JP2020535787A - 新規なアデニロコハク酸シンテターゼ及びこれを用いたプリンヌクレオチドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の他の一つの目的は、変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼ及び前記ベクターを含むプリンヌクレオチドを生産する微生物を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階;及び前記微生物または培地でプリンヌクレオチドを回収する段階を含むプリンヌクレオチドの製造方法を提供することにある。
用語相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられてもよい。
保存された(conserved)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性(homologous)を有するか同一(identical)の配列は、一般的に、配列全体または全長の少なくとも約50%、60%、70%、80%または90%の中間または高い厳しい条件(stringent conditions)でハイブリッドしてもよい。ハイブリッドするポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
本明細書において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体(monomer)が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドのポリマー(polymer)であって、一定の長さ以上のDNAまたはRNA鎖であり、より具体的には、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本発明の変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチドは、本発明のアデニロコハク酸シンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含まれてもよい。本発明でアデニロコハク酸シンテターゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、purA遺伝子であり、具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であってもよいが、これに制限されない。
ハイブリッド化は、たとえハイブリダイゼーションの厳密度に応じて塩基間のミスマッチ(mismatch)が可能であっても、2つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いにハイブリッド化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。例えば、DNAに関するとアデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本発明は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含んでもよい。
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、55℃のTm値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリッド化条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Tm値は、60℃、63℃または65℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されてもよい。
ポリヌクレオチドをハイブリッド化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は該当技術分野でよく知られている(非特許文献8参照)。
本発明で変異型アデニロコハク酸シンテターゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、purA遺伝子であり、これをコードするポリヌクレオチドに関する説明は、前述した通りである。
本発明で変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチドも、先に説明した通りである。
本明細書で使用する用語、「ベクター」は、適切な宿主内で目的のポリペプチドを発現できるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するDNA製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを使用して、染色体に目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入してもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換え(homologous recombination)によって行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体が挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー(selection marker)をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち、目的核酸分子が挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬剤耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能な表現型を付与するマーカーがもちいられてもよい。選択剤(selective agent)が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存するか、他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別することができる。
また、前記で用語、「作動可能に連結された」ものとは、本発明の目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようなプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
