KR100517163B1

KR100517163B1 - 1-인산화 당유도체 아노머의 선택적인 제조방법 및뉴클레오사이드의 제조방법

Info

Publication number: KR100517163B1
Application number: KR10-2001-7012917A
Authority: KR
Inventors: 코마쯔히로노리; 아와노히로카즈; 후카자와노부유키; 이토키요시; 이케다이치로; 아라키타다시; 나카무라타케시; 아사노타모츠; 후지와라쥰야; 안도토모유키; 츠치아카츠토시; 마루야마쿄코; 우메타니히데키; 야마우치타가히로; 미야케히토키
Original assignee: 미쯔이카가쿠 가부시기가이샤
Priority date: 2000-02-10
Filing date: 2001-02-13
Publication date: 2005-09-26
Also published as: DE60134196D1; CA2366513A1; US20060094869A1; US20020193314A1; EP1178051A2; EP1178051A4; EP1178051B1; WO2001058920A2; KR20020013524A; WO2001058920A3; CN1372564A; BR0104461A; ATE397001T1; JP2010031037A; US7038039B2

Abstract

1-인산화 당유도체의 아노머혼합물을 가인산분해 및 이성화하는 한편, 염기의 존재하에서의 산성 조건에서 이성체의 한쪽을 결정화함으로써 평형을 전이시켜, 선택적으로 소망의 이성체만을 제조한다. 또, 뉴클레오사이드 포스포릴라제의 작용에 의해, 얻어진 1-인산화 당유도체와 염기로부터 높은 입체선택성과 수율로 뉴클레오사이드를 제조한다. 이 제조방법은, 1-인산화 당유도체 및 뉴클레오사이드를 제조하는 아노머선택적인 제조방법이다.

Description

1-인산화 당유도체 아노머의 선택적인 제조방법 및 뉴클레오사이드의 제조방법{PROCESS FOR SELECTIVELY PRODUCING 1-PHOSPHORYLATED SUGAR DERIVATIVE ANOMER AND PROCESS FOR PRODUCING NUCLEOSIDE}

본 발명은, 1-인산화 당유도체의 제조방법에 관한 것이다. 1-인산화 당류는, 널리 생물계에 분포되어, 각종 효소의 반응기질로서 작용하여, 의약품이나 자양식품 등의 유용한 물질을 제조하기 위한 출발물질로서 이용되고 있다. 합성 1-인산화 당유도체는, 항바이러스제, 효소억제제 등의 약품을 제조하는 출발물질로서의 용도로서 기대되어 왔다.

또, 본 발명은, 항바이러스성 의약품, 항암성 의약품, 항정신성 의약품 등의 출발물질 또는 의약원료로서 사용되는 뉴클레오사이드화합물의 제조방법에 관한 것이다.

1-인산화 당유도체의 제조방법으로서는 다음과 같은 것이 공지되어 있다:

1) 1-브로모당과 인산은염을 축합시키는 방법(J. Biol. Chem., Vol.121, p465(1937); J. Am. Chem. Soc., Vol.78, p811(1956); J. Am. Chem. Soc., Vol.79, p.5057(1957));

2) 1-할로겐화 당과 디벤질인산의 트리에틸아민염을 축합시키는 방법(J. Am. Chem. Soc., Vol.77, p3423(1955); J. Am. Chem. Soc., Vol.80, p1994(1958); J. Am. Chem. Soc., Vol.106, p7851(1984); J. Org. Chem., Vol.59, p.690(1994));

3) 1-아세틸화 당과 오르토인산을 가열축합시키는 방법(J. Org. Chem., Vol.27, p1107(1962); Carbohydrate Res., Vol.3, p.117(1966); Carbohydrate Res., Vol.3, p.463(1967); Can. J. Biochem., Vol.50, p.574(1972));

4) 1위치를 이미드화해서 활성화시킨 당과 디벤질인산을 축합시키는 방법(Carbohydrate Res., Vol.61, p.181(1978); Tetrahedron Lett., Vol.23, p.405(1982));

5) 탈륨 또는 리튬 알콜레이트에 의해 1위치에서 활성화된 당을 염화 디벤질인산으로 처리하는 방법(Carbohydrate Res., Vol.94, p.165(1981); Chem. Lett., Vol.23, p.405(1982));

6) 뉴클레오사이드 포스포릴라제의 작용을 이용한 뉴클레오사이드의 가인산분해(phosphorolysis)에 의해 1-인산화 당유도체를 형성하는 방법(J. Biol. Chem., Vol.184, p437(1980)).

이들 방법은 다음과 같은 결점이 있다.

상기 1)항 내지 5)항에 기재된 화학적 제조법에 있어서의 공통적인 문제점은, 1-위치에 인접한 작용기의 영향으로 인해 α/β아노머간의 아노머선택률의 편차때문에 소망의 이성체를 선택성 양호하게 제조하는 일반적인 합성법을 확립하는 것이 곤란하다는 점이다. 양호한 선택률 및 수율을 얻기 위해서는, 2-아세톡시 또는 2-아세트아미노기의 존재가 필수이지만, 2-데옥시당은 불안정하므로, 이들 합성법은 상당히 좁은 적용범위로 제한되어 버린다. 따라서, 아노머선택률을 제어하기 곤란하므로, 컬럼크로마토그래피정제가 필요하여, 수율불량을 초래한다(Chem. Zvesti, Vol.28(1), p.115(1974); Izv. Akad. Nauk SSSR, Ser. Khim., Vol.8, p.1843(1975)).

물론, 1-인산화 2-데옥시피라노스보다도 더 불안정하여 선택성의 제어가 더 곤란한 1-인산화 2-데옥시푸라노스의 화학적 제법에 대한 보고는 없다.

또, 상기 6)항에 있어서는, 이노신 등의 상당히 제한된 유형의 리보뉴클레오사이드이외에는 뉴클레오사이드 자체의 제조가 곤란하다. 따라서, 리보스-1-인산 등의 제한된 유형의 1-인산화 당유도체를 제조할 수 있다. 또한, 출발물질로서의 뉴클레오사이드 자체가 값비싸므로, 비용면에서 만족스러운 제법은 아니다.

상기 설명한 바와 같이, "뉴클레오사이드 포스포릴라제"란 용어는, 하기 식:

뉴클레오사이드 + 인산(염)→염기 + 1-인산화 당유도체

으로 표시되는 반응을 촉매하는 인산의 존재하에 뉴클레오사이드에 N-글리코사이드결합의 가인산분해가능한 효소에 대한 총칭이다.

푸린 뉴클레오사이드 포스포릴라제와 피리미딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제의 2군으로 통상 구분될 수 있는 효소는, 널리 생물계에 분포되어 있고; 이들은, 포유류, 조류, 어류 등의 조직; 효모; 세균 등에 존재한다. 이 효소반응은 가역적이며, 역반응을 이용한 각종 뉴클레오사이드의 합성법, 즉 2'-데옥시리보스 1-인산과 핵산염기로부터 티미딘(티민, 아데닌 또는 구아닌)(일본국 공개특허 평 1-104190호 공보), 2'-데옥시아데노신(일본국 공개특허 평 11-137290호 공보) 또는 2'-데옥시구아노신(일본국 공개특허 평 11-137290)의 합성법이 개시되어 있다.

또, Agric. Biol. Chem., Vol. 50(1), pp.121-126(1986)에는, 인산의 존재하에 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes)로부터 푸린 뉴클레오사이드 포스포릴라제를 이용한 반응에 의해, 이노신을 리보스 1-인산과 하이포크산틴으로 분해하고, 이온교환수지를 이용해서 단리된 리보스 1-인산과 1,2,4-트리아졸-3-카르복시아미드를, 엔테로박터 아에로게네스로부터의 푸린 뉴클레오사이드 포스포릴라제로 처리하여 항바이러스제로서의 리바비린을 제조하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 이상 설명한 바와 같이, 1-인산화 당유도체를 제조하는 공업적인 프로세스는 아직 확립되어 있지 않으므로, 뉴클레오사이드 포스포릴라제의 역반응을 이용한 범용 뉴클레오사이드의 공업적인 제법도 아직 확립되어 있지 않다.

또한, 1-인산화 당유도체와 염기로부터 효소의 역반응을 이용해서 뉴클레오사이드를 형성하는 반응은 가역적이므로, 전화율을 향상시킬 수 없다고 하는 기술적인 결점이 있다.

발명의 개시

본 발명의 제 1목적은, 푸라노스, 피라노스 등의 당류골격내에 있어서의 차이, 데옥시당 등의 치환기의 유무 또는 천연형 혹은 합성형이라고 하는 당의 종류에 의한 영향을 받지 않는 범용성이 높은, 아노머선택적인 1-인산화 당유도체를 제조하는 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 제 2목적은, 1-인산화 당유도체와 핵산염기를 뉴클레오사이드 포스포릴라제로 처리함으로써 범용성이 높은 뉴클레오사이드의 제조방법 및 해당 반응시의 뉴클레오사이드에 대한 전화율을 향상시키는 방법을 제공하는 데 있다.

즉, 본 발명의 궁극적인 목적은, 상기 제 1목적 및 제 2목적을 달성함으로써 저비용으로 고순도의 뉴클레오사이드를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은, 상기 제 1목적을 달성하기 위해 예의 연구를 행한 결과, 1-인산화 당유도체가 소정 조건하에 아노머 및 1-인산화 당유도체의 다이머와의 평형상태로 존재하는 것과, 상기 조건을 조정해서 소망의 아노머만을 결정으로서 석출시키므로, 바람직한 방향으로 평형을 전이시켜 소망의 아노머를 선택성 양호하게 고수율로 얻는 것이 가능하다는 것을 발견하고, 이러한 지견에 의거해서, 본 발명에 이르게 되었다.

구체적으로는, 본 발명은 하기 실시형태예를 포함한다.

(1) 1-인산화 당유도체의 아노머혼합물을 가인산분해 및 이성화하여, 1-인산화 당유도체모노머의 α이성체 및 β이성체를 얻는 공정과, 염기의 존재하에서의 산성 조건에서 이들 이성체중 한쪽을 선택적으로 결정화해서 이들 이성체중 한쪽을 선택적으로 결정화해서 이들 아노머간의 평형을 전이시키는(즉, 기울어지게 하는) 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 1-인산화 당유도체모노머의 α이성체 또는 β이성체의 선택적인 제조방법.

(2) 하기 일반식(1):

(식중, R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 보호된 하이드록시메틸기 또는 보호된 카르복실기를 표시하고; R³은 아실기를 표시하고; R⁴는 수산기의 보호기를 표시하고; X는 할로겐원자, 알콕시기 또는 알킬티오기를 표시하고; W는 산소원자 또는 황원자를 표시하고; Z는 산소원자, 황원자 또는 치환되어 있어도 되는 탄소원자를 표시하고; m은 1 내지 3의 정수를 표시하고; n은 0 또는 1을 표시하고; p 및 q는 0 내지 4의 정수를 표시하고; r은 0 또는 1을 표시하며; 단, p, q, r 및 n은, Z가 산소원자 또는 황원자일 경우에는 p+r≤n+1 및 q≤2×(n+1)-2×(p+r)이고, Z가 탄소원자일 경우에는 p+r≤n+2 및 q≤2×(n+2)-2×(p+r)인 조건을 충족함)로 표시되는 1-인산화 당유도체의 아노머혼합물을 가인산분해 및 이성화하여, 1-인산화 당유도체모노머의 α이성체 및 β이성체를 얻는 공정과, 염기의 존재하에서의 산성 조건에서 이들 이성체중 한쪽을 선택적으로 결정화해서 이들 이성체중 한쪽을 선택적으로 결정화해서 이들 아노머간의 평형을 전이시키는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 1-인산화 당유도체모노머의 α이성체 또는 β이성체의 선택적인 제조방법.

(3) 하기 일반식(3):

(식중, R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 하이드록시메틸기 또는 카르복실기를 표시하고; R³은 수소원자 또는 아실기를 표시하고; X, W, Z, n, p, q 및 r은 상기 일반식(1)에서 정의한 것과 마찬가지임)으로 표시되는 1-인산화 당유도체모노머의 제조방법에 있어서, 상기 일반식(1)로 표시되는 1-인산화 당유도체의 아노머혼합물을 가인산분해 및 이성화하여, 1-인산화 당유도체모노머의 α이성체 및 β이성체를 얻는 공정과; 염기의 존재하에서의 산성 조건에서 이들 이성체중 한쪽을 선택적으로 결정화해서 이들 이성체중 한쪽을 선택적으로 결정화해서 이들 아노머간의 평형을 전이시키는 공정과; R⁴로 표시된 보호기를 제거하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 1-인산화 당유도체모노머의 제조방법.

(4) 하기 일반식(4):

(식중, R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 치환된 벤조일기로 보호된 하이드록시메틸기 또는 보호된 카르복실기를 표시하고; R⁴는 수소원자 또는 수산기의 보호기를 표시하고; R³, X, W, Z, m, p, q 및 r은 상기 일반식(1)에서 정의한 것과 마찬가지이고, n은 0임)로 표시되는 것을 특징으로 하는 1-인산화 당유도체의 트리머, 다이머 또는 모노머 혹은 그 염류.

(5) 하기 일반식(5):

(식중, p 및 q는 0 내지 3의 정수이고; r은 0 또는 1을 표시하고; R¹, R², R³, R⁴, X, W 및 Z는 상기 일반식(1)에서 정의한 것과 마찬가지이며; 단, p, q 및 r은, Z가 산소원자 또는 황원자일 경우에는 p+q+r≤3이고, Z가 탄소원자일 경우에는 p+q+r≤5인 조건을 충족함)로 표시되는 것을 특징으로 하는 1-인산화 당유도체 모노머 혹은 그 염류.

(6) 하기 일반식(6):

(식중, R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 하이드록시메틸기 또는 카르복실기를 표시하고; R³, X, W, Z, p, q 및 r은 상기 일반식(1)에서 정의한 것과 마찬가지이고, n은 0임)으로 표시되는 1-인산화 당유도체 모노머 혹은 그 염류.

(7) 하기 일반식(7):

(식중, p 및 q는 0 내지 3의 정수이고; r은 0 또는 1을 표시하고; R¹, R², R³, X, W 및 Z는 상기 일반식(1)에서 정의한 것과 마찬가지이며; 단, p, q 및 r은, Z가 산소원자 또는 황원자일 경우에는 p+r≤1 및 q≤2-2×(p+r)이고, Z가 탄소원자일 경우에는 p+r≤2 및 q≤4-2×(p+r)인 조건을 충족함)로 표시되는 1-인산화 당유도체 모노머 또는 그 염류.

(8) 하기 일반식(20):

(식중, R¹¹은 보호된 하이드록시메틸기를 표시하고, R¹⁴는 수산기의 보호기를 표시함)으로 표시되는 1-인산화 당류의 제조방법에 있어서,

하기 일반식(18):

(식중, R¹¹ 및 R¹⁴는 상기와 동일함)로 표시되는 화합물을, 염기의 존재하에 인산으로 처리하여 하기 일반식(19):

(식중, R¹¹ 및 R¹⁴는 상기와 동일하고, m은 1 내지 3의 정수를 표시함)로 표시되는 1-인산화 당유도체의 아노머혼합물을 얻는 공정; 상기 혼합물을 가인산분해 및 이성화하는 공정; 및 염기의 존재하에서의 산성 조건에서, 형성된 α이성체를 선택적으로 결정화해서 상기 아노머이성체간의 평형을 전이시키는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 상기 일반식(20)으로 표시되는 1-인산화 당류의 제조방법.

(9) 하기 일반식(18):

(식중, R¹¹은 보호된 하이드록시메틸기를 표시하고, R¹⁴는 수산기의 보호기를 표시함)로 표시되는 화합물을, 염기의 존재하에 인산으로 처리하여 하기 일반식(19):

(식중, R¹¹ 및 R¹⁴는 상기와 동일하고, m은 1 내지 3의 정수를 표시함)로 표시되는 1-인산화 당유도체의 아노머혼합물을 얻는 공정; 상기 아노머혼합물을 가인산분해 및 이성화하는 공정; 및 염기의 존재하에서의 산성 조건에서, 형성된 α이성체를 선택적으로 결정화해서 상기 아노머이성체간의 평형을 전이시켜 α이성체를 얻는 공정; 및 보호기를 제거하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 2-데옥시-α-D-리보스-1-인산의 제조방법.

또, 본 발명자들은, 상기 제 2목적을 달성하기 위해 예의검토를 행한 결과, 널리 생물계에 분포하는 뉴클레오사이드 포스포릴라제의 역반응을 이용하고, 또, 1-인산화 당유도체의 상기 제조방법과 조합시킴으로써, 범용성이 높은 뉴클레오사이드의 제조방법을 확립하였다. 또한, 본 발명자들은, 인산이온과 난수용성 염을 형성가능한 금속양이온을 존재시킴으로써, 반응시 부산물로서의 인산이온이 난수용성 염으로 침전되어, 뉴클레오사이드제조를 위한 쪽으로 반응평형이 전이되므로, 반응수율이 향상될 수 있다는 것도 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은, 저비용으로 고순도의 뉴클레오사이드를 제조하는 제조방법을 제공할 수 있게 되었다.

상기 지견에 의거한 본 발명은 이하의 실시형태를 포함한다.

(10) 하기 일반식(8):

(식중, B는 독립적으로 할로겐원자, 알킬기, 할로알킬기, 알케닐기, 할로알케닐기, 알키닐기, 아미노기, 알킬아미노기, 하이드록시기, 하이드록시아미노기, 아미녹시기, 알콕시기, 메르캅토기, 알킬메르캅토기, 아릴기, 아릴옥시기 또는 시아노기로 치환되어 있어도 되는 피리미딘, 푸린, 아자푸린 및 데아자푸린으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기이고; R¹, R², R³, X, W, Z, n, p, q 및 r은 상기 일반식(1)에서 정의한 것과 마찬가지임)로 표시되는 뉴클레오사이드의 제조방법에 있어서,

1-인산화 당유도체의 아노머혼합물을 가인산분해 및 이성화하여, 1-인산화 당유도체모노머의 α이성체 및 β이성체를 얻는 공정과, 염기의 존재하에서의 산성 조건에서 이들 이성체중 한쪽을 선택적으로 결정화해서 이들 아노머간의 평형을 전이시키는 공정과, R⁴로 표시된 보호기를 제거하는 공정을 구비한 1-인산화 당유도체모노머를 제조하는 상기 (3)항에 있어서의 제 1공정; 및

뉴클레오사이드포스포릴라제의 작용에 의해 상기 제 1공정에서 얻어진 1-인산화 당유도체중의 인산기와 염기와의 교환반응을 행하는 제 2공정을 구비한 것을 특징으로 하는 상기 일반식(8)로 표시되는 뉴클레오사이드의 제조방법.

