JP2001245676A - 変異型酸性フォスファターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造方
法において有用な変異型酸性フォスファターゼ、該変異
型酸性フォスファターゼをコードする遺伝子、該遺伝子
を含む組換えＤＮＡ及び該組換えＤＮＡを保有する微生
物を提供する。 【解決手段】 燐酸エステル加水分解活性が低下し、フ
ォスファターゼ活性を有する変異型酸性フォスファター
ゼを、好ましくはpH3.0〜5.5の条件下でヌクレオシド並
びにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミ
ル燐酸（塩）から成る群より選択される燐酸供与体に作
用させてヌクレオシド−５′−燐酸エステルを生成せし
め、これを採取することによって、安価かつ効率的にヌ
クレオシド−５′−燐酸エステルを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヌクレオシド−
５′−燐酸エステルの製造において有用な、燐酸エステ
ル加水分解活性が低下し、フォスファターゼ活性を有す
る酸性フォスファターゼ、該酸性フォスファターゼをコ
ードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えＤＮＡ、該組換
えＤＮＡを保有する微生物に関する。ヌクレオシド−
５′−燐酸エステルは、調味料、医薬並びにそれらの原
料等として有用である。

【０００２】

【従来の技術】ヌクレオシドを生化学的に燐酸化してヌ
クレオシド−５′−燐酸エステルを製造する方法として
は、燐酸供与体として、パラニトロフェニル燐酸を用い
る方法（特公昭39-29858号）、無機燐酸を用いる方法
（特公昭42−1186号）、ポリ燐酸を用いる方法（特開昭
53-56390号）、アセチル燐酸を用いる方法（特開昭56−
82098号）、アデノシン三燐酸（ＡＴＰ）を用いる方法
（特開昭63−230094号）が知られている。しかしなが
ら、これらの方法にあっては使用する基質が高価であっ
たり、反応副生物が生じたりするために、安価かつ効率
的にヌクレオシド−５′−燐酸エステルの生産を行うに
は満足のいくものではなかった。

【０００３】そこで、本発明者らは、特定の微生物菌体
を、酸性条件下でヌクレオシド並びにポリ燐酸（塩）、
フェニル燐酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）よりなる
群より選択される燐酸供与体に作用させることにより、
２′−、３′−ヌクレオチド異性体の副生を伴うことな
く、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルを効率よく生成
する方法を開発した（特開平7−231793号）。

【０００４】しかしながら、この方法においても、使用
する微生物菌体にわずかながら存在するヌクレオシド分
解活性のために反応中に基質が一部分解され、また、反
応を継続すると生成蓄積したヌクレオシド−５′−燐酸
エステルが分解するため、反応液中に副生物が生成する
とともに、十分な収率が得られなかった。さらに、菌体
あたりの燐酸転移活性が低いため、高濃度の基質を添加
して反応を行えない等の欠点があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヌク
レオシド−５′−燐酸エステルの製造方法において有用
な酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組
換えＤＮＡ及び該組換えＤＮＡを保有する微生物を提供
することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来の方
法よりも効率の良いヌクレオシド−５′−燐酸エステル
の製造方法を開発するために種々の検討を加えた結果、
微生物の無細胞抽出液より精製した酸性フォスファター
ゼをpH3.0〜5.5の条件下でヌクレオシド並びにポリ燐酸
（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカルバミル燐酸（塩）
から成る群より選択される燐酸供与体に作用させること
により、高収率で効率良くヌクレオシド−５′−燐酸エ
ステルを生産することができることを発見した。さら
に、モルガネラ属細菌及びエシェリヒア属細菌より燐酸
エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファ
ターゼをコードする遺伝子を取得することに成功し、遺
伝子工学的手法により該遺伝子を大量発現させることに
よりヌクレオシド−５′−燐酸エステルの生産性が飛躍
的に向上することを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。

【０００７】すなわち、本発明は、燐酸エステル加水分
解活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ、該酸性
フォスファターゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む
組換えＤＮＡ、並びに該組換えＤＮＡを保有する微生物
を提供するものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 ＜１＞本発明の変異型酸性フォスファターゼ 本発明の酸性フォスファターゼは、燐酸エステル加水分
解活性が低下し、フォスファターゼ活性を有する変異型
酸性フォスファターゼである。酸性フォスファターゼ
（EC 3.1.3.2）は、本来、燐酸エステルを酸性条件下で
加水分解する反応を触媒する酵素であり、燐酸転移反応
により生成するヌクレオシド−５′−燐酸エステルを分
解するヌクレオチダーゼ活性（以下、「燐酸エステル加
水分解活性」という）を有している。酸性フォスファタ
ーゼを用いてヌクレオシド−５′−燐酸エステルを製造
する場合には、このような酸性フォスファターゼでも使
用することができるが、高い収率でヌクレオシド−５′
−燐酸エステルを得るためには、野生型の酸性フォスフ
ァターゼに比べて燐酸エステル加水分解活性が低下した
変異型酸性フォスファターゼ（以下、単に「変異型酸性
フォスファターゼ」ともいう）を使用することが望まし
い。

【０００９】本発明の変異型酸性フォスファターゼは、
具体的には、配列表配列番号４、１１、１８、２０、２
２又は２４に示されるアミノ酸配列、又はこれらのいず
れかのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ
酸の置換、欠失、挿入又は転移を含むアミノ酸配列を有
し、かつ、配列番号４に示されるアミノ酸配列において
７２番目のグリシン残基及び／又は１５１番目のイソロ
イシン残基の他のアミノ酸残基への置換に相当するアミ
ノ酸の置換を有し、燐酸エステル加水分解活性が低下
し、フォスファターゼ活性を有する変異型酸性フォスフ
ァターゼである。

【００１０】上記のような変異型酸性フォスファターゼ
は、後述するように、酸性フォスファターゼをコードす
る遺伝子を直接変異させることによって得られる変異型
遺伝子を発現させることによって得られるが、酸性フォ
スファターゼを産生する微生物を、紫外線照射またはN
−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）
等の通常人工突然変異に用いられている変異剤により処
理し、燐酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性
フォスファターゼを産生するようになった変異株を培養
することによっても、変異型酸性フォスファターゼを得
ることができる。

【００１１】上記のような変異株から変異型酸性フォス
ファターゼ活性を有する蛋白質を得るには、同微生物を
適当な培地で培養し、増殖した菌体を回収し、当該菌体
を破砕して無細胞抽出液を調製して、これより必要に応
じ精製すればよい。

【００１２】変異株を培養する培地には格別の制限はな
く、通常の炭素源、窒素源、無機イオン及び必要ならば
有機栄養源を含む通常の培地でよい。炭素源としては、
グルコース、シュクロース等の糖類、グリセロール等の
アルコール類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源
としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウ
ム塩その他が用いられる。無機イオンとしては、マグネ
シウムイオン、燐酸イオン、カリウムイオン、鉄イオ
ン、マンガンイオンその他が必要に応じ適宜使用され
る。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等、又は
これらを含有する酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コ
ーンスティープリカー、カゼイン分解物、大豆加水分解
物等が適宜用いられる。

【００１３】培養条件にも格別の制限はなく、例えば、
好気的条件下にてpH５〜８及び温度25〜40℃の範囲内で
pH及び温度を適当に制御しつつ12〜48時間程度培養を行
なえばよい。

【００１４】増殖した菌体は、遠心分離等により培養液
から回収することができる。回収した菌体から無細胞抽
出液を調製するには、通常の方法が用いられる。すなわ
ち、菌体を超音波処理、ダイノミル、フレンチプレス等
の方法にて破砕し、遠心分離により菌体残渣を除去する
ことにより無細胞抽出液が得られる。

【００１５】無細胞抽出液から変異型酸性フォスファタ
ーゼを精製するには、硫安分画、イオン交換クロマトグ
ラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラまフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等
電点沈殿等、酵素の精製に通常用いられる手法が適宜組
み合わせて用いられる。精製は、完全精製である必要は
必ずしもなく、基質のヌクレオシドの分解に関与する酵
素等の夾雑物が除去できればよい。

【００１６】＜２＞変異型遺伝子を用いた酸性フォスフ
ァターゼの製造法 本発明の変異型酸性フォスファターゼは、野生型酸性フ
ォスファターゼをコードする遺伝子に、同遺伝子がコー
ドする変異型酸性フォスファターゼの燐酸エステル加水
分解活性が低下するような変異が導入された変異型酸性
フォスファターーゼ遺伝子を作製し、同変異型遺伝子を
適当な宿主を用いて発現させることによって製造するこ
とができる。また、変異型酸性フォスファターゼを産生
する変異株から取得した変異型酸性フォスファターゼ遺
伝子を適当な宿主を用いて発現させることによっても、
製造することができる。

【００１７】以下、野生型酸性フォスファターゼ遺伝
子、及び変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を取得する
方法を例示する。

【００１８】（１）酸性フォスファターゼ遺伝子の取得 酸性フォスファターゼ活性を有する蛋白質をコードする
構造遺伝子を含むＤＮＡ断片は、当該酵素活性を有する
微生物等の細胞からクローニングすることができる。

【００１９】酸性フォスファターゼ活性を有する細菌と
しては、モルガネラ属、エシェリヒア属、プロビデンシ
ア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属又はセラチ
ア属に属する細菌が挙げられる。より具体的には以下の
ような菌株を挙げることができる。

【００２０】 モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii） NCIMB 10466 モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii） IFO 3168 モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii） IFO 3848 エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae） JCM 1650 エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae） ATCC 33429 エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae） ATCC 33430 プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii） ATCC 29851 プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii） ATCC 33672 エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes） IFO 12010 エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes） IFO 13534 クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella planticola） IFO 14939 クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella planticola） IAM 1133 セラチア・フィカリア（Serratia ficaria） IAM 13540 セラチア・ マルセセンス（Serratia marcescens） IAM 12143

【００２１】クローニング方法としては、例えば、酵素
活性を指標として染色体遺伝子発現ライブラリーを探索
する方法、当該蛋白質に対する抗体を作成して染色体遺
伝子発現ライブラリーを探索する方法、精製された蛋白
質のＮ末端等のアミノ酸配列を解析し、これを基にプロ
ーブを作成し遺伝子ライブラリーを探索する方法等があ
る。

【００２２】具体的には、上記のモルガネラ・モルガ
ニ、エシェリヒア・ブラッタエ、プロビデンシア・スチ
ュアルティ、エンテロバクター・アエロゲネス、クレブ
シエラ・プランティコラ、セラチア・フィカリア、又は
セラチア・ マルセセンスの酸性フォスファターゼをコ
ードする遺伝子は、それぞれの微生物の染色体遺伝子発
現ライブラリーを作成し、フォスファターゼ活性を指標
として該ライブラリーを探索することによりクローニン
グできる。

【００２３】すなわち、まず、上記細菌より染色体ＤＮ
Ａを調製し、これを適当な制限酵素で部分分解した後、
エシェリヒア・コリで自律複製できるベクターに連結
し、得られた組換えＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ
を形質転換することにより染色体遺伝子発現ライブラリ
ーが作成できる。染色体ＤＮＡを切断する際に、切断反
応時間等を調節して切断の程度を調整すれば、幅広い種
類の制限酵素が使用できる。また、遺伝子のクローニン
グに使用するベクターとしては、エシェリヒア・コリで
自律複製できるベクターであればいかなるものでも構わ
ない。例えば、pUC19、pUC118、pHSG298、pBR322、pBlu
escriptII等が用いられる。

【００２４】ベクターと、酸性フォスファターゼをコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片を連結して組換え体ＤＮ
Ａを調製するには、染色体ＤＮＡを切断するときに用い
る制限酵素と同じもの、又は染色体ＤＮＡ断片の切断面
に相補する切断面を生じる制限酵素を用いてあらかじめ
ベクターを切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを
用いてＤＮＡ断片との連結を行えばよい。作成した組換
えＤＮＡの受容菌としては、ベクターの複製に好適なも
のであればいずれの菌株でもよく、例えばHB101、JM10
9、DH5等のエシェリヒア・コリ菌株が用いられる。

【００２５】かくして得られる形質転換体を寒天培地上
に生育させコロニーを形成させた後、培地表面にｐ−ニ
トロフェニル燐酸を含む反応液を注ぎ反応を行うと、フ
ォスファターゼ活性を発現した株は、ｐ−ニトロフェノ
ールを遊離して黄色を示す。前記反応を酸性条件下で行
い、呈色を指標として形質転換体を選択することによ
り、目的の酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を
含むＤＮＡ断片を保有する形質転換体を選択することが
できる。

【００２６】次いで、選択された形質転換体より組換え
ＤＮＡを回収し、ベクターに連結されている酸性フォス
ファターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の構造
を解析する。酸性フォスファターゼをコードする遺伝子
の塩基配列は、モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466由来
の遺伝子の場合、配列表配列番号２に、エシェリヒア・
ブラッタエ JCM 1650由来の遺伝子の場合、配列表配列
番号９に、プロビデンシア・スチュアルティ ATCC 2985
1由来の遺伝子の場合、配列表配列番号１７に、エンテ
ロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来の遺伝子の場
合、配列表配列番号１９に、クレブシエラ・プランティ
コラ IFO 14939由来の遺伝子の場合、配列表配列番号２
１に、セラチア・フィカリア IAM 13540由来の遺伝子の
場合、配列表配列番号２３にそれぞれ示される。

【００２７】上記遺伝子によりコードされると推定され
る酸性フォスファターゼのアミノ酸配列を、配列表配列
番号４、１１、１８、２０、２２及び２４に示す。上記
の遺伝子によってコードされる酸性フォスファターゼ
は、本発明に好適に使用することができる。さらに、上
記遺伝子によってコードされる酸性フォスファターゼの
アミノ酸配列のいずれかと実質的に相同であるアミノ酸
配列を有する酸性フォスファターゼも、本発明に好適に
使用することができる。「実質的に相同」とは、酸性フ
ォスファターゼのアミノ酸配列が、ヌクレオシド−５′
−燐酸エステル生成活性（以下、「燐酸転移活性」とい
う）を失わないような１又は２以上のアミノ酸残基の置
換、欠失、挿入又は転移を含んでいてもよいことを意味
する。

【００２８】（２）変異型酸性フォスファターゼをコー
ドする遺伝子の取得 上記で得られる野生型酸性フォスファターゼは、燐酸エ
ステル加水分解活性を有するため、ヌクレオシド−５′
−燐酸エステルの製造においては、反応時間の経過とと
もに生産物の分解を伴い、反応収率を低下させる要因と
なることがある。このような場合、燐酸エステル加水分
解活性が低下するように酸性フォスファターゼをコード
する遺伝子に人為的に変異を起こさせればよい。

【００２９】ＤＮＡの目的部位に目的の変異を起こす部
位特異的変異法としては、ＰＣＲを用いる方法（Higuch
i, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds.,
Stockton press (1989)）；Carter, P., Meth. in Enzy
mol., 154, 382 (1987)）、ファージを用いる方法（Kr
amer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154,
350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymo
l., 154, 367 (1987)）などがある。

