PL183293B1 - Sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, zmutowana kwaśna fosfataza, kwaśna fosfataza, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, gen kodujący kwaśną fosfatazę, zrekombinowany DNA oraz nowy szczep E.coli - Google Patents
Sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, zmutowana kwaśna fosfataza, kwaśna fosfataza, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, gen kodujący kwaśną fosfatazę, zrekombinowany DNA oraz nowy szczep E.coliInfo
- Publication number
- PL183293B1 PL183293B1 PL96323493A PL32349396A PL183293B1 PL 183293 B1 PL183293 B1 PL 183293B1 PL 96323493 A PL96323493 A PL 96323493A PL 32349396 A PL32349396 A PL 32349396A PL 183293 B1 PL183293 B1 PL 183293B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- amino acid
- acid
- ala
- acid phosphatase
- Prior art date
Links
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 title claims abstract description 90
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 75
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 title claims abstract description 75
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 92
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 claims abstract description 230
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 155
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 claims abstract description 150
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 129
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 229920000137 polyphosphoric acid Polymers 0.000 claims abstract description 14
- CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N phenyl phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=CC=C1 CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- FFQKYPRQEYGKAF-UHFFFAOYSA-N carbamoyl phosphate Chemical compound NC(=O)OP(O)(O)=O FFQKYPRQEYGKAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 134
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 89
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 88
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 46
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 35
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 33
- 108050008598 Phosphoesterases Proteins 0.000 claims description 25
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 25
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 25
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 20
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 24
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 abstract description 28
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 81
- GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N Inosinic acid Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 80
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 80
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 76
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 75
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 72
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 70
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 68
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 67
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 66
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 56
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 56
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 53
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 44
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 38
- 241000588772 Morganella morganii Species 0.000 description 37
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 35
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 35
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 34
- 229940076266 morganella morganii Drugs 0.000 description 34
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 33
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 33
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 32
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 31
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 30
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 26
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 25
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 23
- 241000588717 Shimwellia blattae Species 0.000 description 22
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 22
- 241000588746 Raoultella planticola Species 0.000 description 20
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 20
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 18
- 241000881765 Serratia ficaria Species 0.000 description 18
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 18
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 18
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 17
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 17
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 17
- 241000588778 Providencia stuartii Species 0.000 description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 16
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 15
- 241001087783 Shimwellia blattae DSM 4481 = NBRC 105725 Species 0.000 description 15
- -1 phosphate ester Chemical class 0.000 description 15
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 13
- TYJOJLOWRIQYQM-UHFFFAOYSA-L disodium;phenyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OC1=CC=CC=C1 TYJOJLOWRIQYQM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 13
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 13
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 13
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 13
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 13
- RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 12
- QSVMIMFAAZPCAQ-PMVVWTBXSA-N Gly-His-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QSVMIMFAAZPCAQ-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 12
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 108010080575 glutamyl-aspartyl-alanine Proteins 0.000 description 12
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 12
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 11
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- ZZRCKSSPGJOTEE-UHFFFAOYSA-L disodium;carbamoyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].NC(=O)OP([O-])([O-])=O ZZRCKSSPGJOTEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 11
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 11
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 10
- WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 10
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 10
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 10
- 235000019830 sodium polyphosphate Nutrition 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- ZZZWQALDSQQBEW-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZZZWQALDSQQBEW-STQMWFEESA-N 0.000 description 9
- GKWFMNNNYZHJHV-SRVKXCTJSA-N Asp-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O GKWFMNNNYZHJHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 9
- IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N Leu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N 0.000 description 9
- DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 9
- HJOSVGCWOTYJFG-WDCWCFNPSA-N Thr-Glu-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O HJOSVGCWOTYJFG-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 9
- 108010010430 asparagine-proline-alanine Proteins 0.000 description 9
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N Ala-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 8
- OLPPXYMMIARYAL-QMMMGPOBSA-N Gly-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN OLPPXYMMIARYAL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- 241000588771 Morganella <proteobacterium> Species 0.000 description 8
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 8
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 7
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N Glu-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 7
- RCHFYMASWAZQQZ-ZANVPECISA-N Gly-Trp-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CN)=CNC2=C1 RCHFYMASWAZQQZ-ZANVPECISA-N 0.000 description 7
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ZUZINZIJHJFJRN-UBHSHLNASA-N Pro-Phe-Ala Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 ZUZINZIJHJFJRN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- WFAUDCSNCWJJAA-KXNHARMFSA-N Thr-Lys-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O WFAUDCSNCWJJAA-KXNHARMFSA-N 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 7
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 7
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 7
- OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N Ala-Thr-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 6
- NVUIWHJLPSZZQC-CYDGBPFRSA-N Arg-Ile-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NVUIWHJLPSZZQC-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 6
- WAEDSQFVZJUHLI-BYULHYEWSA-N Asp-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WAEDSQFVZJUHLI-BYULHYEWSA-N 0.000 description 6
- YKKHFPGOZXQAGK-QWRGUYRKSA-N Cys-Gly-Tyr Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YKKHFPGOZXQAGK-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DMHGKBGOUAJRHU-UHFFFAOYSA-N Ile-Arg-Pro Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O DMHGKBGOUAJRHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- RFWXYTJSVDUBBZ-DCAQKATOSA-N Pro-Pro-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RFWXYTJSVDUBBZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 6
- FHDLKMFZKRUQCE-HJGDQZAQSA-N Thr-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FHDLKMFZKRUQCE-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 6
- PRONOHBTMLNXCZ-BZSNNMDCSA-N Tyr-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PRONOHBTMLNXCZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 6
- YYLHVUCSTXXKBS-IHRRRGAJSA-N Tyr-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYLHVUCSTXXKBS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 6
- SLLKXDSRVAOREO-KZVJFYERSA-N Val-Ala-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SLLKXDSRVAOREO-KZVJFYERSA-N 0.000 description 6
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N cytidine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 108010008237 glutamyl-valyl-glycine Proteins 0.000 description 6
- 108010078326 glycyl-glycyl-valine Proteins 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 6
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 6
- GIXFALHDORQSOQ-UHFFFAOYSA-N 2,4,6,8-tetrahydroxy-1,3,5,7,2$l^{5},4$l^{5},6$l^{5},8$l^{5}-tetraoxatetraphosphocane 2,4,6,8-tetraoxide Chemical compound OP1(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O1 GIXFALHDORQSOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N Ala-Ala-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 5
- NHLAEBFGWPXFGI-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N NHLAEBFGWPXFGI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- YFHATWYGAAXQCF-JYJNAYRXSA-N Arg-Pro-Phe Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YFHATWYGAAXQCF-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 5
- FTCGGKNCJZOPNB-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FTCGGKNCJZOPNB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- KSGAFDTYQPKUAP-GMOBBJLQSA-N Asn-Met-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KSGAFDTYQPKUAP-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 5
- UXHYOWXTJLBEPG-GSSVUCPTSA-N Asn-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UXHYOWXTJLBEPG-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 5
- XPGVTUBABLRGHY-BIIVOSGPSA-N Asp-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N XPGVTUBABLRGHY-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 5
- OVPHVTCDVYYTHN-AVGNSLFASA-N Asp-Glu-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OVPHVTCDVYYTHN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 5
- MYOHQBFRJQFIDZ-KKUMJFAQSA-N Asp-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MYOHQBFRJQFIDZ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 5
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 5
- HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-N ITP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 5
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 5
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 5
- VCSBGUACOYUIGD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asn-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VCSBGUACOYUIGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 5
- KVOFSTUWVSQMDK-KKUMJFAQSA-N Leu-His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CC1=CN=CN1 KVOFSTUWVSQMDK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 5
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 5
- HAQLBBVZAGMESV-IHRRRGAJSA-N Met-Lys-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O HAQLBBVZAGMESV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 5
- XIULAFZYEKSGAJ-IXOXFDKPSA-N Thr-Leu-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XIULAFZYEKSGAJ-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 5
- SLCSPPCQWUHPPO-JYJNAYRXSA-N Tyr-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 SLCSPPCQWUHPPO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 5
- CTDPLKMBVALCGN-JSGCOSHPSA-N Tyr-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O CTDPLKMBVALCGN-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 5
- SFSZDJHNAICYSD-PMVMPFDFSA-N Tyr-His-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)NC(=O)[C@H](CC4=CC=C(C=C4)O)N SFSZDJHNAICYSD-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 5
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 5
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 5
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 5
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- GZLWJXDJNWQUPE-UHFFFAOYSA-N diazanium;carbamoyl phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].NC(=O)OP([O-])([O-])=O GZLWJXDJNWQUPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- TUHZSMCNIUXAIJ-UHFFFAOYSA-L dilithium;carbamoyl phosphate Chemical compound [Li+].[Li+].NC(=O)OP([O-])([O-])=O TUHZSMCNIUXAIJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- LWOUTMDLWBPUNT-UHFFFAOYSA-L dipotassium;carbamoyl phosphate Chemical compound [K+].[K+].NC(=O)OP([O-])([O-])=O LWOUTMDLWBPUNT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 5
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 5
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 5
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 5
- 229940005657 pyrophosphoric acid Drugs 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 5
- AUHDWARTFSKSAC-HEIFUQTGSA-N (2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-(6-oxo-1H-purin-9-yl)oxolane-2-carboxylic acid Chemical compound [C@]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)(N1C=NC=2C(O)=NC=NC12)C(=O)O AUHDWARTFSKSAC-HEIFUQTGSA-N 0.000 description 4
- ATKGDRWOHKQXLK-SXBJJNBASA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purin-6-one;[(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl dihydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O.C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ATKGDRWOHKQXLK-SXBJJNBASA-N 0.000 description 4
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- YAXNATKKPOWVCP-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YAXNATKKPOWVCP-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- MPLOSMWGDNJSEV-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MPLOSMWGDNJSEV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- DHBKYZYFEXXUAK-ONGXEEELSA-N Ala-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 DHBKYZYFEXXUAK-ONGXEEELSA-N 0.000 description 4
- ZBLQIYPCUWZSRZ-QEJZJMRPSA-N Ala-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 ZBLQIYPCUWZSRZ-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 4
- DXTYEWAQOXYRHZ-KKXDTOCCSA-N Ala-Phe-Tyr Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N DXTYEWAQOXYRHZ-KKXDTOCCSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- KDFQZBWWPYQBEN-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N KDFQZBWWPYQBEN-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- KVMPVNGOKHTUHZ-GCJQMDKQSA-N Asp-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KVMPVNGOKHTUHZ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 4
- JNNVNVRBYUJYGS-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JNNVNVRBYUJYGS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- AIJAPFVDBFYNKN-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Asp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)N AIJAPFVDBFYNKN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FDBTVENULFNTAL-XQQFMLRXSA-N Leu-Val-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N FDBTVENULFNTAL-XQQFMLRXSA-N 0.000 description 4
- HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N Lys-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- NQOQDINRVQCAKD-ULQDDVLXSA-N Lys-Tyr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N NQOQDINRVQCAKD-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 4
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IFPBAGJBHSNYPR-ZKWXMUAHSA-N Ser-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O IFPBAGJBHSNYPR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- SOACHCFYJMCMHC-BWBBJGPYSA-N Ser-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O SOACHCFYJMCMHC-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N Thr-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 4
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 4
- LXWZOMSOUAMOIA-JIOCBJNQSA-N Thr-Asn-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LXWZOMSOUAMOIA-JIOCBJNQSA-N 0.000 description 4
- PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N Tyr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N Tyr-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 4
- LAYSXAOGWHKNED-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LAYSXAOGWHKNED-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 4
- PYPZMFDMCCWNST-NAKRPEOUSA-N Val-Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N PYPZMFDMCCWNST-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 4
- 238000010931 ester hydrolysis Methods 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010075431 glycyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 4
- PGZVUSPTYXQADT-KQYNXXCUSA-N inosine 2'-phosphate Chemical compound OP(=O)(O)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 PGZVUSPTYXQADT-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- XALREVCCJXUVAL-KQYNXXCUSA-N inosine 3'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 XALREVCCJXUVAL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 239000004245 inosinic acid Substances 0.000 description 4
- 229940028843 inosinic acid Drugs 0.000 description 4
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 4
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940048084 pyrophosphate Drugs 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N (2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKIKVSXTXVVFDV-MMWGEVLESA-N Ala-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N OKIKVSXTXVVFDV-MMWGEVLESA-N 0.000 description 3
- FVNAUOZKIPAYNA-BPNCWPANSA-N Ala-Met-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FVNAUOZKIPAYNA-BPNCWPANSA-N 0.000 description 3
- 108010011667 Ala-Phe-Ala Proteins 0.000 description 3
- IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](C)N IOFVWPYSRSCWHI-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 3
- PLTGTJAZQRGMPP-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC(N)=O PLTGTJAZQRGMPP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- ZUFPUBYQYWCMDB-NUMRIWBASA-N Asn-Thr-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZUFPUBYQYWCMDB-NUMRIWBASA-N 0.000 description 3
- PUUPMDXIHCOPJU-HJGDQZAQSA-N Asn-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O PUUPMDXIHCOPJU-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 3
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 3
- HKTRDWYCAUTRRL-YUMQZZPRSA-N Glu-His Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 HKTRDWYCAUTRRL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- OCJRHJZKGGSPRW-IUCAKERBSA-N Glu-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O OCJRHJZKGGSPRW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- WIKMTDVSCUJIPJ-CIUDSAMLSA-N Glu-Ser-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N WIKMTDVSCUJIPJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- MZZSCEANQDPJER-ONGXEEELSA-N Gly-Ala-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MZZSCEANQDPJER-ONGXEEELSA-N 0.000 description 3
- KBBFOULZCHWGJX-KBPBESRZSA-N Gly-Tyr-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)CN)O KBBFOULZCHWGJX-KBPBESRZSA-N 0.000 description 3
- GWCJMBNBFYBQCV-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GWCJMBNBFYBQCV-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 3
- 241000256623 Icaria Species 0.000 description 3
- DPTBVFUDCPINIP-JURCDPSOSA-N Ile-Ala-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 DPTBVFUDCPINIP-JURCDPSOSA-N 0.000 description 3
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 3
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N L-Prolyl-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N L-xanthosine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N Leu-Ala-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N Lys-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFHRXJOZEXUKLV-IRXDYDNUSA-N Phe-Gly-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 WFHRXJOZEXUKLV-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 3
- KBVJZCVLQWCJQN-KKUMJFAQSA-N Phe-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KBVJZCVLQWCJQN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NXEYSLRNNPWCRN-SRVKXCTJSA-N Pro-Glu-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NXEYSLRNNPWCRN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 3
- GZGFSPWOMUKKCV-NAKRPEOUSA-N Ser-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO GZGFSPWOMUKKCV-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N Thr-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 3
- ODSAPYVQSLDRSR-LKXGYXEUSA-N Thr-Cys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ODSAPYVQSLDRSR-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 3
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 3
- CSNBWOJOEOPYIJ-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O CSNBWOJOEOPYIJ-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 3
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N Valylglycine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N Xanthosine Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N 0.000 description 3
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- AZSFNUJOCKMOGB-UHFFFAOYSA-N cyclotriphosphoric acid Chemical compound OP1(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O1 AZSFNUJOCKMOGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- DVXOPOCXFDGNKS-UHFFFAOYSA-L dipotassium;phenyl phosphate Chemical compound [K+].[K+].[O-]P([O-])(=O)OC1=CC=CC=C1 DVXOPOCXFDGNKS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N nebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 108010074082 phenylalanyl-alanyl-lysine Proteins 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N xanthosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 14C-Guanosin-5'-monophosphat Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QXDXBKZJFLRLCM-UAKXSSHOSA-N 5-hydroxyuridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(O)=C1 QXDXBKZJFLRLCM-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- PIPTUBPKYFRLCP-NHCYSSNCSA-N Ala-Ala-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PIPTUBPKYFRLCP-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N Ala-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- ZIWWTZWAKYBUOB-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZIWWTZWAKYBUOB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N Ala-Gly-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- HQJKCXHQNUCKMY-GHCJXIJMSA-N Ala-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N HQJKCXHQNUCKMY-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 2
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- SDZRIBWEVVRDQI-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SDZRIBWEVVRDQI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- VRTOMXFZHGWHIJ-KZVJFYERSA-N Ala-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VRTOMXFZHGWHIJ-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- BOKLLPVAQDSLHC-FXQIFTODSA-N Ala-Val-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N BOKLLPVAQDSLHC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N Ala-Val-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLWSGICNBZGYTA-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XLWSGICNBZGYTA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- RIQBRKVTFBWEDY-RHYQMDGZSA-N Arg-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RIQBRKVTFBWEDY-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- QQEWINYJRFBLNN-DLOVCJGASA-N Asn-Ala-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QQEWINYJRFBLNN-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- KXEGPPNPXOKKHK-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KXEGPPNPXOKKHK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- QISZHYWZHJRDAO-CIUDSAMLSA-N Asn-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N QISZHYWZHJRDAO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ULRPXVNMIIYDDJ-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ULRPXVNMIIYDDJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N Asn-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- LTCKTLYKRMCFOC-KKUMJFAQSA-N Asp-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LTCKTLYKRMCFOC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC(O)=O KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- RKXVTTIQNKPCHU-KKHAAJSZSA-N Asp-Val-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O RKXVTTIQNKPCHU-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 2
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- PMSMKNYRZCKVMC-DRZSPHRISA-N Glu-Phe-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N PMSMKNYRZCKVMC-DRZSPHRISA-N 0.000 description 2
- UZWUBBRJWFTHTD-LAEOZQHASA-N Glu-Val-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UZWUBBRJWFTHTD-LAEOZQHASA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- LLZXNUUIBOALNY-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LLZXNUUIBOALNY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MHXKHKWHPNETGG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N His-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 2
- 101000907912 Homo sapiens Pre-mRNA-splicing factor ATP-dependent RNA helicase DHX16 Proteins 0.000 description 2
- 101000798532 Homo sapiens Transmembrane protein 171 Proteins 0.000 description 2
- PFTFEWHJSAXGED-ZKWXMUAHSA-N Ile-Cys-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)O)N PFTFEWHJSAXGED-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- HPCFRQWLTRDGHT-AJNGGQMLSA-N Ile-Leu-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HPCFRQWLTRDGHT-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 2
- 240000007218 Ipomoea hederacea Species 0.000 description 2
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 2
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N Leu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- BTEMNFBEAAOGBR-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BTEMNFBEAAOGBR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- MKBIVWXCFINCLE-SRVKXCTJSA-N Lys-Asn-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N MKBIVWXCFINCLE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- ZJWIXBZTAAJERF-IHRRRGAJSA-N Lys-Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N ZJWIXBZTAAJERF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- RIJCHEVHFWMDKD-SRVKXCTJSA-N Lys-Lys-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RIJCHEVHFWMDKD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- WGILOYIKJVQUPT-DCAQKATOSA-N Lys-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WGILOYIKJVQUPT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010722 N-Glycosyl Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108010063372 N-Glycosyl Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150101414 PRP1 gene Proteins 0.000 description 2
- BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N Phe-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- LBSARGIQACMGDF-WBAXXEDZSA-N Phe-Ala-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 LBSARGIQACMGDF-WBAXXEDZSA-N 0.000 description 2
- AFNJAQVMTIQTCB-DLOVCJGASA-N Phe-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 AFNJAQVMTIQTCB-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- IEIFEYBAYFSRBQ-IHRRRGAJSA-N Phe-Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N IEIFEYBAYFSRBQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBALDZKOTNSBFM-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DBALDZKOTNSBFM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- KIZQGKLMXKGDIV-BQBZGAKWSA-N Pro-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KIZQGKLMXKGDIV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- VJLJGKQAOQJXJG-CIUDSAMLSA-N Pro-Asp-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VJLJGKQAOQJXJG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 101100368710 Rattus norvegicus Tacstd2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 101100342406 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRS1 gene Proteins 0.000 description 2
- HBOABDXGTMMDSE-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HBOABDXGTMMDSE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- KCFKKAQKRZBWJB-ZLUOBGJFSA-N Ser-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KCFKKAQKRZBWJB-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 2
- TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N Thr-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- NRUPKQSXTJNQGD-XGEHTFHBSA-N Thr-Cys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NRUPKQSXTJNQGD-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- YUOCMLNTUZAGNF-KLHWPWHYSA-N Thr-His-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N)O YUOCMLNTUZAGNF-KLHWPWHYSA-N 0.000 description 2
- MUAFDCVOHYAFNG-RCWTZXSCSA-N Thr-Pro-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MUAFDCVOHYAFNG-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- 102100032478 Transmembrane protein 171 Human genes 0.000 description 2
- QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- HZDQUVQEVVYDDA-ACRUOGEOSA-N Tyr-Tyr-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HZDQUVQEVVYDDA-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 2
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UUYCNAXCCDNULB-QXEWZRGKSA-N Val-Arg-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O UUYCNAXCCDNULB-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 2
- YQMILNREHKTFBS-IHRRRGAJSA-N Val-Phe-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N YQMILNREHKTFBS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 2
- 108010036533 arginylvaline Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 2
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 2
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N glycylvaline Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- QIVUCLWGARAQIO-OLIXTKCUSA-N (3s)-n-[(3s,5s,6r)-6-methyl-2-oxo-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-5-(2,3,6-trifluorophenyl)piperidin-3-yl]-2-oxospiro[1h-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3,6'-5,7-dihydrocyclopenta[b]pyridine]-3'-carboxamide Chemical compound C1([C@H]2[C@H](N(C(=O)[C@@H](NC(=O)C=3C=C4C[C@]5(CC4=NC=3)C3=CC=CN=C3NC5=O)C2)CC(F)(F)F)C)=C(F)C=CC(F)=C1F QIVUCLWGARAQIO-OLIXTKCUSA-N 0.000 description 1
- UQQHOWKTDKKTHO-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethyl)-5-(6-methoxypurin-9-yl)oxolane-3,4-diol Chemical compound C1=NC=2C(OC)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O UQQHOWKTDKKTHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDTFMPXQUSBYRL-UUOKFMHZSA-N 2-Aminoadenosine Chemical compound C12=NC(N)=NC(N)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O ZDTFMPXQUSBYRL-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- SQTAOHNMJFNLKF-VITAEQTISA-N 2-amino-9-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-sulfanyloxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@]1(S)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O SQTAOHNMJFNLKF-VITAEQTISA-N 0.000 description 1
- DCTLYFZHFGENCW-UUOKFMHZSA-N 5'-xanthylic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 DCTLYFZHFGENCW-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- YBTWWWIJBCCYNR-UAKXSSHOSA-N 5-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YBTWWWIJBCCYNR-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 5-bromouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- WYXSYVWAUAUWLD-SHUUEZRQSA-N 6-azauridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=N1 WYXSYVWAUAUWLD-SHUUEZRQSA-N 0.000 description 1
- LGQVOKWMIRXXDM-UHFFFAOYSA-N 6-fluoro-7h-purine Chemical compound FC1=NC=NC2=C1NC=N2 LGQVOKWMIRXXDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYFLINJPCLMDLX-QOOXTFGASA-N 9-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-6-oxopurine-5-carboxylic acid Chemical compound [C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)N1C=NC2(C(=O)N=CN=C12)C(=O)O OYFLINJPCLMDLX-QOOXTFGASA-N 0.000 description 1
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- FBHOPGDGELNWRH-DRZSPHRISA-N Ala-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FBHOPGDGELNWRH-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- LJFNNUBZSZCZFN-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Cys Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O LJFNNUBZSZCZFN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HJGZVLLLBJLXFC-LSJOCFKGSA-N Ala-His-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HJGZVLLLBJLXFC-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- DVJSJDDYCYSMFR-ZKWXMUAHSA-N Ala-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O DVJSJDDYCYSMFR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- NOGFDULFCFXBHB-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N NOGFDULFCFXBHB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N Ala-Leu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- VHVVPYOJIIQCKS-QEJZJMRPSA-N Ala-Leu-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 VHVVPYOJIIQCKS-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PMQXMXAASGFUDX-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CCCCN PMQXMXAASGFUDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OINVDEKBKBCPLX-JXUBOQSCSA-N Ala-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OINVDEKBKBCPLX-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- MDNAVFBZPROEHO-DCAQKATOSA-N Ala-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MDNAVFBZPROEHO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Val Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(C)N)CCCCN MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- QKHWNPQNOHEFST-VZFHVOOUSA-N Ala-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O QKHWNPQNOHEFST-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N Ala-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- YCTIYBUTCKNOTI-UWJYBYFXSA-N Ala-Tyr-Asp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N YCTIYBUTCKNOTI-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- OTOXOKCIIQLMFH-KZVJFYERSA-N Arg-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N OTOXOKCIIQLMFH-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N Arg-Gly-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- WMEVEPXNCMKNGH-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N WMEVEPXNCMKNGH-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IYVSIZAXNLOKFQ-BYULHYEWSA-N Asn-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IYVSIZAXNLOKFQ-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- UDSVWSUXKYXSTR-QWRGUYRKSA-N Asn-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O UDSVWSUXKYXSTR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- YUOXLJYVSZYPBJ-CIUDSAMLSA-N Asn-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YUOXLJYVSZYPBJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KRXIWXCXOARFNT-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O KRXIWXCXOARFNT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- WSWYMRLTJVKRCE-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WSWYMRLTJVKRCE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- SLHOOKXYTYAJGQ-XVYDVKMFSA-N Asp-Ala-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 SLHOOKXYTYAJGQ-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- XBQSLMACWDXWLJ-GHCJXIJMSA-N Asp-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O XBQSLMACWDXWLJ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N Asp-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HJCGDIGVVWETRO-ZPFDUUQYSA-N Asp-Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(O)=O HJCGDIGVVWETRO-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N Asp-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- NQSUTVRXXBGVDQ-LKXGYXEUSA-N Cys-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NQSUTVRXXBGVDQ-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- KXUKWRVYDYIPSQ-CIUDSAMLSA-N Cys-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KXUKWRVYDYIPSQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KCPOQGRVVXYLAC-KKUMJFAQSA-N Cys-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N KCPOQGRVVXYLAC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N Glu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- CXRWMMRLEMVSEH-PEFMBERDSA-N Glu-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CXRWMMRLEMVSEH-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N Glu-Pro Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YBTCBQBIJKGSJP-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- SWDNPSMMEWRNOH-HJGDQZAQSA-N Glu-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SWDNPSMMEWRNOH-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- LWYUQLZOIORFFJ-XKBZYTNZSA-N Glu-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O LWYUQLZOIORFFJ-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- HQTDNEZTGZUWSY-XVKPBYJWSA-N Glu-Val-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O HQTDNEZTGZUWSY-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- QRWPTXLWHHTOCO-DZKIICNBSA-N Glu-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O QRWPTXLWHHTOCO-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N Gly-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N Gly-His Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N Gly-Leu-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- DBUNZBWUWCIELX-JHEQGTHGSA-N Gly-Thr-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DBUNZBWUWCIELX-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-NSHDSACASA-N Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- UVTSZKIATYSKIR-RYUDHWBXSA-N Gly-Tyr-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UVTSZKIATYSKIR-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- LYZYGGWCBLBDMC-QWHCGFSZSA-N Gly-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)CN)C(=O)O LYZYGGWCBLBDMC-QWHCGFSZSA-N 0.000 description 1
- CZVQSYNVUHAILZ-UWVGGRQHSA-N His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 CZVQSYNVUHAILZ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- UXSATKFPUVZVDK-KKUMJFAQSA-N His-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N UXSATKFPUVZVDK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- CWSZWFILCNSNEX-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Asn Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N CWSZWFILCNSNEX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FBVHRDXSCYELMI-PBCZWWQYSA-N His-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O FBVHRDXSCYELMI-PBCZWWQYSA-N 0.000 description 1
- HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N His-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- VTMSUKSRIKCCAD-ULQDDVLXSA-N His-Tyr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N VTMSUKSRIKCCAD-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- YBGTWSFIGHUWQE-MXAVVETBSA-N Ile-His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)CC1=CN=CN1 YBGTWSFIGHUWQE-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- WIZPFZKOFZXDQG-HTFCKZLJSA-N Ile-Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WIZPFZKOFZXDQG-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 1
- IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N Ile-Leu-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N Leu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PBGDOSARRIJMEV-DLOVCJGASA-N Leu-His-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PBGDOSARRIJMEV-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N Leu-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AEDWWMMHUGYIFD-HJGDQZAQSA-N Leu-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AEDWWMMHUGYIFD-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- NTSPQIONFJUMJV-AVGNSLFASA-N Lys-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NTSPQIONFJUMJV-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KZOHPCYVORJBLG-AVGNSLFASA-N Lys-Glu-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N KZOHPCYVORJBLG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N Lys-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- IMTUWVJPCQPJEE-IUCAKERBSA-N Met-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IMTUWVJPCQPJEE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100205189 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012220 PCR site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- MQVFHOPCKNTHGT-MELADBBJSA-N Phe-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)O MQVFHOPCKNTHGT-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N Phe-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- BIYWZVCPZIFGPY-QWRGUYRKSA-N Phe-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BIYWZVCPZIFGPY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- DOXQMJCSSYZSNM-BZSNNMDCSA-N Phe-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DOXQMJCSSYZSNM-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- BONHGTUEEPIMPM-AVGNSLFASA-N Phe-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BONHGTUEEPIMPM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N Phe-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- GLJZDMZJHFXJQG-BZSNNMDCSA-N Phe-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O GLJZDMZJHFXJQG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- MCIXMYKSPQUMJG-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MCIXMYKSPQUMJG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- CQZNGNCAIXMAIQ-UBHSHLNASA-N Pro-Ala-Phe Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O CQZNGNCAIXMAIQ-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N Pro-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KIPIKSXPPLABPN-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KIPIKSXPPLABPN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WFHYFCWBLSKEMS-KKUMJFAQSA-N Pro-Glu-Phe Chemical compound N([C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 WFHYFCWBLSKEMS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- VPEVBAUSTBWQHN-NHCYSSNCSA-N Pro-Glu-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VPEVBAUSTBWQHN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- UUHXBJHVTVGSKM-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O UUHXBJHVTVGSKM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KLSOMAFWRISSNI-OSUNSFLBSA-N Pro-Ile-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KLSOMAFWRISSNI-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- KDBHVPXBQADZKY-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 KDBHVPXBQADZKY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N Pro-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- IDQFQFVEWMWRQQ-DLOVCJGASA-N Ser-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O IDQFQFVEWMWRQQ-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- QKQDTEYDEIJPNK-GUBZILKMSA-N Ser-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO QKQDTEYDEIJPNK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UBRMZSHOOIVJPW-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Lys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O UBRMZSHOOIVJPW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VZQRNAYURWAEFE-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 VZQRNAYURWAEFE-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- HNDMFDBQXYZSRM-IHRRRGAJSA-N Ser-Val-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HNDMFDBQXYZSRM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- KEGBFULVYKYJRD-LFSVMHDDSA-N Thr-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KEGBFULVYKYJRD-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N Thr-Cys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- XOTBWOCSLMBGMF-SUSMZKCASA-N Thr-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XOTBWOCSLMBGMF-SUSMZKCASA-N 0.000 description 1
- XFTYVCHLARBHBQ-FOHZUACHSA-N Thr-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XFTYVCHLARBHBQ-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- URPSJRMWHQTARR-MBLNEYKQSA-N Thr-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O URPSJRMWHQTARR-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- ZSPQUTWLWGWTPS-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZSPQUTWLWGWTPS-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- WVVOFCVMHAXGLE-LFSVMHDDSA-N Thr-Phe-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WVVOFCVMHAXGLE-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- VBMOVTMNHWPZJR-SUSMZKCASA-N Thr-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VBMOVTMNHWPZJR-SUSMZKCASA-N 0.000 description 1
- PEYSVKMXSLPQRU-FJHTZYQYSA-N Trp-Ala-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O PEYSVKMXSLPQRU-FJHTZYQYSA-N 0.000 description 1
- NZFCWALTLNFHHC-JYJNAYRXSA-N Tyr-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NZFCWALTLNFHHC-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- QAYSODICXVZUIA-WLTAIBSBSA-N Tyr-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QAYSODICXVZUIA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- SOEGLGLDSUHWTI-STECZYCISA-N Tyr-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 SOEGLGLDSUHWTI-STECZYCISA-N 0.000 description 1
- DDRBQONWVBDQOY-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O DDRBQONWVBDQOY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UEOOXDLMQZBPFR-ZKWXMUAHSA-N Val-Ala-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N UEOOXDLMQZBPFR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N Val-Ala-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N Val-Leu-Ser Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LJSZPMSUYKKKCP-UBHSHLNASA-N Val-Phe-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 LJSZPMSUYKKKCP-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- AEFJNECXZCODJM-UWVGGRQHSA-N Val-Val-Gly Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC([O-])=O AEFJNECXZCODJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N acetyl dihydrogen phosphate Chemical compound CC(=O)OP(O)(O)=O LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229910001447 ferric ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010027668 glycyl-alanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010031424 isoleucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010093296 prolyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010087846 prolyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000002718 pyrimidine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
12P 19/32 Sposób wytwarzania 5’- fosforanowego estru nukleozydy zmutowana kwasna fosfataza, kwasna fosfataza, gen kodujacy zmutowana kwasna fosfataze, gen kodujacy kwasna fosfataze, zrekombinowany DNA oraz nowy szczep E. coli ( 30) Pierwszenstwo: 25.05.1995,JP,7-149781 26.03.1996, JP,8-094680 ( 43) Zgloszenie ogloszono: 30.03.1998 BUP 07/98 ( 45) O udzieleniu patentu ogloszono: 28.06.2002 WUP 06/02 ( 73) Uprawniony z patentu: AJINOMOTO CO., INC., Tokyo, JP Twórcy wynalazku: Yasuhiro Mihara, Kanagawa, JP Takashi Utagawa, Kanagawa, JP Hideaki Yamada, Kyoto, JP Yasuhisa Asano, Toyama, JP ( 7 4 ) Pelnomocnik: Kulikowska Wanda, KULIKOWSKA & KULIKOWSKI 1. Sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, znamienny tym, ze nukleozyd poddaje sie dzialaniu kwasnej fosfatazy i donora g ru py fosforanowej wybranego z grupy obejmujacej kwas polifosforowy lub jego sól, kwas fenylofosforowy lub jego sól i karbamoilofosforan lub jego sól przy pH od 3,0 do 5,5 i wydzie- la sie 5'-fosforanowy ester nukleozydu. 7. Zmutowana kwasna fosfataza obejmujaca sekwencje aminokwasowa zasadniczo identyczna z sek- w encja am inokw asow a nr 4 w Liscie Sekwencji, posiadajaca mutacje obnizajaca jej aktywnosc fosfo- monoesterazy, wybrana sposród grupy obejmujacej podstawienia reszt aminokwasowych odpowiadajace podsta- wieniu(om) reszty glicyny w pozycj i 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liscie Sekwencji. 10. Kwasna fosfataza obejmujaca sekwencje aminokwasowa nr 11 w Liscie Sekw encji. 12. Gen kodujacy zmutowana kwasna fosfataze obejmujaca sekwencje aminokwasowa zasadniczo iden- tyczna z sekwencja aminokwasowa nr 4 w Liscie Sekwencji, posiadajaca mutacje obnizajaca jej aktywnosc fosfomonoesterazy, wybrana sposród grupy obejmujacej podstawienia reszty aminokwasowej odpowiadajace podstawieniu(om) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w se- kwencji nr 4 w Liscie Sekwencji. 15. Gen kodujacy kwasna fosfataze obejmujaca sekwencje nr 11 w Liscie Sekwencji. 17. Zrekombinowany DNA obejmujacy gen kodujacy zmutowana kw asna fosfataze obejmujacasekwen- cje aminokwasowa zasadniczo identyczna z sekwencja aminokwasowa nr 4 w Liscie Sekwencji, posiadajaca mutacje obnizajaca jej aktywnosc fosfomonoesterazy, wybrana sposród grupy obejmujacej podstawienia reszt aminokwasowych odpowiadajace podstawieniu(om) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozy- cji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liscie Sekwencji. 22. Escherichia coli AJ 13143 (FERM BP-5422). 23. Escherichia coli A J13144 (FERM BP-5423). PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, zmutowana kwaśna fosfataza, kwaśna fosfataza, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, gen kodujący kwaśną fosfatazę, zrekombinowany DNA oraz nowy szczep E.coli. 5'-Fosforanowy ester nukleozydu jest użyteczny jako materiał wzbogacający, materiał farmaceutyczny i surowiec do ich wytwarzania.