(11) 하기 일반식(9):

(식중, B는 상기 일반식(8)에서 정의한 것과 동일하며; R¹, R², R³, X, W, Z, n, p, q 및 r은 상기 일반식(1)에서 정의한 것과 마찬가지임)로 표시되는 뉴클레오사이드의 제조방법에 있어서,

뉴클레오사이드 포스포릴라제의 작용에 의해 상기 (6)항에 기재한 1-인산화 당유도체 모노머중의 인산기와 염기와의 교환반응을 행하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 상기 일반식(9)로 표시되는 뉴클레오사이드의 제조방법.

(12) 하기 일반식(10):

(식중, B는 상기 일반식(8)에서 정의한 것과 동일하며; R¹, R², R³, X, W, Z, p, q 및 r은 상기 일반식(1)에서 정의한 것과 마찬가지임)으로 표시되는 뉴클레오사이드의 제조방법에 있어서,

뉴클레오사이드 포스포릴라제의 작용에 의해 상기 (7)항에 기재한 1-인산화 당유도체 모노머중의 인산기와 염기와의 교환반응을 행하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 상기 일반식(10)으로 표시되는 뉴클레오사이드의 제조방법.

(13) 하기 일반식(21):

(식중, B는 상기 일반식(8)에서 정의한 것과 마찬가지임)로 표시되는 뉴클레오사이드의 제조방법에 있어서,

상기 (12)항에 있어서, R¹이 하이드록시메틸기이고, R²가 수소원자이고, p 및 r이 0이고, X가 불소원자인 2-데옥시-α-D-리보스-1-인산을 제조하는 제 1공정; 및

상기 제 1공정에서 얻어진 1-인산화 당유도체중의 인산기와 염기와의 교환반응을 뉴클레오사이드 포스포릴라제의 작용에 의해 행하는 제 2공정을 구비한 것을 특징으로 하는 상기 일반식(21)로 표시되는 뉴클레오사이드의 제조방법.

상기 (10)항 내지 (13)항의 실시형태에 있어서, 뉴클레오사이드 포스포릴라제는, 푸린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.1), 구아노신 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.15), 피리미딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.2), 우리딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.3), 티미딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.4) 및 데옥시우리딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.23)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이어도 된다.

또, 뉴클레오사이드 포스포릴라제활성은, 푸린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.1), 구아노신 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.15), 피리미딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.2), 우리딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.3), 티미딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.4) 및 데옥시우리딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.23)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 뉴클레오사이드포스포릴라제를 발현하는 미생물을 이용해서 얻어도 된다.

또한, 상기 (10)항 내지 (13)항의 실시형태에 있어서, 뉴클레오사이드 포스포릴라제의 작용에 의해 1-인산화 당유도체모노머중의 인산기와 염기와의 교환반응을 행할 때, 인산이온과 난수용성 염을 형성가능한 금속양이온을 반응액중에 존재시켜도 된다.

상기 (10)항 내지 (13)항의 실시형태에 있어서, 인산이온과 함께 난수용성 염을 형성가능한 금속양이온은, 칼슘이온, 바륨이온, 알루미늄이온 및 마그네슘이온으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 금속양이온이어도 된다.

또한, 본 발명에는, 하기 일반식(11) 내지 (13) 및 (20)의 어느 하나로 표시되는 화합물도 포함된다.

즉, 본 발명은, 하기 실시형태도 포함한다:

트리플루오로티미딘, 리바비린, 오로티딘, 우라실 아라비노사이드, 아데닌 아라비노사이드, 2-메틸-아데닌 아라비노사이드, 2-클로로-하이포크산틴 아라비노사이드, 티오구아닌 아라비노사이드, 2,6-디아미노푸린 아라비노사이드, 시토신 아라비노사이드, 구아닌 아라비노사이드, 티민 아라비노사이드, 에노시타빈, 겜시타빈, 아지도티미딘, 이독슈리딘(idoxuridine), 디데옥시아데노신, 디데옥시이노신, 디데옥시시티딘, 디데하이드로데옥시티미딘, 티아디데옥시시티딘, 소리부딘, 5-메틸우리딘, 비라졸, 티오이노신, 테가푸르(tegafur), 독시플루리딘, 브레디닌, 네불라린, 알로푸리놀 우라실, 5-플루오로우라실, 2'-아미노우리딘, 2'-아미노아데노신, 2'-아미노구아니딘, 2-클로로-2'-아미노이노신, 2'-데옥시-2'-메틸리덴-시티딘(이하, "DMDC"라 약칭함) 및 2'-데옥시-2'-(플루오로메틸리덴)-시티딘(이하, "FMDC"라 약칭함)을 제외한, 하기 일반식(11):

(식중, B, R¹, R², R³, X, W, Z, n, p, q 및 r은 상기 일반식(1) 및 (8)에서 정의한 것과 마찬가지임)로 표시되는, 천연적으로 생산되지 않는 합성 뉴클레오사이드 또는 그 염;

트리플루오로티미딘, 리바비린, 오로티딘, 우라실 아라비노사이드, 아데닌 아라비노사이드, 2-메틸-아데닌 아라비노사이드, 2-클로로-하이포크산틴 아라비노사이드, 티오구아닌 아라비노사이드, 2,6-디아미노푸린 아라비노사이드, 시토신 아라비노사이드, 구아닌 아라비노사이드, 티민 아라비노사이드, 에노시타빈, 겜시타빈, 아지도티미딘, 이독슈리딘, 디데옥시아데노신, 디데옥시이노신, 디데옥시시티딘, 디데하이드로데옥시티미딘, 티아디데옥시시티딘, 소리부딘, 5-메틸우리딘, 비라졸, 티오이노신, 테가푸르, 독시플루리딘, 브레디닌, 네불라린, 알로푸리놀 우라실, 5-플루오로우라실, 2'-아미노우리딘, 2'-아미노아데노신, 2'-아미노구아니딘, 2-클로로-2'-아미노이노신, DMDC 및 FMDC를 제외한, 하기 일반식(12):

트리플루오로티미딘, 리바비린, 오로티딘, 우라실 아라비노사이드, 아데닌 아라비노사이드, 2-메틸-아데닌 아라비노사이드, 2-클로로-하이포크산틴 아라비노사이드, 티오구아닌 아라비노사이드, 2,6-디아미노푸린 아라비노사이드, 시토신 아라비노사이드, 구아닌 아라비노사이드, 티민 아라비노사이드, 에노시타빈, 겜시타빈, 아지도티미딘, 이독슈리딘, 디데옥시아데노신, 디데옥시이노신, 디데옥시시티딘, 디데하이드로데옥시티미딘, 티아디데옥시시티딘, 소리부딘, 5-메틸우리딘, 비라졸, 티오이노신, 테가푸르, 독시플루리딘, 브레디닌, 네불라린, 알로푸리놀 우라실, 5-플루오로우라실, 2'-아미노우리딘, 2'-아미노아데노신, 2'-아미노구아니딘, 2-클로로-2'-아미노이노신, DMDC 및 FMDC를 제외한, 하기 일반식(13):

(식중, B, R¹, R², R³, X, W, Z, p, q 및 r은 상기 일반식(1) 및 (8)에서 정의한 것과 마찬가지임)으로 표시되는 뉴클레오사이드 또는 그 염; 및

하기 일반식(20):

(식중, R¹¹및 R¹⁴는 상기 일반식(18)에서 정의한 것과 마찬가지임)으로 표시되는 1-인산화 당류 또는 그 염.

발명을 수행하기 위한 최량의 형태

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용하는 당류란, 푸코스, 람노스, 디지톡소스, 올레안드로스, 퀴노보스 등의 6-데옥시당류, 알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스 등의 헥소스류, 리보스, 아라비노즈, 크실로스, 리소스 등의 펜토스류, 에리트로스, 트레오스 등의 테트로스류, 글루코사민, 다우노사민 등의 아미노당류, 글루쿠론산, 갈락투론산 등의 우론산류, 사이코스, 프럭토스, 소르보스, 타가토스, 펜툴로스 등의 케토스류, 2-데옥시리보스 등의 데옥시당류 등의 D계열 및 L계열의 천연형 단당류로부터 유래된 잔기; 합성 피라노스, 푸라노스당류로부터 유래된 잔기; 상기 잔기중의 어느 하나에 있어서의 수산기 및/또는 아미노기가 보호 또는 아실화된 당잔기유도체 혹은 불소 등의 할로겐으로 수산기가 치환된 할로겐화 당잔기를 지닌 당류 등을 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 1-인산화 당유도체란, 천연형 또는 합성형 단당류로부터 유래된 잔기중에서 1-하이드록시기가 인산화된 당유도체를 말한다. 특히 지정하지 않는 한, 모노머, 다이머 또는 트리머 혹은 이들의 혼합물도 포함되며, 혼합물에 있어서 그 혼합비는 제한이 없다.

"보호된 하이드록시메틸기" 및 "수산기의 보호기"란 용어에 있어서의 보호기란, 수소첨가분해, 가수분해 및 광분해 등의 적절한 화학적 처리에 의해 제거될 수 있는 것을 의미하며, 예를 들면, 포르밀기, 아실기, 실릴기, 알킬기, 아랄킬기, 카르보닐기를 들 수 있고, 바람직하게는 포르밀기, 지방족 아실기, 방향족 아실기, 실릴기, 알콕시알킬기, 할로겐화 알킬기, 아랄킬기, 알콕시카르보닐기, 아랄킬옥시카르보닐기 등을 들 수 있다.

지방족 아실기로서는 알킬카르보닐기, 할로겐화 저급 알킬카르보닐기를 들 수 있다.

알킬카르보닐기의 예로서는, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 펜타노일기, 피발로일기, 발레릴기, 이소발레릴기, 옥타노일기, 노닐카르보닐기, 데실카르보닐기, 3-메틸노닐카르보닐기, 8-메틸노닐카르보닐기, 3-에틸옥틸카르보닐기, 3,7-디메틸옥틸카르보닐기, 운데실카르보닐기, 도데실카르보닐기, 트리데실카르보닐기, 테트라데실카르보닐기, 펜타데실카르보닐기, 헥사데실카르보닐기, 1-메틸펜타데실카르보닐기, 14-메틸펜타데실카르보닐기, 13,13-디메틸테트라데실카르보닐기, 헵타데실카르보닐기, 15-메틸헥사데실카르보닐기, 옥타데실카르보닐기 등을 들 수 있다.

할로겐화 저급 알킬카르보닐기의 예로서는, 클로로아세틸기, 디클로로아세틸기, 트리클로로아세틸기, 트리플루오로아세틸기 등을 들 수 있다.

방향족 아실기로서는, 아릴카르보닐기, 할로겐화 아릴카르보닐기, 저급-알킬화 아릴카르보닐기, 저급-알콕시화 아릴카르보닐기, 질산화 아릴카르보닐기, 저급-알콕시카르보닐화 아릴카르보닐기 또는 아릴화 아실카르보닐기 등을 들 수 있다.

아릴카르보닐기의 예로서는, 벤조일기, α-나프토일기, β-나프토일기 등을 들 수 있다.

할로겐화 아릴카르보닐기의 예로서는, 2-플루오로벤조일기, 3-플루오로벤조일기, 4-플루오로벤조일기, 2-클로로벤조일기, 3-클로로벤조일기, 4-클로로벤조일기, 2-브로모벤조일기, 3-브로모벤조일기, 4-브로모벤조일기, 2,4-디클로로벤조일기, 2,6-디클로로벤조일기, 3,4-디클로로벤조일기, 3,5-디클로로벤조일기 등을 들 수 있다.

저급-알킬화 아릴카르보닐기의 예로서는, 2-톨루오일기, 3-톨루오일기, 4-톨루오일기, 2,4,6-트리메틸벤조일기 등을 들 수 있다.

저급-알콕시화 아릴카르보닐기의 예로서는, 2-아닐소일기, 3-아니소일기, 4-아니소일기 등을 들 수 있다.

질산화 아릴카르보닐기의 예로서는, 2-니트로벤조일기, 3-니트로벤조일기, 4-니트로벤조일기, 3,5-디니트로벤조일기 등을 들 수 있다.

저급-알콕시카르보닐화 아릴카르보닐기의 예로서는, 2-(메톡시카르보닐)벤조일기 등을 들 수 있다. 아릴화 아릴카르보닐기의 예로서는, 4-페닐벤조일기 등을 들 수 있다.

실릴기로서는, 저급-알킬실릴기, 아릴-치환 저급 알킬실릴기를 들 수 잇다.

저급-알킬실릴기의 예로서는, 트리메틸실릴기, 트리에틸실릴기, 이소프로필디메틸실릴기, tert-부틸디메틸실릴기, 메틸디이소프로필실릴기, 트리이소프로필실릴기 등을 들 수 있다.

아릴-치환 저급 알킬실릴기의 예로서는, 디페닐메틸실릴기, 디페닐이소프로필실릴기, 페닐디이소프로필실릴기를 들 수 있다.

아랄킬기로서는, 벤질기, 저급알킬기가 치환된 아랄킬기, 저급알콕시기가 치환된 아랄킬기, 니트로기가 치환된 아랄킬기, 할로겐원자가 치환된 아랄킬기 또는 시아노기가 치환된 아랄킬기를 들 수 있다.

이들의 예로서는, 2-메틸벤질기, 3-메틸벤질기, 4-메틸벤질기, 2,4,6-트리메틸벤질기, 2-메톡시벤질기, 3-메톡시벤질기, 4-메톡시벤질기, 2-니트로벤질기, 3-니트로벤질기, 4-니트로벤질기, 2-클로로벤질기, 3-클로로벤질기, 4-클로로벤질기, 2-브로모벤질기, 3-브로모벤질기, 4-브로모벤질기, 2-시아노벤질기, 3-시아노벤질기, 4-시아노벤질기 등을 들 수 있다.

아랄킬옥시카르보닐기로서는, 저급 알킬기가 치환된 아랄킬옥시카르보닐기, 저급 알콕시기가 치환된 아랄킬옥시카르보닐기, 니트로기가 치환된 아랄킬옥시카르보닐기, 할로겐원자가 치환된 아랄킬옥시카르보닐기 또는 시아노기가 치환된 아랄킬옥시카르보닐기를 들 수 있다.

이들의 예로서는, 2-메틸벤질옥시카르보닐기, 3-메틸벤질옥시카르보닐기, 4-메틸벤질옥시카르보닐기, 2,4,6-트리메틸벤질옥시카르보닐기, 2-메톡시벤질옥시카르보닐기, 3-메톡시벤질옥시카르보닐기, 4-메톡시벤질옥시카르보닐기, 2-니트로벤질옥시카르보닐기, 3-니트로벤질옥시카르보닐기, 4-니트로벤질옥시카르보닐기, 2-클로로벤질옥시카르보닐기, 3-클로로벤질옥시카르보닐기, 4-클로로벤질옥시카르보닐기, 2-브로모벤질옥시카르보닐기, 3-브로모벤질옥시카르보닐기, 4-브로모벤질옥시카르보닐기, 2-시아노벤질옥시카르보닐기, 3-시아노벤질옥시카르보닐기, 4-시아노벤질옥시카르보닐기 등을 들 수 있다.

알콕시카르보닐기로서는, 저급-알콕시카르보닐기, 할로겐원자가 치환된 알콕시카르보닐기 또는 알킬실릴기가 치환된 알콕시카르보닐기를 들 수 있다.

저급-알콕시카르보닐기의 예로서는, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 프로폭시카르보닐기, 부톡시카르보닐기, sec-부톡시카르보닐기, tert-부톡시카르보닐기 등을 들 수 있다.

할로겐원자가 치환된 알콕시카르보닐기의 예로서는, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐기를 들 수 있고, 알킬실릴기가 치환된 알콕시카르보닐기의 예로서는, 2-트리메틸실릴에톡시카르보닐기를 들 수 있다.

알킬기로서는, 메톡시에틸기, 에톡시메틸기, 2-메톡시에틸기, 2-메톡시에톡시메틸기 등의 알콕시알킬기; 2,2,2-트리클로로에틸기 등의 할로겐화 알킬기; 또는 벤질기, α-나프틸메틸기, β-나프틸메틸기, 디페닐메틸기, 트리페닐메틸기 등의 아릴기로 치환된 저급 알킬기를 들 수 있다.

이들 중, 지방족 아실기, 방향족 아실기, 아랄킬기가 바람직하고, 4-톨루오일기, 4-클로로벤조일기, 벤조일기가 보다 바람직하다. R¹ 및 R²중의 "보호된 카르보닐기"란 용어에 있어서의 보호기란, 수소첨가분해, 가수분해 및 광분해 등의 적절한 화학적 처리에 의해 제거될 수 있는 것을 의미하며, 예를 들면, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기 등의 저급 알킬기; 2-(트리메틸실릴)에틸기, 2-(트리에틸실릴)에틸기 등의 실릴화 저급 알킬기; 또는 상기 아랄킬기 혹은 알콕시알킬기 등을 들 수 있고, 메틸기, tert-부틸기 또는 벤질기가 보다 바람직하다.

X란 용어에 있어서의 할로겐원자란, 불소원자, 염소원자, 브롬원자 또는 요드원자를 의미한다.

X란 용어에 있어서의 알콕시기 또는 알킬티오기로서는, 상기 저급 알킬기, 아랄킬기 또는 알콕시알킬기를 지닌 알콕시기 또는 알킬티오기를 들 수 있고, 메톡시기, 메톡시에톡시기 또는 메틸티오기가 바람직하다.

Z란 용어에 있어서의 치환되어 있어도 되는 탄소원자란, 식으로 표시된 치환기(Xq 및 NHR³)를 1개 또는 2개 지닌 탄소원자, 혹은 치환기를 지니지 않을 경우에는 수소원자를 지닌 탄소원자를 의미한다.

R³의 용어에 있어서의 아실기로서는, 상기 지방족 아실기, 방향족 아실기, 알콕시카르보닐기 또는 아랄킬옥시카르보닐기, 또는 메탄술포닐기, 트리플루오로메탄술포닐기 등의 저급 알칸술포닐기 혹은 벤젠술포닐기, p-톨루엔술포닐기 등의 아릴술포닐기를 들 수 있고; 바람직하게는 지방족 아실기, 방향족 아실기 혹은 저급 알칸술포닐기를 들 수 있고; 특히, 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 벤조일기, 메탄술포닐기 등을 들 수 있다. 치환기로서 NHR³를 1개이상 지닐 경우, 각 NHR³중의 R³은, 독립적으로 상기 기중 어느 하나를 표시한다.

R⁴, R¹¹ 및 R¹⁴의 용어에 있어서의 "보호된 하이드록시메틸기", "수산기의 보호기"에 있어서의 보호기는, R¹ 및 R²에 대해서 설명한 것으로부터 선택하면 된다.

