DE602004012948T2

DE602004012948T2 - Mutierte Phosphoribosylpyrophosphat Synthetase und Methode zur L-Histidin-Produktion

Info

Publication number: DE602004012948T2
Application number: DE602004012948T
Authority: DE
Inventors: Elena Vitalievna Klyachko; Rustem Saidovich Shakulov; Yuri Ivanovich Kozlov
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-11-10
Filing date: 2004-11-10
Publication date: 2009-05-28
Anticipated expiration: 2024-11-11
Also published as: JP2005160474A; ATE391772T1; RU2282660C2; JP4852839B2; EP1529839A1; EP1529839B1; DE602004012948D1; RU2004120501A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Biotechnologie, insbesondere ein Verfahren zum Herstellen von L-Aminosäure, wie L-Histidin. Genauer gesagt betrifft. die vorliegende Erfindung die Verwendung eines neuen rückkopplungsresistenten Enzyms, das an der Biosynthese von Purinen und L-Histidin beteiligt ist. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung eine neue rückkopplungsresistente mutierte Phosphoribosylpyrophosphatsynthetase (PRPP-Synthetase) aus E. coli, d. h. Bakterien der Familie der Enterobacteriaceae, welches das Enzym enthält, und ein Verfahren zur Herstellung von L-Histidin durch Fermentation unter Verwendung der Bakterienstämme.
Hintergrund der Erfindung
Herkömmlich sind L-Aminosäuren industriell durch ein Fermentationsverfahren unter Einsatz von Stämmen von Mikroorganismen, die von natürlichen Quellen oder Mutanten derselben erhalten wurden, die speziell modifiziert wurden, um die L-Aminosäure-Produktivität zu erhöhen, hergestellt worden.
Es wurden viele Techniken offenbart, um die L-Aminosäure-Produktivität zu erhöhen, beispielsweise durch Transformation von Mikroorganismen durch rekombinante DNA (vgl. beispielsweise das US-Patent Nr. 4,278,765 ). Diese Techniken basieren auf einer Erhöhung der Aktivitäten der Enzyme, die an der Aminosäurebiosynthese und/oder an der Desensibilisierung der Zielenzyme gegenüber Rückkopplungshemmung durch die hergestellte L-Aminosäure beteiligt sind (vgl. beispielsweise die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 56-18596 (1981), WO 95/16042 oder die US Patentnummern 5,661,012 und 6,040,160 ).
5-Phosphoribosyl-α-1-pyrophosphat (Phosphoribosylpyrophosphat, PRPP) und Adenosin-5'-triphosphat (ATP) sind die anfäng lichen Substrate der Histidinbiosynthese. PRPP verbindet die Histidinbiosynthese mit der Biosynthese von Pyrimidinnucleotiden, Purinnucleotiden, Pyridinnucleotiden und Tryptophan (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Herausgeber: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).
Viele Nucleotide inhibieren die Aktivität von PRPP-Synthetase kompetitiv mit ATP. Der einzige potente Nucleotidinhibitor ist jedoch Adenosin-5'-diphosphat (ADP). Es kompletiert mit ATP und ist ein allosterischer Inhibitor, der an eine Stelle bindet, die sich vom aktiven Zentrum unterscheidet (Howe-Jensen, B. et al, J. Biol. Chem. 261: 6765–6771 (1986).
Mutanten mit einer veränderten PRPP-Synthetase sind sowohl in E. coli als auch in S. typhimurium erhalten worden. Eine der E. coli-Mutanten produziert PRPP-Synthetase mit einer 27-fachen Erhöhung des Km-Wertes für ATP, und das Enzym wird nicht mehr durch AMP inhibiert. Diese Mutation resultiert aus einer Substitution des Aspartat 128 durch Alanin (prsDA-Mutation). Eine S. typhimurium prs-Mutante ist temperaturempfindlich und hat nur 20% der Wildtyp-PRPP-Synthetaseaktivität. Dieses mutierte Enzym hat erhöhte Km-Werte für ATP und Ribose-5-phosphat und eine verringerte Empfindlichkeit bezüglich der Inhibition durch ADP. Die Mutation ist das Ergebnis des Austausches von Arginin 78 gegen Cystein (Escherichia coli and Salmonella, zweite Auflage, Herausgeber: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).
Es ist bekannt, dass die Überaktivität von menschlicher PRPP-Synthetase und die Resistenz gegen Purinnucleotid mit Abnormalitäten der Nervenentwicklung sowie mit erhöhtem Blutharnsäurespiegel und Gicht in Verbindung stehen (Becker M. A. et al, Arthritis Rheum, 18: 6 Suppl: 687–94 (1975); Zoref E. et al, J. Clin. Invest., 56(5): 1093–9 (1975)). Eine Harnsäureüberproduktion in Individuen mit überaktiver PRPP-Synthetase resultiert aus einer erhöhten Produktion von PRPP und einer daraus folgenden Beschleunigung der Purinnucleotid-Synthese de novo. Es wurde gezeigt, dass die Überaktivität von PRPP-Synthetase das Ergebnis einer Mutation von A nach G bei Nucleotid 341 des mutierten Gens ist, was einer Substitution von Aspargin nach Serin am Aminosäurerest 113 des reifen Proteins entspricht. Eine solche mutierte PRPP-Synthetase ist gegen Purinnucleotide resistent, welche das normale Enzym durch einen Mechanismus inhibieren, der in Bezug auf ATP nicht kompetitiv ist (Roessler, B. J. et al. J. Biol. Chem., v. 268, No 35, 26476–26481 (1993); Becker, M. A. et al, J. Clin. Invest., 96(5): 2133–41 (1995)).
