JPH0121956B2

JPH0121956B2 -

Info

Publication number: JPH0121956B2
Application number: JP15985480A
Authority: JP
Inventors: Takuo Sakai; Kyonin Gu
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1980-11-13
Filing date: 1980-11-13
Publication date: 1989-04-24
Also published as: JPS5783286A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はプロトペクチン可溶化酵素の調製法に
関する。プロトペクチン可溶化酵素は果汁の清澄あるい
は植物組織の破砕に利用され実用に供されてい
る。プロトペクチン可溶化酵素の調製には、イオ
ン交換クロマトグラフイー、ゲル過などが利用
されていたが、酵素収率は高くない。また、ペクチンゲルを吸着体としたアフイニテ
イークロマトグラフイーを用いて本発明で用いる
プロトペクチン可溶化酵素と同類の酵素であるエ
ンド・ポリガラクチユロナーゼを調製する方法も
知られているが、該方法において用いられるペク
チンゲルは軟かくて、実用に供し得ないものであ
る。そこで本発明者等は、プロトペクチン可溶化酵
素を調製する際のクロマトグラフイー用ゲルとし
て適当なゲルを見出すべく鋭意検討した結果、デ
ンプンとペクチンの混合物を固定化することによ
り、プロトペクチン様のゲルを作ることができ、
該ゲルを吸着体とする１回のアフイニテイークロ
マトグラフイーにより、培養液からプロトペク
チン可溶化酵素を高収率で分離精製しうることを
見出し本発明を達成した。すなわち、本発明の要旨は、プロトペクチン可
溶化酵素を含む混合物から、デンプンとペクチン
の混合物を不溶化したゲルを吸着体とするアフイ
ニテイークロマトグラフイーにより、プロトペク
チン可溶化酵素を分離精製することを特徴とする
プロトペクチン可溶化酵素の調製法に存する。本発明を詳細に説明するに、吸着体として用い
られる、デンプンとペクチンの混合物を不溶化し
たゲルは、次のようにして調製される。まず、デンプンとペクチンの混合物を水酸化ナ
トリウム水溶液に溶解する。デンプンとしては、
可溶性デンプンが好適であるが、その他一般のデ
ンプンであつてもよい。デンプンとペクチンの混
合割合は、前者：後者の重量比で、0.3：１ない
し10：１の範囲が好ましい。水酸化ナトリウム水
溶液としては、0.5NaOH〜10N NaOHのものが
好ましい。デンプンとペクチンの混合物は、水酸
化ナトリウム水溶液中、10〜40重量％程度とする
のが好ましい。溶解後、50〜70℃程度の温度で、
数分〜数十分間程度、撹拌下に加熱される。次い
でエピクロルヒドリンを添加して50℃〜70℃で、
数分〜数時間撹拌下加熱して反応させると、ゲル
が生成するので、さらに同温度で熟成してのち、
ゲルを分離、洗浄後、20メツシユ〜40メツシユ程
度に粉砕することが好ましい。上述のようにして得られる不溶化したゲルのペ
クチン酸の部分は、次の構造を有すると推定され
る。しかして本発明においては、プロトペクチン可
溶化酵素を含む混合物から、上記ゲルを吸着体と
するアフイニテイークロマトグラフイーにより、
プロトペクチン可溶化酵素を分離精製する。プロ
トペクチン可溶化酵素を含む混合物としては、微
生物の培養液が挙げられる。微生物としては、
カビ、細菌等でもよいが、これらは一般に多種の
ペクチン質分解酵素を同時に生産するし、食品加
工用の酵素の給源としては食品衛生上必ずしも適
当ではなく、酵母が好ましい。酵母としては、ト
リコスポロンペニシレータムSNO−３株のよう
なトリコスポロン属に属するもの、サツカロマイ
セスフラジリスのようなサツカロマイセス属に
属するもの、エンドミコプシスカプスラリス等
のエンドミコプシス属に属するもの等が挙げられ
る。また、ガラクトマイセスリーシーＬ（工業技
術院微生物工業研究所に寄託され、その微生物
（受託番号は微工研菌寄第5726号である。）のよう
なガラクトマイセス属に属するもの等も挙げられ
る。分離精製は、酵母の培養液のような微生物の
培養液の場合は、培養液そのまゝに上記不溶
化ゲルを加えてアフイニテイークロマトグラフイ
ーをおこなつてもよいが、培養液をその酵素の
活性最適PH附近のPHをもつ緩衝液に対して透析し
ておくことが好ましい。透析後上記不溶化ゲルを
加えて撹拌し吸着させる。吸着後ゲルをカラムに充填し、酢酸塩緩衝液で
洗浄後、溶出する。溶出溶媒としては、食塩濃度
