WO2001058920A2

WO2001058920A2 - Procede de production selective d'un anomere derive d'un sucre 1-phosphoryle

Info

Publication number: WO2001058920A2
Application number: PCT/JP2001/000968
Authority: WO
Inventors: Hironori Komatsu; Hirokazu Awano; Nobuyuki Fukazawa; Kiyoshi Ito; Ichirou Ikeda; Tadashi Araki; Takeshi Nakamura; Tamotsu Asano; Junya Fujiwara; Tomoyuki Ando; Katsutoshi Tsuchiya; Kyoko Maruyama; Hideki Umetani; Takahiro Yamauchi; Hitoki Miyake
Original assignee: Mitsui Chemicals, Inc.
Priority date: 2000-02-10
Filing date: 2001-02-13
Publication date: 2001-08-16
Also published as: KR100517163B1; CA2366513A1; US20020193314A1; JP2010031037A; US20060094869A1; EP1178051A2; CN1372564A; WO2001058920A3; US7038039B2; DE60134196D1; EP1178051A4; EP1178051B1; BR0104461A; KR20020013524A; ATE397001T1

Description

明細書

1 -リン酸化糖誘導体のァノマーの選択的な製造法並びにヌクレオシドの製造法技分 Sr

本発明は、 1一リン酸化糖誘導体の製造法に関する。 1一リン酸化糖誘導体は、広く生物界に存在し、様々な酵素類の反応基質となって、医薬品や栄養食品などの有用な物質の製造原料となる。また、非天然型の 1一リン酸化糖誘導体は、抗ウィルス剤や酵素阻害剤の製造原料としての利用が期待されている。

さらに、本発明は、抗ウィルス医薬品、抗ガン医薬品やアンチセンス医薬品などの原料または原体として使用されるヌクレオシド化合物の製造法に関する。技術背景

1一リン酸化糖誘導体の製造法としては、

1) 1一臭素化糖とリン酸銀塩とを縮合する方法（J B i o l . C h em. ， Vo l . 1 2 1 , P 46 5 ( 1 9 3 7) 、 J Am. C h e m. S o c . ， Vo l . 7 8， P 8 1 1 ( 1 9 5 6 ) 、 J Am. C h e m. S o c . , Vo l . 7 9， P 5 0 5 7 ( 1 9 5 7) ) 、

2 ) 1一ハロゲン化糖とジベンジルリン酸のトリエチルァミン塩とを縮合する方法（ J . Am. C h em. S o c . , Vo l . 7 7, P 342

3 ( 1 9 5 5 ) 、 J . Am. C h em. S o c . , Vo l . 8 0, P I 9 94 ( 1 9 5 8) 、 J . Am. Ch em. S o c . , Vo l . 1 0 6， P 7 8 5 1 ( 1 9 84) 、 J . O r . Ch em. ， V o l . 5 9， P 6 9 0 ( 1 9 94) ) 、

3) 1一ァセチル化糖を正リン酸と加熱縮合する方法（ J . O r g. C h em. ， Vo l . 2 7， P 1 1 0 7 ( 1 9 6 2) 、 C a r b o h y d r a t e R e s . , V o l . 3， P 1 1 7 ( 1 9 6 6 ) 、 C a r b o h y d r a t e R e s . , V o l . 3， P 46 3 ( 1 9 6 7 ) 、 C a n . J . B i o c h em. ， V o l . 5 0， P 574 ( 1 9 7 2) ) 、

4) 1位をイミデート化して活性化した後にジベンジルリン酸と縮合する方法（C a r b o h y d r a t e R e s . ， V o l . 6 1， P 1 8 1 ( 1 9 7 8 ) 、 T e t r a h e d r o n L e t t . ， Vo l . 2 3， P 40 5 ( 1 9 82) ) 、

5 ) 1位を夕リゥムゃリチウムアルコラ一トとして活性化した後にジべンジルリン酸ク口リドで処理する方法（C a r b o h y d r a t e R e s . ， Vo l . 94， P 1 6 5 ( 1 9 8 1) 、 C h e m. L e t t . , Vo l . 2 3， P 40 5 (1 9 82) ) 、

