CN103642823B - 一种磷酸转移酶基因PhoC(I)及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磷酸转移酶基因PhoC(I)及其制备方法与应用。磷酸转移酶基因PhoC(I)，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。以具有磷酸转移酶活性的菌为筛选库，设计引物，然后采用限制性内切酶EcoRI随机切基因组以筛选获得具有磷酸转移酶活性的磷酸转移酶基因PhoC(I)。本发明的磷酸转移酶基因PhoC(I)较PCR扩增到的磷酸转移酶基因序列(PhoC？II)多了一段基因序列。利用该基因PhoC(I)制备的重组菌的酶活比采用PCR扩增所得基因PhoC(II)的重组菌酶活大大提升。所得重组菌以整细胞高效催化肌苷、鸟苷合成呈味核苷酸二钠（I+G）。不仅底物转化率高、专一性强，后续提取工艺也简单方便，可以用于产业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及磷酸转移酶基因的筛选、克隆表达及应用。
背景技术
呈味核苷酸主要指5`-肌苷酸二钠(5`-IMP)和5`-鸟苷酸二钠(5`-GMP)。这两种核苷酸均具有强烈的鲜味，能以几何级程度增加食品原料及味精的鲜味，是我国第二代调味品(超鲜味精)及第三代味精(复合调味料)、新一代鸡精调味品的主要原料，已作为重要的食品添加剂和药物中间体而被业界广泛关注。当前，以肌苷和鸟苷为原料加上合适的磷酸供体，采用化学法和酶法催化都可以制备5`-肌苷酸和5`-鸟苷酸，由于酶法具有催化条件温和、专一性较强、环境友好、特异性高以及成本低等特点(Asano和Y.MIHARA等,1999；崔桂友，2003；宋勇波和储炬等，2003；KUNINAKA,1960)，而受到国内外科研人员和产业界的极力推崇，发展迅速。其中，日本味之素公司已采用酶催化合成技术生产呈味核苷酸(三原康博，等.核苷-5’磷酸酯的制造方法(P)，2003，CN1105778C)，韩国希杰则利用直接发酵产肌苷酸(金灦洙，等.生产5’-肌苷酸的微生物和使其生产5’-肌苷酸的生产工艺(P)，2003，CN1406273A)。为提升国内核苷酸产业的国际竞争力，开发利用磷酸转移酶催化制备呈味核苷酸二钠的酶工程技术体系，具有重要的战略和现实意义。
在已发现具有磷酸转移酶活性的菌株研究最多的有：产气肠杆菌(Y.MIHARA,etal.AcidPhosphatase/PhosphotransferasefromEntericBacteria.JOURNALOFBIOSCIENCEANDBIOENGINEERING,2001,92(1):50-54.)、蟑螂埃希氏菌以及摩氏摩根菌(Y.MIHARA,etal.ImprovingthePyrophosphate-inosinePhosphotransferaseActivityofEscherichiablattaeAcidPhosphatasebySequentialSite-directedMutagenesis.Biosci.Biotechnol.Biochem,2004,68(5):1046-1050)，报道的磷酸转移酶基因大小为740-747bp，表达的磷酸转移酶蛋白大小为26KD左右，转化率在75％之间，当前急需表达转化率高、专一性强的蛋白表达体系，加速其产业化应用进程。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种磷酸转移酶基因PhoC(I)及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
磷酸转移酶基因PhoC(I)，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
磷酸转移酶基因PhoC(I)的制备方法，包括如下步骤：以具有磷酸转移酶活性的菌为筛选库，设计引物：
PhoC-upper:5'-CTGCGAATTCTTTGCGCTGGTTCCCGCCGGCAATGA-3’
phoC-lower:5'-GGGAAGCTTCTAATTTCGCTGTTTCGCAAACTCGTC-3’；
然后采用限制性内切酶EcoRI随机切基因组以筛选获得具有磷酸转移酶活性的磷酸转移酶基因PhoC(I)。所述具有磷酸转移酶活性的菌为产气肠杆菌、蟑螂埃希氏菌或摩氏摩根菌。
含有磷酸转移酶基因PhoC(I)的磷酸转移酶重组菌，由如下步骤制备而成：将磷酸转移酶基因PhoC(I)分别以pUC19，pBluscriptIISK(+)或pET28为表达载体，在BL21(DE3)、Top10或JM109宿主中进行表达。
