JPH01132381A - ヘパリチナーゼ及びその製造法 - Google Patents
ヘパリチナーゼ及びその製造法Info
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- JPH01132381A JPH01132381A JP29062687A JP29062687A JPH01132381A JP H01132381 A JPH01132381 A JP H01132381A JP 29062687 A JP29062687 A JP 29062687A JP 29062687 A JP29062687 A JP 29062687A JP H01132381 A JPH01132381 A JP H01132381A
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明はヘパリチナーゼに関するものである。
ヘパリチナーゼはｌ（Ｓを特異的に分解する酵素であり
、類似の構造を有するＨｅｐも分解する場合がある。従
来のヘパリチナーゼは微生物（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒ
ｕｍ ｈａｐａｒｉｎｕｍ）から抽出したものであり、
当該酵素とＨ５を分解する点については共通するが、そ
の他の性質は全く異なるものである。また哺乳類のヘパ
リチナーゼは血小板から見出されている。当該酵素はＨ
φから新規に見出された酵素であり、血小板起源のもの
と同一であるか不明である。
、類似の構造を有するＨｅｐも分解する場合がある。従
来のヘパリチナーゼは微生物（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒ
ｕｍ ｈａｐａｒｉｎｕｍ）から抽出したものであり、
当該酵素とＨ５を分解する点については共通するが、そ
の他の性質は全く異なるものである。また哺乳類のヘパ
リチナーゼは血小板から見出されている。当該酵素はＨ
φから新規に見出された酵素であり、血小板起源のもの
と同一であるか不明である。
血小板起源のヘパリチナーゼを製造する場合、血小板は
人為的に培養できないため、該酵素を大量に製造するこ
とは非常に困難であるので、目的の酵素を得るには、そ
のコストが高くなるという欠点がある。
人為的に培養できないため、該酵素を大量に製造するこ
とは非常に困難であるので、目的の酵素を得るには、そ
のコストが高くなるという欠点がある。
発明者等は、その給源を培養可能な哺乳類細胞に求め、
広くスクリーニングした結果。
広くスクリーニングした結果。
株化阿φからヘパリチナーゼを採取することに成功し、
しかも阿φを種々の活性化物質（例えばＬＰＳ等）で活
性化することにより、Ｈφの本酵素産生能が著しく先進
することを見出しこの発明に到達した。
しかも阿φを種々の活性化物質（例えばＬＰＳ等）で活
性化することにより、Ｈφの本酵素産生能が著しく先進
することを見出しこの発明に到達した。
すなわちこの発明は少なくとも下記の性質（１）〜（６
〕を有する新規なヘパリチナーゼである。
〕を有する新規なヘパリチナーゼである。
（１）作用：ヘパラン硫酸（ｌ（Ｓ）及び類似のグリコ
シド結合を有するヘパリン（Ｈｅｐ）に作用してオリゴ
糖を生ずる。
シド結合を有するヘパリン（Ｈｅｐ）に作用してオリゴ
糖を生ずる。
（２）至適ＰＩ（： ７．０〜７．５
（３）至適温度＝３７〜４０°Ｃ
（４）分子量：約９８，０００（１０％ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動法による。） 一３＝ （５）安定ｐＨは６〜７である。
リルアミドゲル電気泳動法による。） 一３＝ （５）安定ｐＨは６〜７である。
（６）安定温度は４０°Ｃ以下である。
次に、第１図から第４図に基づき、上記性質を詳細に説
明する。
明する。
（１）作用：Ｈ５を分解し、オリゴ糖を生成する。
Ｈ５と類似のグリコシド結合を有するＨｅｐに作用し、
分解する場合もある。
分解する場合もある。
（２）至適ｐＨ：第１図に示されるように、至適ｐＨは
７．０〜７．５である。至適ｐ！（の測定は０．１５Ｍ
ＮａＣＱと牛血清アルブミン（ＢＳＡ 、 ２０ Ｄ
ｇ／ｍ Ｑ ）を含むｌｏｍＭの各種緩衝液に酵素を加
えて、３７℃で行なった。ヘパリチナーゼ活性測定はＣ
Ｎ −セファロースに固定化したＨ５を基質とし、反応
させた後、遊離したｌ（Ｓフラグメントを硫酸カルバソ
ール法で測定した。活性単位は１時間にＡ、５３０ｎｍ
０．０１上昇させる酵素力価を一単位とした。第一図中
○−０は酢酸ナトリウム、・−・はリン酸カリウム、△
−△はトリス・塩酸緩衝液を示す。
７．０〜７．５である。至適ｐ！（の測定は０．１５Ｍ
ＮａＣＱと牛血清アルブミン（ＢＳＡ 、 ２０ Ｄ
ｇ／ｍ Ｑ ）を含むｌｏｍＭの各種緩衝液に酵素を加
えて、３７℃で行なった。ヘパリチナーゼ活性測定はＣ
Ｎ −セファロースに固定化したＨ５を基質とし、反応
させた後、遊離したｌ（Ｓフラグメントを硫酸カルバソ