상기 일반식(1) 내지 (17)중 어느 하나로 표시되는 구조를 지닌 당잔기로서는, 바람직하게는 전술한 바와 같이, 천연형 당류로부터 유래된 것, 합성형 당류로부터 유래된 것, 당잔기로부터의 유도체 또는 할로겐화 당잔기 등을 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

상기 일반식(4) 내지 (7)중 어느 하나로 표시되는 화합물의 염이란, 해당 화합물에 있어서의 인산잔기에 의해 형성된 것이면 된다. 이러한 염의 예로서는, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리금속염; 마그네슘염, 칼슘염, 바륨염 등의 알칼리토금속염; 알루미늄염, 철염 등의 금속염; 암모늄염; 또는 1급, 2급, 3급 알킬아민염 등의 알킬아민염 등을 들 수 있다.

여기서 말하는 1급 아민으로서는, 메틸아민, 에틸아민, 프로필아민, 이소프로필아민, 부틸아민, 헥실아민, 옥틸아민 등의 알킬아민; 시클로헥실아민 등의 시클로알킬아민; 또는 벤질아민 등을 들 수 있다.

또, 2급 아민으로서는, 디에틸아민, 디이소프로필아민, 디부틸아민, 디헥실아민, 디옥틸아민 등의 디알킬아민; 디시클로헥실아민 등의 디시클로알킬아민; 또는 피페리딘, 모르폴린, N-메틸피페라딘 등의 고리식 아민 등을 들 수 있다.

또한, 3급 아민으로서는, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, N-에틸디이소프로필아민, 트리부틸아민, 트리헥실아민, 트리옥틸아민, N-에틸디시클로헥실아민, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 등의 3급 알킬아민; 아닐린, N,N-디메틸아닐린, N,N-디에틸아닐린, N,N-디부틸아닐린, N,N-디옥틸아닐린 등의 아닐린화합물; 피리딘, 2,6-디메틸피리딘, 2,4,6-루티딘, 니코틴아미드 등의 피리딘화합물; 글리신, 알라닌, 피롤린, 리신, 아르기닌, 글루타민 등의 아미노산; 또는 신코니딘, 1-(1-나프틸)에틸아민, 1-페닐에틸아민 등의 광학활성아민 등을 들 수 있고, 이들은 모두 1가 또는 2가 염도 포함한다.

본 발명의 상기 일반식(4) 내지 (7)중 어느 하나로 표시되는 화합물은, 수분을 흡수해서 흡착수를 지니거나, 수화물로 될 경우가 있으나, 이들도 모두 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명에 의한 1-인산화 당유도체의 아노머혼합물은, 하기 반응식(I):

반응식(I)

로 표시되는 반응에 의해 제조해도 되나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

상기 반응식(I)에 있어서, R¹, R², R³, R⁴, X, W, Z, m, n, p, q 및 r은 상기 일반식(1)에서 정의한 것과 마찬가지이고, Y는 불소원자, 염소원자, 브롬원자 또는 요드원자이다. m이 1, 2 또는 3일 경우, 각각 인산트리에스테르, 인산 디에스테르 또는 인산모노에스테르가 제공된다. 이들을, 각각, 1-인산화 당유도체트리머, 1-인산화 당유도체다이머 및 1-인산화 당유도체모노머라 칭한다. 또, 1-인산화 당유도체트리머, 1-인산화 당유도체다이머 및 1-인산화 당유도체모노머는, 일괄적으로 1-인산화 당유도체라 칭하며, 그 혼합비는 한정되지 않는다.

인산으로서는, 오르토인산 등의 수분함량이 낮은 것이 바람직하나, 특히 한정되지 않는다.

염기에 대해서는, 반응을 억제하지 않고, 탈산소제로서 작용을 하는 한 특히 한정되지 않는다. 바람직한 무기염기로서는, 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 탄산염 또는 수산화물을 들 수 있고, 바람직한 유기염기로서는, 3급 알킬아민류, 아닐린류, 피리딘류, 광학활성 아민류 등을 들 수 있다.

탈수제는, 용매 또는 첨가제로부터의 수분이 반응에 악영향을 주지 않을 경우 사용해도 되며, 물에 대한 흡착성 또는 반응성이 적절한 한 특히 제한은 없고, 바람직하게는 몰리큘러시브(molecular seives), 5산화인 등을 들 수 있다.

반응은 통상 용매의 존재하에 행한다. 용매에 대해서는, 반응을 억제하지 않고, 출발물질을 어느 정도 용해시키지 않는 한 제한은 없다. 사용가능한 용매로서는, 헥산, 헵탄 등의 지방족 탄화수소류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 아니솔 등의 방향족 탄화수소류; 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 4염화탄소, 디클로로에탄, 클로로벤젠, 디클로로벤젠 등의 할로겐화 탄화수소류; 포름산에틸, 아세트산에틸, 아세트산프로필, 아세트산 n-부틸, 디에틸카보네이트 등의 에스테르류; 디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 테트라하이드로푸란, 다이옥산, 디메톡시에탄, 디글림 등의 에테르류; 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 이소부틸니트릴 등의 니트릴류; 포름아미드, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸-2-피롤리돈, N-메틸피롤리디논, N,N-디메틸-2-이미다졸리디논 등의 아미드류; 아세톤, 2-부타논, 메틸이소프로필케톤, 메틸이소부틸케톤 등의 케톤류; 이들로부터 선택된 2종이상의 혼합물 등을 들 수 있다.

반응온도는 특히 제한은 없고, 통상 -80℃ 내지 60℃, 바람직하게는 -10℃ 내지 25℃이다.

반응기간은 출발물질, 시약, 용매의 종류, 반응온도 등의 다수의 요인에 따라 다르나, 반응종료까지 통상 1분 내지 24시간, 바람직하게는 10분 내지 2시간이다.

당유도체(14)와 인산과의 비에 대해서는 제약이 없고, 반응은 통상 화합물(14):인산 = 1:10 내지 3:1에서 행한다. 이 경우, 생성물(1)은 화합물(14):인산의 비율에 따라, 인산에 결합된 당 잔기수(즉, m)가 1, 2 또는 3인 화합물의 혼합물이어도 된다.

또, 하기 반응식(II):

반응식(II)

로 표시된 반응에 의해 α체 또는 β체의 1-인산화 당유도체(16a) 또는 (16b)가 제조된다.

상기 반응식에 있어서, R¹, R², R³, R⁴, X, W, Z, m, n, p, q 및 r은 상기 일반식(1)에서 정의한 것과 마찬가지이다.

본 제조방법에 의하면, 일반식(15)로 표시되는 1-인산화 당유도체는, 모노머, 다이머 또는 트리머 혹은 이들의 혼합물이어도, 이들은 반응계에서 일반식(16)으로 표시되는 1-인산화 당유도체로 전환될 수 있기 때문에 그들의 혼합비에 대해서는 특히 한정되지 않는다.

바람직한 인산은, 제한은 없으나, 오르토인산 등의 수분함량이 낮은 것이어도 된다.

염기는, 화합물(16)에 있어서의 인산기와 염을 형성해서 α체 화합물(16a) 또는 β체 화합물(16b)중 한쪽을 선택적으로 결정화시키기 위해 중요하다. 가장 적합한 염기는, 반응에 사용된 용매에 비추어 선택하면 되고; 바람직하게는 상기 무기염기, 3급 알킬아민류, 아닐린류, 피리딘류, 아미노산류, 광학활성아민류 등을 들 수 있고, 형성된 염은 어느 것도 1가염 및 2가염을 포함한다.

탈수제는, 용매 또는 첨가제로부터의 수분이 반응에 악영향을 주지 않을 경우 사용해도 되며, 물에 대한 흡착성 또는 반응성이 적절한 한 특히 제한은 없고; 바람직하게는 몰리큘러시브, 5산화인 등을 들 수 있다.

반응은 통상 용매의 존재하에 행한다. 용매에 대해서는, 반응을 억제하지 않고, 출발물질을 어느 정도 용해시켜, 화합물(16)중의 인산기의 염형성에 의해 생성된 α체(16a) 또는 β체(16b)중 한쪽의 선택적인 결정화를 촉진하는 한 제한은 없고, 그 예로서는 상기 지방족 탄화수소류, 방향족 탄화수소류, 할로겐화 탄화수소류, 에스테르류, 에테르류, 니트릴류, 아미드류, 케톤류 및 이들로부터 선택된 2종이상의 혼합물 등을 들 수 있다.

반응온도는, 화합물(16)중의 인산기의 염형성에 의해 생성된 α체(16a) 또는 β체(16b)중 한쪽의 선택적인 결정화를 촉진하도록 화합물(15)과 (16)간의 평형반응을 가속시키는 한 제한은 없고, 통상 -80℃ 내지 60℃, 바람직하게는 -10℃ 내지 25℃이다.

반응기간은 출발물질, 시약, 용매의 종류, 반응온도 등의 다수의 요인에 따라 다르나, 반응종료까지 통상 3시간 내지 1주일, 바람직하게는 6시간 내지 24시간이다.

당유도체(1)와 인산과의 비에 대해서는 제약이 없고, 반응은 통상 화합물(1):인산 = 1:10 내지 3:1에서, 반응계의 pH가 통상 1 내지 7, 적합하게는 1 내지 4의 산성범위에서 행한다. 산성 조건하에 행함으로써, 아노머간의 평형반응이 일어난다. 또, 인산기와 염을 형성하는 바와 같은 염기를 공존시킴으로써, 목적으로 하는 당인산의 염이 결정으로 석출된다. 이들 양쪽의 조건이 만족되면, 한쪽의 당인산아노머가 결정으로 석출되는 동시에 아노머간의 평형반응이 일어나, 점차 한쪽의 아노머로 비율이 기울어져 가는 현상이 일어난다.

또, α체 또는 β체의 1-인산화 당유도체(16a) 또는 (16b)는, 염교환반응에 의해 반응계에서 사용되는 것이외의 염기에 의해 인산으로서 단리해도 된다.

여기서 사용가능한 염기로서는, 상기 무기염기, 1급 알킬아민류, 2급 알킬아민류, 3급 알킬아민류, 아닐린류, 피리딘류, 아미노산류, 광학활성아민류 등을 들 수 있고, 형성된 염은 1가염 및 2가염을 포함한다.

보호기는, 하기 반응식(III):

반응식(III)

에 의해 제거해서, 1-인산화 당유도체(17a) 또는 (17b)를 제조한다.

상기 반응식에 있어서, R¹, R², R³, R⁴, X, W, Z, n, p, q 및 r은 상기 일반식(1)에서 정의한 것과 마찬가지이고; 는 R^1'및 R^2'는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 하이드록시메틸기 또는 카르복실기이고; R^3'는 수소원자 또는 아실기이다.

화합물(16a) 또는 (16b)중의 R¹및 R²에 있어서의 하이드록시메틸기 또는 R⁴에 있어서의 수산기의 보호기로서 상기 지방족 아실기, 방향족 아실기 또는 알콕시카르보닐기를 사용하거나, 또는 R¹및 R²에 있어서의 카르복실기의 보호기로서 상기 저급 알킬기를 사용할 경우, 수계 용매에서 염기로 해당 화합물을 처리함으로써 제거해도 된다. 사용가능한 염기로서는, 바람직하게는 탄산나트륨, 탄산칼륨 등의 알칼리금속 탄산염; 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리금속수산화물; 수산화암모늄, 수산화 테트라-n-부틸암모늄 등의 암모늄수산화물; 상기 무기염기, 1급 알킬아민류, 2급 알킬아민류, 3급 알킬아민류 등을 들 수 있다.

사용가능한 용매로서는, 특히 제약은 없고, 통상의 가수분해에 사용되는 것; 바람직하게는 물; 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올 등의 알콜; 상기 에테르류 등을 들 수 있다. 반응온도 및 반응기간은 특히 제약은 없고, 출발물질, 사용된 염기 등의 다수의 요인에 따라 다르고; 통상 반응은 -10℃ 내지 100℃에서 1시간 내지 5일간에 종료해도 된다. 보호기 R³은, 반응온도, 반응기간, 시약의 당량수를 조정함으로써 적절하게 남기거나 동시에 제거해도 된다.

화합물(16a) 또는 (16b)중의 R¹및 R²에 있어서의 하이드록시메틸기 또는 R⁴에 있어서의 수산기의 보호기로서 상기 아랄킬기 또는 아랄킬옥시카르보닐기를 사용하거나, 또는 R¹및 R²에 있어서의 카르복실기의 보호기로서 상기 아랄킬기를 사용할 경우, 이들은, 예를 들면, 금속촉매를 이용한 접촉수소화에 의해 제거해도 된다.

촉매는, 바람직하게는, 팔라듐-탄소, 라네니켈, 산화백금, 백금흑, 로듐-산화알루미늄, 트리페닐포스핀-염화로듐 및 팔라듐-황산바륨으로부터 선택해도 된다. 반응압력은 제약은 없다. 일반적으로, 사용되는 용매는 제약없이 통상의 가수분해에 사용되는 것이면 어느 것이라도 된다. 바람직하게는 물; 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올 등의 알콜류; 상기 에테르류; 상기 에스테르류 등으로부터 선택하면 된다. 반응온도 및 반응기간은 제약없이 출발물질, 사용된 염기 등의 각종 요인에 따라 다르고; 통상 반응은 -10℃ 내지 100℃에서 1시간 내지 5일에 종료된다. 보호기 R³은 통상 남겨두어도 된다.

화합물(16a) 또는 (16b)중의 R¹및 R²에 있어서의 하이드록시메틸기 또는 R⁴에 있어서의 수산기의 보호기로서 상기 실릴기를 사용하거나, 또는 R¹및 R²에 있어서의 카르복실기의 보호기로서 상기 실릴화 저급 알킬기를 사용할 경우, 이들은, 예를 들면, 테트라-n-부틸암모늄플루오라이드 등의 불소음이온을 생성할 수 있는 화합물을 이용해서 제거해도 된다.

용매는 해당 반응을 억제하지 않는 한 제약은 없고, 예를 들면, 상기 에테르류를 사용하면 된다. 반응온도 및 반응기간은 제약없이 출발물질, 사용된 염기 등의 각종 요인에 따라 다르고; 통상 반응은 -10℃ 내지 50℃에서 10분 내지 10시간에 종료된다. 보호기 R³은 통상 남겨두어도 된다.

보호기를 제거할 때, 생성물중의 인산기는 반응계내에 존재하는 염기와 함께 염으로서 얻어진다. 이 염은, 필요에 따라, 다른 염기와의 염으로 전환해도 된다. 이 경우, 사용되는 염기로서는, 상기 무기염기, 1급 알킬아민류, 2급 알킬아민류, 3급 알킬아민류, 아닐린류, 피리딘류, 아미노산류, 광학활성아민류로부터 선택해도 되고, 형성된 염은 1가 또는 2가염을 포함한다.

여기서 사용되는 1-인산화 당유도체란, 인산부분이 에스테르결합을 통해 1위치에 결합되어 있는 당 또는 그 유도체이다.

구체적으로는, 하기 일반식(6):

(식중, R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 하이드록시메틸기 또는 카르복실기이고; R³, X, W, Z, n, p, q 및 r은 상기 일반식(4)에서 정의한 것과 마찬가지임)으로 표시된다.

대표적인 예로서는, 특히 제한은 없지만, 리보스-1-인산, 2-데옥시리보스-1-인산, 2,3-디데옥시리보스-1-인산, 아라비노스-1-인산을 들 수 있으나, 상기 범용성이 높은 아노머선택적인 제조법에 의해 얻을 수 있는 한 특히 구별없이 어떠한 유도체를 사용해도 된다.

1-인산화 당유도체를 구성하는 천연물로부터 유래된 당류의 예로서는, D-아라비노스, L-아라비노스, D-크실로스, L-릭소스, D-리보스 등의 알도펜토스류; D-크실로스, L-크실로스, D-리불로스 등의 케토펜토스류; D-갈락토스, L-갈락토스, D-글루코스, D-탈로스, D-만도스 등의 알도스헥소스류; D-타가토스, L-소르보스, D-사이코스, D-프럭토스 등의 케토헥소스류; D-2-데옥시리보스, D-2,3-디데옥시리보스, D-푸코스, L-푸코스, D-람노스, L-람노스, D-푸코피라노스, L-푸코피라노스, D-람노푸라노스, L-람노푸라노스, D-알로메틸로스, D-퀴노보스, D-안티알로스, D-탈로메틸로스, L-탈로메틸로스, D-디기탈로스, D-디기톡소스, D-시마로스, 티벨로스, 아베쿠오스, 파라토스, 콜리토스, 아스카릴로스 등의 데옥시당류; 글루코사민, 다우노사민 등의 아미노당류; 글루쿠론산, 갈락투론산 등의 우론산류 등을 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명에 의한 뉴클레오사이드의 제조방법에 대해 설명한다. 본 발명에서 사용하는 염기는, 할로겐원자, 알킬기, 할로알킬기, 알케닐기, 할로알케닐기, 알키닐기, 아미노기, 알킬아미노기, 하이드록시기, 하이드록시아미노기, 아미녹시기, 알콕시기, 메르캅토기, 알킬메르캅토기, 아릴기, 아릴옥시기 및/또는 시아노기로 치환되어 있어도 되는 피리미딘, 푸린, 아자푸린 및 데아자푸린으로부터 선택된 천연 또는 합성 염기이다.

치환기로서의 할로겐의 예로서는, 염소, 불소, 브롬, 요드 등을 들 수 있다. 알킬기의 예로서는, 메틸기, 에틸기, 프로필기 등의 탄소수 1 내지 7의 저급 알킬기이다. 할로알킬기의 예로서는, 플루오로메틸기, 디플루오로메틸기, 트리플루오로메틸기, 브로모메틸기, 브로모에틸기 등의 탄소수 1 내지 7의 알킬기를 지닌 것을 들 수 있다. 알케닐기의 예로서는, 비닐기, 알릴기 등의 탄소수 2 내지 7인 것을 들 수 있다. 할로알케닐기의 예로서는, 브로모비닐기, 클로로비닐기 등의 탄소수 2 내지 7의 알케닐기를 지닌 것을 들 수 있다. 알키닐기의 예로서는, 에티닐기, 프로피닐기 등의 탄소수 2 내지 7을 지닌 것을 들 수 있다. 알킬아미노기의 예로서는, 메틸아미노기, 에틸아미노기 등의 탄소수 1 내지 7의 알킬기를 지닌 것을 들 수 있다. 알콕시기의 예로서는, 메톡시기, 에톡시기 등의 탄소수 1 내지 7인 것을 들 수 있다. 알킬메르캅토기의 예로서는, 메틸메르캅토기, 에틸메르캅토기 등의 탄소수 1 내지 7의 알킬기를 지닌 것을 들 수 있다. 아릴기의 예로서는, 페닐기; 메틸페닐기, 에틸페닐기 등의 탄소수 1 내지 5의 알킬기를 지닌 알킬페닐기; 메톡시페닐기, 에톡시페닐기 등의 탄소수 1 내지 5의 알콕시기를 지닌 알콕시페닐기; 디메틸아미노페닐기, 디에틸아미노페닐기 등의 탄소수 1 내지 5의 알킬아미노를 지닌 알킬아미노페닐기; 클로로페닐기, 브로모페닐기 등의 할로게노페닐기 등을 들 수 있다.