上述磷酸转移酶重组菌的表达方法中，发酵的培养基每1000mL包含以下成分：NaCl25g，NaH2PO4.2H2O8g，MgSO4.7H2O5g，(NH4)2SO48g，酵母抽提物15g，蛋白胨20g，葡萄糖35g；发酵至OD为3-10时，需要添加0.2-0.5mM的诱导剂IPTG或质量浓度为0.2-0.5％的乳糖，诱导开始后葡萄糖的浓度控制在0.5-1.8％；发酵温度在20-37℃，诱导温度在15-34℃之间。
利用上述磷酸转移酶重组菌催化肌苷、鸟苷合成肌苷酸和鸟苷酸的方法中，温度为20-35℃，pH值为3.5-6.0。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明以具有磷酸转移酶活性的菌为筛选库，设计引物然后采用限制性内切酶EcoRI随机切基因组以筛选获得具有磷酸转移酶活性的磷酸转移酶基因PhoC(I)。该磷酸转移酶基因PhoC(I)较PCR扩增到的磷酸转移酶基因序列(PhoCII)多了一段基因序列。利用该基因PhoC(I)制备的重组菌的酶活比采用PCR扩增所得基因PhoC(II)的重组菌酶活大大提升。所得重组菌以整细胞高效催化肌苷、鸟苷合成呈味核苷酸二钠(I+G)。不仅底物转化率高、专一性强，后续提取工艺也简单方便，可以用于产业化生产。
附图说明
图1是磷酸转移酶基因PhoC(I)酶切后的电泳图。
图2是磷酸转移酶基因PhoC(II)PCR扩增获得的电泳图。
图3是重组菌SL-a与SL-b的酶活比较。
图4是表达酸性磷酸转移酶的蛋白图谱。
图5是整细胞催化合成肌苷酸的高效液相色谱。
具体的实施方式
实施例1表达磷酸转移酶基因重组菌的构建
(a)PCR扩增获得酸性磷酸转移酶基因
将产气肠杆菌、蟑螂埃希氏菌以及摩氏摩根菌接入LB培养基，37℃过夜培养，按Omega基因组提取试剂盒提取三株菌的基因组DNA，以Genebank提供的磷酸转移酶基因信息，采用primer5.0设计引物扩增目标片段，引物如表1所示：
表1磷酸转移酶(PhoC)基因引物
PCR扩增的反应体系和PCR反应条件如表2和表3所示：
将PCR扩增得到的磷酸转移酶基因，进行酶切、胶回收，连接到T载体pMD-18T，并导入到JM109，送测序得到磷酸转移酶基因序列PhoC(I)为747bp，备用。
(b)EcoRI酶切基因组筛选磷酸转移酶基因
用EcoRI酶切产气肠杆菌、蟑螂埃希氏菌以及摩氏摩根菌的基因组，随机连接到表达载体pBluscriptIISK(+)，导入宿主BL21(DE3)，在氨苄青霉素平板上长出的单菌落，长出单菌落后，分别挑单菌落到48孔板过夜培养，再分别用孔板进行催化实验。
在筛选的催化反应过程采用对硝基苯磷酸为磷酸供体，如表现有磷酸转移酶活性的片段则会因为对硝基苯磷酸失去磷酸根而显黄色，然后挑取反应液显黄色的菌落进行测序从而获得磷酸转移酶基因，在本实验中筛选获得一个磷酸转移酶基因片段(PhoC(I))，基因序列如SEQIDNO.1所示。
(C)表达磷酸转移酶重组菌的构建
将2段磷酸转移酶基因分别连接到pUC19，pBluscriptIISK(+)构建表达载体，导入宿主菌BL21(DE3)，JM109或者Top10等，构建酸性磷酸转移酶重组菌，结果表明，相比较与PCR扩增得到的磷酸转移酶基因phoC(II)构建的重组菌SL-a，酶切筛选获得的酸性磷酸转移酶基因PhoC(I)的重组菌SL-b的酶活是重组菌SL-a的1.75倍，结果如图3所示，重组菌SL-b表达的磷酸转移酶SDS蛋白图如图4所示。
实施例2重组菌SL-b发酵诱导产磷酸转移酶的工艺及其应用
重组菌SL-b发酵诱导产磷酸转移酶，所用的培养基包含以下成分(1000mL)：NaCl25g，NaH2PO4.2H2O8g，MgSO4.7H2O5g，(NH4)2SO48g，酵母抽提物15g，蛋白胨20g，葡萄糖35g。发酵至OD为3-10时，需要添加0.2-0.5mM的诱导剂IPTG或者浓度为0.2-0.5％的乳糖，诱导开始后葡萄糖的浓度控制在0.5-1.8％左右。以10-15％的接种量，发酵温度在20-37℃，诱导温度在15-34℃之间，过夜培养菌体浓度OD达到25-30左右。菌体酶活为80U/g湿菌体。
发酵培养酶液10000g离心10min获得菌体，放4℃冰箱备用。以肌苷和鸟苷为底物，焦磷酸钠为磷酸供体，在100mM，pH3.5-4.8，醋酸钠缓冲液下反应，转化率达到85％以上，肌苷反应液的高效液相图谱如图5所示，同时催化合成的IMP的碳谱和氢谱显示出，与化学法得到的IMP化学位移完全一致，结果表明酶法合成的IMP质量可靠，可用于产业化生产。
SEQUENCELISTING
<110>广东肇庆星湖生物科技股份有限公司
<120>一种磷酸转移酶基因PhoC(I)及其制备方法与应用
<130>
<160>3
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>999