前記微生物は、変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを含むか、または変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて、変異型アデニロコハク酸シンテターゼが発現できる細胞または微生物であって、本発明の目的上、前記宿主細胞または微生物は、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼを含み、プリンヌクレオチドを生成することができる微生物であれば、すべて可能である。
本発明の目的上、「プリンヌクレオチド」は、プリン系の構造を含んでいるヌクレオチドを意味する。その例として、IMP、またはXMPであってもよいが、これに制限されない。
本明細書において、用語、「プリンヌクレオチドを生産する微生物」は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含み、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化されたり不活性化されるなどの原因により特定メカニズムが弱化されたり強化された微生物であって、目的とするプリンヌクレオチドの生産のために、遺伝的変異が起きたり活性を強化させた微生物であってもよい。本発明の目的上、前記プリンヌクレオチドを生産する微生物は、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼを含み、目的とするプリンヌクレオチドの生産能が増加したことを特徴とし、具体的には、コリネバクテリウム属微生物であってもよい。具体的には、本発明でプリンヌクレオチドを生産する微生物またはプリンヌクレオチドの生産能を有する微生物は、プリンヌクレオチド生合成経路内の遺伝子の一部が強化または弱化されるか、プリンヌクレオチド分解経路内の遺伝子の一部が強化または弱化された微生物であってもよい。例えば、前記微生物は、ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ(phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase)をコードする遺伝子であるpurFの発現が強化されるか、IMP分解経路に該当する5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ(inosine-5'-monophosphate dehydrogenase)をコードする遺伝子であるguaBの発現が弱化された微生物であってもよいが、これに制限されない。
本発明のもう一つの様態として、前記プリンヌクレオチドを生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階;及び前記微生物または培地でプリンヌクレオチドを回収する段階を含む、プリンヌクレオチドの製造方法を提供する。
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特に制限されないが、塩基性化合物(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア)または酸性化合物(例えば、リン酸または硫酸)を用いて適正pH(例えば、pH5〜9、具体的には、pH6〜8、最も具体的には、pH6.8)を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は20〜45℃、具体的には、25〜40℃を維持してもよく、約10〜160時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産された5’−イノシン酸は、培地中に分泌されるか細胞内に残留しうる。
本発明の前記培養段階で生産されたプリンヌクレオチドを回収する方法は、培養方法によって当該分野で公知の適切な方法を用いて、培養液から目的とするプリンヌクレオチドを収集(collect)してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びHPLCなどが用いられてもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて培地または微生物から目的とするプリンヌクレオチドを回収してもよい。
また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行ってもよい。したがって、前記回収されたプリンヌクレオチドは、精製された形態またはプリンヌクレオチドを含有した微生物発酵液であってもよい(非特許文献9)。
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、IMPを生産できないか、IMPを生産しても非常に極微量を生産することができる。したがって、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872を基にIMP生産株を製作した。より具体的には、プリン生合成酵素の一番目であるホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるpurFの活性を強化させて、IMPの分解経路に該当する5’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるguaB 活性を弱化させたIMP生産菌株を製造した。
purFの開始コドンが変更された菌株を製作するために、配列番号3のpurFが含まれた挿入用ベクターを製作した。挿入用ベクターにpurF遺伝子をクローニングするために、具体的に、PCRは、コリネバクテリウム・スタティオニスATCC6872の染色体を鋳型として、配列番号4と5及び配列番号6と7のプライマーを用いて行い、94℃で30秒の変性(denaturation)、55℃で30秒のアニーリング(annealing)、及び72℃で2分の伸長(extension)過程を30回繰り返した。前記PCR反応で獲得した2つのDNA切片を鋳型として、配列番号4と7をプライマーとして再びPCRを行った。PCRの条件は、94℃で30秒の変性(denaturation)、55℃で30秒のアニーリング(annealing)、及び72℃で2分の伸長(extension)過程を30回繰り返して行い 、得られたDNA断片をXbaIで切断した後、同じ制限酵素で切断された(pDZ(特許文献1及び2))ベクターにクローニングした。前記方法で製作されたベクターをpDZ−purF−g1aと命名した。