피리미딘염기의 예로서는, 시토신, 우라실, 5-플루오로시토신, 5-플루오로우라실, 5-클로로시토신, 5-클로로우라실, 5-브로모시토신, 5-브로모우라실, 5-아이오도시토신, 5-아이오도우라실, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실(티민), 5-에틸시토신, 5-에틸우라실, 5-플루오로메틸시토신, 5-플루오로메틸우라실, 5-트리플루오로시토신, 5-트리플루오로우라실, 5-비닐우라실, 5-브로모비닐우라실, 5-클로로비닐우라실, 5-에티닐시토신, 5-에티닐우라실, 5-프로피닐우라실, 피리미딘-2-온, 4-하이드록시아미노피리미딘-2-온, 4-아미녹시피리미딘-2-온, 4-메톡시피리미딘-2-온, 4-아세톡시피리미딘-2-온, 4-플루오로피리미딘-2-온, 5-플루오로피리미딘-2-온 등을 들 수 있다.

푸린염기의 예로서는, 푸린, 6-아미노푸린(아데닌), 6-하이드록시푸린, 6-플루오로푸린, 6-클로로푸린, 6-메틸아미노푸린, 6-디메틸아미노푸린, 6-트리플루오로메틸아미노푸린, 6-벤조일아미노푸린, 6-아세틸아미노푸린, 6-하이드록시아미노푸린, 6-아미녹시푸린, 6-메톡시푸린, 6-아세톡시푸린, 6-벤조일옥시푸린, 6-메틸푸린, 6-에틸푸린, 6-트리플루오로메틸푸린, 6-페닐푸린, 6-메르캅토푸린, 6-메틸메르캅토푸린, 6-아미노푸린-1-옥사이드, 6-하이드록시푸린-1-옥사이드, 2-아미노-6-하이드록시푸린(구아닌), 2,6-디아미노푸린, 2-아미노-6-클로로푸린, 2-아미노-6-아이오도푸린, 2-아미노푸린, 2-아미노-6-메르캅토푸린, 2-아미노-6-메틸메르캅토푸린, 2-아미노-6-하이드록시아미노푸린, 2-아미노-6-메톡시푸린, 2-아미노-6-벤조일옥시푸린, 2-아미노-6-아세톡시푸린, 2-아미노-6-메틸푸린, 2-아미노-6-시클로프로필아미노메틸푸린, 2-아미노-6-페닐푸린, 2-아미노-8-브로모푸린, 6-시아노푸린, 6-아미노-2-클로로푸린(2-클로로아데닌), 6-아미노-2-플루오로푸린(2-플루오로아데닌) 등을 들 수 있다.

아자푸린염기 및 데아자푸린염기의 예로서는, 6-아미노-3-데아자푸린, 6-아미노-8-아자푸린, 2-아미노-6-하이드록시-8-아자푸린, 6-아미노-7-데아자푸린, 6-아미노-1-데아자푸린, 6-아미노-2-아자푸린 등을 들 수 있다.

뉴클레오사이드 포스포릴라제는, 인산의 존재하에 뉴클레오사이드내의 N-글리코사이드결합의 가인산분해가능한 효소의 통칭이며, 본 발명은 그 역반응을 이용한다. 반응에 사용되는 효소는, 대응하는 1-인산화 당유도체와 염기로부터 소망의 뉴클레오사이드를 형성하는 활성을 지니는 한 종류나 기원은 어느 것이라도 된다. 효소는, 일반적으로 푸린형과 피리미딘형의 2종류로 분류된다. 푸린형 효소의 예로서는, 푸린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.1), 구아노신 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.15)를 들 수 있고, 피리미딘형 효소의 예로서는, 피리미딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.2), 우리딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.3), 티미딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.4) 및 데옥시우리딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.23)를 들 수 있다.

본 발명에 있어서 뉴클레오사이드 포스포릴라제를 발현하는 미생물은, 제약은 없고, 푸린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.1), 구아노신 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.15), 피리미딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.2), 우리딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.3), 티미딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.4) 및 데옥시우리딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.23)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 뉴클레오사이드 포스포릴라제를 발현하는 미생물이면 어느 것이라도 된다.

이러한 미생물의 바람직한 예로서는, 노카르디아(Nocardia)속, 미크로박테리움(Microbacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 셀룰로모나스(Cellulomonas)속, 플라보박테리움(Flabobacterium)속, 클루이베레(Kluyvere)속, 미코박테리움(Micobacterium)속, 헤모필루스(Haemophilus)속, 미코플라나(Micoplana)속, 프로타미노박터(Protaminobacter)속, 칸디다(Candida)속, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 바실루스(Bacillus)속, 호열성 바실루스속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 하프니아(Hafnia)속, 프로테우스(Proteus)속, 비브리오(Vibrio)속, 스타피로코커스(Staphyrococcus)속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속, 사르티나(Sartina)속, 플라노코커스(Planococcus)속, 에세리시아(Escherichia)속, 쿠르티아(Kurthia)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 아시네토박터(Acinotobacter)속, 크산토박터(Xanthobacter)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 리조비움(Rhizobium)속, 살모넬라(Salmonella)속, 클레브시엘라(Klebsiella)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 에르위니아(Erwinia)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 시트로박터(Citrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 아르쓰로박터(Arthrobacter)속, 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속에 속하는 균주를 들 수 있다.

근년의 분자생물학 및 유전공학의 진보에 의하면, 상기 균주내의 뉴클레오사이드 포스포릴라제의 분자생물학적 특성, 아미노산서열 등을 해석함으로써, 해당 균주로부터 단백질의 유전자를 취득하고, 해당 유전자 및 그 발현에 필요한 제어영역이 삽입된 재조합플라스미드를 구축하고, 이 플라스미드를 주어진 숙주에 도입해서, 단백질을 발현시킨 유전자재조합균주를 생산하는 것이 가능해졌으며, 또, 이들 프로세스는 비교적 용이하다. 최근의 기술수준에 비추어, 뉴클레오사이드 포스포릴라제의 유전자를 주어진 숙주에 도입한 유전자재조합균주도, 본 발명에 의한 뉴클레오사이드 포스포릴라제를 발현하는 미생물에 포함된다.

여기서 발현에 필요한 제어영역이란, 프로모터서열(전사를 제어하는 오퍼레이터서열), 리보좀결합서열(SD서열), 전사종결서열 등이다. 프로모터서열의 예로서는, 대장균으로부터 유래된 트립토판오페론의 trp오페레이터; 락토즈오페론내의 lac프로모터; 람다페이지로부터 유래된 PL프로모터 및 PR프로모터; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래된 글루코네이트신타제프로모터(gnt); 알칼리프로테아제프로모터(apr); 중성 프로테아제프로모터(npr); α-아밀라제프로모터(amy) 등을 들 수 있다. tac프로모터와 같이 독자적으로 변성설계된 서열을 사용해도 된다. 리보좀결합서열은, 예를 들면, 대장균 혹은 바실러스 서브틸리스로부터 유래된 서열이어도 되나, 대장균 혹은 바실러스 서브틸리스 등의 소정의 숙주에서 기능할 수 있다면 어느 서열이라도 된다. 예를 들면, DNA합성에 의해 형성된 콘센서스서열, 즉, 16S 리보좀 RNA내의 3'-말단영역에 상보적인 염기가 4개이상 연속한 서열을 사용할 수 있다. 전사종결서열은, 반드시 필요한 것은 아니고, ρ-인자비의존성인 터미네이터, 예를 들면, 리포프로테인 터미네이터, trp오페론 터미네이터 등을 사용해도 된다. 바람직하게는, 재조합플라스미드상의 이들 제어영역은, 다음과 같이 순차 정렬되어 있어도 된다: 5'-말단의 상류로부터, 프로모터서열, 리보좀결합서열, 뉴클레오사이드 포스포릴라제 코딩유전자 및 전사종결서열.

여기서 플라스미드의 예로서는, 대장균내의 자율복제영역을 지닌 pBR322, pUC18, 블루스크립트 II SK(+), pKK223-3 및 pSC101; 바실러스 서브틸리스내의 자율복제영역을 지닌 pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, φ1, φ105 등을 벡터로서 이용하는 것이 가능하다. 2종이상의 숙주에서 자율복제가능한 플라스미드의 예로서는, pHV14, TRp7, Yep7, pBS7 등을 벡터로서 이용하는 것이 가능하다.

여기서 주어진 숙주는, 후술하는 실시예의 대장균(Escherichia coli)을 대표예로서 들 수 있으나, 이 대장균으로 한정되지 않고, 바실러스 서브틸리스 등의 바실러스속 균주, 효모, 방선균 등 기타의 균주를 사용해도 된다.

본 발명에 있어서의 뉴클레오사이드 포스포릴라제활성은, 효소활성을 지닌 상기 균주이외에도, 효소활성을 나타내는 균체의 처리물 및 그의 고정화물로부터 얻을 수 있다. 균체의 처리물로서는, 예를 들면, 아세톤건조균체 또는 기계적 파괴, 초음파분쇄, 동결·융해, 가압·감압, 삼투압법, 자기소화, 세포벽분해, 계면활성제처리 등의 적절한 절차에 의해 제작된 균체파쇄물 등을 들 수 있다. 필요에 따라, 균체는 또한, 황산암모늄침전, 아세톤침전 또는 컬럼크로마토그래피에 의해 더욱 정제해도 된다.

본 발명에 있어서는, 인산이온과 난수용성 염을 형성가능한 금속양이온은, 제약없이, 반응시 부산물로서 인산이온과 난수용성 염을 형성하여 침전시킬 수 있는 금속양이온이면 어느 것이라도 사용가능하며; 예를 들면, 칼슘이온, 마그네슘이온, 바륨이온, 철이온, 코발트이온, 니켈이온, 구리이온, 은이온, 몰리브덴이온, 납이온, 아연이온, 리튬이온 등을 들 수 있다. 이들 중, 반응에 악영향을 주지 않는 공업적으로 보편적이고 안전한 금속이온, 예를 들면, 칼슘이온, 바륨이온, 알루미늄이온, 마그네슘이온 등이 특히 바람직하다.

본 발명에 있어서 인산이온과 난수용성 염을 형성가능한 금속양이온은, 반응액중에, 인산이온과 난수용성 염을 형성가능한 금속양이온과 염소이온, 질소이온, 탄산이온, 황산이온, 아세트산이온 및 하이드록시이온으로부터 선택된 적어도 1종의 음이온과의 염을 첨가함으로써 얻을 수 있다. 그러한 염의 예로서는, 염화칼슘, 질화칼슘, 탄산칼슘, 황산칼슘, 아세트산칼슘, 염화바륨, 질화바륨, 탄산바륨, 황산바륨, 아세트산바륨, 염화알루미늄, 질화알루미늄, 탄산알루미늄, 황산알루미늄, 아세트산알루미늄, 수산화칼슘, 수산화바륨, 수산화알루미늄, 수산화마그네슘, 염화마그네슘, 질화마그네슘, 탄산마그네슘, 황산마그네슘, 아세트산마그네슘 등을 들 수 있다.

이러한 금속양이온은, 반응액중에 펜토스-1-인산과의 염으로서 존재해도 되며; 예를 들면, 리보스-1-인산 칼슘염, 2-데옥시리보스-1-인산 칼슘염, 2,3-디데옥시리보스-1-인산 칼슘염, 아라비노스 -1-인산 칼슘염, 리보스-1-인산 바륨염, 2-데옥시리보스-1-인산 바륨염, 2,3-디데옥시리보스-1-인산 바륨염, 아라비노스-1-인산 바륨염, 리보스-1-인산 알루미늄염, 2-데옥시리보스-1-인산 알루미늄염, 2,3-디데옥시리보스-1-인산 알루미늄염, 아라비노스-1-인산 알루미늄염 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 뉴클레오사이드화합물을 제조하는 반응은, 목적으로 하는 뉴클레오사이드, 기질로서의 1-인산화 당유도체 및 염기, 반응촉매로서의 뉴클레오사이드 포스포릴라제 또는 효소의 활성을 발현하는 미생물, 반응계로부터 인산을 제거하기 위해 첨가하는 금속염의 종류와 성질에 따라, 적절한 pH 및 온도 등의 조건하에 적절한 관리폭을 선정하면 되나; 통상, pH는 5 내지 10, 온도는 10 내지 60℃이다. pH가 관리폭을 벗어난 경우, 예를 들면, 목표물 또는 기질의 안정성불량, 효소활성의 저감, 인산과 난수용성 염을 형성하는 데 대한 실패 등에 의해 반응전화율이 저하될 수 있다. 반응도중에 pH가 변하면, 필요에 따라, 염화수소산, 황산 등의 산 혹은 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리를 적절한 시기에 첨가하면 된다. 1-인산화 당유도체 및 염기의 농도는 약 0.1 내지 1000mM이 적당하다. 이들간의 몰비에 대해서는, 1-인산화 당유도체 또는 그 염에 대한 염기의 몰비는 0.1 내지 10, 반응전화율의 점에서, 바람직하게는 0.95이하이다.

첨가된 인산과 난수용성 염을 형성가능한 금속염은, 반응에 사용된 1-인산화 당유도체에 대해 0.1 내지 10의 몰비, 보다 바람직하게는 0.5 내지 5의 몰비로 첨가하면 된다. 상기 염의 첨가수순에 대해서는 제약은 없으나, 일괄첨가 혹은 반응중에 순차 첨가해도 된다. 본 발명은, 기본적으로 용매로서 물을 사용하나, 필요에 따라, 통상의 효소반응에 사용되는 알콜, 디메틸술폭사이드 등의 유기용매를 적절한 양 첨가해도 된다. 고농도의 반응에 있어서는, 기질로서의 염기나 생성물로서의 뉴클레오사이드가 반응액중에 완전히 용해되지 않지만, 이러한 경우에도 본 발명을 적용할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이 제조된 뉴클레오사이드화합물은, 농축, 결정화, 용해, 전해, 이온교환수지나 활성탄을 이용한 흡·탈착 등의 통상의 절차에 의해 단리할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 참조해서 보다 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

3,5-O-비스(4-클로로벤조일)-2-데옥시-D-리보스-1-인산(18) 및 비스[3,5-O-비스(4-클로로벤조일)-2-데옥시-D-리보스-1-일]인산(19)의 아노머혼합물의 제조

아세토니트릴 51㎖와 오르토인산 1.18g과의 혼합물에, 트리-n-부틸아민 2.3g과 몰리큘러시브 4A 5.07g을 첨가하고, 이 혼합물을 교반하 5℃까지 냉각하였다. 1시간후, 이 혼합물에 3,5-O-비스(4-클로로벤조일)-2-데옥시-α-D-리보실클로라이드(순도: 85%) 5.07g을 첨가하고, 얻어진 혼합물을 1시간 교반하여, 표제의 화합물(18)과 (19)의 혼합물[(18):(19) = 3:5, 화합물(18)의 α체/β체 = 5/2]의 아세토니트릴용액을 얻었다.

분석용 샘플의 제조를 위해, 이들 화합물을 시클로헥실아민염으로 전환한 후, 실리카겔컬럼크로마토그래피에 의해 정제하여, 메탄올-아세트산에틸(1:10)에 의한 용출분획으로부터, 표제의 화합물(19)의 2종의 아노머이성체(19a) 및 (19b)를 얻었다.

(19a): 저극성 분획

¹H NMR(CDCl₃, 270MHz) d: 8.0-7.8(m, 8H), 7.4-7.2(m, 8H), 6.06(m, 1.2H), 5.98(m, 0.8H), 5.56(m, 1.2H), 5.41(m, 0.8H), 4.7-4.3(m, 6H), 2.6-2.4(m, 1H), 2.75-2.6(m, 2H), 2.5-2.3(m, 2H), 2.2-1.9(m, 2H), 1.8-1.6(m, 2H), 1.6-0.9(m, 8H); MS(APCI) m/z 883(M-H).

(19b): 고극성 분획

¹H NMR(CDCl₃, 270MHz) d: 8.0-7.8(m, 8H), 7.4-7.2(m, 8H), 6.1-5.9(m, 2H), 5.55(m, 0.67H), 5.39(m, 1.33H), 4.7-4.3(m, 6H), 3.1-2.85(m, 1H), 2.75-2.4(m, 2H), 2.32(m, 2H), 2.2-1.9(m, 2H), 1.8-1.6(m, 2H), 1.6-0.9(m, 8H); MS(APCI) m/z 883(M-H).

실시예 2

2-부타논 49㎖와 오르토인산 1.11g과의 혼합물에, 트리-n-부틸아민 2.11g과 몰리큘러시브 4A 4.9g을 첨가하고, 이 혼합물을 교반하 5℃까지 냉각하였다. 또, 이 혼합물에 3,5-O-비스(4-클로로벤조일)-2-데옥시-α-D-리보실클로라이드(순도: 85%) 4.9g을 첨가하고, 얻어진 혼합물을 10분간 교반하여, 표제의 화합물(18)과 (19)의 혼합물[(18):(19) = 1:4, 화합물(18)의 α체/β체 = 7/10]의 2-부타논용액을 얻었다.

실시예 3

2-부타논 2ℓ와 오르토인산 136.8g과의 혼합물에, 트리-n-부틸아민 90.6g과 몰리큘러시브 4A 200g을 첨가하고, 이 혼합물을 교반하 5℃까지 냉각하였다. 1시간교반후, 이 혼합물에 3,5-O-비스(4-클로로벤조일)-2-데옥시-α-D-리보실클로라이드(순도: 85%) 200g을 첨가하고, 얻어진 혼합물을 2시간 교반하여, 표제의 화합물(18)과 (19)의 혼합물[(18):(19) = 5:4, 화합물(18)의 α체/β체 = 5/2]의 2-부타논용액을 얻었다.

실시예 4

3,5-O-비스(4-클로로벤조일)-2-데옥시-α-D-리보스-1-인산(18a)의 제조

실시예 1에서 제조한 아세토니트릴용액을 교반하 5℃까지 냉각하고, 해당 혼합물에 오르토인산 2.29g을 첨가하였다. 3시간 교반후, 결정화를 개시하고 나서, 얻어진 혼합물은 농후한 현탁액으로 되었다. 5시간후, 반응현탁액중의 표제의 화합물(18a)의 α체/β체의 비는 10/1이었다. 몰리큘러시브에 의해 혼합물로서 결정을 회수하였다. 이 고형물을 메탄올 100㎖에 용해시키고, 재차 여과하여 몰리큘러시브를 제거하였다. HPLC분석에 의하면, HPLC상에 β 체없이 표제의 화합물(18a) 3.68g이 메탄올용액중에 함유되어 있는 것을 알 수 있었다(출발물질의 순도로부터 환산한 후의 수율: 74.6%).

