JP2003250570A

JP2003250570A - ２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製造方法及びこの中間体の製造方法、並びにこれらに使用する２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ遺伝子

Info

Publication number: JP2003250570A
Application number: JP2002057633A
Authority: JP
Inventors: Akira Shimizu; 昌清水; Jun Ogawa; 順小川; Seiichiro Matsumoto; 清一郎松本; Yoshie Sasaki; 美江佐々木
Original assignee: YUKI GOSEI YAKUHIN KOGYO KK; Yuki Gosei Kogyo Co Ltd
Current assignee: YUKI GOSEI YAKUHIN KOGYO KK; Yuki Gosei Kogyo Co Ltd
Priority date: 2002-03-04
Filing date: 2002-03-04
Publication date: 2003-09-09

Abstract

(57)【要約】【課題】２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製
造方法を提供すること。【解決手段】ＡＴＰの存在下、グルコース、フルクト
ース、グルコース６−リン酸、フルクトース６−リン
酸、グルコース１，６−ジリン酸、フルクトース１，６
−ジリン酸、グリセロール、ジヒドロキシアセトン、グ
リセルアルデヒド又はグリセロール３−リン酸からグリ
セルアルデヒド３−リン酸を生成する能力を有する微生
物を利用してグリセルアルデヒド３−リン酸を生成させ
る工程と、該生成物とアセトアルデヒドを２−デオキシ
リボース５−リン酸アルドラーゼを含有する微生物によ
り反応させて２−デオキシリボース５−リン酸を生成さ
せる工程と、該生成物と核酸塩基をホスホペントムター
ゼとヌクレオシドホスホリラーゼを含有する微生物によ
り反応させて２’−デオキシリボヌクレオシド化合物を
生成させる工程とを具備する２’−デオキシリボヌクレ
オシド化合物の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗ウイルス剤、ア
ンチセンス医薬などの原料、並びに核酸合成のための基
質として有用な２’−デオキシリボヌクレオシド化合物
を生化学的方法により選択的に製造する方法に関する。
また、本発明は、２’−デオキシリボヌクレオシド化合
物を製造する際の中間体である２−デオキシリボース５
−リン酸を製造する方法に関する。更に、本発明は、こ
れら方法の酵素反応を触媒し得る形質転換体の作成に使
用される２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ
遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、２’−デオキシリボヌクレオシド
化合物の製造方法は天然物である魚類の精子から抽出生
産する方法が常法として知られている。しかし、原料と
なるＤＮＡ（デオキシリボ核酸）が高価でかつ分離精製
工程が煩雑であり安価に２’−デオキシリボヌクレオシ
ド化合物を得ることはできなかった。

【０００３】一方、２’−デオキシリボヌクレオシド化
合物と核酸塩基を原料として、ヌクレオシドホスホリラ
ーゼにより塩基交換反応を行わせ、希望するヌクレオシ
ドを得る方法が報告されている（Ｈｏｒｉ．Ｎ．，Ｗａ
ｔａｎａｂｅ，Ｍ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｙ．，Ｍｉｋ
ａｍｉ，Ｙ．；Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５
３巻，１９７〜２０２頁，１９８９年）。

【０００４】この方法は、ヌクレオシドホスホリラーゼ
により既存の２’−デオキシリボヌクレオシド化合物か
ら誘導された２−デオキシリボース１−リン酸を用い、
ヌクレオシドホスホリラーゼにより核酸塩基をリボシル
化するものである。すなわち、この方法により、２−デ
オキシリボース１−リン酸と任意の核酸塩基を原料にし
て、ヌクレオシドホスホリラーゼの作用により、該当す
る２’−デオキシリボヌクレオシド化合物を調製するこ
とが可能である。

【０００５】しかしながら、既存の２’−デオキシリボ
ヌクレオシド化合物を原料としないで、安価で入手しや
すい化合物を出発原料として、２’−デオキシリボヌク
レオシド化合物を生化学的に合成する方法は確立されて
いない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこでまず、２−デオ
キシリボース５−リン酸からホスホペントムターゼによ
り２−デオキシリボース１−リン酸を生化学的に生成さ
せる、２−デオキシリボース１−リン酸の製造方法に関
する発明、及び２−デオキシリボース５−リン酸と核酸
塩基からホスホペントムターゼとヌクレオシドホスホリ
ラーゼにより２’−デオキシリボヌクレオシド化合物を
生成させる、２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の
製造方法に関する発明を完成させた（特願２０００−２
８９１８７）。

【０００７】次いで、前述の発明の原料となる２−デオ
キシリボース５−リン酸を、グリセルアルデヒド３−リ
ン酸とアセトアルデヒドから、２−デオキシリボース５
−リン酸アルドラーゼの触媒作用により生化学的に生成
させる、又はジヒドロキシアセトンリン酸とアセトアル
デヒドから、トリオースリン酸イソメラーゼと２−デオ
キシリボース５−リン酸アルドラーゼの触媒作用により
生化学的に生成させる、２−デオキシリボース５−リン
酸の製造方法に関する発明を完成させた（特願２００１
−５８９０２）。

【０００８】さらに、この２−デオキシリボース５−リ
ン酸アルドラーゼを用いて、グリセルアルデヒド３−リ
ン酸とアセトアルデヒドを原料として２−デオキシリボ
ース５−リン酸を生成させ、次に該２−デオキシリボー
ス５−リン酸と核酸塩基を、ホスホペントムターゼとヌ
クレオシドホスホリラーゼにより反応させ、２’−デオ
キシリボヌクレオシド化合物を生化学的に生成させる、
２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製造方法に関
する発明を完成させた（特願２００１−２６４１６
０）。また、ジヒドロキシアセトンリン酸とアセトアル
デヒドを、トリオースリン酸イソメラーゼと２−デオキ
シリボース５−リン酸アルドラーゼにより反応させて、
２−デオキシリボース５−リン酸を生成させ、次に該２
−デオキシリボース５−リン酸と核酸塩基を、ホスホペ
ントムターゼとヌクレオシドホスホリラーゼにより反応
させ、２’−デオキシリボヌクレオシド化合物を生化学
的に生成させる、２’−デオキシリボヌクレオシド化合
物の製造方法に関する発明を完成させた（特願２００１
−２６４１６０）。なお、上記特許出願は全て、本願出
願時に未公開である。

【０００９】しかしながら、いずれの方法においても、
安価で入手しやすいグルコース類又はグリセロール類を
出発原料として生化学的に２’−デオキシリボヌクレオ
シド化合物を得る方法は検討されていないのが現状であ
る。本発明者らは、この点に着目し、より安価で入手し
やすいグルコース類又はグリセロール類から２’−デオ
キシリボヌクレオシド化合物の製造を試みた。

【００１０】したがって、本発明の目的は、グルコース
類又はグリセロール類を出発原料として、２’−デオキ
シリボヌクレオシド化合物を選択的に製造する方法を提
供することである。また、２’−デオキシリボヌクレオ
シド化合物を製造する際の中間体である２−デオキシリ
ボース５−リン酸を製造する方法を提供することであ
る。さらに、上記製造方法に有用な２−デオキシリボー
ス５−リン酸アルドラーゼ活性を有する遺伝子を提供す
ることである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上述の課題
を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、微生物由来の酵素
による反応をカップリングさせることにより、グルコー
ス、グリセロールなどの糖類から２−デオキシリボース
５−リン酸を生成させた後、２’−デオキシリボヌクレ
オシド化合物を選択的に製造する方法を見いだし本発明
を完成するに至った。

【００１２】すなわち、本発明の要旨は以下のとおりで
ある。

【００１３】（１）グルコース、フルクトース、グル
コース６−リン酸、フルクトース６−リン酸、グルコー
ス１，６−ジリン酸、フルクトース１，６−ジリン酸、
グリセロール、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデ
ヒド及びグリセロール３−リン酸からなる群より選択さ
れる糖類からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成する
能力を有する微生物の菌体、該微生物菌体の処理物又は
該微生物由来の酵素を、アデノシン５’−トリリン酸の
存在下、該糖類に作用させてグリセルアルデヒド３−リ
ン酸を生成させる工程と、該グリセルアルデヒド３−リ
ン酸とアセトアルデヒドとを、２−デオキシリボース５
−リン酸アルドラーゼを含有する微生物の菌体、該微生
物菌体の処理物又は該微生物由来の酵素により反応させ
て、２−デオキシリボース５−リン酸を生成させる工程
とを具備することを特徴とする２−デオキシリボース５
−リン酸の製造方法。

【００１４】（２）グルコース、フルクトース、グル
コース６−リン酸、フルクトース６−リン酸、グルコー
ス１，６−ジリン酸、フルクトース１，６−ジリン酸、
グリセロール、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデ
ヒド及びグリセロール３−リン酸からなる群より選択さ
れる糖類からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成する
能力を有する微生物の菌体、該微生物菌体の処理物又は
該微生物由来の酵素を、アデノシン５’−トリリン酸の
存在下、該糖類に作用させてグリセルアルデヒド３−リ
ン酸を生成させる工程と、該グリセルアルデヒド３−リ
ン酸とアセトアルデヒドを、２−デオキシリボース５−
リン酸アルドラーゼを含有する微生物の菌体、該微生物
菌体の処理物又は該微生物由来の酵素により反応させ
て、２−デオキシリボース５−リン酸を生成させる工程
と、該２−デオキシリボース５−リン酸と核酸塩基を、
ホスホペントムターゼとヌクレオシドホスホリラーゼを
含有する微生物の菌体、該微生物菌体の処理物又は該微
生物由来の酵素により反応させて、２’−デオキシリボ
ヌクレオシド化合物を生成させる工程とを具備すること
を特徴とする２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の
製造方法。

【００１５】（３）グルコース、フルクトース、グル
コース６−リン酸、フルクトース６−リン酸、グルコー
ス１，６−ジリン酸、フルクトース１，６−ジリン酸、
グリセロール、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデ
ヒド及びグリセロール３−リン酸からなる群より選択さ
れる糖類からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成する
能力を有する前記微生物が、パン酵母、エシェリヒア
属、クレブシエラ属、バチルス属、シュードモナス属、
オクロバクトラム属、サッカロマイセス属、キャンディ
ダ属、又はロドトルラ属に属する微生物であり、２−デ
オキシリボース５−リン酸アルドラーゼを含有する前記
微生物が、クレブシエラ属、エンテロバクター属、エシ
ェリヒア属、又はバチルス属に属する微生物であること
を特徴とする、（１）記載の２−デオキシリボース５−
リン酸の製造方法。

【００１６】（４）グルコース、フルクトース、グル
コース６−リン酸、フルクトース６−リン酸、グルコー
ス１，６−ジリン酸、フルクトース１，６−ジリン酸、
グリセロール、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデ
ヒド及びグリセロール３−リン酸からなる群より選択さ
れる糖類からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成する
能力を有する前記微生物が、パン酵母、エシェリヒア
属、クレブシエラ属、バチルス属、シュードモナス属、
オクロバクトラム属、サッカロマイセス属、キャンディ
ダ属、又はロドトルラ属に属する微生物であり、２−デ
オキシリボース５−リン酸アルドラーゼを含有する前記
微生物が、クレブシエラ属、エンテロバクター属、エシ
ェリヒア属、又はバチルス属に属する微生物であり、ホ
スホペントムターゼとヌクレオシドホスホリラーゼを含
有する前記微生物が、クレブシエラ属、エンテロバクタ
ー属、エシェリヒア属、又はバチルス属に属する微生物
であることを特徴とする、（２）記載の２’−デオキシ
リボヌクレオシド化合物の製造方法。

【００１７】（５）グルコース、フルクトース、グル
コース６−リン酸、フルクトース６−リン酸、グルコー
ス１，６−ジリン酸、フルクトース１，６−ジリン酸、
グリセロール、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデ
ヒド及びグリセロール３−リン酸からなる群より選択さ
れる糖類からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成する
能力を有する前記微生物、及び２−デオキシリボース５
−リン酸アルドラーゼを含有する前記微生物が、エシェ
リヒア・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８（ＦＥＲＭＢＰ−７
８９５）、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴＳ８
（ＦＥＲＭＢＰ−７８９６）又はクレブシエラ・ニュー
モニエＢ−４４（ＩＦＯ１６５７９）であることを
特徴とする、（１）又は（３）記載の２−デオキシリボ
ース５−リン酸の製造方法。

【００１８】（６）グルコース、フルクトース、グル
コース６−リン酸、フルクトース６−リン酸、グルコー
ス１，６−ジリン酸、フルクトース１，６−ジリン酸、
グリセロール、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデ
ヒド及びグリセロール３−リン酸からなる群より選択さ
れる糖類からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成する
能力を有する前記微生物、及び２−デオキシリボース５
−リン酸アルドラーゼを含有する前記微生物が、エシェ
リヒア・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８（ＦＥＲＭＢＰ−７
８９５）、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴＳ８
（ＦＥＲＭＢＰ−７８９６）又はクレブシエラ・ニュー
モニエＢ−４４（ＩＦＯ１６５７９）であり、ホス
ホペントムターゼとヌクレオシドホスホリラーゼを含有
する前記微生物が、バチルス・コアギュランスＹＧＫ
−６０５４（ＦＥＲＭＢＰ−７８９８）又はバチルス
・スピーシーズＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭＢＰ−
７８９７）であることを特徴とする、（２）又は（４）
記載の２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製造方
法。

【００１９】（７）前記グリセルアルデヒド３−リン
酸を生成させる工程が、アデニン、アデノシン、アデノ
シン５’−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸か
らなる群より選択されるアデノシン類からアデノシン
５’−トリリン酸を生成する能力を有する微生物、該微
生物菌体の処理物又は該微生物由来の酵素を該アデノシ
ン類に作用させて得られるアデノシン５’−トリリン酸
の存在下で行われることを特徴とする、（１）、（３）
又は（５）記載の２−デオキシリボース５−リン酸の製
造方法。

【００２０】（８）前記グリセルアルデヒド３−リン
酸を生成させる工程が、アデニン、アデノシン、アデノ
シン５’−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸か
らなる群より選択されるアデノシン類からアデノシン
５’−トリリン酸を生成する能力を有する微生物、該微
生物菌体の処理物又は該微生物由来の酵素を該アデノシ
ン類に作用させて得られるアデノシン５’−トリリン酸
の存在下で行われることを特徴とする、（２）、（４）
又は（６）記載の２’−デオキシリボヌクレオシド化合
物の製造方法。

【００２１】（９）前記グリセルアルデヒド３−リン
酸を生成させる工程が、微生物の解糖系により得られる
アデノシン５’−トリリン酸の存在下で行われることを
特徴とする、（１）、（３）又は（５）記載の２−デオ
キシリボース５−リン酸の製造方法。

【００２２】（１０）前記グリセルアルデヒド３−リ
ン酸を生成させる工程が、微生物の解糖系により得られ
るアデノシン５’−トリリン酸の存在下で行われること
を特徴とする、（２）、（４）又は（６）記載の２’−
デオキシリボヌクレオシド化合物の製造方法。

【００２３】（１１）アデニン、アデノシン、アデノ
シン５’−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸か
らなる群より選択されるアデノシン類からアデノシン
５’−トリリン酸を生成する能力を有する前記微生物
が、パン酵母、メタノール資化性酵母、ブレビバクテリ
ウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、クレ
ブシエラ属、バチルス属、シュードモナス属、オクロバ
クトラム属、サッカロマイセス属、キャンディダ属、又
はロドトルラ属に属する微生物であることを特徴とす
る、（７）記載の２−デオキシリボース５−リン酸の製
造方法。

【００２４】（１２）アデニン、アデノシン、アデノ
シン５’−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸か
らなる群より選択されるアデノシン類からアデノシン
５’−トリリン酸を生成する能力を有する前記微生物
が、パン酵母、メタノール資化性酵母、ブレビバクテリ
ウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、クレ
ブシエラ属、バチルス属、シュードモナス属、オクロバ
クトラム属、サッカロマイセス属、キャンディダ属、又
はロドトルラ属に属する微生物であることを特徴とす
る、（８）記載の２’−デオキシリボヌクレオシド化合
物の製造方法。

