PL183293B1 - Sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, zmutowana kwaśna fosfataza, kwaśna fosfataza, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, gen kodujący kwaśną fosfatazę, zrekombinowany DNA oraz nowy szczep E.coli - Google Patents

Sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, zmutowana kwaśna fosfataza, kwaśna fosfataza, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, gen kodujący kwaśną fosfatazę, zrekombinowany DNA oraz nowy szczep E.coli

Info

Publication number
PL183293B1
PL183293B1 PL96323493A PL32349396A PL183293B1 PL 183293 B1 PL183293 B1 PL 183293B1 PL 96323493 A PL96323493 A PL 96323493A PL 32349396 A PL32349396 A PL 32349396A PL 183293 B1 PL183293 B1 PL 183293B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
sequence
amino acid
acid
ala
acid phosphatase
Prior art date
Application number
PL96323493A
Other languages
English (en)
Other versions
PL323493A1 (en
Inventor
Yasuhiro Mihara
Takashi Utagawa
Hideaki Yamada
Yasuhisa Asano
Original Assignee
Ajinomoto Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Kk filed Critical Ajinomoto Kk
Publication of PL323493A1 publication Critical patent/PL323493A1/xx
Publication of PL183293B1 publication Critical patent/PL183293B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

12P 19/32 Sposób wytwarzania 5’- fosforanowego estru nukleozydy zmutowana kwasna fosfataza, kwasna fosfataza, gen kodujacy zmutowana kwasna fosfataze, gen kodujacy kwasna fosfataze, zrekombinowany DNA oraz nowy szczep E. coli ( 30) Pierwszenstwo: 25.05.1995,JP,7-149781 26.03.1996, JP,8-094680 ( 43) Zgloszenie ogloszono: 30.03.1998 BUP 07/98 ( 45) O udzieleniu patentu ogloszono: 28.06.2002 WUP 06/02 ( 73) Uprawniony z patentu: AJINOMOTO CO., INC., Tokyo, JP Twórcy wynalazku: Yasuhiro Mihara, Kanagawa, JP Takashi Utagawa, Kanagawa, JP Hideaki Yamada, Kyoto, JP Yasuhisa Asano, Toyama, JP ( 7 4 ) Pelnomocnik: Kulikowska Wanda, KULIKOWSKA & KULIKOWSKI 1. Sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, znamienny tym, ze nukleozyd poddaje sie dzialaniu kwasnej fosfatazy i donora g ru py fosforanowej wybranego z grupy obejmujacej kwas polifosforowy lub jego sól, kwas fenylofosforowy lub jego sól i karbamoilofosforan lub jego sól przy pH od 3,0 do 5,5 i wydzie- la sie 5'-fosforanowy ester nukleozydu. 7. Zmutowana kwasna fosfataza obejmujaca sekwencje aminokwasowa zasadniczo identyczna z sek- w encja am inokw asow a nr 4 w Liscie Sekwencji, posiadajaca mutacje obnizajaca jej aktywnosc fosfo- monoesterazy, wybrana sposród grupy obejmujacej podstawienia reszt aminokwasowych odpowiadajace podsta- wieniu(om) reszty glicyny w pozycj i 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liscie Sekwencji. 10. Kwasna fosfataza obejmujaca sekwencje aminokwasowa nr 11 w Liscie Sekw encji. 12. Gen kodujacy zmutowana kwasna fosfataze obejmujaca sekwencje aminokwasowa zasadniczo iden- tyczna z sekwencja aminokwasowa nr 4 w Liscie Sekwencji, posiadajaca mutacje obnizajaca jej aktywnosc fosfomonoesterazy, wybrana sposród grupy obejmujacej podstawienia reszty aminokwasowej odpowiadajace podstawieniu(om) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w se- kwencji nr 4 w Liscie Sekwencji. 15. Gen kodujacy kwasna fosfataze obejmujaca sekwencje nr 11 w Liscie Sekwencji. 17. Zrekombinowany DNA obejmujacy gen kodujacy zmutowana kw asna fosfataze obejmujacasekwen- cje aminokwasowa zasadniczo identyczna z sekwencja aminokwasowa nr 4 w Liscie Sekwencji, posiadajaca mutacje obnizajaca jej aktywnosc fosfomonoesterazy, wybrana sposród grupy obejmujacej podstawienia reszt aminokwasowych odpowiadajace podstawieniu(om) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozy- cji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liscie Sekwencji. 22. Escherichia coli AJ 13143 (FERM BP-5422). 23. Escherichia coli A J13144 (FERM BP-5423). PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, zmutowana kwaśna fosfataza, kwaśna fosfataza, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, gen kodujący kwaśną fosfatazę, zrekombinowany DNA oraz nowy szczep E.coli. 5'-Fosforanowy ester nukleozydu jest użyteczny jako materiał wzbogacający, materiał farmaceutyczny i surowiec do ich wytwarzania.
Znane są metody biochemicznej fosforylacji nukleozydu w wyniku której powstaje 5'-fosforanowy ester nukleozydu przy zastosowaniu poniżej wymienionych donorów grup fosforanowych; obejmująone metodę wykorzystującąkwas p-nitrofenyfosforowy (publikacja japońskiego opisu patentowego numer 39-29858), metodę wykorzystującąnieorganiczny kwas fosforanowy (publikacja japońskiego opisu patentowego numer 42-1186), metodę wykorzystującąkwas polifosforowy (japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 53-56390), metodę wykorzystującą kwas acetylofosforowy (japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 56-82098) oraz metodę wykorzystującą trifosforan adenozyny (ATP) (japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 63-230094). Jednakże, metody te nie są zadawalające do wydajnego i taniego wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, ponieważ stosowane substraty są kosztowne, lub ponieważ w reakcji wytwarzane są produkty uboczne.
A zatem, autorzy niniejszego wynalazku opracowali metodę wydajnego wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu bez ubocznego wytwarzania izomerów 2'-, 3'-nukleotydów przez umożliwienie komórkom określonego mikroorganizmu działanie w warunkach kwaśnych na nukleozyd i donor grupy fosforanowej wybranej z grupy składającej się z kwasu polifosforowego lub jego soli, kwasu fenylofosforowego lub jego soli oraz karbamoilofosforanu lub jego soli (japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 7-231793).
Jednakże, nawet ta metoda posiada następujące wady. Mianowicie, na przykład, część substratu ulega degradacji podczas reakcji w wyniku aktywności degradującej nukleozydy, która niestety występuje w niewielkiej ilości w komórkach mikroorganizmu przeznaczonego do stosowania. Ponadto, w miarę trwania reakcj i wytwarzany i akumulowany 5'-fosforanowy ester nukleozydu jest degradowany. Dlatego też, w roztworze reakcyjnym wytwarzane są produkty uboczne, i niemożliwe było otrzymanie dostatecznej wydajności. Ponadto, reakcji nie można prowadzić, jeśli substrat dodaje się w wysokim stężeniu, z powodu niskiej aktywności transfosforylacji na komórkę mikroorganizmu.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zapewnienie metody taniego i wydajnego wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu. Innym przedmiotem wynalazku jest zapewnienie enzymu, genu kodującego enzym, zrekombinowanego DNA obejmującego gen i mikroorganizmu zawierającego zrekombinowany DNA, które są użyteczne w metodzie wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu.
W wyniku różnych badań wykonanych przez autorów niniejszego wynalazku w celu opracowania metody wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, która jest wydajniejsza od metod konwencjonalnych, stwierdzono, że 5'-fosforanowy ester nukleozydu może być skutecznie wytwarzany z wysoką wydajnością dzięki umożliwieniu kwaśnej fosfatazie, oczyszczonej z wolnego od komórek ekstraktu mikroorganizmu, działania w warunkach pH 3,0 do 5,5 na nukleozyd i donor grupy fosforanowej wybrany z grupy składającej się z kwasu polifosforowego lub jego soli, kwasu fenylofosforowego lub jego soli oraz karbamoilofosforanu lub jego soli. Ponadto autorom niniejszego wynalazku udało się otrzymać z różnych bakterii geny typu dzikiego kodujące kwaśne fosfatazy oraz z bakterii należącej do rodzaju Morgcmella i z bakterii należącej do rodzaju Escherichia geny kodujące kwaśne fosfatazy o obniżonych aktywnościach fosfomonoesterazy. Poza tym autorzy niniejszego wynalazku stwierdzili, że wydajność wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu wyraźnie poprawia się w wyniku prowadzenia na wysokim poziomie ekspresj i genu, zgodnie z technikami inżynierii genetycznej. A zatem cel niniejszego wynalazku został zrealizowany.
Mianowicie, niniejszy wynalazek zapewnia metodę wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, obejmującą etapy umożliwienia kwaśnej fosfatazie, i korzystnie kwaśnej fosfatazie o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy, działania w warunkach pH 3,0 do 5,5 na nukleozyd
183 293 i donor grupy fosforanowej wybrany z grupy składającej się z kwasu polifosforowego lub jego soli, kwasu fenylofosforowego lub jego soli, oraz karbamoilofosforanu lub jego soli z utworzeniem 5'-fosforanowego estru nukleozydu, oraz metodę jego zbierania.
W innym aspekcie, niniejszy wynalazek zapewnia zmutowane kwaśne fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy, geny kodujące kwaśne fosfatazy, zrekombinowane DNA obejmujące geny i mikroorganizmy zawierające zrekombinowany DNA.
W jeszcze innym aspekcie, niniejszy wynalazek zapewnia nowe kwaśne fosfatazy pochodzące z bakterii należących do rodzajów Escherichia, Enterobacter, Klebsiella lub Serratia, geny kodujące kwaśne fosfatazy, zrekombinowane DNA obejmujące geny i mikroorganizmy posiadające zrekombinowany DNA.
Niniejszy wynalazek będzie szczegółowo wyjaśniony poniżej.
< 1 > Przygotowywanie kwaśnej fosfatazy
Rodzaj kwaśnej fosfatazy stosowanej w niniejszym wynalazku nie jest szczególnie ograniczony, pod warunkiem, że katalizuje ona reakcję wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu przez przeniesienie grupy fosforanowej z donora, wybranego z grupy składającej się z kwasu polifosforowego lub jego soli, kwasu fenylofosforowego lub jego soli oraz karbamoilofosforanu lub jego soli, do nukleozydu w warunkach pH 3,0 do 5,5. Taka kwaśna fosfataza obejmuje korzystnie fosfazy pochodzące z mikroorganizmów. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, niniejszy wynalazek wykorzystuje enzymy pochodzące z bakterii należącej do rodzaju Morganella, Escherichia, Providencia, Enterobacter, Klebsiella lub Serratia. Reprezentatywne przykłady takiej bakterii obejmują następujące szczepy bakteryjne.
Morganella morganii NCIMB 10466
Morganella morganii IFO 3168
Morganella morganii IFO 3848
Escherichia blattae JCM 1650
Escherichia blattae ATCC 33429
Escherichia blattae ATCC 33430
Providencia stuartii ATCC 29851
Providencia stuartii ATCC 33672
Enterobacter aerogenes IFO 12010
Enterobacter aerogenes IFO 13534
Klebsiella planticola IFO 14939
Klebsiellaplanticola IAM 1133
Serratiaficaria IAM 13540
Serratia marcescens IAM 12143
Należy zauważyć, że kwaśna fosfataza (EC 3.1.3.2) jest oryginalnie enzymem, który katalizuje reakcję, w kwaśnych warunkach, do hydrolizy estru fosforanowego i posiada aktywność nukleozydazy do degradacji 5'-fosforanowego estru nukleozydu utworzonego w wyniku reakcji transfosforylacji (dalej w niniejszym opisie, aktywność nukleozydazy określa się jako „aktywność fosfomonoesterazy”). Nawet taką kwaśną fosfatazę można stosować w metodzie wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu według niniejszego wynalazku. Jednakże, w celu otrzymania 5'-fosforanowego estru nukleozydu z wysoką wydajnością pożądane jest stosowanie zmutowanej kwaśnej fosfatazy (dalej w niniejszym opisie określanej po prostujako „zmutowana kwaśna fosfataza”, jeśli to konieczne), której aktywność fosfomonoesterazy jest obniżona w porównaniu z kwaśną fosfatazą typu dzikiego, wytwarzaną przez bakterie opisane powyżej.
Zmutowaną kwaśną fosfatazę otrzymuje się przez ekspresję zmutowanego genu uzyskanego przez bezpośrednie mutowanie genu kodującego kwaśną fosfatazę w sposób opisany poniżej. Alternatywnie, zmutowaną kwaśną fosfatazę można otrzymać także przez traktowanie mikroorganizmu wytwarzającego kwaśną fosfatazę napromieniowaniem światłem ultrafioletowym lub czynnikiem mutagennym stosowanym zazwyczaj do otrzymywania sztucznych mutacji, takim jakN-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (NTG), i hodowanie zmutowanego mikroorganizmu w celu wytworzenia zmutowanej kwaśnej fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy.
183 293
Białko wykazujące aktywność kwaśnej fosfatazy można otrzymać z mikroorganizmów, jak opisane powyżej, przez hodowanie wykazującego aktywność szczepu mikroorganizmu w odpowiednim podłożu, zbieranie namnożonych komórek mikroorganizmu, rozbijanie komórek mikroorganizmu w celu przygotowania wolnego od komórek ekstraktu i dostateczne oczyszczenie z niego białka.
Podłoże do hodowli mikroorganizmu nie podlega szczególnym ograniczeniom, odpowiednie może byś zwykłe podłoże zawierające zwykłe źródło węgla, źródło azotu, jony nieorganiczne i ewentualnie źródło organicznych substancji odżywczych. Odpowiednie do użycia źródło węgla obejmuje, na przykład, cukry takie jak glukoza i sacharoza, alkohole takie jak glicerol i kwasy organiczne. Stosowane źródła azotu obejmują na przykład, amoniak gazowy, wodny roztwór amoniaku i sole amoniowe. Jony nieorganiczne odpowiednie do stosowania jeśli jest to konieczne obejmują na przykład, jon magnezowy, jon fosforanowy, jon potasowy, jon żelazowy i jon manganowy. Odpowiednie do stosowania źródło organicznych substancji odżywczych obejmuje, na przykład, witaminy i aminokwasy, jak również źródła zawierająceje, takie jak ekstrakt drożdżowy, pepton ekstrakt mięsny, namok kukurydziany, hydrolizat kazeiny i hydrolizat soi. Warunki hodowli również nie podlegają szczególnym ograniczeniom. Mikroorganizm można hodować, na przykład, w warunkach tlenowych w ciągu około 12 do 48 godzin, odpowiednio utrzymując pH i temperaturą w zakresie, pH od 5 do 8 i temperaturę od 25 do 40°C.
Namnożone komórki bakteryjne można zbierać z hodowli płynnej przez, na przykład, wirowanie. Z zebranych komórek bakteryjnych przygotowuje się wolny od komórek ekstrakt stosując zwykłą metodę. Mianowicie, wolny od komórek ekstrakt otrzymuje się przez rozbicie komórek bakteryjnych taką metodą jak poddawanie działaniu ultradźwięków, młynek Dyno, prasa Frencha i usunięcie pozostałości komórek przez wirowanie.
Kwaśną fosfatazę oczyszcza się z wolnego od komórek ekstraktu przez zastosowanie połączenia technik zazwyczaj stosowanych do oczyszczania enzymów, takich jak frakcjonowanie siarczanem amonu, chromatografia jonowymienna, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, chromatografia powinowactwa, chromatografia sączenia molekularnego i oczyszczanie izoelektryczne. Jeśli chodzi o wytrącanie, nie jest koniecznie nieodzowne całkowite oczyszczenie kwaśnej fosfatazy. Wystarczające jest usunięcie takich zanieczyszczeń, jak enzym uczestniczący w degradacji nukleozydu jako substratu.
< 2 > Przygotowywanie genu kwaśnej fosfatazy
Fragment DNA, który zawiera strukturalny gen kodujący białko posiadające aktywność kwaśnej fosfatazy, można sklonować wychodząc z, na przykład, komórek mikroorganizmu posiadającego aktywność enzymu. Metody klonowania obejmują na przykład, metodę, w której bibliotekę ekspresyjną genów chromosomalnych przeszukuje się jako wskaźnik wykorzystując aktywność enzymu, metodę, w której przygotowuje się przeciwciało skierowane przeciw białku do przeszukiwania biblioteki ekspresyjnej genów chromosomalnych, oraz metodę, w której analizuje się sekwencję aminokwasową takąjak N-końcowa sekwencja oczyszczonego białka, na podstawie której przygotowuje się sondę do przeszukiwania biblioteki genów.
W szczególności, gen kodujący kwaśną fosfatazę opisanych powyżej Morganella morgami, Escherichia blattae, Providencia siuartii, Enterobacter aerogens, Klebsiella planticola, Serratiaficaria lub Serratia marcescens można sklonować przez przygotowanie ekspresyjnej biblioteki genów chromosomalnych każdego z mikroorganizmów i przeszukanie biblioteki przez wykorzystanie aktywności fosfatazy jako wskaźnika.
Mianowicie, ekspresyjną bibliotekę genów chromosomalnych można przygotować przez przygotowanie najpierw chromosomalnego DNA z powyższych bakterii, jego częściową degradację odpowiednim enzymem restrykcyjnym, a następnie jego ligację z wektorem zdolnym do autonomicznej replikacji w Escherichia coli i stransformowanie Escherichia coli otrzymanym zrekombinowanym DNA. Do trawienia chromosomalnego DNA można stosować szeroki zakres enzymów restrykcyjnych, dostosowując czas reakcji trawienia do wymaganego stopnia trawienia. Do klonowania genu można zastosować każdy wektor, z zastrzeżeniem, że jest on zdol
183 293 ny do autonomicznej replikacji w Escherichia coli. Na przykład, można zastosować pUC19, pUC118, pHSG298, pBR322 i pBluescript II.
Wektor można zligować z fragmentem DNA zawierającym gen kodujący kwaśną fosfatazę w celu przygotowania zrekombinowanego DNA przez uprzednie strawienie wektora tym samym enzymem restrykcyjnym, jak zastosowany do trawienia chromosomalnego DNA, lub enzymem restrykcyjnym, który tworzy w wyniku rozszczepienia koniec komplementarny do końca fragmentu DNA chromosomalnego, oraz jego ligację z fragmentem DNA przy zastosowaniu ligazy, takiej jak ligaza DNA T4. Jako biorcę przygotowanego zrekombinowanego DNA można zastosować jakikolwiek szczep mikroorganizmu, pod warunkiem, że jest on odpowiedni do ligacji wektora. Można zastosować, na przykład, taki szczep mikroorganizmu, jak Escherichia coli HB101, JM109 i DH5.
Tak otrzymane transformanty hoduje się na podłożu agarowym dla utworzenia ich kolonii. Następnie, gdy na powierzchnię podłoża wylewa się roztwór reakcyjny zawierający kwas p-nitrofenylofosforowy w celu przeprowadzenia reakcji, szczep, w którym zachodzi ekspresja aktywności fosfatazy, uwalnia p-nitrofenol i wykazuje barwę żółtą. Transformanta, który zawiera fragment DNA obejmujący gen kodujący stanowiącą przedmiot wynalazku kwaśną fosfatazę, można wyselekscjonować przez przeprowadzenie opisanej powyżej reakcji w warunkach kwaśnych i wybór transformanta przy wykorzystaniu jako wskaźnika powstawania zabarwienia.
Następnie z wyselekcjonowanego transformanta odzyskuje się DNA w celu analizy struktury zligowanego z wektorem fragmentu DNA zawierającego gen kodujący kwaśną fosfatazę. Sekwencję nukleotydową genu kodującego kwaśną fosfatazę przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 w Liście Sekwencji w przypadku genu pochodzącego z Morganella morganii NCIMB 10466, w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 9 w Liście Sekwencji w przypadku genu pochodzącego z Escherichia blattae JCM 1650, w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 17 w Liście Sekwencji w przypadku genu pochodzącego z Providencia stuartii ATCC 29851, w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 19 w Liście Sekwencji w przypadku genu pochodzącego z Enterobacter aerogens IFO 12010, w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 21 w Liście Sekwencji w przypadku genu pochodzącego z Klebsiellaplanticola IFO 14939, lub w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 23 w Liście Sekwencji w przypadku genu pochodzącego z Serratia ficaria IAM 13540.
Przewidywane sekwencje aminowkasowe kwaśnych fosfataz kodowanych przez powyższe geny przedstawiono w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 4, 11, 18, 20, 22 i 24. Kwaśne fosfatazy kodowane przez powyższe geny korzystnie stosuje się dla celów niniejszego wynalazku. Ponadto, kwaśną fosfatazę obejmującą sekwencję aminokwasową, która jest zasadniczo identyczna z sekwencjąaminokwasowąktórejkolwiek z fosfataz kodowanych przez powyższe geny również korzystnie stosuje się dla celów niniejszego wynalazku. Termin „zasadniczo identyczna” oznacza, że sekwencje aminowkasowe kwaśnych fosfataz mogą posiadać podstawienie, delecję, insercję lub tranzycję jednego lub wielu reszt aminokwasowych, nie tracąc przy tym aktywności wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu (dalej w niniejszym opisie określanej jako „aktywność transfosforylacyjna”).
< 3 > Przygotowywanie genu kodującego zmutowaną kwaśną fosfatazę
Otrzymana jak opisano powyżej kwaśna fosfataza typu dzikiego posiada aktywność fosfomonoesterazy. Dlatego też, aktywność fosfomonoesterazy może służyć jako czynnik powodujący towarzyszącą degradację produktu w miarę czasu trwania reakcji wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukloezydu, wynikiem czego staje się obniżenie wydajności reakcji. W celu pokonania tej niedogodności, korzystne jest wywołanie sztucznej mutacji genu kodującego kwaśną fosfatazę, tak aby obniżyć aktywność fosfomonoesterazy.
Metody ukierunkowanej mutagenezy wywoływania zamierzonej mutacji w zamierzonym miejscu DNA obejmują, na przykład metodę stosowania PCR (Higuchi, R., 61, wPCR Technology (Erlich, H.A.,red. Stockton press (1989); Carter, P., Meth. inEnzymol., 154, 382 (1987)) i metodę stosowani fagów (Kramer, W. i Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154,350 (1987); Kunkel, T.A. i in. Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)).