실시예 5

실시예 2에서 제조한 2-부타논용액을 교반하 5℃까지 냉각하고, 해당 용액에 오르토인산 2.2g을 첨가하였다. 1시간 교반후, 결정의 석출이 개시되어, 농후한 현탁액을 얻었다. 20시간후, 반응현탁액중의 상기 화합물(18a)의 α체/β체의 비는 8/1이었다. 이 현탁액에 트리-n-부틸아민 6.33g을 첨가하여 석출된 결정을 용해시키고, 여과에 의해 몰리큘러시브를 제거하였다. 이 여과액에 톨루엔 250㎖를 첨가하고, 얻어진 용액을 물 55㎖로 수세하고, 유기층을 빙냉하였다. 이 혼합물에 시클로헥실아민 2.32g을 첨가하고, 교반하 결정화하였다. 1시간후, 석출된 결정을 여과에 의해 회수하고, 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(18a)의 디시클로헥실아민염 3.19g을 무색분말로서 얻었다(출발물질의 순도로부터 환산한 후의 수율: 64.7%; α체:β체 = 97.5:2.5).

¹H NMR(DMSO-d₆, 270MHz) d: 8.00(d, J=8.6Hz, 2H), 7.96(d, J=8.6Hz, 2H), 7.58(d, J=8.6Hz, 2H), 7.58(d, J=8.6Hz, 2H), 5.82(dd, J=5.3, 5.3Hz, 1H), 5.36(d, J=8.6Hz, 1H), 4.6-4.3(m, 3H), 4.7-3.5(br, 6H), 2.7-2.6(m, 2H), 2.55-2.4(m, 1H), 2.25(d, J=4.2Hz, 1H), 1.85-1.75(m, 4H), 1.7-1.6(m, 4H), 1.55-1.45(m, 2H), 1.25-0.9(m, 10H); MS(APCI) m/z 590(M+C₆H₁₄N).

실시예 6

실시예 3에서 제조한 2-부타논용액을 교반하 5℃까지 냉각하고, 1시간 교반후, 결정의 석출이 개시되어, 농후한 현탁액을 얻었다. 23시간후, 반응현탁액중의 상기 화합물(18a)의 α체/β체의 비는 7/1이었다. 이 현탁액에 트리-n-부틸아민 259g을 첨가하여 석출된 결정을 용해시키고, 여과에 의해 몰리큘러시브를 제거하였다. 이 여과액을 물 2.2ℓ로 수세하고, 수층을 톨루엔 1ℓ로 추출하였다. 유기층을 모아서 빙냉하였다. 이 혼합물에 시클로헥실아민 87.5g을 첨가하고, 교반하 결정화하였다. 1시간후, 석출된 결정을 여과에 의해 회수하고, 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(18a)의 디시클로헥실아민염 213g을 무색분말로서 얻었다(출발물질의 순도로부터 환산한 후의 수율: 78.1%; α체:β체 = 96.9:3.1).

실시예 7

2-데옥시-α-D-리보스-1-인산(20)의 제조

실시예 4에서 제조한 메탄올용액에 수산화암모늄 수용액 20㎖를 첨가하고, 얻어진 혼합물을 실온에서 교반하였다. 28시간 교반후, 석출된 결정을 여과에 의해 회수하고, 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(20)의 암모늄염 589㎎을 무색분말로서 얻었다(수율: HPLC상의 β체없이 21.1%).

실시예 8

2-데옥시-α-D-리보스-1-인산(20)의 제조

실시예 6에서 제조한 화합물(18a)을 메탄올 2.3ℓ 및 수산화암모늄수용액 450㎖의 혼합액에 현탁하고, 얻어진 혼합물을 실온에서 교반하였다. 28시간 교반후, 석출된 결정을 여과에 의해 회수하고, 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(20)의 암모늄염 62.0g을 무색분말로서 얻었다(수율: HPLC상의 β체없이 81.0%).

¹H NMR(D₂O, 270MHz) d: 5.56(s, 1H), 4.03(m, 2H), 3.52(dd, J=3.3, 12.2Hz, 1H), 3.41(dd, J=5.3, 12.2Hz, 1H), 2.17(m, 1H), 1.87(d, J=13.9Hz, 1H); MS(APCI) m/z: 213(M-H).

실시예 9

2,3,5-O-트리스(4-클로로벤조일)-α-D-리보스-1-인산(21)의 제조

메틸이소부틸케톤 67㎖와 오르토인산 3.32g과의 혼합액에, 트리-n-부틸아민 2.11g 및 몰리큘러시브 4A 6.6g을 첨가하고, 얻어진 혼합액을 교반하 5℃까지 냉각하였다. 해당 혼합물에 2,3,5-O-트리스(4-클로로벤조일)-α-D-리보실 클로라이드 6.66g을 첨가하였다. 1시간후, 결정의 석출이 개시되어, 농후한 현탁액이 얻어졌다. 10시간후, 반응현탁액중의 표제의 화합물(21)의 α체/β체의 비는 10/1이었다. 이 현탁액에 트리-n-부틸아민 6.33g을 첨가하여 석출된 결정을 용해시키고, 여과에 의해 몰리큘러시브를 제거하였다. 이 여과액을 물 55㎖로 수세하고, 유기층을 빙냉하였다. 이 혼합물에 시클로헥실아민 2.4g을 첨가하고, 교반하 결정화하였다. 1시간후, 석출된 결정을 여과에 의해 회수하고, 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(21)의 디시클로헥실아민염 7.02g을 무색분말로서 얻었다(수율: 73.0%; α체:β체 = 99:1).

¹H NMR(DMSO-d₆, 270MHz) d: 8.2-7.8(m, 6H), 7.6-7.4(m, 6H), 5.9-5.7(m, 1H), 5.6-5.4(m, 3H), 4.6-4.3(m, 1H), 4.7-3.5(br, 6H), 2.7-2.6(m, 2H), 1.9-1.7(m, 4H), 1.7-1.6(m, 4H), 1.55-1.4(m, 2H), 1.3-0.9(m, 10H); MS(APCI) m/z 745(M+C₆H₁₄N).

실시예 10

α-D-리보스-1-인산(22)의 제조

실시예 9에서 제조한 화합물(21)을 메탄올 105㎖ 및 수산화암모늄수용액 21㎖의 혼합액에 현탁하고, 얻어진 혼합물을 실온에서 교반하였다. 32시간 교반후, 석출된 결정을 여과에 의해 회수하고, 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(22)의 암모늄염 1.90g을 무색분말로서 얻었다(수율: HPLC상의 β체없이 86.0%).

¹H NMR(D₂O, 270MHz) d: 5.6(m, 1H), 4.2(m, 1H), 4.1-4.0(m, 2H), 3.75(m, 1H), 3.7(m, 1H); MS(APCI) m/z: 229(M-H).

실시예 11

5-O-(4-클로로벤조일)-2,3-디데옥시-α-D-리보스-1-인산(23)의 제조

아세토니트릴 33㎖와 오르토인산 3.5g과의 혼합액에, 트리-n-부틸아민 2.2g 및 몰리큘러시브 4A 3.3g을 첨가하고, 얻어진 혼합액을 교반하 5℃까지 냉각하였다. 해당 혼합물에 5-O-(4-클로로벤조일)-2,3-디데옥시-α-D-리보실 클로라이드 3.28g을 첨가하였다. 1시간후, 결정의 석출이 개시되어, 농후한 현탁액이 얻어졌다. 20시간후, 반응현탁액중의 표제의 화합물(23)의 α체/β체의 비는 10/1이었다. 이 현탁액에 트리-n-부틸아민 6.5g을 첨가하여 석출된 결정을 용해시키고, 여과에 의해 몰리큘러시브를 제거하였다. 이 여과액을 톨루엔 70㎖로 희석하고 나서 물 55㎖로 수세하고, 유기층을 빙냉하였다. 이 혼합물에 시클로헥실아민 2.5g을 첨가하고, 교반하 결정화하였다. 1시간후, 석출된 결정을 여과에 의해 회수하고, 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(23)의 디시클로헥실아민염 4.56g을 무색분말로서 얻었다(수율: 71.5%; α체:β체 = 97:3).

¹H NMR(DMSO-d₆, 270MHz) d: 8.2-7.8(m, 2H), 7.6-7.4(m, 2H), 5.9-5.7(m, 1H), 5.6-5.4(m, 1H), 4.6-4.3(m, 1H), 4.7-3.5(br, 6H), 2.7-2.6(m, 2H), 1.9-1.7(m, 8H), 1.7-1.6(m, 4H), 1.55-1.4(m, 2H), 1.3-0.9(m, 10H); MS(APCI) m/z 374(M+C₆H₁₄N).

실시예 12

2,3-디데옥시-α-D-리보스-1-인산(24)의 제조

실시예 11에서 제조한 화합물(23)을 메탄올 46㎖ 및 수산화암모늄수용액 10㎖의 혼합액에 현탁하고, 얻어진 혼합물을 실온에서 교반하였다. 30시간 교반후, 석출된 결정을 여과에 의해 회수하고, 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(24)의 암모늄염 1.68g을 무색분말로서 얻었다(수율: HPLC상의 β체없이 85.0%).

¹H NMR(D₂O, 270MHz) d: 5.2(m, 1H), 4.1-3.9(m, 1H), 3.6-3.3(m, 2H), 2.1-2.3(m, 2H), 1.9-1.7(m, 2H); MS(APCI) m/z: 197(M-H).

실시예 13

2,3,5-O-트리스(4-클로로벤조일)-α-D-아라비노푸라노실-1-인산(25)의 제조

메틸이소부틸케톤 67㎖와 오르토인산 3.3g과의 혼합액에, 트리-n-부틸아민 2.1g 및 몰리큘러시브 4A 6.6g을 첨가하고, 얻어진 혼합액을 교반하 5℃까지 냉각하였다. 해당 혼합물에 2,3,5-O-트리스(4-클로로벤조일)-α-D-아라비노푸라노실 클로라이드 6.6g을 첨가하였다. 1시간후, 결정의 석출이 개시되어, 농후한 현탁액이 얻어졌다. 8시간후, 반응현탁액중의 표제의 화합물(25)의 α체/β체의 비는 10/1이었다. 이 현탁액에 트리-n-부틸아민 6.3g을 첨가하여 석출된 결정을 용해시키고, 여과에 의해 몰리큘러시브를 제거하였다. 이 여과액을 물 55㎖로 수세하고, 유기층을 빙냉하였다. 이 혼합물에 시클로헥실아민 2.4g을 첨가하고, 교반하 결정화하였다. 1시간후, 석출된 결정을 여과에 의해 회수하고, 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(25)의 디시클로헥실아민염 6.72g을 무색분말로서 얻었다(수율: 70.5%; α체:β체 = 99:1).

MS(APCI) m/z 745(M+C₆H₁₄N).

실시예 14

α-D-아라비노푸라노실-1-인산(26)의 제조

실시예 13에서 제조한 화합물(25)을 메탄올 94㎖ 및 수산화암모늄수용액 18㎖의 혼합액에 현탁하고, 얻어진 혼합물을 실온에서 교반하였다. 48시간 교반후, 석출된 결정을 여과에 의해 회수하고, 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(26)의 암모늄염 1.72g을 무색분말로서 얻었다(수율: HPLC상의 β체없이 82.0%).

¹H NMR(D₂O, 270MHz) d: 5.3(m, 1H), 3.95-3.3(m, 5H); MS(APCI) m/z: 229(M-H).

실시예 15

(2R)-2-벤질옥시메틸-1,3-디옥소란-4-인산(27)의 제조

(2R)-2-벤질옥시메틸-4-(R,S)-아세톡시-1,3-디옥소란 1.06g의 에테르 12㎖ 용액에, 빙냉하, 다이옥산중의 4N염화수소산용액 4㎖를 첨가하였다. 3.5시간 교반후, 해당 혼합물을 실온으로 데우고, 농축에 의해 용매를 제거한 후, 잔류물을 또, 톨루엔으로 공비처리하여, (2R)-2-벤질옥시메틸-1,3-디옥소라닐 클로라이드 500㎎을 무색투명한 오일로서 얻었다. 아세토니트릴 1.1㎖에, 오르토인산 0.27g, 트리-n-부틸아민 0.66㎖ 및 몰리큘러시브 4A 0.23g을 순차 첨가하고, 얻어진 혼합물을 1.5시간 교반하였다. 이 현탁액에 빙냉하 상기 오일 0.27g을 첨가하고, 얻어진 혼합물을 빙냉하 5.5시간 교반하였다. 이 혼합물에 트리-n-부틸아민 0.6㎖를 첨가하고, 30분간 교반한 후, 해당 혼합물을 톨루엔으로 희석하고 물로 추출하였다. 수층을 n-부탄올로 추출한 후 농축하였다. 얻어진 농축액을 톨루엔에 용해시키고, 이 용액에 시클로헥실아민을 첨가하여 표제의 화합물(27)의 시클로헥실아민염을 백색고체로서 얻었다.

¹H NMR(D₆O) δ: 0.98-1.10(2H, m), 1.14-1.23(6H, m), 1.47-1.51(2H, m), 1.61-1.64(4H, m), 1.78-1.83(4H, m), 2.94-3.00(2H, m), 3.46-3.60(2H, m), 3.72-3.79(1H, m), 3.92-4.00(1H, m), 4.41-4.51(2H, m), 5.01-5.03 및 5.22-5.24(총 1H, m), 5.64-5.72(총 1H, m), 7.24-7.30(5H, m); MS(APCI) m/z 390(M+C₆H₁₄N)⁺.

실시예 16

(2R)-2-하이드록시메틸-1,3-디옥소란-4-인산(28)의 제조

메탄올 10㎖에 실시예 15에서 제조한 화합물(27) 0.2g을 용해시키고, 얻어진 용액을 대기압하 촉매로서 10%Pd/C 0.11g을 이용해서 수소첨가처리를 행하였다. 여과에 의해 촉매를 제거한 후, 여과액을 농축하여, 표제의 화합물(28)의 시클로헥실아민염을 얻었다.

¹H NMR(D₆O) δ: 0.99-1.06(2H, m), 1.10-1.24(6H, m), 1.47-1.50(2H, m), 1.62-1.66(4H, m), 1.80-1.85(4H, m), 1.96-3.02(2H, m), 3.51-3.57(2H, m), 3.72-3.79(1H, m), 3.93-4.00(1H, m), 4.99-5.01 및 5.13-5.15(총 1H, m), 5.64-5.67 및 5.70-5.73(총 1H, m); MS(APCI) m/z: 199(M-H)^-.

실시예 17

2,3-디데옥시-3-플루오로-5-O-(4-페닐벤조일)-α-D-에리트로펜토푸라노스-1-인산(29)의 제조

실온에서 오르토인산 62㎎, 트리-n부틸아민 52㎕ 및 아세토니트릴 0.7㎖의 교반된 혼합액에 몰리큘러시브 4A 70㎎을 첨가하고, 얻어진 혼합물을 빙욕하에서 교반하였다. 이 혼합물에 2,3-디데옥시-3-플루오로-5-O-(4-페닐벤조일)-D-에리트로펜토푸라노실 클로라이드 70㎎을 첨가하고, 동일 온도에서 1일간 반응시켰다. 다음에, 이 혼합물에 트리-n-부틸아민 156㎕를, 이어서 탈이온수를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 톨루엔으로 3회 추출하고, 유기층에 시클로헥실아민 48㎕를 첨가하고, 30분간 교반하였다. 이 혼합물을 진공농축하고, 아세톤을 첨가하여 침전물을 생성시키고, 이것을 여과에 의해 회수하였다. 잔류물을 클로로포름으로 세정하고, 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(29)의 디시클로헥실아민염을 백색고체로서 얻었다.

¹H NMR(CD₃OD) δ: 1.1-1.4(10H, m), 1.65(2H, m), 1.89(4H, m), 1.96(4H, m), 2.3-2.5(2H, m), 2.91(2H, m), 4.5(2H, m), 4.6-4.8(1H, m), 5.1-5.3(1H, m), 5.97(1H, m), 7.41(1H, m), 7.47(2H, m), 7.68(2H, m), 7.75(2H, m), 8.08(2H, m); MS(APCI) m/z: 496(M+C₆H₁₄N)⁺.

실시예 18

2,3-디데옥시-3-플루오로-α-D-에리트로펜토푸라노스-1-인산(30)의 제조

실시예 17에서 제조한 화합물(29) 21㎎의 메탄올 1㎖ 용액에, 시클로헥실아민 20㎕를 첨가하고, 얻어진 혼합물을 2주간 반응시켰다. 해당 혼합물을 진공농축하고, 디에틸에테르를 첨가하였다. 상기 혼합물을 여과하고, 고형물을 진공건조하여 표제의 화합물의 디시클로헥실아민염 12㎎을 백색고체로서 얻었다.

¹H NMR(CD₃OD) δ: 1.1-1.4(10H, m), 1.66(2H, m), 1.79(4H, m), 1.94(4H, m), 2.3-2.4(2H, m), 2.88(2H, m), 3.59(2H, m), 4.3-4.4(1H, m), 5.11(0.5H, m; 기타 0.5H는 물의 피크에 가려있으므로 판별불가능하였음), 5.89(1H, m); MS(APCI) m/z: 215(M-H)^-.

실시예 19

2,3-디데옥시-3-플루오로-5-O-(4-페닐벤조일)-D-에리트로펜토푸라노스-1-인산(31)의 제조

실온에서 오르토인산 759㎎, 트리-n부틸아민 646㎕ 및 아세토니트릴 8.6㎖의 교반된 혼합액에 몰리큘러시브 4A 0.86g을 첨가하고, 얻어진 혼합물을 얼음욕조에서 교반하였다. 이 혼합물에 2,3-디데옥시-3-플루오로-5-O-(4-페닐벤조일)-D-에리트로펜토푸라노실 클로라이드 864㎎을 첨가하고, 동일 온도에서 1일간 반응시켰다. 다음에, 이 혼합물에 트리-n-부틸아민 1.94㎖를, 이어서 탈이온수를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 톨루엔으로 3회 추출하고, 순수로 5회 세정하였다. 유기층을 분리하고, 이 유기층에 시클로헥실아민 590㎕를 첨가하고, 30분간 교반하였다. 이 혼합물을 진공농축하고, 아세톤을 첨가한 후, 해당 혼합물을 교반하고 여과하였다. 잔류물을 이소프로필에테르로 더욱 세정하고, 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(31)을 백색고체로서 얻었다. α체:β체 = 66:34.