6 ) ヌクレオシドホスホリラ一ゼの作用によりヌクレオシドの加リン酸分解反応を行って、 1一リン酸化糖誘導体を製造する方法（ J . B i o

1. C h em. ， V o l . 1 84、 P 43 7、 1 9 5 0〉、等が知られている。

しかしながら、これらの方法には各々以下の点で問題がある。

1) 〜 5) の化学的な製造法について共通する問題点としては、 1位に隣接する官能基に影響されてひ体 Z ]3体のァノマー選択性が変化し、望む異性体を選択性良く得るための一般的な合成法を考えることが難しい点があげられる。選択性と高収率を実現するためには、 2位ァセトキシ基あるいは 2位ァセトァミノ基などの存在が欠かせず、加えて、 2位デォキシ糖が不安定なこともあり、これら合成法の適用範囲は狭い。そのため、 2位デォキシピラノースの 1—リン酸化体合成については、ァノマー選択性の制御が難しいことから、カラムクロマト精製を必要とし、収率の低い結果しか得られていない [C h e m. Z v e s t i , V o 1. 2 8 ( 1) , P 1 1 5 ( 1 9 74) 、 I z v. Ak a d. N a u k S S S R, S e r . Kh i m. , Vo l . 8 , P 1 843 (1 9 7 5) ] 。従って、 2位デォキシピラノースの 1一リン酸化体以上に不安定で選択性の制御が困難な 2位デォキシフラノース類の 1一リン酸化体に至つては、これまで化学的な製造例は報告されていない。

6) に関しては、イノシンなどごく限られたリポヌクレオシド以外については、ヌクレオシドの供給そのものが困難であり、リポース一 1 _ リン酸などの限られた 1一リン酸化糖誘導体しか製造することができない。また、原料となるヌクレオシド自体が高価であるために、コスト的にも満足のゆくものではない。

以上のように、 1―リン酸化糖誘導体の工業的な製造方法に関しては、未確立であった。

一方、ヌクレオシドホスホリラーゼはリン酸存在下でヌクレオシドの N—グリコシド結合を加リン酸分解できる酵素の総称であり、次式で表される反応を触媒する。

ヌクレオシド +リン酸（塩） → 塩基 + 1—リン酸化糖誘導体プリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンホスホリラ一ゼに大別される該酵素は、広く生物界に分布し、哺乳類、鳥類、魚類などの組織、酵母、細菌に存在する。この酵素反応は可逆的であり、逆反応を利用した各種ヌクレオシドの合成が以前より知られている。例えば、 2 ' ーデォキシリポース 1—リン酸と核酸塩基（チミン、アデニンまたはグァニン）からチミジン（特開平 0 1— 1 04 1 9 0号公報）、 2 ' —デォキシアデノシン（特開平 1 1一 1 3 7 2 9 0号公報）または 2 ' —デォキシグアノシン（特開平 1 1— 1 3 7 2 90号公報）を製造する方法が開示されている。

更に、 Ag r i c . B i o l . C h em. , Vo l . 5 0 ( 1) , Ρ P. 1 2 1〜 1 2 6, ( 1 9 8 6 ) では、イノシンをリン酸存在下で、 En t e r o b a c t e r a e r o g e n e s由来のプリンヌクレオシドホスホリラ一ゼを用いた反応により、リポース 1—リン酸とヒポキサンチンに分解した後、イオン交換樹脂で単離したリボース 1一リン酸と 1 , 2 , 4—トリァゾールー 3—力ルポキサミドより、同じく E xi t e r o b a c t e r a e r o g e n e s由来のフリンヌクレ才シドホスホリラーゼにより、抗ウィルス剤であるリバピリンを製造する技術が報告されている。

しかしながら、前述の理由のように、 1 一リン酸化糖誘導体の工業的な製造方法が未確立であるため、ヌクレオシドホスホリラーゼの逆反応を利用した汎用性の高いヌクレオシドの工業的な製造方法についても、未確立であった。

また、該酵素の逆反応を利用して、 1 _リン酸化糖誘導体と塩基よりヌクレオシドを生成させる反応は平衡反応であるため、転化率が向上しないという技術的欠点も存在していた。発明の開示

本発明の第一の課題は、フラノースゃピラノースといった糖の骨格の違い、デォキシ糖といった置換基の有無、あるいは天然型や非天然型といった糖の種類に影響されることのない、汎用性の高い、ァノマ一選択的な 1 一リン酸化糖誘導体の製造法を提供することである。