【００３０】燐酸エステル加水分解活性が低下した変異
型酸性フォスファターゼの例としては、配列表配列番号
４、１１、１８、２０、２２又は２４に示されるアミノ
酸配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を含み、か
つ、野生型酸性フォスファターゼの燐酸エステル加水分
解活性を低下させる変異を有する変異型酸性フォスファ
ターゼが挙げられる。具体的には、モルガネラ・モルガ
ニ NCIMB 10466由来の酵素の場合、配列表配列番号４に
示されるアミノ酸配列において７２番目のグリシン残基
及び／又は１５１番目のイソロイシン残基が他のアミノ
酸残基に置換したものが挙げられる。後述の実施例で
は、７２番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に、
１５１番目のイソロイシン残基をスレオニン残基に置換
した変異型酸性フォスファターゼ遺伝子取得の例を示し
た。また、エシェリヒア・ブラッタエJCM 1650由来の酵
素の場合、配列表配列番号１１に示されるアミノ酸配列
において７４番目のグリシン残基及び／又は１５３番目
のイソロイシン残基が他のアミノ酸残基に置換したもの
が挙げられる。後述の実施例では、７４番目のグリシン
残基をアスパラギン酸残基に、１５３番目のイソロイシ
ン残基をスレオニン残基に置換した変異型酸性フォスフ
ァターゼ遺伝子取得の例を示した。

【００３１】従って、これらの変異型酸性フォスファタ
ーゼをコードするように、上記の部位特異的変異法によ
り、野生型遺伝子の特定の部位において塩基の置換を行
えばよい。なお、燐酸エステル加水分解活性を低下させ
る変異は、野生型酸性フォスファターゼと比較してヌク
レオシド−５′−燐酸エステルの生成活性の実質的な低
下を伴わない変異であることが望ましく、ヌクレオシド
−５′−燐酸エステルの生成活性が低下する場合であっ
ても、燐酸エステル加水分解活性の方が低下の程度が大
きく、その結果、燐酸エステル加水分解活性／ヌクレオ
シド−５′−燐酸生成活性の比が野生型酸性フォスファ
ターゼより低くなるような変異であればよい。燐酸エス
テル加水分解活性の低下の程度としては、野生型酵素の
約40％以下程度まで活性が低下すればよい。

【００３２】後述の実施例のように、エシェリヒア・ブ
ラッタエ JCM 1650の酸性フォスファターゼのアミノ酸
配列は、モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466の酸性フォ
スファターゼと高い相同性を有しており、配列番号４に
示されるアミノ酸配列において７２番目のグリシン残基
及び１５１番目のイソロイシン残基は、それぞれ配列番
号１１に示されるアミノ酸配列における７４番目のグリ
シン残基及び１５３番目のイソロイシン残基に相当す
る。また、エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650以外に
も、プロビデンシア・スチュアルティ ATCC 29851、エ
ンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010、クレブシエ
ラ・プランティコラ IFO 14939及びセラチア・フィカリ
ア IAM 13540等の微生物に由来する酸性フォスファター
ゼのアミノ酸配列も、モルガネラ・モルガニ NCIMB 104
66の酸性フォスファターゼと相同性が高く、それぞれ配
列番号４に示されるアミノ酸配列において７２番目のグ
リシン残基及び１５１番目のイソロイシン残基に相当す
るアミノ酸残基を有しており、同様にして変異型酸性フ
ォスファターゼ遺伝子を得ることができる。配列番号４
に示されるアミノ酸配列における７２番目のグリシン残
基及び１５１番目のイソロイシン残基に相当するアミノ
酸残基は、プロビデンシア・スチュアルティ ATCC 2985
1、エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010及びク
レブシエラ・プランティコラ IFO 14939由来の酸性フォ
スファターゼでは、配列表配列番号１８、２０又は２２
に示すアミノ酸配列において、９２番目のグリシン残基
及び１７１番目のイソロイシン残基であり、セラチア・
フィカリア IAM 13540由来の酸性フォスファターゼで
は、配列表配列番号２４に示すアミノ酸配列において、
８８番目のグリシン残基及び１６７番目のイソロイシン
残基である。

【００３３】（３）変異型酸性フォスファターゼ遺伝子
の宿主への導入 上記のようにして得られる変異型酸性フォスファターゼ
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当なベクタ
ーに再度組換えて宿主細胞に導入させることにより、変
異型酸性フォスファターゼを発現した組換え菌を得るこ
とができる。

【００３４】宿主としては、上記したHB101、JM109、DH
5等のエシェリヒア・コリ菌株が挙げられるが、これ以
外にも、構築した組換えＤＮＡの複製起点と酸性フォス
ファターゼ遺伝子が機能し、組換えＤＮＡが複製可能で
かつ酸性フォスファターゼ遺伝子の発現が可能な細菌な
らば、すべて宿主として利用できる。最も好ましい宿主
の１つはエシェリヒア・コリ JM109である。

【００３５】変異型酸性フォスファターゼをコードする
遺伝子を組み込むベクターとしては、宿主において複製
可能なものであれば特に制限はない。宿主としてエシェ
リヒア・コリを用いる場合には当該細菌で自律複製でき
るプラスミドを挙げることができる。例えば、ColE1系
プラスミド、p15A系プラスミド、Ｒ因子系プラスミド、
ファージ系プラスミド等を用いることができる。具体的
に例示すれば、pBR322（Gene, 2, 95 （1977））、pUC1
9（Gene, 33, 103（1985））、pUC119（Methods in Enz
ymology, 153, 3（1987））、pACYC184（Ｊ. Bacterio
l, 134, 1141（1978））、pSC101（Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 70, 3240（1973））等が挙げられる。

【００３６】酸性フォスファターゼをコードする遺伝子
を含むＤＮＡ断片が、宿主で機能可能なプロモーターを
含んでいる場合には、そのままベクターに連結すればよ
い。前記ＤＮＡ断片がプロモーターを含まない場合に
は、前記遺伝子の上流に、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の宿
主微生物内で働く他のプロモーターを連結すればよい。
前記ＤＮＡ断片がプロモーターを含んでいる場合であっ
ても、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を効率
的に発現させるために、他のプロモーターと置換しても
よい。

【００３７】変異型酸性フォスファターゼをコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターとを連結させてなる
組換えＤＮＡを宿主に導入する方法としては特に制限は
なく、通常の方法により行うことができる。宿主として
エシェリヒア・コリを用いる場合には、塩化カルシウム
法（J. Mol. Biol., 53, 159（1970）） 、Hanahan法
（J. Mol. Biol.,166,557（1983））、ＳＥＭ法（Gene,
96,23（1990））、Chungらの方法（Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 86,2172（1989））、電気穿孔法（Nuclei
c Acids Res., 16, 6127（1988））などの方法を用いる
ことができる。

【００３８】また、上記のように、変異型酸性フォスフ
ァターゼ遺伝子を自律複製可能なベクターＤＮＡに挿入
したものを宿主に導入し、染色体外ＤＮＡとして宿主に
保持させてもよいが、変異型酸性フォスファターゼ遺伝
子を、トランスダクション、トランスポゾン（Biotechn
ol., 1, 417 (1983)）、Ｍｕファージ（特開平2-10998
5）または相同組換え（Experiments in Molecular Gene
tics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)）を用いた方法
で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。

【００３９】（４）組換え菌による変異型酸性フォスフ
ァターゼ遺伝子の発現 上記のようにして得られる変異型酸性フォスファターゼ
をコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡを導入した形質
転換体は、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要なら
ば有機栄養源を含む適当な培地で培養することにより、
変異型酸性フォスファターゼを菌体内に発現することが
できる。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グ
リセロール等のアルコール類、有機酸その他が適宜使用
される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオン
としては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリウム
イオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応
じ適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、ア
ミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、
肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、
大豆加水分解物、その他が適宜用いられる。また、培地
にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド）等の、プロモーターに応じた発現誘導剤を添加
することにより、変異型酸性フォスファターゼ活性の発
現量が上昇する場合がある。

【００４０】培養条件にも格別の制限はなく、例えば、
好気的条件下にてpH５〜８及び温度25〜40℃の範囲内で
pH及び温度を適当に制御しつつ12〜48時間程度培養を行
なえばよい。

【００４１】次いで、培養物から菌体を回収し、破砕に
より無細胞抽出液を取得し、これから変異型酸性フォス
ファターゼを精製することができる。精製には上記＜１
＞に述べたような酵素の精製に通常用いられる手法が適
宜組み合わせて用いられる。精製は完全精製である必要
は必ずしもなく、基質のヌクレオシドの分解に関与する
酵素等の夾雑物が除去できればよい。

【００４２】＜３＞変異型酸性フォスファターゼを用い
たヌクレオシド−５′−燐酸エステルの製造 上記＜１＞で取得した変異型酸性フォスファターゼ又は
上記＜２＞に示したような遺伝子工学的手法により遺伝
子を大量発現させて得られる変異型酸性フォスファター
ゼを用いて、ヌクレオシド及び燐酸供与体からヌクレオ
シド−５′−燐酸エステルを製造することができる。好
ましくは、変異型酸性フォスファターゼを、ヌクレオシ
ド並びにポリ燐酸（塩）、フェニル燐酸（塩）及びカル
バミル燐酸（塩）よりなる群より選択された燐酸供与体
に接触反応させる。この際、高い生産性を得るには、反
応液のpHを3.0〜5.5の範囲の弱酸性に調製することが好
ましい。

【００４３】また、遺伝子工学的手法により変異型酸性
フォスファターゼをコードする遺伝子を大量発現させた
場合には、精製した酸変異型性フォスファターゼに替え
て、形質転換体の菌体を含む培養物、該培養物から分離
・回収した菌体、該菌体を固定化処理、アセトン処理、
凍結乾燥処理等した菌体処理物を使用することによって
も、安価かつ効率的にヌクレオシド−５′−燐酸エステ
ルを生成することができる。

【００４４】使用するヌクレオシドとしては、プリンヌ
クレオシド類として、イノシン、グアノシン、アデノシ
ン、キサントシン、プリンリボシド、６−メトキシプリ
ンリボシド、２，６−ジアミノプリンリボシド、６−フ
ルオロプリンリボシド、６−チオプリンリボシド、２−
アミノ−６−チオプリンリボシド、メルカプトグアノシ
ン等、ピリミジンヌクレオシド類として、ウリジン、シ
チジン、５−アミノウリジン、５−ヒドロキシウリジ
ン、５−ブロモウリジン、６−アザウリジン等が挙げら
れる。反応によりこれらの天然型ヌクレオシド及び非天
然型ヌクレオシドの５′位が特異的に燐酸化され、それ
ぞれ対応するヌクレオシド−５′−燐酸エステルが生成
する。

【００４５】反応液に添加するヌクレオシドの濃度は１
〜20g/dlが望ましい。水に難溶性のヌクレオシドを使用
する場合には、硼酸あるいはジメチルスルホキシドのよ
うな界面活性剤を添加すると反応収率が向上する場合が
ある。

【００４６】燐酸供与体として用いられるポリ燐酸
（塩）としては、ピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐
酸、テトラメタ燐酸、ヘキサメタ燐酸もしくはそれらの
混合物、又はそれらのナトリウム塩、カリウム塩もしく
はそれらの塩混合物などが、フェニル燐酸（塩）として
は、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリウ
ム、Ｏ，Ｏ−ジフェニル燐酸無水物もしくはそれらの混
合物などが、カルバミル燐酸（塩）としては、カルバミ
ル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウム、カル
バミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジリチウム
もしくはそれらの混合物などが使用可能である。燐酸供
与体の使用濃度は、燐酸受容体であるヌクレオシドの濃
度によって決定される。通常、ヌクレオシドの１〜５倍
量が望ましい。

【００４７】反応は通常、温度20〜60℃、好ましくは30
〜40℃で、pH3.5〜6.5、好ましくはpH4.0〜5.0の弱酸性
側が好結果を与える。反応には静置又は撹はんのいずれ
の方法も採用し得る。反応時間は、使用する酵素の活
性、基質濃度などの条件によって異なるが、１〜100時
間である。

【００４８】このようにして生成したヌクレオシド−
５′−燐酸エステルを反応終了混合物より採取分離する
には、合成吸着樹脂を用いる方法や沈殿剤を用いる方
法、その他通常の採取分離方法が採用できる。

【００４９】

【実施例】以下、実施例にて本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

【００５０】燐酸転移活性の測定は、イノシンを基質と
して次の条件で行った。イノシン40μmol/ml、ピロ燐酸
ナトリウム100μmol/ml、酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.
0）100μmol/ml及び酵素を含む反応液（1ml）でpH5.0、
30℃で10分反応を行った。2Ｎ塩酸200μlを添加して反
応を停止した後、遠心分離により沈澱を除き、燐酸転移
反応により生成した５′−イノシン酸を定量した。この
標準反応条件にて1分間に1μmolの５′−イノシン酸を
生成する酵素量を１unitと定めた。

【００５１】また、燐酸エステル加水分解活性の測定
は、５′−イノシン酸を基質として次の条件で行った。
５′−イノシン酸10μmol/ml、メス／NaOH緩衝液（pH6.
0）100μmol/ml及び酵素を含む反応液（１ml）で30℃で
10分反応を行った。２Ｎ塩酸200μlを添加して反応を停
止した後、遠心分離により沈澱を除き、加水分解反応に
より生成したイノシンを定量した。この標準反応条件に
て1分間に1μmolのイノシンを生成する酵素量を１unit
と定めた。

【００５２】なお、イノシン及び５′−イノシン酸は、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、下記
の条件にて分析した。

【００５３】カラム：Cosmosil 5Ｃ18-AR （4.6×150m
m）〔ナカライテスク社製品〕 移動相：5mM 燐酸カリウムバッファー（pH 2.8）／メタ
ノール ＝ 95／5 流速：1.0ml/min 温度：室温 検出：ＵＶ245nm

【００５４】また、イノシン以外のヌクレオシドを原料
とするヌクレオシド−５′−燐酸エステルの生成反応に
おいても、原料のヌクレオシド及び生成したヌクレオシ
ド−５′−燐酸エステルは、上記と同様にＨＰＬＣによ
り分析した。

【００５５】

【参考例１】モルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスフ
ァターゼの精製と性質 ペプトン１g/dl、酵母エキス0.5g/dl及び食塩１g/dlを
含有する栄養培地（pH7.0）50mlを500ml坂口フラスコに
入れ、120℃にて20分間加熱殺菌した。これに、斜面培
養したモルガネラ・モルガニ NCIMB 10466を一白金耳接
種し、30℃で16時間振盪培養した。培養液から遠心分離
により回収した菌体約3,000gを１Ｌの100mM燐酸カリウ
ムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分間超音波
処理を行い菌体を破砕した。処理液を遠心分離して不溶
性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。

【００５６】この無細胞抽出液に30％飽和となるように
硫酸アンモニウムを添加した。遠心分離により生成した
沈澱を除去した後、上清液に60％飽和となるように硫酸
アンモニウムを追加添加した。生成した沈澱を遠心分離
で集め、100mM燐酸カリウムバッファーに溶解した。