guaBの開始コドンが変更された菌株を製作するために、配列番号8のguaBが含まれた挿入用ベクターを製作した。挿入用ベクターにguaB遺伝子をクローニングするために、具体的に、PCRは、コリネバクテリウム・スタティオニスATCC6872の染色体を鋳型として、配列番号9と10及び配列番号11と12のプライマーを用いて行い、前記PCR産物を鋳型として配列番号9と12をプライマーに再びPCRを行い、得られた断片を実施例1−1と同様にクローニングを進めた。製作されたベクターをpDZ−guaB−a1tと命名した。これを同様の方法でATCC6872::purF(g1a)に導入し、最終的に変異が導入された菌株を選別した。
最終的に選別された野生型コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872基盤のIMP生産菌株をCJI2330と命名した。
種培地2mlを直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、ATCC6872及びCJI2330をそれぞれ接種して30℃の温度で24時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注して121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLC(SHIMAZDU LC20A)を用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表3の通りである。下記のような結果は、purF強化及びguaBを弱化させた菌株がIMPの生産能を有することを示唆する。
−発酵培地:グルタミン酸ナトリウム0.1%、塩化アンモニウム1%、硫酸マグネシウム1.2%、塩化カルシウム0.01%、硫酸鉄20mg/l、硫酸マンガン20mg/l、硫酸亜鉛20mg/l、硫酸銅5mg/l、L−システイン23mg/l、アラニン24mg/l、ニコチン酸8mg/l、ビオチン45μg/l、チアミン塩酸5mg/l、アデニン30mg/l、リン酸(85%)1.9%、ぶどう糖2.55%、果糖1.45%になるように添加して用いた。
プリンヌクレオチドの生産能を向上させるアデニロコハク酸シンテターゼ変異を発掘するために、これをコードする遺伝子であるpurAの変異ライブラリを製作した。
purA変異ライブラリを製作するために、まずpurAを含む組換えベクターを製作した。PCRは、コリネバクテリウム・スタティオニスATCC6872の染色体を鋳型として、配列番号13及び配列番号14のプライマーを用いて行い、前記増幅産物をTOPO Cloning Kit(Invitrogen)を用いて大腸菌ベクターpCR2.1にクローニングしてPCR−purAを得た。
前記実施例2−1で製作したベクターを基にpurA変異ライブラリを製作した。ライブラリは、error−prone PCR kit(clontech DiversifyTMPCR Random Mutagenesis Kit)を用いて製作した。変異が発生しうる条件で、配列番号15及び配列番号16をプライマーとしてPCR反応を行った。具体的には、1000bp当たり0〜3つの変異が発生する条件で、94℃で30秒予熱した後、94℃で30秒、68℃で1分30秒の過程を25回繰り返して行った。このとき得られたPCR産物をメガプライマー(500〜125ng)とし、95℃で50秒、60℃で50秒、68℃で12分の過程を25回繰り返した。その後、DpnI処理して大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25mg/l)を含むLB固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニーの0種を選別した後、プラスミドを獲得してポリヌクレオチド配列を分析した結果、2変異/kbの頻度で互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。約20,000個の形質転換された大腸菌コロニーを取ってプラスミドを抽出し、これをpTOPO−purA−libraryと命名した。
実施例3−1:ライブラリの評価
前記実施例2−2で製作したpTOPO−purA−libraryを実施例1で製作した菌株CJI2330に電気穿孔法で形質転換した後、カナマイシン25mg/lを含有した栄養培地に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株から10,000個のコロニーを確保し、各コロニーをCJI2330_pTOPO_purA(mt)1からCJI2330_pTOPO_purA(mt)10000までと命名した。
−栄養培地:ペプトン1%、肉汁1%、塩化ナトリウム0.25%、酵母エキス1%、寒天2%、pH7.2
培養液から生産された5’−イノシン酸の生産量を分析するために、培養終了後の培養上澄み液3μlを蒸留水が197μlずつ分注された96ウェルUVプレートに移した。次に、マイクロプレートリーダー(MicroplateReader)を用いて30秒間振とうし、25℃、波長270nmで分光光度計で吸光度を測定し、CJI2330菌株の吸光度と比較して10%以上増加した吸光度を示す50個の変異菌株コロニーを選別した。その他のコロニーは対照区に比べて類似または減少した吸光度を示した。
選別された変異の有効性を検証するため、発酵力価の評価を行った。種培地2mlを、直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、CJI2330及びCJI2330::pTOPO_purA(mt)333をそれぞれ接種して30℃の温度で24時間振とう培養し、種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注し、121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLC(SHIMAZDU LC20A)を用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表6の通りである。
前記突然変異菌株の遺伝子変異を確認するために、配列番号17と18のプライマーを用いてCJI2330::pTOPO_purA(mt)333の菌株においてPCRを行い、シークエンシングを行い、purA遺伝子内にの変異を確認した。