【００２５】（１３）解糖系によりアデノシン５’−
トリリン酸を生成する能力を有する前記微生物が、パン
酵母、メタノール資化性酵母、ブレビバクテリウム属、
コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、クレブシエラ
属、バチルス属、シュードモナス属、オクロバクトラム
属、サッカロマイセス属、キャンディダ属、又はロドト
ルラ属に属する微生物であることを特徴とする、（９）
記載の２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。

【００２６】（１４）解糖系によりアデノシン５’−
トリリン酸を生成する能力を有する前記微生物が、パン
酵母、メタノール資化性酵母、ブレビバクテリウム属、
コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、クレブシエラ
属、バチルス属、シュードモナス属、オクロバクトラム
属、サッカロマイセス属、キャンディダ属、又はロドト
ルラ属に属する微生物であることを特徴とする、（１
０）記載の２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製
造方法。

【００２７】（１５）アデニン、アデノシン、アデノ
シン５’−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸か
らなる群より選択されるアデノシン類からアデノシン
５’−トリリン酸を生成する能力を有する前記微生物
が、パン酵母又はブレビバクテリウムアンモニアゲネ
スＡＴＣＣ６８７２であることを特徴とする、
（７）又は（１１）記載の２−デオキシリボース５−リ
ン酸の製造方法。

【００２８】（１６）アデニン、アデノシン、アデノ
シン５’−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸か
らなる群より選択されるアデノシン類からアデノシン
５’−トリリン酸を生成する能力を有する前記微生物
が、パン酵母又はブレビバクテリウムアンモニアゲネ
スＡＴＣＣ６８７２であることを特徴とする、
（８）又は（１２）記載の２’−デオキシリボヌクレオ
シド化合物の製造方法。

【００２９】（１７）解糖系によりアデノシン５’−
トリリン酸を生成する能力を有する前記微生物が、パン
酵母又はブレビバクテリウムアンモニアゲネスＡＴ
ＣＣ６８７２であることを特徴とする、（９）又は（１
３）記載の２−デオキシリボース５−リン酸の製造方
法。

【００３０】（１８）解糖系によりアデノシン５’−
トリリン酸を生成する能力を有する前記微生物が、パン
酵母又はブレビバクテリウムアンモニアゲネスＡＴ
ＣＣ６８７２であることを特徴とする、（１０）又は
（１４）記載の２’−デオキシリボヌクレオシド化合物
の製造方法。

【００３１】（１９）配列番号２で示されるアミノ酸
配列からなる２−デオキシリボース５−リン酸アルドラ
ーゼ活性を有する酵素タンパク質、又は配列番号２で示
されるアミノ酸配列において１つ若しくは複数のアミノ
酸が欠失、置換、付加及び/若しくは挿入されたアミノ
酸配列からなり、かつ２−デオキシリボース５−リン酸
アルドラーゼ活性を有する酵素タンパク質。

【００３２】（２０）配列番号４で示される塩基配列
を含み、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ
活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子、又は
配列番号４で示される塩基配列において１つ若しくは複
数のヌクレオチドが欠失、置換、付加及び/若しくは挿
入された塩基配列を含み、かつ２−デオキシリボース５
−リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素タンパク質をコ
ードする遺伝子。

【００３３】（２１）配列番号２で示されるアミノ酸
配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は配列
番号２で示されるアミノ酸配列において１つ若しくは複
数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び/若しくは挿入さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ２−デオキシリボース
５−リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素タンパク質を
コードする遺伝子。

【００３４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００３５】＜酵素反応による２’−デオキシリボヌク
レオシド化合物の合成＞本発明では、まず、アデノシン
５’−トリリン酸の存在下、グルコース、フルクトー
ス、グルコース６−リン酸、フルクトース６−リン酸、
グルコース１，６−ジリン酸、フルクトース１，６−ジ
リン酸、グリセロール、ジヒドロキシアセトン、グリセ
ルアルデヒド及びグリセロール３−リン酸からなる群よ
り選択される糖類からグリセルアルデヒド３−リン酸を
生成する能力を有する微生物の菌体、該微生物菌体の処
理物又は該微生物由来の酵素を用いて、該糖類に作用さ
せてグリセルアルデヒド３−リン酸を合成することがで
きる。

【００３６】例えば、下記の（１−ａ）式に示されるグ
ルコース代謝系、（１−ｂ）式又は（１−ｃ）式に示さ
れるグリセロール代謝系などの反応における糖類から、
グリセルアルデヒド３−リン酸を合成することができ
る。

【００３７】本明細書において、グルコース、フルクト
ース、グルコース６−リン酸、フルクトース６−リン
酸、グルコース１，６−ジリン酸、フルクトース１，６
−ジリン酸、グリセロール、ジヒドロキシアセトン、グ
リセルアルデヒド及びグリセロール３−リン酸のことを
便宜的に糖類と称する。

【００３８】本明細書において「アデノシン５’−トリ
リン酸の存在下」とは、アデノシン５’−トリリン酸が
存在している条件下であれば特に限定されず、以下に記
載されるように、酵素反応時にアデノシン５’−トリリ
ン酸を存在させることができる。例えば、アデノシン
５’−トリリン酸は微生物に微量含有されているので、
使用する微生物に元々内在しているものであってもよい
し、人為的に反応系に加えてもよい。また、アデニン、
アデノシン、アデノシン５’−モノリン酸及びアデノシ
ン５’−ジリン酸からなる群より選択されるアデノシン
類からアデノシン５’−トリリン酸を生成する能力を有
する微生物、該微生物菌体の処理物又は該微生物由来の
酵素を該アデノシン類に作用させて再生したアデノシン
５’−トリリン酸を用いることもできる（ＡＴＰ再生系
ともいう）。あるいは、微生物の解糖系により得られる
アデノシン５’−トリリン酸を用いることもできる。さ
らに、これらの手法を組み合わせて、アデノシン５’−
トリリン酸を用いることもできる。すなわち、本発明に
おいては、人為的にアデノシン５’−トリリン酸（ＡＴ
Ｐ）を添加した場合であっても、微生物中に内在するＡ
ＴＰや微生物のＡＴＰ再生系、解糖系により得られるＡ
ＴＰを、該微生物が反応に利用することを妨げるもので
はない。本発明は、微生物による酵素反応を利用したも
のであるため、微生物が目的の生成物を産生し得る限
り、本発明の方法において微生物が、当該反応に何れの
起源のＡＴＰを利用してもよい。

【００３９】なお、本発明において、解糖系とは下記の
（１−ａ）式に示されるグルコース代謝系から、さら
に、ピルビン酸、エタノール、又は乳酸まで分解される
代謝経路を意味する。フルクトース１，６−ジリン酸又
はグリセロール３−リン酸を出発原料とするときは、ア
デノシン５’−トリリン酸の存在下でなくとも本反応は
十分に進行するが、アデノシン５’−トリリン酸が過剰
量存在するときは目的物の収率も向上する。

【００４０】以下、具体的に式に基づいて説明する。
（１−ａ）式のようにグルコース代謝系では、例えば、
アデノシン５’−トリリン酸（ＡＴＰと略す）の存在下
にグルコースからグリセルアルデヒド３−リン酸を合成
することができる。また、（１−ｂ）式又は（１−ｃ）
式のようにグリセロール代謝系では、例えば、ＡＴＰの
存在下にグリセロールからグリセルアルデヒド３−リン
酸を合成することができる。

【００４１】

【化１】

【００４２】

【化２】

【００４３】

【化３】

【００４４】次に、下記（２）式に示すように、例え
ば、上述の（１−ａ）式、（１−ｂ）式又は（１−ｃ）
式で得られたグリセルアルデヒド３−リン酸と、アセト
アルデヒドとから、２−デオキシリボース５−リン酸ア
ルドラーゼ（以下、式中でＤＥＲＡと略す）を含有する
微生物の菌体、該微生物菌体の処理物又は該微生物由来
の酵素の触媒作用により、２−デオキシリボース５−リ
ン酸へ変換することができる。（２）式は平衡反応であ
るが、平衡は２−デオキシリボース５−リン酸の生成側
に片寄っている。続いて、下記（３）及び（４）式に示
すように、上述（２）式で得られた反応液（すなわち、
２−デオキシリボース５−リン酸を生成物として含有す
る反応液）と、核酸塩基（式中ではアデニン）とから、
ホスホペントムターゼ（以下、式中でＰＰＭと略す）と
ヌクレオシドホスホリラーゼ（以下、式中でＮＰと略
す）を含有する微生物の菌体、該微生物菌体の処理物又
は該微生物由来の酵素の触媒作用により、２−デオキシ
リボース１−リン酸を経由して２’−デオキシリボヌク
レオシド化合物を合成することができる。

【００４５】本発明に使用する核酸塩基としては、天然
型のチミン、ウラシル、シトシン、アデニン、グアニ
ン、ヒポキサンチンなどの他に、ヌクレオシドホスホリ
ラーゼにより認識される人工の核酸塩基類縁化合物（例
えば、５−ブロモウラシル、５−フルオロウラシル、５
−トリフルオロメチルウラシル、２−アミノプリン、
２，６−ジアミノプリン、２−クロロプリン、６−クロ
ロプリン、２，６−ジクロロプリン、２−アミノ−６−
クロロプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルチオ
プリン、１−デアザアデニン、３−デアザグアニン、ベ
ンズイミダゾール、グリオキサール−グアニンなど）を
使用することができる。従って、本発明の方法により得
られる２’−デオキシリボヌクレオシド化合物は、これ
ら天然の核酸塩基および人工の核酸塩基類縁化合物の何
れかを塩基として含む化合物であり得る。

【００４６】

【化４】

【００４７】

【化５】

【００４８】

【化６】

【００４９】本発明において、（１−ａ）式で示される
グルコース代謝系、（１−ｂ）式又は（１−ｃ）式で示
されるグリセロール代謝系の反応、次に（２）式の反応
から（３）式の反応を経由して（４）式への反応の移行
は、それぞれの反応で得られた目的物を単離することな
く連続して行うことができる。このように、反応を連続
して行うことを、本発明において「反応のカップリン
グ」又は「反応をカップリングさせる」という。

【００５０】反応のカップリングとは、まず、（１−
ａ）式、（１−ｂ）式又は（１−ｃ）式を触媒する微生
物の反応によりグリセルアルデヒド３−リン酸を生成さ
せた後、（２）式の反応を触媒する微生物及びアセトア
ルデヒドを反応液中に添加することにより２−デオキシ
リボース５−リン酸を生成させ、その後、（３）式及び
（４）式の反応を触媒する微生物、及び核酸塩基を反応
液中に添加することにより行うことができる。あるい
は、（１−ａ）式、（１−ｂ）式又は（１−ｃ）式の反
応を行う際に（２）式の反応を触媒する微生物及びアセ
トアルデヒドが既に添加されていてもよい。また、（１
−ａ）式、（１−ｂ）式又は（１−ｃ）式と（２）式の
反応を行う際に、（３）式及び（４）式の反応を触媒す
る微生物、及び核酸塩基が既に添加されていてもよい。
本発明の説明において、２−デオキシリボース５−リ
ン酸を生成させるまでの反応［（１−ａ）式、（１−
ｂ）式又は（１−ｃ）式と、（２）式の反応］と、その
後の２’−デオキシリボヌクレオシド化合物を製造する
反応［（３）式及び（４）式の反応］を便宜的に分けて
説明するが、本発明は、中間生成物（グリセルアルデヒ
ド３−リン酸、２−デオキシリボース５−リン酸、２−
デオキシリボース１−リン酸）を単離することなく連続
して各反応を行うことができるのである。

【００５１】なお、（１−ａ）式、（１−ｂ）式又は
（１−ｃ）式から、（４）式へ反応を連続して行うに
は、（３）式及び（４）式の反応においてもアセトアル
デヒドの存在下で行うことが好ましい。アセトアルデヒ
ドの存在下で（３）式及び（４）式の反応を行うと、最
終生成物である２’−デオキシリボヌクレオシド化合物
の収率を増大させることができる。アセトアルデヒドの
存在により、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラ
ーゼが共存している反応系では、（２）式の平衡反応を
２−デオキシリボース５−リン酸の生成側（右側）にシ
フトさせることができるからである。

【００５２】また、グルコース１，６−ジリン酸はホス
ホペントムターゼによる反応の活性化因子として報告さ
れており（Ｈａｍｍｅｒ−Ｊｅｓｐｅｒｓｏｎ，Ｋ．，
Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ａ．；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，１７巻，３９７〜４０７頁，１９７０
年）、（３）式の反応系に加えることが望ましい。

【００５３】＜微生物及び酵素＞本発明において「糖類
からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成する能力を有
する微生物」としては該能力を有するものであれば特に
限定されないが、例えば、パン酵母、エシェリヒア（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、オクロバ
クトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、サッカロマ
イセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディ
ダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、又はロドトルラ（Ｒｈｏｄｏ
ｔｏｒｕｌａ）属に属する微生物が挙げられ、好ましく
は、パン酵母、エシェリヒア属、クレブシエラ属に属す
る微生物が挙げられる。より好ましくは、エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、クレブ
シエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ）に属する微生物が挙げられ、より具体
的には、エシェリヒア・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−７８９５）、エシェリヒア・コリＪＭ
１０９／ｐＴＳ８（ＦＥＲＭＢＰ−７８９６）又はク
レブシエラ・ニューモニエＢ−４４（ＩＦＯ１６５
７９）が挙げられる。

【００５４】「アデニン、アデノシン、アデノシン５’
−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸からなる群
より選択されるアデノシン類からアデノシン５’−トリ
リン酸を生成する能力を有する微生物」としては該能力
を有するものであれば特に限定されないが、例えば、パ
ン酵母、メタノール資化性酵母、ブレビバクテリウム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｉｒｕｍ）属、コリネバクテリ
ウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリ
ヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
属、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）
属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、又はロドトル
ラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属に属する微生物が挙げ
られ、好ましくは、パン酵母、ブレビバクテリウム属に
属する微生物が挙げられる。ブレビバクテリウム属のう
ちより好ましくは、ブレビバクテリウム・アンモニアゲ
ネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｉｒｕｍａｍｍｏｎｉａ
ｇｅｎｅｓ）に属する微生物が挙げられ、より具体的に
は、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ
６８７２が挙げられる。

【００５５】「解糖系によりアデノシン５’−トリリン
酸を生成する能力を有する微生物」としては該能力を有
するものであれば特に限定されないが、例えば、パン酵
母、メタノール資化性酵母、ブレビバクテリウム（Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｉｒｕｍ）属、コリネバクテリウム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリヒア
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、オ
クロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、サッ
カロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャ
ンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、又はロドトルラ（Ｒｈ
ｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属に属する微生物が挙げられ、好
ましくは、パン酵母、ブレビバクテリウム属に属する微
生物が挙げられる。ブレビバクテリウム属のうちより好
ましくは、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｉｒｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅ
ｓ）に属する微生物が挙げられ、より具体的には、ブレ
ビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７
２が挙げられる。

【００５６】「２−デオキシリボース５−リン酸アルド
ラーゼ（ＥＣ４．１．２．４）を含有する微生物」とし
ては該活性を有するものであれば特に限定されないが、
例えば、クレブシエラ属、エンテロバクター属、エシェ
リヒア属、又はバチルス属に属する微生物が挙げられ、
好ましくは、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）
属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）
属、又はエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に
属する微生物が挙げられる。さらに好ましくはクレブシ
エラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ）に属する微生物であり、より具体的には
クレブシエラ・ニューモニエＢ−４４（ＩＦＯ１６
５７９）である。更に、「２−デオキシリボース５−リ
ン酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．４）を含有する微
生物」として、２−デオキシリボース５−リン酸アルド
ラーゼ遺伝子で形質転換された任意の形質転換体を利用
することもできる。その一例として、本発明で実際に作
成された形質転換体、即ち、エシェリヒア・コリ１０
Ｂ５／ｐＴＳ８（ＦＥＲＭＢＰ−７８９５）、エシェ
リヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴＳ８（ＦＥＲＭＢＰ
−７８９６）を挙げることができる（後述の実施例１お
よび２の記載を参照）。