183 293
Przykładami zmutowanej kwaśnej fosfatazy posiadającej obniżoną aktywność fosfomonoesterazy jest kwaśna fosfataza obejmująca sekwencję aminokwasową która jest zasądniczo identyczna z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji przedstawionych w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 4, 11, 18, 20, 22 i 24 w Liście Sekwencji, i posiada mutację, która obniża aktywność fosfomonoesterazy kwaśnej fosfatazy typu dzikiego. Konkretnie, przykładem zmutowanej kwaśnej fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy dla enzymu pochodzącego z Morganella morganii NCIMB 10466 jest enzym, w którym resztą glicyny w pozycji 72 i/lub resztę izoleucyny w pozycji 151 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 w Liście Sekwencji podstawiono innąresztą aminokwasową. W opisanych poniżej przykładach, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę przedstawiono jako przykład, w którym resztę glicyny w pozycji 72 podstawia się resztą kwasu asparaginowego, a resztę izoleucyny w pozycji 151 podstawia się resztą treoniny. Z drugiej strony, przykładem kwaśnej fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy dla enzymu pochodzącego z Escherichia blattae JCM 1650 jest enzym, w którym resztę glicyny w pozycji 74 i/lub resztę izoleucyny w pozycji 153 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11 w Liście Sekwencji podstawiono innąresztąaminokwasową. W opisanych poniżej przykładach, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę przedstawiono jako przykład, w którym resztę glicyny w pozycji 74 podstawia się resztą kwasu asparaginowego, a resztę izoleucyny w pozycji 153 podstawia się resztą treoniny.
Zatem, w określonym miejscu genu typu dzikiego można podstawić nukleotyd, zgodnie z opisanymi powyżej metodami ukierunkowanej mutagenezy, tak że kodowana jest zmutowana kwaśna fosfataza. Pożądane jest, aby mutacja obniżająca aktywność fosfomonoesterazy była takiego rodzaju mutacją aby aktywność wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu nie ulega zasadniczemu obniżeniu w porównaniu z kwaśną fosfatazą typu dzikiego. Jednakże, nawet w przypadku obniżenia aktywności wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, wystarczające będzie, jeśli stopień obniżenia aktywności fosfomonoesterazy będzie większy niż stopień obniżenia aktywności wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, w wyniku czego stosunek aktywności fosfomonoesterazy do aktywności wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydowego zmutowanej kwaśnej fosfatazy jest obniżony w porównaniu z kwaśną fosfatazą typu dzikiego. Jeśli chodzi o stopień obniżenia aktywności fosfomonoesterazy, aktywność tą można obniżyć do mniej niż około 40% aktywności enzymu typu dzikiego. Jak przedstawiono poniżej w rozwiązaniach, sekwencja amino kwasowa kwaśnej fosfatazy Escherichia blattae JCM 1650jest w wysokim stopniu homologiczna do tej sekwencji Morganella morgamiNCIMB 10466, a reszta glicyny w pozycji 72 i reszta izoleucyny w pozycji 151 w sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 odpowiadają odpowiednio reszcie glicyny w pozycji 74 i reszcie izoleucyny w pozycji 153 w sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11. Ponadto, pozaEscherichia blattae JCM 1650, sekwencje aminowkasowe kwaśnych fosfataz pochodzących z takich mikroorganizmów, jak Providencia stuartii ATCC 29851, Enterobacter aerogenes IFO 12010, Klebsiella planticola\FQ 14939 iSerratiaficaria\MA 13450, wykazująwysokistopieńhomologiiztąsekMorganella morganii NCIMB 10466, a sekwencje aminokwasowe tych kwaśnych fosfataz obejmują reszty aminokwasowe odpowiadające reszcie glicyny w pozycji 72 i reszcie izoleucyny w pozycji 151 w sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4. Dlatego też, geny kodujące zmutowane kwaśne fosfatazy pochodzące z tych mikroorganizmów można otrzymać w opisany powyżej sposób. Reszta glicyny w pozycji 92 i reszta izoleucyny w pozycji 171 sekwencji aminokwasowej kwaśnej fosfatazy pochodzącej zProvidenciastuartii ATCC29851,Enterobacter aerogenesIFO 12010 lubKlebsiellaplanticola IFO 14939, przedstawionych w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 18, 20 lub 20, oraz reszta glicyny w pozycji 88 i reszta izoleucyny w pozycji 167 sekwencji aminokwasowej kwaśnej fosfatazy pochodzącej zSerratiaficaria IAM 13450, przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 24, odpowiadają odpowiednio reszcie glicyny w pozycji 72 i reszcie
183 293 izoleucyny w pozycji 151 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4.
< 4> Wprowadzanie genu kwaśnej fosfatazy do gospodarza
Zrekombinowany mikroorganizm przeznaczony do prowadzenia na wysokim poziomie ekspresji aktywności kwaśnej fosfatazy można otrzymać przez wprowadzenie do komórek gospodarza fragmentu DNA, uzyskanego jak opisano powyżej, obejmującego gen kodujący białko posiadające aktywność kwaśnej fosfatazy, po ponownym zrekombinowaniu fragmentu DNA z odpowiednim wektorem. Stosując taką procedurę, prowadzi się ekspresję kwaśnej fosfatazy typu dzikiego przy wykorzystaniu genu kwaśnej fosfatazy typu dzikiego, podczas gdy ekspresję zmutowanej kwaśnej fosfatazy prowadzi się przy wykorzystaniu genu kodującego zmutowaną kwaśną fosfatazę.
Gospodarz obejmuje takie szczepy mikroorganizmów, jak opisane powyżej Escherichia coli HB101, JM 109 i DH5. Poza tymi szczepami, jako gospodarza można wykorzystać każdą bakterię, pod warunkiem, że miejsce początku replikacji skonstruowanego zrekombinowanego DNA i gen kwaśnej fosfatazy spełniająswoje funkcje, zrekombinowany DNA jest zdolny do replikacji i gen kwaśnej fosfatazy jest zdolny do ekspresji. Jednym z najkorzystniejszych gospodarzy jest Escherichia coli JM 109.
Wektor wprowadzania do niego genu kodującego kwaśną fosfatazę nie podlega szczególnym ograniczeniom, pod warunkiem, że jest zdolny do replikacji w gospodarzu. Jeśli jako gospodarza stosuje się Escherichia coli, przykładami wektora mogą być plazmidy ulegające w bakterii autonomicznej replikacji. Można na przykład stosować plazmidy typu ColEl, plazmidy typu pl5A, plazmidy typu czynnika R i plazmidy typu fagowego. Plazmidy takie w szczególności obejmują na przykład, pBR322 (Gene, 2, 95 (1977)), pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)), pUC119 (Methods in Enzymology, 153, 3 (1987)), pACYel84 (J. Bacteriol. 134,1141 (1978)) i pSCIOl (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70, 3240 (1973)).
Jeśli fragment DNA obejmujący gen kodujący kwaśną fosfatazę obejmuje promotor, który jest zdolny do działania w gospodarzu, to fragment DNA można zligować z wektorem w takiej postaci. Jeśli fragment DNA nie obejmuje takiego promotora, w pozycji przed genem można zligować inny promotor, który działa w mikroorganizmie gospodarza, taki jak lac, trp i PL. Nawet jeśli fragment DNA obejmuje promotor, to promotor ten można podstawić innym promotorem dla uzyskania wydajnej ekspresji genu kodującego kwaśną fosfatazę.
Nie występują szczególne ograniczenia metody wprowadzania do gospodarza zrekombinowanego DNA skonstruowanego przez ligację wektora z fragmentem DNA obejmującym gen kodujący kwaśną fosfatazę. Zrekombinowany DNA można wprowadzać do gospodarza stosując zwykłąmetodę. Jeśli jako gospodarza stosuje się Escherichia coli, można stosować na przykład metodę z wykorzystaniem chlorku wapniowego (J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), metodę Hanahana (J. Mol. Biol., 166,557 (1983), metodę SEM (Gene, 96,23 (1990)), metodę Chunga i in., (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 2172 (1989)) i elektroporację (Nucleic AcidsR.es., 16, 6127 (1988)).
Gen kwaśnej fosfatazy można wstawić do DNA wektora zdolnego do autonomicznej replikacji, który można wprowadzić do gospodarza, tak, że gospodarz będzie go posiadał w postaci pozachromosomalnego DNA, jak opisano powyżej. Alternatywnie, gen kwaśnej fosfatazy można wprowadzać do chromosomu mikroorganizmu gospodarza zgodnie z metodą która wykorzystuje transdukcję, ta.mspozon(Biotechnol., 1,417 (1983)), fagaMu (japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 2-109985) lub rekomibnację homologiczną(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)).
< 5 > Ekspresja genu kwaśnej fosfatazy przez zrekombinowany mikroorganizm
Otrzymany w opisany powyżej sposób transformant, do którego wprowadzono zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący kwaśną fosfatazę, jest zdolny do ekspresji aktywności kwaśnej fosfatazy na wysokim poziomie w swoich komórkach, co można osiągnąć przez jego hodowlę w odpowiednim podłożu, zawierającym źródło węgla, źródło azotu, jony nieorganiczne i ewentualnie źródło organicznych substancji odżywczych. Odpowiednie do użycia źródło
183 293 obejmuje, na przykład, cukry, takie jak glukoza, alkohole, takie jak glicerol, i kwasy organiczne. Stosowane źródła azotu obejmują na przykład, amoniak gazowy, wodny roztwór amoniaku i sole amoniowe. Jony nieorganiczne odpowiednie do stosowania, jeśli jest to konieczne, obejmuj ą na przykład, j on magnezowy, j on fosforanowy, j on potasowy, j on żelazowy i j on manganowy. Odpowiednie do stosowania źródło organicznych substancji odżywczych obejmuje, na przykład, witaminy i aminokwasy, jak również źródła zawierające je, takie jak ekstrakt drożdżowy, pepton, ekstrakt mięsny, namok kukurydziany, hydrolizat kazeiny i hydrolizat soi. Poziom ekspresji aktywności kwaśnej fosfatazy można zwiększyć przez dodanie do podłoża zależnego od promotora czynnika indukującego ekspresję, takiego jak IPTG (izopropylo-3-D-tiogalaktopiranozydu).
Warunki hodowli również nie podlegają szczególnym ograniczeniom. Hodowlę można prowadzić, na przykład, w warunkach tlenowych w ciągu około 12 do 48 godzin, utrzymując pH i temperaturę odpowiednio w zakresie pH od 5 do 8 i temperaturę od 25 do 40°C.
Następnie komórki mikroorganizmu zbiera się z hodowli i otrzymuje się ekstrakt wolny od komórek przez ich rozbicie, z którego można oczyścić kwaśną fosfatazę. Oczyszczanie prowadzi się stosując odpowiednie połączenie technik zazwyczaj stosowanych do oczyszczania enzymów, takich jak te opisane w uprzednio przedstawionym punkcie < 1 >. Frakcjonowanie siarczanem amonu, chromatografia jonowymienna, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, chromatografia powinowactwa, chromatografia sączenia molekularnego i oczyszczanie izoelektryczne. Jeśli chodzi o oczyszczanie, nie jest koniecznie nieodzowne całkowite oczyszczenie kwaśnej fosfatazy. Wystarczające jest uzyskanie usunięcia takich zanieczyszczeń, jak enzym uczestniczący w degradacji nukleozydu jako substratu.
< 6 > Wytwarzanie 5'-fosforanowego estru nukleozydu
5'-Fosforanowy ester nukleozydu można wytwarzać w mieszaninie reakcyjnej przez umożliwienie kwaśnej fosfatazie, otrzymanej jak opisano w punkcie < 1 >, lub kwaśnej fosfatazie typu dzikiego bądź zmutowanej kwaśnej fosfatazie otrzymanej w dużej ilości przez ekspresję genu zgodnie z techniką inżynierii genetycznej, jak opisano w punkcie < 5 >, kontaktu i powodowania reakcji nukleozydu z donorem grupy fosforanowej wybranym z grupy składającej się z kwasu polifosforowego i jego soli, kwasu fenylofosforowego i jego soli oraz karbamoilofosforanu i jego soli. W celu uzyskania w tej reakcji wysokiej produktywności, ważne jest doprowadzenie pH roztworu reakcyjnego do lekko kwaśnego w zakresie 3,0 do 5,5.
Jeśli prowadzi się ekspresję genu kodującego kwaśną fosfatazę w dużej ilości stosując techniki inżynierii genetycznej, szczególnie jeśli prowadzi się ekspresję w dużej ilości genu kodującego zmutowaną kwaśną fosfatazę o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy, to możliwe jest wydajne i tanie wytwarzanie 5'-fosforanowego estru nukleozydu przy zastosowaniu hodowli zawierającej komórki mikroorganizmu transformanta, komórek mikroorganizmu oddzielonych i zebranych z hodowli lub produktu otrzymanego z komórek mikroorganizmu uzyskanego, na przykład, przez immobilizację, traktowanie acetonem lub liofilizację, zamiast oczyszczonej kwaśnej fosfatazy.
Stosowane nukleozydy obejmują na przykład, nukleozydy purynowe, takie jak inozyna, guanozyna, adenozyna, ksantozyna, rybonukleozyd purynowy, rybonukleozyd 6-metoksypurynowy, rybonukleozyd 2,6-diaminopurynowy, rybonukleozyd 6-fluoropurynowy, rybonukleozyd 6-tiopurynowy, rybonukleozyd 2-amino-6-tiopurynowy i merkaptoguanozyna; oraz nukleozydy pirymidynowe, takie jakury dyna, cytydyna, 5-aminourydyna, 5-hydroksyurydyna, 5-bromourydyna i 6-azaurydyna. W wyniku reakcji, te nukleozydy typu naturalnego i nukleozydy typu nienaturalnego ulegają specyficznej fosforylacji w ich pozycjach 5' i wytwarzane są odpowiednio odpowiadające 5'-fosforanowe estry nukleozydów.
Pożądane jest dodawanie nukleozydu do roztworu reakcyjnego w stężeniu 1 do 20 g/dl. W przypadku stosowania nukleozydu, który jest słabo rozpuszczalny w wodzie, wydajność reakcji można poprawić przez dodanie kwasu borowego lub środka powierzchniowo czynnego, takiego jak dimetylosulfotlenek.
183 293
Odnośnie stosowanego donora grupy fosforanowej, donory nadające się do stosowaniajak kwas polifosforowy lub jego sole, obejmują na przykład, kwas pirofosforowy, kwas tripolifosforowy, kwas trimetafosforowy, kwas tetrametafosforowy, kwas heksametafosforowy, ich mieszaniny, ich sole sodowe, ich sole potasowe oraz mieszaniny tych soli. Donory nadające się do stosowaniajak kwas fenylofosforowy i jego sole, obejmują na przykład, fenylofosforan disodowy, fenylofosforan dipotasowy, bezwodnik kwasu O,O-difenylofosforowego i ich mieszaniny. Donory nadające się do stosowaniajak karbamoilofosforan lub jego sole, obejmuje, na przykład, karbamoilofosforan disodowy, karbamoilofosforan dipotasowy, karbamoilofosforan diamonowy, karbamoilofosforan dilitowy i ich mieszaniny. Stężenie, w którym stosuje się donor grup fosforanowych, zdeterminowane jest przez stężenie nukleozydujako akceptora grup fosforanowych. Donor grup fosforanowych stosuje się zazwyczaj w ilości 1 do 5 razy ilości nukleozydu.
Korzystny wynik otrzymuje się w reakcji zazwyczaj w temperaturze 20 do 60°C, korzystnie 30 do 40°C, w pH lekko kwaśnym 3,5 do 6,5, korzystnie 4,0 do 5,0. Reakcję można prowadzić stosując którąkolwiek z metod stacjonarnych i metod wytrząsania. Czas reakcji zależy od takich warunków, jak aktywność stosowanego enzymu i stężenie substratu, jest to jednakże od 1 do 100 godzin.
Tak wytworzony 5'-fosforanowy ester nukleozydu można zbierać i wydzielać z mieszaniny po zakończeniu reakcji wykorzystując metody stosowania syntetycznej żywicy do adsorpcji, metody stosowania czynnika wytrącającego oraz inne zwykle metody zbierania i wydzielania.
Krótki opis rysunków
Figura 1 przedstawia zależność pomiędzy pH roztworu reakcyjnego i wytwarzaną ilością kwasu 5'-inozynowcgo w reakcji przeprowadzonej przy użyciu enzymu pochodzącego z Morganella morganii.
Figura 2 przedstawia zależność pomiędzy pH roztworu reakcyjnego i wytwarzaną ilością kwasu 5'-inozynowego w reakcji przeprowadzonej przy użyciu enzymu pochodzącego z Escherichia blattae.
Figura 3 przedstawia mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne we fragmencie chromosomalnego DNA Morganella morganii obejmującego gen kodujący kwaśną fosfatazę.
Figura 4 przedstawia ilość kwasu 5'-inozynowego wytwarzanego w reakcji przeprowadzonej przy użyciu szczepu zawierającego gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii.
Figura 5 przedstawia ilość kwasu 5'-inozynowego wytwarzanego w reakcjach przeprowadzonych przy użyciu odpowiednio szczepu zawierającego gen kwaśnej fosfatazy typu dzikiego i szczepu zawierającego gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy pochodzącej zMorganella morganii.
Figura 6 przedstawia mapę miej sc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyj ne we fragmencie chromosomalnego DNA Escherichia blattae obejmującego gen kodujący kwaśną fosfatazę.
Figura 7 przedstawia diagram ilustrujący ilość kwasu 5'-inozynowego wytwarzanąw reakcji przeprowadzonej przy użyciu szczepu zwierającego gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae.
Figura 8 przedstawia ilość kwasu 5'-inozynowego wytwarzanąw reakcjach przeprowadzonych przy użyciu odpowiednio szczepu zawierającego gen kwaśnej fosfatazy typu dzikiego i szczepu zawierającego gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy pochodzącej zEscherichia blattae.
Figura 9 przedstawia mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne we fragmencie chromosomalnego DNA Enterobacter aerogenes obejmującego gen kodujący kwaśną fosfatazę.
Figura 10 przedstawia mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne we fragmencie chromosomalnego DNA Klebsiellaplanticola obejmującego gen kodujący kwaśną fosfatazę.
Figura 11 przedstawia mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne we fragmencie chromosomalnego DNA Serratiaficaria obejmującego gen kodujący kwaśną fosfatazę.
183 293
Figura 12 przedstawia w jednoliterowym kodzie sekwencje aminokwasowe, przewidziane na podstawie sekwencji nukloetydowych, kwaśnych fosfataz pochodzących z Morganella morgami, Escherichia blattae, Providencia stuartii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella planticola i Serratia ficaria.
Opis korzystnych rozwiązań
Niniejszy wynalazek zostanie poniżej szczegółowo wyjaśniony w odniesieniu do przykładów, jednakże, niniejszy wynalazek nie ogranicza się do tych przykładów.
Aktywność transfosforylacyjną mierzono w poniższych warunkach, jako substrat stosując inozynę. Reakcję prowadzi się w pH 5,0 w temperaturze 30°C w ciągu 10 minut w roztworze reakcyjnym (1 ml) zawierającym 40 pmoli/ml inozyny, 100 pmoli/ml pirofosforanu sodowego, 100 pmoli/ml buforu octanu sodowego (pH 5,0) oraz enzym. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 200 μΐ 2 N kwasu solnego. Następnie osady usuwano przez wirowanie. Później ilościowo mierzono kwas 5'-inozynowy wytworzony w reakcji transfosforylacji. Ilość enzymu wytwarzającą w tych standardowych warunkach reakcji 1 pmol kwasu 5'-inozynowego na minutę zdefiniowano jako 1 jednostkę.
Aktywność fosfomonoesterazy mierzono w poniższych warunkach, jako substrat stosując kwas 5'-inozynowy. Reakcję prowadzono w temperaturze 30°C wciągu 10 minut w roztworze reakcyjnym (1 ml) zawierającym 10 pmoli/ml kwasu 5'-inozynowego, 100 pmoli/ml buforu MES/NAOH (pH 6,0) oraz enzym. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 200 pl 2 N kwasu solnego. Następnie osady usuwano przez wirowanie. Później ilościowo mierzono inozynę wytworzoną w reakcji hydrolizy. Ilość enzymu wytwrzającą w tych standardowych warunkach reakcji 1 pmol inozyny na minutę zdefiniowano jako 1 jednostkę.
Inozynę i kwas 5-inozynowy analizowano w poniższych warunkach metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
Kolumna: Cosmosil 5C18-AR (4,6 x 150 mm) [produkowana przez nacalai tesąue];
Faza ruchoma: 5 mM bufor fosforanów potasowych (pH 2,8/metanol = 95/5);
Szybkość przepływu: l,0ml/min;
Temperatura: temperatura pokojowa;
Detekcja: UV przy długości fali 245 nm.
Nawiasem mówiąc, w reakcji wytwarzania 5'-fosforanowych estrów nukleozydów z zastosowaniem jako surowców nukleozydów innych niż inozyna, nukleozydy jako surowce i wytwarzane 5'-fosforanowe estry nukleozydów analizuje się przez HPLC w opisany powyżej sposób.
Przykład 1. Oczyszczanie i charakterystyka kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii
Podłoże odżywcze (pH 7,0, 50 ml), zawierające 1 g/dl peptonu, 0,5 g/dl ekstraktu drożdżowego i 1 g/dl chlorku sodowego, wlewano do kolb Sakaguchi (500 ml), które wyjaławiano w temperaturze 120°C w ciągu 20 minut. Każdąz kolb zaszczepiono zapomocąplatynowej ezy wyhodowaną na skosie Morganella morganii NCIMB 10466, którąhodowano w temperaturze 3 0°C w ciągu 16 godzin z wytrząsaniem. Komórki mikroorganizmu (około 3 000 g), które zbierano z hodowli przez wirowanie, zawieszano w 100 mM buforze fosforanów potasowych (1 litr, pH 7,0). W celu rozbicia komórek prowadzono traktowanie ultradźwiękami w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowaną zawiesinę wirowano w celu usunięcia frakcji nierozpuszczalnej. W ten sposób przygotowywano ekstrakt wolny od komórek.
Do wolnego od komórek ekstraktu dodawano siarczan amonowy do uzyskania 30% nasycenia. Pojawiający się osad usuwano przez wirowanie, a następnie dalej dodawano sirczanu amonowego do uzyskania 60% nasycenia. Pojawiający się osad zbierano przez wirowanie i rozpuszczano go w 100 mM buforze fosforanów potasowych.