【００５７】この粗酵素液を100mM燐酸カリウムバッフ
ァー（pH7.0）５Ｌに対し４回透析した後、20mM燐酸カ
リウムバッファー（pH7.0）で平衡化したDEAE-トヨパー
ル 650Mカラム（φ4.1×22cm）にチャージし、800mlの2
0mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）で洗浄した。燐酸
転移活性は、素通り画分にあったので、当該画分を回収
した。

【００５８】この活性画分に、35％飽和となるように硫
酸アンモニウムを添加し、35％硫安飽和の20mM燐酸カリ
ウムバッファー（pH7.0）で平衡化したブチルトヨパー
ルカラム（φ3.1×26cm）に吸着させた。35％飽和から2
0％飽和燐酸カリウムバッファー（pH7.0）の直線的な濃
度勾配で溶出した。

【００５９】活性画分を集め、50mM燐酸カリウムバッフ
ァー（pH7.0）１Ｌに対し透析した後、50mM燐酸カリウ
ムバッファー（pH7.0）で平衡化したヒドロキシアパタ
イトカラム（φ5×6.5cm）に吸着させた。50mMから300m
M燐酸カリウムバッファー（pH7.0）の直線的な濃度勾配
で溶出した。

【００６０】活性画分を集め、限外ろ過により濃縮し
た。この酵素液をHiLoadＴＭ 16/60 Superdex200カラム
（ファルマシア社製品）に注入し、100mM食塩を含む50m
M燐酸カリウムバッファー(pH7.0)、流速1.0ml/分にて溶
出した。

【００６１】以上の操作によって、燐酸転移活性を示す
酵素を無細胞抽出液より最終的に約10％の回収率で約55
0倍に精製した。この精製過程における比活性及び回収
率を表１に示す。この酵素標品は、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動において均一であった。

【００６２】

【表１】 精製された酵素は次の性質を有していた。

【００６３】（１）作用：ポリ燐酸等の燐酸供与体より
ヌクレオシドに燐酸を転移し、ヌクレオシド−５′−燐
酸エステルを生成する。逆に燐酸エステルを加水分解す
る作用も示す。

【００６４】（２）基質特異性：燐酸転移反応において
はピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ
燐酸、ヘキサメタ燐酸、フェニル燐酸ジナトリウム、フ
ェニル燐酸ジカリウム、Ｏ，Ｏ−ジフェニル酸無水物、
カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウ
ム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジ
リチウムなどが燐酸供与体となる。また、燐酸受容体と
してはプリンリボシド、イノシン、グアノシン、アデノ
シン、キサントシン、ウリジン、シチジン等が燐酸受容
体となる。一方、燐酸エステル加水分解反応において
は、ピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメ
タ燐酸、ヘキサメタ燐酸等の無機燐酸、また、フェニル
燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリウム、Ｏ，Ｏ−
ジフェニル燐酸無水物、カルバミル燐酸ジナトリウム、
カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル燐酸ジアンモニ
ウム、カルバミル燐酸ジリチウム等の燐酸エステル、さ
らに、５′−プリンリボチド、５′−イノシン酸、５′
−グアニル酸、５′−アデニル酸、５′−キサンチル
酸、５′−ウリジル酸、５′−シチジル酸等の５′−ヌ
クレオチドが作用を受ける。

【００６５】（３）至適pH：5.2（燐酸転移反応）、6.5
（燐酸エステル加水分解反応） （４）pH安定性：pH3.0〜12.0（30℃、60分処理） （５）至適温度：35℃付近 （６）温度安定性：30℃まで安定（pH7.0、30分処理） （７）金属イオン及び阻害剤の影響：本酵素活性は金属
イオン添加による活性化現象は見られず、Ag²⁺、Pb²⁺、
Hg²⁺及びCu²⁺によって阻害される。また、ヨード酢酸に
よって阻害される。 （８）分子量：高速液体クロマトグラフィー（TSKgel G
-3000SW、東ソー社製品)により約190,000と算出され
る。 （９）サブユニット分子量：SDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により約25,000と算出される。

【００６６】本酵素はヌクレオシドへの燐酸転移活性だ
けでなく、逆に燐酸エステルを加水分解する活性も示
し、しかも燐酸エステル分解活性のほうが燐酸転移活性
に比べて20倍以上高い活性を示した。また、その他の性
質もモルガネラ属の菌が産生する既知の酸性フォスファ
ターゼとよく一致することから（Microbiology, 140, 1
341-1350 (1994)）、本酵素は酸性フォスファターゼで
あることが明らかとなった。

【００６７】ピロ燐酸ナトリウム10g/dl及びイノシン２
g/dlをpH5.5、5.0、4.5、4.0、3.5の各pHの酢酸ナトリ
ウムバッファーに溶解し、これに上記の酵素標品を50un
its/dlとなるように添加した。各pHを維持しながら30℃
で６時間反応を行い、経時的に生成した５′−イノシン
酸の量を測定した。なお、生成したイノシン酸は、５′
−イノシン酸のみで、２′−イノシン酸及び３′−イノ
シン酸の副生は全く認められなかった。結果を図１に示
す。５′−イノシン酸の生成速度はpH5.0の時に最大と
なったが、５′−イノシン酸の最大蓄積量はpHがより低
い方が高くなった。５′−イノシン酸の生産にはpH4.0
の反応条件が最も効率がよく、３時間の反応で2.60g/dl
の５′−イノシン酸が生成蓄積した。

【００６８】

【参考例２】モルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスフ
ァターゼ標品による種々のヌクレオシドの燐酸化反応 ピロ燐酸ナトリウム10g/dl及び燐酸受容体としてイノシ
ン、グアノシン、ウリジン又はシチジンを２g/dlを酢酸
ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに参考
例１の酵素標品を50units/dlとなるように添加し、pHを
4.0に維持しながら、30℃で３時間反応させた。反応に
より生成したヌクレオシド−５′−エステルの量を表２
に示す。

【００６９】なお、生成したヌクレオチドはヌクレオシ
ド−５′−エステルのみでヌクレオシド−２′−エステ
ル及びヌクレオシド−３′−エステルの副生は全く認め
られなかった。

【００７０】

【表２】

【００７１】

【参考例３】モルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスフ
ァターゼ標品による種々の燐酸化合物を燐酸供与体とす
る５′−イノシン酸の生産 イノシン２g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナト
リウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポリゴンＰ、千
代田化学（株）製品）、フェニル燐酸ジナトリウム又は
カルバミル燐酸ジナトリウム10g/dlを酢酸ナトリウムバ
ッファー（pH4.0）に溶解し、これに参考例１で調製し
た酵素標品を50units/dlとなるように添加し、pHを4.0
に維持しながら30℃で３時間反応させた。反応により生
成した５′−イノシン酸の量を表３に示す。

【００７２】いずれの燐酸供与体を用いた場合にも効率
よく５′−イノシン酸が生成蓄積したが、ポリ燐酸ナト
リウムを燐酸供与体として用いた場合に最も５′−イノ
シン酸の蓄積量が高かった。

【００７３】

【表３】

【００７４】

【参考例４】エシェリヒア・ブラッタエ由来の酸性フォ
スファターゼの精製と性質 ペプトン１g/dl、酵母エキス0.5g/dl及び食塩１g/dlを
含有する栄養培地（pH7.0）50mlを500ml坂口フラスコに
入れ、120℃にて20分間加熱殺菌した。これに、斜面培
養したエシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650を一白金耳
接種し、30℃で16時間振盪培養した。培養液から遠心分
離により菌体を回収した。この菌体約3,300gを１Ｌの10
0mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で
20分間超音波処理を行い菌体を破砕した。処理液を遠心
分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。

【００７５】この無細胞抽出液に30％飽和となるように
硫酸アンモニウムを添加した。遠心分離により生成した
沈澱を除去した後、上清液に60％飽和となるように硫酸
アンモニウムを追加添加した。生成した沈澱を遠心分離
により回収し、100mM燐酸カリウムバッファーに溶解し
た。

【００７６】この粗酵素液を100mM燐酸カリウムバッフ
ァー（pH7.0）５Ｌに対し４回透析した後、20mM燐酸カ
リウムバッファー（pH7.0）で平衡化したDEAE-トヨパー
ル650Mカラム（φ6.2×35cm）にチャージし、20mM燐酸
カリウムバッファー（pH7.0）で洗浄した。燐酸転移活
性は素通り画分にあったので、当該画分を回収した。

【００７７】この活性画分に35％飽和となるように硫酸
アンモニウムを添加し、これを35％飽和硫酸アンモニウ
ムを含む20mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）で平衡
化したブチルトヨパールカラム（φ5.0×22.5cm）に吸
着させた。これを35％飽和から20％飽和燐酸カリウムバ
ッファー（pH7.0）の直線的な濃度勾配で溶出した。

【００７８】活性画分を集め、100mM燐酸カリウムバッ
ファー（pH7.0）１Ｌに対し透析した後、100mM燐酸カリ
ウムバッファー（pH7.0）で平衡化したヒドロキシアパ
タイトカラム（φ3.0×7.0cm）に吸着させた。これを50
mMから100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.0）の直線的
な濃度勾配で溶出し、活性画分を集めた。

【００７９】この酵素液を10mM燐酸カリウムバッファー
（pH6.0）１Ｌに対し透析した後、10mM燐酸カリウムバ
ッファー（pH6.0）で平衡化したCM-Toyopearlカラム
（φ2.0×14.0cm）に吸着させた。これを0mMから300mM
塩化カリウムを含む燐酸カリウムバッファー（pH6.0）
の直線的な濃度勾配で溶出した。この活性画分を集め
た。

【００８０】以上の操作によって、燐酸転移活性を示す
酵素を無細胞抽出液より最終的に約16％の回収率で約60
0倍に精製した。この精製過程における比活性及び回収
率を表４に示す。この酵素標品は、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動において均一であった。

【００８１】

【表４】

【００８２】精製された酵素は次の性質を有していた。 （１）作用：ポリ燐酸等の燐酸供与体よりヌクレオシド
に燐酸を転移し、ヌクレオシド−５′−燐酸エステルを
生成する。逆に燐酸エステルを加水分解する作用も示
す。

【００８３】（２）基質特異性：燐酸転移反応において
はピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメタ
燐酸、ヘキサメタ燐酸、フェニル燐酸ジナトリウム、フ
ェニル燐酸ジカリウム、Ｏ，Ｏ−ジフェニル燐酸無水
物、カルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカ
リウム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐
酸ジリチウムなどが燐酸供与体となる。また燐酸受容体
としてはプリンリボシド、イノシン、グアノシン、アデ
ノシン、キサントシン、ウリジン、シチジン等が燐酸受
容体となる。一方、燐酸エステル加水分解反応において
は、ピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリメタ燐酸、テトラメ
タ燐酸、ヘキサメタ燐酸等の無機燐酸、また、フェニル
燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジカリウム、Ｏ，Ｏ−
ジフェニル燐酸無水物、カルバミル燐酸ジナトリウム、
カルバミル燐酸ジカリウム、カルバミル燐酸ジアンモニ
ウム、カルバミル燐酸ジリチウム等の燐酸エステル、そ
して５′−プリンリボチド、５′−イノシン酸、５′−
グアニル酸、５′−アデニル酸、５′−キサンチル酸、
５′−ウリジル酸、５′−シチジル酸等の５′−ヌクレ
オチドが作用を受ける。

【００８４】（３）至適pH：5.2（燐酸転移反応）、6.5
（燐酸エステル加水分解反応） （４）pH安定性：pH3.5〜12.0（30℃、60分処理） （５）至適温度：35℃付近 （６）温度安定性：40℃まで安定（pH7.0、30分処理） （７）金属イオン及び阻害剤の影響：本酵素活性は金属
イオン添加による活性化現象は見られず、Fe²⁺、Ag²⁺、
Pb²⁺、Hg²⁺及びCu²⁺によって阻害される。また、ヨード
酢酸によって阻害される。 （８）分子量：高速液体クロマトグラフィー（TSKgel G
-3000SW、東ソー社製品)により約188,000と算出され
る。 （９）サブユニット分子量：SDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により約24,500と算出される。

【００８５】本酵素もモルガネラ・モルガニ NCIMB 104
66の無細胞抽出液より精製した酵素と同様にヌクレオシ
ドへの燐酸転移活性だけでなく、逆に燐酸エステルを加
水分解する活性も示した。しかも燐酸エステル分解活性
のほうが燐酸転移活性に比べて30倍以上高い活性を示す
ことから、酸性フォスファターゼであることが明らかと
なった。

【００８６】ピロ燐酸ナトリウム15g/dl及びイノシン３
g/dlをpH5.5、5.0、4.5、4.0、3.5の各pHの酢酸ナトリ
ウムバッファーに溶解し、これに上記の酵素標品を50un
its/dlとなるように添加した。各pHを維持しながら30℃
で６時間反応を行い、経時的に生成した５′−イノシン
酸の量を測定した。なお、生成したイノシン酸は５′−
イノシン酸のみで、２′−イノシン酸及び３′−イノシ
ン酸の副生は全く認められなかった。結果を図２に示
す。５′−イノシン酸の生成速度はpH5.0の時に最大と
なったが、５′−イノシン酸の最大蓄積量はpHがより低
い範囲の方が高く、５′−イノシン酸の生産はpH4.0の
反応条件が最も効率的であった。30℃、pH4.0の反応で
は３時間で1.56g/dlの５′−イノシン酸が生成蓄積し
た。

【００８７】

【参考例５】エシェリヒア・ブラッタエ由来の酸性フォ
スファターゼ標品による種々のヌクレオシドの燐酸化反
応 ピロ燐酸ナトリウム15g/dl及びイノシン、グアノシン、
ウリジン又はシチジンを３g/dlを酢酸ナトリウムバッフ
ァー（pH4.0）に溶解し、これに参考例４の酵素標品を5
0units/dlとなるように添加し、pHを4.0に維持しなが
ら、35℃で３時間反応させた。生成したヌクレオシド−
５′−エステルの量を表５に示す。

【００８８】なお、生成したヌクレオチドはヌクレオシ
ド−５′−エステルのみでヌクレオシド−２′−エステ
ル及びヌクレオシド−３′−エステルの副生は全く認め
られなかった。

【００８９】

【表５】

【００９０】

【参考例６】エシェリヒア・ブラッタエ由来の酸性フォ
スファターゼ標品による種々の燐酸化合物を燐酸供与体
とする５′−イノシン酸の生産 イノシン２g/dl及び燐酸供与体としてトリポリ燐酸ナト
リウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポリゴンＰ、千
代田化学（株）製品）、フェニル燐酸ジナトリウム又は
カルバミル燐酸ジナトリウム10g/dlを酢酸ナトリウムバ
ッファー（pH4.0）に溶解し、これに参考例４で調製し
た酵素標品を上記の酵素標品を50units/dlとなるように
添加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で３時間反応さ
せた。生成した５′−イノシン酸の量を表６に示す。

【００９１】いずれの燐酸供与体を用いた場合にも効率
よく５′−イノシン酸が生成蓄積したが、ポリ燐酸ナト
リウムを燐酸供与体として用いた場合に最も５′−イノ
シン酸の蓄積量が高かった。