ール法で測定した。活性単位は１時間にＡ、５３０ｎｍ
０．０１上昇させる酵素力価を一単位とした。第一図中
○−０は酢酸ナトリウム、・−・はリン酸カリウム、△
−△はトリス・塩酸緩衝液を示す。
（３）至適温度：第２図に示される通り、３７〜４００
Ｃである。至適温度の測定は０．１５Ｍ ＮａＣ１）と
ＢＳＡ （２０ｐ ｇ／ｍ Ｑ ）を含む１０ｍＭ ト
リス・塩酸（ｐＨ７，５）中に酵素を加えて行なった。
Ｃである。至適温度の測定は０．１５Ｍ ＮａＣ１）と
ＢＳＡ （２０ｐ ｇ／ｍ Ｑ ）を含む１０ｍＭ ト
リス・塩酸（ｐＨ７，５）中に酵素を加えて行なった。
酵素活性の測定は上記（２）と同様の方法で行なった。
（４）分子量：１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動法によると９８．ＯＯＯＭＤであり、電気泳動的
には単一である。電気泳動はり、Ｌａｅｍｌｉの方法に
準じて行なった。すなわち、本酵素を２．３％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＯ３）、 ５％メルカプトエタノ
ール、ｌθ％クリセロール（ｐ］１６．８）に加えて、
３分間ＳＤＳ化した。分子量標準蛋白はγ−グロブリン
（分子量１６０，０００）、グリセルアルテヒトホスフ
エイト脱水素酵素（分子量１２０，０００）、牛血清ア
ルブミン（分子量６７．０００）、卵白アルブミン（分
子量４３，０００）を用いた。
気泳動法によると９８．ＯＯＯＭＤであり、電気泳動的
には単一である。電気泳動はり、Ｌａｅｍｌｉの方法に
準じて行なった。すなわち、本酵素を２．３％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＯ３）、 ５％メルカプトエタノ
ール、ｌθ％クリセロール（ｐ］１６．８）に加えて、
３分間ＳＤＳ化した。分子量標準蛋白はγ−グロブリン
（分子量１６０，０００）、グリセルアルテヒトホスフ
エイト脱水素酵素（分子量１２０，０００）、牛血清ア
ルブミン（分子量６７．０００）、卵白アルブミン（分
子量４３，０００）を用いた。
（５）ｐＨ安定性：第３図に示されるように、ｐＨ６，
０〜７．０である。ｐ）Ｉ安定性の測定は４℃、２４時
時間縁衝液（いずれも０．１５Ｍ ＮａＣＱを含む１０
ｍＭ濃度である）中において行なった。酵素活性の測定
は上記（２）と同様の方法で行なった。
０〜７．０である。ｐ）Ｉ安定性の測定は４℃、２４時
時間縁衝液（いずれも０．１５Ｍ ＮａＣＱを含む１０
ｍＭ濃度である）中において行なった。酵素活性の測定
は上記（２）と同様の方法で行なった。
第三図中のＱ−０は酢酸ナトリウム、・−・はリン酸カ
リウム、Δ−△はトリス・塩酸緩衝液を示す。
リウム、Δ−△はトリス・塩酸緩衝液を示す。
（６）温度安定性：第４図に示される通り、４０℃以下
である。本酵素を０．１５Ｍ ＮａＣＱとＢＳＡ（２０
Ｍｇ／ＷＩＱ）を含む１０ＩＩＩＭトリス・塩酸緩衝液
（ｐＨ７，５）中、１５分間各温度で処理した後、残存
酵素活性を測定した。その方法は上記（２）と同様の方
法で行なった。〔発明の効果〕 転移性腫瘍細胞やリンパ球が血管外露出時に産生ずるヘ
パリチナーゼにより、血管内皮基底膜の主成分の一つで
ある。ヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸部
が分解されてそれらの細胞が移動している可能性が高い
と報告されている。また動脈硬化初期にみられる血液単
球由来マクロファージや平滑筋細胞の移動も同様の機構
によるものと考えられている。このように当該酵素は腫
瘍細胞の転移及び動脈硬化初期病変におけるＨφや平滑
筋細胞の血管的皮下侵入に非常に深く関わっており、こ
れらの機構解明に多大な貢献が期待される。
である。本酵素を０．１５Ｍ ＮａＣＱとＢＳＡ（２０
Ｍｇ／ＷＩＱ）を含む１０ＩＩＩＭトリス・塩酸緩衝液
（ｐＨ７，５）中、１５分間各温度で処理した後、残存
酵素活性を測定した。その方法は上記（２）と同様の方
法で行なった。〔発明の効果〕 転移性腫瘍細胞やリンパ球が血管外露出時に産生ずるヘ
パリチナーゼにより、血管内皮基底膜の主成分の一つで
ある。ヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸部
が分解されてそれらの細胞が移動している可能性が高い
と報告されている。また動脈硬化初期にみられる血液単
球由来マクロファージや平滑筋細胞の移動も同様の機構
によるものと考えられている。このように当該酵素は腫
瘍細胞の転移及び動脈硬化初期病変におけるＨφや平滑
筋細胞の血管的皮下侵入に非常に深く関わっており、こ
れらの機構解明に多大な貢献が期待される。
次にこの発明を実施例により説明する。
［実施例］
Ｈφ（Ｐ３８８Ｄ１）を１０％牛脂児血清を加えたＲＰ
Ｍ１１６４０培地、５％ＣＤ、、３７°Ｃで培養した後
、無血清培地に変換し、同一条件下で培養した。
Ｍ１１６４０培地、５％ＣＤ、、３７°Ｃで培養した後