Ten roztwór nieoczyszczonego enzymu dializowano cztery razy wobec 5 litrów 100 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0), a następnie nakładano go na kolumnę DEAE-Toyopeal 650M (φ 4,1 x 22 cm) zrównoważoną 20 mM buforem fosforanów potasowych (pH 7,0), a następnie przemywano 800 ml 20 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0). Aktywność
183 293 transforylacji stwierdzano we frakcji, która przechodziła przez kolumnę i w ten sposób frakcję odzyskiwano.
Do frakcji dodawano siarczanu amonowego do uzyskania 35% nasycenia i adsorbowano na kolumnie Butyl-Toyopeal (φ 3,1 x 26 cm) zrównoważoną20 mM buforem fosforanów potasowych (pH 7,0) zawierającym siarczan amonowy o 35% nasyceniu. Elucję prowadzono stosując liniowy gradient stężenia od 35% nasycenia do 20% nasycenia w buforze fosforanów potasowych (pH 7,0).
Aktywne frakcje zbierano i dializowano wobec 1 litra 50 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0), a następnie nakładano na kolumnę z hydroksyapatytem (φ 5 x 6,5 cm) zrównoważoną 50 mM buforem fosforanów potasowych (pH 7,0). Elucję prowadzono stosując liniowy gradient stężenia od 50 mM do 300 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0).
Aktywne frakcje zbierano i zatężano przez ultrafiltrację. Ten roztwór enzymu nakładano na kolumnę HiLoad TM 16/60 Superdex 200 (produkowanąprzez Pharmacia). Elucję prowadzono z szybkością przepływu 1,0 ml/minutę stosując 50 mM bufor fosforanów potasowych zawierający 100 mM chlorek sodowy.
Zgodnie z opisaną powyżej procedurą enzym wykazujący aktywność transfosforylacji oczyszczono w konsekwencji z wolnego od komórek ekstraktu około 550-krotnie przy stosunku odzyskania około 10%. Aktywność właściwąi stosunek odzyskania dla tego procesu oczyszczania przedstawiono w tabeli 1. Ta próbka enzymu była homogenna w elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z SDS.
Tabela 1
Etap odzyskiwania Aktywność całkowita (jednostki) Białko całkowite (mg) Aktywność właściwa (jednostki/mg) Stosunek (%)
1. Wolny od komórek ekstrakt 597 127 200 0,005 100
2. Frakcjonowanie siarczanem 568 122 210 0,005 95
amonu (30 do 60%)
3. DEAE-Toyopearl 517 36 498 0,014 87
4. Butyl-Toypearl 394 1 121 0,351 66
5. Hydroksy apatyt 112 50 2,244 19
6. Superdex 200 63 24 2,630 10
Oczyszczony enzym posiada następujące właściwości.
(1) Działanie: Grupa fosforanowa ulega przeniesieniu z donora grup fsoforanowych, takiego jak kwas polifosforowy, na nukleozyd, i tworzony jest 5'-fosforanowy ester nukleozydu. Enzym ten wykazuje również aktywność odwrotną hydrolizowania estru fosforanowego.
(2) Specyficzność substratowa: Związki służące jako donory grup fosforanowych w reakcji transfosforylacji obejmują na przykład, kwas pirofosforowy, kwas tripolifosforowy, kwas trimetafosforowy, kwas tetrametafosforowy, kwas heksametafosforowy, fenylofosforan disodowy, fenylofosforan dipotasowy, bezwodnik kwasu Ο,Ο-difenylofosforowego, karbamoilofosforan disodowy, karbamoilofosforan dipotasowy, karbamoilofosforan diamonowy i karbamoilofosforan dilitowy. Związki służące jako akceptory grup fosforanowych obejmują na przykład, rybonukleozyd purynowy, inozynę, guanozynę, adenozynę, ksantozynę, urydynę i cytydynę. Z drugiej strony, związki podlegające działaniu w reakcji hydrolizy estru fosforanowego obejmują na przykład, nieorganiczny kwas fosforowy, taki j ak kwas pirofosforowy, kwas tripolifosforowy, kwas trimetafosforowy, kwas tetrametafosforowy, kwas heksametafosforowy; ester fosforanowy, taki jak fenylofosforan disodowy, fenylofosforan dipotasowy, bezwodnik kwasu Ο,Ο-difenylofosforowego, karbamoilofosforan disodowy, karbamoilofosforan dipotasowy, karbamoilofosforan diamonowy i karbamoilofosforan dilitowy; oraz 5'-nukleotyd, taki jak rybonukleotyd 5'-purynowy, wkas 5'-inozynowy, kwas 5'-guanylowy, kwas 5'-adenylowy, kwas 5'-ksantylinowy, kwas 5'-urydylowy i kwas 5'-cytydylowy.
183 293 (3) Optimum pH: 5,2 (reakcja transfosforylacji), 6,5 (reakcja hydrolizy estru fosforanowego).
(4) Stabilność w pH: pH 3,0 do 12,0 (traktowanie w temperaturze 30°C wciągu 60 minut) (5) Optimum temperaturowe: około 35°C.
(6) Stabilność temperaturowa: stabilny do temperatury 30°C (traktowanie w pH 7,0 w ciągu 30 minut).
(7) Wpływ dodania jonu metalu i inhibitora: Enzym ten nie wykazuje zjawiska aktywacji swojej aktywności pod wpływem dodania żądanego jonu metalu. Aktywność hamują Ag2+, Pb2+, Hg2+ i Cu2+. Aktywność hamuje także kwas jodooctowy.
(8) Masa cząsteczkowa: Obliczona masa cząsteczkowa według wysokosprawnej chromatografii cieczowej (TSKgel G-3000SW, produkowana przez Toyo Soda) wynosi około 190 000.
(9) Masa cząsteczkowa podjednostki: Obliczona masa cząsteczkowa według elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z SDS wynosi około 25 000.
Enzym ten wykazuje nie tylko aktywność przenoszenia grupy fosforanowej na nukleozyd, ale także przeciwną aktywność hydrolizowania estru fosforanowego. Ponadto, enzym ten wykazuje aktywność hydrolizowania estrów fosforanowych (aktywność fosfomonoesterazy), która jest wyższa od aktywności transfosforylacji nie mniej niż 20-krotnie. Inne właściwości są zgodne z właściwościami znanej kwaśnej fosfatazy wytwarzanej przez bakterię należącą do rodzaju Morganella (Microbiology, 140, 1341-1350 (1994)). A zatem wykazano, że enzym ten jest kwaśną fosfatazą.
Pirofosforan sodowy (10 g/dl) i inozynę (2 g/dl) rozpuszczono w buforach octanu sodowego posiadających pH 5,5, 5,0, 4,5, 4,0 i 3,5, do których dodano próbki opisanego powyżej enzymu, tak że otrzymano stężenie 50 jednostek/dl. Mieszaninę reakcyjnąinkubowano w temperaturze 30°C wciągu 6 godzin utrzymując każde pH, i ilość wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego mierzono w miarę upływu czasu. Wytwarzany kwas inozynowy zawierał tylko kwas 5'-inozynowy. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania kwasu 2'-inozynowego i kwasu 3'-inozynowego. Wynik przedstawiono na fig. 1. Szybkość wytwarzania kwasu 5'-inozynowego była największa w pH 5,0. Jednakże, maksymalna akumulowana ilość kwasu 5'-inozynowego była wyższa w niższych pH. Warunki reakcji w pH 4,0 były najbardziej wydajne pod względem wytwarzania kwasu 5'-inozynowego, w warunkach tych kwas 5'-inozynowy był wytwarzany i akumulowany w ilości 2,60 g/dl po prowadzeniu reakcji w ciągu 3 godzin.
Przykład2. Reakcja fosfory lacj i różnych nukleozydów przez próbkę kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morgami
Pirofosforan sodowy (10 g/dl) i inozynę, guanozynę, urydynę lub cytydynę (2 g/dl) jako akceptory grup fosforanowych rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich próbki enzymu przygotowanego w przykładzie 1, tak że stężenie wynosiło 50 jednostek/dl. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 3 godzin utrzymując pH 4,0. Ilość wytwarzanych w reakcji 5'-fosforanowych estrów nukleozydów przedstawiono w tabeli 2.
Wytwarzany nukleotyd zawierał tylko ester 5'-nukloezydowy. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania estru 2'-nukleozydowego i estru 3'-nukleozydowego.
Tabela 2
Nukleozyd Produkt Wytwarzana ilość (g/dl)
Inozyna kwas 5'-inozynowy 2,60
Guanozyna kwas 5'-guanylowy 1,90
Urydyna kwas 5'-urydylowy 1,30
Cytydyna kwas 5'-cytydylowy 0,98
Przykład 3. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z różnych związków fosforanowych jako donorów grup fosforanowych przez próbkę kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii
Inozynę (2 g/dl) itripolifosforan sodowy, polifosforan sodowy (nazwa fabryczna: PolygonP, produkowany przez Chiyoda Chemical), fenylofosforan disodowy lub karbamoilofosforan
183 293 disodowy (10 g/dl) jako donory grup fosforanowych rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich próbki enzymu przygotowanego w przykładzie 1, tak że stężenie wynosiło 50 jednostek/dl. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 3 godzin utrzymując pH 4,0. Ilość wytwarzanego w reakcji kwasu 5'-inozynowego przedstawiono w tabeli 3.
Kwas 5'-inozynowy był wydajnie wytwarzany i akumulowany przy wykorzystaniu każdego z donorów grup fosforanowych. Jednakże, akumulacja kwasu 5'-inozynowego była najwyższa, gdy jako donor grup fosforanowych stosowano polifosforan sodowy.
Tabela 3
Donor grup fosforanowych Wytwarzany kwas 5'-inozynowy (g/dl)
Tripolifosforan sodowy 2,10
Polifosforan sodowy 2,72
Fenylofosforan disodowy 2,33
Karbamoilofosforan disodowy 2,54
Przykład4. Oczyszczanie i charakterystyka kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae
Podłoże odżywcze (pH 7,0, 50 ml), zawierające 1 g/dl peptonu, 0,5 g/dl ekstraktu drożdżowego i 1 g/dl chlorku sodowego, wlewano do kolb Sakaguchi (500 ml), które wyjaławiano w temperaturze 120°C w ciągu 20 minut. Każdąz kolb zaszczepiono za pomocąplatynowej ezy wyhodowaną na skosie Escherichia blattae JCM 1650, którą hodowano w temperaturze 30°C wciągu 16 godzin z wytrząsaniem. Komórki mikroorganizmu zbierano z hodowli przez wirowanie. Komórki mikroorganizmu (około 3 300 g) zawieszano w 100 mM buforze fosforanów potasowych (1 litr, pH 7,0). W celu rozbicia komórek mikroorganizmu prowadzono traktowanie ultradźwiękami w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowanązawiesinę wirowano w celu usunięcia frakcji nierozpuszczalnej. W ten sposób przygotowywano ekstrakt wolny od komórek.
Do wolnego od komórek ekstraktu dodawano siarczan amonowy do uzyskania 30% nasycenia. Pojawiający się osad usuwano przez wirowanie, a następnie dalej dodawano siarczanu amonowego do uzyskania 60% nasycenia. Pojawiający się osad zbierano przez wirowanie i rozpuszczano go 100 mM buforze fosforanów potasowych.
Ten roztwór nieoczyszczonego enzymu dializowano cztery razy wobec 5 litrów 100 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0), a następnie nakładano go na kolumnę DEAE-Toyopeal 65 OM (φ 6,2 x 35 cm) zrównoważoną20 mM buforem fosforanów potasowych (pH 7,0) a następnie przemywano 20 mM bufoerm fosforanów potasowych (pH 7,0). Aktywność transforylacji stwierdzono we frakcji, która przechodziła przez kolumnę i w ten sposób frakcję zbierano.
Do aktywnej frakcji dodawano siarczanu amonowego do uzyskania 35% nasycenia i adsorbowano na kolumnie Butyl-Toyopeal (φ 5,0 x 22,5 cm) zrównoażoną20 mM buforem fosforanów potasowych (pH 7,0) zawierającym siarczan amonowy o 35% nasyceniu. Elucję prowadzono stosując liniowy gradient stężenia od 35% nasycenia do 20% nasycenia w buforze fosforanów potasowych (pH 7,0).
Aktywne frakcje zbierano i dializowano wobec 1 litra 100 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0), a następnie nakładano na kolumnę z hydroksyapatytem (φ 3,0 x 7,0 cm) zrównoważoną 100 mM buforem fosforanów potasowych (pH 7,0). Elucję prowadzono stosując liniowy gradient stężenia od 50 mM do 100 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0) i zbierano aktywne frakcje.
Ten roztwór enzymu dializowano wobec 1 litra 10 mM buforu fosforanów potasowych (pH 6,0), a następnie nakładano na kolumnę CM-Toyopearl (φ 2,0x14 cm) zrównoważoną 10 mM buforem fosforanów potasowych (pH 6,0). Elucję prowadzono stosując liniowy gradient stę
183 293 żenią od 0 mM do 300 mM chlorku potasowego w buforze fosforanów potasowych (pH 6,0). Aktywne frakcje wyeluowano z kolumny i zebrano.
Zgodnie z opisaną powyżej procedurą, enzym wykazujący aktywność transfosforylacji oczyszczano w konsekwencji z wolnego od komórek ekstraktu około 600-krotnie przy stosunku odzyskania około 16%. Aktywność właściwą i stosunek odzyskania dla tego procesu oczyszczania przedstawiono w tabeli 4. Ta próbka enzymu była homogenna w elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z SDS.
Tabela 4
Etap Aktywność całkowita (jednostki) Białko całkowite (mg) Aktywność właściwa (jednostki/mg) Stosunek odzyskania (%)
1. Wolny od komórek ekstrakt 365 160 650 0,002 100
2. Frakcjonowanie siarczanem amonu (30 do 60%) 340 138 895 0,002 93
3. DEAE-Toyopearl 318 30 440 0,010 87
4. Butyl-Toyopearl 232 661 0,347 63
5. Hydroksyapatyt 96 96 1,000 26
6. CM-Toyopearl 59 43 1,365 16
Oczyszczony enzym posiada następujące właściwości.
(1) Działanie: Grupa fosforanowa ulega przeniesieniu z donora grup fosforanowych, takiego jak kwas polifosforowy, na nukleozyd, i tworzony jest 5'-fosforanowy ester nukleozydu. Enzym ten wykazuje również aktywność odwrotną, hydrolizowania estru fosforanowego.
(2) Specyficzność substratowa: Związki służące jako donory grup fosforanowych w reakcji transfosforylacji obejmują, na przykład, kwas pirofosforowy, kwas tripolifosforowy, kwas trimetafo sforo wy, kwas tetrametafosforowy, kwas heksametafosforowy, fenyl ofosforan disodowy, fenylofosforan dipotasowy, bezwodnik kwasu Ο,Ο-difenylofosforowego, karbamoilofosforan disodowy, karbamoilofosforan dipotasowy, karbamoilofosforan diamonowy i karbamoilofosforan dilitowy. Związki służące jako akceptory grup fosforanowych obejmują, na przykład, rybonukleozyd purynowy, inozynę, guanozynę, adenozynę, ksantozynę, urydynę i cytydynę. Z drugiej strony, związki podlegające działaniu w reakcji hydrolizy estru fosforanowego obejmują na przykład, nieorganiczny kwas fosforowy, taki jak kwas pirofosforowy, kwas tripolifosforowy, kwas trimetafosforowy, kwas tetrametafosforowy, kwas heksametafosforowy; ester fosforanowy, taki jak fenylofosforan disodowy, fenylofosforan dipotasowy, bezwodnik kwasu Ο,Ο-difenylofosforowego, karbamoilofosforan disodowy, karbamoilofosforan dipotasowy, karbamoilofosforan diamonowy i karbamoilofosforan dilitowy; oraz 5'-nukloetyd, taki jak rybonukleotyd 5'-purynowy, kwas 5'-inozynowy, kwas 5'-guanylowy, kwas 5'-adenylowy, kwas 5'-ksantylinowy, kwas 5'-urydylowy i kwas 5'-cytydylowy.
(3) Optimum pH: 5,2 (reakcja transfosforylacji), 6,5 (reakcja hydrolizy estru fosforanowego).
(4) Stabilność w pH: pH 3,5 do 12,0 (traktowanie w temperaturze 30°C w ciągu 60 minut).
(5) Optimum temperaturowe: około 35°C.
(6) Stabilność temperaturowa: stabilna do temperatury 40°C (traktowanie w pH 7,0 w ciągu 30 minut).
(7) Wpływ dodania jonu metalu i inhibitora: Enzym ten nie wykazuje zjawiska akty wacj i swojej aktywności pod wpływem dodania żadnego jonu metalu. Aktywność hamują Fe2+, Ag2+, Pb2+, Hg2+ i Cu2+. Aktywność hamuje także kwas jodooctowy.
(8) Masa cząsteczkowa: Obliczona masa cząsteczkowa według wysokosprawnej chromatografii cieczowej (TSKgel G-3000SW, produkowana przezToyo Soda) wynosi około 188 000.
(9) Masa cząsteczkowa podjednostki: Obliczona masa cząsteczkowa według elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z SDS wynosi około 24 500.
183 293
Enzym ten wykazuje nie tylko aktywność przenoszenia grupy fosforanowej na nukleozyd, ale także aktywność odwrotną, hydrolizowania estru fosforanowego, tak samo, jak enzym oczyszczony z wolnego od komórek ekstraktu Morganella morganii NCIMB 10466. Ponadto, enzym ten wykazuje aktywność hydrolizowania estrów fosforanowych (aktywność fosfomonoesterazy), która jest wyższa od aktywności transfosforylacji nie mniej niż 30-krotnie. A zatem, wykazano, że enzym ten jest kwaśną fosfatazą.
Pirofosforan sodowy (15 g/dl) i inozynę (3 g/dl) rozpuszczono w buforach octanu sodowego posiadających pH 5,5, 5,0, 4,5, 4,0 i 3,5, do których dodano próbki opisanego powyżej enzymu, tak że otrzymano stężenie 50 jednostek/dl. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 6 godzin utrzymując każde pH, i ilość wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego mierzono w miarę upływu czasu. Wytwarzany kwas inozynowy zawierał tylko kwas 5'-inozynowy. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania kwasu 2'-inozynowego i kwasu 3'-inozynowego. Wynik przedstawiono na fig. 2. Szybkość wytwarzania kwasu 5'-inozynowego była największa wpH 5,0. Jednakże, maksymalna akumulowana ilość kwasu 5'-inozynowego była wyższa w niższych pH. Warunki reakcji w pH 4,0 były najbardziej wydajne pod względem wytwarzania kwasu 5'-inozynowego. Kwas 5'-inozynowy był wytwarzany i akumulowany w ilości 1,56 g/dl po prowadzeniu rekacji w pH 4 wciągu 3 godzin.
Przykład 5. Reakcj a fosforylacj i różnych nukleozydów przez próbkę kwaśnej fosfatazy pochodzącej w Escherichia blattae
Pirofosforan sodowy (15 g/dl) i inozynę, guanozynę, urydynę lub cytydynę (3 g/dl) rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich próbki enzymu przygotowanego w przykładzie 4, tak że stężenie wynosiło 50 jednostek/dl. Mieszaninę reakcyjnąinkubowano w temperaturze 35°C w ciągu 3 godzin utrzymując pH 4,0. Ilość wytwarzanych w reakcji estru 5'-nukleozydowego przedstawiono w tabeli 5.
Wytwarzany nukleotyd zawierał tylko ester 5'-nukleozydowy. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania estru 2'-nukleozydowego i estru 3'-nukleozydowego.
Tabela 5
Nukleozyd Produkt Wytwarzana ilość (g/dl)
Inozyna kwas 5'-inozynowy 1,56
Guanozyna kwas 5'-guanylowy 1,05
Urydyna kwas 5'-urydylowy 1,87
Cytydyna kwas 5'-cytydylowy 1,22
Przykład 6. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z różnych związków fosforanowych jako donorów grup fosforanowych przez próbkę kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae
Inozynę (2 g/dl) i tripolifosforan sodowy, polifosforan sodowy (nazwa fabryczna: Poły gon P, produkowany przez Chiyoda Chemical), fenylofosforan disodowy lub karbamoilofosforan disodowy (10 g/dl) jako donory grup fosforanowych rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich próbki enzymu przygotowanego w przykładzie 4, tak, że stężenie wynosiło 50 jednostek/dl. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 35°C w ciągu 3 godzin utrzymując pH 4,0. Ilość wytwarzanego w reakcji kwasu 5'-inozynowego przedstawiono w tabeli 6.
Kwas 5'-inozynowy był wydajnie wytwarzany i akumulowany przy wykorzystaniu każdego z donorów grup fosforanowych. Jednakże, akumulacja kwasu 5'-inozynowego była najwyższa, gdy jako donor grup fosforanowych stosowano polifosforan sodowy.
183 293
Tabela 6
Donor grup fosforanowych Wytwarzany kwas 5'-inozynowy (g/dl)
Tripolifosforan sodowy 1,20
Polifosforan sodowy 1,79
Fenylofosforan disodowy 1,50
Karbamoilofosforan disodowy ____________________143
Przykład 7. Izolowanie genu kodującego kwaśną fosfatazą z chromosomu Morganella morganii (1) Określanie N-końcowej sekwencji aminokwasowej
Kwaśną fosfatazę oczyszczoną z wolnego od komórek ekstraktu Morganella morganii NCIMB 10466 zgodnie z metodą opisaną w przykładzie 1 zaadsorbowano na membranie DITC (produkowanej przez Milligen/Biosearch) i jej N-końcowąsekwencję aminokwasową określono przy użyciu Proseąuencer 6625 (produkowanego przez Milligen/Biosearch). Określono N-końcową sekwencję aminokwasową obejmującą 20 reszt przedstawioną w sekwencji o numerze indentyfikacyjnym: 1 w Liście Sekwencji.