Ein Verfahren zum Herstellen von Purinnucleosiden über Fermentation von Mikroorganismen der Gattung Escherichia und mit der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosiden, wobei sie eine prsDA-Mutation tragen, ist bekannt (europäische Patentanmeldung EP 1004663A1 ). Es gibt jedoch derzeit keine Berichte, die eine mutierte Bakterien PRPP-Synthetase beschreiben, die gegen Purinnucleotide rückkopplungsresistent ist, und es gibt keine Berichte über die Verwendung einer solchen mutierten PRPP-Synthetase zur Verbesserung der L-Histidin-Produktion unter Einsatz von L-Histidin produzierenden Stämmen.
Roessler Blake J. et al.: "Human X-linked phosphoribosylpyrophosphate synthetase superactivity is associated with distinct point mutations in the PRPS1 gene". Journal of Biological Chemistry, vol. 268, Nr. 35, 1993, Seiten 26476–26481, XP002312502 ISSN: 0021-9258, offenbaren, dass eine mutierte Form von menschlichem PRPP mit einer Asp-Ser-Substitution an der Aminosäureposition 113 des Proteins eine Resistenz gegen Rückkopplungshemmung durch Purinnucleotide zeigt.
Tatibana M. et al: "Mammalian phosphoribosyl-pyrophosphate synthetase", Advances in Enzyme Regulation, 1995, vol. 35, Seiten 229–249, XP002312503 ISSN: 0065-2571 offenbart, dass die Position 113 von Säuger PRPP der Position 115 in E. coli entspricht.
Offenbarung der Erfindung
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer neuen mutierten bakteriellen PRPP-Synthetase, die Entwicklung eines L-Histidin produzierenden Stammes mit erhöhter Produktion von L-Histidin und die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von L-Histidin unter Einsatz des Stammes.
Dieses Ziel wurde durch Konstruieren einer neuen mutierten PRPP-Synthetase aus E. coli erreicht. Auf der Grundlage der hohen Konservierung des prsA-Gens (Taira M. et al., J. Biol. Chem., Vol. 262, No 31, S. 14867–14870 (1987)) wurde die mutierte PRPP-Synthetase aus E. coli mit einer Mutation, die der menschlichen Mutation Asn-113 entspricht, konstruiert. Es wurde gezeigt, dass die Verwendung einer solchen mutierten PRPP-Synthetase die L-Histidin-Produktion erhöhen kann, wenn zusätzliche Kopien in die Zellen des L-Histidin produzierenden Stammes eingeführt werden. Somit wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft folgendes:

1). Eine mutierte bakterielle Phosphoribosylpyrophosphatsynthetase (PRPP-Synthetase), worin der Aspartatrest, welcher der Position 115 in einer Wildtyp-Phosphoribosylpyrophosphat-Synthetase aus Escherichia coli entspricht, durch einen Serinrest ersetzt ist und die Rückkopplungshemmung durch Purinnucleotide ausgeschaltet ist.
2. Eine für die mutierte PRPP-Synthetase nach Punkt 1) kodierende DNA.
3. Bakterium der Familie Enterobacteriaceae, welches die DNA nach Punkt 2) enthält und die Fähigkeit zur Produktion von L-Histidin hat.
4. Bakterium nach Punkt 3), worin die Aktivität der mutierten PRPP-Synthetase verstärkt ist.
5. Bakterium nach Punkt 4), worin das Bakterium zur Gattung Escherichia gehört.
6. Bakterium nach Punkt 4), worin die Aktivität der mutierten PRPP-Synthetase durch Erhöhen der exprimierten Menge des mutierten PRPP-Synthetasegens verstärkt ist.
7. Bakterium nach Punkt 6), worin die Aktivität der mutierten PRPP-Synthetase durch Erhöhen der Kopienzahl des mutierten PRPP-Synthetasegens oder durch Modifizieren einer Expressionskontrollsequenz des Gens, so dass die Expression des Gens verstärkt sein sollte, erhöht ist.
8. Bakterium nach Punkt 7), worin die Kopienzahl durch Einführen zusätzlicher Kopien des mutierten PRPP-Synthetasegens in das Chromosom des Bakteriums erhöht ist.
9. Verfahren zum Herstellen von L-Histidin, welches das Kultivieren des Bakteriums nach einem der Punkte 3) bis 8) in einem Kulturmedium zur Produktion und Anhäufung von L-Histidin in dem Kulturmedium und das Gewinnen des L-Histidins aus dem Kulturmedium umfasst.
10. Verfahren nach Punkt 9), worin das Bakterium eine verstärkte Expression der Gene für die Histidin-Biosynthese aufweist.

Die PRPP-Synthetase mit einer Mutation an dem Aspartatrest, der der Position 115 der Wildtyp-PRPP-Synthetase entspricht, kann als "die mutierte PRPP-Synthetase" bezeichnet werden, eine DNA. die für die mutierte PRPP-Synthetase kodiert, kann als "das mutierte prsA-Gen" oder "das mutierte PRPP-Synthetasegen" bezeichnet werden, und eine PRPP-Synthetase ohne Substitution kann als "eine Wildtyp PRPP-Synthetase" bezeichnet werden.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden eingehender erklärt.
