JP2001046097A5 - - Google Patents
Download PDFInfo
- Publication number
- JP2001046097A5 JP2001046097A5 JP1999165694A JP16569499A JP2001046097A5 JP 2001046097 A5 JP2001046097 A5 JP 2001046097A5 JP 1999165694 A JP1999165694 A JP 1999165694A JP 16569499 A JP16569499 A JP 16569499A JP 2001046097 A5 JP2001046097 A5 JP 2001046097A5
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleoside
- deoxynucleoside
- dna fragment
- deoxyribosyltransferase
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 34
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 34
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 31
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 31
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 22
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims description 21
- 108010000247 nucleoside deoxyribosyltransferase II Proteins 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 150000008266 deoxy sugars Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 claims description 3
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 10
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N Deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 9
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N dCyd Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 9
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 9
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N DEOXYTHYMIDINE Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 8
- 239000002609 media Substances 0.000 description 8
- OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 229940104302 Cytosine Drugs 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N Cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940104230 Thymidine Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl β-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 Adenine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Natural products NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 Chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N Chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N Deoxycytidine triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N Deoxyguanosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100012021 KLHL41 Human genes 0.000 description 1
- 101710042579 KLHL41 Proteins 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 229940039696 Lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940113082 Thymine Drugs 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N Uridine triphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cells Anatomy 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J dATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-J 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- -1 dialysis treatment Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 1
- 229950010342 uridine triphosphate Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このように、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼはデオキシヌクレオシドの酵素合成に有用な酵素であるものの、ラクトバシラス属に属する乳酸菌体由来の無細胞抽出液などを酵素源としてそのまま使用する従来法では以下のような問題点が指摘されていた。
（１）乳酸菌は一般に生育が悪く、大量の菌体を調製することが困難である。
（２）ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼは菌体内酵素であるため、乳酸菌を破砕する必要がある。しかし、乳酸菌の細胞壁は硬く、しかも菌体内でのヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの発現量も低く、結果としてヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの抽出効率は非常に低い。
【発明が解決しようとする課題】
このように、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼはデオキシヌクレオシドの酵素合成に有用な酵素であるものの、ラクトバシラス属に属する乳酸菌体由来の無細胞抽出液などを酵素源としてそのまま使用する従来法では以下のような問題点が指摘されていた。
（１）乳酸菌は一般に生育が悪く、大量の菌体を調製することが困難である。
