転換体を寒天平板培地に生育させた後、ペクチン酸を含む軟寒天を重層し、６０℃程度に放置することにより、組換え体より酵素を漏出させると同時に酵素反応を行わせる。その後、１Ｍ塩化カルシウム溶液を注ぐとペクチン酸リアーゼ活性を生産しているコロニーの周辺には透明環が現れるので、ペクチン酸リアーゼ活性を有するクローンを選択できる。さらに、これらクローンの培養菌体破砕物が、ペクチン酸やペクチンに作用するかを調査することにより、ｐｅｌ９Ａを保有するクローンを選択できる。
【００１９】
次いで、常法にしたがって、得られたポジティブ株から挿入ＤＮＡ断片を調製し塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサムーギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は白動塩基配列決定機（例えばＬＩ−ＣＯＲ社製ｍｏｄｅ１４０００Ｌ、ファルマシア社製ＡＬＦＨ型等）を用いて配列決定が行われる。そして決定された塩基配列は、Ｇｅｎｅｔｙｘ， ＤＮＡＳＩＳなどのＤＮＡ解析ソフトを用いてオープンリーデイングフレームの検索がなされ、得られた推定アミノ酸配列について、データベース検索を行うことにより、公知のタンパク質とのホモロジーを調べることができる。
【００２０】
配列番号１に本発明のｐｅｌ９Ａ遺伝了の塩基配列を、配列番号２に本発明のｐｅｌ９Ａタンパク質のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質がペクチン酸リアーゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１−２０個程度、さらに好ましくは１−１０個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１−２０個程度、さらに好ましくは１−１０個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１−２０個程度、さらに好ましくは１−１０個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【００２１】
また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１５−１５０ ｍＭ、好ましくは１５−３０ ｍＭであり、温度が３７−８０℃、好ましくは５０−６５℃での条件をいう。なお、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅ１法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐ１ｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＲＡ社製）、Ｍｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＲＡ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて行うことができる。
【００２２】
一旦、本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００２３】
１．組換えベクターおよび形質転換体の作製
（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＣＢＤ−Ｃ、ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１Ｏ，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥＰ２４、ＹＣｐ５０、ＹＩｐ３０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２４】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、等が挙げられる。
【００２５】
（２）形質組換え体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ１１ｕｓｓｕｂｔｉ１ｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母が挙げられ、ＣＯＳ細胞、ＣＨ０細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ１ｉ） Ｋ１２ ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ１１ｕｓ ｓｕｂｔｉ１ｉｓ） ＭＩ １１４、２０７−２１などが挙げられる。
【００２６】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、１ａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａ１．： Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ１． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ６９， ２１１０， １９７２］やエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２７】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａ１１プロモーター、ｇａ１１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。
【００２８】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法［Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａ１．： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ１．， １９４，１８２， １９９０］、スフェロプラスト法［Ｈｉｎｎｅｎ， Ａ． ｅｔ ａ１．： Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ１． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ７５， １９２９， １９７８］、酢酸リチウム法［Ｉｔｏｈ， Ｈ．： Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．，１５３， １６３， ９８３］等が挙げられる。
【００２９】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ヒトＧＨ３、ヒト肌細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＷプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００３０】