【００５７】クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｂ−４４（ＩＦ
Ｏ１６５７９）は、財団法人発酵研究所（Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅｆｏｒＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａ
ｋａ；２−１７−８５，ｊｕｓｏ−ｈｏｎｍａｃｈｉ，
ｙｏｄｏｇａｗａ−ｋｕ，Ｏｓａｋａ，５３２−８６８
６，Ｊａｐａｎ）へ平成１３年３月１日に寄託されてい
る。なお、本菌株は、国立感染症研究所が作成した微生
物のバイオセーフティーレベルによれば、レベル２に属
するものであるため、ブダペスト条約上の国際寄託当局
である産業技術総合研究所（旧工業技術院）生命工学工
業技術研究所により受託を拒否され、平成１３年２月２
７日付けでその旨証明されている。

【００５８】「ホスホペントムターゼ（ＥＣ５．４．
２．７）とヌクレオシドホスホリラーゼ［プリンヌクレ
オシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）及びピリ
ミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．
２）の両者を意味する］を含有する微生物」としては、
該活性を有するものであれば特に限定されないが、例え
ば、クレブシエラ属、エンテロバクター属、エシェリヒ
ア属、又はバチルス属に属する微生物が挙げられ、好ま
しくは、バチルス属に属する耐熱性微生物、より好まし
くはバチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃ
ｏａｇｕｌａｎｓ）に属する微生物が挙げられる。さら
に好ましくは、バチルス・コアギュランスＹＧＫ−６０
５４（ＦＥＲＭＢＰ−７８９８）、及びバチルス・ス
ピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＹＧＫ−６
００８（ＦＥＲＭＢＰ−７８９７）である。

【００５９】本菌株は通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に平成１２年５月１２日に国内寄託された
［バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏ
ａｇｕｌａｎｓ）ＹＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭＰ−
１７８５２）、及びバチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｐ．）ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭＰ−
１７８５１）］。その後、平成１４年２月１５日に産業
技術総合研究所特許生物寄託センターに国内寄託から国
際寄託へ移管されている。

【００６０】寄託菌株であるクレブシエラ・ニューモニ
エ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
Ｂ−４４、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＹＧＫ−６０５４、及びバチ
ルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）Ｙ
ＧＫ−６００８の菌学的性質は、バージェイス・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第１
巻（１９８４年）及びバージェイス・マニュアル・オブ
・デターミナティブ・バクテリオロジー第９版（１９９
４年）に準じて検討した。なお、実験は主として長谷川
武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」（学会出版セ
ンター、１９８５年）記載の方法により行った。

【００６１】以下に、寄託菌株である＜１＞クレブシエ
ラ・ニューモニエＢ−４４、＜２＞バチルス・コアギ
ュランスＹＧＫ−６０５４、及び＜３＞バチルス・ス
ピーシーズＹＧＫ−６００８の菌学的性質を記載す
る。

【００６２】＜１＞クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｂ−４４
（ＩＦＯ１６５７９）。１．形態的性質（１）細胞の形及び大きさ：桿菌、０．８×０．８〜
３．２μｍ（２）グラム染色性：陰性（３）細胞の多形性の有無：なし（４）運動性：なし（５）鞭毛の着生状態：なし（６）胞子の有無：なし（７）抗酸性：なし２．培養的性質（１）肉汁寒天平板培養：円形、全縁滑らか、低凸
状、表層滑らか、乳黄色（２）肉汁寒天斜面培養：乳黄色、不透明で培地全体
に拡がり生育は良好である。（３）肉汁液体培養：濁りは中程度で均一、色なし（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：変化なし（５）リトマスミルク：やや酸性、凝固、ガス発生３．生理学的性質（１）硝酸塩の還元：陽性（２）脱窒反応：陰性（３）ＭＲテスト：陽性（４）ＶＰテスト：陰性（５）インドールの生成：陰性（６）硫化水素の生成：陰性（７）デンプンの加水分解：陰性（８）クエン酸の利用・コーザー（Ｋｏｓｅｒ）培地：陽性・クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）培地：
陽性（９）無機窒素源の利用：・硝酸塩：陽性（弱い）・アンモニウム塩：陽性（弱い）（10）色素の産生：陰性（11）ウレアーゼ：陰性（12）オキシダーゼ：陰性（13）カタラーゼ：陽性（14）生育の範囲・ｐＨ：３．５〜１０．２（至適５．０〜８．０）・温度域：１０〜４０℃（至適２２〜３０℃）（15）酸素に対する態度：均一に生育、ガス発生（16）Ｏ−Ｆテスト・グルコース：Ｆ４．その他種の特徴を示すに必要なもの（１）各種炭素源の利用・ラクトース：＋・マルトース：＋・Ｄ−キシロース：＋・Ｄ−マンニトール：＋・ラフィノース：＋・Ｄ−ソルビトール：＋・シュークロース：＋・イノシトール：＋・アドニトール：＋・Ｌ−ラムノース：＋・Ｌ−アラビノース：＋・Ｄ−マンノース：＋（２）β−ガラクトシダーゼ：＋（３）アルギニン脱炭酸： − （４）リジン脱炭酸：＋（５）オルニチン脱炭酸： − （６）エスクリン加水分解：＋（７）有機酸の利用・マロン酸：＋・クエン酸：＋・グルコン酸：＋・ｎ−カプリン酸： − ・アジピン酸： − ・ＤＬ−リンゴ酸：＋（８）アセトアミド利用： − （９）インドール・ピルビン酸産生： − （10）アルギニンデヒドロラーゼ： − （11）ゼラチン加水分解： − （12）酢酸フェニル資化能： − ５．化学分類学的性質（１）ＧＣ含量：５０〜５２mol％（ＨＰＬＣ法）以上の菌学的性質に基づき、本菌株はクレブシエラ・ニ
ューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ）と判明した。

【００６３】＜２＞バチルス・コアギュランス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＹＧＫ−６０５４
（ＦＥＲＭＢＰ−７８９８）１．形態的性質（１）細胞の形及び大きさ：桿菌、０．７×２μｍ（２）グラム染色性：陽性（３）細胞の多形性の有無：なし（４）運動性：あり（５）鞭毛の着生状態：周毛（６）胞子：楕円形の内性胞子形成、位置は末端（７）抗酸性：なし２．培養的性質（１）肉汁寒天平板培養：不規則形、全縁波状、低くて
平ら、やや光沢あり、クリーム色（２）肉汁寒天斜面培養：クリーム色、半透明で培地全
体に広がり生育は良好（３）肉汁液体培養：濁りは中程
度で均一（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：全体液化（冷却時）（５）リトマスミルク：凝固、ｐＨ８３．生理学的性質（１）硝酸塩の還元：陽性（２）脱窒反応：陽性（３）ＭＲテスト：陰性（４）ＶＰテスト：陽性（５）インドールの生成：陰性（６）硫化水素の生成：陰性（７）デンプンの加水分解：陰性（８）クエン酸の利用：陽性（９）無機窒素源の利用：・硝酸塩：陽性・アンモニウム塩：陽性（10）色素の産生：陰性（11）ウレアーゼ：陰性（12）オキシダーゼ：陽性（13）カタラーゼ：陽性（14）生育の範囲・ｐＨ５〜６．８における生育：生育した・ＮａＣｌ濃度：１〜２％で生育した、５％で生育せず・温度域：４２〜５９℃で生育した（至適５２〜５５
℃）、３０℃で生育せず（15）酸素に対する態度：通性嫌気性（16）Ｏ−Ｆテスト・グルコース：Ｆ（ガスの産生なし）４．その他種の特徴を示すに必要なもの（１）各種炭素源の利用・ラクトース：− ・マルトース：＋・Ｄ−キシロース：＋・マンニトール：＋・Ｄ-ラフィノース：− ・ソルビトール：− ・シュークロース：− ・イノシトール：− ・アドニトール：− ・ラムノース：− ・Ｌ−アラビノース：− ・Ｄ−マンノース：− ・リボース：＋・ガラクトース：＋・Ｄ−グルコース：＋・Ｄ−フルクトース：＋・Ｎ−アセチルグルコサミン：＋・トレハロース：＋（２）β−ガラクトシダーゼ：陽性（３）アルギニン脱炭酸：陰性（４）リジン脱炭酸：陰性（５）オルニチン脱炭酸：陰性（６）エスクリン加水分解：陽性（７）インドール産生：陰性（８）アルギニンジヒドロラーゼ：陰性（９）ゼラチン加水分解：陽性５．化学分類学的性質（１）ＧＣ含量：５０〜５２ｍｏｌ％（ＨＰＬＣ法）以上の菌学的性質に基づき、本菌株はバチルス・コアギ
ュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）と
判明した。

【００６４】＜３＞バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｐ．）ＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−７８９７）１．形態的性質（１）細胞の形及び大きさ：桿菌、０．８×２〜３μｍ（２）グラム染色性：陽性（３）細胞の多形性の有無：なし（４）運動性：あり（５）鞭毛の着生状態：周毛（６）胞子：楕円形の内性胞子形成、位置は末端（７）抗酸性：なし２．培養的性質（１）肉汁寒天平板培養：楕円形、全縁なめらか、低凸
状、やや光沢あり、クリーム色（２）肉汁寒天斜面培養：クリーム色、不透明で画線跡
にそって生育、生育は良好（３）肉汁液体培養：濁りは中程度で均一（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：全面液化（冷却時）（５）リトマスミルク：凝固、ｐＨ８３．生理学的性質（１）硝酸塩の還元：陽性（２）脱窒反応：陽性（３）ＭＲテスト：陰性（４）ＶＰテスト：陽性（５）インドールの生成：陰性（６）硫化水素の生成：陰性（７）デンプンの加水分解：陰性（８）クエン酸の利用：陽性（９）無機窒素源の利用：・硝酸塩：陽性・アンモニウム塩：陽性（10）色素の産生：陰性（11）ウレアーゼ：陰性（12）オキシダーゼ：陽性（13）カタラーゼ：陽性（14）生育の範囲・ｐＨ５〜６．８における生育：ｐＨ５〜５．７で生育
せず、ｐＨ６．８で生育した・ＮａＣｌ濃度：１％で生育した、２〜５％で生育せず・温度域：４２〜５９℃で生育した（至適５２〜５５
℃）、３０℃で生育せず（15）酸素に対する態度：通性嫌気性（16）Ｏ−Ｆテスト・グルコース：Ｆ（ガスの産生なし）４．その他種の特徴を示すに必要なもの（１）各種炭素源の利用・ラクトース：− ・マルトース：＋・Ｄ−キシロース：＋・マンニトール：＋・Ｄ−ラフィノース：− ・ソルビトール：− ・シュークロース：− ・イノシトール：− ・アドニトール：− ・ラムノース：− ・Ｌ−アラビノース：− ・Ｄ−マンノース：− ・リボース：＋・ガラクトース：＋・Ｄ−グルコース：＋・Ｄ−フルクトース：＋・Ｎ−アセチルグルコサミン：＋・トレハロース：＋（２）β−ガラクトシダーゼ：陽性（３）アルギニン脱炭酸：陰性（４）リジン脱炭酸：陰性（５）オルニチン脱炭酸：陰性（６）エスクリン加水分解：陽性（７）インドール産生：陰性（８）アルギニンジヒドロラーゼ：陰性（９）ゼラチン加水分解：陽性５．化学分類学的性質（１）ＧＣ含量：４８〜５０ｍｏｌ％（ＨＰＬＣ法）以上の菌学的性質に基づき、本菌株はバチルス・スピー
シーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）と判明した。

【００６５】＜培養条件と酵素の調製＞本発明に用いる
微生物は通常の細菌用培地に生育させることができる。
寄託菌株の培養も同様である。例えば、クレブシエラ・
ニューモニエＢ−４４（ＩＦＯ１６５７９）は、通
常の細菌用培地に生育させることができる。窒素源とし
ては、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、トリプトンな
どを、無機塩としては、塩化アンモニウム、硝酸カリウ
ム、塩化ナトリウムなどを用いることができる。なお、
２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼの生産を
高めるために、培地に、２−デオキシリボース、フルク
トース、フルクトース１，６−ジリン酸、ジヒドロキシ
アセトンなどを添加することが有効である。

【００６６】バチルス・コアギュランスＹＧＫ−６０
５４（ＦＥＲＭＢＰ−７８９８）、及びバチルス・ス
ピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＹＧＫ−６
００８（ＦＥＲＭＢＰ−７８９７）は通常の細菌用培
地に生育させることができる。窒素源としては、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素類又はペ
プトン、トリプトンなどの有機窒素類を用いることがで
きる。また、培地にマンガン、マグネシウムを添加する
ことが望ましい。なお、ホスホペントムターゼとヌクレ
オシドホスホリラーゼの生産を高めるうえで、培地にリ
ボースなどの糖又はイノシン、チミジンなどのヌクレオ
シドを添加することが有効である。

【００６７】本発明において、微生物の菌体、該微生物
菌体の処理物又は該微生物に由来の酵素によりとは、微
生物を含有する懸濁液（菌体懸濁液）又は該微生物から
産生される酵素を用いて反応を行うことを意味する。ま
た、微生物菌体の処理物とは、微生物菌体を物理的又は
化学的処理（例えば、ポリオキシエチレンラウリルアミ
ンなどの界面活性剤、キシレン、トルエンなどの有機溶
媒を含有する溶液で処理）により膜構造を部分的又は全
体的に破壊する操作を行ったものを意味する。すなわ
ち、本発明は、菌体懸濁液そのものを用いて反応を行っ
てもよく、また微生物から産生される酵素を取り出して
該反応を行ってもよい。

【００６８】＜反応条件及び生成物の分離精製と定量＞
まず、グルコース代謝系、グリセロール代謝系などにお
ける糖類からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成させ
た後、該グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデ
ヒドから２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ
により２−デオキシリボース５−リン酸を生成させる反
応条件について記す。以下、２−デオキシリボース５−
リン酸が生成されるまでの反応を「第一の反応系」とも
いう。

【００６９】「第一の反応系」において、糖類の初期濃
度は、一般に１００〜１０００ｍＭである。アセトアル
デヒドの初期濃度は、一般に１５〜１０００ｍＭであ
り、好ましくは１５０〜４００ｍＭである。アデノシン
５’−トリリン酸を人為的に反応に添加する場合は、そ
の初期濃度は、一般に１０〜５００ｍＭであり、好まし
くは５０〜１００ｍＭである。

【００７０】また、アデニン、アデノシン、アデノシン
５’−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸からな
る群より選択されるアデノシン類からアデノシン５’−
トリリン酸を生成する能力を有する微生物、該微生物菌
体の処理物又は該微生物由来の酵素を該アデノシン類に
作用させて得られたアデノシン５’−トリリン酸を用い
る場合は、基質となるアデノシン類の初期濃度は、一般
に１０〜１００ｍＭであり、好ましくは１０〜１５ｍＭ
程度の触媒量である。あるいは、微生物の解糖系により
得られるアデノシン５’−トリリン酸を用いる場合は、
前記（１−ａ）式に示されるグルコース代謝系における
糖類が基質として利用され得る。

【００７１】反応液のｐＨは、通常４．０〜１２．５で
あり、好ましくは７．０〜９．５である。反応液として
は上記ｐＨに調整することが可能な任意の緩衝液が使用
可能である。反応温度は、通常２０〜６０℃であり、好
ましくは２５〜４０℃である。反応時間は反応条件によ
って左右されるが、通常２〜６時間で終了する。

【００７２】「第一の反応系」に使用する微生物は、好
ましくは、該微生物を予め栄養培地で、３〜７２時間培
養したものが使用され、より好ましくは８〜２４時間培
養したものが使用される。また、反応に使用する菌体濃
度は、好ましくは、１．０〜２０質量％であるが、菌体
濃度が高いほど２−デオキシリボース５−リン酸を生成
するうえで好ましい。

【００７３】なお、反応液からの生成物の採取は行って
も行わなくても次の反応に移行することができるが、採
取を行う場合には、限外ろ過、イオン交換分離、吸着ク
ロマトグラフィーなどにより行うことができる。

【００７４】反応生成物の定量は２つの方法により行う
ことができる。第１の方法はバートン（Ｂｕｒｔｏｎ）
法である（例えば、東京化学同人、生化学辞典・第３
版、６６４頁、１９９８年）。本法は、ジフェニルアミ
ン・酢酸・硫酸反応により、鋭敏に２−デオキシリボー
スを検出する特異性の高い定量方法で、２−デオキシリ
ボース５−リン酸の吸光係数は２−デオキシリボースの
それと等しい。第２の方法は、ＤＮＡの比色定量法であ
るシステイン・硫酸（ｃｙｓｔｅｉｎ−ｓｕｌｆａｔ
ｅ）法の応用である（例えば、Ｓｔｕｍｐｆ，Ｐ．
Ｋ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１６９巻，３６７
〜３７１頁，１９４７年）。本法により２−デオキシリ
ボース５−リン酸を定量することができる。