【００９２】

【表６】

【００９３】

【実施例１】モルガネラ・モルガニ染色体からの酸性フ
ォスファターゼをコードする遺伝子の単離 （１）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466の無細胞抽出液から
参考例１記載の方法に従い精製した酸性フォスファター
ゼをＤＩＴＣメンブレン（Milligen/Biosearch社製）に
吸着させ、Prosequencer 6625（Milligen/Biosearch社
製）を用いてＮ末端のアミノ酸配列を決定した。配列表
配列番号１に示した20残基のＮ末端アミノ酸配列が決定
された。

【００９４】（２）酸性フォスファターゼをコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離 モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466の培養菌体からMurr
ay and Thomsonの方法（Nucl. Acid Res., 4321, 8 (19
80)）に従い、染色体ＤＮＡを調製した。これを制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した後、ショ糖密度勾配遠心
分離により３〜６kbpのＤＮＡ断片を分画した。プラス
ミドベクターpUC118（宝酒造社製）を制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで切断し、部分分解した染色体ＤＮＡ断片と連結させ
た。ＤＮＡの連結はＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造社製）を用い、指定された方法にて行った。次いで、
得られたＤＮＡ混合物を用いて常法によりエシェリヒア
・コリ JM109（宝酒造社製）を形質転換した。形質転換
体をアンピシリン100μg/mlを含むＬ寒天培地上にプレ
ーティングして生育させ、遺伝子ライブラリーを作成し
た。

【００９５】形質転換体の生育した寒天培地の表面に４
mM ｐ−ニトロフェニル燐酸及び100mM メス／ＮａＯＨ
バッファー（pH6.5）を含む反応液を注ぎ、30℃で15分
間保温した。フォスファターゼ活性を発現した菌は、ｐ
−ニトロフェノールを遊離して黄色を示すため、これを
指標として形質転換体を選択した。約20,000株の形質転
換体の遺伝子発現ライブラリーを探索した結果、フォス
ファターゼ活性を発現した形質転換体30株が得られた。

【００９６】フォスファターゼ活性を発現した30株の形
質転換体を単コロニー分離し、アンピシリン100μg/ml
を含むＬ培地2.5mlに接種し、37℃で16時間培養した。
培養液より集菌した菌体にイノシン２g/dl及びピロ燐酸
ナトリウム10g/dlを含む100mM酢酸ナトリウムバッファ
ー（pH5.0）50μlを添加し、30℃で16時間反応を行っ
た。ＨＰＬＣ分析にて５′−イノシン酸の生成を検出
し、燐酸転移活性を持つ菌株を選択した。その結果、燐
酸転移活性を示し、目的の酸性フォスファターゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片を保有すると予想される形質転換体５
株を得ることができた。

【００９７】

【実施例２】モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466由来の
酸性フォスファターゼ遺伝子の塩基配列の決定 実施例１で得られたモルガネラ・モルガニ NCIMB10466
由来酸性フォスファターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を保
有すると予想される形質転換体の１株より、アルカリ溶
菌法（Molecular Cloning 2nd edition（J. Sambrook,
E. F. Fritschand T. Maniatis, Cold Spring Harbour
Laboratoty Press, p1.25（1989））によりプラスミド
を調製し、挿入されたＤＮＡ断片の解析を行った。な
お、このプラスミドをpMPI501と命名した。決定した挿
入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図３に示す。

【００９８】さらにサブクローニングにより、酸性フォ
スファターゼ遺伝子領域を限定した結果、制限酵素Ｈｉ
ｎｄIIIと制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出される1.2Kbpの
大きさの断片中に本酸性フォスファターゼ遺伝子が含ま
れることが示唆された。そこで塩基配列の決定のため
に、この1.2kbpの断片をＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩで
切断したpUC118に結合したプラスミドＤＮＡを構築し
た。pMPI505と命名したこのプラスミドＤＮＡを用いて
常法によりエシェリヒア・コリ JM109（宝酒造（社）
製）を形質転換し、これを100μg/mlのアンピシリンを
含むＬ寒天培地上にプレーテイングし、形質転換体を得
た。

【００９９】pMPI505を保有するエシェリヒア・コリ JM
109（宝酒造製）の形質転換体よりアルカリ溶菌法によ
りプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行った。塩基
配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequen
cing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用い、サ
ンガーらの方法（J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)）に
従って行った。決定したオープン・リーデイング・フレ
ームの塩基配列を配列表配列番号２に示した。また、こ
の塩基配列より推定される蛋白質のアミノ酸配列を配列
表配列番号３に示した。このアミノ酸配列中に精製酵素
のＮ末端アミノ酸配列と完全に一致する配列が存在し
た。精製酵素のＮ末端は配列番号３に示される配列の21
番目のアラニン残基から開始していたため、配列番号３
に示されるアミノ酸配列は前駆体蛋白質の配列であり、
１番目のメチオニン残基から20番目のアラニン残基まで
のペプチドは翻訳後に除去されるものと考えられた。こ
れより推定される成熟蛋白質のアミノ酸配列を配列表配
列番号４に示した。アミノ酸配列から予想される成熟蛋
白質の分子量は24.9キロダルトンと算出され、精製酵素
のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とよく一致した。以上の結果
及び本断片を含むプラスミドを有する形質転換体が燐酸
転移活性を示すことから本オープン・リーデイング・フ
レームは目的の酸性フォスファターゼをコードする領域
であると同定した。

【０１００】塩基配列、アミノ酸配列各々について既知
の配列との相同性比較を行った。用いたデーターベース
はＥＭＢＬ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結
果、配列表配列番号２に示される塩基配列は、既知のモ
ルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスファターゼ遺伝子
（Thaller, M. C. et. al. Microbiology , 140, 1341
(1994)）では、54番目のＧがＡ、72番目のＧがＡ、276
番目のＴがＧ、378番目のＴがＣ、420番目のＧがＴ、52
5番目のＣがＧ、529番目のＣがＴ、531番目のＧがＡで
ある以外は配列が一致し、また、配列表配列番号４に示
されるアミノ酸配列は、モルガネラ・モルガニ由来の酸
性フォスファターゼと同一であることが判明した。すな
わち、配列表配列番号４に示されるアミノ酸配列からな
る蛋白質をコードする遺伝子が、モルガネラ・モルガニ
NCIMB 10466の酸性フォスファターゼ遺伝子である。

【０１０１】なお、前駆体蛋白質は249個のアミノ酸か
ら成り、その配列から予想される蛋白質の分子量は27.0
キロダルトンであった。また、pMPI505をエシェリヒア
・コリ JM 109に保持させた株は、AJ13143と命名され、
平成８年２月23日付で工業技術院生命工学工業技術研究
所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１
番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託され、受託
番号FERM BP-5422が付与されている。

【０１０２】

【比較例１】モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466由来の
酸性フォスファターゼ遺伝子の発現による活性の増幅 実施例２にて構築したエシェリヒア・コリ JM109／pMPI
505をアンピシリン100μg/ml及びＩＰＴＧ１mMを含むＬ
培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。該培養液か
ら遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄し
た。菌体を５mlの100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.
0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い破砕し
た。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽
出液を調製した。

【０１０３】得られた無細胞抽出液の燐酸転移活性を、
プラスミドpUC118で同様に形質転換したエシェリヒア・
コリ JM109及びモルガネラ・モルガニ野生株より調製し
た無細胞抽出液の活性を対照として測定した結果を表７
に示した。エシェリヒア・コリ JM109／pUC118では燐酸
転移活性は検出されず、モルガネラ・モルガニ野生株で
も燐酸転移活性は低かった。一方、エシェリヒア・コリ
JM109／pMPI505はモルガネラ・モルガニ野生株に比べ
て比活性で150倍と高い燐酸転移活性を示しており、こ
の結果から導入したＤＮＡ断片がエシェリヒア・コリに
おいて酸性フォスファターゼを高発現していることが示
された。

【０１０４】

【表７】

【０１０５】

【比較例２】モルガネラ・モルガニ NCIMB 10466由来の
酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンか
ら５′−イノシン酸の生産 ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及びイノシン６g/dlを100mM
酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに
上記のエシェリヒア・コリ JM109／pMPI505の菌体を乾
燥菌体重量で100ｍg/dlとなるように添加し、pHを4.0に
維持しながら、30℃で６時間反応を行い、経時的に生成
した５′−イノシン酸の量を測定した。なお、生成した
イノシン酸は５′−イノシン酸のみで２′−イノシン酸
及び３′−イノシン酸の副生は全く認められなかった。
結果を図４に示す。酸性フォスファターゼ遺伝子保持株
は著量の酸性フォスファターゼを発現し、本菌を用いた
ピロ燐酸とイノシンからの５′−イノシン酸生産反応に
おいては、非常に効率よく短時間で５′−イノシン酸が
生成蓄積した。しかし、反応時間をのばすと生成蓄積し
た５′−イノシン酸の分解による減少が認められた。

【０１０６】

【実施例３】燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォ
スファターゼ遺伝子の作成 比較例１及び２に示したように酸性フォスファターゼ遺
伝子保持株は著量の酸性フォスファターゼを発現し、本
菌を用いたピロ燐酸とイノシンからの５′−イノシン酸
生産反応においては、非常に効率よく短時間で５′−イ
ノシン酸が生成蓄積する。しかし、生成した５′−イノ
シン酸が酸性フォスファターゼ自体が有する燐酸エステ
ル加水分解活性によって分解を受けるために５′−イノ
シン酸の蓄積量がある程度以上は上がらないことが判明
した。そこで実施例１にてクローニングしたモルガネラ
・モルガニ NCIMB 10466由来酸性フォスファターゼ遺伝
子にＰＣＲを用いる部位特異的変異法により変異を導入
し、酵素の改質を行った。

【０１０７】ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステ
ム社製モデル394）を用いてホスホアミダイト法にて配
列表配列番号５、６及び７に示す配列を有するオリゴヌ
クレオチドMUT500、MUT510及びMUT520をそれぞれ合成し
た鋳型として実施例２で調製したプラスミドpMPI505 １
ng、プライマーとしてＭ13プライマーＲＶ（宝酒造社
製）とMUT510オリゴヌクレオチド各2.5μmol及びタック
ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットをdAT
P、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム 50mM及び
塩化マグネシウム 1.5mMを含む100mM トリスー塩酸緩衝
液（pH8.3）100μlに添加し、94℃を30秒、55℃を２
分、72℃を３分のサイクルを25回繰り返すＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応はサーマルサイクラーPJ2000型（宝
酒造社製）を用いて行った。また別に、鋳型としてプラ
スミドＤＮＡ pMPI505 １ng、プライマーとしてＭ13プ
ライマーＭ4（宝酒造社製）とMUT500オリゴヌクレオチ
ド各2.5μmolを用いて同様にＰＣＲ反応を行った。それ
ぞれの反応液をマイクロスピンカラムS-400（ファルマ
シア社製）を用いてゲル濾過により精製し、プライマー
を除去した。

【０１０８】それぞれのＰＣＲ反応液１μlをdATP、dCT
P、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム 50mM及び塩化マ
グネシウム 1.5mMを含む100mM トリスー塩酸緩衝液（pH
8.3）95μlに添加し、94℃で10分加熱後、60分間かけて
37℃まで冷却した後、37℃で15分保温しヘテロ二本鎖を
形成させた。これにタックＤＮＡポリメラーゼ2.5ユニ
ットを添加して72℃で３分反応を行い、ヘテロ二本鎖を
完成させた。次に、この反応液にＭ13プライマーＲＶ及
びＭ13プライマーＭ4各2.5μmolを添加して、94℃を30
秒、55℃を２分、72℃を３分のサイクルを10回繰り返す
ＰＣＲ反応を行った。

【０１０９】２回目のＰＣＲ反応の生成物をＨｉｎｄII
IとＥｃｏＲＩで切断後フェノール／クロロホルム抽出
し、エタノール沈殿した。このＤＮＡ断片をＨｉｎｄII
I及びＥｃｏＲＩで切断したpUC118に結合し、得られた
プラスミドＤＮＡを用いて常法によりエシェリヒア・コ
リ JM109（宝酒造製）を形質転換した。これを100μg/m
lのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にプレーテイング
し、形質転換体を得た。 形質転換体よりアルカリ溶菌
法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行い、
目的の塩基が置換されていることを確認した。塩基配列
の決定はTaq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing K
it（アプライドバイオケミカル社製）を用い、サンガー
らの方法（J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)）に従って
行った。このようにして成熟蛋白質の72番目のグリシン
残基（GGT）がアスパラギン酸残基（G*AT）に置換した
変異型フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作
成した。この変異型遺伝子を含むプラスミドをpMPI510
と命名した。

【０１１０】また、鋳型としてpMPI505、プライマーと
してMUT500とMUT520オリゴヌクレオチドを用いて同様の
操作により、成熟蛋白質の151番目のイソロイシン残基
（ATC）がスレオニン残基（A^*CC）に置換した変異型フ
ォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作成した。
この変異型遺伝子を含むプラスミドをpMPI520と命名し
た。さらに鋳型としてpMPI510、プライマーとしてMUT50
0とMUT520オリゴヌクレオチドを用いて同様の操作によ
り、成熟蛋白質の72番目のグリシン残基（GGT）がアス
パラギン酸残基（G^*AT）に、151番目のイソロイシン残
基（ATC）がスレオニン残基（A^*CC）に置換した変異型
フォスファターゼをコードする変異型遺伝子を作成し
た。この変異型遺伝子を含むプラスミドをpMPI530と命
名した。

【０１１１】それぞれの変異型酸性フォスファターゼ遺
伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ J
M109／pMPI510、エシェリヒア・コリ JM109／pMPI520、
エシェリヒア・コリ JM109／pMPI530及び野生型酸性フ
ォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシ
ェリヒア・コリ JM109／pMPI505をアンピシリン100μg/
ml及びＩＰＴＧ１mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で
16時間培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集
め、生理食塩水で１回洗浄した。菌体を５mlの100mM燐
酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分
間超音波処理を行い菌体を破砕した。処理液を遠心分離
して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。得ら
れた無細胞抽出液の燐酸エステル加水分解活性及び燐酸
転移活性をpH4.0にて測定し、野生株のものと比較し
た。

【０１１２】野生型および変異型酸性フォスファターゼ
の燐酸エステル加水分解活性及び燐酸転移活性を測定し
た結果を表８に示す。変異型酸性フォスファターゼは、
野生型酸性フォスファターゼと比較して、燐酸エステル
加水分解活性と燐酸転移活性がいずれも低下していた
が、燐酸エステル加水分解活性の方が低下の程度が大き
く、その結果、変異型酸性フォスファターゼの燐酸エス
テル加水分解活性／燐酸転移活性の比は野生型酸性フォ
スファターゼに比べて低くなっていた。

【０１１３】

【表８】

【０１１４】

【実施例４】燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォ
スファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−
イノシン酸の生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを
導入したエシェリヒア・コリ JM109／pMPI510、エシェ
リヒア・コリ JM109／pMPI520、エシェリヒア・コリ JM
109／pMPI530及び野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を
含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109／
pMPI505をアンピシリン100μg/ml及びＩＰＴＧ１mMを含
むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。