(1) Mutierte PRPP-Synthetase und mutiertes prsA-Gen
Es ist bekannt, dass die genetische und funktionelle Basis der Überaktivität von menschlicher PRPP-Synthetase, die mit der Resistenz gegen Purinnucleotid in Zusammenhang steht, durch eine einzige Basensubstitution in dem prsA-Gen verursacht wird (Roessler, B. J. et al. J. Biol. Chem., Vol. 268, Nr. 35, 26476–26481 (1993)). Auf der Grundlage der hohen Konservierung des prsA-Gens (Taira M. et al., J. Biol. Chem., Vol. 262, Nr. 31, S. 14867–14870 (1987)), wurde die mutierte PRPP-Synthetase aus E. coli mit einer Mutation, die der menschlichen Mutatio Asn-113 entspricht, konstruiert. Eine solche Mutation ist für alle bakteriellen PRPP-Synthetasen unbekannt. Der Ausdruck "bakterielle PRPP-Synthetase" bedeutet die PRPP-Synthetase, die in Bakterien der Familie der Enterobacteriaceae, in Corynebakterien, Bakterien der Gattung Bacillus und dergleichen vorhanden ist. Die Familie der Enterobacteriaceae umfasst Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattung Escherichia ist bevorzugt.
Die Substitution des Aminosäurerests, der dem Aspartat an der Position 115 der PRPP-Synthetase von Escherichia coli entspricht, durch eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise Serin, in der Aminosäuresequenz der Wildtyp PRPP-Synthetase [EC 2.7.6.1] aus E. coli führt zur Bildung eines mutierten Proteins, das gegen Purinnucleotide rückkopplungsresistent ist, beispielsweise gegen Purin-di- und mononucleotiden, hauptsächlich Guanosin-5'-diphosphat (GDP), Adenosin-5'-diphosphat (ADP) und Adenosin-5'-monophosphat (AMP).
Die mutierte PRPP-Synthetase wird auf der Grundlage der Sequenzen durch Einführen von Mutationen in ein Wildtyp prsA-Gen unter Einsatz üblicher Verfahren erhalten. Als Wildtyp prsA-Gen kann das prsA-Gen aus E. coli genannt werden (Nucleotidnummern 1260151 bis 1261098 in der Sequenz der GenBank Accession NC_000913, gi: 16129170, SEQ ID NR.: 1). Das prsA-Gen ist zwischen den ORFs von ychM und ychB auf dem Chromosom des E. coli-Stammes K-12 lokalisiert. Deshalb kann das prsA-Gen durch PCR (Polymerasekettenreaktion; vgl. White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) unter Verwendung von Primern, die auf der Grundlage der Nucleotidsequenz des Gens hergestellt worden sind, erhalten werden. Gene, die für PRPP-Synthetase anderer Mikroorganismen kodieren, können auf ähnliche Weise erhalten werden.
Der Ausdruck "Aktivität von PRPP-Synthetase" bedeutet die Aktivität, die Reaktion der Bildung von 5-Phosphoribosyl-α-1-pyrophosphat (PRPP) aus Ribose-5-phosphat und ATP unter Freisetzung von AMP zu katalysieren. Die PRPP-Synthetaseaktivität der Extrakte und das Ausmaß der Inhibition durch ADP können unter Einsatz des teilweise modifizierten Verfahrens von K. F. Jensen et al. gemessen werden (Analytical Biochemistry, 98, 254–263 (1979)). Im speziellen kann [α-³²P]ATP als das Substrat eingesetzt werden, und [³²P]AMP, das durch die Reaktion produziert wird, sollte gemessen werden.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "L-Aminosäurerest, der der Position 115 entspricht", einen Aspartatrest, der dem Aminosäurerest der Position 115 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 entspricht. Die Position des Aminosäurerests kann eine andere sein. Wenn beispielsweise ein Aminosäurerest am N-terminalen Abschnitt eingeführt wird, wird der Aminosäurerest, der sich inhärent an der Position 115 befindet, zur Position 116. In einem solchen Fall wird der Aminosäurerest, der der ursprünglichen Position 115 entspricht, als der Aminosäurerest an der Position 115 in der vorliegenden Erfindung bezeichnet.
Um den L-Aminosäurerest, der der Position 115 von PRPP-Synthetase aus E. coli entspricht, zu bestimmen, ist es erforderlich, die Aminosäuresequenz von PRPP-Synthetase aus E. coli (SEQ ID NR: 2) und die Aminosäuresequenz der PRPP-Synthetase aus einem interessierenden Bakterium zu vergleichen und die L-Aminosäure zu bestimmen, die in der PRPP-Synthetase aus dem interessierenden Bakterium der Position 115 entspricht.
Die DNA, die für die mutierte PRPP-Synthetase kodiert, kann durch Isolieren einer DNA, die mit der DNA einer bekannten PRSA-Gen-Sequenz oder eines Teils davon als Sonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert und die für ein Protein mit PRPP-Synthetaseaktivität kodiert, aus einer Zelle, welche die mutierte PRPP- Synthetase enthält, die einer Mutationsbehandlung unterworfen wird, erhalten werden.