３．本発明のタンパク質の製造
本発明のタンパク質は、本発明のペクチン酸リアーゼ遺伝子又はペクチン酸リアーゼの触媒ドメイン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するもの、または該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に前記変異が導入されたアミノ酸配列を有するものをいう。さらに、これらのタンパク質とセルロース結合タンパク質又はβ一ガラクトシダーゼタンパク質との融合タンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。本発明のタンパク質は、クロストリジウム属に属する細菌又は前記２において得られた形質転換体の培養物から、以下のようにして製造することができる。ここで、「培養物」とは、培養後の培地上清、培養により得られた細胞若しくは細胞の破砕物のいずれをも意昧するものである。クロストリジウム属に属する細菌（例えばクロストリジウム・ステルコラリウム）又は前記２において得られた形質転換体を培養する方法は、それらの細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００３１】
培地としては、前記細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。ここで、炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デキストリン、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、グリセロール、工タノール、プロパノール等のアルコール類、動物油、糖蜜などが用いられる。また、窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ベプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン、コバルト、亜鉛、鉄、モリブデン等の陽イオン、及び硫酸、リン酸、塩酸、硝酸などの陰イオンの塩が用いられる。
【００３２】
また、クロストリジウム属に属する細菌などを嫌気培養する場合にはシステインなどの還元作用を有する物質を培地に添加し、菌の接種は培養器上部の空間に残存する酸素を窒素パージ等で十分除去した後に行うことが好ましい。そして嫌気性菌の培養は、嫌気ボックス、嫌気ジャー、ブチルゴム栓付き試験管などで行う。さらに、形質転換体を培養する場合には、必要に応じて培地にアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を添加してもよい。そして、前記細胞のペクチン酸リアーゼ活性が最高値に達するまで培養を行う。
【００３３】
さらに、クロストリジウム属に属する細菌などを培養する場合には、ペクチン酸やペクチンを添加すると細胞当りのペクチン酸リアーゼ活性を上昇させることができる場合があるため、必要に応じてこれらの物質を添加する。さらに、形質転換体の培養において、その形質転換体が誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換されたものである場合には、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換された微生物を培養するときにはイソプロピルーβ一Ｄ一チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００３４】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％Ｃ０２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、べニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３５】
培養後、本発明のペクチン酸リアーゼタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペクチン酸リアーゼタンパク質を抽出する。菌体の破砕は、超音波、フレンチプレス、ガラスビーズを使用するホモジナイザーなどを用いることができるが、リゾチームや凍結融解法との併用によって行うこともできる。また、本発明のペクチン酸リアーゼタンパク質が菌休外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフイニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００３６】
４．ペクチン酸リアーゼ活性の測定
ペクチン酸リアーゼの活性は以下のようにして測定することができる。すなわち、酵素溶液をペクチン酸やペクチンに作用させて、生成した４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘクス４−エノピラノシルウロン酸を分光光度計を用いて定量することができる。また、反応により生じたオリゴ糖を薄層クロマトグラフィーなどにより検出することも出来る。
【００３７】
５．本発明のタンパク質に対する抗体
本発明においては、本発明のタンパク質に対する抗体を作製することもできる。「抗体」とは、抗原である本発明のペプチドに結合し得る抗体分子全体またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片）を意昧し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。木発明の抗体は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ ｅｔ ａ１．， Ｍｏ１ｅｃｕ１ａｒ Ｃ１ｏｎｉｎｇ， Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）を参照］。
【００３８】
（１）本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体の作製
前記のようにして、遺伝子工学的に作製した本発明のペクチン酸リアーゼタンパク質又はその断片を抗原として、これを哺乳動物、例えばヒト、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは１−５ミリグラムであり、アジュバントを用いるときは２５〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは２〜４週間間隔で、２〜５回、好ましくは３〜４回免疫を行う。そして、最終の免疫口から１２−１６日後に、好ましくは、酵素免疫測定法（ＥＩＡ； ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ； ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００３９】