本発明の第二の課題は、 1 一リン酸化糖誘導体と核酸塩基からヌクレオシドホスホリラーゼの作用により汎用性の高いヌクレオシドの製造方法を提供することであり、さらに、同反応におけるヌクレオシドの転化率の向上方法を提供することである。

すなわち、本発明の課題は、これら第一および第二の課題を解決することにより、低コス卜で高純度のヌクレオシドの製造法を提供することである。

本発明者らは、上記第一の課題を達成するべく鋭意検討を行い、 1 一リン酸化糖誘導体が一定の条件下にァノマー異性体および 1 一リン酸化糖誘導体のダイマ一との平衡状態で存在することを発見し、さらにこの平衡条件を操作することで、望むァノマー異性体のみが結晶として析出し、その結果、平衡が次々と傾くことにより、望むァノマー異性体のみを高い選択性と高収率で得られることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。、すなわち、本発明は、以下の各態様を含む。，

(1) 1一リン酸化糖誘導体のァノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する 1ーリン酸化糖誘導体モノマー α体または ]3体の一方を選択的に晶析することによりァノマー混合物間の平衡を傾け、 1—リン酸化糖誘導体モノマーのひ体または) 3体の一方を選択的に製造する方法。

(2) 下記式（1)

(1)

〔式中、 1ぉょび尺 ²は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、保護されたヒドロキシメチル基または保護された力ルポキシル基を表し、 R 3 はァシル基を表し、 R ⁴は水酸基の保護基を表し、 Xはハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基を表し、 Wは酸素原子またはィォゥ原子を表し、 Zは酸素原子、ィォゥ原子または置換されてよい炭素原子を表し、 mは 1から 3の整数を表し、 nは 0または 1を表し、 pおよび Qは 0から 4の整数を表し、 rは 0または 1を表す。（ただし、 p、 Q、 r、 nは、 Zが酸素原子、ィォゥ原子の場合には、 p+ r≤n+ l、 q ≤ 2 X (n+ 1) - 2 X (p+ r) を、 Zが炭素原子の場合は p + r≤ n + 2、 q≤ 2 X (n + 2) - 2 X (p + r ) を満たす。）〕で示される 1ーリン酸化糖誘導体のァノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する 1ーリン酸化糖誘導体モノマーの α体または iS体の一方を選択的に晶析することによりァノマ一混合物間の平衡を傾け、 1一リン酸化糖誘導体モノマーの 0；体たは iS体の一方を選択的に製造する方法。

(3) 上記式（ 1) で示される 1—リン酸化糖誘導体のァノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する 1一リン酸化糖誘導体モノマ —の a体または J3体の一方を選択的に晶析することによりァノマー混合物間の平衡を傾け、 1一リン酸化糖誘導体モノマーの a体または iS体の一方を選択的に製造し、ついで R ⁴で表わされる保護基の脱離反応を行つて、下記式（3)

R²

(3)

(式中、 1ぉょび ²は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒド口キシメチル基または力ルポキシル基を表し、 R 3は水素原子またはァシル基を表し、 X、 W、 Z、 n、 p、 q > rは式（1) におけるのと同義である。）で示される 1一リン酸化糖誘導体モノマーを製造する方法。

(4) 下記式（4)

(4) (式中、 1ぉょび ²は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、置換されたベンゾィルで保護されたヒドロキシメチル基、または保護された力ルポキシル基を表し、 R ⁴は水素原子または水酸基の保護基を表し、、 R 3、 χ、 w、 Z、 m、 n、 p、 Q、 rは、式（1) におけるのと同義である。）で示される 1一リン酸化糖誘導体トリマ一、ダイマー、モノマーまたはそれらの塩。

(5) 下記式（5)

(R⁴0)p

(5)

〔式中、 pおよび qは 0から 3の整数を表し、 rは 0または 1を表し、 R i、 R 2、 R 3、 R 4、 χ、 w、 Zは、式（1) におけるのと同義である。

(ただし、 p、 Q、 rは、 Zが酸素原子、ィォゥ原子の場合には、 p + q_+ r≤3を、 Zが炭素原子の場合は p + Q+ r≤5を満たす。）〕で示される 1ーリン酸化糖誘導体モノマーまたはその塩。

(6) 下記式（6)

<H0)p r

(6)