【０１１５】ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及びイノシン6g
/dlを100mM酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解
し、これに上記の培養で得たエシェリヒア・コリ各菌株
の菌体を乾燥菌体重量で100ｍg/dlとなるように添加
し、pHを4.0に維持しながら、30℃で22時間反応を行
い、経時的に生成した５′−イノシン酸の量を測定し
た。結果を図５に示す。

【０１１６】図５中、縦軸は５′−イノシン酸の濃度
（mg/dl）を、横軸は反応時間（ｈ）を、また黒埋め円
形はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pM
PI505、黒埋め三角形はエシェリヒア・コリ（Escherich
ia coli）JM109/pMPI510、白抜き円形はエシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）JM109/pMPI520、白抜き四角
形はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pM
PI530の各菌体を使用した場合の反応の推移を示す。

【０１１７】燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォ
スファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−
イノシン酸の生産反応においては生成した５′−イノシ
ン酸の分解速度が低下しており、その結果として ５′
−イノシン酸の収率及び蓄積量が向上した。72番目のグ
リシン残基及び151番目のイソロイシン残基がそれぞれ
アスパラギン酸残基及びスレオニン残基へと置換された
変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株エシェリヒア
・コリ JM109／pMPI530が最も高い５′−イノシン酸の
蓄積を示した。

【０１１８】

【実施例５】燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォ
スファターゼ遺伝子保持株を用いた各種ヌクレオシド−
５′−燐酸エステルの生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを
導入したエシェリヒア・コリ JM109／pMPI530をアンピ
シリン100μg/ml及びＩＰＴＧ1mMを含むＬ培地50mlに接
種し、37℃で16時間培養した。

【０１１９】ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及び燐酸受容体
としてイノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン６
g/dlを100mM酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5）に溶解
し、これに上記の菌体を乾燥菌体重量で100ｍg/dlとな
るように添加し、pHを4.0に維持しながら、30℃で22時
間反応させた。生成したヌクレオシド−５′−燐酸エス
テルの量を表９に示した。なお、生成したヌクレオチド
はヌクレオシド−５′−燐酸エステルのみでヌクレオシ
ド−２′−燐酸エステル及びヌクレオシド−３′−燐酸
エステルの副生は全く認められなかった。

【０１２０】

【表９】

【０１２１】

【実施例６】燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォ
スファターゼ遺伝子保持株を用いた各種燐酸化合物を燐
酸供与体とする５′−イノシン酸の生産変異型酸性フォ
スファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシェ
リヒア・コリ JM109／pMPI530を、アンピシリン100μg/
ml及びＩＰＴＧ１mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で
16時間培養した。

【０１２２】イノシン６g/dl及び燐酸供与体としてトリ
ポリ燐酸ナトリウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポ
リゴンＰ、千代田化学（株）製品）、フェニル酢酸ジナ
トリウム又はカルバミル燐酸ジナトリウム10g/dlを酢酸
ナトリウムバッファー（pH4.5）に溶解し、これに上記
の菌体を乾燥菌体重量で100ｍg/dlとなるように添加
し、pHを4.0に維持しながら30℃で22時間反応させた。
生成した５′−イノシン酸の量を表１０に示した。いず
れの燐酸供与体を用いた場合にも効率よく５′−イノシ
ン酸が生成蓄積したが、ポリ燐酸を燐酸供与体として用
いた場合に最も５′−イノシン酸の蓄積量が高かった。

【０１２３】

【表１０】

【０１２４】

【実施例７】エシェリヒア・ブラッタエ染色体からの酸
性フォスファターゼをコードする遺伝子の単離 （1）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650の無細胞抽出液か
ら精製した酸性フォスファターゼをＤＩＴＣメンブレン
（ミリジェン／バイオサーチ社製）に吸着させ、Proseq
uencer 6625（ミリジェン／バイオサーチ社製）を用い
てＮ末端のアミノ酸配列を決定した。配列表配列番号８
に示す15残基のＮ末端アミノ酸配列が決定された。

【０１２５】（2）酸性フォスファターゼをコードする
遺伝子断片の単離 エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650の培養菌体からMur
ray and Thomsonの方法（Nucl. Acid Res., 4321, 8 (1
980)）に従い、染色体ＤＮＡを調製した。これをＳａｕ
３ＡＩで部分分解した後、ショ糖密度勾配遠心分離によ
り３〜６KbpのＤＮＡ断片を分画した。プラスミドベク
ターpUC118（宝酒造社製）をＢａｍＨＩで切断し、部分
分解した染色体ＤＮＡ断片と連結させた。ＤＮＡの連結
はＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用い、
指定された方法にて行った。次いで、得られたＤＮＡ混
合物を用いて常法によりエシェリヒア・コリ JM109（宝
酒造社製）を形質転換した。形質転換体をアンピシリン
100μg/mlを含むＬ寒天培地上にプレーティングして生
育させ、遺伝子ライブラリーを作成した。

【０１２６】形質転換体の生育した寒天培地の表面に４
mM ｐ−ニトロフェニル燐酸及び100mM メス／ＮａＯＨ
バッファー（pH6.5）を含む反応液を注ぎ、30℃で15分
間保温した。フォスファターゼ活性を発現した菌は、ｐ
−ニトロフェノールを遊離して黄色を示すため、これを
指標として、形質転換体を選択した。約8,000株の形質
転換体の染色体遺伝子発現ライブラリーを探索した結
果、フォスファターゼ活性を発現した形質転換体14株が
得られた。

【０１２７】フォスファターゼ活性を発現した14株の形
質転換体を単コロニー分離し、アンピシリン100μg/ml
を含むＬ培地2.5mlに接種し、37℃で16時間培養した。
培養液から集菌した菌体にイノシン２g/dl及びピロ燐酸
ナトリウム10g/dlを含む100mM酢酸ナトリウムバッファ
ー（pH5.0）50μlを添加し、30℃ 16時間反応を行っ
た。ＨＰＬＣ分析にて ５′−イノシン酸の生成を検出
し、燐酸転移活性を持つ菌株を選択した。その結果、燐
酸転移活性を示し、目的の酸性フォスファターゼ遺伝子
断片を保有すると予想される形質転換体３株を得ること
ができた。

【０１２８】

【実施例８】エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650由来
酸性フォスファターゼ遺伝子の塩基配列の決定 実施例７で得られたエシェリヒア・ブラッタエ JCM 16
50由来酸性フォスファターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
保有すると予想される形質転換体の１株よりアルカリ溶
菌法によりプラスミドを調製し、挿入されたＤＮＡ断片
の解析を行った。このプラスミドをpEPI301と命名し
た。決定した挿入されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を図
６に示す。

【０１２９】さらにサブクローニングにより酸性フォス
ファターゼ遺伝子領域を限定した結果、制限酵素Ｃｌａ
ＩとＢａｍＨＩで切り出される2.4kbpの大きさの断片中
に本酸性フォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆
された。そこで塩基配列の決定のために該断片をＣｌａ
Ｉ及びＢａｍＨＩで切断したpBluescript KS（+）（ス
トラテジーン社製）に結合したプラスミドＤＮＡを構築
した。pEPI305と命名したこのプラスミドＤＮＡを用い
て常法によりエシェリヒア・コリ JM109（宝酒造製）を
形質転換し、これをアンピシリン100μg/mlを含むＬ寒
天培地上にプレーテイングし、形質転換体を得た。

【０１３０】pEPI305を保有するエシェリヒア・コリ JM
109（宝酒造製）の形質転換体よりアルカリ溶菌法によ
りプラスミドを調製し、塩基配列の決定を行った。決定
したオープン・リーデイング・フレームの塩基配列を配
列表配列番号９に示した。この塩基配列より推定される
蛋白質のアミノ酸配列を配列表配列番号１０に示した。
このアミノ酸配列中に精製酵素のＮ末端アミノ酸配列と
完全に一致する配列が存在した。精製酵素のＮ末端は配
列表配列番号１０の配列の19番目のロイシン残基から開
始していたため、配列番号１０に示されるアミノ酸配列
は前駆体蛋白質の配列であり、１番目のメチオニン残基
から18番目のアラニン残基までのペプチドは翻訳後に除
去されるものと考えられた。これより推定される成熟蛋
白質のアミノ酸配列を配列表配列番号１１に示した。こ
れより予想される成熟蛋白質の分子量は25.1キロダルト
ンと算出され、精製酵素ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とよく
一致した。以上の結果及び本断片を含むプラスミドを有
する形質転換体が燐酸転移活性を示すことから本オープ
ン・リーデイング・フレームは目的の酸性フォスファタ
ーゼをコードする領域であると同定した。

【０１３１】すなわち、配列表番号１１に示されるアミ
ノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子が、エシェ
リヒア・ブラッタエ JCM 1650の酸性フォスファターゼ
遺伝子である。

【０１３２】塩基配列、アミノ酸配列各々について既知
の配列との相同性比較を行った。用いたデーターベース
はＥＭＢＬ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結
果、配列表番号８に示される蛋白質及びそれをコードす
るＤＮＡは新規であることが判明した。本遺伝子のコー
ドする前駆体蛋白質は249個のアミノ酸から成り、その
配列から予想される蛋白質の分子量は27.0キロダルトン
であった。

【０１３３】アミノ酸配列各々について既知の配列との
相同性比較を行った結果、本蛋白質はプロビデンシア・
スチュアルテイ（Providencia stuartii）の酸性フォス
ファターゼと77.4％、実施例２のモルガネラ・モルガニ
（Morganella morganii）の酸性フォスファターゼと77.
1％、サルモネラ・チヒムリウム（Salmonella typhimur
ium）の酸性フォスファターゼと44.3％の相同性を示し
た。

【０１３４】なお、pEPI305をエシェリヒア・コリ JM 1
09に保持させた株は、AJ13144と命名され、平成８年２
月23日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番
号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に
ブタペスト条約に基づき国際寄託され、受託番号FERM B
P-5423が付与されている。

【０１３５】

【比較例３】エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650 由来
の酸性フォスファターゼ遺伝子の発現による活性の増幅 実施例８で作成したエシェリヒア・コリ JM109／pEPI30
5をアンピシリン100μg/ml及びＩＰＴＧ１mMを含むＬ培
地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。該培養液から
遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄し
た。菌体を５mlの100mM燐酸カリウムバッファー（pH7.
0）に懸濁し、４℃で20分間超音波処理を行い菌体を破
砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細
胞抽出液を調製した。

【０１３６】得られた無細胞抽出液の燐酸転移活性を、
プラスミドpBluescript KS（+）で同様に形質転換した
エシェリヒア・コリ JM109及びエシェリヒア・ブラッタ
エ野生株より調製した無細胞抽出液を対照として測定し
た結果を表１１に示した。エシェリヒア・コリ JM109／
pBluescript KS（+）では燐酸転移活性は検出されず、
エシェリヒア・ブラッタエ野生株でも燐酸転移活性は低
かった。一方、エシェリヒア・コリ JM109／pEPI305は
エシェリヒア・ブラッタエ野生株に比べて比活性で120
倍と高い燐酸転移活性を示しており、この結果から導入
したＤＮＡ断片がエシェリヒア・コリにおいて酸性フォ
スファターゼを高発現していることが示された。

【０１３７】

【表１１】

【０１３８】

【比較例４】エシェリヒア・ブラッタエ JCM 1650 由来
の酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシン
から５′−イノシン酸の生産 ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及びイノシン６ｇ/dlを100mM
酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに
上記のエシェリヒア・コリ JM109／pEPI305の菌体を乾
燥菌体重量で200mg/dlとなるように添加し、pHを4.0に
維持しながら、35℃で10時間反応を行い、経時的に生成
した５′−イノシン酸の量を測定した。なお、生成した
イノシン酸は５′−イノシン酸のみで２′−イノシン酸
及び３′−イノシン酸の副生は全く認められなかった。
結果を図７に示す。本菌を用いたピロ燐酸とイノシンか
らの５′−イノシン酸生産反応においては、非常に効率
よく短時間で５′−イノシン酸が生成蓄積した。

【０１３９】

【実施例９】燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォ
スファターゼ遺伝子の作成 比較例３及び４に示したようにエシェリヒア・ブラッタ
エ由来酸性フォスファターゼ遺伝子保持株は著量の酸性
フォスファターゼを発現し、本菌を用いたピロ燐酸とイ
ノシンからの５′−イノシン酸生産反応においては、非
常に効率よく短時間で５′−イノシン酸が生成蓄積す
る。しかし、生成した５′−イノシン酸が酸性フォスフ
ァターゼ自体が有する燐酸エステル加水分解活性によっ
て分解を受けるために５′−イノシン酸の蓄積量がある
程度以上上がらないことが判明した。そこで実施例７に
てクローニングしたエシェリヒア・ブラッタエ由来酸性
フォスファターゼ遺伝子にＰＣＲを用いる部位特異的変
異法により変異を導入し酵素の性質の改良を行うことと
した。

【０１４０】ＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステ
ム社製モデル394）を用いてホスホアミダイト法にて配
列表配列番号１２、１３及び１４に示すオリゴヌクレオ
チドMUT300、MUT310及びMUT320をそれぞれ合成した。

【０１４１】鋳型として実施例８で調製したプラスミド
pEPI305 １ng、プライマーとしてＭ13プライマーＲＶ
（宝酒造社製）及びMUT310オリゴヌクレオチド各2.5μm
ol及びタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユ
ニットをdATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウ
ム 50mM及び塩化マグネシウム 1.5mMを含む100mM トリ
スー塩酸緩衝液（pH8.3）100μlに添加し、94℃を30
秒、55℃を２分、72℃を３分のサイクルを25回繰り返す
ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応はサーマルサイクラー
PJ2000型（宝酒造社製）を用いて行った。また別に、鋳
型としてプラスミドpEPI305 １ng、プライマーとしてＭ
13プライマーＭ3（宝酒造社製）及びMUT300オリゴヌク
レオチド各2.5μmolを用いて同様にＰＣＲ反応を行っ
た。それぞれの反応液をマイクロスピンカラムS-400
（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過により精製し、
プライマーを除去した。

【０１４２】それぞれのＰＣＲ反応液１μlをdATP、dCT
P、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム 50mM及び塩化マ
グネシウム 1.5mMを含む100mMトリスー塩酸緩衝液（pH
8.3）95μlに添加し、94℃で10分加熱後、60分間かけて
37℃まで冷却した後、37℃で15分保温しヘテロ二本鎖を
形成させた。これにタックＤＮＡポリメラーゼ2.5ユニ
ットを添加して72℃で3分反応を行い、ヘテロ二本鎖を
完成させた。次に、この反応液にＭ13プライマーＲＶ及
びＭ13プライマーＭ3各2.5μmolを添加して、94℃を30
秒、55℃を２分、72℃を３分のサイクルを10回繰り返す
ＰＣＲ反応を行った。