Znane są metody biochemicznej fosforylacji nukleozydu w wyniku której powstaje 5'-fosforanowy ester nukleozydu przy zastosowaniu poniżej wymienionych donorów grup fosforanowych; obejmująone metodę wykorzystującąkwas p-nitrofenyfosforowy (publikacja japońskiego opisu patentowego numer 39-29858), metodę wykorzystującąnieorganiczny kwas fosforanowy (publikacja japońskiego opisu patentowego numer 42-1186), metodę wykorzystującąkwas polifosforowy (japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 53-56390), metodę wykorzystującą kwas acetylofosforowy (japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 56-82098) oraz metodę wykorzystującą trifosforan adenozyny (ATP) (japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 63-230094). Jednakże, metody te nie są zadawalające do wydajnego i taniego wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, ponieważ stosowane substraty są kosztowne, lub ponieważ w reakcji wytwarzane są produkty uboczne.
A zatem, autorzy niniejszego wynalazku opracowali metodę wydajnego wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu bez ubocznego wytwarzania izomerów 2'-, 3'-nukleotydów przez umożliwienie komórkom określonego mikroorganizmu działanie w warunkach kwaśnych na nukleozyd i donor grupy fosforanowej wybranej z grupy składającej się z kwasu polifosforowego lub jego soli, kwasu fenylofosforowego lub jego soli oraz karbamoilofosforanu lub jego soli (japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 7-231793).
Jednakże, nawet ta metoda posiada następujące wady. Mianowicie, na przykład, część substratu ulega degradacji podczas reakcji w wyniku aktywności degradującej nukleozydy, która niestety występuje w niewielkiej ilości w komórkach mikroorganizmu przeznaczonego do stosowania. Ponadto, w miarę trwania reakcj i wytwarzany i akumulowany 5'-fosforanowy ester nukleozydu jest degradowany. Dlatego też, w roztworze reakcyjnym wytwarzane są produkty uboczne, i niemożliwe było otrzymanie dostatecznej wydajności. Ponadto, reakcji nie można prowadzić, jeśli substrat dodaje się w wysokim stężeniu, z powodu niskiej aktywności transfosforylacji na komórkę mikroorganizmu.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zapewnienie metody taniego i wydajnego wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu. Innym przedmiotem wynalazku jest zapewnienie enzymu, genu kodującego enzym, zrekombinowanego DNA obejmującego gen i mikroorganizmu zawierającego zrekombinowany DNA, które są użyteczne w metodzie wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu.
W wyniku różnych badań wykonanych przez autorów niniejszego wynalazku w celu opracowania metody wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, która jest wydajniejsza od metod konwencjonalnych, stwierdzono, że 5'-fosforanowy ester nukleozydu może być skutecznie wytwarzany z wysoką wydajnością dzięki umożliwieniu kwaśnej fosfatazie, oczyszczonej z wolnego od komórek ekstraktu mikroorganizmu, działania w warunkach pH 3,0 do 5,5 na nukleozyd i donor grupy fosforanowej wybrany z grupy składającej się z kwasu polifosforowego lub jego soli, kwasu fenylofosforowego lub jego soli oraz karbamoilofosforanu lub jego soli. Ponadto autorom niniejszego wynalazku udało się otrzymać z różnych bakterii geny typu dzikiego kodujące kwaśne fosfatazy oraz z bakterii należącej do rodzaju Morgcmella i z bakterii należącej do rodzaju Escherichia geny kodujące kwaśne fosfatazy o obniżonych aktywnościach fosfomonoesterazy. Poza tym autorzy niniejszego wynalazku stwierdzili, że wydajność wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu wyraźnie poprawia się w wyniku prowadzenia na wysokim poziomie ekspresj i genu, zgodnie z technikami inżynierii genetycznej. A zatem cel niniejszego wynalazku został zrealizowany.
Mianowicie, niniejszy wynalazek zapewnia metodę wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, obejmującą etapy umożliwienia kwaśnej fosfatazie, i korzystnie kwaśnej fosfatazie o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy, działania w warunkach pH 3,0 do 5,5 na nukleozyd
183 293 i donor grupy fosforanowej wybrany z grupy składającej się z kwasu polifosforowego lub jego soli, kwasu fenylofosforowego lub jego soli, oraz karbamoilofosforanu lub jego soli z utworzeniem 5'-fosforanowego estru nukleozydu, oraz metodę jego zbierania.
W innym aspekcie, niniejszy wynalazek zapewnia zmutowane kwaśne fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy, geny kodujące kwaśne fosfatazy, zrekombinowane DNA obejmujące geny i mikroorganizmy zawierające zrekombinowany DNA.
W jeszcze innym aspekcie, niniejszy wynalazek zapewnia nowe kwaśne fosfatazy pochodzące z bakterii należących do rodzajów Escherichia, Enterobacter, Klebsiella lub Serratia, geny kodujące kwaśne fosfatazy, zrekombinowane DNA obejmujące geny i mikroorganizmy posiadające zrekombinowany DNA.
Niniejszy wynalazek będzie szczegółowo wyjaśniony poniżej.
< 1 > Przygotowywanie kwaśnej fosfatazy
Rodzaj kwaśnej fosfatazy stosowanej w niniejszym wynalazku nie jest szczególnie ograniczony, pod warunkiem, że katalizuje ona reakcję wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu przez przeniesienie grupy fosforanowej z donora, wybranego z grupy składającej się z kwasu polifosforowego lub jego soli, kwasu fenylofosforowego lub jego soli oraz karbamoilofosforanu lub jego soli, do nukleozydu w warunkach pH 3,0 do 5,5. Taka kwaśna fosfataza obejmuje korzystnie fosfazy pochodzące z mikroorganizmów. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, niniejszy wynalazek wykorzystuje enzymy pochodzące z bakterii należącej do rodzaju Morganella, Escherichia, Providencia, Enterobacter, Klebsiella lub Serratia. Reprezentatywne przykłady takiej bakterii obejmują następujące szczepy bakteryjne.
Morganella morganii NCIMB 10466
Morganella morganii IFO 3168
Morganella morganii IFO 3848
Escherichia blattae JCM 1650
Escherichia blattae ATCC 33429
Escherichia blattae ATCC 33430
Providencia stuartii ATCC 29851
Providencia stuartii ATCC 33672
Enterobacter aerogenes IFO 12010
Enterobacter aerogenes IFO 13534
Klebsiella planticola IFO 14939
Klebsiellaplanticola IAM 1133
Serratiaficaria IAM 13540
Serratia marcescens IAM 12143
Należy zauważyć, że kwaśna fosfataza (EC 3.1.3.2) jest oryginalnie enzymem, który katalizuje reakcję, w kwaśnych warunkach, do hydrolizy estru fosforanowego i posiada aktywność nukleozydazy do degradacji 5'-fosforanowego estru nukleozydu utworzonego w wyniku reakcji transfosforylacji (dalej w niniejszym opisie, aktywność nukleozydazy określa się jako „aktywność fosfomonoesterazy”). Nawet taką kwaśną fosfatazę można stosować w metodzie wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu według niniejszego wynalazku. Jednakże, w celu otrzymania 5'-fosforanowego estru nukleozydu z wysoką wydajnością pożądane jest stosowanie zmutowanej kwaśnej fosfatazy (dalej w niniejszym opisie określanej po prostujako „zmutowana kwaśna fosfataza”, jeśli to konieczne), której aktywność fosfomonoesterazy jest obniżona w porównaniu z kwaśną fosfatazą typu dzikiego, wytwarzaną przez bakterie opisane powyżej.
Zmutowaną kwaśną fosfatazę otrzymuje się przez ekspresję zmutowanego genu uzyskanego przez bezpośrednie mutowanie genu kodującego kwaśną fosfatazę w sposób opisany poniżej. Alternatywnie, zmutowaną kwaśną fosfatazę można otrzymać także przez traktowanie mikroorganizmu wytwarzającego kwaśną fosfatazę napromieniowaniem światłem ultrafioletowym lub czynnikiem mutagennym stosowanym zazwyczaj do otrzymywania sztucznych mutacji, takim jakN-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (NTG), i hodowanie zmutowanego mikroorganizmu w celu wytworzenia zmutowanej kwaśnej fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy.
183 293
Białko wykazujące aktywność kwaśnej fosfatazy można otrzymać z mikroorganizmów, jak opisane powyżej, przez hodowanie wykazującego aktywność szczepu mikroorganizmu w odpowiednim podłożu, zbieranie namnożonych komórek mikroorganizmu, rozbijanie komórek mikroorganizmu w celu przygotowania wolnego od komórek ekstraktu i dostateczne oczyszczenie z niego białka.
Podłoże do hodowli mikroorganizmu nie podlega szczególnym ograniczeniom, odpowiednie może byś zwykłe podłoże zawierające zwykłe źródło węgla, źródło azotu, jony nieorganiczne i ewentualnie źródło organicznych substancji odżywczych. Odpowiednie do użycia źródło węgla obejmuje, na przykład, cukry takie jak glukoza i sacharoza, alkohole takie jak glicerol i kwasy organiczne. Stosowane źródła azotu obejmują na przykład, amoniak gazowy, wodny roztwór amoniaku i sole amoniowe. Jony nieorganiczne odpowiednie do stosowania jeśli jest to konieczne obejmują na przykład, jon magnezowy, jon fosforanowy, jon potasowy, jon żelazowy i jon manganowy. Odpowiednie do stosowania źródło organicznych substancji odżywczych obejmuje, na przykład, witaminy i aminokwasy, jak również źródła zawierająceje, takie jak ekstrakt drożdżowy, pepton ekstrakt mięsny, namok kukurydziany, hydrolizat kazeiny i hydrolizat soi. Warunki hodowli również nie podlegają szczególnym ograniczeniom. Mikroorganizm można hodować, na przykład, w warunkach tlenowych w ciągu około 12 do 48 godzin, odpowiednio utrzymując pH i temperaturą w zakresie, pH od 5 do 8 i temperaturę od 25 do 40°C.
Namnożone komórki bakteryjne można zbierać z hodowli płynnej przez, na przykład, wirowanie. Z zebranych komórek bakteryjnych przygotowuje się wolny od komórek ekstrakt stosując zwykłą metodę. Mianowicie, wolny od komórek ekstrakt otrzymuje się przez rozbicie komórek bakteryjnych taką metodą jak poddawanie działaniu ultradźwięków, młynek Dyno, prasa Frencha i usunięcie pozostałości komórek przez wirowanie.
Kwaśną fosfatazę oczyszcza się z wolnego od komórek ekstraktu przez zastosowanie połączenia technik zazwyczaj stosowanych do oczyszczania enzymów, takich jak frakcjonowanie siarczanem amonu, chromatografia jonowymienna, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, chromatografia powinowactwa, chromatografia sączenia molekularnego i oczyszczanie izoelektryczne. Jeśli chodzi o wytrącanie, nie jest koniecznie nieodzowne całkowite oczyszczenie kwaśnej fosfatazy. Wystarczające jest usunięcie takich zanieczyszczeń, jak enzym uczestniczący w degradacji nukleozydu jako substratu.
< 2 > Przygotowywanie genu kwaśnej fosfatazy
Fragment DNA, który zawiera strukturalny gen kodujący białko posiadające aktywność kwaśnej fosfatazy, można sklonować wychodząc z, na przykład, komórek mikroorganizmu posiadającego aktywność enzymu. Metody klonowania obejmują na przykład, metodę, w której bibliotekę ekspresyjną genów chromosomalnych przeszukuje się jako wskaźnik wykorzystując aktywność enzymu, metodę, w której przygotowuje się przeciwciało skierowane przeciw białku do przeszukiwania biblioteki ekspresyjnej genów chromosomalnych, oraz metodę, w której analizuje się sekwencję aminokwasową takąjak N-końcowa sekwencja oczyszczonego białka, na podstawie której przygotowuje się sondę do przeszukiwania biblioteki genów.
W szczególności, gen kodujący kwaśną fosfatazę opisanych powyżej Morganella morgami, Escherichia blattae, Providencia siuartii, Enterobacter aerogens, Klebsiella planticola, Serratiaficaria lub Serratia marcescens można sklonować przez przygotowanie ekspresyjnej biblioteki genów chromosomalnych każdego z mikroorganizmów i przeszukanie biblioteki przez wykorzystanie aktywności fosfatazy jako wskaźnika.
Mianowicie, ekspresyjną bibliotekę genów chromosomalnych można przygotować przez przygotowanie najpierw chromosomalnego DNA z powyższych bakterii, jego częściową degradację odpowiednim enzymem restrykcyjnym, a następnie jego ligację z wektorem zdolnym do autonomicznej replikacji w Escherichia coli i stransformowanie Escherichia coli otrzymanym zrekombinowanym DNA. Do trawienia chromosomalnego DNA można stosować szeroki zakres enzymów restrykcyjnych, dostosowując czas reakcji trawienia do wymaganego stopnia trawienia. Do klonowania genu można zastosować każdy wektor, z zastrzeżeniem, że jest on zdol
183 293 ny do autonomicznej replikacji w Escherichia coli. Na przykład, można zastosować pUC19, pUC118, pHSG298, pBR322 i pBluescript II.
Wektor można zligować z fragmentem DNA zawierającym gen kodujący kwaśną fosfatazę w celu przygotowania zrekombinowanego DNA przez uprzednie strawienie wektora tym samym enzymem restrykcyjnym, jak zastosowany do trawienia chromosomalnego DNA, lub enzymem restrykcyjnym, który tworzy w wyniku rozszczepienia koniec komplementarny do końca fragmentu DNA chromosomalnego, oraz jego ligację z fragmentem DNA przy zastosowaniu ligazy, takiej jak ligaza DNA T4. Jako biorcę przygotowanego zrekombinowanego DNA można zastosować jakikolwiek szczep mikroorganizmu, pod warunkiem, że jest on odpowiedni do ligacji wektora. Można zastosować, na przykład, taki szczep mikroorganizmu, jak Escherichia coli HB101, JM109 i DH5.
Tak otrzymane transformanty hoduje się na podłożu agarowym dla utworzenia ich kolonii. Następnie, gdy na powierzchnię podłoża wylewa się roztwór reakcyjny zawierający kwas p-nitrofenylofosforowy w celu przeprowadzenia reakcji, szczep, w którym zachodzi ekspresja aktywności fosfatazy, uwalnia p-nitrofenol i wykazuje barwę żółtą. Transformanta, który zawiera fragment DNA obejmujący gen kodujący stanowiącą przedmiot wynalazku kwaśną fosfatazę, można wyselekscjonować przez przeprowadzenie opisanej powyżej reakcji w warunkach kwaśnych i wybór transformanta przy wykorzystaniu jako wskaźnika powstawania zabarwienia.
Następnie z wyselekcjonowanego transformanta odzyskuje się DNA w celu analizy struktury zligowanego z wektorem fragmentu DNA zawierającego gen kodujący kwaśną fosfatazę. Sekwencję nukleotydową genu kodującego kwaśną fosfatazę przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 w Liście Sekwencji w przypadku genu pochodzącego z Morganella morganii NCIMB 10466, w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 9 w Liście Sekwencji w przypadku genu pochodzącego z Escherichia blattae JCM 1650, w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 17 w Liście Sekwencji w przypadku genu pochodzącego z Providencia stuartii ATCC 29851, w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 19 w Liście Sekwencji w przypadku genu pochodzącego z Enterobacter aerogens IFO 12010, w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 21 w Liście Sekwencji w przypadku genu pochodzącego z Klebsiellaplanticola IFO 14939, lub w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 23 w Liście Sekwencji w przypadku genu pochodzącego z Serratia ficaria IAM 13540.
Przewidywane sekwencje aminowkasowe kwaśnych fosfataz kodowanych przez powyższe geny przedstawiono w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 4, 11, 18, 20, 22 i 24. Kwaśne fosfatazy kodowane przez powyższe geny korzystnie stosuje się dla celów niniejszego wynalazku. Ponadto, kwaśną fosfatazę obejmującą sekwencję aminokwasową, która jest zasadniczo identyczna z sekwencjąaminokwasowąktórejkolwiek z fosfataz kodowanych przez powyższe geny również korzystnie stosuje się dla celów niniejszego wynalazku. Termin „zasadniczo identyczna” oznacza, że sekwencje aminowkasowe kwaśnych fosfataz mogą posiadać podstawienie, delecję, insercję lub tranzycję jednego lub wielu reszt aminokwasowych, nie tracąc przy tym aktywności wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu (dalej w niniejszym opisie określanej jako „aktywność transfosforylacyjna”).
< 3 > Przygotowywanie genu kodującego zmutowaną kwaśną fosfatazę
Otrzymana jak opisano powyżej kwaśna fosfataza typu dzikiego posiada aktywność fosfomonoesterazy. Dlatego też, aktywność fosfomonoesterazy może służyć jako czynnik powodujący towarzyszącą degradację produktu w miarę czasu trwania reakcji wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukloezydu, wynikiem czego staje się obniżenie wydajności reakcji. W celu pokonania tej niedogodności, korzystne jest wywołanie sztucznej mutacji genu kodującego kwaśną fosfatazę, tak aby obniżyć aktywność fosfomonoesterazy.
Metody ukierunkowanej mutagenezy wywoływania zamierzonej mutacji w zamierzonym miejscu DNA obejmują, na przykład metodę stosowania PCR (Higuchi, R., 61, wPCR Technology (Erlich, H.A.,red. Stockton press (1989); Carter, P., Meth. inEnzymol., 154, 382 (1987)) i metodę stosowani fagów (Kramer, W. i Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154,350 (1987); Kunkel, T.A. i in. Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)).
183 293
Przykładami zmutowanej kwaśnej fosfatazy posiadającej obniżoną aktywność fosfomonoesterazy jest kwaśna fosfataza obejmująca sekwencję aminokwasową która jest zasądniczo identyczna z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji przedstawionych w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 4, 11, 18, 20, 22 i 24 w Liście Sekwencji, i posiada mutację, która obniża aktywność fosfomonoesterazy kwaśnej fosfatazy typu dzikiego. Konkretnie, przykładem zmutowanej kwaśnej fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy dla enzymu pochodzącego z Morganella morganii NCIMB 10466 jest enzym, w którym resztą glicyny w pozycji 72 i/lub resztę izoleucyny w pozycji 151 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 w Liście Sekwencji podstawiono innąresztą aminokwasową. W opisanych poniżej przykładach, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę przedstawiono jako przykład, w którym resztę glicyny w pozycji 72 podstawia się resztą kwasu asparaginowego, a resztę izoleucyny w pozycji 151 podstawia się resztą treoniny. Z drugiej strony, przykładem kwaśnej fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy dla enzymu pochodzącego z Escherichia blattae JCM 1650 jest enzym, w którym resztę glicyny w pozycji 74 i/lub resztę izoleucyny w pozycji 153 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11 w Liście Sekwencji podstawiono innąresztąaminokwasową. W opisanych poniżej przykładach, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę przedstawiono jako przykład, w którym resztę glicyny w pozycji 74 podstawia się resztą kwasu asparaginowego, a resztę izoleucyny w pozycji 153 podstawia się resztą treoniny.