(2) Izolowanie fragmentu DNA obejmującego gen kodujący kwaśną fosfatazę
Z namnożonych komórek mikroorganizmu Morganella morgami NCIMB 10466 wyekstrahowano chromosomalny DNA według metody Murraya i Thomsona (Nuci. Acid Res., 4321, 8 (1980)). Chromosomalny DNA częściowo zdegradowano enzymem restrykcyjnym SauIIIAI. Następnie fragmenty DNA o długości 3-6 kbp frakcjonowano poprzez wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy. Wektor plazmidowy pUCl 18 (produkowany przez Takara Shuzo) strawiono enzymem restrykcyjnym ZLuwHI i zligowano z nim fragmenty częściowo zdegradowanego chromosomalnego DNA. Ligację DNA przeprowadzono stosując zestaw do ligacji DNA (produkowany przez Takara Shuzo) zgodnie ze wskazaną metodą. Następnie otrzymaną mieszaniną DNA stransformowano, zgodnie ze zwykłą metodą Escherichia coli JM 109 (produkowaną przez Takara Shuzo). Transformanty wysiano na podłoże agarowe L zawierające 100 pg/ml ampicyliny i hodowano je w celu przygotowania biblioteki genowej.
Na powierzchnię podłoża agarowego, na którym hodowano transformanty wylano roztwór reakcyjny zawierający 4 mM kwas p-nitrofenylofosforowy i 100 mM bufor MES/NaOH (pH 6,5) i utrzymywano temperaturę 30°C w ciągu 15 minut. Szczepy, w których zachodziła ekspresja aktywności fosfatazy uwalniały p-nitro fenol i wykazywały żółtą barwę. A zatem, transformanty selekcjonowano wykorzystując jako wskaźnik to zjawisko. W wyniku przeszukania ekspresyjnej biblioteki genowej, obejmującej około 20 000 szczepów transformantów, otrzymano 30 szczepów transformantów, w których zachodziła ekspresja aktywności fosfatazy.
Transformanty (30 szczepów), w których zachodziła ekspresja aktywności fosfatazy, poddano izolowaniu pojedynczych kolonii. Pojedynczymi koloniami zaszczepiano podłoże L (2,5 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i hodowano je w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin. Do zebranych z hodowli komórek mikroorganizmu dodawano bufor octanu sodowego (100 mM, pH 5,0, 50 μΐ) zawierający inozynę (2 g/dl) i pirofosforan sodowy (10 g/dl) i mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 16 godzin. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego wykrywano przez analizę HPLC dla wyselekcjonowania szczepów mikroorganizmu wykazujących aktywność transfosforylacji. W wyniku, udało nam się uzyskać 5 szczepów transformantów, które wykazywały aktywność transfosforylacji dla których założono, że zawierają fragment DNA obejmujący stanowiący przedmiot wynalazku gen kwaśnej fosfatazy.
Przykład 8. Określane sekwencji nukleotydowej genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii NCIMB 10466
Wstawiony fragment DNA analizowano przez przygotowywanie plazmidu zgodnie z metodą lizy alkalicznej (Molecular Cloning, wyd. 2 (J. Sambrook, E.F. Fritsch i T. Maniatis, Cold Spring Harbor laboratory Press, pl. 25 (1989)) z jednego z otrzymanych w przykładzie 7 szczepów transformantów, dla których założono, że zawierają fragment DNA obejmujący gen kwaś
183 293 nej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii NCIMB 10466. Plazmid ten oznaczono pMPI501. Figury 3 przedstawia określoną mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne we wstawionym fragmencie DNA.
Region genu kwaśnej fosfatazy dokładniej określano przez subklonowanie. Wynik sugerował, że ten gen kwaśnej fosfatazy zawarty był we fragmencie o wielkości 1,2 kbp, wyciętym enzymami restrykcyjnymi Hind[\\ i EcoRL A zatem, w celu określenia sekwencji aminokwasowej skonstruowano plazmidowy DNA, w którym zligowano fragment o długości 1,2 kbp z pUC 118 strawionym HindTi i Eco RI. Tym plazmidowym DNA, oznaczonym pMPI505, zgodnie ze zwykłą metodą stransformowano Escherichia coli JM109 (produkowaną przez Takara Shuzo), którą dla otrzymania transformanta wysiano na podłoże agarowe L zawierające 100 pg/ml ampicyliny.
Dla określenia sekwencji nukleotydowej, z transformanta Escherichia coli JM 109 (produkowanej przez Takara Shuzo) zawierającego pMPI505 wyekstrahowano plazmid zgodnie z metodą lizy alkalicznej. Sekwencję nukleotydową określono zgodnie z metodą Sangera (J. Mol. Biol. 143,161 (1980)) stosując zestaw do sekwencjonowania Taq DyeDeoxy Terminator Cycle (produkowany przez Applied Biochemical). Sekwencję nukleotydową określonej otwartej ramki odczytu przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 w Liście Sekwencji. Sekwencję aminokwasową białka, prze widzianą na podstawie sekwencji nukleoty do wej, przedstawiono w sekwencji o numerze identyfiakcyjnym: 3 w Liście Sekwencji. W sekwencji aminokwasowej stwierdzono częściowąsekwencję całkowicie zgodnązN-końcowąsekwencjąaminokwasową oczyszczonego enzymu. Koniec N oczyszczonego enzymu rozpoczyna się resztą alaniny w pozycji 21 sekwencji przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3. A zatem, zakłada się, że sekwencja aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3 jest sekwencją białka prekursorowego, i że peptyd obejmujący odcinek od reszty metioniny w pozycji 1 do reszty alaniny w pozycji 20 jest usuwany po translacji. Tak przewidzianą sekwencję aminokwasową dojrzałego białka przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 w Liście Sekwencji. Masę cząsteczkową dojrzałego białka obliczono na podstawie sekwencji aminokwasowej na 24,9 kilodaltonów, co wykazuje dobrą zgodność z wynikiem SDS-PAGE oczyszczonego enzymu. Zgodnie z opisanymi powyżej wynikami, i z powodu faktu, że transformant zawierający plazmid obejmujący ten fragment wykazywał aktywność transfosforylacji, stwierdzono, że ta otwarta ramka odczytu była regionem kodującym stanowiącą przedmiot wynalazku kwaśną fosfatazę.
Sekwencję nukleotydowąi sekwencję aminokwasowąporównano odpowiednio ze znanymi sekwencjami w poszukiwaniu homologii. Wykorzystano bazy danych EMBL i SWISSPROT. W wyniku ujawniono, że sekwencja nukloetydowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 w Liście Sekwencji zgodna jest ze znaną sekwencją nukleotydową genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii (Thaller, M. C. i in., Microbiology, 140, 1341 (1994)), z tym wyjątkiem, że w tej ostatniej G w pozycji 54 jest A, G w pozycji 72 jest A, T w pozycji 276 jest G, T w pozycji 378 jest C, G w pozycji 420 jest T, C w pozycji 525 jest G, C w pozycji 529jest T, a G w pozycji 531 jest A, oraz że sekwencja aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 w Liście Sekwencji jest taka sama, jak sekwencja genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii. Mianowicie, gen który koduje białko posiadające sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 w Liście Sekwencji, jest genem kwaśnej fosfatazy Morganella morganiiNCIMB 10466.
Białko prekursorowe obejmuje 249 aminokwasów, a jego masa cząsteczkowa przewidziana na podstawie sekwencji wynosi 27,0 kilodaltonów.
Szczep Escherichia coli stransformowany plazmidem pMPI505 oznaczono AJ13143 i zdeponowano w depozycie międzynarodowym 23 lutego 1996 r. w National Institute of Bioscience and Humań Technology of Agency Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (kod pocztowy: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japonia) na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego i nadano mu numer depozytowy FERM BP-5422.
183 293
Przykład 9. Wzmacnianie aktywności przez ekspresję genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii NCIMB 10466
Skonstruowaną w przykładzie 8 Escherichia coli JM109/pMPI505 zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG i hodowano ją w temperaturze 27°C w ciągu 16 godzin. Komórki mikroorganizmu zebrano z hodowli przez wirowanie i przemyto je raz solą fizjologiczną. Komórki mikroorganizmu zawieszono w 100 mM buforze fosforanów potasowych (5 ml, pH 7,2) i rozbito je poprzez działanie ultradźwiękami prowadzone w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowany roztwór odwirowano dla usunięcia frakcji nierozpuszczalnej i tak przygotowano ekstrakt wolny od komórek.
Aktywność transfosforyłacji otrzymanego ekstraktu wolnego od komórek mierzono jako kontrolę stosując wolne od komórek ekstrakty przygotowane ze szczepu typu dzikiego Morganella morganii oraz Escherichia coli JM109 stransformowanej w opisany powyżej sposób plazmidem pUCl 18. Wynik przedstawiono w tabeli 7. Aktywności transfosforyłacji nie wykryto Escherichia coli JM109/pUC118. Aktywność transfosforyłacji była również niska w szczepie typu dzikiego Morganella morganii. Z drugiej strony, Escherichia coli JM109/pMPI505 wykazywała aktywność transfosforyłacji, która pod względem aktywności właściwej była 150 razy wyższa od tej szczepu dzikiego Morganella morgami. Odnosząc się do tego wyniku, wykazano, że wprowadzony fragment DNA umożliwia Escherichia coli ekspresję kwaśnej fosfatazy na wysokim poziomie.
Tabela 7
Szczep mikroorganizmu Aktywność transfosforyłacji (jednostki/mg)
Morganella morganii NCIMB 10466 Escherichia coli JM109/pUCl 18 Escherichia coli JM109/pMPI505 0,008 nie wykryta 1,250
Przykład 10. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z inozyny przy użyciu szczepu zawierającego gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii NCIMB 10466
Pirofosforan sodowy (12 g/dl) i inozynę (6 g/dl) rozpuszczono w 100 mM buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich komórki mikroorganizmu Escherichia coli JM109/pMPI505 w ilości do uzyskania stężenia komórek 100 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagę komórek mikroorganizmu. Mieszaninę reakcyjnąinkubowano w temperaturze 3 7°C w ciągu 6 godzin utrzymując pH 4,0, i ilość wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego mierzono w miarę upływu czasu. Wytwarzany kwas inozynowy zawierał tylko kwas 5'-inozynowy. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania kwasu 2'-inozynowego i kwasu 3'-inozynowego. Wynik przedstawiono na fig. 4. W szczepie zawierającym gen kwaśnej fosfatazy zachodziła ekspresja znaczących ilości kwaśnej fosfatazy i kwas 5'-inozynowy był przy zastosowaniu tego mikroorganizmu wytwarzany i akumulowany maksymalnie wydajnie podczas krótkiego czasu reakcji wytwarzania kwasu 5'-inozynowego z pirofosforanu i inozyny. Jednakże, jeśli czas reakcji wydłużano, obserwowano, że ilość wytwarzanego i akumulowanego kwasu 5'-inozynowego ulegała obniżeniu w wyniku degradacji.
Przykład 11. Przygotowywanie genu kwaśnej fosfatazy typu o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Jak opisano w przykładach 9 i 10, w szczepie zawierającym gen kwaśnej fosfatazy zachodzi ekspresja znaczących ilości kwaśnej fosfatazy i kwas 5'-inozynowy jest przy zastosowaniu tego mikroorganizmu wytwarzany i akumulowany maksymalnie wydajnie podczas krótkiego czasu reakcji wytwarzania kwasu 5'-inozynowego z pirofosforanu i inozyny. Jednakże, ujawniono, że akumulowana ilość kwasu 5'-inozynowego nie przekracza pewnego stopnia, ponieważ wytworzony kwas 5'-inozynowy podlega degradacji przez aktywność fosfomonoesterazy samej kwaśnej fosfatazy. A zatem, enzym poprawiono przez wprowadzenie, zgodnie z metodąukierun
183 293 kowanej mutagenezy przy użyciu PCR, mutacji do sklonowanego w przykładzie 7 genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej Morganella morganii NCIMP 10466.
Zgodnie z metodą wykorzystującą fosforynoamidy, stosując syntezator DNA (Model 394, produkowany przez Applied Biosystems), zsyntetyzowano oligonukloetydy MUT500, MUT510 i MUT520, posiadające sekwencje przedstawione odpowiednio w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 5, 6 i 7.
Do 100 mM buforu Tris-HCl (pH 8,3, 100 pl) zawierającego dATP, dCTP, dGTP, dTTP (każdy 200 μΜ), chlorek potasowy (50 mM) i chlorek magnezowy (1,5 mM) dodano jako matrycę plazmid pMPI505 (1 ng), przygotowany w przykładzie 8, starter RV Μ13 (produkowany przez Takara Shuzo), oligonukleotyd MUT510 (2,5 pmola każdego) jako starter oraz polimerazę DNA Taq (2,5 jednostki, produkowana przez Takara Shuzo) w celu przeprowadzenia reakcji PCR, w której cykl obejmujący okresy 30 sekund w temperaturze 94°C, 2 minut w temperaturze 55°C i 3 minut w temperaturze 72°C powtórzono 25 razy. Reakcję PCR przeprowadzono stosując Thermal Cycler typu PJ2000 (produkowany przez Takara Shuzo). Reakcję PCR przeprowadzono również w taki sam sposób, jak opisano powyżej, stosując jako matrycę DNA plazmidu pMPI505 (1 ng) i jako startery, starter M4 Ml 3 (produkowany przez Takara Shuzo) i oligonukleotyd MUT500 (2,5 pmola każdego). Każdy z produktów reakcji oczyszczono przez sączenie molekularne przy użyciu kolumny Microspin S-400 (produkowanej przez Pharmacia) w celu usunięcia starterów.
Każdy z produktów reakcji PCR (1 μΐ) dodano do 100 mM buforu Tris-HCl (pH 8,3,95 μΐ) zawierającego dATP, dCTP, dGTP, dTTP (każdy 200 μΜ), chlorek potasowy (50 mM) i chlorek magnezowy (1,5 mM) i ogrzewano je w temperaturze 94°C wciągu 10 minut, a następnie schładzano do temperatury 37°C wciągu 60 minut. Następnie utrzymywano temperaturę 37°C wciągu 15 dla utworzenia heterodupleksu. Dodano polimerazę DNA Tag (2,5 jednostek) w celu przeprowadzenia reakcji w temperaturze 72°C w ciągu 3 minut, aby zakończyć tworzenie heterodupleksu. Następnie do tego roztworu reakcyjnego dodano starter RV Μ13 i starter M4 Μ13 (każdego po 2,5 pmola) w celu przeprowadzenia reakcji PCR, podczas której 10 razy powtórzono cykl obejmujący okresy 30 sekund w temperaturze 94°C, 2 minut w temperaturze 55°C i 3 minut w temperaturze 72°C.
Produkt drugiej reakcji PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi HincBU i EcoRI, a następnie wyekstrahowano fenolem/chloroformem i wytrącono etanolem. Ten fragment DNA zligowano z pUC 118 strawionym HindUI i EcoRI. Otrzymanym DNA plazmidowym stransformowano Escherichia coli JM 109 (produkowaną przez Takara Shuzo) zgodnie ze zwykłą metodą a następnie wysiano ją na podłoże agarowe L zawierające 100 pg/ml ampicyliny dla otrzymania transformanta. Plazmid wyekstrahowano z transformanta zgodnie z metodą lizy alkalicznej dla określenia jego sekwencji nukleotydowej, potwierdzając, że docelowy nukleotyd został podstawiony. Sekwencję nukleotydową określono zgodnie z metodą Sangera (J. Mol. Biol. 143, 161 (1980)) stosując zestaw do sekwencjonowania Taq DyeDeoxy Terminator Cycle (produkowany przez Applied Biochemical). Tak więc przygotowano gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, w której resztę glicyny w pozycji 72 (GGT) dojrzałego białka podstawiono resztą kwasu asparaginowego (G*AT). Plazmid obejmujący ten zmutowany gen oznaczono pMPI510.
Następnie przygotowano zmutowany gen kodujący zmutowaną fosfatazę, w której resztę izoleucyny w pozycji 151 (ATC) dojrzałego białka podstawiono resztę treoniny (A*CC), zgodnie z takąsamąprocedurą jak opisano powyżej, z zastosowaniem pMPI505 jako matrycy i oligonukloetydów MUT500 i MUT520 jako starterów. Plazmid zawierający ten zmutowany gen oznaczono pMPI520. Ponadto, przygotowano zmutowany gen kodujący, zmutowaną fosfatazę, w której resztę glicyny w pozycji 72 (GGT) dojrzałego białka podstawiono resztą kwasu asparaginowego (G*AT) oraz resztę izoleucyny w pozycji 151 (ATC) dojrzałego białka podstawiono resztątreoniny (A*CC), zgodnie z takąsamąprocedurą jak opisano powyżej, z zastosowaniem pMPI510jako matrycy i oligonukloetydówMUT500 iMUT520 jako starterów. Plazmid zawierający ten zmutowany gen oznaczono pMPI530.
183 293
Escherichia coli JM109/pMPI510, Escherichia coli JM109/pMPI520 i Escherichia coli JM109/pMPI530, do których wprowadzono plazmidy obejmujące odpowiednie geny zmutowanej kwaśnej fosfatazy, oraz Escherichia coli JM109/pMPI505, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen kwaśnej fosfatazy typu dzikiego, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 μΐ/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano je w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin. Komórki mikroorganizmów zbierano z hodowli i raz przemywano solą fizjologiczną. Komórki mikroorganizmów zawieszano w 100 mM buforze fosforanów potasowych (5 ml, pH 7,0), i rozbij ano przez traktowanie ultradźwiękami w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowane roztwory wirowano w celu usunięcia frakcji nierozpuszczalnej i w ten sposób przygotowywano ekstrakty wolne do komórek. Aktywności fosfomonoesteraz i aktywności transfosforylacji otrzymanych wolnych od komórek ekstraktów zmierzono w pH 4,0 i porównano z aktywnością szczepu dzikiego. Tabela 8 przedstawia wynik pomiaru aktywności fosfomonoesteraz i aktywności transfosforylacji kwaśnych fosfataz typu dzikiego i zmutowanych kwaśnych fosfataz. Wykazuje ona, że zarówno aktywności fosfomonoesteraz, jak i aktywności transfosforylacji zmutowanych kwaśnych fosfataz są obniżone w porównaniu z kwaśną fosfatazą typu dzikiego, oraz że stopnie obniżenia aktywności fosfomonoesteraz są wyższe od obniżenia stopnia aktywności transfosforylacji, czego wynikiem jest obniżenie stosunku aktywności fosfomonoesterazy do aktywności transfosforylacji zmutowanej kwaśnej fosfatazy w porównaniu z kwaśną fosfatazą typu dzikiego.
Tabela 8
Plazmid Aktywność fosfomonoesterazy (jednostki/mg) Aktywność transfosforylacji (jednostki/mg) Stosunek1’ (wartość względna)
pMPI505 5,91 0,625 9,45 (100)
pMPI510 0,59 0,090 6,55 (69)
pMPI520 2,24 0,583 3,84 (40)
pMPI530 1,07 0,318 3,36 (35)
Stosunek aktywności fosfomonoesteraz do aktywności wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu
Przykład 12. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z inozyny z zastosowaniem szczepów zawierających gen kodujący kwaśną fosfatazę o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Escherichia coli JM109/pMPI510, Escherichia coli JM109/pMPI520 i Escherichia coli JM109/pMPI530, do których wprowadzono plazmidy obejmujące zmutowane geny kwaśnej fosfatazy, oraz Escherichia coli JM109/pMPI501, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen kwaśnej fosfatazy typu dzikiego, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano je w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin.
Pirofosforan sodowy (12 g/dl) i inozynę (6 g/dl) rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich komórki mikroorganizmu każdego ze szczepów Escherichia coli, otrzymanych przez opisanąpowyżej hodowlę, JM 109/pMPI5 05 w ilości do uzyskania stężenia komórek 100 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagę komórek mikroorganizmu. Mieszaninę reacyjnąinkubowano w temepraturze 30°C w ciągu 22 godzin utrzymując pH 4,0 i ilość wytwarzanego w reakcj i kwasu 5'-inozyno wego mierzono w miarą upływu czasu. Wynik przedsta- wiono na fig. 5.
Na figurze 5 oś rzędnych wskazuje stężenie kwasu 5'-inozynowego (mg/dl), a oś odciętych wskazuje czas reakcji (h). Postęp reakcji oznaczono pełnymi kółkami dla Escherichia coli JM109/pMPI505, pełnymi trójkątami dla Escherichia coli JM109/pMPI510, pustymi kółkami dla Escherichia coli JM109/pMPI520 i pustymi kwadratami dla Escherichia coli JM109/pMPI530, jak mierzono z wykorzystaniem komórek mikroorganizmów odpowiednich szczepów.
Szybkość degradacji wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego była obniżona w reakcji jego wytwarzania z inozyny przy użyciu szczepów zawierających gen kwaśnej fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy. W wyniku tego, wydajność i akumulowana ilość kwasu 5'-inozynowego były zwiększone. Największą akumulację kwasu 5'-inozynowego wykazywała Escherichia coli JM109/pMPI530, jako szczep zawierający gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy,
183 293 w której resztę glicyny w pozycji 72 i resztę izoleucyny w pozycji 151 podstawiono odpowiednio resztą kwasu asparaginianowego i resztą treoniny.
Przykład 13. Wytwarzanie różnych 5'-fosforanowych estrów nukleozy dów przy użyciu szczepów zawierających gen kodujący kwaśną fosfatazą o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Escherichia coli JM109/pMPI530, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 mg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano ją w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin.
Pirofosforan sodowy (12 g/dl) i inozynę, guanozynę, urydynę lub cytydynę (6 g/dl) jako akceptory grup fosforanowych rozpuszczono w 100 mM buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich opisane powyżej komórki mikroorganizmu, w ilości do uzyskania stężenia komórek 100 mg/dł, wprzeliczeniu na suchą wagę komórek. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 22 godzin utrzymując pH 4,0. Ilości wytwarzanych 5'-fosforanowych estrów nukleozydów przedstawiono w tabeli 9. Wytwarzany nukleotyd zawierał tylko ester 5'-fosforanowy nukleozydu. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania 2'-fosforanowego estru nukleozydu i 3'-fosforanowego estru nukleozydu.