【０１４３】２回目のＰＣＲ反応の生成物をＣｌａＩと
ＢａｍＨＩで切断後フェノール／クロロホルム抽出し、
エタノール沈殿した。このＤＮＡ断片をＣｌａＩとＢａ
ｍＨＩで切断したpBluescript KS（＋）に結合し、得ら
れたプラスミドＤＮＡを用いて常法によりエシェリヒア
・コリ JM109（宝酒造製）を形質転換した。これを100
μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天培地上にプレーテイ
ングし、形質転換体を得た。

【０１４４】形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラ
スミドを調製し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が
置換されていることを確認した。このようにして成熟蛋
白質の74番目のグリシン残基（GGG）がアスパラギン酸
残基（G^*A^*T）に置換した変異型フォスファターゼをコ
ードする変異型遺伝子を作成した。この変異型遺伝子を
含むプラスミドをpEPI310と命名した。

【０１４５】鋳型としてpEPI305、プライマーとしてMUT
300とMUT320オリゴヌクレオチドを用いて同様の操作に
より、成熟蛋白質の153番目のイソロイシン残基（ATC）
がスレオニン残基（A^*CC）に置換した変異型フォスファ
ターゼをコードする変異型遺伝子を作成した。この変異
型遺伝子を含むプラスミドをpEPI320と命名した。さら
に鋳型としてpEPI310、プライマーとしてMUT300とMUT32
0オリゴヌクレオチドを用いて同様の操作により、成熟
蛋白質の74番目のグリシン残基（GGG）がアスパラギン
酸残基（G^*A^*T）に、153番目のイソロイシン残基（AT
C）がスレオニン残基（A^*CC）に置換した変異型フォス
ファターゼをコードする変異型遺伝子を作成した。この
変異型遺伝子を含むプラスミドをpEPI330と命名した。

【０１４６】それぞれの変異型酸性フォスファターゼ遺
伝子を含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ J
M109／pEPI310、エシェリヒア・コリ JM109／pEPI320、
エシェリヒア・コリ JM109／pEPI330及び野生型酸性フ
ォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシ
ェリヒア・コリ JM109／pEPI305をアンピシリン100μg/
ml及びＩＰＴＧ１mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で
16時間培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集
め、生理食塩水で１回洗浄した。菌体を５mlの100mM燐
酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分
間超音波処理を行い破砕した。処理液を遠心分離して不
溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。得られた無
細胞抽出液の燐酸エステル加水分解活性及び燐酸転移活
性をpH4.0にて測定し、野生株のものと比較した。

【０１４７】野生型および変異型酸性フォスファターゼ
の燐酸エステル加水分解活性及び燐酸転移活性を測定し
た結果を表１２に示す。変異型酸性フォスファターゼ
は、野生型酸性フォスファターゼと比較して、燐酸エス
テル加水分解活性と燐酸転移活性がいずれも低下してい
たが、燐酸エステル加水分解活性の方が低下の程度が大
きく、その結果、変異型酸性フォスファターゼの燐酸エ
ステル加水分解活性／燐酸転移活性の比は野生型酸性フ
ォスファターゼに比べて低くなっていた。

【０１４８】

【表１２】

【０１４９】

【実施例１０】燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フ
ォスファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′
−イノシン酸の生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを
導入したエシェリヒア・コリ JM109／pEPI310、エシェ
リヒア・コリ JM109／pEPI320、エシェリヒア・コリ JM
109／pEPI330及び野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を
含むプラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109／
pEPI305をアンピシリン100μg/ml及びＩＰＴＧ１mMを含
むＬ培地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。

【０１５０】ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及びイノシン６
g/dlを酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、
これに上記培養で得たエシェリヒア・コリ各菌株の菌体
を乾燥菌体重量で200mg/dlとなるように添加し、pHを4.
0に維持しながら、35℃で32時間反応を行い、経時的に
生成した５′−イノシン酸の量を測定した。結果を図８
に示す。

【０１５１】図８中、縦軸は５′−イノシン酸の濃度
（mg/dl）を、横軸は反応時間（ｈ）を、また黒埋め円
形はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pE
PI305、黒埋め三角形はエシェリヒア・コリ（Escherich
ia coli）JM109/pEPI310、白抜き円形はエシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）JM109/pEPI320、白抜き四角
形はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）JM109/pE
PI330の各菌体を使用した場合の反応の推移を示す。

【０１５２】燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フォ
スファターゼ遺伝子保持株を用いたイノシンから５′−
イノシン酸の生産反応においては生成した５′−イノシ
ン酸の分解速度が低下しており、その結果として ５′
−イノシン酸の収率及び蓄積量が向上した。７４番目の
グリシン残基及び１５３番目のイソロイシン残基がそれ
ぞれアスパラギン酸残基及びスレオニン残基へと置換さ
れた変異型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株エシェリ
ヒア・コリ JM109／pEPI330が最も高い５′−イノシン
酸の蓄積を示した。

【０１５３】

【実施例１１】燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フ
ォスファターゼ遺伝子保持株を用いた各種ヌクレオシド
−５′−燐酸エステルの生産 変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを
導入したエシェリヒア・コリ JM109／pEPI330をアンピ
シリン100μg/ml及びＩＰＴＧ１mMを含むＬ培地50mlに
接種し、37℃で16時間培養した。

【０１５４】ピロ燐酸ナトリウム12g/dl及び燐酸受容体
としてイノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン６
g/dlを100mM酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5）に溶解
し、これに上記の菌体を乾燥菌体重量で200ｍg/dlとな
るように添加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で32時
間反応させた。生成したヌクレオシド−５′−燐酸エス
テルの量を表１３に示した。なお、生成したヌクレオチ
ドはヌクレオシド−５′−燐酸エステルのみでヌクレオ
シド−２′−燐酸エステル及びヌクレオシド−３′−燐
酸エステルの副生は全く認められなかった。

【０１５５】

【表１３】

【０１５６】

【実施例１２】燐酸エステル加水分解活性低下型酸性フ
ォスファターゼ遺伝子保持株を用いる各種燐酸化合物を
燐酸供与体とする５′−イノシン酸の生産変異型酸性フ
ォスファターゼ遺伝子を含むプラスミドを導入したエシ
ェリヒア・コリ JM109／pEPI330をアンピシリン100μg/
ml及びＩＰＴＧ１mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で
16時間培養した。

【０１５７】イノシン６g/dl及び燐酸供与体としてトリ
ポリ燐酸ナトリウム、ポリ燐酸ナトリウム（商品名：ポ
リゴンＰ、千代田化学（株）製品）、フェニル酢酸ジナ
トリウム又はカルバミル燐酸ジナトリウム12g/dlを100m
M酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）に溶解し、これに
上記の菌体を乾燥菌体重量で200ｍg/dlとなるように添
加し、pHを4.0に維持しながら、35℃で32時間反応させ
た。生成した５′−イノシン酸の量を表１４に示した。
いずれの燐酸供与体を用いた場合にも効率よく５′−イ
ノシン酸が生成蓄積したが、ポリ燐酸を燐酸供与体とし
て用いた場合に最も５′−イノシン酸の蓄積量が高かっ
た。

【０１５８】

【表１４】

【０１５９】

【参考例７】プロビデンシア・スチュアルティ染色体か
らの酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の単離と
塩基配列の確認 既知のプロビデンシア・スチュアルティの酸性フォスフ
ァターゼ遺伝子の塩基配列（EMBL Accession number X6
4820）を基に、該酸性フォスファターゼ遺伝子を増幅す
るようにデザインした配列表配列番号１５及び１６に示
す配列を有するＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマー
PRP1及びPRP2を合成した。

【０１６０】プロビデンシア・スチュアルティ ATCC 29
851の培養菌体から、Murry and Thompsonの方法（Nucl.
Acid Res., 4321, 8, (1980)）に従い染色体ＤＮＡを
調製した。鋳型としてこの染色体ＤＮＡ 0.1ng、プライ
マーとしてPRP1及びPRP2オリゴヌクレオチド各2.5μmol
並びにタックＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）2.5ユ
ニットをdATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウ
ム50mM及び塩化マグネシウム1.5mMを含む100mMトリス−
塩酸緩衝液（pH8.3）100μlに添加し、94℃を30秒、55
℃を２分、72℃を３分のサイクルを30回繰り返すＰＣＲ
反応を行った。反応液をアガロース電気泳動に供し、増
幅された約１kbpのＤＮＡ断片をグラスパウダー（宝酒
造社製）を用いて回収した。この遺伝子断片をＢａｍＨ
Ｉで切断後、ＢａｍＨＩで切断したpUC118に結合した。
このプラスミドをpPRP100と命名した。

【０１６１】pPRP100を導入したエシェリヒア・コリ JM
109/pPRP100の燐酸エステル加水分解活性及び燐酸転移
活性を測定した。その結果、本菌は燐酸エステル加水分
解活性だけでなく、ヌクレオシドへの燐酸転移活性も示
した。

【０１６２】エシェリヒア・コリ JM109/pPRP100よりア
ルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配列の決
定を行った。決定したオープン・リーデイング・フレー
ムの塩基配列及びこの塩基配列より推定される蛋白質の
アミノ酸配列を配列表配列番号１７及び配列番号１８に
示した。本オープン・リーデイング・フレームの塩基配
列は既知のプロビデンシア・スチュアルティの酸性フォ
スファターゼ遺伝子の塩基配列と完全に一致した。

【０１６３】

【参考例８】エンテロバクター・アエロゲネス、クレブ
シエラ・プランティコラ及びセラチア・フィカリアの染
色体からの酸性フォスファターゼをコードする遺伝子の
単離と塩基配列の決定 エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010、クレブシ
エラ・プランティコラIFO 14939及びセラチア・フィカ
リア IAM 13540の培養菌体からMurry and Thompsonの方
法（Nucl. Acid Res., 4321, 8, (1980)）に従い、それ
ぞれの染色体ＤＮＡを調製した。ついで、実施例１
（２）と同様の方法により、約20,000株のエシェリヒア
・コリ JM109の形質転換体よりなる染色体遺伝子発現ラ
イブラリーをそれぞれ作成し、探索した結果、燐酸転移
活性を示す形質転換体を得ることができた。これらの形
質転換体はそれぞれの菌株由来の酸性フォスファターゼ
遺伝子を保有すると考えられた。

【０１６４】エンテロバクター・アエロゲネス IFO 120
10由来の酸性フォスファターゼ遺伝子を保有すると考え
られるエシェリヒア・コリ JM109形質転換体の１株より
アルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、挿入された
ＤＮＡ断片の解析を行った。このプラスミドをpENP100
と命名した。決定したエンテロバクター・アエロゲネス
IFO 12010由来の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図９
に示す。

【０１６５】サブクローニングにより、酸性フォスファ
ターゼ遺伝子領域を限定した結果、制限酵素ＳａｌＩと
制限酵素ＫｐｎＩで切り出される1.6kbpの断片中に本酸
性フォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆され
た。そこで塩基配列の決定のためにこのＳａｌＩ−Ｋｐ
ｎＩ断片をＳａｌＩ及びＫｐｎＩで切断したpUC118に結
合したプラスミドＤＮＡを構築した。このプラスミドを
pENP110と命名した。

【０１６６】同様に、クレブシエラ・プランティコラ I
FO 14939由来の酸性フォスファターゼ遺伝子断片を保有
すると考えられるエシェリヒア・コリ JM109形質転換体
の１株よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、
挿入されたＤＮＡ断片の解析を行った。このプラスミド
をpKLP100と命名した。決定したクレブシエラ・プラン
ティコラ IFO 14939由来の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地
図を図１０に示す。

【０１６７】サブクローニングにより、酸性フォスファ
ターゼ遺伝子領域を限定した結果、制限酵素ＫｐｎＩと
制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出される2.2kbpの断片中に本
酸性フォスファターゼ遺伝子が含まれることが示唆され
た。そこで塩基配列の決定のためにこのＫｐｎＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片をＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断したpUC118に
結合したプラスミドＤＮＡを構築した。このプラスミド
をpKLP110と命名したまた、セラチア・フィカリア IAM
13540由来の酸性フォスファターゼ遺伝子断片を保有す
ると考えられるエシェリヒア・コリ JM109形質転換体の
１株よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、挿
入されたＤＮＡ断片の解析を行った。このプラスミドを
pSEP100と命名した。決定したセラチア・フィカリア IA
M 13540由来の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１１
に示す。

【０１６８】サブクローニングにより、酸性フォスファ
ターゼ遺伝子領域を限定した結果、制限酵素ＨｉｎdIII
で切り出される1.4kbpの断片中に本酸性フォスファター
ゼ遺伝子が含まれることが示唆された。そこで塩基配列
の決定のためにこのＨｉｎdIII断片をＨｉｎdIIIで切断
したpUC118に結合したプラスミドＤＮＡを構築した。こ
のプラスミドをpSEP110と命名した。

【０１６９】pENP110、pKLP110及びpSEP110をそれぞれ
導入したエシェリヒア・コリ JM109/pENP110、エシェリ
ヒア・コリ JM109/pKLP110及びエシェリヒア・コリ JM1
09/pSEP110の形質転換体よりアルカリ溶菌法によりそれ
ぞれのプラスミドを調製し、実施例２の方法に従い、挿
入断片の塩基配列の決定を行った。決定したそれぞれの
挿入断片のオープン・リーデイング・フレームの塩基配
列のうちエンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由
来のものを配列表配列番号１９に、クレブシエラ・プラ
ンティコラ IFO 14939由来のものを配列表配列番号２１
に、そしてセラチア・フィカリア IAM 13540由来のもの
を配列表配列番号２３に示した。また、各々の推定され
るアミノ酸配列を配列表配列番号２０、２２、２４に示
した。各ＤＮＡ断片を含むプラスミドを有する形質転換
体が燐酸転移活性を示したことから、これらのオープン
・リーデイング・フレームは目的の酸性フォスファター
ゼ遺伝子であると同定した。

【０１７０】塩基配列、アミノ酸配列各々について既知
の配列との相同性比較を行った。用いたデーターベース
はＥＭＢＬ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結
果、配列表配列番号１９、２１及び２３に示される遺伝
子はいずれも新規な遺伝子であることが判明した。ま
た、エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来の
遺伝子がコードする蛋白質は248個、クレブシエラ・プ
ランティコラ IFO 14939由来の遺伝子がコードする蛋白
質は248個、セラチア・フィカリア IAM 13540由来の遺
伝子がコードする蛋白質は244個のアミノ酸からそれぞ
れなるものと推定された。なお、これらの蛋白質は、モ
ルガネラ・モルガニ及びエシェリヒア・ブラッタエの酸
性フォスファターゼの場合と同様、前駆体蛋白質である
可能性がある。

【０１７１】また、これらの塩基配列より予想される蛋
白質のアミノ酸配列を実施例２で推定したモルガネラ・
モルガニ NCIMB 10466、実施例８で推定したエシェリヒ
ア・ブラッタエ JCM 1650及び既知のプロビデンシア・
スチュアルティ（EMBL Accession number X64820）の酸
性フォスファターゼの前駆体蛋白質のアミノ酸配列と共
にアミノ酸の一文字表記で図１２に示した。図中ですべ
てのアミノ酸配列において共通のアミノ酸残基を配列の
下に＊で示した。