（２）本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体の作製
（ｉ）抗体産生細胞の採取は前記のようにして、遺伝子工学的に作製した本発明のタンパク質又はその断片を抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは１〜５ミリグラムであり、アジュバントを用いるときは２５〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完令アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは２〜４週間間隔で、２〜５回、好ましくは３〜４回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１２〜１６日後、好ましくは１４日後に抗休産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、抹消血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【００４０】
（ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｓｐ２／Ｏ、ＮＳ−Ｉなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを４：１〜１：４の割合で混合し、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１，５００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００４１】
（ｉｉｉ）ハイブリドーマの選別及ぴクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上にＯ．８個／ウエル程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、約１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって行うことができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。
【００４２】
モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％Ｃ０２濃度）で２〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水または血清を採集する。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４３】
このようにしてポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が得られた後は、これをリガンドとして、固体担体に結合させることによりアフィニティークロマトグラフィーカラムを作製し、そして該カラムを用い、前記の採取源又は他の採取源から、本発明のペクチン酸リアーゼタンパク質を精製することができる。さらにこれらの抗体は本発明のペクチン酸リアーゼタンパク質を検出するためにウエスタンブロッティングに用いることもできる。
【００４４】
【実施例】
［実施例１］ペクチン酸リアーゼ遺伝子のクローニング
（１）染色体ＤＮＡの調製
常法に従って、クロストリジウム・ステルコラリウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）の染色体ＤＮＡを調製した。すなわち、Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ ＦＥＲＭ Ｐ−１８７４５株を、１００ｍｌのＧＳ培地（０．４５％酵母エキス、Ｏ．５％セロビオース、０．１システイン塩酸塩、２．０９％ＭＯＰＳ、Ｏ．１５％ ＫＨ２Ｐ０４、０．２９％Ｋ２ＨＰ０４、Ｏ．１３％（ＮＨ４）２Ｓ０４、Ｏ．２％ＭｇＣｌ２、０．０３％ＣａＣｌ２、Ｏ．ＯＯ０２５％ＦｅＳ０４・７Ｈ２０、ｐＨ７．４）で、６０℃、１日間、嫌気的に培養後、遠心分離することにより菌体を回収した。得られた菌体を１０ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、これに１ｍｌの１０％ＳＤＳおよび０．１ｍｌの２０ミリグラム／ｍｌプロテイナーゼＫを加え、３７℃で１時間保温した。次いで２ｍｌの５ＭＮａＣ１を加えよく撹絆後、１ｍｌの１０％ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）一０．７ＭｎａＣｌを加え、６５℃で１０分間保温した。次いで、同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加えよく攪拌した後、遠心分離した。得られた上清を滅菌済遠心管に移し、２倍容量のエタノールを加え、室温に１０分間放置した。次いで、遠心分離により白沈殿物を回収し、減圧下、デシケーター中で乾燥させた。次いで、１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌとなるようにリボヌクレアーゼＡ溶液を加え、３７℃で３０分間保温した。０．１ｍ１の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ８．Ｏ）及び２．２ｍ１のエタノールを加え、よく混合した後、遠心分離により上清を除去した。沈殿物をデシケーター中で乾燥させた後Ｏ．５ｍ１のＴＥ緩衝液に溶解させることにより染色体ＤＮＡを得た。
【００４５】
（２）ＤＮＡライブラリーの作製
上記（１）において得られたゲノムＤＮＡを用い、クロストリジウム・ステルコラリウムの染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。すなわち、染色休ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分的に切断した後、Ｏ．４％アガロースＨＩ４（宝酒造社製）によるアガロースゲル電気泳動を行い、５〜１０ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ＧｅｎｅＣ１ｅａｎキット（Ｂｉｏ１０１社製）により回収した。さらに、ｄＧおよびｄＡ存在下、Ｋ１ｅｎｏｗ酵素により、５’−突出末端を一部修復合成し、２ヌクレオチド突出末端を持つ染色体ＤＮＡ断片を調製した。