（２）ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼは菌体内酵素であるため、乳酸菌を破砕する必要がある。しかし、乳酸菌の細胞壁は硬く、しかも菌体内でのヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの発現量も低く、結果としてヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの抽出効率は非常に低い。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記問題点を解決すべく、遺伝子工学的手法でヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを大量に生産させ、これをデオキシヌクレオシドの合成に使用することにより上記問題を解決できるのではないかと考え、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの組換えＤＮＡ手法による生産を試みた。しかし、従来、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ遺伝子に関する報告はなされておらず、試行錯誤を繰り返した結果、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子のクローニングに成功し、この遺伝子を用いて発現させた特定のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を用いることにより、上記従来法の欠点を克服し、効率的にデオキシヌクレオシドを合成できることを見出し、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記問題点を解決すべく、遺伝子工学的手法でヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを大量に生産させ、これをデオキシヌクレオシドの合成に使用することにより上記問題を解決できるのではないかと考え、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの組換えＤＮＡ手法による生産を試みた。しかし、従来、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ遺伝子に関する報告はなされておらず、試行錯誤を繰り返した結果、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子のクローニングに成功し、この遺伝子を用いて発現させた特定のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を用いることにより、上記従来法の欠点を克服し、効率的にデオキシヌクレオシドを合成できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩを用いて塩基受容体とデオキシ糖残基供与体とからデオキシヌクレオシドを製造する方法において、組換えＤＮＡ手法にて調製されたヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとして、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質、または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾または付加されたアミノ酸配列からなり、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を使用することを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法に関するものである。
また、本発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩを用いて塩基受容体とデオキシ糖残基供与体とからデオキシヌクレオシドを製造する方法において、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとして、以下の（ｃ）〜（ｇ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を使用することを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法に関するものである。
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｆ）上記（ｄ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片、
（ｇ）上記（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）記載のＤＮＡ断片の上流にさらにＳＤ配列を含んでなるＤＮＡ断片
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｆ）上記（ｄ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片、
（ｇ）上記（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）記載のＤＮＡ断片の上流にさらにＳＤ配列を含んでなるＤＮＡ断片
さらに、本発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩを用いて塩基受容体とデオキシ糖残基供与体とからデオキシヌクレオシドを製造する方法において、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとして、組換えＤＮＡ手法にて得られたヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する菌体から調製した粗酵素液を使用することを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法に関するものである。
本発明においては、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を生産することができる限りにおいて、配列番号２で示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された遺伝子、またはそれらの遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子も利用することができる。なお、ここでいうストリンジェントな条件下とは、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、０．１％ｗ／ｖ Ｎ−ラウロイルザルコシン・ナトリウム塩、０．０２％ ｗ／ｖ ＳＤＳ、０．５％ ｗ／ｖブロッキング試薬を含む溶液を用い、６０℃で２０時間程度反応温度条件下でハイブリダイゼーション反応を行なうことを意味する。
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有するタンパク質を異種微生物内で大量生産させるために使用する発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有するタンパク質の生産量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。このような転写開始シグナルとしては、宿主として大腸菌を用いる場合には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Proc．Natl．Acad．Sci．USA.,80，21(1983）、Gene，20，231(1982））、ｔｒｃプロモーター(J．Biol．Chem．，260，3539(1985））などを、酵母を宿主とする場合にはグリセルアルデヒド-3-ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（J．Biol．Chem．，254，2078(1980））や抑制性酸性ホスファターゼ(Nucl．Acids Res.，11，1657(1983））などの遺伝子の発現制シグナルを例示することができる。
得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有するタンパク質の産生を誘導して菌体内に当該酵素タンパク質が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、大腸菌を宿主として使用する場合、培地として２ｘＹＴ培地（Methods in Enzymology，100，20（1983））、ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地（Molecular Cloning、前述）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、２０〜４０℃の培養温度で必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
培養中にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質の産生を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を適当量添加する。また、使用するプロモーターが構成的に転写活性を有する場合には、特に発現誘導剤を添加する必要はない。
このようにして調製した培養物から膜分離あるいは遠心分離処理などにより菌体を回収する。