【０１７２】図１２に示したように６種類の菌株由来の
酸性フォスファターゼのアミノ酸配列は非常に相同性が
高く、130個のアミノ酸残基がすべてのアミノ酸配列に
おいて共通していた。これより、これらの酸性フォスフ
ァターゼは非常に類似する機能を持つことが予想され
る。

【０１７３】

【参考例９】プロビデンシア・スチュアルティ、エンテ
ロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・プランティ
コラ 及びセラチア・フィカリア由来の酸性フォスファ
ターゼ遺伝子の発現による活性の増幅 参考例７にて構築したエシェリヒア・コリ JM109/pPRP1
00、参考例８にて構築したエシェリヒア・コリ JM109/p
ENP110、エシェリヒア・コリ JM109/pKLP110及びエシェ
リヒア・コリ JM109/pSEP110をアンピシリン100μg/ml
及びＩＰＴＧ1mMを含むＬ培地50mlに接種し、37℃で16
時間培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集
め、生理食塩水で１回洗浄した。菌体を５mlの100mM燐
酸カリウムバッファー（pH7.0）に懸濁し、４℃で20分
間超音波処理を行い破砕した。処理液を遠心分離して不
溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。

【０１７４】得られた無細胞抽出液の燐酸転移活性を、
プロビデンシア・スチュアルティ ATCC 29851、エンテ
ロバクター・アエロゲネス IFO 12010、クレブシエラ・
プランティコラ IFO 14939、セラチア・フィカリア IAM
13540及びプラスミドpUC118で同様に形質転換したエシ
ェリヒア・コリ JM109より調製した無細胞抽出液の活性
を対照として測定した結果を表１５に示した。いずれの
菌も野生株の燐酸転移活性は低かった。また、エシェリ
ヒア・コリ JM109/pUC118では燐酸転移活性は検出され
なかった。一方、酸性フォスファターゼ遺伝子を導入し
たエシェリヒア・コリ JM109の形質転換体はいずれも野
生株に比べて高い燐酸転移活性を示しており、この結果
から導入した遺伝子断片がエシェリヒア・コリにおいて
酸性フォスファターゼを高発現していることが示され
た。

【０１７５】

【表１５】

【０１７６】

【発明の効果】本発明により、燐酸エステル加水分解活
性を低下させる変異を有する酸性フォスファターゼ、該
酸性フォスファターゼをコードする遺伝子、該遺伝子を
含む組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを保有する微生物が
提供される。前記変異型酸性酸性フォスファターゼ、又
はそれを産生する微生物を用いることにより、効率よく
ヌクレオシド−５′−燐酸エステルを製造することがで
きる。

【０１７７】

【配列表】 <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> 変異型酸性フォスファターゼ <130> P-8245 <140> <141> 2000-12-26 <150> JP 7-149781 <151> 1995-05-25 <150> JP 8-94680 <151> 1996-03-26 <160> 24 <170> PatentIn version 3.0

【０１７８】 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Morganella morganii <400> 1 Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr 1 5 10 15 Leu Lys Asn Glu 20

【０１７９】 <210> 2 <211> 750 <212> DNA <213> Morganella morganii <220> <221> CDS <222> (1)..(747) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(60) <220> <221> mat_peptide <222> (61)..(747) <400> 2 atg aag aag aat att atc gcc ggt tgt ctg ttc tca ctg ttt tcc ctt 48 Met Lys Lys Asn Ile Ile Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu -20 -15 -10 -5 tcc gcg ctg gcc gcg atc ccg gcg ggc aac gat gcc acc acc aag ccg 96 Ser Ala Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro 1 5 10 gat tta tat tat ctg aaa aat gaa cag gct atc gac agc ctg aaa ctg 144 Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu 15 20 25 tta ccg cca ccg ccg gaa gtc ggc agt att cag ttt tta aat gat cag 192 Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln 30 35 40 gca atg tat gag aaa ggc cgt atg ctg cgc aat acc gag cgc gga aaa 240 Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys 45 50 55 60 cag gca cag gca gat gct gac ctg gcc gca ggg ggt gtg gca acc gca 288 Gln Ala Gln Ala Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala 65 70 75 ttt tca ggg gca ttc ggc tat ccg ata acc gaa aaa gac tct ccg gag 336 Phe Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu 80 85 90 ctg tat aaa ctg ctg acc aat atg att gag gat gcc ggt gat ctt gcc 384 Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 95 100 105 acc cgc tcc gcc aaa gaa cat tac atg cgc atc cgg ccg ttt gcg ttt 432 Thr Arg Ser Ala Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 110 115 120 tac ggc aca gaa acc tgt aat acc aaa gat cag aaa aaa ctc tcc acc 480 Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr 125 130 135 140 aac gga tct tac ccg tca ggt cat acg tct atc ggc tgg gca acc gca 528 Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala 145 150 155 ctg gtg ctg gcg gaa gtg aac ccg gca aat cag gat gcg att ctg gaa 576 Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu 160 165 170 cgg ggt tat cag ctc gga cag agc cgg gtg att tgc ggc tat cac tgg 624 Arg Gly Tyr Gln Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 175 180 185 cag agt gat gtg gat gcc gcg cgg att gtc ggt tca gcc gct gtc gcg 672 Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala 190 195 200 aca tta cat tcc gat ccg gca ttt cag gcg cag tta gcg aaa gcc aaa 720 Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys 205 210 215 220 cag gaa ttt gca caa aaa tca cag aaa taa 750 Gln Glu Phe Ala Gln Lys Ser Gln Lys 225 229

【０１８０】 <210> 3 <211> 249 <212> PRT <213> Morganella morganii <400> 3 Met Lys Lys Asn Ile Ile Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu -20 -15 -10 -5 Ser Ala Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro 1 5 10 Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu 15 20 25 Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln 30 35 40 Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys 45 50 55 60 Gln Ala Gln Ala Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala 65 70 75 Phe Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu 80 85 90 Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 95 100 105 Thr Arg Ser Ala Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 110 115 120 Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr 125 130 135 140 Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala 145 150 155 Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu 160 165 170 Arg Gly Tyr Gln Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 175 180 185 Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala 190 195 200 Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys 205 210 215 220 Gln Glu Phe Ala Gln Lys Ser Gln Lys 225 229

【０１８１】 <210> 4 <211> 229 <212> PRT <213> Morganella morganii <400> 4 Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr 1 5 10 15 Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu Leu Pro Pro Pro 20 25 30 Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln Ala Met Tyr Glu 35 40 45 Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Gln Ala Gln Ala 50 55 60 Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala Phe Ser Gly Ala 65 70 75 80 Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu Leu Tyr Lys Leu 85 90 95 Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala 100 105 110 Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Gly Thr Glu 115 120 125 Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr Asn Gly Ser Tyr 130 135 140 Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala 145 150 155 160 Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu Arg Gly Tyr Gln 165 170 175 Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser Asp Val 180 185 190 Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala Thr Leu His Ser 195 200 205 Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys Gln Glu Phe Ala 210 215 220 Gln Lys Ser Gln Lys 225 229

【０１８２】 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 5 attaccatga ttacgaattc 20

【０１８３】 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 6 gcggttgcca catcccctgc g 21

【０１８４】 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 7 ttgcccagcc ggtagacgta t 21

【０１８５】 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Escherichia blattae <400> 8 Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro Asp Leu 1 5 10 15

【０１８６】 <210> 9 <211> 750 <212> DNA <213> Escherichia blattae <220> <221> CDS <222> (1)..(747) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(54) <220> <221> mat_peptide <222> (55)..(747) <400> 9 atg aaa aaa cgt gtt ctg gca gtt tgt ttt gcc gca ttg ttc tct tct 48 Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser -18 -15 -10 -5 cag gcc ctg gcg ctg gtc gct acc ggc aac gac act acc acg aaa ccg 96 Gln Ala Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro 1 5 10 gat ctc tac tac ctc aag aac agt gaa gcc att aac agc ctg gcg ctg 144 Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu 15 20 25 30 ttg ccg cca cca ccg gcg gtg ggc tcc att gcg ttt ctc aac gat cag 192 Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln 35 40 45 gcc atg tat gaa cag ggg cgc ctg ctg cgc aac acc gaa cgc ggt aag 240 Ala Met Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys 50 55 60 ctg gcg gcg gaa gat gca aac ctg agc agt ggc ggg gtg gcg aat gct 288 Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala 65 70 75 ttc tcc ggc gcg ttt ggt agc ccg atc acc gaa aaa gac gcc ccg gcg 336 Phe Ser Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala 80 85 90 ctg cat aaa tta ctg acc aat atg att gag gac gcc ggg gat ctg gcg 384 Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 95 100 105 110 acc cgc agc gcg aaa gat cac tat atg cgc att cgt ccg ttc gcg ttt 432 Thr Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 115 120 125 tat ggg gtc tct acc tgt aat acc acc gag cag gac aaa ctg tcc aaa 480 Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys 130 135 140 aat ggc tct tat ccg tcc ggg cat acc tct atc ggc tgg gct act gcg 528 Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala 145 150 155 ctg gtg ctg gca gag atc aac cct cag cgc cag aac gag atc ctg aaa 576 Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys 160 165 170 cgc ggt tat gag ctg ggc cag agc cgg gtg att tgc ggc tac cac tgg 624 Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 175 180 185 190 cag agt gat gtg gat gcc gcg cgg gta gtg gga tct gcc gtt gtg gcg 672 Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala 195 200 205 acc ctg cat acc aac ccg gcg ttc cag cag cag ttg cag aaa gcg aag 720 Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys 210 215 220 gcc gaa ttc gcc cag cat cag aag aaa taa 750 Ala Glu Phe Ala Gln His Gln Lys Lys 225 230

【０１８７】 <210> 10 <211> 249 <212> PRT <213> Morganella morganii <400> 10 Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser -18 -15 -10 -5 Gln Ala Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro 1 5 10 Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu 15 20 25 30 Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln 35 40 45 Ala Met Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys 50 55 60 Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala 65 70 75 Phe Ser Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala 80 85 90 Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 95 100 105 110 Thr Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 115 120 125 Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys 130 135 140 Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala 145 150 155 Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys 160 165 170 Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 175 180 185 190 Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala 195 200 205 Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys 210 215 220 Ala Glu Phe Ala Gln His Gln Lys Lys 225 230

【０１８８】 <210> 11 <211> 231 <212> PRT <213> Escherichia blattae <400> 11 Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro Asp Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu Leu Pro 20 25 30 Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln Ala Met 35 40 45 Tyr Glu Gln Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Leu Ala 50 55 60 Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala Phe Ser 65 70 75 80 Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala Leu His 85 90 95 Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg 100 105 110 Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Gly 115 120 125 Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys Asn Gly 130 135 140 Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val 145 150 155 160 Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys Arg Gly 165 170 175 Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser 180 185 190 Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala Thr Leu 195 200 205 His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys Ala Glu 210 215 220 Phe Ala Gln His Gln Lys Lys 225 230

【０１８９】 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 12 cctcgaggtc gacggtatcg 20

【０１９０】 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 13 attcgccaca tcgccactgc t 21

【０１９１】 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 14 tagcccagcc ggtagaggta tg 22

【０１９２】 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 15 ctggatcctg tggctatcat cacct 25

【０１９３】 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc_feature <222> ()..() <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 16 ctggatccga cgcgatttta ccata 25

【０１９４】 <210> 17 <211> 747 <212> DNA <213> Providencia stuartii <220> <221> CDS <222> (1)..(744) <400> 17 atg aaa aaa cta tta gca gta ttc tgc gca ggg gct ttt gtt tca acc 48 Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr 1 5 10 15 agt gta ttt gcg gcg atc cct ccc ggc aat gat gtg aca act aaa ccc 96 Ser Val Phe Ala Ala Ile Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro 20 25 30 gat ctt tat tat tta aaa aac tca cag gct att gat agt tta gcg tta 144 Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu 35 40 45 ttg ccg cca cca cct gaa gtg ggc agt atc tta ttt tta aac gac caa 192 Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Leu Phe Leu Asn Asp Gln 50 55 60 gcg atg tat gaa aaa ggc cgt tta ttg cga aat act gag cgt gga gaa 240 Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Glu 65 70 75 80 caa gcc gct aag gat gct gat ctg gct gcg ggc ggt gtt gcg aac gca 288 Gln Ala Ala Lys Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala 85 90 95 ttt tct gaa gct ttt ggt tat ccc att acc gaa aag gat gcg cct gaa 336 Phe Ser Glu Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Glu 100 105 110 att cat aaa ttg ctg acg aat atg att gaa gat gcg ggg gat tta gca 384 Ile His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 115 120 125 act cgc tca gcc aaa gag aaa tac atg cgc att cgt cca ttt gcg ttc 432 Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 130 135 140 tac ggt gtt gct acc tgt aac acg aaa gat cag gac aaa tta tct aag 480 Tyr Gly Val Ala Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Asp Lys Leu Ser Lys 145 150 155 160 aat ggc tct tat cct tct gga cac acc gca att ggc tgg gca tct gca 528 Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ala Ile Gly Trp Ala Ser Ala 165 170 175 ctc gta ttg tca gaa att aac cca gaa aac caa gat aaa att tta aaa 576 Leu Val Leu Ser Glu Ile Asn Pro Glu Asn Gln Asp Lys Ile Leu Lys 180 185 190 cgt ggt tat gaa ctt ggc caa agc cga gtc atc tgt ggt tac cat tgg 624 Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 195 200 205 caa agt gat gtt gat gca gct cgt atc gtt gca tcg ggt gcg gta gca 672 Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Ala Ser Gly Ala Val Ala 210 215 220 act tta cac tcc aac cct gaa ttc caa aaa cag tta caa aaa gcc aaa 720 Thr Leu His Ser Asn Pro Glu Phe Gln Lys Gln Leu Gln Lys Ala Lys 225 230 235 240 gac gaa ttt gct aaa ctg aaa aaa tag 747 Asp Glu Phe Ala Lys Leu Lys Lys 245

【０１９５】 <210> 18 <211> 248 <212> PRT <213> Providencia stuartii <400> 18 Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr 1 5 10 15 Ser Val Phe Ala Ala Ile Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro 20 25 30 Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu 35 40 45 Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Leu Phe Leu Asn Asp Gln 50 55 60 Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Glu 65 70 75 80 Gln Ala Ala Lys Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala 85 90 95 Phe Ser Glu Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Glu 100 105 110 Ile His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 115 120 125 Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 130 135 140 Tyr Gly Val Ala Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Asp Lys Leu Ser Lys 145 150 155 160 Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ala Ile Gly Trp Ala Ser Ala 165 170 175 Leu Val Leu Ser Glu Ile Asn Pro Glu Asn Gln Asp Lys Ile Leu Lys 180 185 190 Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 195 200 205 Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Ala Ser Gly Ala Val Ala 210 215 220 Thr Leu His Ser Asn Pro Glu Phe Gln Lys Gln Leu Gln Lys Ala Lys 225 230 235 240 Asp Glu Phe Ala Lys Leu Lys Lys 245