【００７５】次に、２−デオキシリボース５−リン酸を
ホスホペントムターゼにより、２−デオキシリボース１
−リン酸を生成させた後、該２−デオキシリボース１−
リン酸と核酸塩基とからヌクレオシドホスホリラーゼに
より２’−デオキシリボヌクレオシド化合物を生成させ
る条件について記す。以下、２−デオキシリボース５−
リン酸と核酸塩基から２’−デオキシリボヌクレオシド
化合物が生成されるまでの反応を「第二の反応系」とも
いう。

【００７６】「第二の反応系」において、原料の２−デ
オキシリボース５−リン酸を、「第一の反応系」から単
離することなく使用する場合、２−デオキシリボース５
−リン酸の初期濃度は、「第一の反応系」で得られた濃
度となる。「第二の反応系」において、原料の２−デオ
キシリボース５−リン酸の初期濃度は、５〜２００ｍＭ
であることが好ましく、より好ましくは５〜１００ｍＭ
である。原料の核酸塩基の初期濃度は、一般に５〜２０
０ｍＭであり、好ましくは５〜１００ｍＭである。核酸
塩基は、「第一の反応系」において２−デオキシリボー
ス５−リン酸が生成される程度の十分な反応時間が経過
した後に、該反応液に添加してもよいし、「第一の反応
系」の反応液に予め添加されてもよい。また、核酸塩基
の初期濃度は、２−デオキシリボース５−リン酸の初期
濃度以上とするのがよい。一般に、２−デオキシリボー
ス５−リン酸に対する核酸塩基のモル濃度は高い方が２
−デオキシリボース５−リン酸に対するヌクレオシド化
合物の収率は増大する。ただし、飽和濃度より高い濃度
の核酸塩基を加える場合には、反応の進行を見ながら分
割して加えてもよい。

【００７７】上述のとおり、ホスホペントムターゼとヌ
クレオシドホスホリラーゼによる「第二の反応系」は、
アセトアルデヒドの存在下で行うことが好ましい。アセ
トアルデヒドの存在により、「第一の反応系」の平衡反
応を２−デオキシリボース５−リン酸の生成側にシフト
させることが可能となる。アセトアルデヒドは、「第二
の反応系」の際に存在していれば、任意の時期に添加さ
れ得る。アセトアルデヒドの初期濃度は、一般に５〜６
００ｍＭであり、好ましくは２００〜４００ｍＭであ
る。

【００７８】また、上述のとおり、ホスホペントムター
ゼによる反応は、該反応の活性化因子として報告されて
いるグルコース１，６−ジリン酸の存在下で行うことが
好ましい。グルコース１，６−ジリン酸は、ホスホペン
トムターゼによる反応の際に存在していれば、任意の時
期に添加され得る。グルコース１，６−ジリン酸の初期
濃度は触媒量でかまわないが、好ましくは０．０１〜
０．１ｍＭである。

【００７９】反応液のｐＨは、通常６．０〜１１．０で
あり、好ましくは７．０〜１１．０である。反応液とし
ては上記ｐＨに調整することが可能な任意の緩衝液が使
用可能である。好ましくは、トリス−塩酸緩衝液であ
る。

【００８０】反応温度は、一般に２０〜６５℃で行えば
よく、ホスホペントムターゼおよびヌクレオシドホスホ
リラーゼが耐熱性微生物に由来する耐熱性酵素である場
合には好ましくは５０〜６０℃で行うことができる。反
応時間は反応条件によって左右されるが、通常４〜１２
時間で終了する。

【００８１】「第二の反応系」に使用する微生物は、好
ましくは、該微生物を予め栄養培地で、３〜７２時間培
養したものが使用され、より好ましくは７〜９時間培養
したものが使用される。また、反応に使用する菌体濃度
は、好ましくは、１〜２０質量％であるが、菌体濃度が
高いほど２’−デオキシリボヌクレオシド化合物を生成
するうえで好ましい。

【００８２】「第一の反応系」の最適な反応条件（ｐ
Ｈ、温度）と、「第二の反応系」の最適な反応条件との
ずれは、「第一の反応系」において２−デオキシリボー
ス５−リン酸が生成される程度の時間が経過した後に調
整することが好ましいが、全反応を通して、ｐＨ６．０
〜１１．０、温度２０〜６５℃で行ってもよい。

【００８３】さらに、本発明において、「第一の反応
系」と「第二の反応系」を連続して行うと、ホスホペン
トムターゼ及びヌクレオシドホスホリラーゼによる反応
が、ジヒドロキシアセトンリン酸又はグリセルアルデヒ
ド３−リン酸によって阻害を受けることが明らかになっ
た。グリセルアルデヒド３−リン酸は２−デオキシリボ
ース５−リン酸アルドラーゼによる反応の基質であり、
一方ジヒドロキシアセトンリン酸はトリオースリン酸イ
ソメラーゼによってグリセルアルデヒド３−リン酸にな
る。中間生成物の２−デオキシリボース５−リン酸を単
離せずに、２’−デオキシリボヌクレオシド化合物を製
造する場合、未反応の基質として少量のジヒドロキシア
セトンリン酸又はグリセルアルデヒド３−リン酸が混入
することは避けられない。

【００８４】酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、塩
化カリウム、酢酸カリウム、硝酸ナリトウムなどの無機
塩をホスホペントムターゼ反応系へ添加することが、ジ
ヒドロキシアセトンリン酸又はグリセルアルデヒド３−
リン酸によるホスホペントムターゼ及びヌクレオシドホ
スホリラーゼの阻害を解除するには有効であり、添加濃
度は、一般に５〜１０００ｍＭであり、好ましくは２０
０〜３００ｍＭである。添加時期は、ホスホペントムタ
ーゼによる反応の際に酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニ
ウムなどの無機塩が反応系に存在していれば特に限定さ
れず、予め添加されていても構わない。

【００８５】反応液からの２’−デオキシリボヌクレオ
シド化合物の採取は、限外ろ過、イオン交換分離、吸着
クロマトグラフィーなどにより行うことができる。反応
生成物の定性・定量分析はＴＬＣにより、より精度の高
い定量はＵＶ検出器及び／又は屈折計を装着したＨＰＬ
Ｃなどにより行うことができる。

【００８６】＜２−デオキシリボース５−リン酸アルド
ラーゼ活性を有する酵素タンパク質＞本発明で使用され
る２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ活性を
有する酵素タンパク質は、配列番号２で示されるアミノ
酸配列からなる酵素タンパク質であり得る。２−デオキ
シリボース５−リン酸アルドラーゼ活性とは、下記
（２）式で示される反応を触媒する活性を表し、該活性
を示すものであれば特に限定されない。また、本発明で
使用される２−デオキシリボース５−リン酸アルドラー
ゼ活性を有する酵素タンパク質は、配列番号２で示され
るアミノ酸配列において１つ若しくは複数（一般的には
数個）のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿
入されたアミノ酸配列からなり、かつ２−デオキシリボ
ース５−リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素タンパク
質であれば限定されない。

【００８７】

【化７】

【００８８】＜２−デオキシリボース５−リン酸アルド
ラーゼ遺伝子＞本発明で使用される２−デオキシリボー
ス５−リン酸アルドラーゼをコードする遺伝子は、配列
番号４で示される塩基配列を含み、前記（２）式で示さ
れる２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ活性
を有する酵素タンパク質をコードする塩基配列を含むＤ
ＮＡであり得る。本発明においてはクレブシエラ・ニュ
ーモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ）Ｂ−４４からクローニングされた２−デオキシリ
ボース５−リン酸アルドラーゼ遺伝子を用いたが、２−
デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ遺伝子は、ど
のような生物からクローニングされたものであってもよ
い。

【００８９】本発明で使用される２−デオキシリボース
５−リン酸アルドラーゼ遺伝子は、該遺伝子の塩基配列
において１つ若しくは複数（一般的には数個）のヌクレ
オチドが欠失、置換、付加及び／若しくは挿入された塩
基配列を含み、かつ２−デオキシリボース５−リン酸ア
ルドラーゼ活性を有する酵素タンパク質をコードする塩
基配列を含むものであってもよい。さらに、本発明で使
用される２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ
遺伝子は、上記２−デオキシリボース５−リン酸アルド
ラーゼをコードする遺伝子と標準的な条件下でハイブリ
ダイズする塩基配列若しくは該塩基配列を含む組み換え
ＤＮＡ配列も含み得る。

【００９０】別の側面において、本発明で使用される２
−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼをコードす
る遺伝子は、（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列
からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は（ｂ）配
列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ若しくは
複数（一般的には数個）のアミノ酸が欠失、置換、付加
及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ
２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ活性を有
する酵素タンパク質をコードする遺伝子である。

【００９１】＜ＤＮＡの取得とクローン化したＤＮＡを
含む発現ベクターの構築及び微生物の形質転換と組み換
え微生物による発現＞本発明は、微生物における２−デ
オキシリボース５−リン酸アルドラーゼをコードする単
離ＤＮＡ配列を提供する。本発明の前記ＤＮＡは、対象
となる酵素タンパク質をコードする遺伝子の発現に関与
するプロモーター及びターミネーターなどの調節配列を
含む塩基配列を意味し得る。また、２−デオキシリボー
ス５−リン酸アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコ
ードする単離ＤＮＡ配列の５’−及び３’−非翻訳領域
の間に含まれるｃＤＮＡを意味し得る。

【００９２】更に本発明は、配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有
するベクター、並びに、前記ベクターを含有する形質転
換体を提供する。

【００９３】本発明に用いられる２−デオキシリボース
５−リン酸アルドラーゼの遺伝子、組換え発現ベクター
及び組換え微生物は、以下の手順によって得ることがで
きる。（１）本発明の２−デオキシリボース５−リン酸
アルドラーゼを提供しうる微生物からの染色体ＤＮＡの
単離、及びこの染色体ＤＮＡによる遺伝子ライブラリー
の構築、（２）コロニー又はプラークハイブリダイゼー
ション、ＰＣＲクローニング、インバースＰＣＲ、サザ
ンブロットハイブリダイゼーションなどによる、染色体
ＤＮＡからの２−デオキシリボース５−リン酸アルドラ
ーゼ遺伝子のクローニング、（３）得られた２−デオキ
シリボース５−リン酸アルドラーゼ遺伝子の塩基配列の
決定及び２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ
遺伝子を効率的に含有し発現する組換え発現ベクターの
構築、（４）形質転換、形質導入、接合及び電気穿孔に
よる、組換え発現ベクター上又は染色体上に２−デオキ
シリボース５−リン酸アルドラーゼ遺伝子を有する組換
え微生物の作成。

【００９４】本発明の２−デオキシリボース５−リン酸
アルドラーゼをコードするＤＮＡの単離又はクローニン
グに用いる技術は当技術分野で公知であり、これにはゲ
ノムＤＮＡからの単離が含まれる。このようなゲノムＤ
ＮＡからの本発明のＤＮＡ配列のクローニングは、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによって行う
ことができる。

【００９５】２−デオキシリボース５−リン酸アルドラ
ーゼ遺伝子のクローニングを行うためには、２−デオキ
シリボース５−リン酸アルドラーゼのアミノ酸配列に関
する知識が必要であり、従来の方法によって２−デオキ
シリボース５−リン酸アルドラーゼタンパク質を精製
し、部分アミノ酸配列を決定することにより得ることが
できる（引用文献；Ｖａｌｅｎｔｉｎ−Ｈａｎｓｅｎ，
Ｐ．，Ｂｏｅｔｉｕｓ，Ｆ．，Ｈａｍｍｅｒ−Ｊｅｓｐ
ｅｒｓｅｎ，Ｋ．，ａｎｄＳｖｅｎｄｓｅｎ，Ｉ．，
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２５，５６１−５６
６）。完全なアミノ酸配列を決定する必要はなく、適切
なアミノ酸配列が同定されたら、前記の部分アミノ酸配
列に関する情報に基づき、ＰＣＲ用のプライマーとして
のオリゴヌクレオチドを合成することができる。本発明
において、ＰＣＲによる２−デオキシリボース５−リン
酸アルドラーゼ遺伝子のクローニングために用いるプラ
イマーは、エシェリヒア属、ビブリオ属、アグロバクテ
リウム属、ストレプトマイセス属、又はクレブシエラ属
に属する微生物、最も好ましい態様においてはクレブシ
エラ・ニューモニエＢ−４４の内部ペプチド断片のア
ミノ酸配列に基づく。２−デオキシリボース５−リン酸
アルドラーゼに関するＤＮＡ断片（部分ＤＮＡ配列）
は、前記プライマー及びクレブシエラ・ニューモニエ
Ｂ−４４の染色体ＤＮＡのテンプレートを用いるＰＣＲ
増幅によって生成され得る。増幅されたＤＮＡ断片は、
クレブシエラ・ニューモニエＢ−４４の２−デオキシ
リボース５−リン酸アルドラーゼの全体をコードするゲ
ノム断片をクローニングするためのプローブとして用い
ることができる。

【００９６】コード領域に加えてプロモーター又はター
ミネーターなどの調節配列を含む遺伝子全体は、上記の
ＰＣＲによって得られた部分ＤＮＡ断片を標識した後に
プローブとして用いることにより、適切な宿主内でファ
ージベクター又はプラスミドベクター中に作成したゲノ
ムライブラリーのスクリーニングによって染色体からク
ローニングすることができる。また、ゲノムＤＮＡを制
限酵素処理した後、自己環化させた遺伝子断片に対して
インバース−ＰＣＲを行うことにより、部分ＤＮＡ断片
の上流及び下流を増幅し、配列を解読、連結することに
より、遺伝子全体を得ることができる（Ｏｃｈｍｅｎ，
Ｈ．，Ｇｅｒｂｅｒ，Ａ．Ｓ．，Ｈａｒｔｌ，Ｄ．
Ｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０，６２１−６２３）。
一般にライブラリーの作製、及びシークエンシング、制
限酵素処理、連結などの遺伝子操作には、宿主株として
の大腸菌、及び大腸菌ベクター、λファージベクターな
どのファージベクター、プラスミドベクター又は酵母ベ
クターがしばしば用いられる。プラスミド又はファージ
ライブラリーからの望ましいクローンの同定は、望まし
い遺伝子が適切なストリンジェンシー条件下で望ましい
遺伝子の一部を有するプローブとハイブリダイズするこ
とによってなされる。

【００９７】本発明では、クレブシエラ・ニューモニエ
Ｂ−４４のゲノムＤＮＡを制限酵素処理し、ＰＣＲに
よって得られた部分ＤＮＡ断片とハイブリダイズする制
限酵素処理ＤＮＡ断片をサザンハイブリダイゼーション
により選抜した。この制限酵素処理ＤＮＡ断片を自己環
化させた遺伝子断片に対して、部分ＤＮＡ断片に存在す
る配列に基づいて作成したプライマーを用い、インバー
ス−ＰＣＲを行った。得られた増幅断片の配列を解読
し、部分ＤＮＡ断片の上流及び下流であることを確認の
後、連結することにより、２−デオキシリボース５−リ
ン酸アルドラーゼ遺伝子全体を含む断片を得た。この断
片をシークエンシングに都合よく用いられる適切なプラ
スミドベクター、例えば、ｐＣＵ１８やｐＣＵ１９中に
挿入しサブクローニングした。本発明では、この断片を
ｐＴ７ＢｌｕｅＴベクター中にサブクローニングし
た。

【００９８】目的遺伝子の塩基配列は、ジデオキシチェ
ーンターミネーター法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７４巻，５４６３〜５４６７
頁，１９７７年）などの周知の方法によって決定でき
る。

【００９９】本発明の単離されたＤＮＡ配列を、当技術
分野で周知の方法に従って、異なる属又は種の他の菌株
から、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ活
性を有する酵素タンパクをコードするＤＮＡを同定及び
クローニングするために用いてもよい。

【０１００】本発明では、２−デオキシリボース５−リ
ン酸アルドラーゼをコードする配列を含む組換えＤＮ
Ａ、好ましくはベクター及び／又はプラスミドに関す
る。前記の組換えＤＮＡベクター及び／又はプラスミド
は、上記のＤＮＡのオープンリーディングフレームに加
えて、プロモーター又はターミネーターなどの調節領域
を含んでもよい。