Der hier verwendete Ausdruck "stringente Bedingungen" bezeichnet eine Bedingung, unter der ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildet wird und ein nicht spezifisches Hybrid nicht gebildet wird. Es ist schwierig, diese Bedingung unter Verwendung numerischer Werte genau auszudrücken. Beispielsweise umfassen stringente Bedingungen jedoch eine Bedingung, unter der DNAs mit hoher Homologie, beispielsweise DNAs mit einer Homologie von nicht weniger als 50% hybridisiert werden und DNAs mit einer geringeren Homologie nicht miteinander hybridisiert werden.
Um den Grad der Protein- oder DNA-Homologie abzuschätzen, können mehrere Berechnungsverfahren eingesetzt werden, beispielsweise eine BLAST-Recherche, FASIA-Recherche und CrustalW.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ist ein heuristischer Recherchealgorithmus, der durch die Programme blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn und tblastx verwendet wird. Diese Programme verwenden die statistischen Methoden von Karlin, Samuel und Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 2264–68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873–7). Das FASIA-Rechercheverfahren wird von W. R. Pearson beschrieben ("Rapid and Sensitive Sequenz Comparison with FASTP and FASIA", Methods in Enzymology, 1990 183: 63–98). Das ClustalW-Verfahren wird von Thompson J. D., Higgins D. G. und Gibson T. J. beschrieben ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple Sequenz alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673–4680).
Alternativ dazu sind stringente Bedingungen beispielsweise eine Bedingung, unter der DNA's miteinander bei einer Salzkonzentration hybridisiert werden, die einer üblichen Bedingung beim Waschen in der Southern-Hybridisierung entspricht. d. h. 60°C, 1 × SSC, 0,1% SDS, vorzugsweise 0,1 × SSC, 0,1% SDS. Als Sonde für die DNA, die für verschiedene Varianten kodiert und mit dem prsA-Gen hybridisiert, kann auch eine Teilsequenz der Nucleotidsequenz der SEQ ID NR: 1 eingesetzt werden. Eine solche Sonde kann durch PCR unter Einsatz von Oligonucleotiden, die auf der Grundlage der Nucleotidsequenz der SEQ ID NR: 1 hergestellt werden, als Primer und eines DNA-Fragments, das die Nucleotidsequenz der SEQ ID NR: 1 enthält, als Matrize hergestellt werden. Wenn ein DNA-Fragment mit einer Länge von etwa 300 Basenpaaren als Sonde eingesetzt wird, bestehen die Waschbedingungen für die Hybridisierung beispielsweise aus 50°C, 2 × SSC und 0,1% SDS. Die Dauer des Waschverfahrens hängt von der Art der für das Blotten eingesetzten Membran ab und wird vom Hersteller empfohlen. Beispielsweise ist die empfohlene Waschdauer der Hybond TM N+ Nylonmembran (Amersham) bei stringenten Bedingungen 15 Minuten.
Das Gen, das unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen hybridisierbar ist, umfasst solche mit einem Stoppkodon innerhalb einer kodierenden Region des Gens und solche ohne Aktivität aufgrund der Mutation des aktiven Zentrums. Solche Unannehmlichkeiten können jedoch einfach durch Legieren des Gens mit einem käuflich erwerbbaren Expressionsvektor und durch Untersuchen der PRPP-Synthetaseaktivität des exprimierten Proteins beseitigt werden.
(2) Erfindungsgemäßes Bacterium
Das erfindungsgemäße Bacterium ist ein L-Histidin produzierendes Bacterium der Familie Enterobacteriaceae, welches eine DNA enthält, die für die mutierte PRPP-Synthetase der vorliegenden Erfindung kodiert. Außerdem ist das erfindungsgemäße Bakterium ein L-Histidin produzierendes Bakterium der Familie Enterobacteriaceae mit einer erhöhen Aktivität der mutierten PRPP-Synthetase gemäß der vorliegenden Erfindung. Genauer gesagt ist das erfindungsgemäße Bakterium ein L-Histidin produzierendes Bacterium der Familie Enterobacteriaceae, wobei die L-Histidin-Produktion des Bacteriums durch Erhöhen der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins in einer Zelle des Bacteriums erhöht wird. Genauer gesagt ist das erfindungsgemäße Bacterium ein L-Histidin produzierendes Bacterium der Gattung Escherichia, wobei die L-Histidin-Produktion durch das Bacterium durch Erhöhen der Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms, nämlich der mutierten PRPP-Synthetase, in einer Zelle des Bacteriums verstärkt wird. Genauer gesagt enthält das erfindungsgemäße Bacterium die DNA mit einem mutierten prsA-Gen, das in dem Chromosom oder in einem Plasmid in dem Bacterium überexprimiert wird, und hat eine erhöhte Fähigkeit zur Produktion von L-Histidin.
"Bacterium, das die Fähigkeit zur Produktion von L-Histidin hat" bedeutet ein Bacterium, das L-Histidin in einem Medium anhäufen kann, wenn das erfindungsgemäße Bacterium in dem Medium kultiviert wird. Die L-Histidin produzierende Aktivität kann durch Züchten verliehen oder verstärkt werden. Der hier verwendete Ausdruck "Bacterium mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Histidin" bedeutet auch ein Bacterium, das L-Histidin in einem Kulturmedium in einer Menge, die höher ist als beim Wildtyp oder dem Ausgangsstamm, produzieren und anhäufen kann, und bedeutet vorzugsweise, dass der Mikroorganismus in einem Medium eine Menge von nicht weniger als 0,5 g/L, stärker bevorzugt nicht weniger als 1,0 g/L L-Histidin produzieren und anhäufen kann.