一方、プラスミドｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＸｈｏＩで切断した後、ＧｅｎｅＣ１ｅａｎキットにより回収し、５’−突出末端を一部修復合成し、２ヌクレオチド突出末端を持つプラスミドを得た。調製した上記染色体ＤＮＡ断片と上記プラスミドをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌ＤＨ５α（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ１ｉ ＤＨ５α）に導入した。その際、コンピテントセルおよび形質転換体の調製は塩化カルシウムを用いた常法により実施した。
【００４６】
これらの形質転換休を、アンピシリン（５０μ１／ｍ１）、ＩＰＴＧ（イプロピルチオーβ一Ｄ一ガラクトピラノシド；４０μＭ）、Ｘ−ｇａ１（５一ブロモー４一クロロー３一インドリルーβ一Ｄ一ガラクトピラノシド；４０μｇ／ｍ１）を含むＬＢ寒天平板（ポリベプトン１．Ｏ％、酵母エキスＯ．５％、ＮａＣ１Ｏ．５％、寒天１．５％、ＰＨ７．Ｏ；φ９×１．５センチメートル、丸型シヤーレ）上に塗布し、３７℃で培養し、形成したコロニーのうち、白色のものを約５０００株採取した。
【００４７】
（３）ペクチン酸リアーゼ活性を有するクローンの選択
採取したコロニーをＬＢ寒天平板に接種し、３７℃、一晩培養し、再度コロニーを形成させた後、０．４％ペクチン酸を含む０．５％寒天を重層し、寒天を固化させた後６０℃で２時間保温した。その後、１ＭＣａＣｌ２溶液を注ぎ、コロニーの周りに透明環が現れたコロニーをポジテイブクローンとした。
【００４８】
このポジテイブクローンを、５ｍｌのＬＢ培地（ポリベプトン１．Ｏ％、酵母エキスＯ．５％、ＮａＣ１Ｏ．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃、一晩振とう培養した。遠心分離により回収した菌体を、５ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に懸濁し、２ｘ３０秒の超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離により菌体破砕物を除去し、澄明な液を得た。さらに、６０℃、１５分の加熱処理により大腸菌の酵素を失活させた後、不溶解分を遠心分離で除去し、粗酵素液とした。ペクチン酸リアーゼ活性は、ペクチン酸を基質として確認した。すなわち、Ｏ．５ｍ１の２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８、０．４ｍｌの０．２５ｍＭＣａＣｌ２、１ｍｌの０．４％ペクチン酸ナトリウム水溶液とＯ．１ｍ１の粗酵素を混合し、６０℃で反応させた。２ｍｌの５０ｍＭＨＣｌを加えて反応を止めた後、４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘクス４−エノピラノシルウロン酸残基の生成を２３５ｎｍの吸光度により測定し、ペクチン酸リアーゼ活性を有する形質転換体を１株取得した。
【００４９】
さらに、ジガラクツロン酸およびトリガラクツロン酸に対する作用を調べた。これら基質の加水分解物の確認は１１０℃、３０分熱処理したシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＭＡＣＨＥＲＹ−ＮＡＧＥＬ社製、ＳＩＬ Ｇ−２５）を用いて行い、酵素反応は８μ１の０．４％（ｗｔ／ｖｏ１）各基質溶液、２μ１上記粗酵素液、２μ１の２００ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８を￥ｌｏｃｈ混合し、６０℃、１２時間反応させた。薄層クロマトグラフィーの展開溶媒は１一ブタノール：水：酢酸（５：３：２、ｖｏ１／ｖｏ１）を用いた。展開後は風乾させ、硫酸噴霧、及び１４０℃、５分の処理により発色させた。その結果、該ペクチン酸リアーゼはトリガラクツロン酸に対して作用した。
【００５０】
（４）組換えプラスミドの調製
上記（３）で選択した形質転換体をアンピシリン（５０μ１／ｍ１）を含む１００ｍｌのＬＢ培地にて３７℃、一晩培養、集菌した。滅菌水による洗浄後、５ｍｌの溶液Ｉ（２５ｍＭグルコース、１０ｍＭＥＤＴＡ，２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１（ＰＨ８．Ｏ））に懸濁し、２５ミリグラムのリゾチームを添加し、０℃、３０分間放置した。１０ｍ１の溶液ＩＩ（１Ｎ−ＮａＯＨ、５％ＳＤＳ）を加え、Ｏ℃、５分間放置し、さらに、７．５ｍ１の溶液ＩＩＩ（３Ｍ酢酸ナトリウム（ＰＨ４．８））を加え、Ｏ℃、３０分間放置した。これを遠心し、その上清に５０ｍ１のエタノールを加え、さらに遠心し上清を取り除き５ｍＩの溶液ＩＶ（１０ミリミリリットル酢酸ナトリウム、５０リットルＴｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８．０）とリボヌクレアーゼＡ溶液（１０ミリグラム／ミリリットル）２．５μ１を加え室温で２０分間放置した。これに１２ｍ１のエタノールを加え、遠心によりプラスミドを回収、７０％エタノールで洗浄、乾燥後０．４ｍ１の減菌水に溶解した。こうして得られた組換え体プラスミドをｐＰＥＬ９Ａ−１と名付けた。
【００５１】
（５）挿入断片の塩基配列の決定
上記（４）で得られたｐＰＥＬ９Ａ−１を複数の制限酵素で切断し、制限酵素地図を作製し （図１参照）、また、常法によりサブクローニングを行った。すなわち、制限酵素としてＨｉｎｄＨＩ，ＮｄｅＩ，ＳａｃＩを用い、ｐＰＥＬ９Ａ−１を部分切断後、切断部位をＴ４ＤＮＡリガーゼにより再結合したプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに再度形質転換し、上記（４）と同様の方法で、プラスミドを複数調製した。これらをプライマー蛍光標識法自動ＤＮＡシーケンサー（ＬＩ−ＣＯＲＥ社製、ｍｏｄｅ１４０００Ｌ）により挿入断片の塩基配列を解析した。その結果、３７２０ｂｐの遺伝子配列（配列番号１）およぴ、１２４０個の推定アミノ酸配列（配列番号２）が得られ、この遺伝子をｐｅｌ９Ａと命名した。
【００５２】
次に、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）データベースにより相同性を有する酵素を検索した。本酵素は、多糖リアーゼのファミリー９に分類される触媒ドメインを２つ持つ酵素であり、Ｎ末端側ドメインとＣ末端側ドメインの間の相同性は２１％であった（図２参照）。本酵素はバチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉ１１ｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）のＰｅｌＸと約５３％の相同性を示した。また、本酵素のＣ末端側ドメインはクレブシェラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）ＰｅｌＸと３２％の相同性、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）ｐｅｌと３１％の相同性、バチルス・エスピーＫＳＭ−Ｐ１５ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−Ｐ１５）のＰｅｌと４７％の相同性、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）と４１％の相同性を示した。 （図３，図４，図５参照）。