Tabela 9
Nukleozyd Produkt Wytwarzana ilość (g/dl)
Inozyna kwas 5'-inozynowy 10,01
Guanozyna kwas 5'-guanylowy 6,72
Urydyna kwas 5'-urydylowy 11,90
Cy ty dyna kwas 5'-cytydylowy 7,82
Przykład 14. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z różnych związków fosforanowych jako donorów grup fosforanowych przy użyciu szczepów zawierających gen kodujący kwaśną fosfatazę o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Escherichia coli JM109/pMPI530, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano ją w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin.
Inozynę (6 g/dl) i tripolifosforan sodowy, polifosforan sodowy (nazwa fabryczna: Polygon P, produkowany przez Chiyoda Chemical), fenylofosforan disodowy lub karbamoilofosforan disodowy (10 g/dl) jako donory grup fosforanowych rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,5) i dodano do nich opisane powyżej komórki mikroorganizmu, w ilości do uzyskania stężenia komórek 100 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagę komórek mikroorganizmu. Mieszaninę reakcyjnąinkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 22 godzin utrzymując pH 4,0. Ilość wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego przedstawiono w tabeli 10. Kwas 5'-inozynowy był wydajnie wytwarzany i akumulowany przy wykorzystaniu każdego z donorów grup fosforanowych. Jednakże, akumulacja kwasu 5'-inozynowego była najwyższa, gdy jako donor grup fosforanowych stosowano kwas polifosforowy.
Tabela 10
Donor grup fosforanowych Wytwarzany kwas 5'-inozynowy (g/dl)
Tripolifosforan sodowy 8,93
Polifosforan sodowy 11,45
Fenylofosforan disodowy 9,62
Karbamoilofosforan disodowy 9,89
183 293
Przy kład 15. Izolowanie genu kodującego kwaśnąfosfatazę z chromosomu Escherichia blattae (1) Określanie N-końcowej sekwencji aminokwasowej
Kwaśną fosfatazę oczyszczoną z wolnego od komórek ekstraktu Escherichia blattae JCM 1650 zaadsorbowano na membranie DITC (produkowanej przez Milligen/Biosearch) i jej N-końcową sekwencję aminokwasową określono przy użyciu Prosequencer 6625 (produkowanego przez Milligen/Biosearch). Określono N-końcową sekwencję aminokwasową obejmującą 15 reszt, przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 8 w Liście Sekwencji.
(2) Izolowanie fragmentu DNA obejmującego gen kodujący kwaśnąfosfatazę
Z namnożonych komórek Escherichia blattae JCM 1650 wyedstrahowano chromosomalny DNA według metody Murraya i Thomsona (Nuc\. Acid. Res., 4321,8 (1980)). Chromosomalny DNA częściowo zdegradowano enzymem restrykcyjnym SauIIIAI. Następnie fragmenty DNA o długości 3 do 6 kbp frakcjonowano poprzez wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy. Wektor plazmidowy pUC118 (produkowany przez Takara Shuzo) strawiono enzymem restrykcyjnym BamHI i zligowano z nim fragmenty częściowo zdegradowanego chromosomalnego DNA. Ligację DNA przeprowadzono stosując zestaw do ligacji DNA (produkowany przez Takara Shuzo) zgodnie ze wskazaną metodą. Następnie otrzymaną mieszaniną DNA stransformowano, zgodnie ze zwykłą metodą Escherichia coli JM109 (produkowaną przez Takara Shuzo). Transformanty wysiano na podłoże agarowe L zawierające 100 pg/ml ampicyliny i hodowano je w celu przygotowania biblioteki genowej.
Na powierzchnię podłoża agarowego, na którym hodowano transformanty wylano roztwór reakcyjny zawierający 4 mM kwas p-nitrofenylofosforowy i 100 mM bufor MES/NaOH (pH 6,5) i utrzymywano temperaturę 30°C w ciągu 15 minut. Szczepy, w których zachodziła ekspresja aktywności fosfatazy uwalniały p-nitrofenol i wykazywały żółtą barwę. A zatem, transformanty selekcjonowano wykorzystując jako wskaźnik to zjawisko. W wyniku przeszukania ekspresyjnej biblioteki genowej, obejmującej około 8 000 szczepów transformantów, otrzymano 14 szczepów transformantów, w których zachodziła ekspresja aktywności fosfatazy.
Transformanty (14 szczepów), w których zachodziła ekspresja aktywności fosfatazy, poddano izolowaniu pojedynczych kolonii. Pojedynczymi koloniami zaszczepiono podłoże L (2,5 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i hodowano je w temperaturze 37°C wciągu 16 godzin. Do zebranych z płynnych hodowli komórek mikroorganizmu dodawano bufor octanu sodowego (100 mM, pH 5,0,50 μΐ) zawierający inozynę (2 g/dl) i pirofosforan sodowy (10 g/dl) w celu przeprowadzenia reakcji w temperaturze 30°C w ciągu 16 godzin. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego wykrywano przez analizę HPLC dla wyselekcjonowania szczepów mikroorganizmu wykazujących aktywność transfosforylacji. W wyniku, udało nam się uzyskać 3 szczepy transformantów, które wykazywały aktywność transfosforylacji dla których założono, że zawierają fragment DNA obejmujący stanowiący przedmiot wynalazku gen kwaśnej fosfatazy.
Przykład 16. Określanie sekwencji nukleotydowej genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae JCM 1650
Wstawiony fragment DNA analizowano przez ekstrakcję plazmidu zgodnie z metodą lizy alkalicznej z jednego z otrzymanych w przykładzie 15 szczepów transformantów, dla których założono, że zawierają fragment DNA obejmujący gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae JCM 1650. Plazmid ten oznaczono pEPI301. Fig. 6 przedstawia określoną mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne we wstawionym fragmencie DNA.
Region genu kwaśnej fosfatazy określono dokładniej przez subklonowanie. Wynik sugerował, że ten gen kwaśnej fosfatazy zawarty był we fragmencie o wielkości 2,4 kbp, wyciętym enzymami restrykcyjnymi Cla\ i Ro/mHL A zatem, w celu określenia sekwencji aminokwasowej skonstruowano plazmidowy DNA, z którym zligowano strawiony Cla\ i BamHI pBluescript KS(+) (produkowany przez Stratagene). Tym plazmidowym DNA, oznaczonym pEPI305, zgodnie ze zwykłą metodą stransformowano Escherichia coli JM109 (produkowaną przez Takara Shuzo), którą dla otrzymania transformanta wysiano na podłoże agarowe L zawierające 100 pg/ml ampicyliny.
183 293
Dla określenia sekwencji nukleotydowej, z transformanta Escherichia coli JM 109 (produkowanej przez Takara Shuzo) zawierającego pEPI305 wyekstrahowano plazmid zgodnie z metodąlizy alkalicznej. Sekwencję nukleotydowąokreślonej otwartej ramki odczytu przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 9 w Liście Sekwencji. Sekwencję aminokwasową białka, przewidzianą na podstawie sekwencji nukleotydowej, przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 10 w Liście Sekwencji. W sekwencji aminokwasowej stwierdzono częściową sekwencję całkowicie zgodną z N-końcową sekwencją aminokwasową oczyszczonego enzymu. Koniec N oczyszczonego enzymu rozpoczyna się resztą leucyny w pozycji 19 sekwencji przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 10. A zatem, zakłada się, że sekwencja aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 10 jest sekwencją białka prekursorowego i że peptyd obejmujący odcinek od reszty metioniny w pozycji 1 do reszty alaniny w pozycji 18 jest usuwany po translacji. Tak przewidzianą sekwencję aminokwasową dojrzałego białka przedstawiono w sekwencji o numrze identyfikacyjnym: 11 w Liście Sekwencji. Zgodnie z nią masę cząsteczkową dojrzałego białka obliczono na 25,1 kilodaltonów, co wykazuje dobrą zgodność z wynikiem SDS-PAGE oczyszczonego enzymu. Zgodnie z opisanymi powyżej wynikami, i ponieważ transformant zawierający plazmid obejmujący ten fragment wykazywał aktywność transfosforylacji, stwierdzono, że ta otwarta ramka odczytu była regionem kodującym stanowiącej przedmiot wynalazku kwaśnej fosfatazy.
Mianowicie, gen kodujący białko posiadające sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11 w Liście Sekwencji, jest genem kwaśnej fosfatazy Escherichia blattae JCM 1650.
Sekwencję nukleotydowąi sekwencję aminokwasowąporównano odpowiednio ze znanymi sekwencjami w poszukiwaniu homologii. Wykorzystano bazy danych EMBL i SWISS-PROT. W wyniku ujawniono, że białko przedstawione w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 8 i kodujący je DNA są nowe. Białko prekursorowe kodowane przez ten gen obejmuje 249 aminokwasów, a masa cząsteczkowa białka przewidziana na podstawie jego sekwencji wynosi 27,0 kilodaltonów.
Sekwencję aminokwasowąporównano ze znanymi sekwencjami pod względem homologii. W wyniku stwierdzono, że białko to wykazywało wysoki stopień homologii z kwaśną fosfatazą Providencia stuartii (77,1%), z kwaśną fosfatazą Morganella morganii z przykładu 8 (77,1%) oraz z kwaśną fosfatazą Salmonella typhimurium (44,3%).
Szczep Escherichia coli stransformowany plazmidem pEPI305 oznaczono AJ 13144 i zdeponowano w depozycie międzynarodowym 26 lutego 1996 r. w National Institute of Bioscience and Humań Technology of Agency of Industrial Science and Technology (kod pocztowy :305,1-3, Higashi 1 -chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia) na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego i nadano mu numer depozytowy FERM BP-5423.
Przykład 17. Wzmacnianie aktywności przez ekspresję genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae JCM 1650
Skonstruowaną w przykładzie 16 Escherichia coli JM 109/pMPI305 zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG i hodowano ją w temperaturze 27°C w ciągu 16 godzin. Komórki mikroorganizmu zebrano z hodowli przez wirowanie i przemyto je raz solą fizjologiczną. Komórki mikroorganizmu zawieszono w 100 mM buforze fosforanów potasowych (5 ml, pH 7,2) i rozbito je poprzez traktowanie ultradźwiękami prowadzone w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowany roztwór odwirowano dla usunięcia frakcji nierozpuszczlanej i tak przygotowano ekstrakt wolny od komórek.
Aktywność transfosforylacji otrzymanego ekstraktu wolnego od komórek mierzono jako kontrole stosując wolne od komórek ekstrakty przygotowane ze szczepu typu dzikiego Escherichia blattae oraz Escherichia coli JM 109 stransformowanej plazmidem pBluescript KS(+) w taki sam sposób, jak opisano powyżej. Wynik przedstawiono w tabeli 11. Aktywności transfosforylacji nie wykryto w Escherichia coli JM109/ppBluescript KS(+). Aktywność transfosforylacji była również niska w szczepie typu dzikiego Escherichia blattae. Z drugiej strony, Escherichia coli JM109/pEPI305 wykazywała wysoką aktywność transfosforylacji, która pod
183 293 względem aktywności właściwej była 120 razy wyższa od tej szczepu dzikiego Escherichia blattae. Zgodnie z tym wynikiem, wykazano, że wprowadzony fragment DNA umożliwia Escherichia coli ekspresję kwaśnej fosfatazy na wysokim poziomie.
Tabela 11
Szczep mikroorganizmu Aktywność transfosforylacji (jednostki/mg)
Escherichia blattae JCM 1650 Escherichia coli JM109/pBluescript KS(+) Escherichia coli JM109/pEPI305 0,002 nie wykryta 0,264
Przykład 18. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z inozyny przy użyciu szczepu zawierającego gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae JCM 1650
Pirofosforan sodowy (12 g/dl) i inozynę (6 g/dl) rozpuszczono w 100 mM buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich komórki opisanego powyżej mikroorganizmu Escherichia coli JM 109/pEPI305 w ilości do uzyskania stężenia komórek 100 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagę komórek mikroorganizmu. Mieszaninę reakcyjnąinkubowano w temperaturze 35°C w ciągu 10 godzin utrzymując pH 4,0 i ilość wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego mierzono w miarę upływu czasu. Wytwarzany kwas inozynowy zawierał tylko kwas 5'-inozynowy. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania kwasu 2'-inozynowego i kwasu 3'-inozynowego. Wynik przedstawiono na fig. 7. Kwas 5'-inozynowy był przy zastosowaniu tego mikroorganizmu wytwarzany i akumulowany maksymalnie wydajnie podczas krótkiego czasu reakcji wytwarzania z pirofosforanu i inozyny.
Przykład 19: Przygotowywanie genu kwaśnej fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Jak opisano w przykładach 17 i 18, w szczepie zawierającym gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae zachodzi ekspresja znaczących ilości kwaśnej fosfatazy i kwas 5'-inozynowy jest przy zastosowaniu tego mikroorganizmu wytwarzany i akumulowany maksymalnie wydajnie podczas krótkiego czasu reakcji wytwarzania z pirofosforanu i inozyny. Jednakże, ujawniono, że akumulowana ilość kwasu 5'-inozynowego nie przekracza pewnego stopnia, ponieważ wytworzony kwas 5'-inozynowy podlega degradacji przez aktywność fosfomonoesterazy samej kwaśnej fosfatazy. A zatem, zamierzono poprawić enzym przez wprowadzenie, zgodnie z metodą ukierunkowanej mutagenezy przy użyciu PCR, mutacji do sklonowanego w przykładzie 13 genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej Escherichia blattae.
Zgodnie z metodąwykorzystującąfosforynoamidy, stosując syntezator DNA (Model 394, produkowany przez Applied Biosystems), zsyntetyzowano oligonukleotydy MUT300, MUT310 i MUT320, przedstawione odpowiednio w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 12, 13 i 14 w Liście Sekwencji.
Do 100 mM buforu Tris-HCl (pH 8,3,1 OOpl) zawierającego dATP, dCTP, dGTP, dTTP (każdy 200 μΜ), chlorek potasowy (50 mM) i chlorek magnezowy (1,5 mM) dodano jako matrycę przygotowany w przykładzie 13 plazmid pEPI305 (1 ng),jako startery starter RV Ml 3 (produkowany przez Takara Shuzo) i oligonukleotyd MUT310 (2,5 pmola każdego) oraz polimerazę DNA Taq (2,5 jednostki, produkowana przez Takara Shuzo) w celu przeprowadzenia reakcji PCR, w której cykl obejmujący okresy 30 sekund w temperaturze 94°C, 2 minut w temperaturze 55°C i 3 minut w temperaturze 72°C powtórzono 25 razy. Reakcję PCRprzeprowadzono stosując Thermal Cycler typu PJ2000 (produkowany przez Takara Shuzo). Reakcję PCR przeprowadzono również w taki sam sposób, jak opisano powyżej, stosując jako matrycą plazmid pEPI305 (1 ng) i jako startery starter M3 Ml3 (produkowany przez Takara Shuzo) i oligonukloetyd MUT300 (2,5 pmola każdego). Każdy z roztworów reakcyjnych oczyszczono przez sączenie molekularne przy użyciu kolumny Microspin S-400 (produkowanej przez Pharmacia) w celu usunięcia starterów.
183 293
Każdy z produktów reakcji PCR (Ipl) dodano do 100 mM buforu Tris-HCl (pH 8,3,95 μΐ) zawierającego dATP, dCTP, dGTP, dTTP (każdy 200 μΜ), chlorek potasowy (50 mM) i chlorek magnezowy (1,5 mM) i ogrzewano je w temperaturze 94°C w ciągu 10 minut, a następnie schładzano do temperatury 37°C w ciągu 60 minut. Następnie utrzymywano temperaturę 37°C w ciągu 15 minut dla utworzenia heterodupleksu. Dodano polimerazę DNA Taq (2,5 jednostek) w celu przeprowadzenia reakcji w temperaturze 72°C w ciągu 3 minut, aby zakończyć tworzenie heterodupleksu. Następnie do tego roztworu reakcyjnego dodano starter RV Ml3 i starter M3 Ml3 (każdego po 2,5 pmola) w celu przeprowadzenia reakcji PCR, podczas której 10 razy powtórzono cykl obejmujący okresy 30 sekund w temperaturze 94°C, 2 minut w temperaturze 55°C i 3 minut w temperaturze 72°C.
Produkt drugiej reakcji PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi Ciał i Bamłll, a następnie wyekstrahowano fenolem/chloroformem i wytrącono etanolem. Ten fragment DNA zligowano z pBluescript KS(+) strawionym Ciał i Bamłłl. Otrzymanym DNA plazmidowym stransformowano Escherichia coli JM 109 (produkowaną przez Takara Shuzo) zgodnie ze zwykłą metodą i wysiano ją na podłoże agarowe L zawierające 100 pg/ml ampicyliny dla otrzymania transformanta.
Plazmid wyekstrahowano z transformanta zgodnie z metodą lizy alkalicznej dla określenia jego sekwencji nukloetydowej, potwierdzając, że docelowy nukleotyd został podstawiony. Tak więc przygotowano gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, w której resztę glicyny w pozycji 74 (GGG) dojrzałego białka podstawiono resztą kwasu asparaginowego (G*A*T). Plazmid obejmujący ten zmutowany gen oznaczono pEPI310.
Przygotowano zmutowany gen kodujący zmutowaną fosfatazę, w której resztę izoleucyny w pozycji 153 (ATC) dojrzałego białka podstawiono resztą treoniny (A*CC), zgodnie z taką samą procedurą jak opisano powyżej, z zastosowaniem pEPI305 jako matrycy i oligonukleotydów MUT300 i MUT320 jako starterów. Plazmid zawierający ten zmutowany gen oznaczono pEPI320. Ponadto, przygotowano zmutowany gen kodujący zmutowaną fosfatazę, w której resztę glicyny w pozycji 74 (GGG) dojrzałego białka podstawiono resztą kwasu asparaginowego (G*A*T) oraz resztę izoleucyny w pozycji 153 (ATC) dojrzałego białka podstawiono resztą treoniny (A*CC), zgodnie z taką samą procedurą jak opisano powyżej, z zastosowaniem pEPI310 jako matrycy i oligonukleotydów MUT300 i MUT320 jako starterów. Plazmid zawierający ten zmutowany gen oznaczono pEPI330.
Escherichia coli JM109/pEPI310, Escherichia coli JM109/pEPI320 i Escherichia coli JM109/pEPI330, do których wprowadzono plazmidy obejmujące odpowiednie geny zmutowanej kwaśnej fosfatazy, oraz Escherichia coli JM109/pEPI305, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen kwaśnej fosfatazy typu dzikiego, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 μΐ/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano je w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin. Komórki mikroorganizmów zbierano z hodowli i raz przemywano solą fizjologiczną. Komórki mikroorganizmów zawieszano w 100 mM buforze fosforanów w potasowych (5 ml, pH 7,0) i rozbijano przez traktowanie ultradźwiękami w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowane roztwory wirowano w celu usunięcia frakcji nierozpuszczalnych i w ten sposób przygotowywano ekstrakty wolne od komórek. Aktywności fosfomonoesteraz i aktywności transfosforylacji otrzymanych wolnych od komórek ekstraktów zmierzono w pH 4,0 i porównano z aktywnością szczepu dzikiego.
Tabela 12 przedstawia wynik pomiaru aktywności fosfomonoesteraz i aktywności transfosforylacji kwaśnej fosfatazy typu dzikiego i zmutowanych kwaśnych fosfataz. Wykazuje on, że zarówno aktywności fosfomonoesteraz, jak i aktywności transfosforylacji zmutowanych kwaśnych fosfataz sąobniżone w porównaniu z kwaśnąfosfatazątypu dzikiego, oraz że stopnie obniżenia aktywność fosfomonoesteraz są wyższe od obniżenia stopnia aktywności transfosforylacji, czego wynikiem jest obniżenie stosunku aktywności fosfomonoesterazy do aktywności transfosforylacji zmutowanej kwaśnej fosfatazy w porównaniu z kwaśną fosfatazą typu dzikiego.
183 293
Tabela 12
Plazmid Aktywność fosfomonoesterazy (jednostki/mg) Aktywność transfosforylacji (jednostki/mg) Stosunek1* (wartość względna)
pEPI305 2,38 0,132 18,03 (100)
pEPI310 0,26 0,019 13,68 (76)
pEPI320 0,88 0,123 7,15 (39)
pEPI330 0,42 0,070 6,00 (33)
Stosunek aktywności fosfomonoesteraz do aktywności wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu
Przykład 20. Wytwarzanie kwasu 5'-inozy nowego z inozyny z zastosowaniem szczepów zawierających gen kodujący kwaśną fosfatazę o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Escherichia coli JM109/pEPI310, Escherichia coli JM109/pEPI320 i Escherichia coli JM109/pEPI330, do których wprowadzono plazmidy obejmujące zmutowane geny kwaśnej fosfatazy, oraz Escherichia coli JM109/pEPI305, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen kwaśnej fosfatazy typu dzikiego, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierający 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano je w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin.
Pirofosforan sodowy (12 g/dl) i inozynę (6 g/dl) rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pfl 4,0), i dodawano do nich komórki mikroorganizmów każdego ze szczepów Escherichia coli otrzymanych przez opisanąpowyżej hodowlę, w ilości do uzyskania stężenia komórek 200 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagę komórek mikroorganizmu. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 35°C w ciągu 32 godzin utrzymując pH 4,0 i ilość wytwarzanego w reakcji kwasu 5'-inozynowego mierzono w miarę upływu czasu. Wynik przedstawiono na fig. 8.
Na figurze 8 oś rzędnych wskazuje stężenie kwasu 5'-inozynowego (mg/dl), a oś odciętych wskazuje czas reakcji (h). Postęp reakcji oznaczono pełnymi kółkami dla Escherichia coli JM109/pEPI305, pełnymi trójkątami dla Escherichia coli JM 109/pEPI310, pustymi kółkami dla Escherichia coli JM109/pEPI320 i pełnymi kwadratami dla Escherichia coli JM109/pEPI330, jak mierzono z wykorzystaniem komórek mikroorganizmów odpowiednich szczepów.
Szybkość degradacji wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego była obniżona w reakcji jego wytwarzania z inozyny przy użyciu szczepów zawierających gen kwaśnej fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy. W wyniku tego, wydajność i akumulowana ilość kwasu 5'-inozynowego były zwiększone. Największą akumulację kwasu 5'-inozynowego wykazywała Escherichia coli JM109/pEPI330, jako szczep zawierający gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy, w której resztę glicyny w pozycji 74 i resztę izoleucyny w pozycji 153 podstawiono odpowiednio resztą kwasu aspraginianowego i resztą treoniny.