【０１９６】 <210> 19 <211> 747 <212> DNA <213> Enterobacter aerogenes <220> <221> CDS <222> (1)..(744) <400> 19 atg aaa aag cgc gtt ctc gcc ctc tgc ctc gcc agc ctg ttt tcc gtt 48 Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val 1 5 10 15 aac gct ttc gcg ctg gtc cct gcc ggc aat gat gca acc acc aaa ccg 96 Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro 20 25 30 gat ctc tat tat ctg aaa aat gca cag gcc atc gat agt ctg gcg ctg 144 Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu 35 40 45 ttg ccg ccg ccg ccg gaa gtt ggc agc atc gca ttt tta aac gat cag 192 Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln 50 55 60 gcg atg tat gag aaa gga cgg ctg ttg cgc aat acc gaa cgt ggc aag 240 Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys 65 70 75 80 ctg gcg gct gaa gat gct aac ctg agc gcc ggc ggc gtc gcg aat gcc 288 Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala 85 90 95 ttc tcc agc gct ttt ggt tcg ccc atc acc gaa aaa gac gcg ccg cag 336 Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gln 100 105 110 tta cat aag ctg ctg aca aat atg att gag gat gcc ggc gat ctg gcc 384 Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 115 120 125 acc cgc agc gcg aaa gag aaa tat atg cgc att cgc ccg ttt gcg ttc 432 Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 130 135 140 tac ggc gtt tca acc tgt aac act acc gag cag gac aag ctg tcg aaa 480 Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys 145 150 155 160 aac gga tct tac cct tcc ggc cat acc tct atc ggt tgg gca acc gcg 528 Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala 165 170 175 ctg gta ctg gcg gag atc aat ccg cag cgg caa aac gaa att ctc aaa 576 Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys 180 185 190 cgc ggc tat gaa ttg ggc gaa agc cgg gtt atc tgc ggc tat cat tgg 624 Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 195 200 205 cag agc gat gtc gat gcg gcg cgg ata gtc ggc tcg gcg gtg gtg gcg 672 Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala 210 215 220 acc ctg cat acc aac ccg gcc ttc caa cag cag ttg cag aaa gca aag 720 Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys 225 230 235 240 gat gaa ttc gcc aaa acg cag aag taa 747 Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gln Lys 245

【０１９７】 <210> 20 <211> 248 <212> PRT <213> Enterobacter aerogenes <400> 20 Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val 1 5 10 15 Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro 20 25 30 Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu 35 40 45 Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln 50 55 60 Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys 65 70 75 80 Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala 85 90 95 Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gln 100 105 110 Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 115 120 125 Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 130 135 140 Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys 145 150 155 160 Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala 165 170 175 Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys 180 185 190 Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 195 200 205 Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala 210 215 220 Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys 225 230 235 240 Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gln Lys 245

【０１９８】 <210> 21 <211> 747 <212> DNA <213> Klebsiella planticola <220> <221> CDS <222> (1)..(744) <400> 21 atg aaa aag cgt gta ctc gcc ctt tgc ctt gcc agc ctc ttt tca gtt 48 Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val 1 5 10 15 agc gcc ttt gcg ctg gtt ccc gcc ggc aat gat gcc acc acc aag ccc 96 Ser Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro 20 25 30 gat ctc tac tat ctg aaa aat gcc cag gcc att gac agc ctg gcg ctg 144 Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu 35 40 45 ttg cca ccg ccg ccg gaa gtg ggc agc att gcg ttt tta aac gat cag 192 Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln 50 55 60 gcg atg tat gag aaa ggc cgt ctg ctg cgc gcc acc gcc cgc ggc aag 240 Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Ala Thr Ala Arg Gly Lys 65 70 75 80 ttg gcg gca gaa gat gcc aac ctg agc gcg ggt ggc gtg gcc aac gcc 288 Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala 85 90 95 ttc tcc gca gca ttc ggc tcc ccg atc agc gaa aaa gac gcc ccg gcg 336 Phe Ser Ala Ala Phe Gly Ser Pro Ile Ser Glu Lys Asp Ala Pro Ala 100 105 110 ctg cac aaa ctg ctc acc aac atg att gaa gac gcg ggc gat ctg gcg 384 Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 115 120 125 acc cga ggc gcg aaa gag aag tat atg cgt att cgt ccg ttt gcc ttc 432 Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 130 135 140 tac ggc gtg tcc acc tgc aat acc acc gaa cag gat aag ctg tcg aaa 480 Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys 145 150 155 160 aac ggc tcc tac cct tcc gga cac acc tct atc ggc tgg gcg acc gcc 528 Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala 165 170 175 ctg gtg ctg gcc gaa atc aac ccg cag cgc cag aat gag att ctc aag 576 Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys 180 185 190 cgc ggc tat gag ctc ggt gaa agt cgg gtg atc tgc ggt tac cac tgg 624 Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 195 200 205 cag agc gat gtt gac gcc gcg cgg att gtc ggc tcg gcg gtg gtt gca 672 Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala 210 215 220 acc ctg cat acc aat ccg gcc ttc cag cag cag ctg caa aaa gcc aaa 720 Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys 225 230 235 240 gac gag ttt gcg aaa cag cag aaa tag 747 Asp Glu Phe Ala Lys Gln Gln Lys 245

【０１９９】 <210> 22 <211> 248 <212> PRT <213> Klebsiella planticola <400> 22 Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val 1 5 10 15 Ser Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro 20 25 30 Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu 35 40 45 Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gln 50 55 60 Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Ala Thr Ala Arg Gly Lys 65 70 75 80 Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala 85 90 95 Phe Ser Ala Ala Phe Gly Ser Pro Ile Ser Glu Lys Asp Ala Pro Ala 100 105 110 Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 115 120 125 Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 130 135 140 Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gln Asp Lys Leu Ser Lys 145 150 155 160 Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala 165 170 175 Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gln Arg Gln Asn Glu Ile Leu Lys 180 185 190 Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 195 200 205 Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala 210 215 220 Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gln Gln Gln Leu Gln Lys Ala Lys 225 230 235 240 Asp Glu Phe Ala Lys Gln Gln Lys 245

【０２００】 <210> 23 <211> 735 <212> DNA <213> Serratia ficaria <220> <221> CDS <222> (1)..(732) <400> 23 atg aaa aaa ata tta tta gcc aca tta agc tgc gcc gcg ttg acg cag 48 Met Lys Lys Ile Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gln 1 5 10 15 ttt tcc ttt gcc gcc aaa gat gtc act acc cac cct gag gtt tat ttt 96 Phe Ser Phe Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr His Pro Glu Val Tyr Phe 20 25 30 ctg caa gaa tca cag tcc atc gac agc ctg gca cta ttg ccg ccg ccg 144 Leu Gln Glu Ser Gln Ser Ile Asp Ser Leu Ala Leu Leu Pro Pro Pro 35 40 45 ccg gcg atg gac agc att gat ttc ctg aat gac aaa gcg caa tac gac 192 Pro Ala Met Asp Ser Ile Asp Phe Leu Asn Asp Lys Ala Gln Tyr Asp 50 55 60 gcc ggg aaa ata gtg cgc aat act ccg cgt ggc aag cag gct tat gat 240 Ala Gly Lys Ile Val Arg Asn Thr Pro Arg Gly Lys Gln Ala Tyr Asp 65 70 75 80 gac gcc cac gtt gcc ggg gac ggc gtt gcc gcc gca ttt tcc aac gcc 288 Asp Ala His Val Ala Gly Asp Gly Val Ala Ala Ala Phe Ser Asn Ala 85 90 95 ttc ggc cta gaa ata gcc caa cgg aaa acg ccg gag ctg ttt aag ctg 336 Phe Gly Leu Glu Ile Ala Gln Arg Lys Thr Pro Glu Leu Phe Lys Leu 100 105 110 gtg atg aaa atg cgt gaa gac gcc ggc gat ttg gcg acc cgc agc gcc 384 Val Met Lys Met Arg Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala 115 120 125 aaa aat cac tat atg cgc att cgc ccc ttt gcg ttt tat aac gaa gcg 432 Lys Asn His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Asn Glu Ala 130 135 140 acc tgc cga ccg gac gaa gaa agc acc ctg tcg aag aac ggt tct tac 480 Thr Cys Arg Pro Asp Glu Glu Ser Thr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Tyr 145 150 155 160 cct tcc ggc cat acc acc atc ggc tgg gcg acc gcg ctg gtg ctg gct 528 Pro Ser Gly His Thr Thr Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala 165 170 175 gaa atc aac ccc gcc agg cag ggt gaa atc ctg cag cgc ggc tat gat 576 Glu Ile Asn Pro Ala Arg Gln Gly Glu Ile Leu Gln Arg Gly Tyr Asp 180 185 190 atg ggc caa agc cgg gtt atc tgc ggt tat cac tgg caa agc gac gtg 624 Met Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser Asp Val 195 200 205 act gcg gcg cgc atg gcg gcg tcg gcc atg gtg gcg cgt ttg cat gcc 672 Thr Ala Ala Arg Met Ala Ala Ser Ala Met Val Ala Arg Leu His Ala 210 215 220 gaa ccc acc ttc gcc gcc cag ctg caa aag gcc aaa gac gaa ttc aac 720 Glu Pro Thr Phe Ala Ala Gln Leu Gln Lys Ala Lys Asp Glu Phe Asn 225 230 235 240 ggc ctg aaa aag taa 735 Gly Leu Lys Lys

【０２０１】 <210> 24 <211> 244 <212> PRT <213> Morganella morganii <400> 24 Met Lys Lys Ile Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gln 1 5 10 15 Phe Ser Phe Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr His Pro Glu Val Tyr Phe 20 25 30 Leu Gln Glu Ser Gln Ser Ile Asp Ser Leu Ala Leu Leu Pro Pro Pro 35 40 45 Pro Ala Met Asp Ser Ile Asp Phe Leu Asn Asp Lys Ala Gln Tyr Asp 50 55 60 Ala Gly Lys Ile Val Arg Asn Thr Pro Arg Gly Lys Gln Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Asp Ala His Val Ala Gly Asp Gly Val Ala Ala Ala Phe Ser Asn Ala 85 90 95 Phe Gly Leu Glu Ile Ala Gln Arg Lys Thr Pro Glu Leu Phe Lys Leu 100 105 110 Val Met Lys Met Arg Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala 115 120 125 Lys Asn His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Asn Glu Ala 130 135 140 Thr Cys Arg Pro Asp Glu Glu Ser Thr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Tyr 145 150 155 160 Pro Ser Gly His Thr Thr Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala 165 170 175 Glu Ile Asn Pro Ala Arg Gln Gly Glu Ile Leu Gln Arg Gly Tyr Asp 180 185 190 Met Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser Asp Val 195 200 205 Thr Ala Ala Arg Met Ala Ala Ser Ala Met Val Ala Arg Leu His Ala 210 215 220 Glu Pro Thr Phe Ala Ala Gln Leu Gln Lys Ala Lys Asp Glu Phe Asn 225 230 235 240 Gly Leu Lys Lys

【図面の簡単な説明】

【図１】 モルガネラ・モルガニ由来の酵素を用いた反
応において反応pHと５′−イノシン酸生成量との関係を
示す図。

【図２】 エシェリヒア・ブラッタエ由来の酵素を用い
た反応において反応pHと５′−イノシン酸生成量との関
係を示す図。

【図３】 酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を
含むモルガネラ・モルガニの染色体ＤＮＡ断片の制限酵
素地図を示す図。

【図４】 モルガネラ・モルガニ由来の酸性フォスファ
ターゼ遺伝子保持株を用いた反応における５′−イノシ
ン酸の生産量を示す図。

【図５】 モルガネラ・モルガニ由来の野生型酸性フォ
スファターゼ遺伝子保持株及び変異型酸性フォスファタ
ーゼ遺伝子保持株を用いた反応における５′−イノシン
酸の生産量を示す図。

【図６】 酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を
含むエシェリヒア・ブラッタエの染色体ＤＮＡ断片の制
限酵素地図を示す図。

【図７】 エシェリヒア・ブラッタエ由来の酸性フォス
ファターゼ遺伝子保持株を用いた反応における５′−イ
ノシン酸の生産量を示す図。

【図８】 エシェリヒア・ブラッタエ由来の野生型酸性
フォスファターゼ遺伝子保持株及び変異型酸性フォスフ
ァターゼ遺伝子保持株を用いた反応における５−′イノ
シン酸の生産量を示す図。

【図９】 酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を
含むエンテロバクター・アエロゲネスの染色体ＤＮＡ断
片の制限酵素地図を示す図。

【図１０】 酸性フォスファターゼをコードする遺伝子
を含むクレブシエラ・プランティコラの染色体ＤＮＡ断
片の制限酵素地図を示す図。

【図１１】 酸性フォスファターゼをコードする遺伝子
を含むセラチア・フィカリアの染色体ＤＮＡ断片の制限
酵素地図を示す図。

【図１２】 モルガネラ・モルガニ、エシェリヒア・ブ
ラッタエ、プロビデンシア・スチュアルティ、エンテロ
バクター・アエロゲネス、クレブシエラ・プランティコ
ラ及びセラチア・フィカリアの酸性フォスファターゼ遺
伝子の塩基配列より予想される蛋白質のアミノ酸配列を
アミノ酸の一文字表記で示した図。これらのアミノ酸配
列は、各々配列表配列番号４、１１、１８、２０、２２
及び２４に３文字表記で示されている。図中ですべての
アミノ酸配列において共通のアミノ酸残基を配列の下に
＊で示した。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/16 (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 19/32 Ｃ１２Ｒ 1:02） (Ｃ１２Ｎ 9/16 (Ｃ１２Ｐ 19/32 Ｃ１２Ｒ 1:02） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 19/32 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ (72)発明者 浅野 泰久 富山県射水郡小杉町太閤山９−３−１− 321

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表配列番号４、１１、１８、２０、
   ２２又は２４に示されるアミノ酸配列、又はこれらのい
   ずれかのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミ
   ノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を含むアミノ酸配列を
   有し、かつ、配列番号４に示されるアミノ酸配列におい
   て７２番目のグリシン残基及び／又は１５１番目のイソ
   ロイシン残基の他のアミノ酸残基への置換に相当するア
   ミノ酸の置換を有し、燐酸エステル加水分解活性が低下
   し、フォスファターゼ活性を有する変異型酸性フォスフ
   ァターゼ。
2. 【請求項２】 前記変異が、配列表配列番号４に示され
   るアミノ酸配列においては７２番目のグリシン残基及び
   ／又は１５１番目のイソロイシン残基の他のアミノ酸残
   基への置換、配列表配列番号１１に示すアミノ酸配列に
   おいては７４番目のグリシン残基及び／又は１５３番目
   のイソロイシン残基の他のアミノ酸残基への置換、配列
   表配列番号１８、２０又は２２に示すアミノ酸配列にお
   いては９２番目のグリシン残基及び／又は１７１番目の
   イソロイシン残基の他のアミノ酸残基への置換、配列表
   配列番号２４に示すアミノ酸配列においては８８番目の
   グリシン残基及び／又は１６７番目のイソロイシン残基
   の他のアミノ酸残基の置換である請求項１記載の変異型
   酸性フォスファターゼ。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の酸性フォスファ
   ターゼをコードする遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項３記載の遺伝子を含む組換えＤＮ
   Ａ。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えＤＮＡを保有する
   微生物。