【００５３】
（６）ペクチン酸リアーゼの精製
（ｉ） 組換えプラスミドの構築
ｐｅｌ９Ａ遺伝子の読み枠をＰＣＲ法で増幅しプラスミドベクターｐＱＥ−３０Ｔに連結した。すなわち、ｐＰＥＬ９Ａ−１を鋳型とし、プライマーとしてプライマー１（ＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＡＴＧＣ）とプライマー２（ＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＧＧＧ）を用いて常法に従いｐｅｌ９Ａ遺伝子を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、同じくＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断した発現ベクタープラスミドｐＱＥ−３０Ｔ（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６３， １５９６−１６０４， １９９９）にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。構築したプラスミド（ｐＰＥＬ９Ａ−２）を常法通り形質転換法にて、大腸菌Ｍ−１５株に導入した。
【００５４】
（ｉｉ）ペクチン酸リアーゼの精製
プラスミドｐＰＥＬ９Ａ−２を保有する大腸菌組換え体を、５００ｍｌのＬＢ培地（ポリベプトン１．Ｏ％、酵母エキスＯ．５％、ＮａＣ１Ｏ．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃、一晩振とう培養した。遠心分離により回収した菌体を、１０ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に懸濁し、５ｘ３０秒の超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離により菌体破砕物を除去し、澄明な液を得た。この粗酵素溶液をＨｉｓＴｒａｐ キレーティングカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に吸着させた後、イミダゾール（ｐＨ７．４）の濃度勾配により蛋白質を溶出させた。回収したペクチン酸リアーゼを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に対して透析しイミダゾールを除いた後、ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ カラム（１ｍｌ）に吸着させた。吸着した蛋白質を食塩の濃度勾配により溶出し、各画分の純度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べ、単一のバンドにまで純化されたペクチン酸リアーゼを得た。
【００５５】
（７）Ｎ末端側ドメイン蛋白質の単独発現と精製
（ｉ）組換えプラスミドの構築
Ｎ末端側ドメインをコードする領域をＰＣＲ法で増幅しプラスミドベクターｐＱＥ−３０Ｔに連結した。すなわち、ｐＰＥＬ９Ａ−１を鋳型とし、プライマーとしてプライマー１（ＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＡＴＧＣ）とプライマー３（ＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＡＣＴＧＴＴＡＣＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＡＴＣＧＧ）を用いて常法に従いＮ末端側ドメインをコードする領域を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、同じくＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断した発現ベクタープラスミドｐＱＥ−３０Ｔ（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６３， １５９６−１６０４， １９９９）にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。構築したプラスミド（ｐＰＥＬ９Ａ−３）を常法通り形質転換法にて、大腸菌Ｍ−１５株に導入した。
【００５６】
（ｉｉ）Ｎ末端側ドメイン蛋白質の精製
プラスミドｐＰＥＬ９Ａ−３を保有する大腸菌組換え体を、５００ｍｌのＬＢ培地（ポリベプトン１．Ｏ％、酵母エキスＯ．５％、ＮａＣ１Ｏ．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃、一晩振とう培養した。遠心分離により回収した菌体を、１０ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に懸濁し、５ｘ３０秒の超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離により菌体破砕物を除去し、澄明な液を得た。この粗酵素溶液をＨｉｓＴｒａｐ キレーティングカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に吸着させた後、イミダゾール（ｐＨ７．４）の濃度勾配により蛋白質を溶出させた。回収したＮ末端側ドメイン蛋白質を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に対して透析しイミダゾールを除いた後、ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ カラム（１ｍｌ）に吸着させた。吸着した蛋白質を食塩の濃度勾配により溶出し、各画分の純度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べ、単一のバンドにまで純化されたＮ末端側ドメイン蛋白質を得た。
【００５７】
（８）Ｃ末端側ドメイン蛋白質の単独発現と精製
（ｉ）組換えプラスミドの構築