回収した菌体は、菌体それ自体をヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質として利用することも可能であるが、回収した菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより物理的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチーム処理など酵素的に溶菌させ、菌体残さを遠心分離により除去して無細胞抽出液を調製し、この無細胞抽出液をヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質として利用する方が好適である。この無細胞抽出液内にはヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質が過剰に存在しているため、特に精製処理を施さなくとも酵素源として利用可能である。さらに、熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、または数種組み合わせて得られる粗精製物または精製物をヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質として利用してもかまわない。
回収した菌体は、菌体それ自体をヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質として利用することも可能であるが、回収した菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより物理的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチーム処理など酵素的に溶菌させ、菌体残さを遠心分離により除去して無細胞抽出液を調製し、この無細胞抽出液をヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質として利用する方が好適である。この無細胞抽出液内にはヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質が過剰に存在しているため、特に精製処理を施さなくとも酵素源として利用可能である。さらに、熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、または数種組み合わせて得られる粗精製物または精製物をヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質として利用してもかまわない。
【００２９】
【発明の効果】
乳酸菌体から調製したものを酵素源としてデオキシヌクレオシドを合成する従来法の場合、菌体からのヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの存在量が低いことに加え、抽出効率も悪いため目的とする酵素活性が極めて低く、大量の酵素量を必要とし、また基質濃度も高くできないため、結果としてデオキシヌクレオシドの合成効率が極めて低く、到底実用的な方法とはなり得ない。さらに、混在する他の酵素による副反応によりデオキシヌクレオシドの収率が低下してしまうという問題も内在していた。
しかしながら、本発明によれば、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を効率的に生産でき、活性の高い酵素タンパク質を大量に取得することができるため、少量の酵素タンパク質量で充分であり、基質濃度も高くでき、短時間で効率よくデオキシヌクレオシド、特に２’−デオキシヌクレオシドを合成できるきわめて実用的な方法である。
また、後述実施例に示すように、無細胞抽出液などの粗精製の酵素タンパク質を用いても副反応はほとんど観察されず、従来法の問題点を克服した方法でもある。
【発明の効果】
乳酸菌体から調製したものを酵素源としてデオキシヌクレオシドを合成する従来法の場合、菌体からのヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの存在量が低いことに加え、抽出効率も悪いため目的とする酵素活性が極めて低く、大量の酵素量を必要とし、また基質濃度も高くできないため、結果としてデオキシヌクレオシドの合成効率が極めて低く、到底実用的な方法とはなり得ない。さらに、混在する他の酵素による副反応によりデオキシヌクレオシドの収率が低下してしまうという問題も内在していた。
しかしながら、本発明によれば、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を効率的に生産でき、活性の高い酵素タンパク質を大量に取得することができるため、少量の酵素タンパク質量で充分であり、基質濃度も高くでき、短時間で効率よくデオキシヌクレオシド、特に２’−デオキシヌクレオシドを合成できるきわめて実用的な方法である。
また、後述実施例に示すように、無細胞抽出液などの粗精製の酵素タンパク質を用いても副反応はほとんど観察されず、従来法の問題点を克服した方法でもある。
ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭｄＡＴＰ、０．２ｍＭｄＧＴＰ、０．２ｍＭｄＣＴＰ、０．２ｍＭｄＴＴＰ、乳酸菌染色体ＤＮＡ ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（４０℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、３０秒）のステップを２８回繰り返すことにより行った。
サザンハイブリダイゼーション用のプローブは、上記ＰＣＲ条件でｄＮＴＰにＤＩＧ標識ＵＴＰを含む混合液を使用して作製した。乳酸菌染色体ＤＮＡは種々の制限酵素で分解し電気泳動後、常法に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。この結果から、図１のような制限酵素地図が得られた。
サザンハイブリダイゼーション用のプローブは、上記ＰＣＲ条件でｄＮＴＰにＤＩＧ標識ＵＴＰを含む混合液を使用して作製した。乳酸菌染色体ＤＮＡは種々の制限酵素で分解し電気泳動後、常法に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。この結果から、図１のような制限酵素地図が得られた。
図１のとおり、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ｎｄｔ２ ｇｅｎｅ）は乳酸菌染色体ＤＮＡのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩの３．２ｋｂ断片に存在することが判明した。そこで乳酸菌染色体のＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ消化物の２．３〜４．０ｋｂ断片を回収して、これをｐＵＣ１８のＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ消化物とライゲーションしたものを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。プライマーはプライマー（Ｂ）とシーケンス用プライマーＭ４（ＴａＫａＲａ）を使用し、先の条件で、９４℃・３０秒、４０℃・３０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを３０回繰り返した。得られたＤＮＡ断片はＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後、クローニングベクターｐＨＳＧ３９８に組み込んだ。このプラスミドをｐ３９８−５ＳＨと命名した。
（３）形質転換体の培養と酵素の調製
上記の組換えベクターを保持する大腸菌形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールまたはアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振盪培養した。４×ｌ０8個／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度０．０５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で４時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、１０ｍｌの緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕機にて処理して、さらに遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液におけるヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を対照菌（ｐＨＳＧ３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）と共に下記表に示す。なお、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性は、５ｍＭのデオキシアデノシンとシトシン、またはチミジンとシトシンを基質にして測定した。反応液に無細胞抽出液を加えて反応を開始し、１分間煮沸することにより酵素を失活させた。３７℃におけるデオキシシチジンの生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのデオキシシチジンを生成する活性を１単位（ユニット）とした。