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atgaaaaagcgcgttctcgccctctgcctcgccagcctgttttccgttaacgctttcgcg60
ctggtccctgccggcaatgatgcaaccaccaaaccggatctctattatctgaaaaatgca120
caggccatcgatagtctggcgctgttgccgccgccgccggaagttggcagcatcgcattt180
ttaaacgatcaggcgatgtatgagaaaggacggctgttgcgcaataccgaacgtggcaag240
caggcgcaggcagatgctgacctggccaaaggcgacgtcgcgaatgccttctccagcgct300
tttggttcgcccatcaccgaaaaagacgcgccgcagttacataagctgctgacaaatatg360
attgaagatgccggcgatctggccacccgcagcgcgaaagagaaatatatgcgcattcgc420
ccgtttgcgttctacggcgtttcaacctgtaacactaaagaccaggacaagctgtcgaaa480
aacggatcttacccttccggccatgggtcttccggttgggcaaccgcgctggtactggcg540
gagatcaatccgcagcggcaaaacgaaattctcaaacgcggctatgagttgggcgaaagc600
cgggttatctgcggctatcattggcagagcgatgtcgatgcggcgcggatagtcggctcg660
gcggtggtggcgaccctgcataccaacccggccttccaacagcagttgcagaaagcaaag720
gatgaattcgccaaaacgcagaagtaacgtcatcgccgttgaactcccggaggcggcgct780
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<210>2
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<212>DNA
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<400>3
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Claims (5)
1.磷酸转移酶基因PhoC(I)，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.含有权利要求1所述磷酸转移酶基因PhoC(I)的磷酸转移酶重组菌，其特征在于由如下步骤制备而成：将磷酸转移酶基因PhoC(I)分别以pUC19，pBluescriptIISK(+)或pET28为表达载体，在BL21(DE3)、Top10或JM109宿主中进行表达。
3.培养权利要求2所述磷酸转移酶重组菌的方法，其特征在于：发酵的培养基每1000mL包含以下成分：NaCl25g，NaH2PO4·2H2O8g，MgSO4·7H2O5g，(NH4)2SO48g，酵母抽提物15g，蛋白胨20g，葡萄糖35g；发酵至OD为3-10时，需要添加0.2-0.5mM的诱导剂IPTG或质量浓度为0.2-0.5％的乳糖，诱导开始后葡萄糖的浓度控制在0.5-1.8％；发酵温度在20-37℃，诱导温度在15-34℃之间。
4.利用权利要求2所述磷酸转移酶重组菌催化肌苷合成肌苷酸的方法，其特征在于，温度为20-35℃，pH值为3.5-6.0。
5.利用权利要求2所述磷酸转移酶重组菌催化鸟苷合成鸟苷酸的方法，其特征在于，温度为20-35℃，pH值为3.5-6.0。
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| CN1191566A (zh) * | 1995-05-25 | 1998-08-26 | 味之素株式会社 | 核苷－5’－磷酸酯的制造方法 |
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| Enhancement of nucleoside phosphorylation activity in an acid phosphatase.;Ishikawa K et al.;《Protein Engineering》;20020731;第15卷(第7期);第539-543页 * |
| 赵洪新等.产气肠杆菌磷酸酶基因克隆表达及其特性.《化工学报》.2008,第59卷(第8期),第2071-2078页. * |
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