【０１０１】２−デオキシリボース５−リン酸アルドラ
ーゼをコードする塩基配列の発現に必要又は有利なすべ
ての構成要素を含む適切な転写及び翻訳調節要素を有す
る発現ベクターの作製に用いるために、同業者に周知の
方法を用いてもよい。２−デオキシリボース５−リン酸
アルドラーゼをコードする配列の翻訳をより効率的に行
えるように、特定の転写開始及び転写終結シグナルを用
いてもよい。

【０１０２】２−デオキシリボース５−リン酸アルドラ
ーゼをコードする単離ＤＮＡ配列は、ポリペプチドの発
現をもたらすような様々な様式で操作できる。発現ベク
ターによっては、前記２−デオキシリボース５−リン酸
アルドラーゼをコードする塩基配列をベクターに挿入す
る前に操作することが望ましい又は必要と思われる。ク
ローニング法を用いて塩基配列を改変するための技法は
当技術分野で公知である。２−デオキシリボース５−リ
ン酸アルドラーゼをコードする配列を含有及び発現させ
るためには、さまざまな宿主／ベクター系を用いること
ができる。

【０１０３】これらには、組み換えバクテリオファー
ジ、プラスミド又はコスミドベクターによる形質転換を
受けた細菌などの微生物、酵母発現ベクターによる形質
転換を受けた酵母、ウイルス発現ベクター若しくは細菌
発現ベクターによる形質転換を受けた植物細胞系、又は
動物細胞が含まれるが、これらに制限されない。２−デ
オキシリボース５−リン酸アルドラーゼの使用目的に応
じて発現ベクターを選択してもよい。例えば、大量の２
−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼが必要な場
合には、導入したＤＮＡ配列の高レベルの発現をもたら
すベクターを用いるとよい。このようなベクターには、
ｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、
ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＰＬ−Ｌａｍｂｄａ、ｐＴ７Ｂｌｕ
ｅＴ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＥＴ−２１ａ−ｄ（＋）
などの大腸菌クローニング及び発現ベクターが含まれる
が、これらに限定されない。

【０１０４】本発明の２−デオキシリボース５−リン酸
アルドラーゼをコードするＤＮＡ配列により形質転換さ
れる宿主細胞は、真核細胞でも原核細胞でもよい。宿主
細胞の選択は大部分、ポリペプチドをコードする遺伝子
及びその由来によって決まると思われる。適した原核宿
主細胞は特に、このタンパク質を高レベルに発現させる
ために用いられる大腸菌などの細菌細胞である。２−デ
オキシリボース５−リン酸アルドラーゼを過剰に発現さ
せるために、高レベルの発現を目的としたプロモーター
を含む形質転換用ベクターを用いてもよい。このような
プロモーターを含む形質転換用ベクターには、ｐＴ７Ｂ
ｌｕｅＴ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＥＴ−２１ａ−ｄ
（＋）が含まれるが、これらに限定されない。

【０１０５】２−デオキシリボース５−リン酸アルドラ
ーゼをコードする塩基配列により形質転換された宿主細
胞は、細胞培養物からのタンパク質の発現及び回収のた
めに適した条件下で培養することが可能である。

【０１０６】組み換え生物は、炭素源としてグルコー
ス、スクロースなどの糖類、エタノール、グリセロール
などのアルコール、窒素源として硫酸アンモニウム、ペ
プトン、アミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、
酵母エキスなど、無機塩類として硫酸マグネシウム、塩
化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸一水素カリウ
ム、リン酸水素二カリウムなど、及び他の栄養源として
麦芽エキス、肉エキスなどを含む栄養培地中で好気的あ
るいは嫌気的に培養することができる。培養は、通常１
〜７日間にわたり、培地ｐＨ３〜９、培養温度１０〜６
０℃で行うことができる。

【０１０７】組み換え細胞によって生産される２−デオ
キシリボース５−リン酸アルドラーゼは、配列及び／又
は用いるベクターに応じて分泌させてもよく、細胞内に
含有させてもよい。従来の手順により、２−デオキシリ
ボース５−リン酸アルドラーゼを単離及び精製するため
の１つの態様は以下のとおりである。（１）遠心処理又はろ過によって液体培地から細胞を回
収する。（２）回収した細胞を、適切なｐＨを有する水、生理食
塩水又は緩衝液で洗浄する。（３）洗浄した細胞を緩衝液中に懸濁し、ホモジナイザ
ー、超音波処理、フレンチプレス又はリゾチーム処理な
どによって破砕して、無細胞抽出液を得る。（４）破砕細胞の無細胞抽出液から２−デオキシリボー
ス５−リン酸アルドラーゼを単離及び精製する。

【０１０８】酵素活性を確認した後に発現された２−デ
オキシリボース５−リン酸アルドラーゼタンパク質を用
いて、精製された酵素に対する抗体を生産させる。この
ようにして調製された抗体は、菌株改善試験、培養条件
の最適化試験などにおいて対応する酵素の発現の特徴を
決定するために用いることができる。

【０１０９】

【実施例】以下、実施例によって本発明をさらに具体的
に説明する。２−デオキシリボース５−リン酸及び２’
−デオキシリボヌクレオシド化合物の分析条件、並びに
菌体の培養、静止菌体の調製方法を次に記載する。

【０１１０】＜２−デオキシリボース５−リン酸の同定
・定量＞［ＴＬＣ条件］ＴＬＣプレート：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ
_２５４（メルク）展開液：ｎ−ブタノール／２−プロパノール/水＝３/１
２/４（v/v/v）検出：エタノール/ｐ-アニスアルデヒド/酢酸/硫酸＝９
０/５/１/５（v/v/v/v）発色：９０〜１００℃ ［システイン・硫酸法］被験サンプルと等容量の０．５
％システイン塩酸塩水溶液を加え、さらに、１０倍容量
の７０％硫酸溶液を加える。生じる青色の発色を４９０
ｎｍの吸光度にて測定する。

【０１１１】＜２’−デオキシリボヌクレオシド化合物
の定量＞［ＨＰＬＣ条件］カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライ
テスク） φ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ溶出液：０．１％リン酸含有の１００ｍＭ過塩素酸ナト
リウム水溶液流速：１ｍｌ／ｍｉｎカラム温度：室温検出：ＵＶ２５４ｎｍ

【０１１２】＜菌株の培養＞クレブシエラ・ニューモニ
エＢ−４４を、０．５％２−デオキシリボース、０．
２％塩化アンモニウム、０．１％リン酸水素二カリウ
ム、０．１％リン酸二水素カリウム、０．０３％硫酸マ
グネシウム・七水塩、０．０１％酵母エキス含む培地
（ｐＨ７．０）中にて２８℃で１０時間好気的に培養し
た。

【０１１３】エシェリヒア・コリ１０Ｂ５［染色体マ
ーカー：ｐｉｔ−１，ｐｓｔ−２，ｇｌｐＤ３，ｇｌｐ
Ｒ２，ｐｈｏＡ８，ｔｏｎＡ２２，ｒｅｌ−１，
Ｔ_２ ^Ｒ］（次の文献に記載の著者から入手可能である。
Ｓｐｒａｇｕｅ，Ｇ．Ｆ．，Ｂｅｌｌ，Ｒ．Ｍ．，Ｃｒ
ｏｎａｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ，１４３，７１−７７）を、１％バクトトリプトン
（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリ
ウムを含む培地（ｐＨ７．０）中にて３７℃で１２時間
好気的に培養した。

【０１１４】エシェリヒア・コリＪＭ１０９［染色体
マーカー：ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔ
ｈｉ−１，ｈｓｄＲ１７（ｒ_ｋ ⁻ｒ_ｋ ^＋），ｅ１４
⁻（ｍｃｒＡ⁻），ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡ１，Δ（ｌ
ａｃ−ｐｒｏＡＢ）／Ｆ［ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡ
Ｂ^＋，ｌａｃＩ^ｑ，ＬａｃＺΔＭ１５］］（宝酒造）を
１％バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エ
キス、１％塩化ナトリウムを含む培地（ｐＨ７．０）中
にて３７℃で１２時間好気的に培養した。

【０１１５】バチルス・コアギュランスＹＧＫ−６０
５４を、０．２％チミジン、０．１％リン酸水素二カリ
ウム、０．５％硫酸アンモニウム、０．０１％塩化マン
ガン・四水塩、０．０８％硫酸マグネシウム・七水塩、
０．２％酵母エキス含む培地（ｐＨ７．０）中にて５０
℃で１０時間好気的に培養した。

【０１１６】その他の細菌類は、０．５％バクトトリプ
トン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．１％グ
ルコース、０．１％リン酸水素二カリウムを含む培地
（ｐＨ７．０）中にて３７℃で１２時間好気的に培養し
た。

【０１１７】その他の酵母類は、１％酵母エキス、２％
ペプトン、２％グルコースを含む培地（ｐＨ７．０）中
にて３７℃で１２時間好気的に培養した。

【０１１８】上記得られた各菌株の培養液を遠心分離し
てそれぞれの静止菌体を得た。

【０１１９】＜静止菌体の膜処理＞静止菌体を膜処理す
る際は、上記得られた静止菌体５ｇを、１％キシレン及
び０．４％ポリオキシエチレンラウリルアミンを含む１
０ｍｌに添加し、３０℃で１０分間インキュベートを行
った後、遠心分離により上清を除去し膜処理静止菌体５
ｇを得た。

【０１２０】実施例１：クレブシエラ・ニューモニエ
Ｂ−４４の２−デオキシリボース５−リン酸アルドラー
ゼ遺伝子のクローニング以下に示した方法は特別に記載のない限り、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ第２版
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８９）
に従って行った。

【０１２１】（１）ゲノムＤＮＡの取得ゲノムＤＮＡの調製は、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｖｏｌ２（Ｈｕｍａ
ｎａＰｒｅｓｓＩｎｃ．１９８４）に準じて行っ
た。すなわち、クレブシエラ・ニューモニエＢ−４４
の菌体約１０ｇを２０ｍｌのＴＥＳバッファー［１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）；１０ｍＭ−Ｎａ
Ｃｌ；１ｍＭ−ＥＤＴＡ］に懸濁する。２００ｍｇのＳ
ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１ｍｌの２％リゾチ
ーム溶液、１ｍｌの０．５Ｍ−ＥＤＴＡを加え、室温で
溶菌するまでゆっくりと撹拌する。等量のフェノール／
クロロホルムを加え、ゆっくりと完全に混合する。２
０，０００ｇ、１５分室温で遠心し、上層を回収する。
これを３回繰り返し、上層と下層の間のタンパク質がほ
とんどなくなるまで行う。回収した水層に１／１０量の
３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えて混合し、さらに２倍量
のエタノールをゆっくりと加えて重層し、界面に現れた
ＤＮＡをガラス棒に巻きとる。ＤＮＡを１５ｍｌのＴＥ
Ｓバッファーに溶解し、ＲＮａｓｅ（リボヌクレアー
ゼ）を５０μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で１時
間インキュベートする。さらにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ
Ｋを５０μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で１時間
インキュベートする。等量のエタノールを加え、上記と
同様に抽出、エタノール沈殿を行う。回収したＤＮＡは
７０％エタノール、続いてエタノールでリンスした後、
真空デシケーターにて乾燥し、ＴＥバッファー［１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）；０．１ｍＭ−Ｅ
ＤＴＡ］に溶解し、ＤＮＡを得た。

【０１２２】（２）ＰＣＲによる部分遺伝子断片の取得エシェリヒア・コリの２−デオキシリボース５−リン酸
アルドラーゼをコードするｄｅｏＣ遺伝子の配列につい
てビブリオ属、アグロバクテリウム属、ストレプトマイ
セス属の２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ
遺伝子と高い相同性を示す領域を検索した。このｄｅｏ
Ｃ遺伝子上の相同領域の配列をもとに、センスプライマ
ー（Ｐｒ．ＴＳ０６：５’−ＧＣＡＣＴＧＡＡＡＴＴＧ
ＡＴＧＧＡＣＣＴ−３’（配列番号６））及びアンチセ
ンスプライマー（Ｐｒ．ＴＳ０７：５’−ＡＣＣＧＧＴ
ＡＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＡ−３’（配列番号
７））を設計した。これらのプライマーを用い、クレブ
シエラ・ニューモニエＢ−４４のゲノムＤＮＡを鋳型
とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの結果増幅された約０．
５ｋｂｐの遺伝子断片をクローニングし塩基配列の解読
を行い、４８３ｂｐヌクレオチドからなる配列番号３に
示す配列を得た。

【０１２３】（３）インバース−ＰＣＲによる２−デオ
キシリボース５−リン酸アルドラーゼ全長遺伝子を含む
遺伝子断片の取得クレブシエラ・ニューモニエＢ−４４のゲノムＤＮＡ
を制限酵素処理し、配列番号３に示す断片をプローブと
してサザンハイブリダイゼーションを行うことにより、
約１．５ｋｂｐのＰｖｕＩＩ断片を選抜した。クレブシ
エラ・ニューモニエＢ−４４のゲノムＤＮＡをＰｖｕ
ＩＩにて断片化し、自己環化させた後、配列番号３に示
す断片の配列に基づき設計したセンスプライマー（Ｐ
ｒ．ＴＳ２５：５’−ＣＡＴＴＧＧＴＧＴＣＡＴＣＧＴ
ＣＡＴ−３’（配列番号８））及びアンチセンスプライ
マー（Ｐｒ．ＴＳ２６：５’−ＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧ
ＡＡＡＧＴＧＡＴＣ−３’（配列番号９））を用い、イ
ンバース−ＰＣＲを行った。ＰＣＲの結果増幅された約
１．３ｋｂｐの遺伝子断片をクローニングし塩基配列の
解読を行い、配列番号１に示す配列を得た。配列番号１
において開始コドンＡＴＧから始まり終始コドンＴＡＡ
で終了する７８０ｂｐヌクレオチドからなる一つのオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号４）を
含むことが判明した。このＯＲＦは配列番号５に示す２
５９アミノ酸からなる分子量２７，５９４の蛋白質をコ
ードしており、その推定アミノ酸配列がエシェリヒア属
（エシェリヒア・コリと９４．６％）、ビブリオ属（ビ
ブリオ・コレラと７８．９％）、アグロバクテリウム属
（アグロバクテリウム・テュメファシエンスと５３．２
％）、ストレプトマイセス属（ストレプトマイセス・コ
エリカラーと４６．５％）の２−デオキシリボース５−
リン酸アルドラーゼ遺伝子と高い相同性を示すことが明
らかになった。なお、ここで配列番号５に示されるアミ
ノ酸配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一
である。

【０１２４】実施例２：大腸菌における２−デオキシリ
ボース５−リン酸アルドラーゼ遺伝子の発現大腸菌発現用ベクターｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｃｈ
ａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）とエシェ
リヒア・コリＪＭ１０９又はエシェリヒア・コリ１
０Ｂ５からなる宿主ベクター系を用いた。クレブシエラ
・ニューモニエＢ−４４の２−デオキシリボース５−リ
ン酸アルドラーゼ遺伝子の開始コドンＡＴＧの前後の配
列に基づき設計したＥｃｏＲＩサイトを持つ合成オリゴ
ヌクレオチド（Ｐｒ．ＴＳ２５：５’−ＣＡＴＴＧＧＴ
ＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴ−３’（配列番号８））をセン
スプライマーに、また、終止コドンＴＡＡの前後の配列
に基づき設計したＥｃｏＲＩサイトを持つ合成オリゴヌ
クレオチド（Ｐｒ．ＴＳ２６：５’−ＡＣＧＴＧＣＴＧ
ＴＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＣ−３’（配列番号９））をア
ンチセンスプライマーとして、クレブシエラ・ニューモ
ニエＢ−４４のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行
った。ＰＣＲの結果増幅された約１．３ｋｂｐの遺伝子
断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターに挿入しサブクロー
ニングし、塩基配列を確認した。このプラスミドをＥｃ
ｏＲＩで処理して得たＤＮＡ断片をｐｋｋ２２３−３の
ＥｃｏＲＩサイトに挿入することで発現ベクター（ｐＴ
Ｓ８）を構築した（図１参照）。ｐＴＳ８をエシェリヒ
ア・コリＪＭ１０９又はエシェリヒア・コリ１０Ｂ
５に形質転換し、形質転換株のエシェリヒア・コリＪＭ
１０９／ｐＴＳ８及びにエシェリヒア・コリ１０Ｂ５
／ｐＴＳ８を得た。本形質転換株は平成１４年２月１５
日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄
託されている［エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＴＳ８（ＦＥＲＭ
ＢＰ−７８９６）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）１０Ｂ５／ｐＴＳ８（ＦＥ
ＲＭＢＰ−７８９５）］。