ATCC6872由来のIMP生産菌株を製作し、実施例3で確認した変異を導入してIMPの生産能を確認した。
ATCC6872由来のIMP生産株を製作するために、ATCC6872をリン酸緩衝液(pH7.0)、またはクエン酸緩衝液(pH5.5)に107〜108細胞/mlと懸濁させた。ここにUV処理して、室温または32℃で20〜40分間処理して突然変異を誘発させた。2回にかけて0.85%食塩水で洗浄し、希釈した後、1.7%寒天を含有する適切な濃度の耐性付与物質を添加した最小培地上に塗抹した後、コロニーを得た。それぞれのコロニーを、栄養培地で培養し、種培地で24時間培養した。発酵培地で3〜4日間培養した後、培養液に蓄積されたIMP生産量が最も優れたコロニーを選別した。高濃度IMP生産株を製作するために、アデニン要求性、グアニン漏出型、リゾチーム感受性、3,4−ジヒドロプロリン耐性、ストレプトマイシン耐性、スルファグアニジン耐性、ノルバリン耐性、トリメトプリム耐性を付与するための前記過程をそれぞれの物質に対して順次行った。その結果、前記物質に対する耐性が付与されてIMP生産能の優れたCJI2332を最終選別した。表8にATCC6872に比べたCJI2332の耐性程度を比較して示した。
種培地2mlを直径18mmの試験管に分注して加圧殺菌した後、ATCC6872及びCJI2332をそれぞれ接種し、30℃の温度で24時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注して121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLC(SHIMAZDU LC20A)を用いた方法によりIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表9の通りである。
前記実施例3で選別された変異を菌株に導入するために挿入用ベクターを製作した。purA(G85S)変異導入用ベクターの製作過程は次の通りである。前記CJI2330_pTOPO_purA(mt)133を鋳型とし、配列番号19と配列番号20を用いてPCRを行った。PCRは、94℃で5分間変性した後、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を20回繰り返した後、72℃で5分間重合反応を行った。その結果得られた遺伝子断片をそれぞれXbaIで切断した。T4リガーゼを用いて前記遺伝子断片をXbaI制限酵素で切断した線状のpDZベクターにクローニングし、pDZ−purA(G85S)を製作した。
前記実施例1で製作した野生型由来のIMP生産菌株であるCJI2330と実施例4−1で選別された菌株であるCJI2332にpurA変異を導入してIMP生産量を評価した。CJI2332菌株のpurA遺伝子内に変異が含まれているかどうかを確認するために、CJI2332の染色体DNAをPCRを用いて増幅した。具体的には、まず、前記CJI2332の染色体DNAを鋳型として、配列番号17と18のプライマーを用いて、94℃で1分、58℃で30秒、72℃で2分間Taq DNAポリメラーゼで重合する条件を28回繰り返すPCR方法を通じて、purA断片を増幅した。また、これを同じプライマーで塩基配列を分析した結果、CJI2332菌株のpurA遺伝子には変異がないことを確認した。
その後、pDZ−purA(G85S)のベクターをCJI2330とCJI2332に形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross-over)を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株に遺伝子変異が導入されたかどうかは、配列番号17と配列番号18のプライマーを用いてPCRを行って塩基配列を分析することにより、菌株内に変異が導入されたことを確認した。製作された菌株は、CJI2330::purA(G85S)、CJI2332::purA(G85S)と命名した。
それぞれのCJI2330、CJI2332、CJI2330::purA(G85S)、及びCJI2332::purA(G85S)菌株のIMP生産能を評価した。培養終了後、HPLCを用いた方法でIMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表11の通りである。
前記CJI2332はブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2018年6月22日付で寄託し、受託番号KCCM12277Pを与えられた。また、前記製作されたCJI2332::purA(G85S)菌株はCJI2348と呼ばれており、これをブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2018年6月22日付で寄託し、受託番号KCCM12280Pを与えられた。
実施例5−1:ATCC6872由来のXMP生産菌株の選別
ATCC6872由来のXMP(5'-xanthosine monophosphate)生産株を作製するために、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)ATCC6872をリン酸緩衝液(pH7.0)、またはクエン酸緩衝液(pH5.5)に107〜108細胞/mlと懸濁させた。ここにUV処理して、室温または32℃で20〜40分間処理して突然変異を誘発させた。2回にかけて0.85%食塩水で洗浄し、1.7%寒天を含有した最小培地に耐性を付与しようとする物質を適正濃度に含有した培地に希釈して塗抹した後、コロニーを得た。それぞれのコロニーを、栄養培地で培養し、種培地で24時間培養した。発酵培地で3〜4日間培養した後、培養液に蓄積されたXMPの生産量が最も優れたコロニーを選別した。具体的には、フルオロトリプトファンが濃度別に添加された培地(添加培地)で生育できる変異株の中から選別し、より具体的には、フルオロトリプトファンの濃度100mg/Lでも生育する5’−キサンチル酸の濃度が向上された菌株を選別した。選別された菌株は、CJX1664と命名された。
- 最小培地:ぶどう糖20g/l、リン酸第1カリウム1g/l、リン酸第2カリウム1g/l、ウレア2g/l、硫酸アンモニウム、3g/l、硫酸マグネシウム1g/l、塩化カルシウム100mg/l、硫酸鉄20mg/l、硫酸マンガン10mg/l、硫酸亜鉛10mg/l、ビオチン30μg/l、チアミン塩酸塩0.1mg/l、硫酸銅0.8mg/l、アデニン20mg/l、グアニン20mg/l、pH7.2