Die Familie der Enterobacteriaceae umfasst Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattung Escherichia ist bevorzugt.
Der Ausdruck "Ein Bacterium der Gattung Escherichia" bedeutet, dass das Bacterium nach der Klassifikation, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Mikrobiologie bekannt ist, als Gattung Escherichia klassifiziert wird. Als Beispiele des Mikroorganismus der Gattung Escherichia, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können Escherichia coli (E. coli) genannt werden.
Der Ausdruck "Aktivität der mutierten PRPP-Synthetase wird verstärkt" bedeutet, dass die Aktivität pro Zelle höher wird als in einem nicht modifizierten Stamm, beispielsweise einem Wildtyp-Stamm. Beispielsweise können ein Fall, bei dem die Anzahl der mutierten PRPP-Synthetasemoleküle pro Zelle erhöht wird, ein Fall, bei dem die spezifische Aktivität pro mutiertem PRPP-Synthetasemolekül erhöht wird, und dergleichen genannt werden. Außerdem kann als Wildtyp-Stamm, der als Vergleichsobjekt dient, beispielsweise Escherichia coli K-12 genannt werden. Als Ergebnis der Erhöhung der intrazellulären Aktivität der mutierten PRPP-Synthetase wird eine Wirkung dahingehend beobachtet, dass die Menge der L-Histidin-Anhäufung in einem Medium erhöht wird.
Die Verstärkung der mutierten PRPP-Synthetaseaktivität in einer Bakterienzelle kann durch Erhöhung der Expression eines für die mutierte PRPP-Synthetase kodierenden Gens erreicht werden. Als das mutierte PRPP-Synthetasegen können beliebige Gene, die für mutierte PRPP-Synthetase aus Bakterien der Familie Enterobacteriaceae kodieren, und Gene, die von anderen Bakterien, wie coryneformen Bakterien, abgeleitet sind, eingesetzt werden. Unter diesen sind Gene aus Bakterien der Gattung Escherichia bevorzugt.
Die Transformation von Bakterien mit einer DNA, die für ein Protein kodiert, bedeutet das Einführen der DNA in Bakterienzellen beispielsweise durch herkömmliche Verfahren zur Erhöhung der Expression des Gens, das für das erfindungsgemäße Protein kodiert, und zur Erhöhung der Aktivität des Proteins in der Bakterienzelle.
Die Verfahren zur Verstärkung der Genexpression umfassen das Erhöhen der Genkopienzahl. Die Einführung eines Gens in einen Vektor, der in einem Bacterium der Gattung Escherichia funktionieren kann, erhöht die Kopienzahl des Gens. Für solche Zwecke können Mehrkopienvektoren vorzugsweise eingesetzt werden. Der Mehrkopienvektor ist beispielsweise pBR322, pUC19, pBluescript KS⁺, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b oder dergleichen. Daneben kann eine Verstärkung der Genexpression durch Einführen mehrerer Kopien des Gens in das Bakterienchromosom beispielsweise durch das Verfahren der homologen Rekombination oder dergleichen erreicht werden.
Andererseits kann die Erhöhung der Genexpression dadurch erreicht werden, dass die erfindungsgemäße DNA unter die Kontrolle eines stärkeren Promotors anstelle des nativen Promotors gesetzt wird. Die Stärke des Promotors wird durch die Häufigkeit der RNA-Syntheseinitiationen definiert. Verfahren zur Beurteilung der Stärke von Promotoren und Beispiele leistungsstarker Promotoren sind in Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987–2994) beschrieben. Beispielsweise ist der PR-Promotor als leistungsstarker konstitutiver Promotor bekannt. Andere bekannte leistungsstarke Promotoren sind der PL-Promotor, der lac-Promotor, der trp-Promotor, der trc-Promotor, dessen Phagen λ und dergleichen.
Die Verstärkung der Translation kann erreicht werden, indem in die erfindungsgemäße DNA eine effizientere Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz) anstelle der nativen SD-Sequenz eingeführt wird, wobei die SD-Sequenz ein Abschnitt stromaufwärts des Startkodons der mit der 16S RNA des Ribosoms wechselwirkenden mRNA ist (Shine J. and Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1974, 71, 4, 1342–6).
Die Verwendung des leistungsstarken Promotors kann mit der Vervielfachung der Genkopien kopiert werden.
Verfahren zur Präparation chromosomaler DNA, zur Hybridisierung, PCR, Präparation von Plasmid DNA, Verdauen und Ligieren von DNA, Transformation, Selektion eines Oligonucleotids als Primer und dergleichen können übliche Verfahren sein, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Verfahren werden in Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) und dergleichen beschrieben.
Das erfindungsgemäße Bacterium kann durch Einführen der vorstehend erwähnten DNAs in ein Bacterium, das inhärent die Fähigkeit zur Produktion von L-Histidin hat, erhalten werden. Alternativ dazu kann das erfindungsgemäße Bacterium durch Übertragen der Fähigkeit zur Produktion von L-Histidin auf das Bacterium, das bereits die DNAs enthält, erhalten werden.