Ｃ末端側ドメインをコードする領域をＰＣＲ法で増幅しプラスミドベクターｐＱＥ−３０Ｔに連結した。すなわち、ｐＰＥＬ９Ａ−１を鋳型とし、プライマーとしてプライマー４（ＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＡＣＣＣＴＣＡＡＧＧＴＡＡＣＡＧＴＧＡＧＧＧ）とプライマー２（ＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＧＧＧ）を用いて常法に従いＣ末端側ドメインをコードする領域を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、同じくＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断した発現ベクタープラスミドｐＱＥ−３０Ｔ（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６３， １５９６−１６０４， １９９９）にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。構築したプラスミド（ｐＰＥＬ９Ａ−４）を常法通り形質転換法にて、大腸菌Ｍ−１５株に導入した。
【００５８】
（ｉｉ）Ｃ末端側ドメイン蛋白質の精製
プラスミドｐＰＥＬ９Ａ−４を保有する大腸菌組換え体を、５００ｍｌのＬＢ培地（ポリベプトン１．Ｏ％、酵母エキスＯ．５％、ＮａＣ１Ｏ．５％、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃、一晩振とう培養した。遠心分離により回収した菌体を、１０ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に懸濁し、５ｘ３０秒の超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離により菌体破砕物を除去し、澄明な液を得た。この粗酵素溶液をＨｉｓＴｒａｐ キレーティングカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に吸着させた後、イミダゾール（ｐＨ７．４）の濃度勾配により蛋白質を溶出させた。回収したＣ末端側ドメイン蛋白質を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８に対して透析しイミダゾールを除いた後、ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ カラム（１ｍｌ）に吸着させた。吸着した蛋白質を食塩の濃度勾配により溶出し、各画分の純度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べ、単一のバンドにまで純化されたＣ末端側ドメイン蛋白質を得た。
【００５９】
（９）ペクチン酸リアーゼ、Ｎ末端側ドメイン蛋白質及びＣ末端側ドメイン蛋白質の活性の比較
ペクチン酸リアーゼ活性は、ペクチン酸を基質として確認した。すなわち、Ｏ．５ｍ１の２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ８、０．４ｍｌの０．２５ｍＭＣａＣｌ２、１ｍｌの０．４％ペクチン酸ナトリウム水溶液とＯ．１ｍ１の粗酵素を混合し、６０℃で反応させた。２ｍｌの５０ｍＭＨＣｌを加えて反応を止めた後、４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘクス４−エノピラノシルウロン酸残基の生成を２３５ｎｍの吸光度により測定した。１分間あたり１μｍｏｌの４−デオキシ−Ｌ−トレオ−ヘクス４−エノピラノシルウロン酸を生成する活性を１ユニット（Ｕ）とすると、ペクチン酸リアーゼ、Ｎ末端側ドメイン蛋白質及びＣ末端側ドメイン蛋白質の比活性はそれぞれ５８Ｕ／μｇ、１０Ｕ／μｇ、３０ Ｕ／μｇであった。この結果は、触媒ドメインが２つ連結することにより、酵素活性が相乗的に高まることを示した。また、これら３種の酵素の至適温度は６５℃であった。
【００６０】
【発明の効果】
本発明によるクロストリジウム・ステルコラリウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）ＦＥＲＭ Ｐ−１８７４５株
由来のペクチン酸リアーゼＰｅｌ９Ａは、その分子内に２つの触媒ドメインを有しており、それらが分子内相乗効果を発揮し、従来の単一触媒ドメインからなる酵素に比較し強力な分解活性を示す。またＰｅｌ９Ａは好熱性細菌由来であるため耐熱性に優れており、従来より高温で糖質を処理することができる。
【００６１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＰＥＬ９Ａ−１、ｐＰＥＬ９Ａ−２、ｐＰＥＬ９Ａ−３及びｐＰＥＬ９Ａ−４の制限酵素を示す地図。
【図２】Ｎ末端側ドメインとＣ末端側ドメインとの間の相同性を示す図。
【図３】ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）により相同性を有する酵素を検索した結果を示す図。
【図４】同上。
【図５】同上。
【符号の説明】
Ｃｓ 本発明のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ
Ｂｈ Ｂ． Ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ
Ｋｏ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ
Ｅｒ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ
Ｂ．ｓｐ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．
Ｓｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ
Claims (7)
- 次の（ａ）又は（ｂ）の性質を有する組換えタンパク質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質。 - 請求項１に記載の組換えタンパク質をコードする遺伝子。
- 次の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含むことを特徴とする遺伝子。
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 請求項３に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項５に記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物からペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、該タンパク質の製造方法
- クロストリジウム・ステルコラリウムに属する細菌を培地に培養し、得られる培養物からペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、該タンパク質の製造方法。
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