、無血清培地に変換し、同一条件下で培養した。
培地中にＬＰＳを最終濃度が２０μｇ／ｒｎ Ｑになる
ように加え、さらに同一条件下で１８時間培養した。
ように加え、さらに同一条件下で１８時間培養した。
この活性化処理した阿φ（Ｐ３８８Ｄ１＞１．２ｇを０
．１％トリトン・メー１００と０．１５Ｍ ＮａＣＱを
含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，０）に懸
濁し、ガラスピーズにて１５分間磨砕した。遠心分離に
より上清を採取し、 １０ｍＭ上記緩衝液に対して４℃
で透析した。これをＤＥＡＥ・トヨバールカラムに負荷
し、非吸着画分を直接ＡＨセファロースに固定化したヘ
パリン・セファロース刀ラムに負荷し、ＮａＣＱ濃度を
高めて溶出した。本画分を上記緩衝液に対して透析した
後。
．１％トリトン・メー１００と０．１５Ｍ ＮａＣＱを
含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，０）に懸
濁し、ガラスピーズにて１５分間磨砕した。遠心分離に
より上清を採取し、 １０ｍＭ上記緩衝液に対して４℃
で透析した。これをＤＥＡＥ・トヨバールカラムに負荷
し、非吸着画分を直接ＡＨセファロースに固定化したヘ
パリン・セファロース刀ラムに負荷し、ＮａＣＱ濃度を
高めて溶出した。本画分を上記緩衝液に対して透析した
後。
コンカナバリンＡセファロースカラムに負荷し、１．０
ＭＮ−アセチルクルコサミン（又は１．０Ｍクルコース
）を含む上記緩衝液でヘパリチナーゼを溶出した。濃縮
したヘパリチナーセ画分をトヨバールＨυ５５ＳＦで再
ゲル濾過した。本画分を再度コンカナバリンＡセファロ
ースカラムに負荷し上記方法でヘパリチナーゼを溶出し
た。さらにトヨバール１（Ｉｄ５５３Ｆで再ゲル濾過し
た後、精製へバリチナーゼを４℃で蒸留水に対し透析し
、凍結乾燥した。収量は１８４μｇ２回収率は９．１％
、比活性４．５Ｉ４単位／Ｂ蛋白であり、１０％ＳＤＳ
電気泳動で単一のバンドとなった。得られた酵素の性状
は既述の都りである。
ＭＮ−アセチルクルコサミン（又は１．０Ｍクルコース
）を含む上記緩衝液でヘパリチナーゼを溶出した。濃縮
したヘパリチナーセ画分をトヨバールＨυ５５ＳＦで再
ゲル濾過した。本画分を再度コンカナバリンＡセファロ
ースカラムに負荷し上記方法でヘパリチナーゼを溶出し
た。さらにトヨバール１（Ｉｄ５５３Ｆで再ゲル濾過し
た後、精製へバリチナーゼを４℃で蒸留水に対し透析し
、凍結乾燥した。収量は１８４μｇ２回収率は９．１％
、比活性４．５Ｉ４単位／Ｂ蛋白であり、１０％ＳＤＳ
電気泳動で単一のバンドとなった。得られた酵素の性状
は既述の都りである。
添付図面の第１図は至適ｐＨを示すグラフ。
第２図は至適温度を示すグラフ、第３図はｐＨ安定性を
示すグラフで、第４図は温度安定性を示すグラフである
。 特許出願人 協同乳業株式会社 第１図 ３．５ ４．５ ５５ ６．５ ７．
５ Ｂ、５ ９．５Ｉ−１ 第２図 温度（６Ｃ） 第３図 ｔｓｑ コ ｔｉ ７ Ｂ
９ ｔ。 第４図 温度（”ｃ） 手続補正書（自発） 昭和６２年１２月１４日 特許庁長官 小 川 邦 夫 殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第２９０６２６号 ２、発明の名称 ヘパリチナーゼ及びその製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 協同乳業株式会社 ４、代理人 明細書の発明の詳細な説明の欄 （６，補正の内容り 明細書中 １）第６頁第１２行の［〔発明の効果〕Ｊを削除し ２）同頁第１２行と第１３行との間に次のとおり加入し 「〔発明の効果〕」 ３）同頁第１５行の［である。ヘパラン」を次のとおり
訂正し ［であるヘパランｊ ４）第８頁第５行のｒｌ、０ＭＮ−アセチル」を次のと
おり訂正し ｒｌ、、ＯＭ Ｎ−アセチル」 ５）同頁第８行の「再ゲル濾過」を次のとおり訂正する 「ゲル濾過」
示すグラフで、第４図は温度安定性を示すグラフである
。 特許出願人 協同乳業株式会社 第１図 ３．５ ４．５ ５５ ６．５ ７．
５ Ｂ、５ ９．５Ｉ−１ 第２図 温度（６Ｃ） 第３図 ｔｓｑ コ ｔｉ ７ Ｂ
９ ｔ。 第４図 温度（”ｃ） 手続補正書（自発） 昭和６２年１２月１４日 特許庁長官 小 川 邦 夫 殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第２９０６２６号 ２、発明の名称 ヘパリチナーゼ及びその製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 協同乳業株式会社 ４、代理人 明細書の発明の詳細な説明の欄 （６，補正の内容り 明細書中 １）第６頁第１２行の［〔発明の効果〕Ｊを削除し ２）同頁第１２行と第１３行との間に次のとおり加入し 「〔発明の効果〕」 ３）同頁第１５行の［である。ヘパラン」を次のとおり
訂正し ［であるヘパランｊ ４）第８頁第５行のｒｌ、０ＭＮ−アセチル」を次のと