Zatem, w określonym miejscu genu typu dzikiego można podstawić nukleotyd, zgodnie z opisanymi powyżej metodami ukierunkowanej mutagenezy, tak że kodowana jest zmutowana kwaśna fosfataza. Pożądane jest, aby mutacja obniżająca aktywność fosfomonoesterazy była takiego rodzaju mutacją aby aktywność wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu nie ulega zasadniczemu obniżeniu w porównaniu z kwaśną fosfatazą typu dzikiego. Jednakże, nawet w przypadku obniżenia aktywności wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, wystarczające będzie, jeśli stopień obniżenia aktywności fosfomonoesterazy będzie większy niż stopień obniżenia aktywności wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, w wyniku czego stosunek aktywności fosfomonoesterazy do aktywności wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydowego zmutowanej kwaśnej fosfatazy jest obniżony w porównaniu z kwaśną fosfatazą typu dzikiego. Jeśli chodzi o stopień obniżenia aktywności fosfomonoesterazy, aktywność tą można obniżyć do mniej niż około 40% aktywności enzymu typu dzikiego. Jak przedstawiono poniżej w rozwiązaniach, sekwencja amino kwasowa kwaśnej fosfatazy Escherichia blattae JCM 1650jest w wysokim stopniu homologiczna do tej sekwencji Morganella morgamiNCIMB 10466, a reszta glicyny w pozycji 72 i reszta izoleucyny w pozycji 151 w sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 odpowiadają odpowiednio reszcie glicyny w pozycji 74 i reszcie izoleucyny w pozycji 153 w sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11. Ponadto, pozaEscherichia blattae JCM 1650, sekwencje aminowkasowe kwaśnych fosfataz pochodzących z takich mikroorganizmów, jak Providencia stuartii ATCC 29851, Enterobacter aerogenes IFO 12010, Klebsiella planticola\FQ 14939 iSerratiaficaria\MA 13450, wykazująwysokistopieńhomologiiztąsekMorganella morganii NCIMB 10466, a sekwencje aminokwasowe tych kwaśnych fosfataz obejmują reszty aminokwasowe odpowiadające reszcie glicyny w pozycji 72 i reszcie izoleucyny w pozycji 151 w sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4. Dlatego też, geny kodujące zmutowane kwaśne fosfatazy pochodzące z tych mikroorganizmów można otrzymać w opisany powyżej sposób. Reszta glicyny w pozycji 92 i reszta izoleucyny w pozycji 171 sekwencji aminokwasowej kwaśnej fosfatazy pochodzącej zProvidenciastuartii ATCC29851,Enterobacter aerogenesIFO 12010 lubKlebsiellaplanticola IFO 14939, przedstawionych w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 18, 20 lub 20, oraz reszta glicyny w pozycji 88 i reszta izoleucyny w pozycji 167 sekwencji aminokwasowej kwaśnej fosfatazy pochodzącej zSerratiaficaria IAM 13450, przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 24, odpowiadają odpowiednio reszcie glicyny w pozycji 72 i reszcie
183 293 izoleucyny w pozycji 151 sekwencji aminokwasowej przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4.
< 4> Wprowadzanie genu kwaśnej fosfatazy do gospodarza
Zrekombinowany mikroorganizm przeznaczony do prowadzenia na wysokim poziomie ekspresji aktywności kwaśnej fosfatazy można otrzymać przez wprowadzenie do komórek gospodarza fragmentu DNA, uzyskanego jak opisano powyżej, obejmującego gen kodujący białko posiadające aktywność kwaśnej fosfatazy, po ponownym zrekombinowaniu fragmentu DNA z odpowiednim wektorem. Stosując taką procedurę, prowadzi się ekspresję kwaśnej fosfatazy typu dzikiego przy wykorzystaniu genu kwaśnej fosfatazy typu dzikiego, podczas gdy ekspresję zmutowanej kwaśnej fosfatazy prowadzi się przy wykorzystaniu genu kodującego zmutowaną kwaśną fosfatazę.
Gospodarz obejmuje takie szczepy mikroorganizmów, jak opisane powyżej Escherichia coli HB101, JM 109 i DH5. Poza tymi szczepami, jako gospodarza można wykorzystać każdą bakterię, pod warunkiem, że miejsce początku replikacji skonstruowanego zrekombinowanego DNA i gen kwaśnej fosfatazy spełniająswoje funkcje, zrekombinowany DNA jest zdolny do replikacji i gen kwaśnej fosfatazy jest zdolny do ekspresji. Jednym z najkorzystniejszych gospodarzy jest Escherichia coli JM 109.
Wektor wprowadzania do niego genu kodującego kwaśną fosfatazę nie podlega szczególnym ograniczeniom, pod warunkiem, że jest zdolny do replikacji w gospodarzu. Jeśli jako gospodarza stosuje się Escherichia coli, przykładami wektora mogą być plazmidy ulegające w bakterii autonomicznej replikacji. Można na przykład stosować plazmidy typu ColEl, plazmidy typu pl5A, plazmidy typu czynnika R i plazmidy typu fagowego. Plazmidy takie w szczególności obejmują na przykład, pBR322 (Gene, 2, 95 (1977)), pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)), pUC119 (Methods in Enzymology, 153, 3 (1987)), pACYel84 (J. Bacteriol. 134,1141 (1978)) i pSCIOl (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70, 3240 (1973)).
Jeśli fragment DNA obejmujący gen kodujący kwaśną fosfatazę obejmuje promotor, który jest zdolny do działania w gospodarzu, to fragment DNA można zligować z wektorem w takiej postaci. Jeśli fragment DNA nie obejmuje takiego promotora, w pozycji przed genem można zligować inny promotor, który działa w mikroorganizmie gospodarza, taki jak lac, trp i PL. Nawet jeśli fragment DNA obejmuje promotor, to promotor ten można podstawić innym promotorem dla uzyskania wydajnej ekspresji genu kodującego kwaśną fosfatazę.
Nie występują szczególne ograniczenia metody wprowadzania do gospodarza zrekombinowanego DNA skonstruowanego przez ligację wektora z fragmentem DNA obejmującym gen kodujący kwaśną fosfatazę. Zrekombinowany DNA można wprowadzać do gospodarza stosując zwykłąmetodę. Jeśli jako gospodarza stosuje się Escherichia coli, można stosować na przykład metodę z wykorzystaniem chlorku wapniowego (J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), metodę Hanahana (J. Mol. Biol., 166,557 (1983), metodę SEM (Gene, 96,23 (1990)), metodę Chunga i in., (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 2172 (1989)) i elektroporację (Nucleic AcidsR.es., 16, 6127 (1988)).
Gen kwaśnej fosfatazy można wstawić do DNA wektora zdolnego do autonomicznej replikacji, który można wprowadzić do gospodarza, tak, że gospodarz będzie go posiadał w postaci pozachromosomalnego DNA, jak opisano powyżej. Alternatywnie, gen kwaśnej fosfatazy można wprowadzać do chromosomu mikroorganizmu gospodarza zgodnie z metodą która wykorzystuje transdukcję, ta.mspozon(Biotechnol., 1,417 (1983)), fagaMu (japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 2-109985) lub rekomibnację homologiczną(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)).
< 5 > Ekspresja genu kwaśnej fosfatazy przez zrekombinowany mikroorganizm
Otrzymany w opisany powyżej sposób transformant, do którego wprowadzono zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący kwaśną fosfatazę, jest zdolny do ekspresji aktywności kwaśnej fosfatazy na wysokim poziomie w swoich komórkach, co można osiągnąć przez jego hodowlę w odpowiednim podłożu, zawierającym źródło węgla, źródło azotu, jony nieorganiczne i ewentualnie źródło organicznych substancji odżywczych. Odpowiednie do użycia źródło
183 293 obejmuje, na przykład, cukry, takie jak glukoza, alkohole, takie jak glicerol, i kwasy organiczne. Stosowane źródła azotu obejmują na przykład, amoniak gazowy, wodny roztwór amoniaku i sole amoniowe. Jony nieorganiczne odpowiednie do stosowania, jeśli jest to konieczne, obejmuj ą na przykład, j on magnezowy, j on fosforanowy, j on potasowy, j on żelazowy i j on manganowy. Odpowiednie do stosowania źródło organicznych substancji odżywczych obejmuje, na przykład, witaminy i aminokwasy, jak również źródła zawierające je, takie jak ekstrakt drożdżowy, pepton, ekstrakt mięsny, namok kukurydziany, hydrolizat kazeiny i hydrolizat soi. Poziom ekspresji aktywności kwaśnej fosfatazy można zwiększyć przez dodanie do podłoża zależnego od promotora czynnika indukującego ekspresję, takiego jak IPTG (izopropylo-3-D-tiogalaktopiranozydu).
Warunki hodowli również nie podlegają szczególnym ograniczeniom. Hodowlę można prowadzić, na przykład, w warunkach tlenowych w ciągu około 12 do 48 godzin, utrzymując pH i temperaturę odpowiednio w zakresie pH od 5 do 8 i temperaturę od 25 do 40°C.
Następnie komórki mikroorganizmu zbiera się z hodowli i otrzymuje się ekstrakt wolny od komórek przez ich rozbicie, z którego można oczyścić kwaśną fosfatazę. Oczyszczanie prowadzi się stosując odpowiednie połączenie technik zazwyczaj stosowanych do oczyszczania enzymów, takich jak te opisane w uprzednio przedstawionym punkcie < 1 >. Frakcjonowanie siarczanem amonu, chromatografia jonowymienna, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, chromatografia powinowactwa, chromatografia sączenia molekularnego i oczyszczanie izoelektryczne. Jeśli chodzi o oczyszczanie, nie jest koniecznie nieodzowne całkowite oczyszczenie kwaśnej fosfatazy. Wystarczające jest uzyskanie usunięcia takich zanieczyszczeń, jak enzym uczestniczący w degradacji nukleozydu jako substratu.
< 6 > Wytwarzanie 5'-fosforanowego estru nukleozydu
5'-Fosforanowy ester nukleozydu można wytwarzać w mieszaninie reakcyjnej przez umożliwienie kwaśnej fosfatazie, otrzymanej jak opisano w punkcie < 1 >, lub kwaśnej fosfatazie typu dzikiego bądź zmutowanej kwaśnej fosfatazie otrzymanej w dużej ilości przez ekspresję genu zgodnie z techniką inżynierii genetycznej, jak opisano w punkcie < 5 >, kontaktu i powodowania reakcji nukleozydu z donorem grupy fosforanowej wybranym z grupy składającej się z kwasu polifosforowego i jego soli, kwasu fenylofosforowego i jego soli oraz karbamoilofosforanu i jego soli. W celu uzyskania w tej reakcji wysokiej produktywności, ważne jest doprowadzenie pH roztworu reakcyjnego do lekko kwaśnego w zakresie 3,0 do 5,5.
Jeśli prowadzi się ekspresję genu kodującego kwaśną fosfatazę w dużej ilości stosując techniki inżynierii genetycznej, szczególnie jeśli prowadzi się ekspresję w dużej ilości genu kodującego zmutowaną kwaśną fosfatazę o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy, to możliwe jest wydajne i tanie wytwarzanie 5'-fosforanowego estru nukleozydu przy zastosowaniu hodowli zawierającej komórki mikroorganizmu transformanta, komórek mikroorganizmu oddzielonych i zebranych z hodowli lub produktu otrzymanego z komórek mikroorganizmu uzyskanego, na przykład, przez immobilizację, traktowanie acetonem lub liofilizację, zamiast oczyszczonej kwaśnej fosfatazy.
Stosowane nukleozydy obejmują na przykład, nukleozydy purynowe, takie jak inozyna, guanozyna, adenozyna, ksantozyna, rybonukleozyd purynowy, rybonukleozyd 6-metoksypurynowy, rybonukleozyd 2,6-diaminopurynowy, rybonukleozyd 6-fluoropurynowy, rybonukleozyd 6-tiopurynowy, rybonukleozyd 2-amino-6-tiopurynowy i merkaptoguanozyna; oraz nukleozydy pirymidynowe, takie jakury dyna, cytydyna, 5-aminourydyna, 5-hydroksyurydyna, 5-bromourydyna i 6-azaurydyna. W wyniku reakcji, te nukleozydy typu naturalnego i nukleozydy typu nienaturalnego ulegają specyficznej fosforylacji w ich pozycjach 5' i wytwarzane są odpowiednio odpowiadające 5'-fosforanowe estry nukleozydów.
Pożądane jest dodawanie nukleozydu do roztworu reakcyjnego w stężeniu 1 do 20 g/dl. W przypadku stosowania nukleozydu, który jest słabo rozpuszczalny w wodzie, wydajność reakcji można poprawić przez dodanie kwasu borowego lub środka powierzchniowo czynnego, takiego jak dimetylosulfotlenek.
183 293
Odnośnie stosowanego donora grupy fosforanowej, donory nadające się do stosowaniajak kwas polifosforowy lub jego sole, obejmują na przykład, kwas pirofosforowy, kwas tripolifosforowy, kwas trimetafosforowy, kwas tetrametafosforowy, kwas heksametafosforowy, ich mieszaniny, ich sole sodowe, ich sole potasowe oraz mieszaniny tych soli. Donory nadające się do stosowaniajak kwas fenylofosforowy i jego sole, obejmują na przykład, fenylofosforan disodowy, fenylofosforan dipotasowy, bezwodnik kwasu O,O-difenylofosforowego i ich mieszaniny. Donory nadające się do stosowaniajak karbamoilofosforan lub jego sole, obejmuje, na przykład, karbamoilofosforan disodowy, karbamoilofosforan dipotasowy, karbamoilofosforan diamonowy, karbamoilofosforan dilitowy i ich mieszaniny. Stężenie, w którym stosuje się donor grup fosforanowych, zdeterminowane jest przez stężenie nukleozydujako akceptora grup fosforanowych. Donor grup fosforanowych stosuje się zazwyczaj w ilości 1 do 5 razy ilości nukleozydu.
Korzystny wynik otrzymuje się w reakcji zazwyczaj w temperaturze 20 do 60°C, korzystnie 30 do 40°C, w pH lekko kwaśnym 3,5 do 6,5, korzystnie 4,0 do 5,0. Reakcję można prowadzić stosując którąkolwiek z metod stacjonarnych i metod wytrząsania. Czas reakcji zależy od takich warunków, jak aktywność stosowanego enzymu i stężenie substratu, jest to jednakże od 1 do 100 godzin.
Tak wytworzony 5'-fosforanowy ester nukleozydu można zbierać i wydzielać z mieszaniny po zakończeniu reakcji wykorzystując metody stosowania syntetycznej żywicy do adsorpcji, metody stosowania czynnika wytrącającego oraz inne zwykle metody zbierania i wydzielania.
Krótki opis rysunków
Figura 1 przedstawia zależność pomiędzy pH roztworu reakcyjnego i wytwarzaną ilością kwasu 5'-inozynowcgo w reakcji przeprowadzonej przy użyciu enzymu pochodzącego z Morganella morganii.
Figura 2 przedstawia zależność pomiędzy pH roztworu reakcyjnego i wytwarzaną ilością kwasu 5'-inozynowego w reakcji przeprowadzonej przy użyciu enzymu pochodzącego z Escherichia blattae.
Figura 3 przedstawia mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne we fragmencie chromosomalnego DNA Morganella morganii obejmującego gen kodujący kwaśną fosfatazę.
Figura 4 przedstawia ilość kwasu 5'-inozynowego wytwarzanego w reakcji przeprowadzonej przy użyciu szczepu zawierającego gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii.
Figura 5 przedstawia ilość kwasu 5'-inozynowego wytwarzanego w reakcjach przeprowadzonych przy użyciu odpowiednio szczepu zawierającego gen kwaśnej fosfatazy typu dzikiego i szczepu zawierającego gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy pochodzącej zMorganella morganii.
Figura 6 przedstawia mapę miej sc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyj ne we fragmencie chromosomalnego DNA Escherichia blattae obejmującego gen kodujący kwaśną fosfatazę.
Figura 7 przedstawia diagram ilustrujący ilość kwasu 5'-inozynowego wytwarzanąw reakcji przeprowadzonej przy użyciu szczepu zwierającego gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae.
Figura 8 przedstawia ilość kwasu 5'-inozynowego wytwarzanąw reakcjach przeprowadzonych przy użyciu odpowiednio szczepu zawierającego gen kwaśnej fosfatazy typu dzikiego i szczepu zawierającego gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy pochodzącej zEscherichia blattae.
Figura 9 przedstawia mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne we fragmencie chromosomalnego DNA Enterobacter aerogenes obejmującego gen kodujący kwaśną fosfatazę.
Figura 10 przedstawia mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne we fragmencie chromosomalnego DNA Klebsiellaplanticola obejmującego gen kodujący kwaśną fosfatazę.
Figura 11 przedstawia mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne we fragmencie chromosomalnego DNA Serratiaficaria obejmującego gen kodujący kwaśną fosfatazę.
183 293
Figura 12 przedstawia w jednoliterowym kodzie sekwencje aminokwasowe, przewidziane na podstawie sekwencji nukloetydowych, kwaśnych fosfataz pochodzących z Morganella morgami, Escherichia blattae, Providencia stuartii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella planticola i Serratia ficaria.
Opis korzystnych rozwiązań
Niniejszy wynalazek zostanie poniżej szczegółowo wyjaśniony w odniesieniu do przykładów, jednakże, niniejszy wynalazek nie ogranicza się do tych przykładów.
Aktywność transfosforylacyjną mierzono w poniższych warunkach, jako substrat stosując inozynę. Reakcję prowadzi się w pH 5,0 w temperaturze 30°C w ciągu 10 minut w roztworze reakcyjnym (1 ml) zawierającym 40 pmoli/ml inozyny, 100 pmoli/ml pirofosforanu sodowego, 100 pmoli/ml buforu octanu sodowego (pH 5,0) oraz enzym. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 200 μΐ 2 N kwasu solnego. Następnie osady usuwano przez wirowanie. Później ilościowo mierzono kwas 5'-inozynowy wytworzony w reakcji transfosforylacji. Ilość enzymu wytwarzającą w tych standardowych warunkach reakcji 1 pmol kwasu 5'-inozynowego na minutę zdefiniowano jako 1 jednostkę.
Aktywność fosfomonoesterazy mierzono w poniższych warunkach, jako substrat stosując kwas 5'-inozynowy. Reakcję prowadzono w temperaturze 30°C wciągu 10 minut w roztworze reakcyjnym (1 ml) zawierającym 10 pmoli/ml kwasu 5'-inozynowego, 100 pmoli/ml buforu MES/NAOH (pH 6,0) oraz enzym. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 200 pl 2 N kwasu solnego. Następnie osady usuwano przez wirowanie. Później ilościowo mierzono inozynę wytworzoną w reakcji hydrolizy. Ilość enzymu wytwrzającą w tych standardowych warunkach reakcji 1 pmol inozyny na minutę zdefiniowano jako 1 jednostkę.
Inozynę i kwas 5-inozynowy analizowano w poniższych warunkach metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
Kolumna: Cosmosil 5C18-AR (4,6 x 150 mm) [produkowana przez nacalai tesąue];
Faza ruchoma: 5 mM bufor fosforanów potasowych (pH 2,8/metanol = 95/5);
Szybkość przepływu: l,0ml/min;
Temperatura: temperatura pokojowa;
Detekcja: UV przy długości fali 245 nm.
Nawiasem mówiąc, w reakcji wytwarzania 5'-fosforanowych estrów nukleozydów z zastosowaniem jako surowców nukleozydów innych niż inozyna, nukleozydy jako surowce i wytwarzane 5'-fosforanowe estry nukleozydów analizuje się przez HPLC w opisany powyżej sposób.
Przykład 1. Oczyszczanie i charakterystyka kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii
Podłoże odżywcze (pH 7,0, 50 ml), zawierające 1 g/dl peptonu, 0,5 g/dl ekstraktu drożdżowego i 1 g/dl chlorku sodowego, wlewano do kolb Sakaguchi (500 ml), które wyjaławiano w temperaturze 120°C w ciągu 20 minut. Każdąz kolb zaszczepiono zapomocąplatynowej ezy wyhodowaną na skosie Morganella morganii NCIMB 10466, którąhodowano w temperaturze 3 0°C w ciągu 16 godzin z wytrząsaniem. Komórki mikroorganizmu (około 3 000 g), które zbierano z hodowli przez wirowanie, zawieszano w 100 mM buforze fosforanów potasowych (1 litr, pH 7,0). W celu rozbicia komórek prowadzono traktowanie ultradźwiękami w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowaną zawiesinę wirowano w celu usunięcia frakcji nierozpuszczalnej. W ten sposób przygotowywano ekstrakt wolny od komórek.
Do wolnego od komórek ekstraktu dodawano siarczan amonowy do uzyskania 30% nasycenia. Pojawiający się osad usuwano przez wirowanie, a następnie dalej dodawano sirczanu amonowego do uzyskania 60% nasycenia. Pojawiający się osad zbierano przez wirowanie i rozpuszczano go w 100 mM buforze fosforanów potasowych.
Ten roztwór nieoczyszczonego enzymu dializowano cztery razy wobec 5 litrów 100 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0), a następnie nakładano go na kolumnę DEAE-Toyopeal 650M (φ 4,1 x 22 cm) zrównoważoną 20 mM buforem fosforanów potasowych (pH 7,0), a następnie przemywano 800 ml 20 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0). Aktywność
183 293 transforylacji stwierdzano we frakcji, która przechodziła przez kolumnę i w ten sposób frakcję odzyskiwano.
Do frakcji dodawano siarczanu amonowego do uzyskania 35% nasycenia i adsorbowano na kolumnie Butyl-Toyopeal (φ 3,1 x 26 cm) zrównoważoną20 mM buforem fosforanów potasowych (pH 7,0) zawierającym siarczan amonowy o 35% nasyceniu. Elucję prowadzono stosując liniowy gradient stężenia od 35% nasycenia do 20% nasycenia w buforze fosforanów potasowych (pH 7,0).
Aktywne frakcje zbierano i dializowano wobec 1 litra 50 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0), a następnie nakładano na kolumnę z hydroksyapatytem (φ 5 x 6,5 cm) zrównoważoną 50 mM buforem fosforanów potasowych (pH 7,0). Elucję prowadzono stosując liniowy gradient stężenia od 50 mM do 300 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0).
Aktywne frakcje zbierano i zatężano przez ultrafiltrację. Ten roztwór enzymu nakładano na kolumnę HiLoad TM 16/60 Superdex 200 (produkowanąprzez Pharmacia). Elucję prowadzono z szybkością przepływu 1,0 ml/minutę stosując 50 mM bufor fosforanów potasowych zawierający 100 mM chlorek sodowy.
Zgodnie z opisaną powyżej procedurą enzym wykazujący aktywność transfosforylacji oczyszczono w konsekwencji z wolnego od komórek ekstraktu około 550-krotnie przy stosunku odzyskania około 10%. Aktywność właściwąi stosunek odzyskania dla tego procesu oczyszczania przedstawiono w tabeli 1. Ta próbka enzymu była homogenna w elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z SDS.
Tabela 1
Etap odzyskiwania | Aktywność całkowita (jednostki) | Białko całkowite (mg) | Aktywność właściwa (jednostki/mg) | Stosunek (%) |
1. Wolny od komórek ekstrakt | 597 | 127 200 | 0,005 | 100 |
2. Frakcjonowanie siarczanem | 568 | 122 210 | 0,005 | 95 |
amonu (30 do 60%) | ||||
3. DEAE-Toyopearl | 517 | 36 498 | 0,014 | 87 |
4. Butyl-Toypearl | 394 | 1 121 | 0,351 | 66 |
5. Hydroksy apatyt | 112 | 50 | 2,244 | 19 |
6. Superdex 200 | 63 | 24 | 2,630 | 10 |
Oczyszczony enzym posiada następujące właściwości.
(1) Działanie: Grupa fosforanowa ulega przeniesieniu z donora grup fsoforanowych, takiego jak kwas polifosforowy, na nukleozyd, i tworzony jest 5'-fosforanowy ester nukleozydu. Enzym ten wykazuje również aktywność odwrotną hydrolizowania estru fosforanowego.
(2) Specyficzność substratowa: Związki służące jako donory grup fosforanowych w reakcji transfosforylacji obejmują na przykład, kwas pirofosforowy, kwas tripolifosforowy, kwas trimetafosforowy, kwas tetrametafosforowy, kwas heksametafosforowy, fenylofosforan disodowy, fenylofosforan dipotasowy, bezwodnik kwasu Ο,Ο-difenylofosforowego, karbamoilofosforan disodowy, karbamoilofosforan dipotasowy, karbamoilofosforan diamonowy i karbamoilofosforan dilitowy. Związki służące jako akceptory grup fosforanowych obejmują na przykład, rybonukleozyd purynowy, inozynę, guanozynę, adenozynę, ksantozynę, urydynę i cytydynę. Z drugiej strony, związki podlegające działaniu w reakcji hydrolizy estru fosforanowego obejmują na przykład, nieorganiczny kwas fosforowy, taki j ak kwas pirofosforowy, kwas tripolifosforowy, kwas trimetafosforowy, kwas tetrametafosforowy, kwas heksametafosforowy; ester fosforanowy, taki jak fenylofosforan disodowy, fenylofosforan dipotasowy, bezwodnik kwasu Ο,Ο-difenylofosforowego, karbamoilofosforan disodowy, karbamoilofosforan dipotasowy, karbamoilofosforan diamonowy i karbamoilofosforan dilitowy; oraz 5'-nukleotyd, taki jak rybonukleotyd 5'-purynowy, wkas 5'-inozynowy, kwas 5'-guanylowy, kwas 5'-adenylowy, kwas 5'-ksantylinowy, kwas 5'-urydylowy i kwas 5'-cytydylowy.
183 293 (3) Optimum pH: 5,2 (reakcja transfosforylacji), 6,5 (reakcja hydrolizy estru fosforanowego).
(4) Stabilność w pH: pH 3,0 do 12,0 (traktowanie w temperaturze 30°C wciągu 60 minut) (5) Optimum temperaturowe: około 35°C.
(6) Stabilność temperaturowa: stabilny do temperatury 30°C (traktowanie w pH 7,0 w ciągu 30 minut).
(7) Wpływ dodania jonu metalu i inhibitora: Enzym ten nie wykazuje zjawiska aktywacji swojej aktywności pod wpływem dodania żądanego jonu metalu. Aktywność hamują Ag2+, Pb2+, Hg2+ i Cu2+. Aktywność hamuje także kwas jodooctowy.
(8) Masa cząsteczkowa: Obliczona masa cząsteczkowa według wysokosprawnej chromatografii cieczowej (TSKgel G-3000SW, produkowana przez Toyo Soda) wynosi około 190 000.
(9) Masa cząsteczkowa podjednostki: Obliczona masa cząsteczkowa według elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z SDS wynosi około 25 000.
Enzym ten wykazuje nie tylko aktywność przenoszenia grupy fosforanowej na nukleozyd, ale także przeciwną aktywność hydrolizowania estru fosforanowego. Ponadto, enzym ten wykazuje aktywność hydrolizowania estrów fosforanowych (aktywność fosfomonoesterazy), która jest wyższa od aktywności transfosforylacji nie mniej niż 20-krotnie. Inne właściwości są zgodne z właściwościami znanej kwaśnej fosfatazy wytwarzanej przez bakterię należącą do rodzaju Morganella (Microbiology, 140, 1341-1350 (1994)). A zatem wykazano, że enzym ten jest kwaśną fosfatazą.
Pirofosforan sodowy (10 g/dl) i inozynę (2 g/dl) rozpuszczono w buforach octanu sodowego posiadających pH 5,5, 5,0, 4,5, 4,0 i 3,5, do których dodano próbki opisanego powyżej enzymu, tak że otrzymano stężenie 50 jednostek/dl. Mieszaninę reakcyjnąinkubowano w temperaturze 30°C wciągu 6 godzin utrzymując każde pH, i ilość wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego mierzono w miarę upływu czasu. Wytwarzany kwas inozynowy zawierał tylko kwas 5'-inozynowy. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania kwasu 2'-inozynowego i kwasu 3'-inozynowego. Wynik przedstawiono na fig. 1. Szybkość wytwarzania kwasu 5'-inozynowego była największa w pH 5,0. Jednakże, maksymalna akumulowana ilość kwasu 5'-inozynowego była wyższa w niższych pH. Warunki reakcji w pH 4,0 były najbardziej wydajne pod względem wytwarzania kwasu 5'-inozynowego, w warunkach tych kwas 5'-inozynowy był wytwarzany i akumulowany w ilości 2,60 g/dl po prowadzeniu reakcji w ciągu 3 godzin.
Przykład2. Reakcja fosfory lacj i różnych nukleozydów przez próbkę kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morgami
Pirofosforan sodowy (10 g/dl) i inozynę, guanozynę, urydynę lub cytydynę (2 g/dl) jako akceptory grup fosforanowych rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich próbki enzymu przygotowanego w przykładzie 1, tak że stężenie wynosiło 50 jednostek/dl. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 3 godzin utrzymując pH 4,0. Ilość wytwarzanych w reakcji 5'-fosforanowych estrów nukleozydów przedstawiono w tabeli 2.
Wytwarzany nukleotyd zawierał tylko ester 5'-nukloezydowy. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania estru 2'-nukleozydowego i estru 3'-nukleozydowego.