Als Ausgangsstamm, der hinsichtlich der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins verstärkt werden soll, können Bakterien der Gattung Escherichia mit L-Histidin produzierender Fähigkeit genannt werden, wobei die Stämme mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Histidin zur Gattung Escherichia gehören, wie der Stamm E. coli 24 (VKPM B-5945, russisches Patent 2003677 ); der Stamm E. coli 80 (VKPM B-7270, russisches Patent 2119536 ); die Stämme E. coli NRRL B-12116-B12121 ( US-Patent 4388405 ); die Stämme E. coli H-9342 (FERM BP-6675) und H-9343 (FERM BP-6676) ( US-Patent 6344347 ); der Stamm E. coli H-9341 (FERM BP-6674) ( europäische Patentanmeldung 1085087A2 ); der Stamm E. coli AI80/pFM201 ( US-Patent 6258554 ) und dergleichen.
Es ist wünschenswert, dass das L-Histidin produzierende Bacterium außerdem so modifiziert wird, dass es eine verstärkte Expression der L-Histidin-Biosynthese aufweist. Gene, die für die L-Histidin-Biosynthese effektiv sind, umfassen das hisG-Gen und Gene des hisBHAFI-Operons, vorzugsweise das hisG-Gen, welches für ATP-Phosphoribosyltransferase kodiert, das gegenüber Rückkopplungshemmung durch L-Histidin unempfindlich ist. ( russische Patente 2003677 und 2119536 ).
(3) Erfindungsgemäßes Verfahren
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst ein Verfahren zur Herstellung von L-Histidin, welches die Stufen umfasst, bei denen das erfindungsgemäße Bacterium in einem Kulturmedium kultiviert wird, wobei zugelassen wird, dass L-Histidin in dem Kulturmedium produziert und angehäuft wird, und dass L-Histidin aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
In der vorliegenden Erfindung können die Kultivierung, die Gewinnung und die Reinigung von L-Histidin aus dem Medium und dergleichen auf ähnliche Weise wie bei herkömmlichen Fermentationsverfahren, bei denen eine Aminosäure unter Einsatz eines Mikroorganismus produziert wird, durchgeführt werden. Ein für die Kultivierung eingesetztes Medium kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium sein, solange das Medium eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle und Mineralien sowie bei Bedarf eine geeignete Menge von Nährstoffen enthält, die der Mikroorganismus für sein Wachstum braucht. Die Kohlenstoffquelle kann verschiedene Kohlenhydrate, wie Glucose und Saccharose, und verschiedene organische Säuren enthalten. In Abhängigkeit von der Art der Assimilation des eingesetzten Mikroorganismus kann Alkohol, einschließlich Ethanol und Glycerin, eingesetzt werden. Als Stickstoffquelle werden verschiedene Ammoniumsalze, wie Ammoniak und Ammoniumsulfat, andere Stickstoffverbindungen, wie Amine, natürliche Stickstoffquellen, wie Pepton, Sojabohnenhydrolysat und verdaute fermentative Mikroorganismen eingesetzt. Als Mineralien werden Kaliummonophosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Calciumchlorid und dergleichen eingesetzt. Einige zusätzliche Nährstoffe können bei Bedarf dem Medium zugesetzt werden. Wenn beispielsweise der Mikroorganismus für sein Wachstum Prolin benötigt, (Prolinauxotrophie), kann die ausreichende Menge Prolin für die Kultivierung zu dem Medium gegeben werden.
Die Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, wie als Schüttelkultur und als Rührkultur unter Belüftung, bei einer Temperatur von 20 bis 42°C, vorzugsweise 37 bis 40°C durchgeführt. Der pH-Wert der Kultivierung ist üblicherweise zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,2. Der pH-Wert der Kultivierung kann mit Ammoniak, Calciumcarbonat, verschiedenen Säuren, verschiedenen Basen und Puffern eingestellt werden. Üblicherweise führt eine 1- bis 5-tägige Kultivierung zu der Anhäufung der Zielaminosäure in dem Flüssigmedium.
Nach der Kultivierung können Feststoffe, wie Zellen, aus dem Flüssigmedium durch Zentrifugation oder Membranfiltration entfernt werden, und dann kann die Ziel-L-Aminosäure durch Ionen austausch-, Konzentrations- und Kristallisationsverfahren gewonnen und gereinigt werden.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Beispiele genauer erklärt. In den Beispielen sind die Aminosäuren in der L-Konfiguration, wenn nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1: Klonierung des Wildtyp prsA-Gens aus E. coli und Konstruktion der mutierten prsDA- und prsDS-Gene.
Die gesamte Nucleotidsequenz des Stammes E. coli K-12 wurde bereits ermittelt (Science, 277, 1453–1474, 1997). Auf der Grundlage der berichteten Nucleotidsequenz wurden die in SEQ ID Nr. 3 (Primer 1) und SEQ ID Nr. 4 (Primer 2) angegebenen Primer für die Amplifikation des prsA-Gens synthetisiert. Der Primer 1 enthält die BglII-Erkennungsstelle, die an seinem 5'-Ende eingeführt ist. Der Primer 2 enthält eine XbaI-Erkennungsstelle, die an seinem 5'-Ende eingeführt ist.