【０１２５】次に、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／
ｐＴＳ８又はエシェリヒア・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８
を、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド）を含む栄養培地［１％バクトトリプ
トン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、１％塩化ナ
トリウムを含む培地（ｐＨ７．０）］中にて３７℃で１
２時間好気的に培養した。得られた菌体を超音波処理に
より破砕し、遠心分離後、上清を無細胞抽出液として回
収した。

【０１２６】得られた無細胞抽出液について、以下の方
法により２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ
活性を測定した。活性測定用反応液は、１０ｍＭのトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０２５ｍＭのＮＡ
ＤＨ、０．５ｍＭの２−デオキシリボース５−リン酸、
１Ｕアルコール脱水素酵素、適当量の無細胞抽出液から
なる。反応は３７℃にて行い、反応の進行に伴うＮＡＤ
Ｈの減少を３４０ｎｍの吸光度変化としてモニターする
ことにより、定量を行った。親株クレブシエラ・ニュー
モニエＢ−４４、形質転換株のエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９／ｐＴＳ８又はエシェリヒア・コリ１０Ｂ
５／ｐＴＳ８の無細胞抽出液について２−デオキシリボ
ース５−リン酸アルドラーゼ活性を測定した結果を表１
に示す。形質転換株においては、親株の約３倍の活性が
認められ、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラー
ゼの大量発現が確認された。なお、１Ｕは一分間に１μ
ｍｏｌの２−デオキシリボース５−リン酸を分解しうる
酵素量とした。

【０１２７】

【表１】

【０１２８】実施例３：各種糖類とアセトアルデヒドを
原料とする２−デオキシリボース５−リン酸の合成表２で示される各種糖類１００ｍＭと２００ｍＭのアセ
トアルデヒド、２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
９．０）を含む反応液に、クレブシエラ・ニューモニエ
Ｂ−４４、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴＳ
８又はエシェリヒア・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８の静止
菌体（Ｗｅｔ）をそれぞれ１５％添加し、３０℃で２時
間攪拌した。遠心分離により菌体を除去し、ＴＬＣ分析
及びシステイン・硫酸法により生成した２−デオキシリ
ボース５−リン酸を定量した。

【０１２９】本実施例では、人為的にアデノシン５’−
トリリン酸（ＡＴＰ）を添加せず、反応に必要なＡＴＰ
は、微生物に内在するもの、該微生物の解糖系により得
られるものに依存している。

【０１３０】結果を表２に示す。表２において、−は生
成せずを意味する。いずれの菌株においても、糖類がグ
リセルアルデヒド３−リン酸、ジヒドロキシアセトンリ
ン酸、フルクトース１，６−ジリン酸である場合に著量
の２−デオキシリボース５−リン酸の蓄積が認められ
た。また、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴＳ８
においては、フルクトース６−リン酸、グリセロール３
−リン酸から、エシェリヒア・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ
８においては、グルコース、グルコース６−リン酸から
２−デオキシリボース５−リン酸の生成が認められた。

【０１３１】

【表２】

【０１３２】実施例４：アデノシン５’−トリリン酸存
在下での各種糖類、アセトアルデヒドを原料とする２−
デオキシリボース５−リン酸の合成表３で示される各種糖類１００ｍＭ、２００ｍＭのアセ
トアルデヒド、２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
９．０）、１０ｍＭのアデノシン５’−トリリン酸、１
００ｍＭの塩化カリウム、２０ｍＭの硫酸マグネシウム
・七水塩、１％キシレン、０．４％ポリオキシエチレン
ラウリルアミンを含む反応液に、クレブシエラ・ニュー
モニエＢ−４４、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／
ｐＴＳ８又はエシェリヒア・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８
の静止菌体（Ｗｅｔ）をそれぞれ１１．５％添加し、３
０℃で２時間攪拌した。遠心分離により菌体を除去し、
ＴＬＣ分析及びシステイン・硫酸法により生成した２−
デオキシリボース５−リン酸を定量した。

【０１３３】本実施例では、人為的にアデノシン５’−
トリリン酸（ＡＴＰ）を添加した条件下で反応を行って
いるが、微生物に内在するＡＴＰや微生物の解糖系によ
り得られるＡＴＰを微生物が反応に利用することを妨げ
るものではない。以降の実施例においてＡＴＰを人為的
に添加した場合も同様である。

【０１３４】結果を表３に示す。表３において、−は生
成せずを意味する。いずれの菌株においても、糖類がグ
リセルアルデヒド３−リン酸、ジヒドロキシアセトンリ
ン酸、フルクトース１，６−ジリン酸である場合に著量
の２−デオキシリボース５−リン酸の蓄積が認められ
た。また、いずれの菌株においても、グルコース、グル
コース６−リン酸からも良好な２−デオキシリボース５
−リン酸の蓄積が認められた。また、エシェリヒア・コ
リＪＭ１０９／ｐＴＳ８においては、グリセロール、
グリセロール３−リン酸からも２−デオキシリボース５
−リン酸の生成が認められた。

【０１３５】

【表３】

【０１３６】実施例５：アデノシン５’−トリリン酸存
在下（人為的に添加した条件下）でのグルコース、アセ
トアルデヒドを原料とする２−デオキシリボース５−リ
ン酸の合成５００ｍＭのグルコース、３００ｍＭのアセトアルデヒ
ド、１００ｍＭのアデノシン５’−トリリン酸、１００
ｍＭの塩化カリウム、２０ｍＭの硫酸マグネシウム・七
水塩、１％キシレン、０．４％ポリオキシエチレンラウ
リルアミン及びエシェリヒア・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ
８の静止菌体（Ｗｅｔ）を１１．５ｇ添加した反応液１
００ｍｌを、３０℃で反応した。遠心分離により菌体を
除去し、ＴＬＣ分析及びシステイン・硫酸法により２−
デオキシリボース５−リン酸を定量した。反応時間２１
時間で７５．２ｍＭの２−デオキシリボース５−リン酸
の生成を確認した。

【０１３７】実施例６：アデノシン５’−トリリン酸存
在下（人為的に添加した条件下）にてグルコース、アセ
トアルデヒドから合成した２−デオキシリボース５−リ
ン酸と核酸塩基からの２’−デオキシリボリボヌクレオ
シド化合物の合成実施例５で得られた２−デオキシリボース５−リン酸反
応液からＤＯＷＥＸ６６イオン交換カラム、Ｓｉｌｉｃ
ａｇｅｌ６０カラムにより２−デオキシリボース５
−リン酸を分離し、粗の標品を得た。この粗２−デオキ
シリボース５−リン酸水溶液１ｍｌに、トリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ９．０）が１５０ｍＭ、ヒポキサンチンが５
０ｍＭ、アセトアルデヒドが２００ｍＭ、グルコース
１，６−ジリン酸が０．１ｍＭ、塩化マンガン・四水塩
が１ｍＭ、及びバチルス・コアギュランスＹＧＫ−６
０５４の静止菌体（Ｗｅｔ）が１１．５％濃度になるよ
うに添加した。この際、反応開始時の２−デオキシリボ
ース５−リン酸濃度は１２．７ｍＭであった。５５℃で
２時間反応した後、遠心分離により菌体を除去し、ＨＰ
ＬＣ法により２’−デオキシリボヌクレオシド化合物を
定量した。その結果、１．９８ｍＭの２’−デオキシイ
ノシンの生成を確認した（対２−デオキシリボース５−
リン酸収率、１５．６％）。

【０１３８】実施例７：アデノシン５’−トリリン酸存
在下（人為的に添加した条件下）でのグルコース、アセ
トアルデヒド、核酸塩基を原料とする２’−デオキシリ
ボヌクレオシド化合物の合成５００ｍＭのグルコース、２００ｍＭのアセトアルデヒ
ド、１００ｍＭのアデニン、１００ｍＭのアデノシン
５’−トリリン酸、１００ｍＭの塩化カリウム、２０ｍ
Ｍの硫酸マグネシウム・七水塩、１％キシレン、０．４
％ポリオキシエチレンラウリルアミン、エシェリヒア・
コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８の静止菌体（Ｗｅｔ）１１．
５％、バチルス・コアギュランスＹＧＫ−６０５４の
静止菌体（Ｗｅｔ）１１．５％を含む反応液を、３０℃
で１０時間インキュベートし反応を行った。反応後、遠
心分離により菌体を除去し、ＨＰＬＣ法により２’−デ
オキシリボヌクレオシド化合物を定量した。その結果、
０．３６ｍＭの２’−デオキシアデノシンの生成を確認
した。

【０１３９】なお、本実施例において、核酸塩基として
添加したアデニンが、微生物のＡＴＰ再生系によりＡＴ
Ｐに変換され、反応に必要なＡＴＰとして利用されるこ
とも充分考えられる。以下の実施例において核酸塩基と
してアデニンを添加した場合も同様のことが考えられ
る。

【０１４０】実施例８：アデノシン５’−トリリン酸存
在下（人為的に添加した条件下）でのグルコース、アセ
トアルデヒド、核酸塩基を原料とする２’−デオキシリ
ボヌクレオシド化合物の合成５００ｍＭのグルコース、２００ｍＭのアセトアルデヒ
ド、１００ｍＭのアデノシン５’−トリリン酸、１００
ｍＭの塩化カリウム、２０ｍＭの硫酸マグネシウム・七
水塩、１％キシレン、０．４％ポリオキシエチレンラウ
リルアミン、エシェリヒア・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８
の静止菌体（Ｗｅｔ）１１．５％を含む反応液を、３０
℃で５時間インキュベートした後、１００ｍＭアデニン
とバチルス・コアギュランスＹＧＫ−６０５４の静止
菌体（Ｗｅｔ）１１．５％を添加し、５０℃で５時間イ
ンキュベートし反応を行った。反応後、遠心分離により
菌体を除去し、ＨＰＬＣ法により２’−デオキシリボヌ
クレオシド化合物を定量した。その結果、０．５０ｍＭ
の２’−デオキシアデノシンの生成を確認した。

【０１４１】実施例９：微生物の解糖系を利用する、グ
ルコース、アセトアルデヒドを原料とする２−デオキシ
リボース５−リン酸の合成表４で示される各種微生物菌体（Ｗｅｔ）２０％、５０
０ｍＭグルコース、２００ｍＭのアセトアルデヒド、２
００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ
のリン酸水素二カリウム、２０ｍＭの硫酸マグネシウム
・七水塩、０．５％フィチン酸、１％キシレン、０．２
％ポリオキシエチレンラウリルアミンを含む反応液に、
エシェリヒア・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８の静止菌体
（Ｗｅｔ）７．５％を添加し、２８℃で５時間攪拌し
た。遠心分離により菌体を除去し、ＴＬＣ分析及びシス
テイン・硫酸法により生成した２−デオキシリボース５
−リン酸を定量した。

【０１４２】本実施例においては、人為的にアデノシン
５’−トリリン酸（ＡＴＰ）を添加せず、反応に必要な
ＡＴＰは、主として、反応系に添加した表４記載の各微
生物の解糖系により得られるものに依存している。ただ
し、微生物に内在するＡＴＰの利用を妨げるものではな
い。

【０１４３】結果を表４に示す。いずれの菌株において
も、２−デオキシリボース５−リン酸の生成が認めら
れ、これらの菌株の解糖系によりグルコースから供給さ
れたＡＴＰやグリセルアルデヒド３−リン酸が利用さ
れ、２−デオキシリボース５−リン酸に変換されてい
た。

【０１４４】

【表４】

【０１４５】実施例１０：微生物のＡＴＰ再生系を利用
する、グルコース、アセトアルデヒドを原料とする２−
デオキシリボース５−リン酸の合成表５で示される各種微生物菌体（Ｗｅｔ）７．５％、５
５５ｍＭのグルコース、２００ｍＭのアセトアルデヒ
ド、２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５
０ｍＭのリン酸水素二カリウム、２０ｍＭの硫酸マグネ
シウム・七水塩、０．５％フィチン酸、１％キシレン、
０．４％ポリオキシエチレンラウリルアミン、１０．０
％の１０Ｂ５／ｐＴＳ８株の静止菌体（Ｗｅｔ）を含む
反応液に、１０ｍＭのアデノシン５’−トリリン酸（Ａ
ＴＰ）、又はＡＴＰを再生する原料として、１０ｍＭの
アデニン、アデノシン、アデノシン５’−モノリン酸
（ＡＭＰ）若しくはアデノシン５’−ジリン酸（ＡＤ
Ｐ）をそれぞれ添加し、３０℃で５時間攪拌した。遠心
分離により菌体を除去し、ＴＬＣ分析及びシステイン・
硫酸法により生成した２−デオキシリボース５−リン酸
を定量した。

【０１４６】本実施例においては、人為的にアデノシン
５’−トリリン酸（ＡＴＰ）を添加せず、反応に必要な
ＡＴＰは、主として、反応系に添加した表５記載の各微
生物のＡＴＰ再生系により得られるものに依存してい
る。ただし、微生物に内在するＡＴＰや微生物の解糖系
により得られるＡＴＰの利用を妨げるものではない。

【０１４７】結果を表５に示す。表５において、−は生
成せずを意味する。いずれの菌株においても、２−デオ
キシリボース５−リン酸の生成が認められ、これらの菌
株のＡＴＰ再生系により生じたＡＴＰが利用され、２−
デオキシリボース５−リン酸に変換されていた。

【０１４８】

【表５】

【０１４９】実施例１１：パン酵母の解糖系を利用す
る、グルコース、アセトアルデヒドを原料とする２−デ
オキシリボース５−リン酸の合成市販のパン酵母１ｇに、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）０．５ｍｌ、水１．０ｍｌ、トルエン０．５
ｍｌを加え、３７℃にて１時間インキュベート後、遠心
分離によりトルエン処理パン酵母菌体を回収する。この
トルエン処理パン酵母菌体３００ｍｇを、１０００ｍＭ
のグルコース、５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）、１５ｍＭのＡＭＰ、３０ｍＭの硫酸マグネ
シウム・七水塩を含む５ｍｌの反応液に添加し、３７℃
にて１時間インキュベート後、遠心分離により、反応液
上清を回収する。この上清０．２ｍｌに、膜処理したエ
シェリヒア・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８の静止菌体（Ｗ
ｅｔ）２０ｍｇ、アセトアルデヒド３００ｍＭを添加
し、３０℃にて１時間インキュベート後、遠心分離によ
り菌体を除去し、ＴＬＣ分析及びシステイン・硫酸法に
より生成した２−デオキシリボース５−リン酸を定量し
た。その結果、２２８ｍＭの２−デオキシリボース５−
リン酸が生成していた。

【０１５０】なお、本実施例においては、反応に必要な
ＡＴＰは、主として、パン酵母の解糖系により得られる
ものに依存しているが、反応液中に含まれるＡＭＰが、
ＡＴＰ再生系によりＡＴＰに変換され、利用されている
ことも充分考えられる。以降の実施例においても同様の
ことが考えられる。

【０１５１】実施例１２：パン酵母の解糖系を利用し
て、グルコース、アセトアルデヒドから合成した２−デ
オキシリボース５−リン酸と核酸塩基からの２’−デオ
キシリボヌクレオシド化合物の合成実施例１１で得られた２−デオキシリボース５−リン酸
を含む反応液０．１ｍｌに、３００ｍＭのトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ９．０）、１００ｍＭのヒポキサンチン、
４００ｍＭのアセトアルデヒド、０．２ｍＭのグルコー
ス１，６−ジリン酸、２ｍＭの塩化マンガン・四水塩を
含む反応液０．１ｍｌを加え、さらに、バチルス・コア
ギュランスＹＧＫ−６０５４の静止菌体（Ｗｅｔ）を
１１．５％濃度になるように添加した。この反応液を、
５５℃で２時間インキュベートし、遠心分離により菌体
を除去後、ＨＰＬＣ法により２’−デオキシリボヌクレ
オシド化合物を定量した。その結果、２．５ｍＭの２’
−デオキシイノシンの生成を確認した。