Tabela 2
Nukleozyd | Produkt | Wytwarzana ilość (g/dl) |
Inozyna | kwas 5'-inozynowy | 2,60 |
Guanozyna | kwas 5'-guanylowy | 1,90 |
Urydyna | kwas 5'-urydylowy | 1,30 |
Cytydyna | kwas 5'-cytydylowy | 0,98 |
Przykład 3. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z różnych związków fosforanowych jako donorów grup fosforanowych przez próbkę kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii
Inozynę (2 g/dl) itripolifosforan sodowy, polifosforan sodowy (nazwa fabryczna: PolygonP, produkowany przez Chiyoda Chemical), fenylofosforan disodowy lub karbamoilofosforan
183 293 disodowy (10 g/dl) jako donory grup fosforanowych rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich próbki enzymu przygotowanego w przykładzie 1, tak że stężenie wynosiło 50 jednostek/dl. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 3 godzin utrzymując pH 4,0. Ilość wytwarzanego w reakcji kwasu 5'-inozynowego przedstawiono w tabeli 3.
Kwas 5'-inozynowy był wydajnie wytwarzany i akumulowany przy wykorzystaniu każdego z donorów grup fosforanowych. Jednakże, akumulacja kwasu 5'-inozynowego była najwyższa, gdy jako donor grup fosforanowych stosowano polifosforan sodowy.
Tabela 3
Donor grup fosforanowych | Wytwarzany kwas 5'-inozynowy (g/dl) |
Tripolifosforan sodowy | 2,10 |
Polifosforan sodowy | 2,72 |
Fenylofosforan disodowy | 2,33 |
Karbamoilofosforan disodowy | 2,54 |
Przykład4. Oczyszczanie i charakterystyka kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae
Podłoże odżywcze (pH 7,0, 50 ml), zawierające 1 g/dl peptonu, 0,5 g/dl ekstraktu drożdżowego i 1 g/dl chlorku sodowego, wlewano do kolb Sakaguchi (500 ml), które wyjaławiano w temperaturze 120°C w ciągu 20 minut. Każdąz kolb zaszczepiono za pomocąplatynowej ezy wyhodowaną na skosie Escherichia blattae JCM 1650, którą hodowano w temperaturze 30°C wciągu 16 godzin z wytrząsaniem. Komórki mikroorganizmu zbierano z hodowli przez wirowanie. Komórki mikroorganizmu (około 3 300 g) zawieszano w 100 mM buforze fosforanów potasowych (1 litr, pH 7,0). W celu rozbicia komórek mikroorganizmu prowadzono traktowanie ultradźwiękami w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowanązawiesinę wirowano w celu usunięcia frakcji nierozpuszczalnej. W ten sposób przygotowywano ekstrakt wolny od komórek.
Do wolnego od komórek ekstraktu dodawano siarczan amonowy do uzyskania 30% nasycenia. Pojawiający się osad usuwano przez wirowanie, a następnie dalej dodawano siarczanu amonowego do uzyskania 60% nasycenia. Pojawiający się osad zbierano przez wirowanie i rozpuszczano go 100 mM buforze fosforanów potasowych.
Ten roztwór nieoczyszczonego enzymu dializowano cztery razy wobec 5 litrów 100 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0), a następnie nakładano go na kolumnę DEAE-Toyopeal 65 OM (φ 6,2 x 35 cm) zrównoważoną20 mM buforem fosforanów potasowych (pH 7,0) a następnie przemywano 20 mM bufoerm fosforanów potasowych (pH 7,0). Aktywność transforylacji stwierdzono we frakcji, która przechodziła przez kolumnę i w ten sposób frakcję zbierano.
Do aktywnej frakcji dodawano siarczanu amonowego do uzyskania 35% nasycenia i adsorbowano na kolumnie Butyl-Toyopeal (φ 5,0 x 22,5 cm) zrównoażoną20 mM buforem fosforanów potasowych (pH 7,0) zawierającym siarczan amonowy o 35% nasyceniu. Elucję prowadzono stosując liniowy gradient stężenia od 35% nasycenia do 20% nasycenia w buforze fosforanów potasowych (pH 7,0).
Aktywne frakcje zbierano i dializowano wobec 1 litra 100 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0), a następnie nakładano na kolumnę z hydroksyapatytem (φ 3,0 x 7,0 cm) zrównoważoną 100 mM buforem fosforanów potasowych (pH 7,0). Elucję prowadzono stosując liniowy gradient stężenia od 50 mM do 100 mM buforu fosforanów potasowych (pH 7,0) i zbierano aktywne frakcje.
Ten roztwór enzymu dializowano wobec 1 litra 10 mM buforu fosforanów potasowych (pH 6,0), a następnie nakładano na kolumnę CM-Toyopearl (φ 2,0x14 cm) zrównoważoną 10 mM buforem fosforanów potasowych (pH 6,0). Elucję prowadzono stosując liniowy gradient stę
183 293 żenią od 0 mM do 300 mM chlorku potasowego w buforze fosforanów potasowych (pH 6,0). Aktywne frakcje wyeluowano z kolumny i zebrano.
Zgodnie z opisaną powyżej procedurą, enzym wykazujący aktywność transfosforylacji oczyszczano w konsekwencji z wolnego od komórek ekstraktu około 600-krotnie przy stosunku odzyskania około 16%. Aktywność właściwą i stosunek odzyskania dla tego procesu oczyszczania przedstawiono w tabeli 4. Ta próbka enzymu była homogenna w elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z SDS.
Tabela 4
Etap | Aktywność całkowita (jednostki) | Białko całkowite (mg) | Aktywność właściwa (jednostki/mg) | Stosunek odzyskania (%) |
1. Wolny od komórek ekstrakt | 365 | 160 650 | 0,002 | 100 |
2. Frakcjonowanie siarczanem amonu (30 do 60%) | 340 | 138 895 | 0,002 | 93 |
3. DEAE-Toyopearl | 318 | 30 440 | 0,010 | 87 |
4. Butyl-Toyopearl | 232 | 661 | 0,347 | 63 |
5. Hydroksyapatyt | 96 | 96 | 1,000 | 26 |
6. CM-Toyopearl | 59 | 43 | 1,365 | 16 |
Oczyszczony enzym posiada następujące właściwości.
(1) Działanie: Grupa fosforanowa ulega przeniesieniu z donora grup fosforanowych, takiego jak kwas polifosforowy, na nukleozyd, i tworzony jest 5'-fosforanowy ester nukleozydu. Enzym ten wykazuje również aktywność odwrotną, hydrolizowania estru fosforanowego.
(2) Specyficzność substratowa: Związki służące jako donory grup fosforanowych w reakcji transfosforylacji obejmują, na przykład, kwas pirofosforowy, kwas tripolifosforowy, kwas trimetafo sforo wy, kwas tetrametafosforowy, kwas heksametafosforowy, fenyl ofosforan disodowy, fenylofosforan dipotasowy, bezwodnik kwasu Ο,Ο-difenylofosforowego, karbamoilofosforan disodowy, karbamoilofosforan dipotasowy, karbamoilofosforan diamonowy i karbamoilofosforan dilitowy. Związki służące jako akceptory grup fosforanowych obejmują, na przykład, rybonukleozyd purynowy, inozynę, guanozynę, adenozynę, ksantozynę, urydynę i cytydynę. Z drugiej strony, związki podlegające działaniu w reakcji hydrolizy estru fosforanowego obejmują na przykład, nieorganiczny kwas fosforowy, taki jak kwas pirofosforowy, kwas tripolifosforowy, kwas trimetafosforowy, kwas tetrametafosforowy, kwas heksametafosforowy; ester fosforanowy, taki jak fenylofosforan disodowy, fenylofosforan dipotasowy, bezwodnik kwasu Ο,Ο-difenylofosforowego, karbamoilofosforan disodowy, karbamoilofosforan dipotasowy, karbamoilofosforan diamonowy i karbamoilofosforan dilitowy; oraz 5'-nukloetyd, taki jak rybonukleotyd 5'-purynowy, kwas 5'-inozynowy, kwas 5'-guanylowy, kwas 5'-adenylowy, kwas 5'-ksantylinowy, kwas 5'-urydylowy i kwas 5'-cytydylowy.
(3) Optimum pH: 5,2 (reakcja transfosforylacji), 6,5 (reakcja hydrolizy estru fosforanowego).
(4) Stabilność w pH: pH 3,5 do 12,0 (traktowanie w temperaturze 30°C w ciągu 60 minut).
(5) Optimum temperaturowe: około 35°C.
(6) Stabilność temperaturowa: stabilna do temperatury 40°C (traktowanie w pH 7,0 w ciągu 30 minut).
(7) Wpływ dodania jonu metalu i inhibitora: Enzym ten nie wykazuje zjawiska akty wacj i swojej aktywności pod wpływem dodania żadnego jonu metalu. Aktywność hamują Fe2+, Ag2+, Pb2+, Hg2+ i Cu2+. Aktywność hamuje także kwas jodooctowy.
(8) Masa cząsteczkowa: Obliczona masa cząsteczkowa według wysokosprawnej chromatografii cieczowej (TSKgel G-3000SW, produkowana przezToyo Soda) wynosi około 188 000.
(9) Masa cząsteczkowa podjednostki: Obliczona masa cząsteczkowa według elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z SDS wynosi około 24 500.
183 293
Enzym ten wykazuje nie tylko aktywność przenoszenia grupy fosforanowej na nukleozyd, ale także aktywność odwrotną, hydrolizowania estru fosforanowego, tak samo, jak enzym oczyszczony z wolnego od komórek ekstraktu Morganella morganii NCIMB 10466. Ponadto, enzym ten wykazuje aktywność hydrolizowania estrów fosforanowych (aktywność fosfomonoesterazy), która jest wyższa od aktywności transfosforylacji nie mniej niż 30-krotnie. A zatem, wykazano, że enzym ten jest kwaśną fosfatazą.
Pirofosforan sodowy (15 g/dl) i inozynę (3 g/dl) rozpuszczono w buforach octanu sodowego posiadających pH 5,5, 5,0, 4,5, 4,0 i 3,5, do których dodano próbki opisanego powyżej enzymu, tak że otrzymano stężenie 50 jednostek/dl. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 6 godzin utrzymując każde pH, i ilość wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego mierzono w miarę upływu czasu. Wytwarzany kwas inozynowy zawierał tylko kwas 5'-inozynowy. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania kwasu 2'-inozynowego i kwasu 3'-inozynowego. Wynik przedstawiono na fig. 2. Szybkość wytwarzania kwasu 5'-inozynowego była największa wpH 5,0. Jednakże, maksymalna akumulowana ilość kwasu 5'-inozynowego była wyższa w niższych pH. Warunki reakcji w pH 4,0 były najbardziej wydajne pod względem wytwarzania kwasu 5'-inozynowego. Kwas 5'-inozynowy był wytwarzany i akumulowany w ilości 1,56 g/dl po prowadzeniu rekacji w pH 4 wciągu 3 godzin.
Przykład 5. Reakcj a fosforylacj i różnych nukleozydów przez próbkę kwaśnej fosfatazy pochodzącej w Escherichia blattae
Pirofosforan sodowy (15 g/dl) i inozynę, guanozynę, urydynę lub cytydynę (3 g/dl) rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich próbki enzymu przygotowanego w przykładzie 4, tak że stężenie wynosiło 50 jednostek/dl. Mieszaninę reakcyjnąinkubowano w temperaturze 35°C w ciągu 3 godzin utrzymując pH 4,0. Ilość wytwarzanych w reakcji estru 5'-nukleozydowego przedstawiono w tabeli 5.
Wytwarzany nukleotyd zawierał tylko ester 5'-nukleozydowy. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania estru 2'-nukleozydowego i estru 3'-nukleozydowego.
Tabela 5
Nukleozyd | Produkt | Wytwarzana ilość (g/dl) |
Inozyna | kwas 5'-inozynowy | 1,56 |
Guanozyna | kwas 5'-guanylowy | 1,05 |
Urydyna | kwas 5'-urydylowy | 1,87 |
Cytydyna | kwas 5'-cytydylowy | 1,22 |
Przykład 6. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z różnych związków fosforanowych jako donorów grup fosforanowych przez próbkę kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae
Inozynę (2 g/dl) i tripolifosforan sodowy, polifosforan sodowy (nazwa fabryczna: Poły gon P, produkowany przez Chiyoda Chemical), fenylofosforan disodowy lub karbamoilofosforan disodowy (10 g/dl) jako donory grup fosforanowych rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich próbki enzymu przygotowanego w przykładzie 4, tak, że stężenie wynosiło 50 jednostek/dl. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 35°C w ciągu 3 godzin utrzymując pH 4,0. Ilość wytwarzanego w reakcji kwasu 5'-inozynowego przedstawiono w tabeli 6.
Kwas 5'-inozynowy był wydajnie wytwarzany i akumulowany przy wykorzystaniu każdego z donorów grup fosforanowych. Jednakże, akumulacja kwasu 5'-inozynowego była najwyższa, gdy jako donor grup fosforanowych stosowano polifosforan sodowy.
183 293
Tabela 6
Donor grup fosforanowych | Wytwarzany kwas 5'-inozynowy (g/dl) |
Tripolifosforan sodowy | 1,20 |
Polifosforan sodowy | 1,79 |
Fenylofosforan disodowy | 1,50 |
Karbamoilofosforan disodowy | ____________________143 |
Przykład 7. Izolowanie genu kodującego kwaśną fosfatazą z chromosomu Morganella morganii (1) Określanie N-końcowej sekwencji aminokwasowej
Kwaśną fosfatazę oczyszczoną z wolnego od komórek ekstraktu Morganella morganii NCIMB 10466 zgodnie z metodą opisaną w przykładzie 1 zaadsorbowano na membranie DITC (produkowanej przez Milligen/Biosearch) i jej N-końcowąsekwencję aminokwasową określono przy użyciu Proseąuencer 6625 (produkowanego przez Milligen/Biosearch). Określono N-końcową sekwencję aminokwasową obejmującą 20 reszt przedstawioną w sekwencji o numerze indentyfikacyjnym: 1 w Liście Sekwencji.
(2) Izolowanie fragmentu DNA obejmującego gen kodujący kwaśną fosfatazę
Z namnożonych komórek mikroorganizmu Morganella morgami NCIMB 10466 wyekstrahowano chromosomalny DNA według metody Murraya i Thomsona (Nuci. Acid Res., 4321, 8 (1980)). Chromosomalny DNA częściowo zdegradowano enzymem restrykcyjnym SauIIIAI. Następnie fragmenty DNA o długości 3-6 kbp frakcjonowano poprzez wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy. Wektor plazmidowy pUCl 18 (produkowany przez Takara Shuzo) strawiono enzymem restrykcyjnym ZLuwHI i zligowano z nim fragmenty częściowo zdegradowanego chromosomalnego DNA. Ligację DNA przeprowadzono stosując zestaw do ligacji DNA (produkowany przez Takara Shuzo) zgodnie ze wskazaną metodą. Następnie otrzymaną mieszaniną DNA stransformowano, zgodnie ze zwykłą metodą Escherichia coli JM 109 (produkowaną przez Takara Shuzo). Transformanty wysiano na podłoże agarowe L zawierające 100 pg/ml ampicyliny i hodowano je w celu przygotowania biblioteki genowej.
Na powierzchnię podłoża agarowego, na którym hodowano transformanty wylano roztwór reakcyjny zawierający 4 mM kwas p-nitrofenylofosforowy i 100 mM bufor MES/NaOH (pH 6,5) i utrzymywano temperaturę 30°C w ciągu 15 minut. Szczepy, w których zachodziła ekspresja aktywności fosfatazy uwalniały p-nitro fenol i wykazywały żółtą barwę. A zatem, transformanty selekcjonowano wykorzystując jako wskaźnik to zjawisko. W wyniku przeszukania ekspresyjnej biblioteki genowej, obejmującej około 20 000 szczepów transformantów, otrzymano 30 szczepów transformantów, w których zachodziła ekspresja aktywności fosfatazy.
Transformanty (30 szczepów), w których zachodziła ekspresja aktywności fosfatazy, poddano izolowaniu pojedynczych kolonii. Pojedynczymi koloniami zaszczepiano podłoże L (2,5 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i hodowano je w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin. Do zebranych z hodowli komórek mikroorganizmu dodawano bufor octanu sodowego (100 mM, pH 5,0, 50 μΐ) zawierający inozynę (2 g/dl) i pirofosforan sodowy (10 g/dl) i mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 16 godzin. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego wykrywano przez analizę HPLC dla wyselekcjonowania szczepów mikroorganizmu wykazujących aktywność transfosforylacji. W wyniku, udało nam się uzyskać 5 szczepów transformantów, które wykazywały aktywność transfosforylacji dla których założono, że zawierają fragment DNA obejmujący stanowiący przedmiot wynalazku gen kwaśnej fosfatazy.
Przykład 8. Określane sekwencji nukleotydowej genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii NCIMB 10466
Wstawiony fragment DNA analizowano przez przygotowywanie plazmidu zgodnie z metodą lizy alkalicznej (Molecular Cloning, wyd. 2 (J. Sambrook, E.F. Fritsch i T. Maniatis, Cold Spring Harbor laboratory Press, pl. 25 (1989)) z jednego z otrzymanych w przykładzie 7 szczepów transformantów, dla których założono, że zawierają fragment DNA obejmujący gen kwaś
183 293 nej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii NCIMB 10466. Plazmid ten oznaczono pMPI501. Figury 3 przedstawia określoną mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne we wstawionym fragmencie DNA.
Region genu kwaśnej fosfatazy dokładniej określano przez subklonowanie. Wynik sugerował, że ten gen kwaśnej fosfatazy zawarty był we fragmencie o wielkości 1,2 kbp, wyciętym enzymami restrykcyjnymi Hind[\\ i EcoRL A zatem, w celu określenia sekwencji aminokwasowej skonstruowano plazmidowy DNA, w którym zligowano fragment o długości 1,2 kbp z pUC 118 strawionym HindTi i Eco RI. Tym plazmidowym DNA, oznaczonym pMPI505, zgodnie ze zwykłą metodą stransformowano Escherichia coli JM109 (produkowaną przez Takara Shuzo), którą dla otrzymania transformanta wysiano na podłoże agarowe L zawierające 100 pg/ml ampicyliny.
Dla określenia sekwencji nukleotydowej, z transformanta Escherichia coli JM 109 (produkowanej przez Takara Shuzo) zawierającego pMPI505 wyekstrahowano plazmid zgodnie z metodą lizy alkalicznej. Sekwencję nukleotydową określono zgodnie z metodą Sangera (J. Mol. Biol. 143,161 (1980)) stosując zestaw do sekwencjonowania Taq DyeDeoxy Terminator Cycle (produkowany przez Applied Biochemical). Sekwencję nukleotydową określonej otwartej ramki odczytu przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 w Liście Sekwencji. Sekwencję aminokwasową białka, prze widzianą na podstawie sekwencji nukleoty do wej, przedstawiono w sekwencji o numerze identyfiakcyjnym: 3 w Liście Sekwencji. W sekwencji aminokwasowej stwierdzono częściowąsekwencję całkowicie zgodnązN-końcowąsekwencjąaminokwasową oczyszczonego enzymu. Koniec N oczyszczonego enzymu rozpoczyna się resztą alaniny w pozycji 21 sekwencji przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3. A zatem, zakłada się, że sekwencja aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3 jest sekwencją białka prekursorowego, i że peptyd obejmujący odcinek od reszty metioniny w pozycji 1 do reszty alaniny w pozycji 20 jest usuwany po translacji. Tak przewidzianą sekwencję aminokwasową dojrzałego białka przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 w Liście Sekwencji. Masę cząsteczkową dojrzałego białka obliczono na podstawie sekwencji aminokwasowej na 24,9 kilodaltonów, co wykazuje dobrą zgodność z wynikiem SDS-PAGE oczyszczonego enzymu. Zgodnie z opisanymi powyżej wynikami, i z powodu faktu, że transformant zawierający plazmid obejmujący ten fragment wykazywał aktywność transfosforylacji, stwierdzono, że ta otwarta ramka odczytu była regionem kodującym stanowiącą przedmiot wynalazku kwaśną fosfatazę.
Sekwencję nukleotydowąi sekwencję aminokwasowąporównano odpowiednio ze znanymi sekwencjami w poszukiwaniu homologii. Wykorzystano bazy danych EMBL i SWISSPROT. W wyniku ujawniono, że sekwencja nukloetydowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 w Liście Sekwencji zgodna jest ze znaną sekwencją nukleotydową genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii (Thaller, M. C. i in., Microbiology, 140, 1341 (1994)), z tym wyjątkiem, że w tej ostatniej G w pozycji 54 jest A, G w pozycji 72 jest A, T w pozycji 276 jest G, T w pozycji 378 jest C, G w pozycji 420 jest T, C w pozycji 525 jest G, C w pozycji 529jest T, a G w pozycji 531 jest A, oraz że sekwencja aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 w Liście Sekwencji jest taka sama, jak sekwencja genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii. Mianowicie, gen który koduje białko posiadające sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 w Liście Sekwencji, jest genem kwaśnej fosfatazy Morganella morganiiNCIMB 10466.
Białko prekursorowe obejmuje 249 aminokwasów, a jego masa cząsteczkowa przewidziana na podstawie sekwencji wynosi 27,0 kilodaltonów.
Szczep Escherichia coli stransformowany plazmidem pMPI505 oznaczono AJ13143 i zdeponowano w depozycie międzynarodowym 23 lutego 1996 r. w National Institute of Bioscience and Humań Technology of Agency Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (kod pocztowy: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japonia) na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego i nadano mu numer depozytowy FERM BP-5422.
183 293
Przykład 9. Wzmacnianie aktywności przez ekspresję genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii NCIMB 10466
Skonstruowaną w przykładzie 8 Escherichia coli JM109/pMPI505 zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG i hodowano ją w temperaturze 27°C w ciągu 16 godzin. Komórki mikroorganizmu zebrano z hodowli przez wirowanie i przemyto je raz solą fizjologiczną. Komórki mikroorganizmu zawieszono w 100 mM buforze fosforanów potasowych (5 ml, pH 7,2) i rozbito je poprzez działanie ultradźwiękami prowadzone w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowany roztwór odwirowano dla usunięcia frakcji nierozpuszczalnej i tak przygotowano ekstrakt wolny od komórek.
Aktywność transfosforyłacji otrzymanego ekstraktu wolnego od komórek mierzono jako kontrolę stosując wolne od komórek ekstrakty przygotowane ze szczepu typu dzikiego Morganella morganii oraz Escherichia coli JM109 stransformowanej w opisany powyżej sposób plazmidem pUCl 18. Wynik przedstawiono w tabeli 7. Aktywności transfosforyłacji nie wykryto Escherichia coli JM109/pUC118. Aktywność transfosforyłacji była również niska w szczepie typu dzikiego Morganella morganii. Z drugiej strony, Escherichia coli JM109/pMPI505 wykazywała aktywność transfosforyłacji, która pod względem aktywności właściwej była 150 razy wyższa od tej szczepu dzikiego Morganella morgami. Odnosząc się do tego wyniku, wykazano, że wprowadzony fragment DNA umożliwia Escherichia coli ekspresję kwaśnej fosfatazy na wysokim poziomie.
Tabela 7
Szczep mikroorganizmu | Aktywność transfosforyłacji (jednostki/mg) |
Morganella morganii NCIMB 10466 Escherichia coli JM109/pUCl 18 Escherichia coli JM109/pMPI505 | 0,008 nie wykryta 1,250 |
Przykład 10. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z inozyny przy użyciu szczepu zawierającego gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Morganella morganii NCIMB 10466
Pirofosforan sodowy (12 g/dl) i inozynę (6 g/dl) rozpuszczono w 100 mM buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich komórki mikroorganizmu Escherichia coli JM109/pMPI505 w ilości do uzyskania stężenia komórek 100 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagę komórek mikroorganizmu. Mieszaninę reakcyjnąinkubowano w temperaturze 3 7°C w ciągu 6 godzin utrzymując pH 4,0, i ilość wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego mierzono w miarę upływu czasu. Wytwarzany kwas inozynowy zawierał tylko kwas 5'-inozynowy. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania kwasu 2'-inozynowego i kwasu 3'-inozynowego. Wynik przedstawiono na fig. 4. W szczepie zawierającym gen kwaśnej fosfatazy zachodziła ekspresja znaczących ilości kwaśnej fosfatazy i kwas 5'-inozynowy był przy zastosowaniu tego mikroorganizmu wytwarzany i akumulowany maksymalnie wydajnie podczas krótkiego czasu reakcji wytwarzania kwasu 5'-inozynowego z pirofosforanu i inozyny. Jednakże, jeśli czas reakcji wydłużano, obserwowano, że ilość wytwarzanego i akumulowanego kwasu 5'-inozynowego ulegała obniżeniu w wyniku degradacji.
Przykład 11. Przygotowywanie genu kwaśnej fosfatazy typu o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Jak opisano w przykładach 9 i 10, w szczepie zawierającym gen kwaśnej fosfatazy zachodzi ekspresja znaczących ilości kwaśnej fosfatazy i kwas 5'-inozynowy jest przy zastosowaniu tego mikroorganizmu wytwarzany i akumulowany maksymalnie wydajnie podczas krótkiego czasu reakcji wytwarzania kwasu 5'-inozynowego z pirofosforanu i inozyny. Jednakże, ujawniono, że akumulowana ilość kwasu 5'-inozynowego nie przekracza pewnego stopnia, ponieważ wytworzony kwas 5'-inozynowy podlega degradacji przez aktywność fosfomonoesterazy samej kwaśnej fosfatazy. A zatem, enzym poprawiono przez wprowadzenie, zgodnie z metodąukierun
183 293 kowanej mutagenezy przy użyciu PCR, mutacji do sklonowanego w przykładzie 7 genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej Morganella morganii NCIMP 10466.
Zgodnie z metodą wykorzystującą fosforynoamidy, stosując syntezator DNA (Model 394, produkowany przez Applied Biosystems), zsyntetyzowano oligonukloetydy MUT500, MUT510 i MUT520, posiadające sekwencje przedstawione odpowiednio w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 5, 6 i 7.
Do 100 mM buforu Tris-HCl (pH 8,3, 100 pl) zawierającego dATP, dCTP, dGTP, dTTP (każdy 200 μΜ), chlorek potasowy (50 mM) i chlorek magnezowy (1,5 mM) dodano jako matrycę plazmid pMPI505 (1 ng), przygotowany w przykładzie 8, starter RV Μ13 (produkowany przez Takara Shuzo), oligonukleotyd MUT510 (2,5 pmola każdego) jako starter oraz polimerazę DNA Taq (2,5 jednostki, produkowana przez Takara Shuzo) w celu przeprowadzenia reakcji PCR, w której cykl obejmujący okresy 30 sekund w temperaturze 94°C, 2 minut w temperaturze 55°C i 3 minut w temperaturze 72°C powtórzono 25 razy. Reakcję PCR przeprowadzono stosując Thermal Cycler typu PJ2000 (produkowany przez Takara Shuzo). Reakcję PCR przeprowadzono również w taki sam sposób, jak opisano powyżej, stosując jako matrycę DNA plazmidu pMPI505 (1 ng) i jako startery, starter M4 Ml 3 (produkowany przez Takara Shuzo) i oligonukleotyd MUT500 (2,5 pmola każdego). Każdy z produktów reakcji oczyszczono przez sączenie molekularne przy użyciu kolumny Microspin S-400 (produkowanej przez Pharmacia) w celu usunięcia starterów.
Każdy z produktów reakcji PCR (1 μΐ) dodano do 100 mM buforu Tris-HCl (pH 8,3,95 μΐ) zawierającego dATP, dCTP, dGTP, dTTP (każdy 200 μΜ), chlorek potasowy (50 mM) i chlorek magnezowy (1,5 mM) i ogrzewano je w temperaturze 94°C wciągu 10 minut, a następnie schładzano do temperatury 37°C wciągu 60 minut. Następnie utrzymywano temperaturę 37°C wciągu 15 dla utworzenia heterodupleksu. Dodano polimerazę DNA Tag (2,5 jednostek) w celu przeprowadzenia reakcji w temperaturze 72°C w ciągu 3 minut, aby zakończyć tworzenie heterodupleksu. Następnie do tego roztworu reakcyjnego dodano starter RV Μ13 i starter M4 Μ13 (każdego po 2,5 pmola) w celu przeprowadzenia reakcji PCR, podczas której 10 razy powtórzono cykl obejmujący okresy 30 sekund w temperaturze 94°C, 2 minut w temperaturze 55°C i 3 minut w temperaturze 72°C.