Die chromosomale DNA von E. coli K12, die als Matrize für die PCR eingesetzt wird, wurde durch ein übliches Verfahren präpariert. Die PCR wurde mit dem "Applied Biosystems GeneAmp PCR System 2400" unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: anfängliche DNA-Denaturierung bei 95°C während 3 Minuten, dann 30 Zyklen der Denaturierung bei 95°C während 30 Sekunden, Annealing bei 60°C während 60 Sekunden und Verlängerung bei 72°C während 120 Sekunden; die Endpolymerisation wurde 7 Minuten bei 72°C unter Einsatz von Taq-Polymerase (Fermentas, Litauen) durchgeführt. Das erhaltene PCR-Fragment, welches das prsA-Gen ohne Promotor enthielt, wurde mit BglII und XbaI behandelt und unter dem PR-Promotor in den integrativen Vektor pMW119-PR, der vorher mit denselben Enzymen geschnitten worden war, eingeführt. Der Vektor pMW119-PR wurde aus dem käuflich erwerbbaren Vektor pMW119 durch Einführen des PR-Promotors aus dem Phagen λ und der attR- und attL-Stellen, die für die Mu-Integration erforderlich sind, konstruiert. Auf diese Weise wurde das Plasmid pMW-PR-prsA erhalten.
Das mutierte prsDA-Gen (Substitution von Aspartat 128 gegen Alanin in der PRPP-Synthetase, die von dem mutierten prsDA-Gene) kodiert wird) wurde durch PCR wie vorstehend beschrieben unter Verwendung der Primer 1 (SEQ ID Nr. 3) und 2 (SEQ ID Nr. 4) und des Plasmids pUCprsDA als Matrize erhalten. Das Plasmid pUCprsDA ist in der europäischen Patentanmeldung EP1004663A1 beschrieben. Das erhaltene PCR-Produkt wurde mit BglII und XbaI behandelt und unter dem PR-Promotor in den integrativen Vektor pMW119-PR, der vorher mit denselben Enzymen behandelt worden war, eingeführt. Auf diese Weise wurde das Plasmid pMW-PR-prsDA erhalten.
Das mutierte prsDS-Gen (Substitution von Aspartat 115 gegen Serin in der PRPP-Synthetase, die von dem mutierten prsDS-Gen kodiert wird) wurde durch zwei aufeinanderfolgende PCRs konstruiert. In der ersten Stufe wurden zwei Fragmente des Gens unter Einsatz des Primers 1 (SEQ ID Nr. 3) und des Primers 3 (SEQ ID Nr. 5) für das erste Fragment und des Primers 2 (SEQ ID Nr. 4) und des Primers 4 (SEQ ID Nr. 6) für das zweite Fragment synthetisiert. Die chromosomale DNA von E. coli K12 wurde als Matrize eingesetzt. Dann wurden die erhaltenen PCR-Produkte durch Elektrophorese aufgetrennt und aus dem Gel eluiert. In der zweiten PCR wurden diese zwei DNA-Fragmente verknüpft, so dass ein mutiertes prsDS-Gen vollständig erhalten wurde. Das erhaltene PCR-Fragment, welches das prsDS-Gen ohne Promotor enthielt, wurde mit BglII und XbaI behandelt und unter dem PR-Promotor in dem integrativen Vektor pMW119-PR, der vorher mit denselben Enzymen behandelt worden war, eingeführt. Auf diese Weise wurde das Plasmid pMW-PR-prsDS erhalten.
Beispiel 2: Wirkung der erhöhten Expression des purH-Gens auf die L-Histidin-Produktion
Drei L-Histidin produzierende plasmidlose Stämme, die zusätzliche Kopien der prsA-, prsDA- oder prsDS-Gene enthielten, die in das Bakterienchromosom integriert waren, wurden konstruiert. Der L-Histidin produzierende Stamm E. coli 80 wurde als Ausgangsstamm für die Integration der prsA-, prsDA- und prsDS-Gene in das Bakterienchromosom eingesetzt. Der Stamm 80 wurde in dem russischen Patent 2119536 beschrieben und bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (Russland, 113545 Moskau, 1. Dorozhny proezd, 1) unter der Hinterlegungsnummer VRPM B-7270 hinterlegt.
Die Integration der Gene in das Chromosom des Stammes 80 wurde in zwei Stufen durchgeführt. In der ersten Stufe wurde der Histidin produzierende Stamm 80 mit dem Helferplasmid, welches das Replicon rep(p15A), ein Transposase-Gen (Gene ctso2, ner, A, B aus dem Phagen Mu-cts) und einen Tet^R-Marker enthielt, transformiert. In der zweiten Stufe wurde der erhaltene Stamm mit dem Plasmid pMW-PR-prsA, pMW-PR-prsDA oder pMW-PR-prsDS transformiert. Für die Integration des Gens in das Chromosom wurden die mit Hitzeschock behandelten Zellen in 1 ml L-Brühe überführt, bei 44°C während 20 Minuten, bei 37°C während 40 Minuten inkubiert und dann auf L-Agar verstrichen, der 10 μg/l ml Tetracyclin und 100 μg/ml Ampicillin enthielt.