Przykład21. Wytwarzanie różnych 5'-fosforanowych estrów nukleozydów przy użyciu szczepów zawierających gen kodujący kwaśną fosfatazę o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Escherichia coli JM109/pEPI330, do której -wprowadzono plazmid obejmujący gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano ją w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin.
Pirofosforan sodowy (12 g/dl) i inozynę, guanozynę, urydynę lub cytydynę (6 g/dl) jako akceptory grup fosforanowych rozpuszczono w 100 mM buforze octanu sodowego (pH 4,0), i dodano do nich opisane powyżej komórki mikroorganizmu, w ilości do uzyskania stężenia komórek 200 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagę komórek. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 35°C w ciągu 32 godzin utrzymując pH 4,0. Ilości wytwarzanych 5'-fosforanowych estrów nukleozydów przedstawiono w tabeli 13. Wytwarzany nukleotyd zawierał tylko ester 5'-fosforanowy nukleozydu. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania 2'-fosforanowego estru nukleozydu i 3'-fosforanowego estru nukleozydu.
183 293
Tabela 13
Nukleozyd Produkt Wytwarzana ilość (g/dl)
Inozyna kwas 5'-inozynowy 7,45
Guanozyna kwas 5'-guanylowy 4,77
Urydyna kwas 5'-urydylowy 8,93
Cytydyna kwas 5'-cytydylowy 6,60
Przykład 22. Wytwarzanie kwasu 5'-inozyno wego z różnych związków fosforanowych jako donorów grup fosforanowych przy użyciu szczepów zawierających gen kodujący kwaśną fosfatazę o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Escherichia coli JM109/pEPI330, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano ją w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin.
Inozynę (6 g/dl) i tripolifosforan sodowy, polifosforan sodowy (nazwa fabryczna: Poły gon P, produkowany przez Chiyoda Chemical), fenylofosforan disodowy łub karbamoilofosforan disodowy (12 g/dl) jako donory grup fosforanowych rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,0), i dodawano do nich opisane powyżej komórki mikroorganizmu, w ilości do uzyskania stężenia komórek 200 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagą komórek mikroorganizmu. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 35°C wciągu 32 godzin utrzymując pH 4,0. Ilość wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego przedstawiono w tabeli 14. Kwas 5'-inozynowy był wydajnie wytwarzany i akumulowany przy wykorzystaniu każdego z donorów grup fosforanowych. Jednakże, akumulacja kwasu 5'-inozynowego była najwyższa, gdy jako donor grup fosforanowych stosowano kwas polifosforowy.
Tabela 14
Donor grup fosforanowych Wytwarzany kwas 5'inozynowy (g/dl)
Tripolifosforan sodowy 5,96
Polifosforan sodowy 8,84
Fenylofosforan disodowy 7,60
Karbamoilofosforan disodowy 7,73
Przykład 23. Izolowanie genu kwaśnej fosfatazy pochodzącego z chromosomu Providencia stuartii i określanie sekwencji nukloetydowej genu
Zsyntetyzowano oligonukleotydy PRP1 i PRP2, posiadające sekwencje nukleotydowe przedstawiono odpowiednio w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 15 i 16 w Liście Sekwencji. Oligonukleotydy te przeznaczone sądo amplifikacji genu kodującego kwaśną fosfatazą Providencia stuartii na podstawie znanej sekwencji nukloetydowej genu kodującego kwaśną fosfatazą Providencia stuartii (numer dostępu bazy danych EMBL Χ64820).
Z hodowanych komórek Providencia stuartii ATCC 29851 wyekstrahowano chromosomalny DNA według metody Murraya i Thomsona (Nuci. Acid. Res., 4321,8(1980)). Do 100 mM buforu Tris-HCl (pH 8,3, 100 μΐ) zawierającego dATP, dCTP, dGTP i dTTP (każdy 200 μΜ), chlorek potasowy (50 mM) i chlorek magnezowy (1,5 mM) dodano chromosomalny DNA (0,1 ng) jako matrycę, oligonukleotydy PRP1 i PRP2 (każdy 2,5 μΜ) jako startery i polimerazę DNA Taq (2,5 jednostek, produkowana przez Takara Shuzo) w celu przeprowadzenia reakcji PCR, w której cykl obejmujący okresy 30 sekund w temperaturze 94°C, 2 minut w temperaturze 55°C i 3 minut w temperaturze 72°C powtórzono 30 razy. Roztwór reakcyjny poddano elektroforezie w żelu agarozowym, a następnie odzyskano zamplifikowany fragment DNA o długości około 1 kbp stosując proszek szklany (produkowany przez Takara Shuzo). Fragment genowy strawiono 5amHI i zligowano ze strawionym 5«mHI pUCl 18. Plamid otrzymany w opisany powyżej sposób oznaczono pPRPlOO.
183 293
Mierzono aktywność fosfomonoesterazy i aktywność transfosforylacji Escherichia coli JM109/pPRP100, transformanta, do którego wprowadzono pPRPlOO. W wyniku stwierdzono, że szczep wykazywał aktywność transfosforylacji nukleozydu, jak również aktywność fosfomonoesterazy.
Plazmid z tansformanta Escherichia coli HM109/pPRP100 wyekstrahowano zgodnie z metodą lizy alkalicznej w celu określenia sekwencji nukleotydowej. Sekwencję nukleotydwą określonej otwartej ramki odczytu i sekwencję aminokwasową białka przewidzianą na podstawie sekwencji nukleotydowej przedstawiono w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 17 i 18 w Liście Sekwencji. Sekwencja nukloetydowa otwartej ramki odczytu jest w pełni zgodna z sekwencją nukleotydową znanego genu kwaśnej fosfatazy Providencia stuartii.
Przykład 24. Izolowanie genów kwaśnej fosfatazy pochodzących z chromosomów Enierobacier aerogenes, Klebsiellaplanticola i Serratiaficaria i określanie sekwencji nukleotydowych genów
Z hodowanych komórek mikroorganizmów Enterobacter aerogenes IFO 12010, Klebsiella planticola IFO 14939 i Serratiaficaria IAM 13540 wyekstrahowano chromosomalny DNA według metody Murraya i Thomsona (Nuci. Acid. Res., 4321, 8 (1989)). Następnie, zgodnie z metodą opisaną w przykładzie 7, skontruowano ekspresyjną bibliotekę genów chromosomalnych obejmującą około 20 000 transformantów Escherichia coli JM109 i przeszukano ją dla otrzymania transformantów, które wykazywały aktywność transfosforylacji. Uważano, że każdy z tych transformantów zawiera gen kwaśnej fosfatazy pochodzący z każdego z oryginalnych szczepów.
Plazmidowy DNA z jednego z transformantów Escherichia coli, który, jak uważano, posiadał gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Enterobacter aerogenes IFO 12010 wyekstrahowano zgodnie z metodą lizy alkalicznej i analizowano wstawką DNA plazmidu. Mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne wstawki DNA pochodzącego z Enterobacter aerogenes IFO 12010 przedstawiono na fig. 9.
Wynik określania regionu genu kwaśnej fosfatazy przez subklonowanie, sugerował, że gen kwaśnej fosfatazy zawarty jest we fragmencie o długości 1,6 kbp wyciętym enzymami restrykcyjnymi Sali i Kpnl. Następnie fragment SaR-Kpnl zligowano ze strawionym Sali i Kpnl pUCl 18 w celu skonstruowania plazmidu. Otrzymany plazmid oznaczono pENPl 10.
Zgodnie z procedurą opisanąpo wyżej, z jednego z transformantów Escherichia coli, który, jak uważano, posiadał gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Klebsiella planticola IFO 14939, wyekstrahowano plazmidowy DNA według metody lizy alkalicznej i analizowano wstawkę DNA plazmidu. Powyższy plazmid oznaczono pKLPlOO. Mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne wstawki DNA pochodzącego z Klebsiella planticola IFO 14939 przedstawiono na fig. 10.
Wynik określania regionu genu kwaśnej fosfatazy przez subklonowanie sugerował, że gen kwaśnej fosfatazy zawarty jest we fragmencie o długości 2,2 kbp wyciętym enzymami restrykcyjnymi Kpnl i EcoRI. Następnie fragment Kpnl-EcoRI zligowano ze strawionym Kpnl i EcoRI pUCl 18 w celu skonstruowania plazmidu. Otrzymany plazmid oznaczono pKLPl 10.
Podobnie, plazmidowy DNA wyekstrahowano według metody lizy alkalicznej z jednego z transformantów Escherichia coli, który, jak uważano, posiadał gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Serratiaficaria IAM 13540, i analizowano wstawką DNA plazmidu. Powyższy plazmid oznaczono pSEPlOO. Mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne wstawki DNA pochodzącego z Serratia ficaria IAMFO 13540 przedstawiono na fig. 11.
Wynik określania regionu genu kwaśnej fosfatazy przez subklonowanie sugerował, że gen kwaśnej fosfatazy zawarty jest we fragmencie o długości 1,4 kbp wyciętym enzymami restrykcyj nymi Hindlll. Następnie fragment Hindlll zligowano ze strawionym Hindlll pUC 118 w celu skonstruowania plazmidu. Otrzymany plazmid oznaczono pSEPHO.
Następnie z transformantów Escherichia coli JM109/pENPl 10, Escherichia coli JM109/pKLP110 i Escherichia coli JM109/pSEP110, do których wprowadzono odpowiednio pENP 110, pKLP 110 i pSEP 110, wyekstrahowano plazmidowe DNA według metody lizy alka
183 293 licznej. Sekwencje nukleotydowe wstawek tych plazmidów określono zgodnie z metodą opisaną w przykładzie 8. Określone sekwencje nukleotydowe otwartych ramek odczytu wstawek przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 19 dlaEnterobacter aerogenes IFO 12010, w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 21 dla Klebsiellaplanticola IFO 14939 i w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 23 dla Serratia ficaria IAM 13540. Ponadto, przewidziane sekwencje aminokwasowe przedstawiono odpowiednio w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 20, 22 i 24. Ponieważ transformanty zawierające plazmidy obejmujące te fragmenty wykazywały aktywność transfosforylacji, stwierdzono, że te otwarte ramki odczytu były docelowymi genami kwaśnej fosfatazy.
Sekwencje nukleotydowe i sekwencje aminokwasowe porównano odpowiednio ze znanymi sekwencjami w poszukiwaniu homologii. Wykorzystano bazy danych EMBL i SWISS-PROT. W wyniku ujawniono, że geny przedstawione w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 19, 21 i 23 w Liście Sekwencji są nowymi genami. Zakłada się, że białko kodowane przez gen pochodzący z Enterobacter aerogenes IFO 12010 obejmuje 248 reszt aminokwasowych, białko kodowane przez gen pochodzący z Klebsiellaplanticola IFO 14939 obejmuje 248 reszt aminokwasowych, a białko kodowane przez gen pochodzący z Serratia ficaria IAM 13540 obejmuje 244 reszty aminokwasowe. Istnieje możliwość, że białka te mogą być białkami prekursorowymi, podobnie jak kwaśne fosfatazy pochodzące z Morganella morganii i Escherichia blattae.
Sekwencje aminowaksowe przewidziane na podstawie sekwencji nukloetydowych przedstawiono w kodzie jednoliterowym na fig. 12, razem z przewidzianymi sekwencjami aminokwasowymi otrzymanej w przykładzie 8 kwaśnej fosfatazy Morganella morganii NCIMB 10466, otrzymanej w przykładzie 16 kwaśnej fosfatazy Escherichia blattae JCM 1650 i znaną sekwencją aminokwasową kwaśnej fosfatazy Providencia stuartii (numer dostępu EMBL Χ64820). Wspólne reszty aminokwasowe dla wszystkich sekwencji aminokwasowych wskazano na fig. 12 gwiazdkami pod sekwencjami.
Jak przedstawiono na fig. 12, sekwencje aminokwasowe kwaśnych fosfataz pochodzących z sześciu szczepów są w wysokim stopniu wzajemnie homologiczne i dla wszystkich sekwencji aminokwasowych 130 reszt aminokwasowych jest wspólnych. A zatem, zakłada się, że te kwaśne fosfatazy posiadają podobne funkcje.
Przykład 25. Wzmacnianie aktywności przez ekspresję genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Enterobacter aerogenes, Klebsiella planticola i Serratia ficaria.
Skonstruowaną w przykładzie 23 Escherichia coli JM109/pPRP100 oraz skonstruowanymi w przykładzie 24 Escherichia coli JM109/pENP110, Escherichia coli JM109/pKLP110 i Escherichia coli JM109/pSEPl 10 zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG i hodowano w temperaturze 27°C w ciągu 16 godzin. Komórki mikroorganizmów zbierano z hodowli przez wirowanie i przemywano je raz solą fizjologiczną. Komórki mikroorganizmów zawieszano w 10 mM buforze fosforanów potasowych (5 ml, PH 7,0) i rozbijano je przez traktowanie ultradźwiękami prowadzone w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowane roztwory wirowano dla usunięcia frakcji nierozpuszczalnej i tak przygotowano ekstrakty wolne od komórek.
Aktywności transfosforylacji otrzymanych ekstraktów wolnych od komórek mierzono jako kontrole stosując wolne od komórek ekstrakty przygotowane z Providencia stuartii ATCC 29851, Enterobacter aerogenes IFO 12010, Klebsiella planticola IFO 14939, Serratia ficaria IAM 13450 i Escherichia coli JM109 stransformowanych plazmidem pUCl 18 w taki sam sposób, jak opisano powyżej. Wynik przedstawiono w tabeli 15. Aktywności transfosforylacji były niskie we wszystkich szczepach typu dzikiego. Aktywności transfosforylacji nie wykryto w Escherichia coli JM109/pUCl 18. Z drugiej strony, Escherichia coli JM109, do których wprowadzono geny kwaśnej fosfatazy, wykazywały wysokie aktywności transfosforylacji w porównaniu ze szczepami typu dzikiego. Na podstawie tego wyniku wykazano, że każdy z wprowadzonych fragmentów DNA umożliwia Escherichia coli ekspresję kwaśnej fosfatazy na wysokim poziomie.
183 293
Tabela 15
Szczep mikroorganizmu Aktywność transfosforyłacji (jednostki/mg)
Providencia stuartii ATCC 29851 0,005
Entrobacter aerogenes IFO 12010 0,002
Klebsiellaplanticola IFO 14939 0,002
Serratia ficaria LAM 13450 0,001
Escherichia coli JM109/pUCl 18 nie wykryta
Escherichia coli JM109/pPRP100 0,833
Escherichia coli JM109/pENPl 10 0,301
Escherichia coli JM 109/pKLP 110 0,253
Escherichia coli JM109/pSEPl 10 0,123
Zastosowania przemysłowe
Według niniejszego wynalazku, 5'-fosforanowy ester nukleozydu można tanio i wydajnie wytwarzać umożliwiając działanie kwaśnej fosfatazy w warunkach pH 3,0 do 5,5 na nukleozyd i donor grup fosforanowych wybrany z grupy składającej się z kwasu polifosforowego i jego soli, kwasu fenylofosforowego i jego soli oraz karbamoilofosforanu i jego soli. Szczególnie, ^-fosforanowy ester nukleozydu można wytwarzać wydajniej przez zastosowanie kwaśnej fosfatazy zapewnianej przez niniejszy wynalazek, czyli kwaśnej fosfatazy posiadającej mutację obniżającą aktywność fosfomonoesterazy.
183 293
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:
(i) ZGŁASZAJĄCY: Ajinomoto Co., Inc.
(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Metoda wytwarzania 5'- fosforanowego estru nukleozydu (iii) LICZBA SEKWENCJI: 24 (iv) ADRES DO KRESPONDENCJI:
(A) ADRESAT:
(B) ULICA:
(C) MIASTO:
(D) STAN:
(E) KRAJ:
(F) KOD:
(V) ZAPIS KOMPUTEROWY:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: PC kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release # 1.0, wersja # 1.30 (vi) DANE DOTYCZĄCE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZŁOŻENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 7-149781 (B) DATA ZŁOŻENIA: 5 maja 1995 (vii) DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 8-094680 (B) DATA ZŁOŻENIA: 26 marca 1996
183 293 (viii) INFORMACJE O PEŁNOMOCNIKU/PRZEDSTAWICIELU:
(A) NAZWISKO:
(B) NUMER REJESTRACYJNY:
(ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
(A) TELEFON:
(B) TELEFAX:
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOSĆ: 20 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (v) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Morganella morganii (B) SZCZEP: NCIMB 10466 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 1:
Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr 1 5 10 15
Leu Lys Asn Glu 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 750 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
183 293 (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Morganella morganii (B) SZCZEP: NCIMB 10466 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..747 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd sygnałowy (B) POŁOŻENIE: 1..60 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd dojrzały (B) POŁOŻENIE: 61..747 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 2:
ATG AAG AAG AAT ATT ATC GCC GGT TGT CTG TTC TCA CTG TTT TCC CTT 48
Met -20 Lys Lys Asn Ile Ile Ala Gly -15 Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu -10 -5
TCC GCG CTG GCC GCG ATC CCG GCG GGC AAC GAT GCC ACC ACC AAG CCG 96
Ser Ala Leu Ala Ala Ile Pro Ala 1 Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro 5 10
GAT TTA TAT TAT CTG AAA AAT GAA CAG GCT ATC GAC AGC CTG AAA CTG 144
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu 15 20 Gin Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu 25
TTA CCG CCA CCG CCG GAA GTC GGC AGT ATT CAG TTT TTA AAT GAT CAG 192
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Gin Phe Leu Asn Asp Gin
30 35 40
GCA ATG TAT GAG AAA GGC CGT ATG CTG CGC AAT ACC GAG CGC GGA AAA 240
Ala 45 Met Tyr Glu Lys Gly Arg 50 Met Leu Arg Asn Thr 55 Glu Arg Gly Lys 60
CAG GCA CAG GCA GAT GCT GAC CTG GCC GCA GGG GGT GTG GCA ACC GCA 288
Gin Ala Gin Ala Asp 65 Ala Asp Leu Ala Ala 70 Gly Gly Val Ala Thr 75 Ala
TTT TCA GGG GCA TTC GGC TAT CCG ATA ACC GAA AAA GAC TCT CCG GAG 336
Phe Ser Gly Ala 80 Phe Gly Tyr Pro Ile 85 Thr Glu Lys Asp Ser 90 Pro Glu
183 293
CTG TAT AAA CTG CTG ACC AAT ATG ATT GAG GAT GCC GGT GAT CTT GCC 384
Leu Tyr Lys 95 Leu Leu Thr Asn Met 100 Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 105
ACC CGC TCC GCC AAA GAA CAT TAC ATG CGC ATC CGG CCG TTT GCG TTT 432
Thr Arg 110 Ser Ala Lys Glu His Tyr 115 Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 120
TAC GGC ACA GAA ACC TGT AAT ACC AAA GAT CAG AAA AAA CTC TCC ACC 480
Tyr Gly 125 Thr Glu Thr Cys Asn Thr 130 Lys Asp Gin Lys Lys Leu Ser Thr 135 140
AAC GGA TCT TAC CCG TCA GGT CAT ACG TCT ATC GGC TGG GCA ACC GCA 528
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His 145 Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala 150 155
CTG GTG CTG GCG GAA GTG AAC CCG GCA AAT CAG GAT GCG ATT CTG GAA 576
Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro 160 Ala 165 Asn Gin Asp Ala Ile Leu Glu 170
CGG GGT TAT CAG CTC GGA CAG AGC CGG GTG ATT TGC GGC TAT CAC TGG 624
Arg Gly Tyr 175 Gin Leu Gly Gin Ser 180 Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 185
CAG AGT GAT GTG GAT GCC GCG CGG ATT GTC GGT TCA GCC GCT GTC GCG 672
Gin Ser 190 Asp Val Asp Ala Ala Arg 195 Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala 200
ACA TTA CAT TCC GAT CCG GCA TTT CAG GCG CAG TTA GCG AAA GCC AAA 720
Thr Leu 205 CAG GAA Gin Glu His TTT Phe Ser Asp Pro Ala Phe 210 GCA CAA AAA TCA CAG Ala Gin Lys Ser Gin Gin AAA Lys Ala Gin Leu Ala Lys Ala Lys 215 220 TAA 750
225 229 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 249 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Morganella morganii (B) SZCZEP: NCIMB 10466 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 3:
183 293
Met Lys Lys Asn Ile Ile Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu
-20 -15 -10 -5
Ser Ala Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro
1 5 10
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu Gin Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu
15 20 25
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Gin Phe Leu Asn Asp Gin
30 35 40
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys
45 50 55 60
Gin Ala Gin Ala Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala
65 70 75
Phe Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu
80 85 90
Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
95 100 105
Thr Arg Ser Ala Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
110 115 120
Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gin Lys Lys Leu Ser Thr
125 130 135 140
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala
145 150 155
Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro Ala Asn Gin Asp Ala Ile Leu Glu
160 165 170
Arg Gly Tyr Gin Leu Gly Gin Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp
175 180 185
Gin Sę-r Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala
190 195 200
Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gin Ala Gin Leu Ala Lys Ala Lys
205 210 215 220
Gin Glu Phe Ala Gin Lys Ser Gin Lys
225 229
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 229 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko
183 293 (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Morganella morganii (B) SZCZEP: NCIMB 10466 (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 4:
Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Lys Asn Glu Gin Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu Leu Pro Pro Pio
20 25 30
Pro Glu Val Gly Ile Gin Phe Leu Asn Asp Gin Ala Met Tyr Glu
35 40 45
Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Gin Ala Gin Ala
50 55 60
Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala Phe Ser Gly Ala
65 70 75 80
Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu Leu Tyr Lys Leu
85 90 95
Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala
100 105 110
Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Gly Thr Glu
115 120 125
Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gin Lys Lys Leu Ser Thr Asn Gly Tyr
130 135 140
Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala
145 150 155 160
Glu Val Asn Pro Ala Asn Gin Asp Ala Ile Leu Glu Arg Gly Tyr Gin
165 170 175
Leu Gly Gin Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gin Ser Asp Val
180 185 190
Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala Thr Leu His Ser
195 200 205
Asp Pro Ala Phe Gin Ala Gin Leu Ala Lys Ala Lys Gin Glu Phe Ala
210 215 220
Gin Lys Ser Gin Lys
225 229
183 293 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= “Syntetyczny DNA” (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 5:
ATTACCATGA TTACGAATTC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= Syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: TAK (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 6: GCGGTTGCCA CATCCCCTGC G (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy
183 293 (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= Syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (IV) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 7:
TTGCCCAGCC GGTAGACGTA A (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (v) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Escherichia blattae (B) SZCZEP: JMC 1650 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 8:
Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro Asp
10 15
Leu (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 750 par zasad
183 293 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Escherichia blattae (B) SZCZEP: JCM 1650 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..747 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd sygnałowy (B) POŁOŻENIE: 1..54 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd dojrzały (B) POŁOŻENIE: 55..747 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 9:
ATG AAA AAA CGT GTT CTG GCA GTT TGT TTT GCC GCA TTG TTC TCT TCT 48
Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser
-18 -15 -10 -5
CAG GCC CTG GCG CTG GTC GCT ACC GGC AAC GAC ACT ACC ACG AAA CCG 96
Gin Ala Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro
1 5 10
GAT CTC TAC TAC CTC AAG AAC AGT GAA GCC ATT AAC AGC CTG GCG CTG 144
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Sę-r Leu Ala Leu
15 20 25 30
TTG CCG CCA CCA CCG GCG GTG GGC TCC ATT GCG TTT CTC AAC GAT CAG 192
Leu Pro Pro Pro Pro Ala Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gin
35 40 45
GCC ATG TAT GAA CAG GGG CGC CTG CTG CGC AAC ACC GAA CGC GGT AAG 240
Ala Met Tyr Glu Gin Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys
50 55 60
183 293
CTG GCG GCG GAA GAT GCA AAC CTG AGC AGT GGC GGG GTG GCG AAT GCT 288 Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Alą
7075
TTC TCC GGC GCG TTT GGT AGC CCG ATC ACC GAA AAA GAC GCC CCG GCG336
Phe Ser Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala ProAla
8590
CTG CAT AAA TTA CTG ACC AAT ATG ATT GAG GAC GCC GGG GAT CTG GCG384
Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp LeuAla
100 105110
ACC CGC AGC GCG AAA GAT CAC TAT ATG CGC ATT CGT CCG TTC GCG TTT432
Thr Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe AlaPhe
115 120125
TAT GGG GTC TCT ACC TGT AAT ACC ACC GAG CAG GAC AAA CTG TCC AAA480
Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu SerLys
130 135140
AAT GGC TCT TAT CCG TCC GGG CAT ACC TCT ATC GGC TGG GCT ACT GCG528
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala ThrAla
145 150155
CTG GTG CTG GCA GAG ATC AAC CCT CAG CGC CAG AAC GAG ATC CTG AAA576
Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu Ile LeuLys
160 165170
CGC GGT TAT GAG CTG GGC CAG AGC CGG GTG ATT TGC GGC TAC CAC TGG624
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gin Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr HisTrp
175 180 185190
CAG AGT GAT GTG GAT GCC GCG CGG GTA GTG GGA TCT GCC GTT GTG GCG672
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val ValAla
195 200205
ACC CTG CAT ACC AAC CCG GCG TTC CAG CAG CAG TTG CAG AAA GCG AAG720
Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys AlaLys
210 215220
GCC GAA TTC GCC CAG CAT CAG AAG AAA TAA750
Ala Glu Phe Ala Gin His Gin Lys Lys
225230 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 249 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko
183 293 (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Escherichia blattae (B) SZCZEP: JCM 1650 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 10:
Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser
-18 Gin Ala Leu -15 Ala Leu Val Ala Thr -10 Gly Asn Asp Thr Thr -5 Thr Lys Pro
Asp Leu 1 Tyr Tyr Leu Lys 5 Asn Ser Glu Ala Ile 10 Asn Ser Leu Ala Leu
15 Leu Pro Pro Pro Pro 20 Ala Val Gly Ser Ile 25 Ala Phe Leu Asn Asp 30 Gin
Ala Met Tyr Glu 35 Gin Gly Arg Leu Leu 40 Asn Thr Glu Arg 45 Gly Lys
Leu Ala Ala 50 Glu Asp Ala Asn Leu 55 Ser Ser Gly Gly Val 60 Ala Asn Ala
Phe Ser 65 Gly Ala Phe Gly Ser 70 Pro Ile Thr Glu Lys 75 Asp Ala Pro Ala
Leu 80 His Lys Leu Leu Thr 85 Asn Met Ile Glu Asp 90 Ala Gly Asp Leu Ala
95 Thr Arg Ser Ala Lys 100 His Tyr Met Arg 105 Ile Arg Pro Phe Ala 110 Phe
Tyx* Gly Val 115 Thr Cys Asn Thr Thr 120 Glu Gin Asp Lys Leu 125 Lys
Asn Gly Ser 130 Tyr Pro Ser Gly His 135 Thr Ser Ile Gly Trp 140 Ala Thr Ala
Leu Val 145 Leu Ala Glu Ile Asn 150 Pro Gin Arg Gin Asn 155 Glu Ile Leu Lys
Ąyg 160 Gly Tyr Glu Leu Gly 165 Gin Ser Arg Val Ile 170 Cys Gly Tyr His Trp
175 Gin Ser Asp Val Asp 180 Ala Ala Arg Val Val 185 Gly Ser Ala Val Val 190 Ala
Thr Leu His Thr 195 Asn Pro Ala Phe Gin 200 Gin Gin Leu Gin Lys 205 Ala Lys
Ala Glu Phe 225 210 Ala Gin His Gin Lys 230 215 Lys 220
183 293 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 231 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Escherichia blattae (B) SZCZEP: JCM 1650 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 11:
Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro Asp Leu
1 5 10 15
Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Glu Ala Ile Asn Ser Leu Ala Leu Leu Pro
20 25 30
Pro Pro Pro Ala Val Gly Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gin Ala Met
35 40 45
Tyr Glu Gin Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Leu Ala
50 55 60
Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Ala Phe Ser
65 70 75 80
Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Ala Leu His
85 90 95
Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg
100 105 110
Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Gly
115 120 125
Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu Ser Lys Asn Gly
130 135 140
Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu Ile Leu Lys Arg Gly
165 170 175
Tyr Glu Leu Gly Gin Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gin Ser
180 185 190
Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val Val Ala Thr Leu
195 200 205
His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys Ala Lys Ala Glu
210 215 220
Phe Ala Gin His Gin Lys Lys
225 230
183 293 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= “Syntetyczny DNA” (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 12:
CCTCGAGGTC GACGGTATCG (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= Syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: TAK (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 13:
ATTCGCCACA TCGCCACTGC T
183 293 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= Syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 14:
TAGCCCAGCC GGTAGAGGTA TG (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= Syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: TAK (XI) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 15:
CTGGATCCTG TGGCTATCAT CACCT (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DłUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy
183 293 (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= Syntetyczny DNA” (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 16:
CTGGATCCGA CGCGATTTTA CCATA (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 747 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genoraowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Providencia stuartii (B) SZCZEP: ACTT 29851 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..744 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 17:
ATG AAA AAA CTA TTA GCA GTA TTC TGC GCA GGG GCT ITT GTT TCA ACC
Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr 15 10 15
183 293
AGT GTA TTT GCG GCG ATC CCT CCC GGC AAT GAT GTG ACA ACT AAA CCC 96
Ser Val Phe Ala 20 Ala Ile Pro Pro Gly 25 Asn Asp Val Thr Thr 30 Lys Pro
GAT CTT TAT TAT TTA AAA AAC TCA CAG GCT ATT GAT AGT TTA GCG TTA 144
Asp Leu 35 Tyr Leu Lys Asn Ser 40 Gin Ala Ile Asp Ser 45 Leu Ala Leu
TTG CCG CCA CCA CCT GAA GTG GGC AGT ATC TTA TTT TTA AAC GAC CAA 192
Leu Pro 50 Pro Pro Pro Glu Val 55 Gly Ser Ile Leu Phe 60 Leu Asn Asp Gin
GCG ATG TAT GAA AAA GGC CGT TTA TTG CGA AAT ACT GAG CGT GGA GAA 240
Ala 65 Met Tyr Glu Lys Gly 70 Arg Leu Leu Arg Asn 75 Thr Glu Arg Gly Glu 80
CAA GCC GCT AAG GAT GCT GAT CTG GCT GCG GGC GGT GTT GCG AAC GCA 288
Gin Ala Ala Lys 85 Ala Asp Leu Ala Ala 90 Gly Gly Val Ala Asn 95 Ala
TTT TCT GAA GCT TTT GGT TAT CCC ATT ACC GAA AAG GAT GCG CCT GAA 336
Phe Ser Glu Ala 100 Phe Gly Tyr Pro Ile 105 Thr Glu Lys Asp Ala 110 Pro Glu
ATT CAT AAA TTG CTG ACG AAT ATG ATT GAA GAT GCG GGG GAT TTA GCA 384
Ile His Lys 115 Leu Leu Thr Asn Met 120 Ile Glu Asp Ala Gly 125 Asp Leu Ala
ACT CGC TCA GCC AAA GAG AAA TAC ATG CGC ATT CGT CCA TTT GCG TTC 432
Thr Arg 130 Ser Ala Lys Glu Lys 135 Tyr Met Arg Ile Arg 140 Pro Phe Ala Phe
TAC GGT GTT GCT ACC TGT AAC ACG AAA GAT CAG GAC AAA TTA TCT AAG 480
145 Gly Val Ala Thr Cys 150 Asn Thr Lys Asp Gin 155 Asp Lys Leu Ser Lys 160
AAT GGC TCT TAT CCT TCT GGA CAC ACC GCA ATT GGC TGG GCA TCT GCA 528
Asn Gly Ser Tyr Pro 165 Ser Gly His Thr Ala 170 Ile Gly Trp Ala Ser 175 Ala
CTC GTA TTG TCA GAA ATT AAC CCA GAA AAC CAA GAT AAA ATT TTA AAA 576
Leu Val Leu Ser 180 Glu Ile Asn Pro Glu 185 Asn Gin Asp Lys Ile 190 Leu Lys
CGT GGT TAT GAA CTT GGC CAA AGC CGA GTC ATC TGT GGT TAC CAT TGG 624
Arg Gly Tyr 195 Glu Leu Gly Gin 200 Arg Val Ile Cys Gly 205 Tyr His Trp
CAA AGT GAT GTT GAT GCA GCT CGT ATC GTT GCA TCG GGT GCG GTA GCA 672
Gin 210 Asp Val Asp Ala Ala 215 Arg Ile Val Ala Ser 220 Gly Ala Val Ala
ACT TTA CAC TCC AAC CCT GAA TTC CAA AAA CAG TTA CAA AAA GCC AAA 720
Thr 225 GAC Asp Leu GAA Glu His TTT Phe Ser GCT Ala Asn AAA Lys Pro 230 CTG Leu Glu AAA Lys Phe AAA Lys Gin TAG Lys Gin 235 Leu Gin Lys Ala Lys 240 747
245
183 293 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 248 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Providencia stuartii (B) SZCZEP: ATCC 29851 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 18:
Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr 15 1015
Ser Val Phe Ala Ala Ile Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro 20 2530
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Gin Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu 35 4045
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Leu Phe Leu Asn Asp Gin 50 5560
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Glu
70 7580
Gin Ala Ala Lys Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala 85 9095
Phe Ser Glu Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Glu
100 105110
Ile His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
115 120125
Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
130 135140
Tyr Gly Val Ala Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gin Asp Lys Leu SerLys
145 150 155160
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ala Ile Gly Trp Ala SerAla
165 170175
Leu Val Leu Ser Glu Ile Asn Pro Glu Asn Gin Asp Lys Ile Leu Lys
180 185190
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gin Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp
195 200205
183 293
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Ala Ser Gly Ala Val Ala
210 215 220
Thr Dau His Ser Asn Pro Glu Phe Gin Lys Gin Leu Gin Lys Ala Lys
225 230 235 240
Asp Glu Phe Ala Lys Leu Lys Lys
245 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 19:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 744 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Enterobacter aerogenes (B) SZCZEP: IFO 12010 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..744 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 19:
ATG AAA AAG CGC GTT CTC GCC CTC TGC CTC GCC AGC CTG TTT TCC GTT 48
Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val
1 5 10 15
AAC GCT TTC GCG CTG GTC CCT GCC GGC AAT GAT GCA ACC ACC AAA CCG 96
Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro
20 25 30
GAT CTC TAT TAT CTG AAA AAT GCA CAG GCC ATC GAT AGT CTG GCG CTG 144
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gin Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu
35 40 45
TTG CCG CCG CCG CCG GAA GTT GGC AGC ATC GCA TTT TTA AAC GAT CAG 192
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gin
50 55 60
183 293
GCG ATG TAT GAG AAA GGA CGG CTG TTG CGC AAT ACC GAA CGT GGC AAG 240
Ala 65 Met Tyr Glu Lys Gly Arg 70 Leu Leu Arg Asn 75 Thr Glu Arg Gly Lys 80
CTG GCG GCT GAA GAT GCT AAC CTG AGC GCC GGC GGC GTC GCG AAT GCC 288
Leu Ala Ala Glu 85 Ala Asn Leu Ser Ala 90 Gly Gly Val Ala Asn 95 Ala
TTC TCC AGC GCT TTT GGT TCG CCC ATC ACC GAA AAA GAC GCG CCG CAG 336
Phe Ser Ala 100 Phe Gly Ser* Pro Ile 105 Thr Glu Lys Asp Ala 110 Pro Gin
TTA CAT AAG CTG CTG AGA AAT ATG ATT GAG GAT GCC GGC GAT CTG GCC 384
Leu His Lys 115 Leu Leu Thr Asn Met 120 Ile Glu Asp Ala Gly 125 Asp Leu Ala
ACC CGC AGC GCG AAA GAG AAA TAT ATG CGC ATT CGC CCG TTT GCG TTC 432
Thr 130 Ser Ala Lys Glu Lys 135 Tyr Met Arg Ile Arg 140 Pro Phe Ala Phe
TAC GGC GTT TCA ACC TGT AAC ACT ACC GAG CAG GAC AAG CTG TCG AAA 480
Tyr 145 Gly Val Ser Thr Cys 150 Asn Thr Thr Glu Gin 155 Asp Lys Leu Ser Lys 160
AAC GGA TCT TAC CCT TCC GGC CAT ACC TCT ATC GGT TGG GCA ACC GCG 528
Asn Gly .S^t- Tyr Pro 165 Ser Gly His Thr Ser 170 Ile Gly Trp Ala Thr 175 Ala
CTG GTA CTG GCG GAG ATC AAT CCG CAG CGG CAA AAC GAA ATT CTC AAA 576
Leu Val Leu Ala 180 Glu Ile Asn Pro Gin 185 Arg Gin Asn Glu Ile 190 Leu Lys
CGC GGC TAT GAA TTG GGC GAA AGC CGG GTT ATC TGC GGC TAT CAT TGG 624
Arg Gly Tyr 195 Glu Leu Gly Glu 200 Arg Val Ile Cys Gly 205 Tyr His Trp
CAG AGC GAT GTC GAT GCG GCG CGG ATA GTC GGC TCG GCG GTG GTG GCG 672
Gin Ser 210 Asp Val Asp Ala Ala 215 Arg Ile Val Gly 220 Ala Val Val Ala
ACC CTG CAT ACC AAC CCG GCC TTC CAA CAG CAG TTG CAG AAA GCA AAG 720
Thr 225 GAT Asp Leu GAA Glu His TTC Phe Thr GCC Ala Asn AAA Lys Pro 230 ACG Thr Ala CAG Gin Phe AAG Lys Gin TAA Gin Gin 235 Leu Gin Lys Ala Lys 240 747
245 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 20:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 248 aminokwasów
183 293 (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Enterobacter aerogenes (B) SZCZEP: IFO 12010 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 20:
Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val 15 1015
Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro 20 2530
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gin Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu
4045
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gin 50 5560
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys 65 70 7580
Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala 85 9095
Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gin 100 105110
Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 115 120125
Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 130 135140
Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu SerLys
145 150 155160
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala ThrAla
165 170175
Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu Ile Leu Lys 180 185190
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 195 200205
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala 210 215220
Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys Ala Lys 225 230 235240
Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gin Lys 245
183 293 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 21:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOSC: 747 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Klevsiella planticola (B) SZCZEP: IFO 14939 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..747 (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 21:
ATG AAA AAG CGT GTA CTC GCC CTT TGC CTT GCC AGC CTC TTT TCA GTT 48
Met Lys 1 Lys Arg Val Leu Ala Leu 5 Cys Leu Ala Ser 10 Leu Phe Ser 15 Val
AGC GCC TTT GCG CTG GTT CCC GCC GGC AAT GAT GCC ACC ACC AAG CCC 96
Ser Ala Phe Ala 20 Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala 25 Thr Thr Lys 30 Pro
GAT CTC TAC TAT CTG AAA AAT GCC CAG GCC ATT GAC AGC CTG GCG CTG 144
Asp Leu 35 Tyr Leu Lys Asn Ala 40 Gin Ala Ile Asp 45 Leu Ala Leu
TTG CCA CCG CCG CCG GAA GTG GGC AGC ATT GCG TTT TTA AAC GAT CAG 192
Leu Pro 50 Pro Pro Pro Glu Val Gly 55 Ser Ile Ala Phe 60 Leu Asn Asp Gin
GCG ATG TAT GAG AAA GGC CGT CTG CTG CGC GCC ACC GCC CGC GGC AAG 240
Ala Met 65 Tyr Glu Lys Gly Arg Leu 70 Leu Arg Ala Thr 75 Ala Arg Gly Lys 80
TTG GCG GCA GAA GAT GCC AAC CTG AGC GCG GGT GGC GTG GCC AAC GCC 288
Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu 85 Ser Ala Gly Gly 90 Val Ala Asn 95 Ala
TTC TCC GCA GCA TTC GGC TCC CCG ATC AGC GAA AAA GAC GCC CCG GCG 336
Phe Ser Ala Ala 100 Phe Gly Ser Pro Ile Ser Glu Lys 105 Asp Ala Pro 110 Ala
183 293
CTG CAC AAA CTG CTC ACC AAC ATG ATT GAA GAC GCG GGC GAT CTG GCG 384
Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 115 120125
ACC CGA GGC GCG AAA GAG AAG TAT ATG CGT ATT CGT CCG TTT GCC TTC432
Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe AlaPhe
130 135140
TAC GGC GTG ICC ACC TGC AAT ACC ACC GAA CAG GAT AAG CTG TCG AAA480
Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu SerLys
145 150 155160
AAC GGC TCC TAC CCT TCC GGA CAC ACC TCT ATC GGC TGG GCG ACC GCC528
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala ThrAla
165 170175
CTG GTG CTG GCC GAA ATC AAC CCG CAG CGC CAG AAT GAG ATT CTC AAG576
Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu Ile LeuLys
180 185190
CGC GGC TAT GAG CTC GGT GAA AGT CGG GTG ATC TGC GGT TAC CAC TGG624
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr HisTrp
195 200205
CAG AGC GAT GTT GAC GCC GCG CGG ATT GTC GGC TCG GCG GTG GTT GCA672
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val ValAla
210 215220
ACC CTG CAT ACC AAT CCG GCC TTC CAG CAG CAG CTG CAA AAA GCC ΑΆΑ720
Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys AlaLys
225 230 235240
GAC GAG TTT GCG AAA CAG CAG AAA TAG747
Asp Glu Phe Ala Lys Gin Gin Lys 245 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 22:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 248 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
183 293 (A) ORGANIZM: Klevsiella planticola (B) SZCZEP: IFO 14939 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 22:
Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val 15 1015
Ser Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro 20 2530
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gin Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu 35 4045
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gin 50 5560
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Ala Thr Ala Arg Gly Lys 65 70 7580
Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala 85 9095
Phe Ser Ala Ala Phe Gly Ser Pro Ile Ser Glu Lys Asp Ala Pro Ala 100 105110
Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 115 120125
Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 130 135140
Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu SerLys
145 150 155160
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala ThrAla
165 170175
Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu Ile Leu Lys 180 185190
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 195 200205
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala 210 215220
Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys Ala Lys
225
230
235
240
Asp Glu Phe Ala Lys Gin Gin Lys
245 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 23:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 735 par zasad