Produkt drugiej reakcji PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi HincBU i EcoRI, a następnie wyekstrahowano fenolem/chloroformem i wytrącono etanolem. Ten fragment DNA zligowano z pUC 118 strawionym HindUI i EcoRI. Otrzymanym DNA plazmidowym stransformowano Escherichia coli JM 109 (produkowaną przez Takara Shuzo) zgodnie ze zwykłą metodą a następnie wysiano ją na podłoże agarowe L zawierające 100 pg/ml ampicyliny dla otrzymania transformanta. Plazmid wyekstrahowano z transformanta zgodnie z metodą lizy alkalicznej dla określenia jego sekwencji nukleotydowej, potwierdzając, że docelowy nukleotyd został podstawiony. Sekwencję nukleotydową określono zgodnie z metodą Sangera (J. Mol. Biol. 143, 161 (1980)) stosując zestaw do sekwencjonowania Taq DyeDeoxy Terminator Cycle (produkowany przez Applied Biochemical). Tak więc przygotowano gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, w której resztę glicyny w pozycji 72 (GGT) dojrzałego białka podstawiono resztą kwasu asparaginowego (G*AT). Plazmid obejmujący ten zmutowany gen oznaczono pMPI510.
Następnie przygotowano zmutowany gen kodujący zmutowaną fosfatazę, w której resztę izoleucyny w pozycji 151 (ATC) dojrzałego białka podstawiono resztę treoniny (A*CC), zgodnie z takąsamąprocedurą jak opisano powyżej, z zastosowaniem pMPI505 jako matrycy i oligonukloetydów MUT500 i MUT520 jako starterów. Plazmid zawierający ten zmutowany gen oznaczono pMPI520. Ponadto, przygotowano zmutowany gen kodujący, zmutowaną fosfatazę, w której resztę glicyny w pozycji 72 (GGT) dojrzałego białka podstawiono resztą kwasu asparaginowego (G*AT) oraz resztę izoleucyny w pozycji 151 (ATC) dojrzałego białka podstawiono resztątreoniny (A*CC), zgodnie z takąsamąprocedurą jak opisano powyżej, z zastosowaniem pMPI510jako matrycy i oligonukloetydówMUT500 iMUT520 jako starterów. Plazmid zawierający ten zmutowany gen oznaczono pMPI530.
183 293
Escherichia coli JM109/pMPI510, Escherichia coli JM109/pMPI520 i Escherichia coli JM109/pMPI530, do których wprowadzono plazmidy obejmujące odpowiednie geny zmutowanej kwaśnej fosfatazy, oraz Escherichia coli JM109/pMPI505, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen kwaśnej fosfatazy typu dzikiego, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 μΐ/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano je w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin. Komórki mikroorganizmów zbierano z hodowli i raz przemywano solą fizjologiczną. Komórki mikroorganizmów zawieszano w 100 mM buforze fosforanów potasowych (5 ml, pH 7,0), i rozbij ano przez traktowanie ultradźwiękami w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowane roztwory wirowano w celu usunięcia frakcji nierozpuszczalnej i w ten sposób przygotowywano ekstrakty wolne do komórek. Aktywności fosfomonoesteraz i aktywności transfosforylacji otrzymanych wolnych od komórek ekstraktów zmierzono w pH 4,0 i porównano z aktywnością szczepu dzikiego. Tabela 8 przedstawia wynik pomiaru aktywności fosfomonoesteraz i aktywności transfosforylacji kwaśnych fosfataz typu dzikiego i zmutowanych kwaśnych fosfataz. Wykazuje ona, że zarówno aktywności fosfomonoesteraz, jak i aktywności transfosforylacji zmutowanych kwaśnych fosfataz są obniżone w porównaniu z kwaśną fosfatazą typu dzikiego, oraz że stopnie obniżenia aktywności fosfomonoesteraz są wyższe od obniżenia stopnia aktywności transfosforylacji, czego wynikiem jest obniżenie stosunku aktywności fosfomonoesterazy do aktywności transfosforylacji zmutowanej kwaśnej fosfatazy w porównaniu z kwaśną fosfatazą typu dzikiego.
Tabela 8
Plazmid | Aktywność fosfomonoesterazy (jednostki/mg) | Aktywność transfosforylacji (jednostki/mg) | Stosunek1’ (wartość względna) |
pMPI505 | 5,91 | 0,625 | 9,45 (100) |
pMPI510 | 0,59 | 0,090 | 6,55 (69) |
pMPI520 | 2,24 | 0,583 | 3,84 (40) |
pMPI530 | 1,07 | 0,318 | 3,36 (35) |
Stosunek aktywności fosfomonoesteraz do aktywności wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu
Przykład 12. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z inozyny z zastosowaniem szczepów zawierających gen kodujący kwaśną fosfatazę o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Escherichia coli JM109/pMPI510, Escherichia coli JM109/pMPI520 i Escherichia coli JM109/pMPI530, do których wprowadzono plazmidy obejmujące zmutowane geny kwaśnej fosfatazy, oraz Escherichia coli JM109/pMPI501, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen kwaśnej fosfatazy typu dzikiego, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano je w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin.
Pirofosforan sodowy (12 g/dl) i inozynę (6 g/dl) rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich komórki mikroorganizmu każdego ze szczepów Escherichia coli, otrzymanych przez opisanąpowyżej hodowlę, JM 109/pMPI5 05 w ilości do uzyskania stężenia komórek 100 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagę komórek mikroorganizmu. Mieszaninę reacyjnąinkubowano w temepraturze 30°C w ciągu 22 godzin utrzymując pH 4,0 i ilość wytwarzanego w reakcj i kwasu 5'-inozyno wego mierzono w miarą upływu czasu. Wynik przedsta- wiono na fig. 5.
Na figurze 5 oś rzędnych wskazuje stężenie kwasu 5'-inozynowego (mg/dl), a oś odciętych wskazuje czas reakcji (h). Postęp reakcji oznaczono pełnymi kółkami dla Escherichia coli JM109/pMPI505, pełnymi trójkątami dla Escherichia coli JM109/pMPI510, pustymi kółkami dla Escherichia coli JM109/pMPI520 i pustymi kwadratami dla Escherichia coli JM109/pMPI530, jak mierzono z wykorzystaniem komórek mikroorganizmów odpowiednich szczepów.
Szybkość degradacji wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego była obniżona w reakcji jego wytwarzania z inozyny przy użyciu szczepów zawierających gen kwaśnej fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy. W wyniku tego, wydajność i akumulowana ilość kwasu 5'-inozynowego były zwiększone. Największą akumulację kwasu 5'-inozynowego wykazywała Escherichia coli JM109/pMPI530, jako szczep zawierający gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy,
183 293 w której resztę glicyny w pozycji 72 i resztę izoleucyny w pozycji 151 podstawiono odpowiednio resztą kwasu asparaginianowego i resztą treoniny.
Przykład 13. Wytwarzanie różnych 5'-fosforanowych estrów nukleozy dów przy użyciu szczepów zawierających gen kodujący kwaśną fosfatazą o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Escherichia coli JM109/pMPI530, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 mg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano ją w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin.
Pirofosforan sodowy (12 g/dl) i inozynę, guanozynę, urydynę lub cytydynę (6 g/dl) jako akceptory grup fosforanowych rozpuszczono w 100 mM buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich opisane powyżej komórki mikroorganizmu, w ilości do uzyskania stężenia komórek 100 mg/dł, wprzeliczeniu na suchą wagę komórek. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 22 godzin utrzymując pH 4,0. Ilości wytwarzanych 5'-fosforanowych estrów nukleozydów przedstawiono w tabeli 9. Wytwarzany nukleotyd zawierał tylko ester 5'-fosforanowy nukleozydu. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania 2'-fosforanowego estru nukleozydu i 3'-fosforanowego estru nukleozydu.
Tabela 9
Nukleozyd | Produkt | Wytwarzana ilość (g/dl) |
Inozyna | kwas 5'-inozynowy | 10,01 |
Guanozyna | kwas 5'-guanylowy | 6,72 |
Urydyna | kwas 5'-urydylowy | 11,90 |
Cy ty dyna | kwas 5'-cytydylowy | 7,82 |
Przykład 14. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z różnych związków fosforanowych jako donorów grup fosforanowych przy użyciu szczepów zawierających gen kodujący kwaśną fosfatazę o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Escherichia coli JM109/pMPI530, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano ją w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin.
Inozynę (6 g/dl) i tripolifosforan sodowy, polifosforan sodowy (nazwa fabryczna: Polygon P, produkowany przez Chiyoda Chemical), fenylofosforan disodowy lub karbamoilofosforan disodowy (10 g/dl) jako donory grup fosforanowych rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,5) i dodano do nich opisane powyżej komórki mikroorganizmu, w ilości do uzyskania stężenia komórek 100 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagę komórek mikroorganizmu. Mieszaninę reakcyjnąinkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 22 godzin utrzymując pH 4,0. Ilość wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego przedstawiono w tabeli 10. Kwas 5'-inozynowy był wydajnie wytwarzany i akumulowany przy wykorzystaniu każdego z donorów grup fosforanowych. Jednakże, akumulacja kwasu 5'-inozynowego była najwyższa, gdy jako donor grup fosforanowych stosowano kwas polifosforowy.
Tabela 10
Donor grup fosforanowych | Wytwarzany kwas 5'-inozynowy (g/dl) |
Tripolifosforan sodowy | 8,93 |
Polifosforan sodowy | 11,45 |
Fenylofosforan disodowy | 9,62 |
Karbamoilofosforan disodowy | 9,89 |
183 293
Przy kład 15. Izolowanie genu kodującego kwaśnąfosfatazę z chromosomu Escherichia blattae (1) Określanie N-końcowej sekwencji aminokwasowej
Kwaśną fosfatazę oczyszczoną z wolnego od komórek ekstraktu Escherichia blattae JCM 1650 zaadsorbowano na membranie DITC (produkowanej przez Milligen/Biosearch) i jej N-końcową sekwencję aminokwasową określono przy użyciu Prosequencer 6625 (produkowanego przez Milligen/Biosearch). Określono N-końcową sekwencję aminokwasową obejmującą 15 reszt, przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 8 w Liście Sekwencji.
(2) Izolowanie fragmentu DNA obejmującego gen kodujący kwaśnąfosfatazę
Z namnożonych komórek Escherichia blattae JCM 1650 wyedstrahowano chromosomalny DNA według metody Murraya i Thomsona (Nuc\. Acid. Res., 4321,8 (1980)). Chromosomalny DNA częściowo zdegradowano enzymem restrykcyjnym SauIIIAI. Następnie fragmenty DNA o długości 3 do 6 kbp frakcjonowano poprzez wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy. Wektor plazmidowy pUC118 (produkowany przez Takara Shuzo) strawiono enzymem restrykcyjnym BamHI i zligowano z nim fragmenty częściowo zdegradowanego chromosomalnego DNA. Ligację DNA przeprowadzono stosując zestaw do ligacji DNA (produkowany przez Takara Shuzo) zgodnie ze wskazaną metodą. Następnie otrzymaną mieszaniną DNA stransformowano, zgodnie ze zwykłą metodą Escherichia coli JM109 (produkowaną przez Takara Shuzo). Transformanty wysiano na podłoże agarowe L zawierające 100 pg/ml ampicyliny i hodowano je w celu przygotowania biblioteki genowej.
Na powierzchnię podłoża agarowego, na którym hodowano transformanty wylano roztwór reakcyjny zawierający 4 mM kwas p-nitrofenylofosforowy i 100 mM bufor MES/NaOH (pH 6,5) i utrzymywano temperaturę 30°C w ciągu 15 minut. Szczepy, w których zachodziła ekspresja aktywności fosfatazy uwalniały p-nitrofenol i wykazywały żółtą barwę. A zatem, transformanty selekcjonowano wykorzystując jako wskaźnik to zjawisko. W wyniku przeszukania ekspresyjnej biblioteki genowej, obejmującej około 8 000 szczepów transformantów, otrzymano 14 szczepów transformantów, w których zachodziła ekspresja aktywności fosfatazy.
Transformanty (14 szczepów), w których zachodziła ekspresja aktywności fosfatazy, poddano izolowaniu pojedynczych kolonii. Pojedynczymi koloniami zaszczepiono podłoże L (2,5 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i hodowano je w temperaturze 37°C wciągu 16 godzin. Do zebranych z płynnych hodowli komórek mikroorganizmu dodawano bufor octanu sodowego (100 mM, pH 5,0,50 μΐ) zawierający inozynę (2 g/dl) i pirofosforan sodowy (10 g/dl) w celu przeprowadzenia reakcji w temperaturze 30°C w ciągu 16 godzin. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego wykrywano przez analizę HPLC dla wyselekcjonowania szczepów mikroorganizmu wykazujących aktywność transfosforylacji. W wyniku, udało nam się uzyskać 3 szczepy transformantów, które wykazywały aktywność transfosforylacji dla których założono, że zawierają fragment DNA obejmujący stanowiący przedmiot wynalazku gen kwaśnej fosfatazy.
Przykład 16. Określanie sekwencji nukleotydowej genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae JCM 1650
Wstawiony fragment DNA analizowano przez ekstrakcję plazmidu zgodnie z metodą lizy alkalicznej z jednego z otrzymanych w przykładzie 15 szczepów transformantów, dla których założono, że zawierają fragment DNA obejmujący gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae JCM 1650. Plazmid ten oznaczono pEPI301. Fig. 6 przedstawia określoną mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne we wstawionym fragmencie DNA.
Region genu kwaśnej fosfatazy określono dokładniej przez subklonowanie. Wynik sugerował, że ten gen kwaśnej fosfatazy zawarty był we fragmencie o wielkości 2,4 kbp, wyciętym enzymami restrykcyjnymi Cla\ i Ro/mHL A zatem, w celu określenia sekwencji aminokwasowej skonstruowano plazmidowy DNA, z którym zligowano strawiony Cla\ i BamHI pBluescript KS(+) (produkowany przez Stratagene). Tym plazmidowym DNA, oznaczonym pEPI305, zgodnie ze zwykłą metodą stransformowano Escherichia coli JM109 (produkowaną przez Takara Shuzo), którą dla otrzymania transformanta wysiano na podłoże agarowe L zawierające 100 pg/ml ampicyliny.
183 293
Dla określenia sekwencji nukleotydowej, z transformanta Escherichia coli JM 109 (produkowanej przez Takara Shuzo) zawierającego pEPI305 wyekstrahowano plazmid zgodnie z metodąlizy alkalicznej. Sekwencję nukleotydowąokreślonej otwartej ramki odczytu przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 9 w Liście Sekwencji. Sekwencję aminokwasową białka, przewidzianą na podstawie sekwencji nukleotydowej, przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 10 w Liście Sekwencji. W sekwencji aminokwasowej stwierdzono częściową sekwencję całkowicie zgodną z N-końcową sekwencją aminokwasową oczyszczonego enzymu. Koniec N oczyszczonego enzymu rozpoczyna się resztą leucyny w pozycji 19 sekwencji przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 10. A zatem, zakłada się, że sekwencja aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 10 jest sekwencją białka prekursorowego i że peptyd obejmujący odcinek od reszty metioniny w pozycji 1 do reszty alaniny w pozycji 18 jest usuwany po translacji. Tak przewidzianą sekwencję aminokwasową dojrzałego białka przedstawiono w sekwencji o numrze identyfikacyjnym: 11 w Liście Sekwencji. Zgodnie z nią masę cząsteczkową dojrzałego białka obliczono na 25,1 kilodaltonów, co wykazuje dobrą zgodność z wynikiem SDS-PAGE oczyszczonego enzymu. Zgodnie z opisanymi powyżej wynikami, i ponieważ transformant zawierający plazmid obejmujący ten fragment wykazywał aktywność transfosforylacji, stwierdzono, że ta otwarta ramka odczytu była regionem kodującym stanowiącej przedmiot wynalazku kwaśnej fosfatazy.
Mianowicie, gen kodujący białko posiadające sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11 w Liście Sekwencji, jest genem kwaśnej fosfatazy Escherichia blattae JCM 1650.
Sekwencję nukleotydowąi sekwencję aminokwasowąporównano odpowiednio ze znanymi sekwencjami w poszukiwaniu homologii. Wykorzystano bazy danych EMBL i SWISS-PROT. W wyniku ujawniono, że białko przedstawione w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 8 i kodujący je DNA są nowe. Białko prekursorowe kodowane przez ten gen obejmuje 249 aminokwasów, a masa cząsteczkowa białka przewidziana na podstawie jego sekwencji wynosi 27,0 kilodaltonów.
Sekwencję aminokwasowąporównano ze znanymi sekwencjami pod względem homologii. W wyniku stwierdzono, że białko to wykazywało wysoki stopień homologii z kwaśną fosfatazą Providencia stuartii (77,1%), z kwaśną fosfatazą Morganella morganii z przykładu 8 (77,1%) oraz z kwaśną fosfatazą Salmonella typhimurium (44,3%).
Szczep Escherichia coli stransformowany plazmidem pEPI305 oznaczono AJ 13144 i zdeponowano w depozycie międzynarodowym 26 lutego 1996 r. w National Institute of Bioscience and Humań Technology of Agency of Industrial Science and Technology (kod pocztowy :305,1-3, Higashi 1 -chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia) na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego i nadano mu numer depozytowy FERM BP-5423.
Przykład 17. Wzmacnianie aktywności przez ekspresję genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae JCM 1650
Skonstruowaną w przykładzie 16 Escherichia coli JM 109/pMPI305 zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG i hodowano ją w temperaturze 27°C w ciągu 16 godzin. Komórki mikroorganizmu zebrano z hodowli przez wirowanie i przemyto je raz solą fizjologiczną. Komórki mikroorganizmu zawieszono w 100 mM buforze fosforanów potasowych (5 ml, pH 7,2) i rozbito je poprzez traktowanie ultradźwiękami prowadzone w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowany roztwór odwirowano dla usunięcia frakcji nierozpuszczlanej i tak przygotowano ekstrakt wolny od komórek.
Aktywność transfosforylacji otrzymanego ekstraktu wolnego od komórek mierzono jako kontrole stosując wolne od komórek ekstrakty przygotowane ze szczepu typu dzikiego Escherichia blattae oraz Escherichia coli JM 109 stransformowanej plazmidem pBluescript KS(+) w taki sam sposób, jak opisano powyżej. Wynik przedstawiono w tabeli 11. Aktywności transfosforylacji nie wykryto w Escherichia coli JM109/ppBluescript KS(+). Aktywność transfosforylacji była również niska w szczepie typu dzikiego Escherichia blattae. Z drugiej strony, Escherichia coli JM109/pEPI305 wykazywała wysoką aktywność transfosforylacji, która pod
183 293 względem aktywności właściwej była 120 razy wyższa od tej szczepu dzikiego Escherichia blattae. Zgodnie z tym wynikiem, wykazano, że wprowadzony fragment DNA umożliwia Escherichia coli ekspresję kwaśnej fosfatazy na wysokim poziomie.
Tabela 11
Szczep mikroorganizmu | Aktywność transfosforylacji (jednostki/mg) |
Escherichia blattae JCM 1650 Escherichia coli JM109/pBluescript KS(+) Escherichia coli JM109/pEPI305 | 0,002 nie wykryta 0,264 |
Przykład 18. Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z inozyny przy użyciu szczepu zawierającego gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae JCM 1650
Pirofosforan sodowy (12 g/dl) i inozynę (6 g/dl) rozpuszczono w 100 mM buforze octanu sodowego (pH 4,0) i dodano do nich komórki opisanego powyżej mikroorganizmu Escherichia coli JM 109/pEPI305 w ilości do uzyskania stężenia komórek 100 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagę komórek mikroorganizmu. Mieszaninę reakcyjnąinkubowano w temperaturze 35°C w ciągu 10 godzin utrzymując pH 4,0 i ilość wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego mierzono w miarę upływu czasu. Wytwarzany kwas inozynowy zawierał tylko kwas 5'-inozynowy. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania kwasu 2'-inozynowego i kwasu 3'-inozynowego. Wynik przedstawiono na fig. 7. Kwas 5'-inozynowy był przy zastosowaniu tego mikroorganizmu wytwarzany i akumulowany maksymalnie wydajnie podczas krótkiego czasu reakcji wytwarzania z pirofosforanu i inozyny.
Przykład 19: Przygotowywanie genu kwaśnej fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Jak opisano w przykładach 17 i 18, w szczepie zawierającym gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Escherichia blattae zachodzi ekspresja znaczących ilości kwaśnej fosfatazy i kwas 5'-inozynowy jest przy zastosowaniu tego mikroorganizmu wytwarzany i akumulowany maksymalnie wydajnie podczas krótkiego czasu reakcji wytwarzania z pirofosforanu i inozyny. Jednakże, ujawniono, że akumulowana ilość kwasu 5'-inozynowego nie przekracza pewnego stopnia, ponieważ wytworzony kwas 5'-inozynowy podlega degradacji przez aktywność fosfomonoesterazy samej kwaśnej fosfatazy. A zatem, zamierzono poprawić enzym przez wprowadzenie, zgodnie z metodą ukierunkowanej mutagenezy przy użyciu PCR, mutacji do sklonowanego w przykładzie 13 genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej Escherichia blattae.
Zgodnie z metodąwykorzystującąfosforynoamidy, stosując syntezator DNA (Model 394, produkowany przez Applied Biosystems), zsyntetyzowano oligonukleotydy MUT300, MUT310 i MUT320, przedstawione odpowiednio w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 12, 13 i 14 w Liście Sekwencji.
Do 100 mM buforu Tris-HCl (pH 8,3,1 OOpl) zawierającego dATP, dCTP, dGTP, dTTP (każdy 200 μΜ), chlorek potasowy (50 mM) i chlorek magnezowy (1,5 mM) dodano jako matrycę przygotowany w przykładzie 13 plazmid pEPI305 (1 ng),jako startery starter RV Ml 3 (produkowany przez Takara Shuzo) i oligonukleotyd MUT310 (2,5 pmola każdego) oraz polimerazę DNA Taq (2,5 jednostki, produkowana przez Takara Shuzo) w celu przeprowadzenia reakcji PCR, w której cykl obejmujący okresy 30 sekund w temperaturze 94°C, 2 minut w temperaturze 55°C i 3 minut w temperaturze 72°C powtórzono 25 razy. Reakcję PCRprzeprowadzono stosując Thermal Cycler typu PJ2000 (produkowany przez Takara Shuzo). Reakcję PCR przeprowadzono również w taki sam sposób, jak opisano powyżej, stosując jako matrycą plazmid pEPI305 (1 ng) i jako startery starter M3 Ml3 (produkowany przez Takara Shuzo) i oligonukloetyd MUT300 (2,5 pmola każdego). Każdy z roztworów reakcyjnych oczyszczono przez sączenie molekularne przy użyciu kolumny Microspin S-400 (produkowanej przez Pharmacia) w celu usunięcia starterów.
183 293
Każdy z produktów reakcji PCR (Ipl) dodano do 100 mM buforu Tris-HCl (pH 8,3,95 μΐ) zawierającego dATP, dCTP, dGTP, dTTP (każdy 200 μΜ), chlorek potasowy (50 mM) i chlorek magnezowy (1,5 mM) i ogrzewano je w temperaturze 94°C w ciągu 10 minut, a następnie schładzano do temperatury 37°C w ciągu 60 minut. Następnie utrzymywano temperaturę 37°C w ciągu 15 minut dla utworzenia heterodupleksu. Dodano polimerazę DNA Taq (2,5 jednostek) w celu przeprowadzenia reakcji w temperaturze 72°C w ciągu 3 minut, aby zakończyć tworzenie heterodupleksu. Następnie do tego roztworu reakcyjnego dodano starter RV Ml3 i starter M3 Ml3 (każdego po 2,5 pmola) w celu przeprowadzenia reakcji PCR, podczas której 10 razy powtórzono cykl obejmujący okresy 30 sekund w temperaturze 94°C, 2 minut w temperaturze 55°C i 3 minut w temperaturze 72°C.
Produkt drugiej reakcji PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi Ciał i Bamłll, a następnie wyekstrahowano fenolem/chloroformem i wytrącono etanolem. Ten fragment DNA zligowano z pBluescript KS(+) strawionym Ciał i Bamłłl. Otrzymanym DNA plazmidowym stransformowano Escherichia coli JM 109 (produkowaną przez Takara Shuzo) zgodnie ze zwykłą metodą i wysiano ją na podłoże agarowe L zawierające 100 pg/ml ampicyliny dla otrzymania transformanta.
Plazmid wyekstrahowano z transformanta zgodnie z metodą lizy alkalicznej dla określenia jego sekwencji nukloetydowej, potwierdzając, że docelowy nukleotyd został podstawiony. Tak więc przygotowano gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, w której resztę glicyny w pozycji 74 (GGG) dojrzałego białka podstawiono resztą kwasu asparaginowego (G*A*T). Plazmid obejmujący ten zmutowany gen oznaczono pEPI310.
Przygotowano zmutowany gen kodujący zmutowaną fosfatazę, w której resztę izoleucyny w pozycji 153 (ATC) dojrzałego białka podstawiono resztą treoniny (A*CC), zgodnie z taką samą procedurą jak opisano powyżej, z zastosowaniem pEPI305 jako matrycy i oligonukleotydów MUT300 i MUT320 jako starterów. Plazmid zawierający ten zmutowany gen oznaczono pEPI320. Ponadto, przygotowano zmutowany gen kodujący zmutowaną fosfatazę, w której resztę glicyny w pozycji 74 (GGG) dojrzałego białka podstawiono resztą kwasu asparaginowego (G*A*T) oraz resztę izoleucyny w pozycji 153 (ATC) dojrzałego białka podstawiono resztą treoniny (A*CC), zgodnie z taką samą procedurą jak opisano powyżej, z zastosowaniem pEPI310 jako matrycy i oligonukleotydów MUT300 i MUT320 jako starterów. Plazmid zawierający ten zmutowany gen oznaczono pEPI330.
Escherichia coli JM109/pEPI310, Escherichia coli JM109/pEPI320 i Escherichia coli JM109/pEPI330, do których wprowadzono plazmidy obejmujące odpowiednie geny zmutowanej kwaśnej fosfatazy, oraz Escherichia coli JM109/pEPI305, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen kwaśnej fosfatazy typu dzikiego, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 μΐ/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano je w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin. Komórki mikroorganizmów zbierano z hodowli i raz przemywano solą fizjologiczną. Komórki mikroorganizmów zawieszano w 100 mM buforze fosforanów w potasowych (5 ml, pH 7,0) i rozbijano przez traktowanie ultradźwiękami w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowane roztwory wirowano w celu usunięcia frakcji nierozpuszczalnych i w ten sposób przygotowywano ekstrakty wolne od komórek. Aktywności fosfomonoesteraz i aktywności transfosforylacji otrzymanych wolnych od komórek ekstraktów zmierzono w pH 4,0 i porównano z aktywnością szczepu dzikiego.
Tabela 12 przedstawia wynik pomiaru aktywności fosfomonoesteraz i aktywności transfosforylacji kwaśnej fosfatazy typu dzikiego i zmutowanych kwaśnych fosfataz. Wykazuje on, że zarówno aktywności fosfomonoesteraz, jak i aktywności transfosforylacji zmutowanych kwaśnych fosfataz sąobniżone w porównaniu z kwaśnąfosfatazątypu dzikiego, oraz że stopnie obniżenia aktywność fosfomonoesteraz są wyższe od obniżenia stopnia aktywności transfosforylacji, czego wynikiem jest obniżenie stosunku aktywności fosfomonoesterazy do aktywności transfosforylacji zmutowanej kwaśnej fosfatazy w porównaniu z kwaśną fosfatazą typu dzikiego.
183 293
Tabela 12
Plazmid | Aktywność fosfomonoesterazy (jednostki/mg) | Aktywność transfosforylacji (jednostki/mg) | Stosunek1* (wartość względna) |
pEPI305 | 2,38 | 0,132 | 18,03 (100) |
pEPI310 | 0,26 | 0,019 | 13,68 (76) |
pEPI320 | 0,88 | 0,123 | 7,15 (39) |
pEPI330 | 0,42 | 0,070 | 6,00 (33) |
Stosunek aktywności fosfomonoesteraz do aktywności wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu
Przykład 20. Wytwarzanie kwasu 5'-inozy nowego z inozyny z zastosowaniem szczepów zawierających gen kodujący kwaśną fosfatazę o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Escherichia coli JM109/pEPI310, Escherichia coli JM109/pEPI320 i Escherichia coli JM109/pEPI330, do których wprowadzono plazmidy obejmujące zmutowane geny kwaśnej fosfatazy, oraz Escherichia coli JM109/pEPI305, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen kwaśnej fosfatazy typu dzikiego, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierający 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano je w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin.