Kolonien, die innerhalb 48 Stunden bei 30°C gewachsen waren, wurden in 1 ml L-Brühe eingeimpft und 72 Stunden bei 42°C in Röhrchen inkubiert. Etwa 10 Kolonien aus jedem Röhrchen wurden auf Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz überprüft. Kolonien, die gegen Antibiotika empfindlich waren, wurden auf die Anwesenheit zusätzlicher Kopien des prs-Gens in dem Chromosom durch PCR unter Verwendung des Primers 1 (SEQ ID Nr. 3) und des Primers 5 (SEQ ID Nr. 7) untersucht. Primer 5 enthält eine zu der attR-Stelle des Phagen Mu komplementäre Sequenz. Zu diesem Zweck wurde eine frisch isolierte Kolonie in 50 μl Wasser suspendiert, und dann wurde 1 μl in der PCR eingesetzt. Die PCR-Bedingungen waren folgende: anfängliche DNA-Denaturierung bei 95°C während 5 Minuten; dann 30 Zyklen der Denaturierung bei 95°C während 30 Sekunden, Annealing bei 57°C während 60 Sekunden und Verlängerung bei 72°C während 120 Sekunden; die Endpolymerisation wurde bei 72°C während 7 Minuten durchgeführt. Einige Kolonien, die gegen Antibiotika empfindlich waren, enthielten notwendigerweise ein 1515 bp großes DNA-Fragment. Die Stämme 80::PR-prsA 80::PR-prsDA und 80::PR-prsDS wurden erhalten.

Für die Durchführung einer chargenweisen Minirüttelfermentation wurde eine Impföse mit dem jeweiligen Stamm, auf L-Agar gewachsen war, in L-Brühe überführt und bei 30°C unter Rotation (140 Upm) kultiviert, wobei eine optische Dichte der Kultur bei 540 nm von 2,0 erhalten wurde. Dann wurden 25 ml der Impfkultur zu 250 ml Medium für die Fermentation gegeben und bei 29°C unter Rotation (1500 Upm) kultiviert. Die Dauer der Chargenfermentation war etwa 35–40 Stunden. Nach der Kultivierung wurde die Menge des in dem Medium angehäuften Histidins durch Papierchromatographie bestimmt. Das Papier wurde mit der mobilen Phase n-Butanol:Essigsäure:Wasser = 4:1:1 (Vol./Vol.) entwickelt. Eine Lösung von Ninhydrin (0,5%) in Aceton wurde Färbemittel eingesetzt. Zusammensetzung des Fermentationsmediums (pH 6,0) (g/l):

Glucose	100,0
Mameno	0,2 TN
(NH₄)₂SO₄	8,0
KH₂PO₄	1,0
MgSO₄ × 7H₂O	0,4
FeSO₄ × 7H₂O	0,02
MnSO₄	0,02
Thiamin	0,001
Betain	2,0
L-Prolin	0,8
L-Glutamat	3,0
L-Aspartat	1,0
Adenosin	0,1

Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1

Stamm integriertes Gen DCW, g/l Histidin, g/l Ausbeute pro Glucose

80 - 8,4 16,9 20,40

80::P_R-prsA prsA 8,6 15,6 19,1

80::P_R-prsDA prsDA 7,3 15,8 19,7

80::P_R-prsDS prsDS 8,5 18,4 22,1
Tabelle 1 zeigt, dass die Verwendung des mutierten prsa-Gens, das für gegenüber Purinnucleotiden rückkopplungsresistente PRPP-Synthetase kodiert, die Produktion von Histidin in dem Stamm E. coli 80 verbessert. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Mutierte bakterielle Phosphoribosylpyrophosphat-Synthetase (PRPP-Synthetase), worin der Aspartatrest, welcher der Position 115 in einer Wildtyp-Phosphoribosylpyrophosphat-Synthetase aus Escherichia coli entspricht, durch einen Serinrest ersetzt ist und die Rückkopplungshemmung durch Purinnucleotide ausgeschaltet ist.
Für die mutierte PRPP-Synthetase nach Anspruch 1 kodierende DNA.
Bakterium der Familie Enterobacteriaceae, welches die DNA nach Anspruch 2 enthält und die Fähigkeit zur Produktion von L-Histidin hat.
Bakterium nach Anspruch 3, worin die Aktivität der mutierten PRPP-Synthetase verstärkt ist.
Bakterium nach Anspruch 4, worin das Bakterium zur Gattung Escherichia gehört.
Bakterium nach Anspruch 4, worin die Aktivität der mutierten PRPP-Synthetase durch Erhöhen der exprimierten Menge des mutierten PRPP-Synthetasegens verstärkt ist.
Bakterium nach Anspruch 6, worin die Aktivität der mutierten PRPP-Synthetase durch Erhöhen der Kopienzahl des mutierten PRPP-Synthetasegens oder durch Modifizieren einer Expressionskontrollsequenz des Gens, so dass die Expression des Gens verstärkt sein sollte, erhöht ist.
Bakterium nach Anspruch 7, worin die Kopienzahl durch Einführen zusätzlicher Kopien des mutierten PRPP-Synthetasegens in das Chromosom des Bakteriums erhöht ist.
Verfahren zum Herstellen von L-Histidin, welches das Kultivieren des Bakteriums nach einem der Ansprüche 3 bis 8 in einem Kulturmedium zur Produktion und Anhäufung von L-Histidin in dem Kulturmedium und das Gewinnen des L-Histidins aus dem Kulturmedium umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das Bakterium eine verstärkte Expression der Gene für die Histidin-Biosynthese aufweist.