【０１５２】実施例１３：パン酵母の解糖系を利用す
る、グルコース、アセトアルデヒドを原料とする２−デ
オキシリボース５−リン酸の合成市販のパン酵母１ｇに、０．５ｍｌの１Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）、水１．０ｍｌ、トルエン０．
５ｍｌを加え、３７℃にて１時間インキュベート後、遠
心分離によりトルエン処理パン酵母菌体を回収する。こ
のトルエン処理パン酵母菌体３００ｍｇを、１１１１ｍ
Ｍのグルコース、５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）、１５ｍＭのＡＭＰ、３０ｍＭの硫酸マ
グネシウム・七水塩を含む５ｍｌの反応液に添加し、３
７℃にて１時間インキュベート後、膜処理したエシェリ
ヒア・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８の静止菌体（Ｗｅｔ）
１ｇ、アセトアルデヒド３００ｍＭを加え、さらに３７
℃にて２時間インキュベートした。その後、遠心分離に
より菌体を除去し、ＴＬＣ分析及びシステイン・硫酸法
により生成した２−デオキシリボース５−リン酸を定量
した。その結果、２５０ｍＭの２−デオキシリボース５
−リン酸が生成していた。

【０１５３】実施例１４：パン酵母の解糖系を利用す
る、グルコース、アセトアルデヒド、核酸塩基を原料と
する２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の合成市販のパン酵母１ｇに、０．５ｍｌの１Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）、水１．０ｍｌ、トルエン０．
５ｍｌを加え、３７℃にて１時間インキュベート後、遠
心分離によりトルエン処理パン酵母菌体を回収する。こ
のトルエン処理パン酵母菌体３００ｍｇを、１１１１ｍ
Ｍのグルコース、５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）、１５ｍＭのＡＭＰ、３０ｍＭの硫酸マ
グネシウム・七水塩、膜処理したエシェリヒア・コリ
１０Ｂ５／ｐＴＳ８の静止菌体（Ｗｅｔ）１ｇ、アセト
アルデヒド３００ｍＭ、５０ｍＭアデニン、０．２ｍＭ
のグルコース１，６−ジリン酸、２ｍＭの塩化マンガン
・四水塩とバチルス・コアギュランスＹＧＫ−６０５
４の静止菌体（Ｗｅｔ）１１．５％を含む５ｍｌの反応
液に添加し、３７℃にて３時間インキュベートした。反
応後、遠心分離により菌体を除去し、ＨＰＬＣ法により
２’−デオキシリボヌクレオシド化合物を定量した。そ
の結果、１．５ｍＭの２’−デオキシアデノシンの生成
を確認した。

【０１５４】実施例１５：パン酵母の解糖系を利用す
る、グルコース、アセトアルデヒド、核酸塩基を原料と
する２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の合成市販のパン酵母１ｇに、０．５ｍｌの１Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）、水１．０ｍｌ、トルエン０．
５ｍｌを加え、３７℃にて１時間インキュベート後、遠
心分離によりトルエン処理パン酵母菌体を回収する。こ
のトルエン処理パン酵母菌体３００ｍｇを、１１１１ｍ
Ｍのグルコース、５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）、１５ｍＭのＡＭＰ、３０ｍＭの硫酸マ
グネシウム・七水塩、膜処理したエシェリヒア・コリ
１０Ｂ５／ｐＴＳ８の静止菌体（Ｗｅｔ）１ｇ、アセト
アルデヒド３００ｍＭを含む５ｍｌの反応液に添加し、
３７℃にて１時間インキュベートした。その後、１００
ｍＭアデニン、０．２ｍＭのグルコース１，６−ジリン
酸、２ｍＭの塩化マンガン・四水塩とバチルス・コアギ
ュランスＹＧＫ−６０５４の静止菌体（Ｗｅｔ）１
１．５％を添加し、５０℃で５時間インキュベートし反
応を行った。反応後、遠心分離により菌体を除去し、Ｈ
ＰＬＣ法により２’−デオキシリボヌクレオシド化合物
を定量した。その結果、２．４ｍＭの２’−デオキシア
デノシンの生成を確認した。

【０１５５】実施例１６：パン酵母の解糖系を利用す
る、グルコース、アセトアルデヒド、核酸塩基を原料と
する２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の合成市販のパン酵母１ｇに、０．５ｍｌの１Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）、水１．０ｍｌ、トルエン０．
５ｍｌを加え、３７℃にて１時間インキュベート後、遠
心分離によりトルエン処理パン酵母菌体を回収する。こ
のトルエン処理パン酵母菌体３００ｍｇを、１０００ｍ
Ｍのグルコース、５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）、１５ｍＭのＡＭＰ、３０ｍＭの硫酸マ
グネシウム・七水塩を含む５ｍｌの反応液に添加し、３
７℃にて１時間インキュベート後、遠心分離により、反
応液上清を回収する。この上清に、膜処理したエシェリ
ヒア・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８の静止菌体（Ｗｅｔ）
１ｇ、アセトアルデヒド３００ｍＭ、１００ｍＭアデニ
ン、０．２ｍＭのグルコース１，６−ジリン酸、２ｍＭ
の塩化マンガン・四水塩とバチルス・コアギュランス
ＹＧＫ−６０５４の静止菌体（Ｗｅｔ）１１．５％を添
加し、３７℃にて３時間インキュベートした。反応後、
遠心分離により菌体を除去し、ＨＰＬＣ法により２’−
デオキシリボヌクレオシド化合物を定量した。その結
果、３．３ｍＭの２’−デオキシアデノシンの生成を確
認した。

【０１５６】

【発明の効果】本発明によれば、微生物由来の酵素によ
る反応をカップリングさせることにより、安価で入手し
やすいグルコース、グリセロールなどの糖類からグリセ
ルアルデヒド３−リン酸を生成させ、次に該グリセルア
ルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドから２−デオキ
シリボース５−リン酸を生成させ、続いて該２−デオキ
シリボース５−リン酸と核酸塩基とから２’−デオキシ
リボヌクレオシド化合物を選択的に製造することができ
る。

【０１５７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> YUKI GOSEI KOGYO CO., LTD. <120> A method of preparing a 2'-deoxyribonucleoside compound and an int ermediate thereof, and a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase gene for use in the method. <130> A000200766 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1258 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> CDS <222> (332)..(1108) <223> 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase gene <400> 1 ttacttattt ttcagtgatt attgcctgtt tttcaatttt tagcacaaaa tgcactcgct 60 gctgtcgagg tgtcctgtgg ttttatgtta ttatattaac attcagttgc gtctgcggat 120 tttgattatg cttaaagtaa acatggcgtt ttgcagcgca atactgcact cgtaaaggtg 180 acttgcgtca cattacagta atgcaaattc tctatgagtt ttcattaact gtgatgaatg 240 tcgaagtgta acggcgaggt gatgttacaa tagtaacaga ctcgcaaggt gaacaaacta 300 ttgaaccggc aataagccgt cggagtgtaa a atg act gat tta tct gca agc 352 Met Thr Asp Leu Ser Ala Ser 1 5 agc ctg cgc gcg ttg aaa ctg atg gac ctg acc acg ctg aat gac gat 400 Ser Leu Arg Ala Leu Lys Leu Met Asp Leu Thr Thr Leu Asn Asp Asp 10 15 20 gac acc aat gaa aag gtg atc gct ctg tgc cat cag gca aaa acg ccg 448 Asp Thr Asn Glu Lys Val Ile Ala Leu Cys His Gln Ala Lys Thr Pro 25 30 35 gta ggg aat aca gcg gct atc tgc atc tat ccg cgc ttt atc ccg atc 496 Val Gly Asn Thr Ala Ala Ile Cys Ile Tyr Pro Arg Phe Ile Pro Ile 40 45 50 55 gcg cgt aaa acg ctg aac gcg caa ggc acc ccg gat atc cgt atc gcc 544 Ala Arg Lys Thr Leu Asn Ala Gln Gly Thr Pro Asp Ile Arg Ile Ala 60 65 70 acg gtc acc aac ttc ccg cat ggt aac gat gat atc gat atc gcg ctg 592 Thr Val Thr Asn Phe Pro His Gly Asn Asp Asp Ile Asp Ile Ala Leu 75 80 85 gcg gaa acc cgt gcg gct atc gct tat ggc gcg gac gaa gtt gac gtg 640 Ala Glu Thr Arg Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Ala Asp Glu Val Asp Val 90 95 100 gta ttc ccg tat cgc gcg ctg atc gcg ggt aac gag cag gtc gga ttc 688 Val Phe Pro Tyr Arg Ala Leu Ile Ala Gly Asn Glu Gln Val Gly Phe 105 110 115 gat ctg gtg aag gcc tgt aaa gag gct tgc gcg gcg gcc aac gtg ctg 736 Asp Leu Val Lys Ala Cys Lys Glu Ala Cys Ala Ala Ala Asn Val Leu 120 125 130 135 ttg aaa gtg atc atc gaa acc ggt gag ctg aaa gaa gaa gcg tta att 784 Leu Lys Val Ile Ile Glu Thr Gly Glu Leu Lys Glu Glu Ala Leu Ile 140 145 150 cgt aaa gct tct gaa att tct att aaa gcc ggg gcg gat ttc atc aaa 832 Arg Lys Ala Ser Glu Ile Ser Ile Lys Ala Gly Ala Asp Phe Ile Lys 155 160 165 acc tct acc ggt aaa gtc ccg gta aac gcg acg ccg gaa agc gca cgt 880 Thr Ser Thr Gly Lys Val Pro Val Asn Ala Thr Pro Glu Ser Ala Arg 170 175 180 atc atg ctg gaa gtg atc cgc gat atg ggc gta cag aaa acc gtt ggc 928 Ile Met Leu Glu Val Ile Arg Asp Met Gly Val Gln Lys Thr Val Gly 185 190 195 ttt aag cct gcg ggc ggc gtc cgc agc gct gaa gat gcg cag cag ttc 976 Phe Lys Pro Ala Gly Gly Val Arg Ser Ala Glu Asp Ala Gln Gln Phe 200 205 210 215 ctg gcc att gcc gat gaa ctg ttc ggt gcc gac tgg gcg gat tct cgc 1024 Leu Ala Ile Ala Asp Glu Leu Phe Gly Ala Asp Trp Ala Asp Ser Arg 220 225 230 cac tat cgt ttc ggc gca tcc agc ctg ctg gca agc ctg ctg aaa gcg 1072 His Tyr Arg Phe Gly Ala Ser Ser Leu Leu Ala Ser Leu Leu Lys Ala 235 240 245 ctg ggg cac ggc gac ggt aag agc gcc agc agc tac taaggcgtca 1118 Leu Gly His Gly Asp Gly Lys Ser Ala Ser Ser Tyr 250 255 cggtgacaaa accgtagccc ggatgaggcg cagctgcggc tggcgaagcg ttacgatctg 1178 ccggtgattc tgcactcccg acgtactcac gataagctgg cgatgctgct gaaaaaacat 1238 gccctgccga gaaccggcgt 1258 <210> 2 <211> 259 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <400> 2 Met Thr Asp Leu Ser Ala Ser Ser Leu Arg Ala Leu Lys Leu Met Asp 1 5 10 15 Leu Thr Thr Leu Asn Asp Asp Asp Thr Asn Glu Lys Val Ile Ala Leu 20 25 30 Cys His Gln Ala Lys Thr Pro Val Gly Asn Thr Ala Ala Ile Cys Ile 35 40 45 Tyr Pro Arg Phe Ile Pro Ile Ala Arg Lys Thr Leu Asn Ala Gln Gly 50 55 60 Thr Pro Asp Ile Arg Ile Ala Thr Val Thr Asn Phe Pro His Gly Asn 65 70 75 80 Asp Asp Ile Asp Ile Ala Leu Ala Glu Thr Arg Ala Ala Ile Ala Tyr 85 90 95 Gly Ala Asp Glu Val Asp Val Val Phe Pro Tyr Arg Ala Leu Ile Ala 100 105 110 Gly Asn Glu Gln Val Gly Phe Asp Leu Val Lys Ala Cys Lys Glu Ala 115 120 125 Cys Ala Ala Ala Asn Val Leu Leu Lys Val Ile Ile Glu Thr Gly Glu 130 135 140 Leu Lys Glu Glu Ala Leu Ile Arg Lys Ala Ser Glu Ile Ser Ile Lys 145 150 155 160 Ala Gly Ala Asp Phe Ile Lys Thr Ser Thr Gly Lys Val Pro Val Asn 165 170 175 Ala Thr Pro Glu Ser Ala Arg Ile Met Leu Glu Val Ile Arg Asp Met 180 185 190 Gly Val Gln Lys Thr Val Gly Phe Lys Pro Ala Gly Gly Val Arg Ser 195 200 205 Ala Glu Asp Ala Gln Gln Phe Leu Ala Ile Ala Asp Glu Leu Phe Gly 210 215 220 Ala Asp Trp Ala Asp Ser Arg His Tyr Arg Phe Gly Ala Ser Ser Leu 225 230 235 240 Leu Ala Ser Leu Leu Lys Ala Leu Gly His Gly Asp Gly Lys Ser Ala 245 250 255 Ser Ser Tyr <210> 3 <211> 483 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 3 gcgttgaaac tgatggacct gaccacgctg aatgacgatg acaccaatga aaaggtgatc 60 gctctgtgcc atcaggcaaa aacgccggta gggaatacag cggctatctg catctatccg 120 cgctttatcc cgatcgcgcg taaaacgctg aacgcgcaag gcaccccgga tatccgtatc 180 gccacggtca ccaacttccc gcatggtaac gatgatatcg atatcgcgct ggcggaaacc 240 cgtgcggcta tcgcttatgg cgcggacgaa gttgacgtgg tattcccgta tcgcgcgctg 300 atcgcgggta acgagcaggt cggattcgat ctggtgaagg cctgtaaaga ggcttgcgcg 360 gcggccaacg tgctgttgaa agtgatcatc gaaaccggtg agctgaaaga agaagcgtta 420 attcgtaaag cttctgaaat ttctattaaa gccggggcgg atttcatcaa aacctctacc 480 ggt 483 <210> 4 <211> 780 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> CDS <222> (1)..(777) <400> 4 atg act gat tta tct gca agc agc ctg cgc gcg ttg aaa ctg atg gac 48 Met Thr Asp Leu Ser Ala Ser Ser Leu Arg Ala Leu Lys Leu Met Asp 1 5 10 15 ctg acc acg ctg aat gac gat gac acc aat gaa aag gtg atc gct ctg 96 Leu Thr Thr Leu Asn Asp Asp Asp Thr Asn Glu Lys Val Ile Ala Leu 20 25 30 tgc cat cag gca aaa acg ccg gta ggg aat aca gcg gct atc tgc atc 144 Cys His Gln Ala Lys Thr Pro Val Gly Asn Thr Ala Ala Ile Cys Ile 35 40 45 tat ccg cgc ttt atc ccg atc gcg cgt aaa acg ctg aac gcg caa ggc 192 Tyr Pro Arg Phe Ile Pro Ile Ala Arg Lys Thr Leu Asn Ala Gln Gly 50 55 60 acc ccg gat atc cgt atc gcc acg gtc acc aac ttc ccg cat ggt aac 240 Thr Pro Asp Ile Arg Ile Ala Thr Val Thr Asn Phe Pro His Gly Asn 65 70 75 80 gat gat atc gat atc gcg ctg gcg gaa acc cgt gcg gct atc gct tat 288 Asp Asp Ile Asp Ile Ala Leu Ala Glu Thr Arg Ala Ala Ile Ala Tyr 85 90 95 ggc gcg gac gaa gtt gac gtg gta ttc ccg tat cgc gcg ctg atc gcg 336 Gly Ala Asp Glu Val Asp Val Val Phe Pro Tyr Arg Ala Leu Ile Ala 100 105 110 ggt aac gag cag gtc gga ttc gat ctg gtg aag gcc tgt aaa gag gct 384 Gly Asn Glu Gln Val Gly Phe Asp Leu Val Lys Ala Cys Lys Glu Ala 115 120 125 tgc gcg gcg gcc aac gtg ctg ttg aaa gtg atc atc gaa acc ggt gag 432 Cys Ala Ala Ala Asn Val Leu Leu Lys Val Ile Ile Glu Thr Gly Glu 130 135 140 ctg aaa gaa gaa gcg tta att cgt aaa gct tct gaa att tct att aaa 480 Leu Lys Glu Glu Ala Leu Ile Arg Lys Ala Ser Glu Ile Ser Ile Lys 145 150 155 160 gcc ggg gcg gat ttc atc aaa acc tct acc ggt aaa gtc ccg gta aac 528 Ala Gly Ala Asp Phe Ile Lys Thr Ser Thr Gly Lys Val Pro Val Asn 165 170 175 gcg acg ccg gaa agc gca cgt atc atg ctg gaa gtg atc cgc gat atg 576 Ala Thr Pro Glu Ser Ala Arg Ile Met Leu Glu Val Ile Arg Asp Met 180 185 190 ggc gta cag aaa acc gtt ggc ttt aag cct gcg ggc ggc gtc cgc agc 624 Gly Val Gln Lys Thr Val Gly Phe Lys Pro Ala Gly Gly Val Arg Ser 195 200 205 gct gaa gat gcg cag cag ttc ctg gcc att gcc gat gaa ctg ttc ggt 672 Ala Glu Asp Ala Gln Gln Phe Leu Ala Ile Ala Asp Glu Leu Phe Gly 210 215 220 gcc gac tgg gcg gat tct cgc cac tat cgt ttc ggc gca tcc agc ctg 720 Ala Asp Trp Ala Asp Ser Arg His Tyr Arg Phe Gly Ala Ser Ser Leu 225 230 235 240 ctg gca agc ctg ctg aaa gcg ctg ggg cac ggc gac ggt aag agc gcc 768 Leu Ala Ser Leu Leu Lys Ala Leu Gly His Gly Asp Gly Lys Ser Ala 245 250 255 agc agc tac taa 780 Ser Ser Tyr <210> 5 <211> 259 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <400> 5 Met Thr Asp Leu Ser Ala Ser Ser Leu Arg Ala Leu Lys Leu Met Asp 1 5 10 15 Leu Thr Thr Leu Asn Asp Asp Asp Thr Asn Glu Lys Val Ile Ala Leu 20 25 30 Cys His Gln Ala Lys Thr Pro Val Gly Asn Thr Ala Ala Ile Cys Ile 35 40 45 Tyr Pro Arg Phe Ile Pro Ile Ala Arg Lys Thr Leu Asn Ala Gln Gly 50 55 60 Thr Pro Asp Ile Arg Ile Ala Thr Val Thr Asn Phe Pro His Gly Asn 65 70 75 80 Asp Asp Ile Asp Ile Ala Leu Ala Glu Thr Arg Ala Ala Ile Ala Tyr 85 90 95 Gly Ala Asp Glu Val Asp Val Val Phe Pro Tyr Arg Ala Leu Ile Ala 100 105 110 Gly Asn Glu Gln Val Gly Phe Asp Leu Val Lys Ala Cys Lys Glu Ala 115 120 125 Cys Ala Ala Ala Asn Val Leu Leu Lys Val Ile Ile Glu Thr Gly Glu 130 135 140 Leu Lys Glu Glu Ala Leu Ile Arg Lys Ala Ser Glu Ile Ser Ile Lys 145 150 155 160 Ala Gly Ala Asp Phe Ile Lys Thr Ser Thr Gly Lys Val Pro Val Asn 165 170 175 Ala Thr Pro Glu Ser Ala Arg Ile Met Leu Glu Val Ile Arg Asp Met 180 185 190 Gly Val Gln Lys Thr Val Gly Phe Lys Pro Ala Gly Gly Val Arg Ser 195 200 205 Ala Glu Asp Ala Gln Gln Phe Leu Ala Ile Ala Asp Glu Leu Phe Gly 210 215 220 Ala Asp Trp Ala Asp Ser Arg His Tyr Arg Phe Gly Ala Ser Ser Leu 225 230 235 240 Leu Ala Ser Leu Leu Lys Ala Leu Gly His Gly Asp Gly Lys Ser Ala 245 250 255 Ser Ser Tyr <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sense primer for PCR <400> 6 gcactgaaat tgatggacct 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an antisense primer for PCR <400> 7 accggtagag gttttgatga a 21 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a sense primer for inverse PCR <400> 8 cattggtgtc atcgtcat 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an antisense primer for invers e PCR <400> 9 acgtgctgtt gaaagtgatc 20