Pirofosforan sodowy (12 g/dl) i inozynę (6 g/dl) rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pfl 4,0), i dodawano do nich komórki mikroorganizmów każdego ze szczepów Escherichia coli otrzymanych przez opisanąpowyżej hodowlę, w ilości do uzyskania stężenia komórek 200 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagę komórek mikroorganizmu. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 35°C w ciągu 32 godzin utrzymując pH 4,0 i ilość wytwarzanego w reakcji kwasu 5'-inozynowego mierzono w miarę upływu czasu. Wynik przedstawiono na fig. 8.
Na figurze 8 oś rzędnych wskazuje stężenie kwasu 5'-inozynowego (mg/dl), a oś odciętych wskazuje czas reakcji (h). Postęp reakcji oznaczono pełnymi kółkami dla Escherichia coli JM109/pEPI305, pełnymi trójkątami dla Escherichia coli JM 109/pEPI310, pustymi kółkami dla Escherichia coli JM109/pEPI320 i pełnymi kwadratami dla Escherichia coli JM109/pEPI330, jak mierzono z wykorzystaniem komórek mikroorganizmów odpowiednich szczepów.
Szybkość degradacji wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego była obniżona w reakcji jego wytwarzania z inozyny przy użyciu szczepów zawierających gen kwaśnej fosfatazy o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy. W wyniku tego, wydajność i akumulowana ilość kwasu 5'-inozynowego były zwiększone. Największą akumulację kwasu 5'-inozynowego wykazywała Escherichia coli JM109/pEPI330, jako szczep zawierający gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy, w której resztę glicyny w pozycji 74 i resztę izoleucyny w pozycji 153 podstawiono odpowiednio resztą kwasu aspraginianowego i resztą treoniny.
Przykład21. Wytwarzanie różnych 5'-fosforanowych estrów nukleozydów przy użyciu szczepów zawierających gen kodujący kwaśną fosfatazę o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Escherichia coli JM109/pEPI330, do której -wprowadzono plazmid obejmujący gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano ją w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin.
Pirofosforan sodowy (12 g/dl) i inozynę, guanozynę, urydynę lub cytydynę (6 g/dl) jako akceptory grup fosforanowych rozpuszczono w 100 mM buforze octanu sodowego (pH 4,0), i dodano do nich opisane powyżej komórki mikroorganizmu, w ilości do uzyskania stężenia komórek 200 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagę komórek. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 35°C w ciągu 32 godzin utrzymując pH 4,0. Ilości wytwarzanych 5'-fosforanowych estrów nukleozydów przedstawiono w tabeli 13. Wytwarzany nukleotyd zawierał tylko ester 5'-fosforanowy nukleozydu. Nie obserwowano w ogóle ubocznego wytwarzania 2'-fosforanowego estru nukleozydu i 3'-fosforanowego estru nukleozydu.
183 293
Tabela 13
Nukleozyd | Produkt | Wytwarzana ilość (g/dl) |
Inozyna | kwas 5'-inozynowy | 7,45 |
Guanozyna | kwas 5'-guanylowy | 4,77 |
Urydyna | kwas 5'-urydylowy | 8,93 |
Cytydyna | kwas 5'-cytydylowy | 6,60 |
Przykład 22. Wytwarzanie kwasu 5'-inozyno wego z różnych związków fosforanowych jako donorów grup fosforanowych przy użyciu szczepów zawierających gen kodujący kwaśną fosfatazę o obniżonej aktywności fosfomonoesterazy
Escherichia coli JM109/pEPI330, do której wprowadzono plazmid obejmujący gen zmutowanej kwaśnej fosfatazy, zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG, i hodowano ją w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin.
Inozynę (6 g/dl) i tripolifosforan sodowy, polifosforan sodowy (nazwa fabryczna: Poły gon P, produkowany przez Chiyoda Chemical), fenylofosforan disodowy łub karbamoilofosforan disodowy (12 g/dl) jako donory grup fosforanowych rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,0), i dodawano do nich opisane powyżej komórki mikroorganizmu, w ilości do uzyskania stężenia komórek 200 mg/dl, w przeliczeniu na suchą wagą komórek mikroorganizmu. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 35°C wciągu 32 godzin utrzymując pH 4,0. Ilość wytwarzanego kwasu 5'-inozynowego przedstawiono w tabeli 14. Kwas 5'-inozynowy był wydajnie wytwarzany i akumulowany przy wykorzystaniu każdego z donorów grup fosforanowych. Jednakże, akumulacja kwasu 5'-inozynowego była najwyższa, gdy jako donor grup fosforanowych stosowano kwas polifosforowy.
Tabela 14
Donor grup fosforanowych | Wytwarzany kwas 5'inozynowy (g/dl) |
Tripolifosforan sodowy | 5,96 |
Polifosforan sodowy | 8,84 |
Fenylofosforan disodowy | 7,60 |
Karbamoilofosforan disodowy | 7,73 |
Przykład 23. Izolowanie genu kwaśnej fosfatazy pochodzącego z chromosomu Providencia stuartii i określanie sekwencji nukloetydowej genu
Zsyntetyzowano oligonukleotydy PRP1 i PRP2, posiadające sekwencje nukleotydowe przedstawiono odpowiednio w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 15 i 16 w Liście Sekwencji. Oligonukleotydy te przeznaczone sądo amplifikacji genu kodującego kwaśną fosfatazą Providencia stuartii na podstawie znanej sekwencji nukloetydowej genu kodującego kwaśną fosfatazą Providencia stuartii (numer dostępu bazy danych EMBL Χ64820).
Z hodowanych komórek Providencia stuartii ATCC 29851 wyekstrahowano chromosomalny DNA według metody Murraya i Thomsona (Nuci. Acid. Res., 4321,8(1980)). Do 100 mM buforu Tris-HCl (pH 8,3, 100 μΐ) zawierającego dATP, dCTP, dGTP i dTTP (każdy 200 μΜ), chlorek potasowy (50 mM) i chlorek magnezowy (1,5 mM) dodano chromosomalny DNA (0,1 ng) jako matrycę, oligonukleotydy PRP1 i PRP2 (każdy 2,5 μΜ) jako startery i polimerazę DNA Taq (2,5 jednostek, produkowana przez Takara Shuzo) w celu przeprowadzenia reakcji PCR, w której cykl obejmujący okresy 30 sekund w temperaturze 94°C, 2 minut w temperaturze 55°C i 3 minut w temperaturze 72°C powtórzono 30 razy. Roztwór reakcyjny poddano elektroforezie w żelu agarozowym, a następnie odzyskano zamplifikowany fragment DNA o długości około 1 kbp stosując proszek szklany (produkowany przez Takara Shuzo). Fragment genowy strawiono 5amHI i zligowano ze strawionym 5«mHI pUCl 18. Plamid otrzymany w opisany powyżej sposób oznaczono pPRPlOO.
183 293
Mierzono aktywność fosfomonoesterazy i aktywność transfosforylacji Escherichia coli JM109/pPRP100, transformanta, do którego wprowadzono pPRPlOO. W wyniku stwierdzono, że szczep wykazywał aktywność transfosforylacji nukleozydu, jak również aktywność fosfomonoesterazy.
Plazmid z tansformanta Escherichia coli HM109/pPRP100 wyekstrahowano zgodnie z metodą lizy alkalicznej w celu określenia sekwencji nukleotydowej. Sekwencję nukleotydwą określonej otwartej ramki odczytu i sekwencję aminokwasową białka przewidzianą na podstawie sekwencji nukleotydowej przedstawiono w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 17 i 18 w Liście Sekwencji. Sekwencja nukloetydowa otwartej ramki odczytu jest w pełni zgodna z sekwencją nukleotydową znanego genu kwaśnej fosfatazy Providencia stuartii.
Przykład 24. Izolowanie genów kwaśnej fosfatazy pochodzących z chromosomów Enierobacier aerogenes, Klebsiellaplanticola i Serratiaficaria i określanie sekwencji nukleotydowych genów
Z hodowanych komórek mikroorganizmów Enterobacter aerogenes IFO 12010, Klebsiella planticola IFO 14939 i Serratiaficaria IAM 13540 wyekstrahowano chromosomalny DNA według metody Murraya i Thomsona (Nuci. Acid. Res., 4321, 8 (1989)). Następnie, zgodnie z metodą opisaną w przykładzie 7, skontruowano ekspresyjną bibliotekę genów chromosomalnych obejmującą około 20 000 transformantów Escherichia coli JM109 i przeszukano ją dla otrzymania transformantów, które wykazywały aktywność transfosforylacji. Uważano, że każdy z tych transformantów zawiera gen kwaśnej fosfatazy pochodzący z każdego z oryginalnych szczepów.
Plazmidowy DNA z jednego z transformantów Escherichia coli, który, jak uważano, posiadał gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Enterobacter aerogenes IFO 12010 wyekstrahowano zgodnie z metodą lizy alkalicznej i analizowano wstawką DNA plazmidu. Mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne wstawki DNA pochodzącego z Enterobacter aerogenes IFO 12010 przedstawiono na fig. 9.
Wynik określania regionu genu kwaśnej fosfatazy przez subklonowanie, sugerował, że gen kwaśnej fosfatazy zawarty jest we fragmencie o długości 1,6 kbp wyciętym enzymami restrykcyjnymi Sali i Kpnl. Następnie fragment SaR-Kpnl zligowano ze strawionym Sali i Kpnl pUCl 18 w celu skonstruowania plazmidu. Otrzymany plazmid oznaczono pENPl 10.
Zgodnie z procedurą opisanąpo wyżej, z jednego z transformantów Escherichia coli, który, jak uważano, posiadał gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Klebsiella planticola IFO 14939, wyekstrahowano plazmidowy DNA według metody lizy alkalicznej i analizowano wstawkę DNA plazmidu. Powyższy plazmid oznaczono pKLPlOO. Mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne wstawki DNA pochodzącego z Klebsiella planticola IFO 14939 przedstawiono na fig. 10.
Wynik określania regionu genu kwaśnej fosfatazy przez subklonowanie sugerował, że gen kwaśnej fosfatazy zawarty jest we fragmencie o długości 2,2 kbp wyciętym enzymami restrykcyjnymi Kpnl i EcoRI. Następnie fragment Kpnl-EcoRI zligowano ze strawionym Kpnl i EcoRI pUCl 18 w celu skonstruowania plazmidu. Otrzymany plazmid oznaczono pKLPl 10.
Podobnie, plazmidowy DNA wyekstrahowano według metody lizy alkalicznej z jednego z transformantów Escherichia coli, który, jak uważano, posiadał gen kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Serratiaficaria IAM 13540, i analizowano wstawką DNA plazmidu. Powyższy plazmid oznaczono pSEPlOO. Mapę miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne wstawki DNA pochodzącego z Serratia ficaria IAMFO 13540 przedstawiono na fig. 11.
Wynik określania regionu genu kwaśnej fosfatazy przez subklonowanie sugerował, że gen kwaśnej fosfatazy zawarty jest we fragmencie o długości 1,4 kbp wyciętym enzymami restrykcyj nymi Hindlll. Następnie fragment Hindlll zligowano ze strawionym Hindlll pUC 118 w celu skonstruowania plazmidu. Otrzymany plazmid oznaczono pSEPHO.
Następnie z transformantów Escherichia coli JM109/pENPl 10, Escherichia coli JM109/pKLP110 i Escherichia coli JM109/pSEP110, do których wprowadzono odpowiednio pENP 110, pKLP 110 i pSEP 110, wyekstrahowano plazmidowe DNA według metody lizy alka
183 293 licznej. Sekwencje nukleotydowe wstawek tych plazmidów określono zgodnie z metodą opisaną w przykładzie 8. Określone sekwencje nukleotydowe otwartych ramek odczytu wstawek przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 19 dlaEnterobacter aerogenes IFO 12010, w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 21 dla Klebsiellaplanticola IFO 14939 i w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 23 dla Serratia ficaria IAM 13540. Ponadto, przewidziane sekwencje aminokwasowe przedstawiono odpowiednio w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 20, 22 i 24. Ponieważ transformanty zawierające plazmidy obejmujące te fragmenty wykazywały aktywność transfosforylacji, stwierdzono, że te otwarte ramki odczytu były docelowymi genami kwaśnej fosfatazy.
Sekwencje nukleotydowe i sekwencje aminokwasowe porównano odpowiednio ze znanymi sekwencjami w poszukiwaniu homologii. Wykorzystano bazy danych EMBL i SWISS-PROT. W wyniku ujawniono, że geny przedstawione w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 19, 21 i 23 w Liście Sekwencji są nowymi genami. Zakłada się, że białko kodowane przez gen pochodzący z Enterobacter aerogenes IFO 12010 obejmuje 248 reszt aminokwasowych, białko kodowane przez gen pochodzący z Klebsiellaplanticola IFO 14939 obejmuje 248 reszt aminokwasowych, a białko kodowane przez gen pochodzący z Serratia ficaria IAM 13540 obejmuje 244 reszty aminokwasowe. Istnieje możliwość, że białka te mogą być białkami prekursorowymi, podobnie jak kwaśne fosfatazy pochodzące z Morganella morganii i Escherichia blattae.
Sekwencje aminowaksowe przewidziane na podstawie sekwencji nukloetydowych przedstawiono w kodzie jednoliterowym na fig. 12, razem z przewidzianymi sekwencjami aminokwasowymi otrzymanej w przykładzie 8 kwaśnej fosfatazy Morganella morganii NCIMB 10466, otrzymanej w przykładzie 16 kwaśnej fosfatazy Escherichia blattae JCM 1650 i znaną sekwencją aminokwasową kwaśnej fosfatazy Providencia stuartii (numer dostępu EMBL Χ64820). Wspólne reszty aminokwasowe dla wszystkich sekwencji aminokwasowych wskazano na fig. 12 gwiazdkami pod sekwencjami.
Jak przedstawiono na fig. 12, sekwencje aminokwasowe kwaśnych fosfataz pochodzących z sześciu szczepów są w wysokim stopniu wzajemnie homologiczne i dla wszystkich sekwencji aminokwasowych 130 reszt aminokwasowych jest wspólnych. A zatem, zakłada się, że te kwaśne fosfatazy posiadają podobne funkcje.
Przykład 25. Wzmacnianie aktywności przez ekspresję genu kwaśnej fosfatazy pochodzącej z Enterobacter aerogenes, Klebsiella planticola i Serratia ficaria.
Skonstruowaną w przykładzie 23 Escherichia coli JM109/pPRP100 oraz skonstruowanymi w przykładzie 24 Escherichia coli JM109/pENP110, Escherichia coli JM109/pKLP110 i Escherichia coli JM109/pSEPl 10 zaszczepiono podłoże L (50 ml) zawierające 100 pg/ml ampicyliny i 1 mM IPTG i hodowano w temperaturze 27°C w ciągu 16 godzin. Komórki mikroorganizmów zbierano z hodowli przez wirowanie i przemywano je raz solą fizjologiczną. Komórki mikroorganizmów zawieszano w 10 mM buforze fosforanów potasowych (5 ml, PH 7,0) i rozbijano je przez traktowanie ultradźwiękami prowadzone w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Traktowane roztwory wirowano dla usunięcia frakcji nierozpuszczalnej i tak przygotowano ekstrakty wolne od komórek.
Aktywności transfosforylacji otrzymanych ekstraktów wolnych od komórek mierzono jako kontrole stosując wolne od komórek ekstrakty przygotowane z Providencia stuartii ATCC 29851, Enterobacter aerogenes IFO 12010, Klebsiella planticola IFO 14939, Serratia ficaria IAM 13450 i Escherichia coli JM109 stransformowanych plazmidem pUCl 18 w taki sam sposób, jak opisano powyżej. Wynik przedstawiono w tabeli 15. Aktywności transfosforylacji były niskie we wszystkich szczepach typu dzikiego. Aktywności transfosforylacji nie wykryto w Escherichia coli JM109/pUCl 18. Z drugiej strony, Escherichia coli JM109, do których wprowadzono geny kwaśnej fosfatazy, wykazywały wysokie aktywności transfosforylacji w porównaniu ze szczepami typu dzikiego. Na podstawie tego wyniku wykazano, że każdy z wprowadzonych fragmentów DNA umożliwia Escherichia coli ekspresję kwaśnej fosfatazy na wysokim poziomie.
183 293
Tabela 15
Szczep mikroorganizmu | Aktywność transfosforyłacji (jednostki/mg) |
Providencia stuartii ATCC 29851 | 0,005 |
Entrobacter aerogenes IFO 12010 | 0,002 |
Klebsiellaplanticola IFO 14939 | 0,002 |
Serratia ficaria LAM 13450 | 0,001 |
Escherichia coli JM109/pUCl 18 | nie wykryta |
Escherichia coli JM109/pPRP100 | 0,833 |
Escherichia coli JM109/pENPl 10 | 0,301 |
Escherichia coli JM 109/pKLP 110 | 0,253 |
Escherichia coli JM109/pSEPl 10 | 0,123 |
Zastosowania przemysłowe
Według niniejszego wynalazku, 5'-fosforanowy ester nukleozydu można tanio i wydajnie wytwarzać umożliwiając działanie kwaśnej fosfatazy w warunkach pH 3,0 do 5,5 na nukleozyd i donor grup fosforanowych wybrany z grupy składającej się z kwasu polifosforowego i jego soli, kwasu fenylofosforowego i jego soli oraz karbamoilofosforanu i jego soli. Szczególnie, ^-fosforanowy ester nukleozydu można wytwarzać wydajniej przez zastosowanie kwaśnej fosfatazy zapewnianej przez niniejszy wynalazek, czyli kwaśnej fosfatazy posiadającej mutację obniżającą aktywność fosfomonoesterazy.
183 293
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:
(i) ZGŁASZAJĄCY: Ajinomoto Co., Inc.
(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Metoda wytwarzania 5'- fosforanowego estru nukleozydu (iii) LICZBA SEKWENCJI: 24 (iv) ADRES DO KRESPONDENCJI:
(A) ADRESAT:
(B) ULICA:
(C) MIASTO:
(D) STAN:
(E) KRAJ:
(F) KOD:
(V) ZAPIS KOMPUTEROWY:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: PC kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release # 1.0, wersja # 1.30 (vi) DANE DOTYCZĄCE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZŁOŻENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 7-149781 (B) DATA ZŁOŻENIA: 5 maja 1995 (vii) DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: JP 8-094680 (B) DATA ZŁOŻENIA: 26 marca 1996
183 293 (viii) INFORMACJE O PEŁNOMOCNIKU/PRZEDSTAWICIELU:
(A) NAZWISKO:
(B) NUMER REJESTRACYJNY:
(ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
(A) TELEFON:
(B) TELEFAX:
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOSĆ: 20 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (v) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Morganella morganii (B) SZCZEP: NCIMB 10466 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 1:
Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr 1 5 10 15
Leu Lys Asn Glu 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 750 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
183 293 (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Morganella morganii (B) SZCZEP: NCIMB 10466 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..747 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd sygnałowy (B) POŁOŻENIE: 1..60 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd dojrzały (B) POŁOŻENIE: 61..747 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 2:
ATG | AAG | AAG AAT ATT ATC GCC GGT | TGT CTG TTC TCA CTG TTT TCC CTT | 48 |
Met -20 | Lys | Lys Asn Ile Ile Ala Gly -15 | Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu -10 -5 | |
TCC | GCG | CTG GCC GCG ATC CCG GCG | GGC AAC GAT GCC ACC ACC AAG CCG | 96 |
Ser | Ala | Leu Ala Ala Ile Pro Ala 1 | Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro 5 10 | |
GAT | TTA | TAT TAT CTG AAA AAT GAA | CAG GCT ATC GAC AGC CTG AAA CTG | 144 |
Asp | Leu | Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu 15 20 | Gin Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu 25 | |
TTA | CCG | CCA CCG CCG GAA GTC GGC | AGT ATT CAG TTT TTA AAT GAT CAG | 192 |
Leu | Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Gin Phe | Leu Asn Asp Gin | ||||||||||||
30 | 35 | 40 | ||||||||||||
GCA | ATG | TAT | GAG | AAA | GGC CGT | ATG | CTG | CGC | AAT ACC | GAG | CGC | GGA | AAA | 240 |
Ala 45 | Met | Tyr | Glu | Lys | Gly Arg 50 | Met | Leu | Arg | Asn Thr 55 | Glu | Arg | Gly | Lys 60 | |
CAG | GCA | CAG | GCA | GAT | GCT GAC | CTG | GCC | GCA | GGG GGT | GTG | GCA | ACC | GCA | 288 |
Gin | Ala | Gin | Ala | Asp 65 | Ala Asp | Leu | Ala | Ala 70 | Gly Gly | Val | Ala | Thr 75 | Ala | |
TTT | TCA | GGG | GCA | TTC | GGC TAT | CCG | ATA | ACC | GAA AAA | GAC | TCT | CCG | GAG | 336 |
Phe | Ser | Gly | Ala 80 | Phe | Gly Tyr | Pro | Ile 85 | Thr | Glu Lys | Asp | Ser 90 | Pro | Glu |
183 293
CTG TAT | AAA | CTG CTG ACC AAT ATG | ATT | GAG GAT GCC GGT GAT CTT GCC | 384 |
Leu Tyr | Lys 95 | Leu Leu Thr Asn Met 100 | Ile | Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 105 | |
ACC CGC | TCC | GCC AAA GAA CAT TAC | ATG | CGC ATC CGG CCG TTT GCG TTT | 432 |
Thr Arg 110 | Ser | Ala Lys Glu His Tyr 115 | Met | Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 120 | |
TAC GGC | ACA | GAA ACC TGT AAT ACC | AAA | GAT CAG AAA AAA CTC TCC ACC | 480 |
Tyr Gly 125 | Thr | Glu Thr Cys Asn Thr 130 | Lys | Asp Gin Lys Lys Leu Ser Thr 135 140 | |
AAC GGA | TCT | TAC CCG TCA GGT CAT | ACG | TCT ATC GGC TGG GCA ACC GCA | 528 |
Asn Gly | Ser | Tyr Pro Ser Gly His 145 | Thr | Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala 150 155 | |
CTG GTG | CTG | GCG GAA GTG AAC CCG | GCA | AAT CAG GAT GCG ATT CTG GAA | 576 |
Leu Val | Leu | Ala Glu Val Asn Pro 160 | Ala 165 | Asn Gin Asp Ala Ile Leu Glu 170 | |
CGG GGT | TAT | CAG CTC GGA CAG AGC | CGG | GTG ATT TGC GGC TAT CAC TGG | 624 |
Arg Gly | Tyr 175 | Gin Leu Gly Gin Ser 180 | Arg | Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 185 | |
CAG AGT | GAT | GTG GAT GCC GCG CGG | ATT | GTC GGT TCA GCC GCT GTC GCG | 672 |
Gin Ser 190 | Asp | Val Asp Ala Ala Arg 195 | Ile | Val Gly Ser Ala Ala Val Ala 200 | |
ACA TTA | CAT | TCC GAT CCG GCA TTT | CAG | GCG CAG TTA GCG AAA GCC AAA | 720 |
Thr Leu 205 CAG GAA Gin Glu | His TTT Phe | Ser Asp Pro Ala Phe 210 GCA CAA AAA TCA CAG Ala Gin Lys Ser Gin | Gin AAA Lys | Ala Gin Leu Ala Lys Ala Lys 215 220 TAA | 750 |
225 229 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 249 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Morganella morganii (B) SZCZEP: NCIMB 10466 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 3:
183 293
Met | Lys | Lys | Asn | Ile | Ile | Ala | Gly | Cys | Leu | Phe | Ser | Leu | Phe | Ser | Leu |
-20 | -15 | -10 | -5 | ||||||||||||
Ser | Ala | Leu | Ala | Ala | Ile | Pro | Ala | Gly | Asn | Asp | Ala | Thr | Thr | Lys | Pro |
1 | 5 | 10 | |||||||||||||
Asp | Leu | Tyr | Tyr | Leu | Lys | Asn | Glu | Gin | Ala | Ile | Asp | Ser | Leu | Lys | Leu |
15 | 20 | 25 | |||||||||||||
Leu | Pro | Pro | Pro | Pro | Glu | Val | Gly | Ser | Ile | Gin | Phe | Leu | Asn | Asp | Gin |
30 | 35 | 40 | |||||||||||||
Ala | Met | Tyr | Glu | Lys | Gly Arg | Met | Leu | Arg | Asn | Thr | Glu | Arg | Gly | Lys | |
45 | 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Gin | Ala | Gin | Ala | Asp | Ala | Asp | Leu | Ala | Ala | Gly Gly | Val | Ala | Thr | Ala | |
65 | 70 | 75 | |||||||||||||
Phe | Ser | Gly | Ala | Phe | Gly | Tyr | Pro | Ile | Thr | Glu | Lys | Asp | Ser | Pro | Glu |
80 | 85 | 90 | |||||||||||||
Leu | Tyr | Lys | Leu | Leu | Thr | Asn | Met | Ile | Glu | Asp | Ala | Gly Asp | Leu | Ala | |
95 | 100 | 105 | |||||||||||||
Thr | Arg | Ser | Ala | Lys | Glu | His | Tyr | Met | Arg | Ile | Arg | Pro | Phe | Ala | Phe |
110 | 115 | 120 | |||||||||||||
Tyr | Gly | Thr | Glu | Thr | Cys | Asn | Thr | Lys | Asp | Gin | Lys | Lys | Leu | Ser | Thr |
125 | 130 | 135 | 140 | ||||||||||||
Asn | Gly | Ser | Tyr | Pro | Ser | Gly | His | Thr | Ser | Ile | Gly | Trp | Ala | Thr | Ala |
145 | 150 | 155 | |||||||||||||
Leu | Val | Leu | Ala | Glu | Val | Asn | Pro | Ala | Asn | Gin | Asp | Ala | Ile | Leu | Glu |
160 | 165 | 170 | |||||||||||||
Arg | Gly | Tyr | Gin | Leu | Gly | Gin | Ser | Arg | Val | Ile | Cys | Gly | Tyr | His | Trp |
175 | 180 | 185 | |||||||||||||
Gin | Sę-r | Asp | Val | Asp | Ala | Ala | Arg | Ile | Val | Gly | Ser | Ala | Ala | Val | Ala |
190 | 195 | 200 | |||||||||||||
Thr | Leu | His | Ser | Asp | Pro | Ala | Phe | Gin | Ala | Gin | Leu | Ala | Lys | Ala | Lys |
205 | 210 | 215 | 220 | ||||||||||||
Gin | Glu | Phe | Ala | Gin | Lys | Ser | Gin | Lys | |||||||
225 | 229 |
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 229 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko
183 293 (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Morganella morganii (B) SZCZEP: NCIMB 10466 (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 4:
Ala | Ile | Pro | Ala | Gly | Asn | Asp | Ala | Thr | Thr | Lys | Pro | Asp | Leu | Tyr | Tyr |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Leu | Lys | Asn | Glu | Gin | Ala | Ile | Asp | Ser | Leu | Lys | Leu | Leu | Pro | Pro | Pio |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Pro | Glu | Val | Gly | Ile | Gin | Phe | Leu | Asn | Asp | Gin | Ala | Met | Tyr | Glu | |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Lys | Gly | Arg | Met | Leu | Arg | Asn | Thr | Glu | Arg | Gly | Lys | Gin | Ala | Gin | Ala |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Asp | Ala | Asp | Leu | Ala | Ala | Gly Gly | Val | Ala | Thr | Ala | Phe | Ser | Gly | Ala | |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Phe | Gly | Tyr | Pro | Ile | Thr | Glu | Lys | Asp | Ser | Pro | Glu | Leu | Tyr | Lys | Leu |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Leu | Thr | Asn | Met | Ile | Glu | Asp | Ala | Gly Asp | Leu | Ala | Thr | Arg | Ser | Ala | |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Lys | Glu | His | Tyr | Met | Arg | Ile | Arg | Pro | Phe | Ala | Phe | Tyr | Gly | Thr | Glu |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Thr | Cys | Asn | Thr | Lys | Asp | Gin | Lys | Lys | Leu | Ser | Thr | Asn | Gly | Tyr | |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Pro | Ser | Gly | His | Thr | Ser | Ile | Gly Trp | Ala | Thr | Ala | Leu | Val | Leu | Ala | |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Glu | Val | Asn | Pro | Ala | Asn | Gin | Asp | Ala | Ile | Leu | Glu | Arg | Gly | Tyr | Gin |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Leu | Gly | Gin | Ser | Arg | Val | Ile | Cys | Gly Tyr | His | Trp | Gin | Ser | Asp | Val | |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Asp | Ala | Ala | Arg | Ile | Val | Gly | Ser | Ala Ala | Val | Ala | Thr | Leu | His | Ser | |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Asp | Pro | Ala | Phe | Gin | Ala | Gin | Leu | Ala Lys | Ala | Lys | Gin | Glu | Phe | Ala | |