０〜0.2Mの濃度勾配の緩衝液が挙げられる。以上のような本発明方法によれば、プロトペク
チン可溶化酵素を、簡易な方法で、高収率で分離
精製することができる。分離できるプロトペクチ
ン可溶化酵素は、プロトペクチナーゼ、ポリガラ
クチユロナーゼ等である。以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明
する。実施例１ (1) 吸着体の調製可溶性デンプンとペクチンの２：１（重量比）
の混合物３ｇを12.5mlの3.5N水酸化ナトリウム
水溶液に溶解し、60℃で30分間撹拌した。次い
でエピクロルヒドリン15mlを加えて60℃で60分
間撹拌してのち、同じく60℃で60分間放置し
た。得られたゲルを粉砕し35メツシユとした。
このゲルを充分に水洗し精製に用いた。 (2) トリコスポロンペニシレータムSNO−３
株の培養トリコスポロンペニシレータム
（Trichosporon penicillatum）SNO−３株
（発酵と工業、第37巻、928〜939頁、1979年に
記載されている）を、グルコース2.0ｇ、イー
ストエキス0.2ｇ、ペプトン0.4ｇ、シリコン
KM70（信越化学株式会社製）0.08mlおよび水
100mlからなるPH5.0の培地中で、30℃で24時間
培養した。プロトペクチン可溶化酵素活性は、
90単位／mlであつた。なお、酵素活性の測定は
次のようにしておこなつた。プロトペクチン10mg及び0.02M酢酸塩緩衝液
（PH5.0）0.02Mに検定サンプルの酵素溶液0.5ml
を加え全量2.5mlとし、37℃で30分間反応させ
たのち、過し、遊離してくるペクチン質をカ
ルバゾール・硫酸反応によつて定量することに
よつて測定した。酵素活性の１単位は、30分で
反応混合物１mlあたり、ガラクチユロン酸
1μmoleに相当するペクチンを遊離する酵素の
量で定義される。なお、基質のプロトペクチンは、温州ミカン
の果皮のアルベド層を集め、細かく砕き、水洗
をくりかえして水可溶性のペクチン質を完全に
除去し、次いでこれを凍結乾燥し、さらに100
〜200メツシユの大きさに粉砕したものをプロ
トペクチン標品とした。 (3) 分離精製 (2)で得られた培養液１を0.01M酢酸塩緩
衝液PH5.0に透析して塩を除去したのち（１ml
あたり200〜300単位のプロトペクチン可溶化酵
素を含む）、１mlあたり50mgの割合で、(2)で得
られた不溶化ゲルを加えた。５℃で30分間撹拌
し、10000rpmで５分間遠心した。沈澱したゲ
ルを集め、カラムに充填し、0.01M酢酸塩緩衝
液PH5.0で洗浄した。次いで、食塩濃度０〜
0.3Mの濃度勾配の0.01M酢酸緩衝液PH5.0によ
つて酵素を溶出した。食塩0.1Mの濃度で電気
泳動的に均一なプロトペクチン可溶化酵素が約
80％の収率で得られた。タンパク質含量は約１
mg、プロトペクチン可溶化酵素活性は約5700単
位、比活性は5700単位／mg蛋白であり、発酵と
工業、第37巻、928〜939頁、1979年に記載され
ている酵素と同一であつた。実施例２トリコスポロンペニシレータムのかわりに、
サツカロマイセスフラジリス（Ｓ
accharomyces fragilis、発酵と工業、第37巻
928〜939頁、1979年に記載されている）を用い
て、実施例１の(2)と同一の培地、培養条件で培養
した。培養液から、実施例１の(1)の不溶化ゲルを
用いて、酢酸緩衝液のPHを4.0とする以外は実施
例１の(3)と同様の条件で、アフイニテイークロマ
トグラフイーをおこなつた。収率85％でプロトペクチン可溶化酵素を得た。
これは、発酵と工業、第37巻、928〜939頁、1979
年に記載された酵素と同一であつた。実施例３実施例１の(1)において、可溶性デンプンとペク
チンの１：１（重量比）の混合物３ｇを用いるほ
かは、実施例１の(1)と同様にして、不溶化ゲルを
調製した。このゲルを用いて、実施例１の(2)、(3)と同様に
して、プロトペクチン可溶化酵素を分離精製し
た。収率は90％であつた。実施例４ (1) ガラクトマイセスリーシーＬの培養ガラクトマイセスリーシーＬ〔ジヤーナル
オブマイクロバイオロジーアンドセロロジー
第25巻458〜464頁（1959年）及びカナデイアン
ジヤーナルオブボタニー第55巻1701〜1711
（1977年）に記載されている既知種で、ガラク
トマイセスリーシー（フアンデルワルト）レツ
ドヘツドエトマロツク、Ｌ菌株の菌学的性質は
文献の記載と合致する〕、グルコース0.5ｇ、カ
ゼイン酸分解物0.4ｇ、KNO₃0.11ｇ、
MgSO₄・7H₂O0.05ｇ、CaCl₂0.01ｇ、チアミン
−HCl50μｇ、ピリドキシン−HCl50μｇおよび