おり訂正し ｒｌ、、ＯＭ Ｎ−アセチル」 ５）同頁第８行の「再ゲル濾過」を次のとおり訂正する 「ゲル濾過」
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次の理化学的性質を有するヘパリチナーゼ（１）作
用：ヘパラン硫酸（ＨＳ）及び類似のグリコシド結合を
有するヘパリン（Ｈｅｐ）に作用してオリゴ糖を生ずる
。 （２）至適ｐＨ：７．０〜７．５ （３）至適温度：３７〜４０℃ （４）分子量：約９８，０００（１０％ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動法による。） （５）安定ｐＨは６〜７である。 （６）安定温度は４０℃以下である。 ２、マウス株化マクロファージ（Ｍφ．Ｐ３８８Ｄ１）
を無血清培地で培養し、リポポリサッカライド（ＬＰＳ
）等のＭφ活性化物質で処理した細胞より、このヘパリ
チナーゼをヘパリン・セフアロース及びコンカナバリン
Ａセフアロースを用いて採取することを特徴とする新規
ヘパリチナーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29062687A JPH01132381A (ja) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | ヘパリチナーゼ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29062687A JPH01132381A (ja) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | ヘパリチナーゼ及びその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01132381A true JPH01132381A (ja) | 1989-05-24 |
Family
ID=17758419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29062687A Pending JPH01132381A (ja) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | ヘパリチナーゼ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01132381A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990010650A1 (en) * | 1989-03-16 | 1990-09-20 | The University Of Sydney | Cytokine |
| EP0502496A2 (en) * | 1991-03-06 | 1992-09-09 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Novel heparitinase, process for producing the same and bacteria producing the same |
| JPH06253887A (ja) * | 1993-01-26 | 1994-09-13 | Kyodo Nyugyo Kk | ヘパリチナ−ゼモノクロナ−ル抗体 |
-
1987
- 1987-11-19 JP JP29062687A patent/JPH01132381A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990010650A1 (en) * | 1989-03-16 | 1990-09-20 | The University Of Sydney | Cytokine |
| EP0502496A2 (en) * | 1991-03-06 | 1992-09-09 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Novel heparitinase, process for producing the same and bacteria producing the same |
| US5405759A (en) * | 1991-03-06 | 1995-04-11 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Heparitinase, process for producing the same and bacteria producing the same |
| JPH06253887A (ja) * | 1993-01-26 | 1994-09-13 | Kyodo Nyugyo Kk | ヘパリチナ−ゼモノクロナ−ル抗体 |
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