210 | 215 | 220 |
Gin Lys Ser Gin Lys
225 229
183 293 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= “Syntetyczny DNA” (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 5:
ATTACCATGA TTACGAATTC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= Syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: TAK (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 6: GCGGTTGCCA CATCCCCTGC G (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy
183 293 (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= Syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (IV) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 7:
TTGCCCAGCC GGTAGACGTA A (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (v) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Escherichia blattae (B) SZCZEP: JMC 1650 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 8:
Leu Ala Leu Val Ala Thr Gly Asn Asp Thr Thr Thr Lys Pro Asp
10 15
Leu (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 750 par zasad
183 293 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Escherichia blattae (B) SZCZEP: JCM 1650 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..747 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd sygnałowy (B) POŁOŻENIE: 1..54 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd dojrzały (B) POŁOŻENIE: 55..747 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 9:
ATG | AAA | AAA | CGT | GTT | CTG | GCA | GTT | TGT | TTT | GCC | GCA | TTG | TTC | TCT | TCT | 48 |
Met | Lys | Lys | Arg | Val | Leu | Ala | Val | Cys | Phe | Ala | Ala | Leu | Phe | Ser | Ser | |
-18 | -15 | -10 | -5 | |||||||||||||
CAG | GCC | CTG | GCG | CTG | GTC | GCT | ACC | GGC | AAC | GAC | ACT | ACC | ACG | AAA | CCG | 96 |
Gin | Ala | Leu | Ala | Leu | Val | Ala | Thr | Gly | Asn | Asp | Thr | Thr | Thr | Lys | Pro | |
1 | 5 | 10 | ||||||||||||||
GAT | CTC | TAC | TAC | CTC | AAG | AAC | AGT | GAA | GCC | ATT | AAC | AGC | CTG | GCG | CTG | 144 |
Asp | Leu | Tyr | Tyr | Leu | Lys | Asn | Ser | Glu | Ala | Ile | Asn | Sę-r | Leu | Ala | Leu | |
15 | 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
TTG | CCG | CCA | CCA | CCG | GCG | GTG | GGC | TCC | ATT | GCG | TTT | CTC | AAC | GAT | CAG | 192 |
Leu | Pro | Pro | Pro | Pro | Ala | Val | Gly | Ser | Ile | Ala | Phe | Leu | Asn | Asp | Gin | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
GCC | ATG | TAT | GAA | CAG | GGG | CGC | CTG | CTG | CGC | AAC | ACC | GAA | CGC | GGT | AAG | 240 |
Ala | Met | Tyr | Glu | Gin | Gly Arg | Leu | Leu | Arg | Asn | Thr | Glu | Arg | Gly | Lys | ||
50 | 55 | 60 |
183 293
CTG GCG GCG GAA GAT GCA AAC CTG AGC AGT GGC GGG GTG GCG AAT GCT 288 Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gly Gly Val Ala Asn Alą
7075
TTC TCC GGC GCG TTT GGT AGC CCG ATC ACC GAA AAA GAC GCC CCG GCG336
Phe Ser Gly Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala ProAla
8590
CTG CAT AAA TTA CTG ACC AAT ATG ATT GAG GAC GCC GGG GAT CTG GCG384
Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp LeuAla
100 105110
ACC CGC AGC GCG AAA GAT CAC TAT ATG CGC ATT CGT CCG TTC GCG TTT432
Thr Arg Ser Ala Lys Asp His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe AlaPhe
115 120125
TAT GGG GTC TCT ACC TGT AAT ACC ACC GAG CAG GAC AAA CTG TCC AAA480
Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu SerLys
130 135140
AAT GGC TCT TAT CCG TCC GGG CAT ACC TCT ATC GGC TGG GCT ACT GCG528
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala ThrAla
145 150155
CTG GTG CTG GCA GAG ATC AAC CCT CAG CGC CAG AAC GAG ATC CTG AAA576
Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu Ile LeuLys
160 165170
CGC GGT TAT GAG CTG GGC CAG AGC CGG GTG ATT TGC GGC TAC CAC TGG624
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gin Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr HisTrp
175 180 185190
CAG AGT GAT GTG GAT GCC GCG CGG GTA GTG GGA TCT GCC GTT GTG GCG672
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Val Gly Ser Ala Val ValAla
195 200205
ACC CTG CAT ACC AAC CCG GCG TTC CAG CAG CAG TTG CAG AAA GCG AAG720
Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys AlaLys
210 215220
GCC GAA TTC GCC CAG CAT CAG AAG AAA TAA750
Ala Glu Phe Ala Gin His Gin Lys Lys
225230 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 249 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko
183 293 (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Escherichia blattae (B) SZCZEP: JCM 1650 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 10:
Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Val | Cys Phe Ala Ala Leu Phe Ser Ser | ||||||||||||||
-18 Gin | Ala | Leu | -15 Ala | Leu | Val | Ala | Thr | -10 Gly | Asn | Asp | Thr | Thr | -5 Thr | Lys | Pro |
Asp | Leu | 1 Tyr | Tyr | Leu | Lys | 5 Asn | Ser | Glu | Ala | Ile | 10 Asn | Ser | Leu | Ala | Leu |
15 Leu | Pro | Pro | Pro | Pro | 20 Ala | Val | Gly | Ser | Ile | 25 Ala | Phe | Leu | Asn | Asp | 30 Gin |
Ala | Met | Tyr | Glu | 35 Gin | Gly Arg | Leu | Leu | 40 | Asn | Thr | Glu | Arg | 45 Gly | Lys | |
Leu | Ala | Ala | 50 Glu | Asp | Ala | Asn | Leu | 55 Ser | Ser | Gly Gly | Val | 60 Ala | Asn | Ala | |
Phe | Ser | 65 Gly Ala | Phe | Gly | Ser | 70 Pro Ile | Thr | Glu | Lys | 75 Asp Ala | Pro | Ala | |||
Leu | 80 His | Lys | Leu | Leu | Thr | 85 Asn | Met | Ile | Glu | Asp | 90 Ala | Gly Asp | Leu | Ala | |
95 Thr | Arg | Ser | Ala | Lys | 100 | His | Tyr | Met | Arg | 105 Ile | Arg | Pro | Phe | Ala | 110 Phe |
Tyx* | Gly | Val | 115 Thr | Cys | Asn | Thr | Thr | 120 Glu | Gin | Asp | Lys | Leu | 125 | Lys | |
Asn | Gly | Ser | 130 Tyr | Pro | Ser | Gly | His | 135 Thr | Ser | Ile | Gly | Trp | 140 Ala | Thr | Ala |
Leu | Val | 145 Leu | Ala | Glu | Ile | Asn | 150 Pro | Gin | Arg | Gin | Asn | 155 Glu | Ile | Leu | Lys |
Ąyg | 160 Gly | Tyr | Glu | Leu | Gly | 165 Gin | Ser | Arg | Val | Ile | 170 Cys | Gly | Tyr | His | Trp |
175 Gin | Ser | Asp | Val | Asp | 180 Ala | Ala | Arg | Val | Val | 185 Gly | Ser | Ala | Val | Val | 190 Ala |
Thr | Leu | His | Thr | 195 Asn | Pro | Ala | Phe | Gin | 200 Gin | Gin | Leu | Gin | Lys | 205 Ala | Lys |
Ala | Glu | Phe 225 | 210 Ala | Gin | His | Gin | Lys 230 | 215 Lys | 220 |
183 293 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 231 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Escherichia blattae (B) SZCZEP: JCM 1650 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 11:
Leu | Ala | Leu | Val | Ala | Thr | Gly | Asn | Asp | Thr | Thr | Thr | Lys | Pro | Asp | Leu |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Tyr | Tyr | Leu | Lys | Asn | Ser | Glu | Ala | Ile | Asn | Ser | Leu | Ala | Leu | Leu | Pro |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Pro | Pro | Pro | Ala | Val | Gly | Ile | Ala | Phe | Leu | Asn | Asp | Gin | Ala | Met | |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Tyr | Glu | Gin | Gly Arg | Leu | Leu | Arg | Asn | Thr | Glu | Arg Gly Lys | Leu | Ala | |||
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ala | Glu | Asp | Ala | Asn | Leu | Ser | Ser | Gly Gly | Val | Ala | Asn | Ala | Phe | Ser | |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Gly | Ala | Phe | Gly | Ser | Pro | Ile | Thr | Glu | Lys | Asp | Ala | Pro | Ala | Leu | His |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Lys | Leu | Leu | Thr | Asn | Met | Ile | Glu | Asp | Ala | Gly Asp | Leu | Ala | Thr | Arg | |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Ser | Ala | Lys Asp | His | Tyr | Met | Arg | Ile | Arg | Pro | Phe | Ala | Phe | Tyr | Gly | |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Val | Ser | Thr | Cys | Asn | Thr | Thr | Glu | Gin | Asp | Lys | Leu | Ser | Lys | Asn | Gly |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Ser | Tyr | Pro | Ser | Gly | His | Thr | Ser | Ile | Gly | Trp | Ala | Thr | Ala | Leu | Val |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Leu | Ala | Glu | Ile | Asn | Pro | Gin | Arg | Gin | Asn | Glu | Ile | Leu | Lys Arg | Gly | |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Tyr | Glu | Leu | Gly | Gin | Ser | Arg | Val | Ile | Cys | Gly Tyr | His | Trp | Gin | Ser | |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Asp | Val | Asp | Ala | Ala | Arg | Val | Val | Gly | Ser | Ala | Val | Val | Ala | Thr | Leu |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
His | Thr | Asn | Pro | Ala | Phe | Gin | Gin | Gin | Leu | Gin Lys | Ala | Lys | Ala | Glu | |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Phe | Ala | Gin | His | Gin | Lys | Lys | |||||||||
225 | 230 |
183 293 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= “Syntetyczny DNA” (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 12:
CCTCGAGGTC GACGGTATCG (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= Syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: TAK (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 13:
ATTCGCCACA TCGCCACTGC T
183 293 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= Syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 14:
TAGCCCAGCC GGTAGAGGTA TG (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DłUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= Syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: TAK (XI) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 15:
CTGGATCCTG TGGCTATCAT CACCT (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DłUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy
183 293 (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= Syntetyczny DNA” (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 16:
CTGGATCCGA CGCGATTTTA CCATA (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 747 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genoraowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Providencia stuartii (B) SZCZEP: ACTT 29851 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..744 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 17:
ATG AAA AAA CTA TTA GCA GTA TTC TGC GCA GGG GCT ITT GTT TCA ACC
Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr 15 10 15
183 293
AGT GTA TTT GCG GCG ATC CCT CCC | GGC AAT GAT GTG ACA ACT AAA CCC | 96 | ||||||||||||||
Ser | Val Phe Ala 20 | Ala | Ile Pro Pro | Gly 25 | Asn | Asp Val Thr | Thr 30 | Lys Pro | ||||||||
GAT | CTT | TAT | TAT | TTA | AAA | AAC | TCA | CAG | GCT | ATT | GAT | AGT | TTA | GCG | TTA | 144 |
Asp | Leu | 35 | Tyr | Leu | Lys | Asn | Ser 40 | Gin | Ala | Ile | Asp | Ser 45 | Leu | Ala | Leu | |
TTG | CCG | CCA | CCA | CCT | GAA | GTG | GGC | AGT | ATC | TTA | TTT | TTA | AAC | GAC | CAA | 192 |
Leu | Pro 50 | Pro | Pro | Pro | Glu | Val 55 | Gly | Ser | Ile | Leu | Phe 60 | Leu | Asn | Asp | Gin | |
GCG | ATG | TAT | GAA | AAA | GGC | CGT | TTA | TTG | CGA | AAT | ACT | GAG | CGT | GGA | GAA | 240 |
Ala 65 | Met | Tyr | Glu | Lys | Gly 70 | Arg | Leu | Leu | Arg | Asn 75 | Thr | Glu | Arg | Gly | Glu 80 | |
CAA | GCC | GCT | AAG | GAT | GCT | GAT | CTG | GCT | GCG | GGC | GGT | GTT | GCG | AAC | GCA | 288 |
Gin | Ala | Ala | Lys | 85 | Ala | Asp | Leu | Ala | Ala 90 | Gly | Gly | Val | Ala | Asn 95 | Ala | |
TTT | TCT | GAA | GCT | TTT | GGT | TAT | CCC | ATT | ACC | GAA | AAG | GAT | GCG | CCT | GAA | 336 |
Phe | Ser | Glu | Ala 100 | Phe | Gly | Tyr | Pro | Ile 105 | Thr | Glu | Lys | Asp | Ala 110 | Pro | Glu | |
ATT | CAT | AAA | TTG | CTG | ACG | AAT | ATG | ATT | GAA | GAT | GCG | GGG | GAT | TTA | GCA | 384 |
Ile | His | Lys 115 | Leu | Leu | Thr | Asn | Met 120 | Ile | Glu | Asp | Ala | Gly 125 | Asp | Leu | Ala | |
ACT | CGC | TCA | GCC | AAA | GAG | AAA | TAC | ATG | CGC | ATT | CGT | CCA | TTT | GCG | TTC | 432 |
Thr | Arg 130 | Ser | Ala | Lys | Glu | Lys 135 | Tyr | Met | Arg | Ile | Arg 140 | Pro | Phe | Ala | Phe | |
TAC | GGT | GTT | GCT | ACC | TGT | AAC | ACG | AAA | GAT | CAG | GAC | AAA | TTA | TCT | AAG | 480 |
145 | Gly | Val | Ala | Thr | Cys 150 | Asn | Thr | Lys | Asp | Gin 155 | Asp | Lys | Leu | Ser | Lys 160 | |
AAT | GGC | TCT | TAT | CCT | TCT | GGA | CAC | ACC | GCA | ATT | GGC | TGG | GCA | TCT | GCA | 528 |
Asn | Gly | Ser | Tyr | Pro 165 | Ser | Gly | His | Thr | Ala 170 | Ile | Gly | Trp | Ala | Ser 175 | Ala | |
CTC | GTA | TTG | TCA | GAA | ATT | AAC | CCA | GAA | AAC | CAA | GAT | AAA | ATT | TTA | AAA | 576 |
Leu | Val | Leu | Ser 180 | Glu | Ile | Asn | Pro | Glu 185 | Asn | Gin | Asp | Lys | Ile 190 | Leu | Lys | |
CGT | GGT | TAT | GAA | CTT | GGC | CAA | AGC | CGA | GTC | ATC | TGT | GGT | TAC | CAT | TGG | 624 |
Arg | Gly | Tyr 195 | Glu | Leu | Gly | Gin | 200 | Arg | Val | Ile | Cys | Gly 205 | Tyr | His | Trp | |
CAA | AGT | GAT | GTT | GAT | GCA | GCT | CGT | ATC | GTT | GCA | TCG | GGT | GCG | GTA | GCA | 672 |
Gin | 210 | Asp | Val | Asp | Ala | Ala 215 | Arg | Ile | Val | Ala | Ser 220 | Gly | Ala | Val | Ala | |
ACT | TTA | CAC | TCC | AAC | CCT | GAA | TTC | CAA | AAA | CAG | TTA | CAA | AAA | GCC | AAA | 720 |
Thr 225 GAC Asp | Leu GAA Glu | His TTT Phe | Ser GCT Ala | Asn AAA Lys | Pro 230 CTG Leu | Glu AAA Lys | Phe AAA Lys | Gin TAG | Lys | Gin 235 | Leu | Gin | Lys | Ala | Lys 240 | 747 |
245
183 293 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 248 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Providencia stuartii (B) SZCZEP: ATCC 29851 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 18:
Met Lys Lys Leu Leu Ala Val Phe Cys Ala Gly Ala Phe Val Ser Thr 15 1015
Ser Val Phe Ala Ala Ile Pro Pro Gly Asn Asp Val Thr Thr Lys Pro 20 2530
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ser Gin Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu 35 4045
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Leu Phe Leu Asn Asp Gin 50 5560
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Glu
70 7580
Gin Ala Ala Lys Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala 85 9095
Phe Ser Glu Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Glu
100 105110
Ile His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala
115 120125
Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe
130 135140
Tyr Gly Val Ala Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gin Asp Lys Leu SerLys
145 150 155160
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ala Ile Gly Trp Ala SerAla
165 170175
Leu Val Leu Ser Glu Ile Asn Pro Glu Asn Gin Asp Lys Ile Leu Lys
180 185190
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Gin Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp
195 200205
183 293
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Ala Ser Gly Ala Val Ala
210 215 220
Thr Dau His Ser Asn Pro Glu Phe Gin Lys Gin Leu Gin Lys Ala Lys
225 230 235 240
Asp Glu Phe Ala Lys Leu Lys Lys
245 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 19:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 744 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Enterobacter aerogenes (B) SZCZEP: IFO 12010 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..744 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 19:
ATG | AAA | AAG | CGC | GTT | CTC | GCC | CTC | TGC | CTC | GCC | AGC | CTG | TTT | TCC | GTT | 48 |
Met | Lys | Lys | Arg | Val | Leu | Ala | Leu | Cys | Leu | Ala | Ser | Leu | Phe | Ser | Val | |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
AAC | GCT | TTC | GCG | CTG | GTC | CCT | GCC | GGC | AAT | GAT | GCA | ACC | ACC | AAA | CCG | 96 |
Asn | Ala | Phe | Ala | Leu | Val | Pro | Ala | Gly | Asn | Asp | Ala | Thr | Thr | Lys | Pro | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
GAT | CTC | TAT | TAT | CTG | AAA | AAT | GCA | CAG | GCC | ATC | GAT | AGT | CTG | GCG | CTG | 144 |
Asp | Leu | Tyr | Tyr | Leu | Lys | Asn | Ala | Gin | Ala | Ile | Asp | Ser | Leu | Ala | Leu | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
TTG | CCG | CCG | CCG | CCG | GAA | GTT | GGC | AGC | ATC | GCA | TTT | TTA | AAC | GAT | CAG | 192 |
Leu | Pro | Pro | Pro | Pro | Glu | Val | Gly | Ser | Ile | Ala | Phe | Leu | Asn | Asp | Gin | |
50 | 55 | 60 |
183 293
GCG ATG TAT GAG | AAA GGA CGG CTG | TTG CGC | AAT ACC GAA CGT GGC | AAG | 240 | |||||||||||
Ala 65 | Met | Tyr | Glu | Lys | Gly Arg 70 | Leu | Leu | Arg | Asn 75 | Thr | Glu | Arg | Gly | Lys 80 | ||
CTG | GCG | GCT | GAA | GAT | GCT | AAC | CTG | AGC | GCC | GGC | GGC | GTC | GCG | AAT | GCC | 288 |
Leu | Ala | Ala | Glu | 85 | Ala | Asn | Leu | Ser | Ala 90 | Gly | Gly | Val | Ala | Asn 95 | Ala | |
TTC | TCC | AGC | GCT | TTT | GGT | TCG | CCC | ATC | ACC | GAA | AAA | GAC | GCG | CCG | CAG | 336 |
Phe | Ser | Ala 100 | Phe | Gly | Ser* | Pro | Ile 105 | Thr | Glu | Lys | Asp | Ala 110 | Pro | Gin | ||
TTA | CAT | AAG | CTG | CTG | AGA | AAT | ATG | ATT | GAG | GAT | GCC | GGC | GAT | CTG | GCC | 384 |
Leu | His | Lys 115 | Leu | Leu | Thr | Asn | Met 120 | Ile | Glu | Asp | Ala | Gly 125 | Asp | Leu | Ala | |
ACC | CGC | AGC | GCG | AAA | GAG | AAA | TAT | ATG | CGC | ATT | CGC | CCG | TTT | GCG | TTC | 432 |
Thr | 130 | Ser | Ala | Lys | Glu | Lys 135 | Tyr | Met | Arg | Ile | Arg 140 | Pro | Phe | Ala | Phe | |
TAC | GGC | GTT | TCA | ACC | TGT | AAC | ACT | ACC | GAG | CAG | GAC | AAG | CTG | TCG | AAA | 480 |
Tyr 145 | Gly | Val | Ser | Thr | Cys 150 | Asn | Thr | Thr | Glu | Gin 155 | Asp | Lys | Leu | Ser | Lys 160 | |
AAC | GGA | TCT | TAC | CCT | TCC | GGC | CAT | ACC | TCT | ATC | GGT | TGG | GCA | ACC | GCG | 528 |
Asn | Gly | .S^t- | Tyr | Pro 165 | Ser | Gly | His | Thr | Ser 170 | Ile | Gly | Trp | Ala | Thr 175 | Ala | |
CTG | GTA | CTG | GCG | GAG | ATC | AAT | CCG | CAG | CGG | CAA | AAC | GAA | ATT | CTC | AAA | 576 |
Leu | Val | Leu | Ala 180 | Glu | Ile | Asn | Pro | Gin 185 | Arg | Gin | Asn | Glu | Ile 190 | Leu | Lys | |
CGC | GGC | TAT | GAA | TTG | GGC | GAA | AGC | CGG | GTT | ATC | TGC | GGC | TAT | CAT | TGG | 624 |
Arg | Gly | Tyr 195 | Glu | Leu | Gly | Glu | 200 | Arg | Val | Ile | Cys | Gly 205 | Tyr | His | Trp | |
CAG | AGC | GAT | GTC | GAT | GCG | GCG | CGG | ATA | GTC | GGC | TCG | GCG | GTG | GTG | GCG | 672 |
Gin | Ser 210 | Asp | Val | Asp | Ala | Ala 215 | Arg | Ile | Val | Gly | 220 | Ala | Val | Val | Ala | |
ACC | CTG | CAT | ACC | AAC | CCG | GCC | TTC | CAA | CAG | CAG | TTG | CAG | AAA | GCA | AAG | 720 |
Thr 225 GAT Asp | Leu GAA Glu | His TTC Phe | Thr GCC Ala | Asn AAA Lys | Pro 230 ACG Thr | Ala CAG Gin | Phe AAG Lys | Gin TAA | Gin | Gin 235 | Leu | Gin | Lys | Ala | Lys 240 | 747 |
245 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 20:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 248 aminokwasów
183 293 (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Enterobacter aerogenes (B) SZCZEP: IFO 12010 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 20:
Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val 15 1015
Asn Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro 20 2530
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gin Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu
4045
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gin 50 5560
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys 65 70 7580
Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala 85 9095
Phe Ser Ser Ala Phe Gly Ser Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ala Pro Gin 100 105110
Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 115 120125
Thr Arg Ser Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 130 135140
Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu SerLys
145 150 155160
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala ThrAla
165 170175
Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu Ile Leu Lys 180 185190
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 195 200205
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala 210 215220
Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys Ala Lys 225 230 235240
Asp Glu Phe Ala Lys Thr Gin Lys 245
183 293 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 21:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOSC: 747 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Klevsiella planticola (B) SZCZEP: IFO 14939 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..747 (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 21:
ATG AAA | AAG | CGT | GTA CTC GCC CTT | TGC CTT GCC AGC | CTC | TTT TCA | GTT | 48 |
Met Lys 1 | Lys | Arg | Val Leu Ala Leu 5 | Cys Leu Ala Ser 10 | Leu | Phe Ser 15 | Val | |
AGC GCC | TTT | GCG | CTG GTT CCC GCC | GGC AAT GAT GCC | ACC | ACC AAG | CCC | 96 |
Ser Ala | Phe | Ala 20 | Leu Val Pro Ala | Gly Asn Asp Ala 25 | Thr | Thr Lys 30 | Pro | |
GAT CTC | TAC | TAT | CTG AAA AAT GCC | CAG GCC ATT GAC | AGC | CTG GCG | CTG | 144 |
Asp Leu | 35 | Tyr | Leu Lys Asn Ala 40 | Gin Ala Ile Asp | 45 | Leu Ala | Leu | |
TTG CCA | CCG | CCG | CCG GAA GTG GGC | AGC ATT GCG TTT | TTA | AAC GAT | CAG | 192 |
Leu Pro 50 | Pro | Pro | Pro Glu Val Gly 55 | Ser Ile Ala Phe 60 | Leu | Asn Asp | Gin | |
GCG ATG | TAT | GAG | AAA GGC CGT CTG | CTG CGC GCC ACC | GCC | CGC GGC | AAG | 240 |
Ala Met 65 | Tyr | Glu | Lys Gly Arg Leu 70 | Leu Arg Ala Thr 75 | Ala | Arg Gly | Lys 80 | |
TTG GCG | GCA | GAA | GAT GCC AAC CTG | AGC GCG GGT GGC | GTG | GCC AAC | GCC | 288 |
Leu Ala | Ala | Glu | Asp Ala Asn Leu 85 | Ser Ala Gly Gly 90 | Val | Ala Asn 95 | Ala | |
TTC TCC | GCA | GCA | TTC GGC TCC CCG | ATC AGC GAA AAA | GAC | GCC CCG | GCG | 336 |
Phe Ser | Ala | Ala 100 | Phe Gly Ser Pro | Ile Ser Glu Lys 105 | Asp | Ala Pro 110 | Ala |
183 293
CTG CAC AAA CTG CTC ACC AAC ATG ATT GAA GAC GCG GGC GAT CTG GCG 384
Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 115 120125
ACC CGA GGC GCG AAA GAG AAG TAT ATG CGT ATT CGT CCG TTT GCC TTC432
Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe AlaPhe
130 135140
TAC GGC GTG ICC ACC TGC AAT ACC ACC GAA CAG GAT AAG CTG TCG AAA480
Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu SerLys
145 150 155160
AAC GGC TCC TAC CCT TCC GGA CAC ACC TCT ATC GGC TGG GCG ACC GCC528
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala ThrAla
165 170175
CTG GTG CTG GCC GAA ATC AAC CCG CAG CGC CAG AAT GAG ATT CTC AAG576
Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu Ile LeuLys
180 185190
CGC GGC TAT GAG CTC GGT GAA AGT CGG GTG ATC TGC GGT TAC CAC TGG624
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr HisTrp
195 200205
CAG AGC GAT GTT GAC GCC GCG CGG ATT GTC GGC TCG GCG GTG GTT GCA672
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val ValAla
210 215220
ACC CTG CAT ACC AAT CCG GCC TTC CAG CAG CAG CTG CAA AAA GCC ΑΆΑ720
Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys AlaLys
225 230 235240
GAC GAG TTT GCG AAA CAG CAG AAA TAG747
Asp Glu Phe Ala Lys Gin Gin Lys 245 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 22:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 248 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
183 293 (A) ORGANIZM: Klevsiella planticola (B) SZCZEP: IFO 14939 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 22:
Met Lys Lys Arg Val Leu Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Phe Ser Val 15 1015
Ser Ala Phe Ala Leu Val Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro 20 2530
Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Ala Gin Ala Ile Asp Ser Leu Ala Leu 35 4045
Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Ala Phe Leu Asn Asp Gin 50 5560
Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Leu Arg Ala Thr Ala Arg Gly Lys 65 70 7580
Leu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Leu Ser Ala Gly Gly Val Ala Asn Ala 85 9095
Phe Ser Ala Ala Phe Gly Ser Pro Ile Ser Glu Lys Asp Ala Pro Ala 100 105110
Leu His Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala 115 120125
Thr Arg Gly Ala Lys Glu Lys Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe 130 135140
Tyr Gly Val Ser Thr Cys Asn Thr Thr Glu Gin Asp Lys Leu SerLys
145 150 155160
Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala ThrAla
165 170175
Leu Val Leu Ala Glu Ile Asn Pro Gin Arg Gin Asn Glu Ile Leu Lys 180 185190