100mlの水からなる培地（PH5.0）で、30℃で24
時間培養した。培養液20には、6450mgのタ
ンパク質が含まれ、735×10³単位のプロトペク
チン可溶化酵素活性が認められた。 (2) 分離精製 (1)で得られた培養液を0.01M酢酸塩緩衝液
PH5.0に透析し、同じ緩衝液で平衡化した実施
例１の(1)のペクチン不溶化ゲルのカラムに通塔
した。0.01M酢酸塩緩衝液（PH5.0）を通塔す
ることにより、カラムを洗滌し、非吸着タンパ
ク質を除去した後、食塩濃度０〜0.2Mの濃度
勾配の0.01M酢酸緩衝液PH5.0によつて酵素を
溶出した。食塩0.1Mの濃度で電気泳動的に均
一なプロトペクチン可溶化酵素が90％の収率で
溶出された。タンパク質含量は150mg、プロト
ペクチン可溶化酵素活性は594×10³単位、比活
性は3945単位／mg蛋白であつた。得られた酵素
溶液を50％硫安0.02M酢酸緩衝液PH5.5に対し
て透析すると、板状の形状を有する結晶が得ら
れたが、結晶は形状が不安定でこわれやすかつ
た。 (3) (2)で得られた酵素の性質 (イ) 作用および基質特異性プロトペクチンを分解し可溶化する酵素
で、一種のエンド・ポリガラクチユロナーゼ
である。ガラクチユロン酸オリゴマーに対す
る作用様式については、ガラクチユロン酸ダ
イマーには作用せず、トリマーをダイマーと
モノマーに非常に遅い速度ではあるが分解す
る。またテトラマーを、トリマーとモノマー
および２分子のダイマーの２形式で分解す
る。さらにペンタマーをトリマーおよびダイ
マーに分解する。なお、本酵素は植物組織中のプロトペクチ
ンによく作用する。 (ロ) 至適PH 本酵素の至適PHは、PH3.5〜5.5の範囲にあ
る。 (ハ) 安定PH範囲本酵素を50℃で30分間処理したときPH２〜
6.5で安定である。 (ニ) 作用適温の範囲 PH5.0の条件下、種々の温度で30分間反応
させ、活性に及ぼす温度の影響を調べたとこ
ろ45〜55℃に至適温度を有する。また、本酵
素を、PH5.0の条件下種々の温度で30分間処
理したとき55℃以下で安定である。 (ホ) 分子量牛血清アルブミン、卵アルブミン、α−チ
モトリプシノーゲンＡ、ミオグリビン、チト
クロムＣを内部標準とするSDS−電気泳動に
よると約40000、チトクロムＣ、リゾチーム、
α−チモトリプシノーゲンＡ、卵アルブミ
ン、牛血清アルブミンを内部標準とするセフ
アデツクスＧ−75ゲル（セフアデツクスはフ
アルマシア・フアイン・ケミカル社製ゲル
過剤、商標）によると約30000、26000rpmで
の沈降平衡法によると約26800である。 (ヘ) 沈降定数、等電点沈降平衡法により測定した沈降定数は、
2.99Sであり、焦点電気泳動法により測定し
た等電点（PH）は8.4〜8.5である。 (ト) 糖含量フエノール−硫酸法によつて求めた糖含量
はペントースとして、3.2重量％である。 (チ) 阻害化 Hg⁺またはBa²⁺により阻害化される。 (リ) 結晶形硫安溶液に対して透析することによつて結
晶化した。結晶は板状の形状を有するが、不
安定でこわれ易い。 (ヌ) アミノ酸組成（分子比）リジン 19、ヒスチジン７アルギニン４、トリプトフアン 11 アスパラギン酸 42、スレオニン 22 セリン 33、グルタミン酸 20 プロリン７、グリシン 43 アラニン 18、ハーフシスチン１バリン 20、イソロイシン 24 ロイシン 13、チロシン７フエニルアラニン９、糖質８（ペントースとして） (ル) 比活性プロトペクチン可溶化酵素比活性は3945単
位／mg蛋白である。 (ヲ) 吸光度水溶液中１％溶液の１cm厚のセルを用いた
280nｍの吸光度Ｅ１％ 1cm、280nmは11.93であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１プロトペクチン可溶化酵素を含む混合物か
ら、デンプンとペクチンの混合物を不溶化したゲ
ルを吸着体とするアフイニテイークロマトグラフ
イーにより、プロトペクチン可溶化酵素を分離精
製することを特徴とするプロトペクチン可溶化酵
素の調製法。２プロトペクチン可溶化酵素を含む混合物が、
微生物の培養液である特許請求の範囲第１項記
載の調製法。３デンプンとペクチンの混合物が、重量比で
0.3：１ないし10：１の範囲の混合物である特許
請求の範囲第１項または第２項記載の調製法。４デンプンとペクチンの混合物を水酸化ナトリ
ウム水溶液に溶解して加熱し、次いでエピクロル
ヒドリンを加えてさらに加熱することにより得ら
れる不溶化したゲルを吸着体とする特許請求の範
囲第１項ないし第３項記載の調製法。５微生物が酵母である特許請求の範囲第２項記
載の調製法。