上記の組換えベクターを保持する大腸菌形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールまたはアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振盪培養した。４×ｌ０8個／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度０．０５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で４時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、１０ｍｌの緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕機にて処理して、さらに遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液におけるヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を対照菌（ｐＨＳＧ３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）と共に下記表に示す。なお、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性は、５ｍＭのデオキシアデノシンとシトシン、またはチミジンとシトシンを基質にして測定した。反応液に無細胞抽出液を加えて反応を開始し、１分間煮沸することにより酵素を失活させた。３７℃におけるデオキシシチジンの生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのデオキシシチジンを生成する活性を１単位（ユニット）とした。
【００４５】
【実施例２】
２’−デオキシシチジンの合成（２）
１ｍＭの２’−デオキシアデノシンと１ｍＭのシトシンを含む水溶液１ｍｌに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を２００倍希釈したものを６μ１添加（９ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で１２分反応させた。２’−デオキシシチジンの生成率を測定した結果、０．２ｍＭの２’−デオキシシチジン（対２’−デオキシアデノシン比２０％）が合成された。
【実施例２】
２’−デオキシシチジンの合成（２）
１ｍＭの２’−デオキシアデノシンと１ｍＭのシトシンを含む水溶液１ｍｌに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を２００倍希釈したものを６μ１添加（９ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で１２分反応させた。２’−デオキシシチジンの生成率を測定した結果、０．２ｍＭの２’−デオキシシチジン（対２’−デオキシアデノシン比２０％）が合成された。
【００４６】
【実施例３】
２’−デオキシシチジンの合成（３）
１３３ｍＭの２’−デオキシウリジンと１３３ｍＭのシトシンを含む水溶液１．５Ｌに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を０．４５ｍ１添加（９ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で１８時間反応させた。２’−デオキシシチジンの生成率を測定した結果、７２ｍＭの２’−デオキシシチジン（対２’−デオキシウリジン比５４％）が合成されていることが確認された。
【実施例３】
２’−デオキシシチジンの合成（３）
１３３ｍＭの２’−デオキシウリジンと１３３ｍＭのシトシンを含む水溶液１．５Ｌに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を０．４５ｍ１添加（９ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で１８時間反応させた。２’−デオキシシチジンの生成率を測定した結果、７２ｍＭの２’−デオキシシチジン（対２’−デオキシウリジン比５４％）が合成されていることが確認された。
【００４７】
【実施例４】
チミジンの合成
１００ｍＭの２’−デオキシウリジンと１００ｍＭのチミンを含む水溶液５ｍｌに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を２．８μ１添加（０．９ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で１８時間反応させた。チミジンの生成率を測定した結果、４８ｍＭのチミジン（対２’−デオキシウリジン比４８％）が合成された。
【実施例４】
チミジンの合成
１００ｍＭの２’−デオキシウリジンと１００ｍＭのチミンを含む水溶液５ｍｌに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を２．８μ１添加（０．９ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で１８時間反応させた。チミジンの生成率を測定した結果、４８ｍＭのチミジン（対２’−デオキシウリジン比４８％）が合成された。
【００４８】
【実施例５】
２’−デオキシアデノシンの合成
１００ｍＭの２’−デオキシウリジンと１００ｍＭのアデニンを含む水溶液５ｍＬに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を０．０５ｍｌ添加（１５ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で２０時間反応させた。２’−デオキシアデノシンの生成率を測定した結果、対２’−デオキシウリジン比７７％で２’−デオキシアデノシンが合成された。
【実施例５】
２’−デオキシアデノシンの合成
１００ｍＭの２’−デオキシウリジンと１００ｍＭのアデニンを含む水溶液５ｍＬに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を０．０５ｍｌ添加（１５ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で２０時間反応させた。２’−デオキシアデノシンの生成率を測定した結果、対２’−デオキシウリジン比７７％で２’−デオキシアデノシンが合成された。
【００４９】
【実施例６】
２’−デオキシグアノシンの合成（１）
１００ｍＭの２’−デオキシウリジンと１００ｍＭのグアニンを含む水溶液５ｍＬに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を０．０５ｍｌ添加（１５ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で２０時間反応させた。２’−デオキシグアノシンの生成率を測定した結果、対２’−デオキシウリジン比３０％で２’−デオキシグアノシンが合成された。
【実施例６】
２’−デオキシグアノシンの合成（１）
１００ｍＭの２’−デオキシウリジンと１００ｍＭのグアニンを含む水溶液５ｍＬに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を０．０５ｍｌ添加（１５ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で２０時間反応させた。２’−デオキシグアノシンの生成率を測定した結果、対２’−デオキシウリジン比３０％で２’−デオキシグアノシンが合成された。
【００５０】
【実施例７】
２’−デオキシグアノシンの合成（２）
１０ｍＭの２’−デオキシアデノシンと１０ｍＭのグアニンを含む水溶液５ｍＬに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を０．００５ｍｌ添加（１５ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で２０時間反応させた。２’−デオキシグアノシンの生成率を測定した結果、対２’−デオキシアデノシン比３０％で２’−デオキシグアノシンが合成された。なお、反応液から２’−デオキシイノシンは検出されなかった。
【実施例７】
２’−デオキシグアノシンの合成（２）
１０ｍＭの２’−デオキシアデノシンと１０ｍＭのグアニンを含む水溶液５ｍＬに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を０．００５ｍｌ添加（１５ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で２０時間反応させた。２’−デオキシグアノシンの生成率を測定した結果、対２’−デオキシアデノシン比３０％で２’−デオキシグアノシンが合成された。なお、反応液から２’−デオキシイノシンは検出されなかった。
Claims (5)
- ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩを用いて塩基受容体とデオキシ糖残基供与体とからデオキシヌクレオシドを製造する方法において、組換えＤＮＡ手法にて調製されたヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとして、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質、または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾または付加されたアミノ酸配列からなり、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を使用することを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法。
- ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩを用いて塩基受容体とデオキシ糖残基供与体とからデオキシヌクレオシドを製造する方法において、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとして、以下の（ｃ）〜（ｇ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を使用することを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法。
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｆ）上記（ｄ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片、
（ｇ）上記（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）記載のＤＮＡ断片の上流にさらにＳＤ配列を含んでなるＤＮＡ断片 - ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩを用いて塩基受容体とデオキシ糖残基供与体とからデオキシヌクレオシドを製造する方法において、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとして、組換えＤＮＡ手法にて得られたヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する菌体から調製した粗酵素液を使用することを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法。
- デオキシヌクレオシドが２’−デオキシヌクレオシドである、請求項１〜３項いずれか１項に記載の製造法。
- 粗酵素液が、無細胞抽出液である、請求項３項に記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11165694A JP2001046097A (ja) | 1999-06-04 | 1999-06-11 | デオキシヌクレオシドの酵素製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11-157231 | 1999-06-04 | ||
| JP15723199 | 1999-06-04 | ||
| JP11165694A JP2001046097A (ja) | 1999-06-04 | 1999-06-11 | デオキシヌクレオシドの酵素製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001046097A JP2001046097A (ja) | 2001-02-20 |
| JP2001046097A5 true JP2001046097A5 (ja) | 2005-10-27 |
Family
ID=26484766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11165694A Pending JP2001046097A (ja) | 1999-06-04 | 1999-06-11 | デオキシヌクレオシドの酵素製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001046097A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2829774B1 (fr) * | 2001-09-14 | 2004-09-03 | Pasteur Institut | N-desoxyribosyltransferases de lactobacilles, sequences nucleotidiques correspondantes et leurs applications |
| WO2003057895A1 (fr) * | 2001-12-28 | 2003-07-17 | Yamasa Corporation | Procede de production de 2'-desoxyguanosine |
-
1999
- 1999-06-11 JP JP11165694A patent/JP2001046097A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6805353B2 (ja) | 新規なアデニロコハク酸シンテターゼ及びこれを用いたプリンヌクレオチドの製造方法 | |
| US11040996B2 (en) | Method for preparing nicotinamide mononucleotide (NMN) | |
| JP6873244B2 (ja) | 新規な５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ及びこれを用いた５’−イノシン酸の製造方法 | |
| TW202045726A (zh) | 新穎啟動子及使用該啟動子產生嘌呤核苷酸之方法 | |
| CN108026535B (zh) | 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法 | |
| TW201839140A (zh) | 用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法 | |
| JPH11346778A (ja) | 核酸系物質の製造法 | |
| EP3739044B1 (en) | Variant phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase and method for producing purine nucleotide by using same | |
| RU2678139C2 (ru) | Микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий L-триптофан, и способ продуцирования L-триптофана с использованием данного микроорганизма | |
| JP5209639B2 (ja) | 新規ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及びｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法 | |
| JP3449758B2 (ja) | 挿入配列 | |
| JPWO2004009830A1 (ja) | Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法 | |
| JP2001046097A5 (ja) | ||
| KR101877120B1 (ko) | 생물전환공정을 이용한 2'-데옥시시티딘의 제조방법 | |
| JP3822006B2 (ja) | シチジン５’−ジリン酸コリンの製造法 | |
| EP1233072B1 (en) | Novel use of uridine diphosphate glucose 4-epimerase | |
| JP2002051781A (ja) | デオキシヌクレオシドの酵素的製造法 | |
| JP3729712B2 (ja) | デオキシヌクレオシドの酵素的製造法 | |
| JP4173815B2 (ja) | ２’−デオキシグアノシンの製造法 | |
| JP2003093091A5 (ja) | ||
| TWI819552B (zh) | 用於生產高濃度左旋麩胺酸的菌株及使用其生產左旋麩胺酸的方法 | |
| JP2001046097A (ja) | デオキシヌクレオシドの酵素製造法 | |
| JP3830015B2 (ja) | ウリジン５’−ジリン酸ガラクトースの製造法 | |
| JPH05219978A (ja) | 核酸関連物質の酵素的製造法及びそれに使用する酵素調製物 | |
| JP2024513452A (ja) | 変異型ＳｐｏＴタンパク質及びそれを用いたＬ－アミノ酸を生産する方法 |