¹H NMR(CD₃OD) δ: 1.1-1.4ppm(10H, m), 1.66(2H, m), 1.78(4H, m), 1.98(4H, m), 2.3-2.6(2H, m), 2.89(2H, m), 4.44 & 4.46(α & β, 2H), 4.6-4.8(1H, m), 5.1-5.3 & 5.3-5.4(α & β, 1H, m), 5.97 & 6.00(α & β, 1H, m), 7.40(1H, m), 7.47(2H, m), 7.68(2H, m), 7.75(2H, m), 8.07(1H, m), 8.13(1H, m).

실시예 20

2,3-디데옥시-3-플루오로-D-에리트로펜토푸라노스-1-인산(32)의 제조

실시예 19에서 제조한 화합물(31) 0.29g의 메탄올 15㎖ 용액에, 시클로헥실아민 279㎕를 첨가하고, 얻어진 혼합물을 1주간 반응시켰다. 해당 혼합물을 진공농축하고, 디에틸에테르를 첨가하였다. 상기 혼합물을 교반후 여과하고, 고형물을 진공건조하여 표제의 화합물(32)의 디시클로헥실아민염 185㎎을 백색고체로서 얻었다. α체:β체 = 66:34.

¹H NMR(CD₃OD) δ: 1.1-1.4ppm(10H, m), 1.67(2H, m), 1.79(4H, m), 2.2-2.4(2H, m), 2.94(2H, m), 3.59 & 3.62(α & β, 2H, m), 3.3-3.4(2H, m), 5.10 & 5.1-5.24(α & β, 0.5H & 1H, m, α체의 0.5H는 시그널이 물의 피크에 가려있으므로 판별불가능하였음), 5.88 & 5.93(α & β, 1H, m).

실시예 21

3,5-O-디벤조일-2-O-메틸리보스-1-인산(33)의 제조

1,3,5-O-트리벤조일-2-O-메틸-α-D-리보스 2.84g에, 다이옥산중의 4N염화수소산용액 14.5㎖를 첨가하고, 빙냉하 교반하였다. 2.5시간 교반후, 해당 혼합물에 다이옥산중의 4N염화수소산용액 10㎖를 또 첨가하고, 해당 혼합물을 1시간 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔류물을 다이옥산 10㎖로 2회 공비처리하여 3,5-O-디벤조일-2-O-메틸리보실-1-클로라이드를 얻었다. 이와 별도로, 4-메틸-2-펜타논 15㎖에 98%인산 2.98g을 용해시키고, 몰리큘러시브 4A 2.8g을 첨가한 후, 해당 혼합물을 30분간 교반하였다. 이 혼합물에 트리-n-부틸아민 1.42㎖를 첨가하고 나서, 4-메틸-2-펜타논 10㎖중의 상기 3,5-O-디벤조일-2-O-메틸리보실-1-클로라이드의 용액을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 20시간 반응시킨 후, 트리-n-부틸아민 7.1㎖로 중화하고, 여과에 의해 몰리큘러시브를 제거하고 나서, 여과액을 물 20㎖로 3회 수세하였다. 유기층을 증발시켜 실리카겔컬럼크로마토그래피에 의해 정제하여 표제의 화합물(33) 950㎎을 얻었다.

MS(APCI) m/z: 451(M-H)^-; IR(KBr)㎝^-1: 3448, 2963, 1721, 1453, 1278, 1111, 976, 711, 558.

실시예 22

2-O-메틸리보스-1-β-인산(34)의 제조

실시예 21에서 제조한 화합물(33) 850㎎에 14% 암모니아-메탄올 20㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 20시간 반응시켰다. 용매의 증발후, 디이소프로필에테르를 첨가하여 슬러지를 형성하고, 여과에 의해 결정성 분말을 회수하였다. 해당 분말을 메탄올에 용해시키고, 이 용액에 시클로헥실아민을 첨가하고, 교반하였다. 메탄올의 증발후, 잔류물에 디이소프로필에테르를 첨가하여 슬러지를 형성하였다. 여과에 의해 결정성 분말을 회수하고, 디이소프로필에테르로 세정하였다. 소망의 생성물을 물로 추출하고 수층을 4-메틸-2-펜타논으로 2회 세정하였다. 수층을 농축하고, 이 층에 디이소프로필에테르를 첨가하여 슬러지를 형성하였다. 여과후, 결정을 이소프로필에테르로 세정하여, 화합물(34)의 디시클로헥실아민염 120㎎을 얻었다.

¹H NMR(D₂O) δ: 3.37(s, 3H), 3.49(dd, 1H, J=4.9Hz, 12.7Hz), 3.62(d, 1H, J=4.9Hz), 3.69(dd, 1H, J=2.7Hz, 12.7Hz), 3.74-3.78((m, 1H), 4.28(dd, 1H, J=4.6Hz, 7.8Hz), 5.39(d, 1H, J=5.9Hz); MS(APCI) m/z: 243(M-H)^-.

실시예 23

아세토니트릴 80㎖와 오르토인산 6.92g과의 혼합물에, 트리-n-부틸아민 5.51㎖ 및 몰리큘러시브 4A 10g을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 5시간 교반하고, 하룻밤 방치하였다. -7℃까지 냉각후, 이 혼합물에 3,5-O-비스(4-클로로벤조일)-2-데옥시-α-D-리보실클로라이드(순도: 85%) 10g을 첨가하고, 얻어진 혼합물을 9시간 교반하고, -15℃에서 하룻밤 방치하였다. 트리-n-부틸아민 16.5㎖를 첨가한 후, 여과에 의해 몰리큘러시브 4A를 제거하고, 그 여과액을 농축하고, 잔류물을 4-메틸-2-펜타논에 용해시키고, 수세하였다. 유기층을 빙냉하고, 시클로헥실아민 5.66㎖를 첨가하고 교반하에 결정화시켰다. 1.5시간후, 석출된 결정을 여과하고, 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(18a)의 디시클로헥실아민염 13.5g을 얻었다(α체:β체 = 98.8:1.2).

실시예 24

2-데옥시-α-D-리보스-1-인산(20)의 제조

실시예 23에서 얻어진 화합물 7.05g의 메탄올용액에 시클로헥실아민 2.92㎖를 첨가하고, 실온에서 교반하였다. 72시간 교반후, 해당 혼합물을 농축하고, 잔류물에 에탄올을 첨가하여 현탁액을 얻은 후, 교반하였다. 석출된 결정을 회수한 후, 이들을 실온에서 진공건조하여 표제의 화합물(20)의 디시클로헥실아민염 3.87g을 얻었다(NMR상의 β체없이).

¹H NMR(D₂O) d: 5.57(dd, J=5.1, 6.1Hz, 1H), 4.03(m, 2H), 3.54(ddd, J=1.2, 2.2, 12.2Hz, 1H), 3.42(ddd, J=1.2, 5.1, 12.2Hz, 1H), 3.18-2.94(m, 2H), 2.17(m, 1H), 1.90(d, J=1.2, 12.8Hz, 1H), 1.8-1.45(m, 10H), 1.25-0.9(m, 12H).

C₅H₉O₇P·C₁₂H₂₈N₂에 대한 분석계산치, C: 49.50%; H: 9.04%; N: 6.79%; P: 7.51%,

실측치 C: 49.26%; H: 8.81%; N: 6.64%: P: 7.29%.

실시예 25

2'-데옥시아데노신의 제조(1)

대장균 K-12/XL-10균주(스트라타겐사 제품)를 LB배지 50㎖에 접종하고, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 회수후, 해당 균주를, 리소자임 1㎎/㎖를 함유하는 용균(溶菌)액으로 용균하고, 해당 용균액을 페놀로 처리하여, 통상의 에탄올침전에 의해 DNA를 침전시켰다. DNA침전을 유리봉으로 회수하고 세정하여 대장균염색체 DNA를 작성하였다.

PCR용 프라이머로서 대장균중의 공지의 deoD유전자의 서열(염기번호 11531 내지 12250의 코딩영역을 지닌 겐뱅크수탁번호 AE000508)에 의거해서 설계된 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다. 이들 프라이머의 5'-말단부근 및 3'-말단부근에는, 각각 EcoRI 및 Hind III용의 제한효소인식서열을 지닌다.

서열번호 1: GTGAATTCAC AAAAAGGATA AAACAATGGC

서열번호 2: TCGAAGCTTG CGAAACACAA TTACTCTTT

제한효소 Hind III로 완전소화된 상기 대장균 염색체 DNA 6ng/㎕ 및 프라이머(각각 3μM)를 함유하는 PCR반응액 0.1㎖를 이용해서, 1사이클당 변성: 96℃, 1분; 어닐링: 55℃, 1분; 신장: 74℃, 1분의 조건하에 PCR을 30사이클 행하였다.

상기 반응생산물 및 플라스미드 pUC18(타카라슈조사 제품)을, EcoRI 및 Hind III으로 소화하고 라이게이션-하이(토요보사 제품)를 이용해서 연결하였다. 얻어진 재조합 플라스미드를 사용해서 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 이 형질전환균주를, 암피실린(Am) 50㎍/㎖ 및 X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락도사이드)을 함유하는 LB한천배지에 배양하여 백색콜로니로서 Am내성의 형질전환체를 얻었다. 이와 같이 해서 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드를 추출하여, 소망의 DNA단편이 삽입되어 있는 해당 플라스미드를 pUC-PNP73으로 명명하였다. 이와 같이 해서 얻어진 형질전환체를 대장균 MT-10905로서 명명하였다.

Am 50㎍/㎖를 함유하는 LB배지 100㎖에, 대장균 MT-10905를 37℃에서 하룻밤 진탕배양하고, 해당 배양액을 13,000rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 이 균체를 10mM 트리스염산완충액(pH 8.0) 10㎖에 현탁시키고 초음파처리하여 균질물을 얻은 후 효소원으로서 사용하였다.

실시예 8에서 제조한 2-데옥시-α-D-리보스-1-인산 디암모늄염 2.5mM, 아데닌(와코쥰야쿠사 제품, 특급) 2.5mM, 푸린뉴클레오사이드-포스포릴라제생산균주로부터의 초음파처리된 효소균질물 0.1㎖ 및 트리스-염산완충액(pH 7.4) 10mM의 혼합물에, 염화칼슘(와코쥰야쿠사 제품, 특급)을 상이한 농도로 첨가해서 반응액을 제조하였다. 이 반응액 1㎖를 30℃에서 24시간 반응시킨 바, 반응말기에, 백색침전물이 생성되었다.

반응종료액에 대해 후술하는 조건하에서 HPLC분석을 행한 바, 2'-데옥시아데노신(와코쥰야쿠사 제품, 특급)의 피크와 완전히 일치하는 피크가 모든 반응종료액중에 확인되었다.

HPLC분석조건

컬럼: YMC-팩 ODS-A312, 150×6.0㎜ I.D.

컬럼온도: 40℃

펌프유속: 0.75㎖/분

검출: UV 260nm

용리액: 10mM 인산: 아세토니트릴 = 95:5(v/v)

반응종료액중의 2'-데옥시아데노신의 농도를 구한 후의 반응전화율의 계산결과를 하기 표 1에 표시한다.

염화칼슘의 양(mM)	반응전화율(%)
0.0	80.4
2.5	90.8
10.0	96.0

실시예 26

2'-데옥시아데노신의 제조(2)

염화칼슘 대신에 염화알루미늄을 첨가한 이외에는 실시예 25에 기재한 바와 같이 반응을 행하였다. 반응의 말기에, 백색침전물이 생성되었다. 실시예 25에 기재한 바와 같이 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 2'-데옥시아데노신(와코쥰야쿠사 제품, 특급)의 피크와 완전히 일치하는 피크가 모든 반응종료액중에 확인되었다. 반응종료액중의 2'-데옥시아데노신의 농도를 구한 후의 반응전화율의 계산결과를 하기 표 2에 표시한다.

염화알루미늄의 양(mM)	반응전화율(%)
0.0	80.4(실시예 15에 있어서와 마찬가지임)
2.5	90.2
10.0	93.3

실시예 27

2'-데옥시아데노신의 제조(3)

염화칼슘 대신에 염화바륨 10mM을 첨가한 이외에는 실시예 25에 기재한 바와 같이 반응을 행하였다. 반응의 말기에, 백색침전물이 생성되었다. 실시예 25에 기재한 바와 같이 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 2'-데옥시아데노신(와코쥰야쿠사 제품, 특급)의 피크와 완전히 일치하는 피크가 모든 반응종료액중에 확인되었다. 반응종료액중의 2'-데옥시아데노신의 농도를 구한 후의 반응전화율의 계산결과는 92.4%였다.

실시예 28

티미딘의 제조

실시예 8에서 제조한 2-데옥시-α-D-리보스-1-인산 디암모늄염 2.5mM, 티민(와코쥰야쿠사 제품, 특급) 2.5mM, 티미딘 포스포릴라제(시그마사 제품) 12유닛/㎖, 질산칼슘(와코쥰야쿠사 제품, 특급) 0mM 혹은 10mM 및 트리스-염산완충액(pH 7.4) 10mM로 이루어진 반응액 1㎖를 30℃에서 24시간 반응시킨 바, 반응의 말기에, 백색침전물이 생성되었다. 실시예 25에 기재한 바와 같이 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 티미딘(와코쥰야쿠사 제품, 특급)의 피크와 완전히 일치하는 피크가 반응종료액중에 확인되었다. 반응종료액중의 티미딘의 농도를 구한 후의 반응전화율의 계산결과를 하기 표 3에 표시한다.

질산칼슘의 양(mM)	형성된 티미딘의 양(mM)
0.0	75.2
10.0	91.2

실시예 29

2'-데옥시아데노신의 제조(4)

실시예 8에서 제조한 2-데옥시-α-D-리보스-1-인산 디암모늄염 100mM, 아데닌(와코쥰야쿠사 제품, 특급) 100mM, 실시예 25에서 제조한 푸린뉴클레오사이드-포스포릴라제생산균주로부터의 초음파처리된 효소균질물 0.1㎖, 염화칼슘(와코쥰야쿠사 제품, 특급) 0mM 내지 150mM 및 트리스-염산완충액(pH 8.0) 100mM로 이루어진 반응액 1㎖를 50℃에서 24시간 반응시킨 바, 반응의 말기에, 백색침전물이 생성되었다. 실시예 25에 기재한 바와 같이 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 2-데옥시아데노신(와코쥰야쿠사 제품, 특급)의 피크와 완전히 일치하는 피크가 반응종료액중에 확인되었다. 반응종료액중의 2'-데옥시아데노신의 농도를 구한 후의 반응전화율의 계산결과를 하기 표 4에 표시한다.

염화칼슘의 양(mM)	형성된 2'-데옥시아데노신의 양(mM)
0	85.0
20	90.0
60	96.5
100	97.8
150	97.5

실시예 30

2'-데옥시구아노신의 제조

실시예 8에서 제조한 2-데옥시-α-D-리보스-1-인산 디암모늄염 100mM, 구아닌(와코쥰야쿠사 제품, 특급) 100mM, 실시예 25에서 제조한 푸린뉴클레오사이드-포스포릴라제생산균주로부터의 초음파처리된 효소균질물 0.1㎖, 염화칼슘(와코쥰야쿠사 제품, 특급) 0mM 또는 150mM 및 트리스-염산완충액(pH 8.0) 100mM로 이루어진 반응액 1㎖를 50℃에서 24시간 반응시킨 바, 반응의 말기에, 백색침전물이 생성되었다. 실시예 25에 기재한 바와 같이 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 2-데옥시구아노신(와코쥰야쿠사 제품, 특급)의 피크와 완전히 일치하는 피크가 반응종료액중에 확인되었다. 반응종료액중의 2'-데옥시구아노신의 농도를 구한 후의 반응전화율의 계산결과를 하기 표 5에 표시한다.

염화칼슘의 양(mM)	형성된 2'-데옥시구아노신의 양(mM)
0	50.0
150	97.5

실시예 31

아데노신의 제조

실시예 10에서 제조한 α-D-리보스-1-인산 디암모늄염 100mM, 아데닌(와코쥰야쿠사 제품, 특급) 100mM, 실시예 25에서 제조한 푸린뉴클레오사이드-포스포릴라제생산균주로부터의 초음파처리된 효소균질물 0.1㎖, 염화칼슘(와코쥰야쿠사 제품, 특급) 0mM 또는 150mM 및 트리스-염산완충액(pH 8.0) 100mM로 이루어진 반응액 1㎖를 50℃에서 24시간 반응시킨 바, 반응의 말기에, 백색침전물이 생성되었다. 실시예 25에 기재한 바와 같이 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 아데노신(와코쥰야쿠사 제품, 특급)의 피크와 완전히 일치하는 피크가 반응종료액중에 확인되었다. 반응종료액중의 아데노신의 농도를 구한 후의 반응전화율의 계산결과를 하기 표 6에 표시한다.

염화칼슘의 양(mM)	형성된 아데노신의 양(mM)
0	86.1
150	98.4

실시예 32

2',3'-디데옥시아데노신의 제조

실시예 12에서 제조한 2,3-디데옥시-α-D-리보스-1-인산 디암모늄염 100mM, 아데닌(와코쥰야쿠사 제품, 특급) 100mM, 실시예 25에서 제조한 푸린뉴클레오사이드-포스포릴라제생산균주로부터의 초음파처리된 효소균질물 0.1㎖, 염화칼슘(와코쥰야쿠사 제품, 특급) 0mM 또는 150mM 및 트리스-염산완충액(pH 8.0) 100mM로 이루어진 반응액 1㎖를 50℃에서 24시간 반응시킨 바, 반응의 말기에, 백색침전물이 생성되었다. 실시예 25에 기재한 바와 같이 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 2',3'-디데옥시아데노신(시그마사 제품, 특급)의 피크와 완전히 일치하는 피크가 반응종료액중에 확인되었다. 반응종료액중의 2',3'-디데옥시아데노신의 농도를 구한 후의 반응전화율의 계산결과를 하기 표 7에 표시한다.

염화칼슘의 양(mM)	형성된 2',3'-디데옥시아데노신의 양(mM)
0	82.4
150	96.4

실시예 33

아데닌-9-β-D-아라비노사이드의 제조

실시예 14에서 제조한 α-D-아라비노푸라노실-1-인산 디암모늄염 100mM, 아데닌(와코쥰야쿠사 제품, 특급) 100mM, 실시예 25에서 제조한 푸린뉴클레오사이드-포스포릴라제생산균주로부터의 초음파처리된 효소균질물 0.1㎖, 염화칼슘(와코쥰야쿠사 제품, 특급) 0mM 또는 150mM 및 트리스-염산완충액(pH 8.0) 100mM로 이루어진 반응액 1㎖를 50℃에서 24시간 반응시킨 바, 반응의 말기에, 백색침전물이 생성되었다. 실시예 25에 기재한 바와 같이 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 아데닌-아라비노사이드(시그마사 제품, 특급)의 피크와 완전히 일치하는 피크가 반응종료액중에 확인되었다. 반응종료액중의 아데닌-9-β-D-아라비노사이드의 농도를 구한 후의 반응전화율의 계산결과를 하기 표 8에 표시한다.