183 293 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Serratia ficaria (B) SZCZEP: IAM 13540 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..732 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 23:
ATG AAA AAA ΑΤΑ TTA TTA GCC ACA TTA AGC TGC GCC GCG TTG ACG CAG 48
Met Lys Lys Ile Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gin 15 10 15
N BI BI
TCC TTT GCC Ser Phe Ala GCC AAA GAT Asp GTC ACT ACC CAC CCT GAG GTT TAT TTT 96
Ala Lys Val Thr 25 Thr His Pro Glu Val 30 Tyr Phe
20
CAA GAA TCA CAG TCC ATC GAC AGC CTG GCA CTA TTG CCG CCG CCG 144
Gin Glu Ser Gin Ser Ile Asp Ser Leu Ala Leu Leu Pro Pro Pro
35 40 45
GCG ATG GAC AGC ATT GAT TTC CTG AAT GAC AAA GCG CAA TAC GAC 192
Ala Met Asp Ser Ile Asp Phe Leu Asn Asp Lys Ala Gin Tyr Asp
50 55 60
GGG AAA ATA GTG CGC AAT ACT CCG CGT GGC AAG CAG GCT TAT GAT 240
Gly Lys Ile Val Arg Asn Thr Pro Arg Gly Lys Gin Ala Tyr Asp
70 75 80
GCC CAC GTT GCC GGG GAC GGC GTT GCC GCC GCA TTT TCC AAC GCC 288
Ala His Val Ala Gly Asp Gly Val Ala Ala Ala Phe Ser Asn Ala
85 90 95
GGC CTA GAA ATA GCC CAA CGG AAA ACG CCG GAG CTG TTT AAG CTG 336
Gly Leu Glu Ile Ala Gin Arg Lys Thr Pro Glu Leu Phe Lys Leu
100 105 110
ATG AAA ATG CGT GAA GAC GCC GGC GAT TTG GCG ACC CGC AGC GCC 384
Met Lys Met Arg Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala
115 120 125
183 293
AAA AAT CAC TAT ATG CGC ATT CGC CCC TTT GCG TTT TAT AAC GAA GCG 432
Lys Asn His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Asn Glu Ala
130 135 140
ACC TGC CGA CCG GAC GAA GAA AGC ACC CTG TCG AAG AAC GGT TCT TAC 480
Thr Cys Arg Pro Asp Glu Glu Ser Thr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Tyr
145 150 155 160
CCT TCC GGC CAT ACC ACC ATC GGC TGG GCG ACC GCG CTG GTG CTG GCT 528
Pro Ser Gly His Thr Thr Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala
165 170 175
GAA ATC AAC CCC GCC AGG CAG GGT GAA ATC CTG CAG CGC GGC TAT GAT 576
Glu Ile Asn Pro Ala Arg Gin Gly Glu Ile Leu Gin Arg Gly Tyr Asp
180 185 190
ATG GGC CAA AGC CGG GTT ATC TGC GGT TAT CAC TGG CAA AGC GAC GTG 624
Met Gly Gin Ser Arg Val ile Cys Gly Tyr His Trp Gin Ser Asp Val
195 200 205
ACT GCG GCG CGC ATG GCG GCG TCG GCC ATG GTG GCG CGT TTG CAT GCC 672
Thr Ala Ala Arg Met Ala Ala Ser Ala Met Val Ala Arg Leu His Ala
210 215 220
GAA CCC ACC TTC GCC GCC CAG CTG CAA AAG GCC AAA GAC GAA TTC AAC 720
Glu Pro Thr Phe Ala Ala Gin Leu Gin Lys Ala Lys Asp Glu Phe Asn
225 230 235 240
GGC CTG AAA AAG TAA 735
Gly Leu Lys Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 24:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 244 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: 1iniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Serratia ficaria (B) SZCZEP: IAM 13540 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 24:
Met Lys Lys Ile Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gin 15 10 15
Phe Ser Phe Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr His Pro Glu Val Tyr Phe
25 30
183 293
Leu Gin Glu Ser Gin Ser Ile Asp Ser Leu Ala Leu Leu Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Ala Met Asp Spr Ile Asp Phe Leu Asn Asp Lys Ala Gin Tyr Asp
50 55 60
Ala Gly Lys Ile Val Arg Asn Thr Pro Arg Gly Lys Gin Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Asp Ala His Val Ala Gly Asp Gly Val Ala Ala Ala Phe Ser Asn Ala
85 90 95
Phe Gly Leu Glu Ile Ala Gin Arg Lys Thr Pro Glu Leu Phe Lys Leu
100 105 110
Val Met Lys Met Arg Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala
115 120 125
Lys Asn His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Asn Glu Ala
130 135 140
Thr Cys Arg Pro Asp Glu Glu Ser Thr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Tyr
145 150 155 160
Pro Ser Gly His Thr Thr Ile Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala
165 170 175
Glu Ile Asn Pro Ala Arg Gin Gly Glu Ile Leu Gin Arg Gly Tyr Asp
180 185 190
Met Gly Gin Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gin Ser Asp Val
195 200 205
Thr Ala Ala Arg Met Ala Ala Ser Ala Met Val Ala Arg Leu His Ala
210 215 220
Glu Pro Thr Phe Ala Ala Gin Leu Gin Lys Ala Lys Asp Glu Phe Asn
225 230 235 240
Gly Leu Lys Lys
183 293
czas reakcji (godziny)
183 293
F Z G. 3
SB B P K Η EK BN E SB pMPI 501 pMPI 505
1Kb
SB: połączenie Sau3MIBamW B: Barn HI E: EcoRI K: Kpn\ H: ///ndlll N: Nco\ P: Pst\
183 293
F I G. 4
1 2 3 4 5 6 czas reakcji (godziny)
183 293
ο. σ< ο
CL· ck ο
czas reakcji (godziny)
183 293
F / G. 6 pEPI301
pEPI305 f
1Kb
SB: połączenie Sat/3AI/£amHI B: BamH\ Bg: Bg!\\ C: C!a\ E: EcoRI
czas reakcji (godziny)
183 293 •η ο co
CL, W
CL os o τH g
o en
CU W
CL
Os O s ·“J
(IP/6) AMOuAzoui-fg sbm>|
183 293
SB
K P S S SB ρΕΝΡΙΟΟ pENPllO
IKbp
SB: połączenie Sau3MIBamW\ K: Kpn\ P: PsA S: Sa!\
183 293
FIG. 10
SB K S EH K SB pKLPlOO-----pKLPUO lKbp
SB: połączenie Sau3M/BamH\ E: EcoRI H: H/ndlll K: Kpn\
S: Sad
183 293
SB Η Ρ
PEH
SB pSEPlOO
pSEPllO
1Kb
SB: połączenie Sau3MIBamH\ E: £co Rl H: ///ndlll P: Psti
183 293
E. aerogenes 1:MKKRVLALCLASLFSVNAFALVPAGNDATTKPDLYYLKNAQAIDSLALLP50
E.blat tae 1 :MKKRVLAVCFAALFSSQALALVATGNDTTTKPDLYYLKNSEAINSLALLP5 0
K. planticola 1 :MKKRVLALCLASLFSVSAFALVPAGNDATTKPDLYYLKNAQAIDSLALLP50
M. morgani i 1 :MKKNIIAGCLFSLFSLSALAAIPAGNDATTKPDLYYLKNEQAIDSLKLLP50
P.Stuart i i 1 :MKKLLAVFCAGAFVSTSVFAAIPPGNDVTTKPDLYYLKNSQAIDSLALLP50
S. fi car i a 1: MKK-ILLA-TLSCAALTQFS—FAAKDYTTHPEVYFLQESQSIDSLALLP46
E. aerogenes 51 :PPPEVGSIAFLNDQAMYEKGRLLRNTERGKLAAEDANLSAGGYANAFSSA 100
E. bl at tae 51: PPPAYGSIAFLNDQAMYEQGRLLRNTERGKLAAEDANLSSGGVANAFSGA 100
K. planticola 51:PPPEVGSIAFLNDQAMYEKGRLLRATARGKLAAEDANLSAGGVANAFSAA 100
M. morganii 51:PPPEVGSIQFLNDQAMYEKGRMLRNTERGKQAQADADLAAGGVATAFSGA 100
P. Stuart i i 51: PPPEVGSILFLNDQAMYEKGRLLRNTERGEQAAKDADLAAGGVANAFSEA 100
S. f icaria 47 :PPPAMDSIDFLNDKAQYDAGKIYRNTPRGKQAYDDAHVAGDGVAAAFSNA 96
E.aerogenes 101:FGSPITEKDAPQLHKLLTNMIEDAGDLATRSAKEKYMRIRPFAFYGVSTC 150
E. blat tae 101 :FGSPITEKDAPALHKLLTNMIEDAGDLATRSAKDHYMRIRPFAFYGVSTC 150
K.plant i co la 101 :FGSPISEKDAPALHKLLTNMIEDAGDLATRGAKEKYMRIRPFAFYGVSTC 150
M. morgani i 101 :FGYPITEKDSPELYKLLTNMIEDAGDLATRSAKEHYMRIRPFAFYGTETC 150
P.Stuart i i 101tFGYPITEKDAPEIHKLLTNMIEDAGDLATRSAKEKYMRIRPFAFYGYATC 150
S. f icaria 97 :FGLEIAQRKTPELFKLVMKMREDAGDLATRSAKNHYMRIRPFAFYNEATC 146
E. aerogenes 151: NTTEQDKLSKNGSYPSGHTSIGWATALVLAEINPQRQNE ILKRGYELGES 200
E. bl at tae 151 :NTTEQDKLSKNGSYPSGHTSIGWATALVLAEINPQRQNEILKRGYELGQS 200
K. plant i cola 151: NTTEQDKLSKNGSYPSGHTSIGWATALVLAEINPQRQNEILKRGYELGES 200
M. morganii 151 :NTKDQKKLSTNGSYPSGHTSIGłATALVLAEVNPANQDAILERGYQLGQS 200
P. Stuart i i 151 :NTKDQDKLSKNGSYPSGHTAIGWASALVLSEINPENQDKILKRGYELGQS 200
S. f icaria 147 :RPDEESTLSKNGSYPSGHTTIGWATALVLAEINPARQGE ILQRGYDMGQS 196
E. blat tae 201 :RVICGYHWQSDVDAARVVGSAVVATLHTNPAFQQQLQKAKAEFAQHQKK 24 9
K.plant icola 201:RVICGYHWQSDYDAARIVGSAVVATLHTNPAFQQQLQKAKDEFAKQQK- 248
M. morganii 201 :RVICGYHWQSDVDAARIVGSAAVATLHSDPAFQAQLAKAKQEFAQKSQK 249
E, aerogenes 201 :RVICGYHWQSDVDAARIVGSAVVATLHTNPAFQQQLQKAKDEFAKTQK- 248
P. Stuart i i 201:RVICGYHWQSDYDAARIVASGAVATLHSNPEFQKQLQKAKDEFA-KLKK 248
S.ficaria 197:RVICGYHWQSDVTAARMAASAMVARLHAEPTFAAQLQKAKDEF-NGLKK 244
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (23)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, znamienny tym, że nukleozyd poddaj e się działaniu kwaśnej fosfatazy i donora grupy fosforanowej wybranego z grupy obejmującej kwas polifosforowy lub jego sól, kwas fenylofosforowy lub jego sól i karbamoilofosforan lub jego sól przy pH od 3,0 do 5,5 i wydziela się 5'-fosforanowy ester nukleozydu.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nukleozyd poddaje się działaniu kwaśnej fosfatazy o sekwencji aminokwasowej zasadniczo identycznej z sekwencjąaminokwasową wybraną spośród sekwencji nr 4,11,18,20,22 oraz 24 w Liście Sekwencji, przy czym kwaśna fosfataza posiada mutację obniżającą jej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienia reszty aminokwasowej odpowiadające podstawieniu(om) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izolcucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nukleozyd poddaje się działaniu kwaśnej fosfatazy o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród sekwencji nr 4 oraz 11 w Liście Sekwencji lub sekwencji zasadniczo identycznej z sekwencjąaminokwasowąwybraną spośród sekwencji nr 4 oraz 11 w Liście Sekwencji.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nukleozyd poddaje się działaniu kwaśnej fosfatazy obejmującej sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji nr 18, 20, 22 oraz 24 w Liście Sekwencji, lub sekwencję zasadniczo identyczną z sekwencją aminokwasową wybraną spośród sekwencji nr 18, 20, 22 oraz 24 w Liście Sekwencji.
  5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że nukleozyd poddaje się działaniu kwaśnej fosfatazy posiadającej mutację wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji oraz podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 74 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 153 innym aminokwasem w sekwencji nr 11 w Liście Sekwencji.
  6. 6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że nukleozyd poddaje się działaniu kwaśnej fosfatazy posiadającej mutację wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 92 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 171 innym aminokwasem w sekwencji nr 18,20 lub 22 wLiście Sekwencji orazpodstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 88 i/łub reszty izoleucyny w pozycji 167 innym aminokwasem w sekwencji nr 24 w Liście Sekwencji.
  7. 7. Zmutowana kwaśna fosfataza obejmująca sekwencję aminokwasową zasadniczo identycznąz sekwencjąaminokwasowąnr 4 w Liście Sekwencji, posiadająca mutację obniżającąjej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienia reszt aminokwasowych odpowiadające podstawieniu(om) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
  8. 8. Zmutowana kwaśna fosfataza według zastrz. 7, znamienna tym, że posiada mutację wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
  9. 9. Zmutowana kwaśna fosfataza obejmująca sekwencję aminokwasowązasadniczo identyczną z sekwencjąaminokwasowąnr 11, 18, 20, 22 lub 24 w Liście Sekwencji, posiadająca mutację obniżającąjej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 74 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 153 innym aminokwasem w sekwencji nr 11 w Liście Sekwencji, podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 92 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 171 innym aminokwasem w sekwencji nr 18,20 lub 22 w Liście Sek
    183 293 wencji i podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 88 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 167 innym aminokwasem w sekwencji nr 24 w Liście Sekwencji.
  10. 10. Kwaśna fosfataza obejmująca sekwencję aminokwasową nr 11 w Liście Sekwencji .
  11. 11. Kwaśna fosfataza obejmująca sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji nr 20, 22 oraz 24 w Liście Sekwencji.
  12. 12. Gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę obejmującą sekwencję aminokwasowązasadniczo identycznąz sekwencjąaminokwasową nr 4 w Liście Sekwencji, posiadająca mutację obniżającąjej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienia reszty aminokwasowej odpowiadające podstawieniu(om) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
  13. 13. Gen według zastrz. 12, znamienny tym, że koduje zmutowaną kwaśną fosfatazę posiadającą mutację wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
  14. 14. Gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę obejmującą sekwencję aminokwasową zasadniczo identycznąz sekwencją nr 11, 18, 20, 22 lub 24 w Liście Sekwencji, posiadająca mutację obniżającąjej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 74 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 153 innym aminokwasem w sekwencji nr 11 w Liście Sekwencji, podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 92 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 171 innym aminokwasem w sekwencji nr 18,20 lub 22 w Liście Sekwencji i podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 88 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 167 innym aminokwasem w sekwencji nr 24 w Liście Sekwencji.
  15. 15. Gen kodujący kwaśną fosfatazę obejmującą sekwencję nr 11 w Liście Sekwencji.
  16. 16. Gen kodujący kwaśną fosfatazę obejmującą sekwencję wybraną spośród sekwencji nr 20, 22 oraz 24 w Liście Sekwencji.
  17. 17. Zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę obejmującą sekwencję aminokwasową zasadniczo identyczną z sekwencją aminokwasową nr 4 w Liście Sekwencji, posiadająca mutację obniżającąjej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienia reszt aminokwasowych odpowiadające podstawieniu(om) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
  18. 18. Zrekombinowany DNA według zastrz. 17, znamienny tym, że obejmuje gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę posiadającą mutację wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
  19. 19. Zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę obejmuj ącąsekwencję amino kwasową zasadniczo identycznąz sekwencjąnr 11,18,19,20,22 lub 24 w Liście Sekwencji, posiadającą mutację obniżającąjej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 74 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 153 innym aminokwasem w sekwencji nr 11 w Liście Sekwencji podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 92 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 171 innym aminokwasem w sekwencji nr 18,20 lub 22 w Liście Sekwencji i podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 88 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 167 innym aminokwasem w sekwencji nr 24 w Liście Sekwencji.
  20. 20. Zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący kwaśną fosfatazę o sekwencji aminokwasowej nr 11 w Liście Sekwencji.
  21. 21. Zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący kwaśną fosfatazę o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród sekwencji nr 20, 22 oraz 24 w Liście Sekwencji.
  22. 22. Escherichia coli AJ13143 (FERM BP-5422).
  23. 23. Escherichia coli AJ13144 (FERM BP-5423).
    183 293
PL96323493A 1995-05-25 1996-05-24 Sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, zmutowana kwaśna fosfataza, kwaśna fosfataza, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, gen kodujący kwaśną fosfatazę, zrekombinowany DNA oraz nowy szczep E.coli PL183293B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP14978195 1995-05-25
JP8094680A JPH0937785A (ja) 1995-05-25 1996-03-26 ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法
PCT/JP1996/001402 WO1996037603A1 (fr) 1995-05-25 1996-05-24 Procede de production du nucleoside-5'-phosphate

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL323493A1 PL323493A1 (en) 1998-03-30
PL183293B1 true PL183293B1 (pl) 2002-06-28

Family

ID=26435954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96323493A PL183293B1 (pl) 1995-05-25 1996-05-24 Sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, zmutowana kwaśna fosfataza, kwaśna fosfataza, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, gen kodujący kwaśną fosfatazę, zrekombinowany DNA oraz nowy szczep E.coli

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6010851A (pl)
EP (1) EP0832970B1 (pl)
JP (2) JPH0937785A (pl)
KR (1) KR100293047B1 (pl)
CN (1) CN1105778C (pl)
CA (1) CA2221774A1 (pl)
DE (1) DE69636852T2 (pl)
ES (1) ES2281082T3 (pl)
HU (1) HUP9900808A3 (pl)
PL (1) PL183293B1 (pl)
WO (1) WO1996037603A1 (pl)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4304727B2 (ja) * 1996-11-21 2009-07-29 味の素株式会社 ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法
CA2244314A1 (en) * 1997-07-31 1999-01-31 Sumitomo Chemical Co., Ltd. Process for producing nucleoside derivatives
TWI222464B (en) * 1999-02-08 2004-10-21 Kyowa Hakko Kogyo Kk Process for producing purine nucleotides
US6663211B2 (en) 1999-04-26 2003-12-16 Shuichi Aratsu Printing device and roll paper
WO2001018184A1 (fr) * 1999-09-03 2001-03-15 Ajinomoto Co., Inc. Enzyme produisant une variante de nucleoside-5'-phosphate
JP2001302417A (ja) 2000-02-15 2001-10-31 Ajinomoto Co Inc 胞子発芽阻害剤およびそれを用いた食品
JP2002112782A (ja) * 2000-10-04 2002-04-16 Ajinomoto Co Inc 抗血栓活性を有する蛋白質及びその製造法
JP4649787B2 (ja) * 2001-07-10 2011-03-16 味の素株式会社 ５’−グアニル酸の製造法
WO2005045052A1 (ja) * 2003-11-11 2005-05-19 Mitsui Chemicals, Inc. ペントース−５−リン酸エステルの製造方法
JP4760711B2 (ja) 2004-03-31 2011-08-31 味の素株式会社 バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を使用した発酵によるプリンヌクレオシド及びヌクレオチドの製造方法
US7326546B2 (en) 2005-03-10 2008-02-05 Ajinomoto Co., Inc. Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance
BRPI0709635A2 (pt) * 2006-04-24 2011-07-19 Ajinomoto Kk bactéria pertencendo ao gênero bacillus, e, métodos para produzir uma substáncia derivada de purina, e um nucleotìdeo de purina
WO2007125782A1 (ja) 2006-04-24 2007-11-08 Ajinomoto Co., Inc. プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
JP5070895B2 (ja) * 2007-03-16 2012-11-14 味の素株式会社 リン酸リサイクルによるヌクレオチドの製造方法
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
JP5440489B2 (ja) 2008-02-25 2014-03-12 味の素株式会社 ５’−グアニル酸の製造法
JP5636648B2 (ja) 2009-08-10 2014-12-10 味の素株式会社 ５’−グアニル酸の製造法
CN103451165B (zh) * 2013-08-06 2015-08-05 浙江师范大学 3’,5’-二磷酸腺苷酸特异性3’-核苷酸酶及其构建方法和应用
CN103555687B (zh) * 2013-09-12 2015-06-17 浙江工业大学 一种酸性磷酸酶突变体、编码基因、载体及应用
BR112016008830B1 (pt) 2013-10-23 2023-02-23 Ajinomoto Co., Inc Método para produzir uma substância alvo
CN103642823B (zh) * 2013-11-15 2016-05-25 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 一种磷酸转移酶基因PhoC(I)及其制备方法与应用
EP3719135A1 (en) * 2019-04-01 2020-10-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Enzymatic method for preparation of gdp-fucose
CN113088504B (zh) * 2021-04-12 2022-10-11 江南大学 一种改造的酸性磷酸酶及其应用
JP2024086106A (ja) 2022-12-16 2024-06-27 味の素株式会社 グアノシン－５’－リン酸の製造方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5022115B1 (pl) * 1963-11-11 1975-07-28
JPS5223095A (en) * 1975-08-12 1977-02-21 Ajinomoto Co Inc Preparation of purinenucleotides
JPS5241293A (en) * 1975-09-29 1977-03-30 Koichi Ogata Method of manufacturing glucose-1-phosphate and glucose-6-phosphate
JPS5356390A (en) * 1976-10-28 1978-05-22 Ajinomoto Co Inc Preparation of d-ribose-5'-phosphoric acid derivatives
JPS5682098A (en) * 1979-12-06 1981-07-04 Ajinomoto Co Inc Production of purine nucleoside-5'-monophosphate
JPH0669386B2 (ja) * 1987-03-18 1994-09-07 協和醗酵工業株式会社 ５′−イノシン酸の製造法
JP3651036B2 (ja) * 1993-12-27 2005-05-25 味の素株式会社 ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法

Also Published As

Publication number Publication date
DE69636852T2 (de) 2008-01-24
EP0832970A1 (en) 1998-04-01
CN1191566A (zh) 1998-08-26
KR100293047B1 (ko) 2001-06-15
DE69636852D1 (de) 2007-03-08
EP0832970B1 (en) 2007-01-17
ES2281082T3 (es) 2007-09-16
JPH0937785A (ja) 1997-02-10
HUP9900808A3 (en) 2001-09-28
EP0832970A4 (en) 2004-08-11
KR19990022032A (ko) 1999-03-25
CA2221774A1 (en) 1996-11-28
US6010851A (en) 2000-01-04
CN1105778C (zh) 2003-04-16
HUP9900808A2 (hu) 1999-07-28
JP3180349B2 (ja) 2001-06-25
WO1996037603A1 (fr) 1996-11-28
PL323493A1 (en) 1998-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL183293B1 (pl) Sposób wytwarzania 5&#39;-fosforanowego estru nukleozydu, zmutowana kwaśna fosfataza, kwaśna fosfataza, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, gen kodujący kwaśną fosfatazę, zrekombinowany DNA oraz nowy szczep E.coli
EP0857788B1 (en) Method for producing nucleoside-5&#39;-phosphate ester
US9896705B2 (en) L-arabinose isomerase variants with improved conversion activity and method for production of D-tagatose using them
EP0816491B1 (en) Process for producing nucleic acids
JP3941390B2 (ja) 変異型酸性フォスファターゼ
KR20050004855A (ko) 신규 폴리포스페이트:에이엠피 포스포트랜스퍼라제
EP1318197B1 (en) Thermotolerant ribonuclease h
US6566109B2 (en) Gene for thermostable glucokinase, recombinant vector containing the same, transformant containing the recombinant vector and process for producing thermostable glucokinase using the transformant
EP0458971A1 (en) Inosine guanosine kinase
US5756315A (en) Inosine-guanosine kinase
KR20140111093A (ko) 향상된 전환 활성을 가지는 l-아라비노스 이성화효소 변이체 및 이를 이용한 d-타가토스의 생산 방법
JP2002000289A (ja) ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法
EP1712627B1 (en) Polypeptide having amidase activity and gene thereof
JP2003250570A (ja) ２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製造方法及びこの中間体の製造方法、並びにこれらに使用する２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20080524