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターｐＴＳ８の構築手順を示す図。

フロントページの続き (72)発明者松本清一郎東京都板橋区坂下３−37−１有機合成薬品工業株式会社東京研究所内 (72)発明者佐々木美江東京都板橋区坂下３−37−１有機合成薬品工業株式会社東京研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA07 BA80 CA04 DA05 DA11 EA04 FA02 GA11 4B050 CC01 CC03 CC08 DD02 DD03 LL05 4B064 AF33 CA02 CA05 CA19 CC24 DA01 DA16

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グルコース、フルクトース、グルコース
６−リン酸、フルクトース６−リン酸、グルコース１，
６−ジリン酸、フルクトース１，６−ジリン酸、グリセ
ロール、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド及
びグリセロール３−リン酸からなる群より選択される糖
類からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成する能力を
有する微生物の菌体、該微生物菌体の処理物又は該微生
物由来の酵素を、アデノシン５’−トリリン酸の存在
下、該糖類に作用させてグリセルアルデヒド３−リン酸
を生成させる工程と、該グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒドと
を、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼを含
有する微生物の菌体、該微生物菌体の処理物又は該微生
物由来の酵素により反応させて、２−デオキシリボース
５−リン酸を生成させる工程とを具備することを特徴と
する２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。
【請求項２】グルコース、フルクトース、グルコース
６−リン酸、フルクトース６−リン酸、グルコース１，
６−ジリン酸、フルクトース１，６−ジリン酸、グリセ
ロール、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド及
びグリセロール３−リン酸からなる群より選択される糖
類からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成する能力を
有する微生物の菌体、該微生物菌体の処理物又は該微生
物由来の酵素を、アデノシン５’−トリリン酸の存在
下、該糖類に作用させてグリセルアルデヒド３−リン酸
を生成させる工程と、該グリセルアルデヒド３−リン酸とアセトアルデヒド
を、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼを含
有する微生物の菌体、該微生物菌体の処理物又は該微生
物由来の酵素により反応させて、２−デオキシリボース
５−リン酸を生成させる工程と、該２−デオキシリボース５−リン酸と核酸塩基を、ホス
ホペントムターゼとヌクレオシドホスホリラーゼを含有
する微生物の菌体、該微生物菌体の処理物又は該微生物
由来の酵素により反応させて、２’−デオキシリボヌク
レオシド化合物を生成させる工程とを具備することを特
徴とする２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製造
方法。
【請求項３】グルコース、フルクトース、グルコース
６−リン酸、フルクトース６−リン酸、グルコース１，
６−ジリン酸、フルクトース１，６−ジリン酸、グリセ
ロール、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド及
びグリセロール３−リン酸からなる群より選択される糖
類からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成する能力を
有する前記微生物が、パン酵母、エシェリヒア属、クレ
ブシエラ属、バチルス属、シュードモナス属、オクロバ
クトラム属、サッカロマイセス属、キャンディダ属、又
はロドトルラ属に属する微生物であり、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼを含有す
る前記微生物が、クレブシエラ属、エンテロバクター
属、エシェリヒア属、又はバチルス属に属する微生物で
あることを特徴とする、請求項１記載の２−デオキシリ
ボース５−リン酸の製造方法。
【請求項４】グルコース、フルクトース、グルコース
６−リン酸、フルクトース６−リン酸、グルコース１，
６−ジリン酸、フルクトース１，６−ジリン酸、グリセ
ロール、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド及
びグリセロール３−リン酸からなる群より選択される糖
類からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成する能力を
有する前記微生物が、パン酵母、エシェリヒア属、クレ
ブシエラ属、バチルス属、シュードモナス属、オクロバ
クトラム属、サッカロマイセス属、キャンディダ属、又
はロドトルラ属に属する微生物であり、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼを含有す
る前記微生物が、クレブシエラ属、エンテロバクター
属、エシェリヒア属、又はバチルス属に属する微生物で
あり、ホスホペントムターゼとヌクレオシドホスホリラーゼを
含有する前記微生物が、クレブシエラ属、エンテロバク
ター属、エシェリヒア属、又はバチルス属に属する微生
物であることを特徴とする、請求項２記載の２’−デオ
キシリボヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項５】グルコース、フルクトース、グルコース
６−リン酸、フルクトース６−リン酸、グルコース１，
６−ジリン酸、フルクトース１，６−ジリン酸、グリセ
ロール、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド及
びグリセロール３−リン酸からなる群より選択される糖
類からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成する能力を
有する前記微生物、及び２−デオキシリボース５−リン
酸アルドラーゼを含有する前記微生物が、エシェリヒア
・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８（ＦＥＲＭＢＰ−７８９
５）、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴＳ８（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−７８９６）又はクレブシエラ・ニューモ
ニエＢ−４４（ＩＦＯ１６５７９）であることを特徴
とする、請求項１又は３記載の２−デオキシリボース５
−リン酸の製造方法。
【請求項６】グルコース、フルクトース、グルコース
６−リン酸、フルクトース６−リン酸、グルコース１，
６−ジリン酸、フルクトース１，６−ジリン酸、グリセ
ロール、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド及
びグリセロール３−リン酸からなる群より選択される糖
類からグリセルアルデヒド３−リン酸を生成する能力を
有する前記微生物、及び２−デオキシリボース５−リン
酸アルドラーゼを含有する前記微生物が、エシェリヒア
・コリ１０Ｂ５／ｐＴＳ８（ＦＥＲＭＢＰ−７８９
５）、エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴＳ８（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−７８９６）又はクレブシエラ・ニューモ
ニエＢ−４４（ＩＦＯ１６５７９）であり、ホスホペントムターゼとヌクレオシドホスホリラーゼを
含有する前記微生物が、バチルス・コアギュランスＹ
ＧＫ−６０５４（ＦＥＲＭＢＰ−７８９８）又はバチ
ルス・スピーシーズＹＧＫ−６００８（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−７８９７）であることを特徴とする、請求項２又は
４記載の２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製造
方法。
【請求項７】前記グリセルアルデヒド３−リン酸を生
成させる工程が、アデニン、アデノシン、アデノシン
５’−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸からな
る群より選択されるアデノシン類からアデノシン５’−
トリリン酸を生成する能力を有する微生物、該微生物菌
体の処理物又は該微生物由来の酵素を該アデノシン類に
作用させて得られるアデノシン５’−トリリン酸の存在
下で行われることを特徴とする、請求項１、３又は５記
載の２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。
【請求項８】前記グリセルアルデヒド３−リン酸を生
成させる工程が、アデニン、アデノシン、アデノシン
５’−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸からな
る群より選択されるアデノシン類からアデノシン５’−
トリリン酸を生成する能力を有する微生物、該微生物菌
体の処理物又は該微生物由来の酵素を該アデノシン類に
作用させて得られるアデノシン５’−トリリン酸の存在
下で行われることを特徴とする、請求項２、４又は６記
載の２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製造方
法。
【請求項９】前記グリセルアルデヒド３−リン酸を生
成させる工程が、微生物の解糖系により得られるアデノ
シン５’−トリリン酸の存在下で行われることを特徴と
する、請求項１、３又は５記載の２−デオキシリボース
５−リン酸の製造方法。
【請求項１０】前記グリセルアルデヒド３−リン酸を
生成させる工程が、微生物の解糖系により得られるアデ
ノシン５’−トリリン酸の存在下で行われることを特徴
とする、請求項２、４又は６記載の２’−デオキシリボ
ヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項１１】アデニン、アデノシン、アデノシン
５’−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸からな
る群より選択されるアデノシン類からアデノシン５’−
トリリン酸を生成する能力を有する前記微生物が、パン
酵母、メタノール資化性酵母、ブレビバクテリウム属、
コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、クレブシエラ
属、バチルス属、シュードモナス属、オクロバクトラム
属、サッカロマイセス属、キャンディダ属、又はロドト
ルラ属に属する微生物であることを特徴とする、請求項
７記載の２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。
【請求項１２】アデニン、アデノシン、アデノシン
５’−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸からな
る群より選択されるアデノシン類からアデノシン５’−
トリリン酸を生成する能力を有する前記微生物が、パン
酵母、メタノール資化性酵母、ブレビバクテリウム属、
コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、クレブシエラ
属、バチルス属、シュードモナス属、オクロバクトラム
属、サッカロマイセス属、キャンディダ属、又はロドト
ルラ属に属する微生物であることを特徴とする、請求項
８記載の２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製造
方法。
【請求項１３】解糖系によりアデノシン５’−トリリ
ン酸を生成する能力を有する前記微生物が、パン酵母、
メタノール資化性酵母、ブレビバクテリウム属、コリネ
バクテリウム属、エシェリヒア属、クレブシエラ属、バ
チルス属、シュードモナス属、オクロバクトラム属、サ
ッカロマイセス属、キャンディダ属、又はロドトルラ属
に属する微生物であることを特徴とする、請求項９記載
の２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。
【請求項１４】解糖系によりアデノシン５’−トリリ
ン酸を生成する能力を有する前記微生物が、パン酵母、
メタノール資化性酵母、ブレビバクテリウム属、コリネ
バクテリウム属、エシェリヒア属、クレブシエラ属、バ
チルス属、シュードモナス属、オクロバクトラム属、サ
ッカロマイセス属、キャンディダ属、又はロドトルラ属
に属する微生物であることを特徴とする、請求項１０記
載の２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製造方
法。
【請求項１５】アデニン、アデノシン、アデノシン
５’−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸からな
る群より選択されるアデノシン類からアデノシン５’−
トリリン酸を生成する能力を有する前記微生物が、パン
酵母又はブレビバクテリウムアンモニアゲネスＡＴ
ＣＣ６８７２であることを特徴とする、請求項７又は
１１記載の２−デオキシリボース５−リン酸の製造方
法。
【請求項１６】アデニン、アデノシン、アデノシン
５’−モノリン酸及びアデノシン５’−ジリン酸からな
る群より選択されるアデノシン類からアデノシン５’−
トリリン酸を生成する能力を有する前記微生物が、パン
酵母又はブレビバクテリウムアンモニアゲネスＡＴ
ＣＣ６８７２であることを特徴とする、請求項８又は
１２記載の２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製
造方法。
【請求項１７】解糖系によりアデノシン５’−トリリ
ン酸を生成する能力を有する前記微生物が、パン酵母又
はブレビバクテリウムアンモニアゲネスＡＴＣＣ６
８７２であることを特徴とする、請求項９又は１３記載
の２−デオキシリボース５−リン酸の製造方法。
【請求項１８】解糖系によりアデノシン５’−トリリ
ン酸を生成する能力を有する前記微生物が、パン酵母又
はブレビバクテリウムアンモニアゲネスＡＴＣＣ６
８７２であることを特徴とする、請求項１０又は１４記
載の２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製造方
法。
【請求項１９】配列番号２で示されるアミノ酸配列か
らなる２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ活
性を有する酵素タンパク質、又は配列番号２で示される
アミノ酸配列において１つ若しくは複数のアミノ酸が欠
失、置換、付加及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列
からなり、かつ２−デオキシリボース５−リン酸アルド
ラーゼ活性を有する酵素タンパク質。
【請求項２０】配列番号４で示される塩基配列を含
み、２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ活性
を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子、又は配列
番号４で示される塩基配列において１つ若しくは複数の
ヌクレオチドが欠失、置換、付加及び/若しくは挿入さ
れた塩基配列を含み、かつ２−デオキシリボース５−リ
ン酸アルドラーゼ活性を有する酵素タンパク質をコード
する遺伝子。
【請求項２１】配列番号２で示されるアミノ酸配列か
らなるタンパク質をコードする遺伝子、又は配列番号２
で示されるアミノ酸配列において１つ若しくは複数のア
ミノ酸が欠失、置換、付加及び/若しくは挿入されたア
ミノ酸配列からなり、かつ２−デオキシリボース５−リ
ン酸アルドラーゼ活性を有する酵素タンパク質をコード
する遺伝子。