염화칼슘의 양(mM)	형성된 아데닌-9-β-D-아라비노사이드의 양(mM)
0	79.4
150	93.4

실시예 34

2-아미노-6-클로로푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 제조

실시예 8에서 제조한 2-데옥시-α-D-리보스-1-인산 디암모늄염 10mM, 2-아미노-6-클로로푸린(토쿄카세이사 제품) 10mM, 트리스-염산 완충액(pH 7.5) 100mM 및 실시예 25에서 제조한 푸린뉴클레오사이드-포스포릴라제생산균주로부터의 초음파처리된 효소균질물 50㎕로 이루어진 반응액 1㎖를 50℃에서 4시간 반응시킨 바, 반응의 말기에, 백색침전물이 생성되었다. 반응종료액에 대해 후술하는 조건하에서 HPLC분석을 행한 바, 2-아미노-6-클로로푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 피크가 얻어졌다. 반응종료액중의 2-아미노-6-클로로푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 농도를 구한 후의 반응전화율을 계산한 바, 20.9%였다.

HPLC분석조건

컬럼: 데벨로실 ODS-MG-5, 250×4.6㎜ I.D.

컬럼온도: 40℃

펌프유속: 1.0㎖/분

검출: UV 254nm

용리액: 25mM 인산 2수소칼륨: 메탄올=875:125(v/v)

실시예 35

2,6-디아미노푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 제조

2-아미노-6-클로로푸린 대신에 2,6-디아미노푸린(토쿄카세이사 제품)을 첨가한 이외에는 실시예 34에 기재한 바와 같이 반응을 행하였다. 실시예 34에 기재한 바와 같이 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 2,6-디아미노푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 피크가 얻어졌다. 반응종료액중의 2,6-디아미노푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 농도를 구한 후의 반응전화율을 계산한 바, 75.5%였다.

실시예 36

6-메르캅토푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 제조

2-아미노-6-클로로푸린 대신에 6-메르캅토푸린(코진사 제품)을 첨가한 이외에는 실시예 34에 기재한 바와 같이 반응을 행하였다. 실시예 34에 기재한 바와 같이 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 6-메르캅토푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 피크가 얻어졌다. 반응종료액중의 6-메르캅토푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 농도를 구한 후의 반응전화율을 계산한 바, 57.2%였다.

실시예 37

2-아미노-6-아이오도푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 제조

2-아미노-6-클로로푸린 대신에 2-아미노-6-아이오도푸린을 첨가한 이외에는 실시예 34에 기재한 바와 같이 반응을 행하였다. 실시예 34에 기재한 바와 같이 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 2-아미노-6-아이오도푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 피크가 얻어졌다. 반응종료액중의 2-아미노-6-아이오도푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 농도를 구한 후의 반응전화율을 계산한 바, 69.2%였다.

실시예 38

2-아세틸아미노-6-하이드록시푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 제조

2-아미노-6-클로로푸린 대신에 2-아세틸아미노-6-하이드록시푸린(토쿄카세이사 제품)을 첨가한 이외에는 실시예 34에 기재한 바와 같이 반응을 행하였다. 하기 표시한 조건하에서 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 2-아세틸아미노-6-하이드록시푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 피크가 얻어졌다. 반응종료액중의 2-아세틸아미노-6-하이드록시푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 농도를 구한 후의 반응전화율을 계산한 바, 48.7%였다.

HPLC분석조건

컬럼: 데벨로실 ODS-MG-5, 250×4.6㎜ I.D.

컬럼온도: 40℃

펌프유속: 1.0㎖/분

검출: UV 254nm

용리액: 25mM 인산 2수소칼륨: 메탄올 = 75:25(v/v)

실시예 39

2-아미노-6-시클로프로필아미노푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 제조

2-아미노-6-클로로푸린 대신에 2-아미노-6-시클로프로필아미노푸린을 첨가한 이외에는 실시예 34에 기재한 바와 같이 반응을 행하였다. 실시예 38에 기재한 바와 같이 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 2-아미노-6-시클로프로필아미노푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 피크가 얻어졌다. 반응종료액중의 2-아미노-6-시클로프로필아미노푸린-2'-데옥시-β-D-리보사이드의 농도를 구한 후의 반응전화율을 계산한 바, 87.6%였다.

실시예 40

2',3'-디데옥시-3'-플루오로-D-구아노신의 제조

실시예 18에서 제조한 2,3-디데옥시-3-플루오로-D-에리트로펜토푸라노스-1-인산 7.0mM, 구아닌(토쿄카세이사 제품) 10mM, 트리스-염산완충액(pH 7.5) 100mM 및 실시예 25에서 제조한 푸린뉴클레오사이드-포스포릴라제생산균주로부터의 초음파처리된 효소균질물 0.1㎖로 이루어진 반응액 1㎖를 50℃에서 114시간 반응시켰다. 실시예 34에 기재한 바와 같이 반응종료액에 대해 HPLC분석을 행한 바, 2',3'-디데옥시-3'-플루오로-D-구아노신의 피크가 얻어졌다. 반응종료액중의 2',3'-디데옥시-3'-플루오로-D-구아노신의 농도를 구한 후의 반응전화율을 계산한 바, 47.7%였다.

실시예 41

2',3'-디데옥시-3'-플루오로-D-구아노신의 제조

실시예 18에서 제조한 2,3-디데옥시-3-플루오로-D-에리트로펜토푸라노스-1-인산 7.0mM, 구아닌(토쿄카세이사 제품) 10mM, 트리스-염산완충액(pH 7.5) 100mM 및 실시예 25에서 제조한 푸린뉴클레오사이드-포스포릴라제생산균주로부터의 초음파처리된 효소균질물 0.1㎖로 이루어진 반응액 1㎖를 50℃에서 47시간 반응시켰다. 이 용액에 총농도 20mM의 염화칼슘을 첨가하고 또, 50℃에서 67시간 반응시켰다. 반응종료액을 실시예 34와 마찬가지로 HPLC분석을 행한 바, 2',3'-디데옥시-3'-플루오로-D-구아노신의 피크가 확인되었다. 또, 반응종료액의 2',3'-디데옥시-3'-플루오로-D-구아노신의 농도를 구한 후, 반응전화율을 계산한 바, 84.4%였다.

실시예 42

6-클로로-9-(β-D-리보푸라노스-1-일)푸린의 제조

6-클로로푸린(알드리치사 제품) 10mM, 실시예 10에서 제조한 D-리보스-1-인산(22) 50mM, 실시예 25에서 제조한 푸린뉴클레오사이드-포스포릴라제생산균주로부터의 초음파처리된 효소균질물 0.1㎖ 및 트리스-염산완충액(pH 7.5) 100mM로 이루어진 반응액 1㎖를 50℃에서 20시간 반응시켰다. 반응종료후, 반응액을 이하에 표시한 조건하에서 HPLC분석을 행한 바, 표제의 화합물의 피크가 확인되었다. 또, 반응종료액의 6-클로로-9-(β-D-리보푸라노스-1-일)푸린의 농도를 구한 후, 반응전화율을 계산한 바, 62.4%였다.

HPLC분석조건

컬럼: 데벨로실 ODS-MG-5, 250×4.6㎜ I.D.

컬럼온도: 40℃

펌프유속: 1.0㎖/분

검출: UV 254nm

용리액: 25mM 인산 2수소칼륨: 메탄올 = 75:25(v/v)

실시예 43

1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노스-1-일)-1H-이미다조[4,5-b]피리딘 및 3-(2-데옥시-β-D-리보푸라노스-1-일)-1H-이미다조[4,5-b]피리딘의 제조

실시예 8에서 제조한 2-데옥시-α-D-리보스-1-인산 암모늄염 10mM, 4-아자벤즈이미다졸(알드리치사 제품) 10mM, 트리스-염산완충액(pH 7.5) 100mM 및 실시예 25에서 제조한 푸린뉴클레오사이드-포스포릴라제생산균주로부터의 초음파처리된 효소균질물 50㎕로 이루어진 반응액 1㎖를 50℃에서 17시간 반응시켰다. 반응종료액을 이하에 표시한 조건하에서 HPLC분석을 행한 바, 표제 화합물의 피크가 2개 관찰되었다. 또, 반응종료액의 생성물의 농도를 구한 후, 반응전화율을 계산한 바, 3% 및 7.2%였다.

HPLC분석조건

컬럼: 데벨로실 ODS-MG-5, 250×4.6㎜ I.D.

컬럼온도: 40℃

펌프유속: 1.0㎖/분

검출: UV 254nm

용리액: 25mM 인산 2수소칼륨: 메탄올 = 50:50(v/v)

LC-MS분석데이터: MS(APCI) m/z: 236(MH)⁺

실시예 44

8-아자-2'-데옥시아데노신의 제조

4-아자벤즈이미다졸 대신에 8-아자아데닌(알드리치사 제품)을 사용한 이외에는 실시예 43에 기재한 바와 같이 반응을 행하였다. 반응종료액에 대해 이하에 표시한 조건하에서 HPLC분석을 행한 바, 8-아자-2'-데옥시아데노신의 피크가 확인되었다. 반응종료액중의 8-아자-2'-데옥시아데노신의 농도를 구한 후의 반응전화율을 계산한 바, 4.8%였다.

HPLC분석조건

컬럼: 데벨로실 ODS-MG-5, 250×4.6㎜ I.D.

컬럼온도: 40℃

펌프유속: 1.0㎖/분

검출: UV 254nm

용리액: 25mM 인산 2수소칼륨: 메탄올 = 875:125(v/v)

LC-MS분석데이터: MS(APCI) m/z: 253(MH)⁺

실시예 45

8-아자-2'-데옥시구아노신의 제조

4-아자벤즈이미다졸 대신에 8-아자구아닌(토쿄카세이사 제품)을 사용한 이외에는 실시예 43에 기재한 바와 같이 반응을 행하였다. 반응종료액에 대해 실시예 44에 기재한 바와 같이 HPLC분석을 행한 바, 8-아자-2'-데옥시구아노신의 피크가 확인되었다. 반응종료액중의 8-아자-2'-데옥시구아노신의 농도를 구한 후의 반응전화율을 계산한 바, 36.1%였다.

실시예 46

2-클로로-2'-데옥시아데노신(클라드리빈)의 제조

4-아자벤즈이미다졸 대신에 2-클로로-4-아미노푸린을 사용한 이외에는 실시예 43에 기재한 바와 같이 반응을 행하였다. 반응종료액에 대해 이하에 표시한 조건하에서 HPLC분석을 행한 바, 표제 화합물의 피크가 확인되었다. 반응종료액중의 2-클로로-2'-데옥시아데노신의 농도를 구한 후의 반응전화율을 계산한 바, 96%였다.

HPLC분석조건

컬럼: 데벨로실 ODS-MG-5, 250×4.6㎜ I.D.

컬럼온도: 40℃

펌프유속: 1.0㎖/분

검출: UV 254nm

용리액: 25mM 인산 2수소칼륨: 메탄올 = 875:125(v/v)

실시예 47

1-(β-D-리보푸라노스-1-일)-1,3,4-트리아졸-3-카르복시아미드(리바비린)의 제조

4-아자벤즈이미다졸 대신에 1,2,4-토시아졸-3-카르복시아미드를 사용한 이외에는 실시예 43에 기재한 바와 같이 반응을 행하였다. 반응종료액에 대해 이하에 표시한 조건하에서 HPLC분석을 행한 바, 표제 화합물의 피크가 확인되었다. 반응종료액중의 1-(β-D-리보푸라노스-1-일)-1,3,4-트리아졸-3-카르복시아미드의 농도를 구한 후의 반응전화율을 계산한 바, 69%였다.

HPLC분석조건

컬럼: 데벨로실 ODS-MG-5, 250×4.6㎜ I.D.

컬럼온도: 40℃

펌프유속: 1.0㎖/분

검출: UV 210nm

용리액: 25mM 인산 2수소칼륨

실시예 48

1-(β-D-리보푸라노스-1-일)-5-아미노이미다졸-4-카르복시아미드(아카데신)의 제조

4-아자벤즈이미다졸 대신에 5-아미노이미다졸-4-카르복시아미드를 사용한 이외에는 실시예 43에 기재한 바와 같이 반응을 행하였다. 반응종료액에 대해 이하에 표시한 조건하에서 HPLC분석을 행한 바, 표제 화합물의 피크가 확인되었다. 반응종료액중의 1-(β-D-리보푸라노스-1-일)-5-아미노이미다졸-4-카르복시아미드의 농도를 구한 후의 반응전화율을 계산한 바, 46%였다.

HPLC분석조건

컬럼: 데벨로실 ODS-MG-5, 250×4.6㎜ I.D.

컬럼온도: 40℃

펌프유속: 1.0㎖/분

검출: UV 254nm

용리액: 25mM 인산 2수소칼륨: 메탄올 = 93:7(v/v)

실시예 49

2'-데옥시구아노신의 제조

순수 20g에, 실시예 24에서 제조한 2-데옥시리보스-1-인산 디(모노시클로헥실암모늄)염 3.22g(7.72mmol), 구아닌 1.11g(7.34mmol) 및 수산화마그네슘 0.67g(11.48mmol)을 첨가하였다. 이 반응혼합물의 pH를 20%수산화나트륨수용액으로 9로 조정한 후, 이 혼합물에 0.1㎖의 상기 효소용액(0.1㎖)을 첨가하고, 50℃에서 8시간 반응시켰다. 8시간후의 반응혼합물의 HPLC분석을 행한 바, 소망의 2'-데옥시구아노신을 반응수율 99%로 얻은 것으로 확인되었다.

실시예 50

2'-데옥시아데노신의 제조

순수 20g에, 실시예 24에서 제조한 2-데옥시리보스-1-인산 디(모노시클로헥실암모늄)염 3.22g(7.72mmol), 아데닌 1.01g(7.47mmol) 및 수산화마그네슘 0.67g(11.48mmol)을 첨가하였다. 이 반응혼합물의 pH를 20%수산화나트륨수용액으로 8.6으로 조정한 후, 이 혼합물에 0.1㎖의 상기 효소용액(0.1㎖)을 첨가하고, 50℃에서 3시간 교반하에 반응시켰다. 3시간후의 반응혼합물의 HPLC분석을 행한 바, 소망의 2'-데옥시아데노신을 반응수율 99%로 얻은 것으로 확인되었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은, 아노머선택적인 1-인산화 당유도체 또는 뉴클레오사이드를 제조하는 제조방법으로서 상당히 유용하며, 광범위한 용도에 사용될 것으로 기대된다.

<110> MITSUI CHEMICALS, INC. <120> PROCESS FOR SELECTIVELY PRODUCING 1-PHOSPHORYLATED SUGAR DERIVATIVE ANOMER AND PROCESS FOR PRODUCING NUCLEOSIDE <130> MCI01P018-jn <150> PCT/JP2000-33212 <151> 2000-02-10 <150> PCT/JP2000-67333 <151> 2000-03-10 <150> PCT/JP2000-341960 <151> 2000-11-09 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer for cloning of purine nucleoside phosphrylase of E.coli K-12 <400> 1 gtgaattcac aaaaaggata aaacaatggc 30 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer for cloning of purine nucleoside phosphrylase of E.coli K-12 <400> 2 tcgaagcttg cgaaacacaa ttactcttt 29

Claims

1-인산화 당유도체의 아노머혼합물을 가인산분해 및 이성화하여, 1-인산화 당유도체모노머의 α이성체 및 β이성체를 얻는 공정과, 염기의 존재하에서의 산성 조건에서 이들 이성체중 한쪽을 선택적으로 결정화해서 이들 아노머간의 평형을 전이시키는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 1-인산화 당유도체모노머의 α이성체 또는 β이성체의 선택적인 제조방법.

하기 일반식(1):

(식중, R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 보호된 하이드록시메틸기 또는 보호된 카르복실기를 표시하고; R³은 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 벤조일기 또는 메탄술포닐기를 표시하고; R⁴는 수산기의 보호기를 표시하고; X는 할로겐원자, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬티오기를 표시하고; W는 산소원자 또는 황원자를 표시하고; Z는 산소원자, 황원자 또는 치환되어 있어도 되는 탄소원자를 표시하고; m은 1 내지 3의 정수를 표시하고; n은 0 또는 1을 표시하고; p 및 q는 0 내지 4의 정수를 표시하고; r은 0 또는 1을 표시하며; 단, p, q, r 및 n은, Z가 산소원자 또는 황원자일 경우에는 p+r≤n+1 및 q≤2×(n+1)-2×(p+r)이고, Z가 탄소원자일 경우에는 p+r≤n+2 및 q≤2×(n+2)-2×(p+r)인 조건을 충족함)로 표시되는 1-인산화 당유도체의 아노머혼합물을 가인산분해 및 이성화하여, 1-인산화 당유도체모노머의 α이성체 및 β이성체를 얻는 공정과, 염기의 존재하에서의 산성 조건에서 이들 이성체중 한쪽을 선택적으로 결정화해서 이들 아노머간의 평형을 전이시키는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 1-인산화 당유도체모노머의 α이성체 또는 β이성체의 선택적인 제조방법.

하기 일반식(3):

(식중, R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 하이드록시메틸기 또는 카르복실기를 표시하고; R³은 수소원자, 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 벤조일기 또는 메탄술포닐기를 표시하고; X는 할로겐원자, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬티오기를 표시하고; W는 산소원자 또는 황원자를 표시하고; Z는 산소원자, 황원자 또는 치환되어 있어도 되는 탄소원자를 표시하고; n은 0 또는 1을 표시하고; p 및 q는 0 내지 4의 정수를 표시하고; r은 0 또는 1을 표시하며; 단, p, q, r 및 n은, Z가 산소원자 또는 황원자일 경우에는 p+r≤n+1 및 q≤2×(n+1)-2×(p+r)이고, Z가 탄소원자일 경우에는 p+r≤n+2 및 q≤2×(n+2)-2×(p+r)인 조건을 충족함)으로 표시되는 1-인산화 당유도체모노머의 제조방법에 있어서, 하기 일반식(1):

(식중, R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 보호된 하이드록시메틸기 또는 보호된 카르복실기를 표시하고; R³은 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 벤조일기 또는 메탄술포닐기를 표시하고; R⁴는 수산기의 보호기를 표시하고; X는 할로겐원자, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬티오기를 표시하고; W는 산소원자 또는 황원자를 표시하고; Z는 산소원자, 황원자 또는 치환되어 있어도 되는 탄소원자를 표시하고; m은 1 내지 3의 정수를 표시하고; n은 0 또는 1을 표시하고; p 및 q는 0 내지 4의 정수를 표시하고; r은 0 또는 1을 표시하며; 단, p, q, r 및 n은, Z가 산소원자 또는 황원자일 경우에는 p+r≤n+1 및 q≤2×(n+1)-2×(p+r)이고, Z가 탄소원자일 경우에는 p+r≤n+2 및 q≤2×(n+2)-2×(p+r)인 조건을 충족함)로 표시되는 1-인산화 당유도체의 아노머혼합물을 가인산분해 및 이성화하여, 1-인산화 당유도체모노머의 α이성체 및 β이성체를 얻는 공정과; 염기의 존재하에서의 산성 조건에서 이들 이성체중 한쪽을 선택적으로 결정화해서 이들 아노머간의 평형을 전이시키는 공정과; R⁴로 표시된 보호기를 제거하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 1-인산화 당유도체모노머의 제조방법.