Arg Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp 195 200205
Gin Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Val Val Ala 210 215220
Thr Leu His Thr Asn Pro Ala Phe Gin Gin Gin Leu Gin Lys Ala Lys
225
230
235
240
Asp Glu Phe Ala Lys Gin Gin Lys
245 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 23:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DłUGOŚĆ: 735 par zasad
183 293 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNY: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Serratia ficaria (B) SZCZEP: IAM 13540 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..732 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 23:
ATG AAA AAA ΑΤΑ TTA TTA GCC ACA TTA AGC TGC GCC GCG TTG ACG CAG 48
Met Lys Lys Ile Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gin 15 10 15
N BI BI
TCC TTT GCC Ser Phe Ala | GCC AAA | GAT Asp | GTC ACT ACC CAC CCT GAG GTT TAT TTT | 96 | |||||||||||
Ala | Lys | Val Thr 25 | Thr | His Pro | Glu Val 30 | Tyr Phe | |||||||||
20 | |||||||||||||||
CAA | GAA | TCA | CAG | TCC | ATC | GAC | AGC | CTG | GCA | CTA | TTG | CCG | CCG | CCG | 144 |
Gin | Glu | Ser | Gin | Ser | Ile | Asp | Ser | Leu | Ala | Leu | Leu | Pro | Pro | Pro | |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
GCG | ATG | GAC | AGC | ATT | GAT | TTC | CTG | AAT | GAC | AAA | GCG | CAA | TAC | GAC | 192 |
Ala | Met | Asp | Ser | Ile | Asp | Phe | Leu | Asn | Asp | Lys | Ala | Gin | Tyr | Asp | |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
GGG | AAA | ATA | GTG | CGC | AAT | ACT | CCG | CGT | GGC | AAG | CAG | GCT | TAT | GAT | 240 |
Gly | Lys | Ile | Val | Arg | Asn | Thr | Pro | Arg | Gly | Lys | Gin | Ala | Tyr Asp | ||
70 | 75 | 80 | |||||||||||||
GCC | CAC | GTT | GCC | GGG | GAC | GGC | GTT | GCC | GCC | GCA | TTT | TCC | AAC | GCC | 288 |
Ala | His | Val | Ala | Gly Asp | Gly | Val | Ala | Ala | Ala | Phe | Ser | Asn | Ala | ||
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
GGC | CTA | GAA | ATA | GCC | CAA | CGG | AAA | ACG | CCG | GAG | CTG | TTT | AAG | CTG | 336 |
Gly | Leu | Glu | Ile | Ala | Gin | Arg | Lys | Thr | Pro | Glu | Leu | Phe | Lys | Leu | |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
ATG | AAA | ATG | CGT | GAA | GAC | GCC | GGC | GAT | TTG | GCG | ACC | CGC | AGC | GCC | 384 |
Met | Lys | Met | Arg | Glu | Asp | Ala | Gly Asp | Leu | Ala | Thr | Arg | Ser | Ala | ||
115 | 120 | 125 |
183 293
AAA | AAT | CAC | TAT | ATG | CGC | ATT | CGC | CCC | TTT | GCG | TTT | TAT | AAC | GAA | GCG | 432 |
Lys | Asn | His | Tyr | Met | Arg | Ile | Arg | Pro | Phe | Ala | Phe | Tyr | Asn | Glu | Ala | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
ACC | TGC | CGA | CCG | GAC | GAA | GAA | AGC | ACC | CTG | TCG | AAG | AAC | GGT | TCT | TAC | 480 |
Thr | Cys | Arg | Pro | Asp | Glu | Glu | Ser | Thr | Leu | Ser | Lys | Asn | Gly | Ser | Tyr | |
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
CCT | TCC | GGC | CAT | ACC | ACC | ATC | GGC | TGG | GCG | ACC | GCG | CTG | GTG | CTG | GCT | 528 |
Pro | Ser | Gly | His | Thr | Thr | Ile | Gly Trp | Ala | Thr | Ala | Leu | Val | Leu | Ala | ||
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
GAA | ATC | AAC | CCC | GCC | AGG | CAG | GGT | GAA | ATC | CTG | CAG | CGC | GGC | TAT | GAT | 576 |
Glu | Ile | Asn | Pro | Ala | Arg | Gin | Gly | Glu | Ile | Leu | Gin | Arg | Gly | Tyr | Asp | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
ATG | GGC | CAA | AGC | CGG | GTT | ATC | TGC | GGT | TAT | CAC | TGG | CAA | AGC | GAC | GTG | 624 |
Met | Gly | Gin | Ser | Arg | Val | ile | Cys | Gly Tyr | His | Trp | Gin | Ser | Asp | Val | ||
195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
ACT | GCG | GCG | CGC | ATG | GCG | GCG | TCG | GCC | ATG | GTG | GCG | CGT | TTG | CAT | GCC | 672 |
Thr | Ala | Ala | Arg | Met | Ala | Ala | Ser | Ala | Met | Val | Ala | Arg | Leu | His | Ala | |
210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
GAA | CCC | ACC | TTC | GCC | GCC | CAG | CTG | CAA | AAG | GCC | AAA | GAC | GAA | TTC | AAC | 720 |
Glu | Pro | Thr | Phe | Ala | Ala | Gin | Leu | Gin | Lys | Ala | Lys | Asp | Glu | Phe | Asn | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
GGC | CTG | AAA | AAG | TAA | 735 |
Gly Leu Lys Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 24:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 244 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: 1iniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Serratia ficaria (B) SZCZEP: IAM 13540 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
IDENTYFIKACYJNYM: 24:
Met Lys Lys Ile Leu Leu Ala Thr Leu Ser Cys Ala Ala Leu Thr Gin 15 10 15
Phe Ser Phe Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr His Pro Glu Val Tyr Phe
25 30
183 293
Leu | Gin | Glu | Ser | Gin | Ser | Ile | Asp | Ser | Leu | Ala | Leu | Leu | Pro | Pro | Pro |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Pro | Ala | Met | Asp | Spr | Ile | Asp | Phe | Leu | Asn | Asp | Lys | Ala | Gin | Tyr | Asp |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ala | Gly | Lys | Ile | Val | Arg | Asn | Thr | Pro | Arg | Gly | Lys | Gin | Ala | Tyr | Asp |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Asp | Ala | His | Val | Ala | Gly Asp Gly | Val | Ala | Ala | Ala | Phe | Ser | Asn | Ala | ||
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Phe | Gly | Leu | Glu | Ile | Ala | Gin | Arg | Lys | Thr | Pro | Glu | Leu | Phe | Lys | Leu |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Val | Met | Lys | Met | Arg | Glu | Asp | Ala | Gly Asp | Leu | Ala | Thr | Arg | Ser | Ala | |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Lys | Asn | His | Tyr | Met | Arg | Ile | Arg | Pro | Phe | Ala | Phe | Tyr | Asn | Glu | Ala |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Thr | Cys | Arg | Pro | Asp | Glu | Glu | Ser | Thr | Leu | Ser | Lys | Asn | Gly | Ser | Tyr |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Pro | Ser | Gly | His | Thr | Thr | Ile | Gly Trp | Ala | Thr | Ala | Leu | Val | Leu | Ala | |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Glu | Ile | Asn | Pro | Ala | Arg | Gin | Gly | Glu | Ile | Leu | Gin | Arg Gly | Tyr Asp | ||
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Met | Gly | Gin | Ser | Arg | Val | Ile | Cys | Gly Tyr | His | Trp | Gin | Ser | Asp | Val | |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Thr | Ala | Ala | Arg | Met | Ala | Ala | Ser | Ala | Met | Val | Ala | Arg | Leu | His | Ala |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Glu | Pro | Thr | Phe | Ala | Ala | Gin | Leu | Gin | Lys | Ala | Lys | Asp | Glu | Phe | Asn |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gly | Leu | Lys | Lys |
183 293
czas reakcji (godziny)
183 293
F Z G. 3
SB B P K Η EK BN E SB pMPI 501 pMPI 505
1Kb
SB: połączenie Sau3MIBamW B: Barn HI E: EcoRI K: Kpn\ H: ///ndlll N: Nco\ P: Pst\
183 293
F I G. 4
1 2 3 4 5 6 czas reakcji (godziny)
183 293
ο. σ< ο
CL· ck ο
czas reakcji (godziny)
183 293
F / G. 6 pEPI301
pEPI305 f
1Kb
SB: połączenie Sat/3AI/£amHI B: BamH\ Bg: Bg!\\ C: C!a\ E: EcoRI
czas reakcji (godziny)
183 293 •η ο co
CL, W
CL os o τH g
o en
CU W
CL
Os O s ·“J
(IP/6) AMOuAzoui-fg sbm>|
183 293
SB
K P S S SB ρΕΝΡΙΟΟ pENPllO
IKbp
SB: połączenie Sau3MIBamW\ K: Kpn\ P: PsA S: Sa!\
183 293
FIG. 10
SB K S EH K SB pKLPlOO-----pKLPUO lKbp
SB: połączenie Sau3M/BamH\ E: EcoRI H: H/ndlll K: Kpn\
S: Sad
183 293
SB Η Ρ
PEH
SB pSEPlOO
pSEPllO
1Kb
SB: połączenie Sau3MIBamH\ E: £co Rl H: ///ndlll P: Psti
183 293
E. aerogenes 1:MKKRVLALCLASLFSVNAFALVPAGNDATTKPDLYYLKNAQAIDSLALLP50
E.blat tae 1 :MKKRVLAVCFAALFSSQALALVATGNDTTTKPDLYYLKNSEAINSLALLP5 0
K. planticola 1 :MKKRVLALCLASLFSVSAFALVPAGNDATTKPDLYYLKNAQAIDSLALLP50
M. morgani i 1 :MKKNIIAGCLFSLFSLSALAAIPAGNDATTKPDLYYLKNEQAIDSLKLLP50
P.Stuart i i 1 :MKKLLAVFCAGAFVSTSVFAAIPPGNDVTTKPDLYYLKNSQAIDSLALLP50
S. fi car i a 1: MKK-ILLA-TLSCAALTQFS—FAAKDYTTHPEVYFLQESQSIDSLALLP46
E. aerogenes 51 :PPPEVGSIAFLNDQAMYEKGRLLRNTERGKLAAEDANLSAGGYANAFSSA 100
E. bl at tae 51: PPPAYGSIAFLNDQAMYEQGRLLRNTERGKLAAEDANLSSGGVANAFSGA 100
K. planticola 51:PPPEVGSIAFLNDQAMYEKGRLLRATARGKLAAEDANLSAGGVANAFSAA 100
M. morganii 51:PPPEVGSIQFLNDQAMYEKGRMLRNTERGKQAQADADLAAGGVATAFSGA 100
P. Stuart i i 51: PPPEVGSILFLNDQAMYEKGRLLRNTERGEQAAKDADLAAGGVANAFSEA 100
S. f icaria 47 :PPPAMDSIDFLNDKAQYDAGKIYRNTPRGKQAYDDAHVAGDGVAAAFSNA 96
E.aerogenes 101:FGSPITEKDAPQLHKLLTNMIEDAGDLATRSAKEKYMRIRPFAFYGVSTC 150
E. blat tae 101 :FGSPITEKDAPALHKLLTNMIEDAGDLATRSAKDHYMRIRPFAFYGVSTC 150
K.plant i co la 101 :FGSPISEKDAPALHKLLTNMIEDAGDLATRGAKEKYMRIRPFAFYGVSTC 150
M. morgani i 101 :FGYPITEKDSPELYKLLTNMIEDAGDLATRSAKEHYMRIRPFAFYGTETC 150
P.Stuart i i 101tFGYPITEKDAPEIHKLLTNMIEDAGDLATRSAKEKYMRIRPFAFYGYATC 150
S. f icaria 97 :FGLEIAQRKTPELFKLVMKMREDAGDLATRSAKNHYMRIRPFAFYNEATC 146
E. aerogenes 151: NTTEQDKLSKNGSYPSGHTSIGWATALVLAEINPQRQNE ILKRGYELGES 200
E. bl at tae 151 :NTTEQDKLSKNGSYPSGHTSIGWATALVLAEINPQRQNEILKRGYELGQS 200
K. plant i cola 151: NTTEQDKLSKNGSYPSGHTSIGWATALVLAEINPQRQNEILKRGYELGES 200
M. morganii 151 :NTKDQKKLSTNGSYPSGHTSIGłATALVLAEVNPANQDAILERGYQLGQS 200
P. Stuart i i 151 :NTKDQDKLSKNGSYPSGHTAIGWASALVLSEINPENQDKILKRGYELGQS 200
S. f icaria 147 :RPDEESTLSKNGSYPSGHTTIGWATALVLAEINPARQGE ILQRGYDMGQS 196
E. blat tae 201 :RVICGYHWQSDVDAARVVGSAVVATLHTNPAFQQQLQKAKAEFAQHQKK 24 9
K.plant icola 201:RVICGYHWQSDYDAARIVGSAVVATLHTNPAFQQQLQKAKDEFAKQQK- 248
M. morganii 201 :RVICGYHWQSDVDAARIVGSAAVATLHSDPAFQAQLAKAKQEFAQKSQK 249
E, aerogenes 201 :RVICGYHWQSDVDAARIVGSAVVATLHTNPAFQQQLQKAKDEFAKTQK- 248
P. Stuart i i 201:RVICGYHWQSDYDAARIVASGAVATLHSNPEFQKQLQKAKDEFA-KLKK 248
S.ficaria 197:RVICGYHWQSDVTAARMAASAMVARLHAEPTFAAQLQKAKDEF-NGLKK 244
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.
Claims (23)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, znamienny tym, że nukleozyd poddaj e się działaniu kwaśnej fosfatazy i donora grupy fosforanowej wybranego z grupy obejmującej kwas polifosforowy lub jego sól, kwas fenylofosforowy lub jego sól i karbamoilofosforan lub jego sól przy pH od 3,0 do 5,5 i wydziela się 5'-fosforanowy ester nukleozydu.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nukleozyd poddaje się działaniu kwaśnej fosfatazy o sekwencji aminokwasowej zasadniczo identycznej z sekwencjąaminokwasową wybraną spośród sekwencji nr 4,11,18,20,22 oraz 24 w Liście Sekwencji, przy czym kwaśna fosfataza posiada mutację obniżającą jej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienia reszty aminokwasowej odpowiadające podstawieniu(om) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izolcucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nukleozyd poddaje się działaniu kwaśnej fosfatazy o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród sekwencji nr 4 oraz 11 w Liście Sekwencji lub sekwencji zasadniczo identycznej z sekwencjąaminokwasowąwybraną spośród sekwencji nr 4 oraz 11 w Liście Sekwencji.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nukleozyd poddaje się działaniu kwaśnej fosfatazy obejmującej sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji nr 18, 20, 22 oraz 24 w Liście Sekwencji, lub sekwencję zasadniczo identyczną z sekwencją aminokwasową wybraną spośród sekwencji nr 18, 20, 22 oraz 24 w Liście Sekwencji.
- 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że nukleozyd poddaje się działaniu kwaśnej fosfatazy posiadającej mutację wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji oraz podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 74 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 153 innym aminokwasem w sekwencji nr 11 w Liście Sekwencji.
- 6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że nukleozyd poddaje się działaniu kwaśnej fosfatazy posiadającej mutację wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 92 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 171 innym aminokwasem w sekwencji nr 18,20 lub 22 wLiście Sekwencji orazpodstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 88 i/łub reszty izoleucyny w pozycji 167 innym aminokwasem w sekwencji nr 24 w Liście Sekwencji.
- 7. Zmutowana kwaśna fosfataza obejmująca sekwencję aminokwasową zasadniczo identycznąz sekwencjąaminokwasowąnr 4 w Liście Sekwencji, posiadająca mutację obniżającąjej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienia reszt aminokwasowych odpowiadające podstawieniu(om) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
- 8. Zmutowana kwaśna fosfataza według zastrz. 7, znamienna tym, że posiada mutację wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
- 9. Zmutowana kwaśna fosfataza obejmująca sekwencję aminokwasowązasadniczo identyczną z sekwencjąaminokwasowąnr 11, 18, 20, 22 lub 24 w Liście Sekwencji, posiadająca mutację obniżającąjej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 74 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 153 innym aminokwasem w sekwencji nr 11 w Liście Sekwencji, podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 92 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 171 innym aminokwasem w sekwencji nr 18,20 lub 22 w Liście Sek183 293 wencji i podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 88 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 167 innym aminokwasem w sekwencji nr 24 w Liście Sekwencji.
- 10. Kwaśna fosfataza obejmująca sekwencję aminokwasową nr 11 w Liście Sekwencji .
- 11. Kwaśna fosfataza obejmująca sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji nr 20, 22 oraz 24 w Liście Sekwencji.
- 12. Gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę obejmującą sekwencję aminokwasowązasadniczo identycznąz sekwencjąaminokwasową nr 4 w Liście Sekwencji, posiadająca mutację obniżającąjej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienia reszty aminokwasowej odpowiadające podstawieniu(om) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
- 13. Gen według zastrz. 12, znamienny tym, że koduje zmutowaną kwaśną fosfatazę posiadającą mutację wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
- 14. Gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę obejmującą sekwencję aminokwasową zasadniczo identycznąz sekwencją nr 11, 18, 20, 22 lub 24 w Liście Sekwencji, posiadająca mutację obniżającąjej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 74 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 153 innym aminokwasem w sekwencji nr 11 w Liście Sekwencji, podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 92 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 171 innym aminokwasem w sekwencji nr 18,20 lub 22 w Liście Sekwencji i podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 88 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 167 innym aminokwasem w sekwencji nr 24 w Liście Sekwencji.
- 15. Gen kodujący kwaśną fosfatazę obejmującą sekwencję nr 11 w Liście Sekwencji.
- 16. Gen kodujący kwaśną fosfatazę obejmującą sekwencję wybraną spośród sekwencji nr 20, 22 oraz 24 w Liście Sekwencji.
- 17. Zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę obejmującą sekwencję aminokwasową zasadniczo identyczną z sekwencją aminokwasową nr 4 w Liście Sekwencji, posiadająca mutację obniżającąjej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienia reszt aminokwasowych odpowiadające podstawieniu(om) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
- 18. Zrekombinowany DNA według zastrz. 17, znamienny tym, że obejmuje gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę posiadającą mutację wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 72 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 151 innym aminokwasem w sekwencji nr 4 w Liście Sekwencji.
- 19. Zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę obejmuj ącąsekwencję amino kwasową zasadniczo identycznąz sekwencjąnr 11,18,19,20,22 lub 24 w Liście Sekwencji, posiadającą mutację obniżającąjej aktywność fosfomonoesterazy, wybraną spośród grupy obejmującej podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 74 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 153 innym aminokwasem w sekwencji nr 11 w Liście Sekwencji podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 92 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 171 innym aminokwasem w sekwencji nr 18,20 lub 22 w Liście Sekwencji i podstawienie(a) reszty glicyny w pozycji 88 i/lub reszty izoleucyny w pozycji 167 innym aminokwasem w sekwencji nr 24 w Liście Sekwencji.
- 20. Zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący kwaśną fosfatazę o sekwencji aminokwasowej nr 11 w Liście Sekwencji.
- 21. Zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący kwaśną fosfatazę o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród sekwencji nr 20, 22 oraz 24 w Liście Sekwencji.
- 22. Escherichia coli AJ13143 (FERM BP-5422).
- 23. Escherichia coli AJ13144 (FERM BP-5423).183 293
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14978195 | 1995-05-25 | ||
JP8094680A JPH0937785A (ja) | 1995-05-25 | 1996-03-26 | ヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造法 |
PCT/JP1996/001402 WO1996037603A1 (fr) | 1995-05-25 | 1996-05-24 | Procede de production du nucleoside-5'-phosphate |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL323493A1 PL323493A1 (en) | 1998-03-30 |
PL183293B1 true PL183293B1 (pl) | 2002-06-28 |
Family
ID=26435954
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL96323493A PL183293B1 (pl) | 1995-05-25 | 1996-05-24 | Sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, zmutowana kwaśna fosfataza, kwaśna fosfataza, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, gen kodujący kwaśną fosfatazę, zrekombinowany DNA oraz nowy szczep E.coli |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6010851A (pl) |
EP (1) | EP0832970B1 (pl) |
JP (2) | JPH0937785A (pl) |
KR (1) | KR100293047B1 (pl) |
CN (1) | CN1105778C (pl) |
CA (1) | CA2221774A1 (pl) |
DE (1) | DE69636852T2 (pl) |
ES (1) | ES2281082T3 (pl) |
HU (1) | HUP9900808A3 (pl) |
PL (1) | PL183293B1 (pl) |
WO (1) | WO1996037603A1 (pl) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4304727B2 (ja) * | 1996-11-21 | 2009-07-29 | 味の素株式会社 | ヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造法 |
CA2244314A1 (en) * | 1997-07-31 | 1999-01-31 | Sumitomo Chemical Co., Ltd. | Process for producing nucleoside derivatives |
TWI222464B (en) * | 1999-02-08 | 2004-10-21 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Process for producing purine nucleotides |
US6663211B2 (en) | 1999-04-26 | 2003-12-16 | Shuichi Aratsu | Printing device and roll paper |
WO2001018184A1 (fr) * | 1999-09-03 | 2001-03-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Enzyme produisant une variante de nucleoside-5'-phosphate |
JP2001302417A (ja) | 2000-02-15 | 2001-10-31 | Ajinomoto Co Inc | 胞子発芽阻害剤およびそれを用いた食品 |
JP2002112782A (ja) * | 2000-10-04 | 2002-04-16 | Ajinomoto Co Inc | 抗血栓活性を有する蛋白質及びその製造法 |
JP4649787B2 (ja) * | 2001-07-10 | 2011-03-16 | 味の素株式会社 | 5’−グアニル酸の製造法 |
WO2005045052A1 (ja) * | 2003-11-11 | 2005-05-19 | Mitsui Chemicals, Inc. | ペントース−5−リン酸エステルの製造方法 |
JP4760711B2 (ja) | 2004-03-31 | 2011-08-31 | 味の素株式会社 | バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を使用した発酵によるプリンヌクレオシド及びヌクレオチドの製造方法 |
US7326546B2 (en) | 2005-03-10 | 2008-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
BRPI0709635A2 (pt) * | 2006-04-24 | 2011-07-19 | Ajinomoto Kk | bactéria pertencendo ao gênero bacillus, e, métodos para produzir uma substáncia derivada de purina, e um nucleotìdeo de purina |
WO2007125782A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸または核酸の製造方法 |
JP5070895B2 (ja) * | 2007-03-16 | 2012-11-14 | 味の素株式会社 | リン酸リサイクルによるヌクレオチドの製造方法 |
JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
JP5440489B2 (ja) | 2008-02-25 | 2014-03-12 | 味の素株式会社 | 5’−グアニル酸の製造法 |
JP5636648B2 (ja) | 2009-08-10 | 2014-12-10 | 味の素株式会社 | 5’−グアニル酸の製造法 |
CN103451165B (zh) * | 2013-08-06 | 2015-08-05 | 浙江师范大学 | 3’,5’-二磷酸腺苷酸特异性3’-核苷酸酶及其构建方法和应用 |
CN103555687B (zh) * | 2013-09-12 | 2015-06-17 | 浙江工业大学 | 一种酸性磷酸酶突变体、编码基因、载体及应用 |
BR112016008830B1 (pt) | 2013-10-23 | 2023-02-23 | Ajinomoto Co., Inc | Método para produzir uma substância alvo |
CN103642823B (zh) * | 2013-11-15 | 2016-05-25 | 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 | 一种磷酸转移酶基因PhoC(I)及其制备方法与应用 |
EP3719135A1 (en) * | 2019-04-01 | 2020-10-07 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Enzymatic method for preparation of gdp-fucose |
CN113088504B (zh) * | 2021-04-12 | 2022-10-11 | 江南大学 | 一种改造的酸性磷酸酶及其应用 |
JP2024086106A (ja) | 2022-12-16 | 2024-06-27 | 味の素株式会社 | グアノシン-5’-リン酸の製造方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5022115B1 (pl) * | 1963-11-11 | 1975-07-28 | ||
JPS5223095A (en) * | 1975-08-12 | 1977-02-21 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of purinenucleotides |
JPS5241293A (en) * | 1975-09-29 | 1977-03-30 | Koichi Ogata | Method of manufacturing glucose-1-phosphate and glucose-6-phosphate |
JPS5356390A (en) * | 1976-10-28 | 1978-05-22 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of d-ribose-5'-phosphoric acid derivatives |
JPS5682098A (en) * | 1979-12-06 | 1981-07-04 | Ajinomoto Co Inc | Production of purine nucleoside-5'-monophosphate |
JPH0669386B2 (ja) * | 1987-03-18 | 1994-09-07 | 協和醗酵工業株式会社 | 5′−イノシン酸の製造法 |
JP3651036B2 (ja) * | 1993-12-27 | 2005-05-25 | 味の素株式会社 | ヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造法 |
-
1996
- 1996-03-26 JP JP8094680A patent/JPH0937785A/ja active Pending
- 1996-05-24 PL PL96323493A patent/PL183293B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-05-24 WO PCT/JP1996/001402 patent/WO1996037603A1/ja active IP Right Grant
- 1996-05-24 KR KR1019970708511A patent/KR100293047B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-05-24 CA CA002221774A patent/CA2221774A1/en not_active Abandoned
- 1996-05-24 US US08/750,145 patent/US6010851A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-24 HU HU9900808A patent/HUP9900808A3/hu unknown
- 1996-05-24 EP EP96914437A patent/EP0832970B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-24 ES ES96914437T patent/ES2281082T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-24 CN CN96195770A patent/CN1105778C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-24 DE DE69636852T patent/DE69636852T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-24 JP JP53556896A patent/JP3180349B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69636852T2 (de) | 2008-01-24 |
EP0832970A1 (en) | 1998-04-01 |
CN1191566A (zh) | 1998-08-26 |
KR100293047B1 (ko) | 2001-06-15 |
DE69636852D1 (de) | 2007-03-08 |
EP0832970B1 (en) | 2007-01-17 |
ES2281082T3 (es) | 2007-09-16 |
JPH0937785A (ja) | 1997-02-10 |
HUP9900808A3 (en) | 2001-09-28 |
EP0832970A4 (en) | 2004-08-11 |
KR19990022032A (ko) | 1999-03-25 |
CA2221774A1 (en) | 1996-11-28 |
US6010851A (en) | 2000-01-04 |
CN1105778C (zh) | 2003-04-16 |
HUP9900808A2 (hu) | 1999-07-28 |
JP3180349B2 (ja) | 2001-06-25 |
WO1996037603A1 (fr) | 1996-11-28 |
PL323493A1 (en) | 1998-03-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PL183293B1 (pl) | Sposób wytwarzania 5'-fosforanowego estru nukleozydu, zmutowana kwaśna fosfataza, kwaśna fosfataza, gen kodujący zmutowaną kwaśną fosfatazę, gen kodujący kwaśną fosfatazę, zrekombinowany DNA oraz nowy szczep E.coli | |
EP0857788B1 (en) | Method for producing nucleoside-5'-phosphate ester | |
US9896705B2 (en) | L-arabinose isomerase variants with improved conversion activity and method for production of D-tagatose using them | |
EP0816491B1 (en) | Process for producing nucleic acids | |
JP3941390B2 (ja) | 変異型酸性フォスファターゼ | |
KR20050004855A (ko) | 신규 폴리포스페이트:에이엠피 포스포트랜스퍼라제 | |
EP1318197B1 (en) | Thermotolerant ribonuclease h | |
US6566109B2 (en) | Gene for thermostable glucokinase, recombinant vector containing the same, transformant containing the recombinant vector and process for producing thermostable glucokinase using the transformant | |
EP0458971A1 (en) | Inosine guanosine kinase | |
US5756315A (en) | Inosine-guanosine kinase | |
KR20140111093A (ko) | 향상된 전환 활성을 가지는 l-아라비노스 이성화효소 변이체 및 이를 이용한 d-타가토스의 생산 방법 | |
JP2002000289A (ja) | ヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造法 | |
EP1712627B1 (en) | Polypeptide having amidase activity and gene thereof | |
JP2003250570A (ja) | 2’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製造方法及びこの中間体の製造方法、並びにこれらに使用する2−デオキシリボース5−リン酸アルドラーゼ遺伝子 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20080524 |