- 添加培地:最小培地にフルオロトリプトファン10、20、50、70、100、200mg/lを添加した培地
前記CJX1664の生化学的特性は、下記表12に示した。表12を参照すれば、前記CJX1664は100mg/l濃度のフルオロトリプトファン添加培地でも生育可能である。
種培地2mlを直径18mmの試験管に分注し、加熱殺菌した後、ATCC6872及びCJX1664をそれぞれ接種して30℃の温度で24時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。発酵培地29mlを250mlの振とう用三角フラスコに分注し、121℃の温度で15分間加圧殺菌した後、種培養液2mlを接種して3日間培養した。培養条件は、回転数170rpm、温度30℃、pH7.5に調節した。
培養終了後、HPLC(SHIMAZDU LC20A)を用いた方法によりXMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表13の通りである。
前記実施例5−1で選別したCJX1664菌株がpurA遺伝子の変異を含んでいるかどうかを確認するために、CJX1664の染色体DNAをPCRを用いて増幅した。具体的には、まず、前記CJX1664の染色体DNAを鋳型として、配列番号17と配列番号18のプライマーを用いて、94℃で1分の変性、58℃で30秒の結合、72℃で2分間のTaq DNAポリメラーゼで重合する条件を28回繰り返すPCR方法を通じて、purA断片を増幅した。また、これを同じプライマーで塩基配列を分析した結果、CJX1664菌株のpurA遺伝子には変異がないことを確認した。
前記実施例4−3で製作したベクターをCJX1644に形質転換し、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross-over)を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株に遺伝子変異が導入されたかどうかは、塩基配列を分析して確認した。
前記CJX1664及びCJX1664::purA(G85S)菌株のXMP生産能を評価した。培養終了後、HPLCを用いた方法によりXMPの生産量を測定し、培養結果は以下の表14の通りである。
前記CJX1664は、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2018年7月6日付で寄託し、受託番号KCCM12285Pを与えられた。また、前記製作されたCJX1664::purA(G85S)菌株は、CJX1665と呼ばれて、これをブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2018年7月6日付で寄託し、受託番号KCCM12286Pを与えられた。
実施例6−1:purA変異アミノ酸置換の挿入用ベクターの製作
前記実施例を介してpurA(G85S)の変異はプリンヌクレオチドの生産能を向上させうるという点を確認した。それで、purA変異の位置的重要性を確認するために、85番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換するベクターを製作し、プリンヌクレオチドの生産能に影響を与えるかどうかを確認した。purA(G85S)変異導入用ベクターの製作過程は次の通りである。前記実施例4で製作されたpDZ−purA(G85S)のベクターをバックボーンとして、位置選択的突然変異(Site-directed mutagenesis)を行った。具体的には、表15の配列をプライマーとして用い、PCRを行った。この時、94℃で30秒の変性(denaturation)、55℃で30秒のアニーリング(annealing)、及び68℃で12分の伸長(extension)過程を含み、前記過程は18回繰り返した。その結果得られた産物をDpnI処理した後、DH5αに形質転換して得られたコロニーを一般的に知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、獲得されたプラスミドの情報は表15の通りである。
前記実施例6−1で製造した変異導入用のベクター18種をそれぞれCJI2332に形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/lを含有した培地から選別した。選別された1次菌株は再び2次交差(cross-over)を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株に遺伝子変異が導入されたかどうかは、配列番号17と18のプライマーを用いてPCRを行い、塩基配列を分析して確認した。挿入された変異による菌株名は次の表17の通りである。
Claims (8)
- 配列番号2のアミノ酸配列でN末端から85番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、変異型アデニロコハク酸シンテターゼ。
- 前記他のアミノ酸が、セリン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるものである、請求項1に記載の変異型アデニロコハク酸シンテターゼ。
- 請求項1に記載の変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項1に記載の変異型アデニロコハク酸シンテターゼまたは請求項4に記載のベクターを含み、プリンヌクレオチドを生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)である、請求項5に記載のプリンヌクレオチドを生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 請求項5に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階;及び前記微生物または培地からプリンヌクレオチドを回収する段階を含む、プリンヌクレオチドの製造方法。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)である、請求項7に記載のプリンヌクレオチドの製造方法。
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