하기 일반식(4):

(식중, R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 치환된 벤조일기로 보호된 하이드록시메틸기 또는 보호된 카르복실기를 표시하고; R³은 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 벤조일기 또는 메탄술포닐기를 표시하고; R⁴는 수소원자 또는 수산기의 보호기를 표시하고; X는 할로겐원자, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬티오기를 표시하고; W는 산소원자 또는 황원자를 표시하고; Z는 산소원자, 황원자 또는 치환되어 있어도 되는 탄소원자를 표시하고; m은 1 내지 3의 정수를 표시하고; n은 0을 표시하고; p 및 q는 0 내지 4의 정수를 표시하고; r은 0 또는 1을 표시하며; 단, p, q, r 및 n은, Z가 산소원자 또는 황원자일 경우에는 p+r≤n+1 및 q≤2×(n+1)-2×(p+r)이고, Z가 탄소원자일 경우에는 p+r≤n+2 및 q≤2×(n+2)-2×(p+r)인 조건을 충족함)로 표시되는 것을 특징으로 하는 1-인산화 당유도체의 트리머, 다이머 또는 모노머 혹은 그 염류.

하기 일반식(5):

(식중, R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 보호된 하이드록시메틸기 또는 보호된 카르복실기를 표시하고; R³은 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 벤조일기 또는 메탄술포닐기를 표시하고; R⁴는 수산기의 보호기를 표시하고; X는 할로겐원자, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬티오기를 표시하고; W는 산소원자 또는 황원자를 표시하고; Z는 산소원자, 황원자 또는 치환되어 있어도 되는 탄소원자를 표시하고; p 및 q는 0 내지 3의 정수를 표시하고; r은 0 또는 1을 표시하며; 단, p, q 및 r은, Z가 산소원자 또는 황원자일 경우에는 p+q+r≤3이고, Z가 탄소원자일 경우에는 p+q+r≤5인 조건을 충족함)로 표시되는 것을 특징으로 하는 1-인산화 당유도체 모노머 혹은 그 염류.

하기 일반식(6):

(식중, R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 하이드록시메틸기 또는 카르복실기를 표시하고; R³은 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 벤조일기 또는 메탄술포닐기를 표시하고; X는 할로겐원자, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬티오기를 표시하고; W는 산소원자 또는 황원자를 표시하고; Z는 산소원자, 황원자 또는 치환되어 있어도 되는 탄소원자를 표시하고; n은 0을 표시하고; p 및 q는 0 내지 4의 정수를 표시하고; r은 0 또는 1을 표시하며; 단, p, q, r 및 n은, Z가 산소원자 또는 황원자일 경우에는 p+r≤n+1 및 q≤2×(n+1)-2×(p+r)이고, Z가 탄소원자일 경우에는 p+r≤n+2 및 q≤2×(n+2)-2×(p+r)인 조건을 충족함)으로 표시되는, 천연물이외의 1-인산화 당유도체 모노머 또는 그 염류.

삭제

제 6항에 있어서, R¹이 하이드록시메틸기이고; R²가 수소원자이고; p 및 r이 0이고; X가 불소원자인 것을 특징으로 하는 1-인산화 당유도체모노머 또는 그 염류.

하기 일반식(20):

하기 일반식(18):

(식중, R¹¹ 및 R¹⁴는 상기와 동일함)로 표시되는 화합물을 염기의 존재하에 인산으로 처리하여 하기 일반식(19):

(식중, R¹¹ 및 R¹⁴는 상기와 동일하고, m은 1 내지 3의 정수임)로 표시되는 1-인산화 당유도체의 아노머혼합물을 얻는 공정; 상기 혼합물을 가인산분해 및 이성화하는 공정; 및 염기의 존재하에서의 산성 조건에서, 형성된 α이성체를 선택적으로 결정화해서 상기 아노머이성체간의 평형을 전이시키는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 상기 일반식(20)으로 표시되는 1-인산화 당류의 제조방법.

하기 일반식(18):

(식중, R¹¹ 및 R¹⁴는 상기와 동일하고, m은 1 내지 3의 정수임)로 표시되는 1-인산화 당유도체의 아노머혼합물을 얻는 공정; 상기 혼합물을 가인산분해 및 이성화하는 공정; 염기의 존재하에서의 산성 조건에서, 형성된 α이성체를 선택적으로 결정화해서 상기 아노머이성체간의 평형을 전이시켜 α이성체를 얻는 공정; 및 보호기를 제거하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 2-데옥시-α-D-리보스-1-인산의 제조방법.

하기 일반식(8):

(식중, B는 독립적으로 할로겐원자, 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 할로알킬기, 탄소수 2 내지 7의 알케닐기, 탄소수 2 내지 7의 할로알케닐기, 탄소수 2 내지 7의 알키닐기, 아미노기, 탄소수 1 내지 7의 알킬기를 지닌 알킬아미노기, 하이드록시기, 하이드록시아미노기, 아미녹시기, 탄소수 1 내지 7의 알콕시기, 메르캅토기, 탄소수 1 내지 7의 알킬메르캅토기, 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬아미노기 또는 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 아릴기가 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬아미노기 또는 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 아릴기인 아릴옥시기 또는 시아노기로 치환되어 있어도 되는 피리미딘, 푸린, 아자푸린 및 데아자푸린으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기이고; R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 하이드록시메틸기 또는 카르복실기를 표시하고; R³은 수소원자, 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 벤조일기 또는 메탄술포닐기를 표시하고; X는 할로겐원자, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬티오기를 표시하고; W는 산소원자 또는 황원자를 표시하고; Z는 산소원자, 황원자 또는 치환되어 있어도 되는 탄소원자를 표시하고; n은 0 또는 1을 표시하고; p 및 q는 0 내지 4의 정수를 표시하고; r은 0 또는 1을 표시하며; 단, p, q, r 및 n은, Z가 산소원자 또는 황원자일 경우에는 p+r≤n+1 및 q≤2×(n+1)-2×(p+r)이고, Z가 탄소원자일 경우에는 p+r≤n+2 및 q≤2×(n+2)-2×(p+r)인 조건을 충족함)로 표시되는 뉴클레오사이드의 제조방법에 있어서,

상기 제 3항에 기재한 1-인산화 당유도체모노머를 제조하는 제 1공정; 및

상기 제 1공정에서 얻어진 1-인산화 당유도체중의 인산기와 염기와의 교환반응을 뉴클레오사이드포스포릴라제의 작용에 의해 행하는 제 2공정을 구비한 것을 특징으로 하는 뉴클레오사이드의 제조방법.

삭제

하기 일반식(10):

(식중, B는 독립적으로 할로겐원자, 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 할로알킬기, 탄소수 2 내지 7의 알케닐기, 탄소수 2 내지 7의 할로알케닐기, 탄소수 2 내지 7의 알키닐기, 아미노기, 탄소수 1 내지 7의 알킬기를 지닌 알킬아미노기, 하이드록시기, 하이드록시아미노기, 아미녹시기, 탄소수 1 내지 7의 알콕시기, 메르캅토기, 탄소수 1 내지 7의 알킬메르캅토기, 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬아미노기 또는 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 아릴기가 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬아미노기 또는 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 아릴기인 아릴옥시기 또는 시아노기로 치환되어 있어도 되는 피리미딘, 푸린, 아자푸린 및 데아자푸린으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기이고; R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 하이드록시메틸기 또는 카르복실기를 표시하고; R³은 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 벤조일기 또는 메탄술포닐기를 표시하고; X는 할로겐원자, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬티오기를 표시하고; W는 산소원자 또는 황원자를 표시하고; Z는 산소원자, 황원자 또는 치환되어 있어도 되는 탄소원자를 표시하고; p 및 q는 0 내지 4의 정수를 표시하고; r은 0 또는 1을 표시하며; 단, p, q 및 r은, Z가 산소원자 또는 황원자일 경우에는 p+r≤1 및 q≤2-[2×(p+r)]이고, Z가 탄소원자일 경우에는 p+r≤2 및 q≤4-[2×(p+r)]인 조건을 충족함)으로 표시되는 뉴클레오사이드의 제조방법에 있어서,

뉴클레오사이드 포스포릴라제의 작용에 의해, 상기 제 6항에 기재한 1-인산화 당유도체 모노머중의 인산기와 염기와의 교환반응을 행하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 뉴클레오사이드의 제조방법.

제 13항에 있어서, R¹이 하이드록시메틸기이고; R²가 수소원자이고; p 및 r이 0이고; X가 불소원자인 것을 특징으로 하는 뉴클레오사이드의 제조방법.

하기 일반식(21):

(식중, B는 독립적으로 할로겐원자, 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 할로알킬기, 탄소수 2 내지 7의 알케닐기, 탄소수 2 내지 7의 할로알케닐기, 탄소수 2 내지 7의 알키닐기, 아미노기, 탄소수 1 내지 7의 알킬기를 지닌 알킬아미노기, 하이드록시기, 하이드록시아미노기, 아미녹시기, 탄소수 1 내지 7의 알콕시기, 메르캅토기, 탄소수 1 내지 7의 알킬메르캅토기, 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬아미노기 또는 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 아릴기가 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬아미노기 또는 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 아릴기인 아릴옥시기 또는 시아노기로 치환되어 있어도 되는 피리미딘, 푸린, 아자푸린 및 데아자푸린으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기임)로 표시되는 뉴클레오사이드의 제조방법에 있어서,

상기 제 14항에 기재한 2-데옥시-α-D-리보스-1-인산을 제조하는 제 1공정; 및

뉴클레오사이드 포스포릴라제의 작용에 의해, 상기 제 1공정에서 얻어진 1-인산화 당유도체중의 인산기와 염기와의 교환반응을 행하는 제 2공정을 구비한 것을 특징으로 하는 뉴클레오사이드의 제조방법.

제 11항 및 제 13항 내지 제 15항중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오사이드 포스포릴라제가, 푸린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.1), 구아노신 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.15), 피리미딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.2), 우리딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.3), 티미딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.4) 및 데옥시우리딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.23)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 효소인 것을 특징으로 하는 뉴클레오사이드의 제조방법.

제 11항 및 제 13항 내지 제 15항중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오사이드 포스포릴라제활성대신에, 푸린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.1), 구아노신 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.15), 피리미딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.2), 우리딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.3), 티미딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.4) 및 데옥시우리딘 뉴클레오사이드 포스포릴라제(EC2.4.2.23)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 뉴클레오사이드포스포릴라제를 발현하고 있는 미생물을 사용하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오사이드의 제조방법.

제 11항 및 제 13항 내지 제 15항중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오사이드 포스포릴라제의 작용에 의해, 1-인산화 당유도체모노머중의 인산기와 염기와의 교환반응을 행할 때에, 인산이온과 난수용성 염을 형성가능한 금속양이온을 반응액중에 존재시키는 것을 특징으로 하는 뉴클레오사이드의 제조방법.

제 18항에 있어서, 인산이온과 난수용성 염을 형성가능한 금속양이온이, 칼슘이온, 바륨이온, 알루미늄이온 및 마그네슘이온으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 금속양이온인 것을 특징으로 하는 뉴클레오사이드의 제조방법.

제 11항에 있어서, 뉴클레오사이드가 천연 뉴클레오사이드인 것을 특징으로 하는 뉴클레오사이드의 제조방법.

트리플루오로티미딘, 리바비린, 오로티딘, 우라실 아라비노사이드, 아데닌 아라비노사이드, 2-메틸-아데닌 아라비노사이드, 2-클로로-하이포크산틴 아라비노사이드, 티오구아닌 아라비노사이드, 2,6-디아미노푸린 아라비노사이드, 시토신 아라비노사이드, 구아닌 아라비노사이드, 티민 아라비노사이드, 에노시타빈, 겜시타빈, 아지도티미딘, 이독슈리딘, 디데옥시아데노신, 디데옥시이노신, 디데옥시시티딘, 디데하이드로데옥시티미딘, 티아디데옥시시티딘, 소리부딘, 5-메틸우리딘, 비라졸, 티오이노신, 테가푸르, 독시플루리딘, 브레디닌, 네불라린, 알로푸리놀 우라실, 5-플루오로우라실, 2'-아미노우리딘, 2'-아미노아데노신, 2'-아미노구아니딘, 2-클로로-2'-아미노이노신, 2'-데옥시-2'-메틸리덴-시티딘(DMDC) 및 2'-데옥시-2'-(플루오로메틸리덴)-시티딘(FMDC)을 제외한, 하기 일반식(11):

(식중, B는 독립적으로 할로겐원자, 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 할로알킬기, 탄소수 2 내지 7의 알케닐기, 탄소수 2 내지 7의 할로알케닐기, 탄소수 2 내지 7의 알키닐기, 아미노기, 탄소수 1 내지 7의 알킬기를 지닌 알킬아미노기, 하이드록시기, 하이드록시아미노기, 아미녹시기, 탄소수 1 내지 7의 알콕시기, 메르캅토기, 탄소수 1 내지 7의 알킬메르캅토기, 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬아미노기 또는 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 아릴기가 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬아미노기 또는 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 아릴기인 아릴옥시기 또는 시아노기로 치환되어 있어도 되는 피리미딘, 푸린 및 아자푸린으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기이고; R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 하이드록시메틸기 또는 카르복실기를 표시하고; R³은 수소원자, 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 벤조일기 또는 메탄술포닐기를 표시하고; X는 할로겐원자, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬티오기를 표시하고; W는 산소원자 또는 황원자를 표시하고; Z는 산소원자, 황원자 또는 치환되어 있어도 되는 탄소원자를 표시하고; n은 0 또는 1을 표시하고; p 및 q는 0 내지 4의 정수를 표시하고; r은 0 또는 1을 표시하며; 단, p, q, r 및 n은, Z가 산소원자 또는 황원자일 경우에는 p+r≤n+1 및 q≤2×(n+1)-2×(p+r)이고, Z가 탄소원자일 경우에는 p+r≤n+2 및 q≤2×(n+2)-2×(p+r)인 조건을 충족함)로 표시되는 합성 뉴클레오사이드 또는 그 염.

트리플루오로티미딘, 리바비린, 오로티딘, 우라실 아라비노사이드, 아데닌 아라비노사이드, 2-메틸-아데닌 아라비노사이드, 2-클로로-하이포크산틴 아라비노사이드, 티오구아닌 아라비노사이드, 2,6-디아미노푸린 아라비노사이드, 시토신 아라비노사이드, 구아닌 아라비노사이드, 티민 아라비노사이드, 에노시타빈, 겜시타빈, 아지도티미딘, 이독슈리딘, 디데옥시아데노신, 디데옥시이노신, 디데옥시시티딘, 디데하이드로데옥시티미딘, 티아디데옥시시티딘, 소리부딘, 5-메틸우리딘, 비라졸, 티오이노신, 테가푸르, 독시플루리딘, 브레디닌, 네불라린, 알로푸리놀 우라실, 5-플루오로우라실, 2'-아미노우리딘, 2'-아미노아데노신, 2'-아미노구아니딘, 2-클로로-2'-아미노이노신, 2'-데옥시-2'-메틸리덴-시티딘(DMDC) 및 2'-데옥시-2'-(플루오로메틸리덴)-시티딘(FMDC)을 제외한, 하기 일반식(12):

트리플루오로티미딘, 리바비린, 오로티딘, 우라실 아라비노사이드, 아데닌 아라비노사이드, 2-메틸-아데닌 아라비노사이드, 2-클로로-하이포크산틴 아라비노사이드, 티오구아닌 아라비노사이드, 2,6-디아미노푸린 아라비노사이드, 시토신 아라비노사이드, 구아닌 아라비노사이드, 티민 아라비노사이드, 에노시타빈, 겜시타빈, 아지도티미딘, 이독슈리딘, 디데옥시아데노신, 디데옥시이노신, 디데옥시시티딘, 디데하이드로데옥시티미딘, 티아디데옥시시티딘, 소리부딘, 5-메틸우리딘, 비라졸, 티오이노신, 테가푸르, 독시플루리딘, 브레디닌, 네불라린, 알로푸리놀 우라실, 5-플루오로우라실, 2'-아미노우리딘, 2'-아미노아데노신, 2'-아미노구아니딘, 2-클로로-2'-아미노이노신, 2'-데옥시-2'-메틸리덴-시티딘(DMDC) 및 2'-데옥시-2'-(플루오로메틸리덴)-시티딘(FMDC)을 제외한, 하기 일반식(13):

(식중, B는 독립적으로 할로겐원자, 탄소수 1 내지 7의 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 할로알킬기, 탄소수 2 내지 7의 알케닐기, 탄소수 2 내지 7의 할로알케닐기, 탄소수 2 내지 7의 알키닐기, 아미노기, 탄소수 1 내지 7의 알킬기를 지닌 알킬아미노기, 하이드록시기, 하이드록시아미노기, 아미녹시기, 탄소수 1 내지 7의 알콕시기, 메르캅토기, 탄소수 1 내지 7의 알킬메르캅토기, 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬아미노기 또는 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 아릴기가 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬아미노기 또는 할로겐으로 치환되어 있어도 되는 아릴기인 아릴옥시기 또는 시아노기로 치환되어 있어도 되는 피리미딘, 푸린 및 아자푸린으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기이고; R¹ 및 R²는 독립적으로 수소원자, 메틸기, 하이드록시메틸기 또는 카르복실기를 표시하고; R³은 수소원자, 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 벤조일기 또는 메탄술포닐기를 표시하고; X는 할로겐원자, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬티오기를 표시하고; W는 산소원자 또는 황원자를 표시하고; Z는 산소원자, 황원자 또는 치환되어 있어도 되는 탄소원자를 표시하고; p 및 q는 0 내지 4의 정수를 표시하고; r은 0 또는 1을 표시하며; 단, p, q 및 r은, Z가 산소원자 또는 황원자일 경우에는 p+r≤1 및 q≤2-[2×(p+r)]이고, Z가 탄소원자일 경우에는 p+r≤2 및 q≤4-[2×(p+r)]인 조건을 충족함)으로 표시되는 뉴클레오사이드 또는 그 염.

하기 일반식(20):

(식중, R¹¹은 보호된 하이드록시메틸기를 표시하고; R¹⁴는 수산기의 보호기를 표시함)으로 표시되는 1-인산화 당류 또는 그 염.