(式中、 1^ 1ぉょび1 ²は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基、または力ルポキシル基を表し、 R ³、 X、 W、 Z、 n、 p、 d、 rは、式（1) におけるのと同義である。）で示される 1ーリン酸化糖誘導体モノマ一またはその塩。

(7) 下記式（7)

S

〔式中、 pおよび Qは 0から 3の整数を表し、 rは 0または 1を表し、 R i、 R 2、 R 3、 R 4、 χ、 w、 Zは、式（ 1 ) におけるのと同義である。

(ただし、 p、 Qi、 rは、 Zが酸素原子、ィォゥ原子の場合には、 p + r≤ 1 q≤ 2 - 2 X (p + r) を、 Zが炭素原子の場合は p + r≤ 2、 q≤4 - 2 X (p+ r) を満たす。）〕で示される 1—リン酸化糖誘導体モノマーまたはその塩。

( 8 ) 下記式（18) ：

R 11

(18)

(式中、 R 11は保護されたヒドロキシメチル基を表し、 R "は水酸基の保護基を表す。）で示される化合物を、塩基の存在下にリン酸で処理して、下記式（19) :

(19)

(式中、 R iiおよび R i⁴は、前記と同義であり、 mは請求項 2と同義である。）で示される 1一リン酸化糖誘導体のァノマ一混合物とした後、加リン酸分解および異性化し、生成する α体を選択的に晶析させることによるァノマー混合物間の平衡を傾け、下記式（20) ：

(20)

(式中、 R 11および R "は前記と同義である。）で示される 1一リン酸化糖を製造する方法。

( 9 ) 下記式（18) ：

(18)

(式中、 R aは保護されたヒドロキシメチル基を表し、 R i⁴は水酸基の保護基を表す。）で示される化合物を、塩基の存在下にリン酸で処理して、下記式（19) ：

( 1 9 )

(式中、 R 11および R i⁴は、前記と同義であり、 mは請求項 2と同義である。）で示される 1 一リン酸化糖誘導体のァノマ一混合物とした後、加リン酸分解および異性化し、生成する α体を選択的に晶析させることによるァノマ一混合物間の平衡を傾け、 α体を選択的に製造し、ついで保護基の脱離を行って、 2—デォキシー a—D—リポース— 1 一リン酸を製造する方法。

さらに、本発明者らは、上記第二の課題を達成するべく鋭意検討を行い、広く生物界に分布するヌクレオシドホスホリラーゼの逆反応を利用し、かつ、前記 1 一リン酸化糖誘導体の合成方法と組み合わせることで汎用性の高いヌクレオシドの合成法を確立した。さらに、反応液にリン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンを存在させることにより、反応の副生成物であるリン酸イオンが難水溶性の塩として沈殿し、反応の平衡がヌクレオシド合成方向へ移動するために反応収率が向上することも見出した。これにより、低コストで高純度のヌクレオシドの製造法を提供する本発明を完成させるに至った。

すなわち、かかる知見に基づいてなされた本発明は以下の態様を含む。

( 1 0 ) 1ーリン酸化糖誘導体のァノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する 1ーリン酸化糖誘導体モノマーのひ体または )3体の一方を選択的に晶析することによりァノマー混合物間の平衡を傾け、 1ーリン酸化糖誘導体モノマーの α体または j8体の一方を選択的に製造し、ついで R で表わされる保護基の脱離反応を行って 1—リン酸化糖誘導体モノマーを製造する上記（3 ) の態様における第一の工程と、ヌクレオシドホスホリラ一ゼにより第一の工程で得られた 1一リン酸化糖誘導体のリン酸基と塩基との交換反応を行う第二の工程により、下記式 (8) - 、

R²

(H0)p ： (NHR³)i

n

Xq

(8)

(式中、 Bは、独立してそれぞれピリミジン、プリン、ァザプリンおよぴデァザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、八口アルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、ァリール基、ァリールォキシ基またはシァノ基によって置換されていてもよい。また、 R i、 R 2、 R 3、 χ、 w、 Z、 n、 p、 Q、 rは式（ 1) におけるのと同義である。）で示されるヌクレオシドを製造する方法。

( 1 1) ヌクレオシドホスホリラーゼを用いて、上記（6) の態様における 1一リン酸化糖誘導体モノマーのリン酸基と塩基との交換反応により、下記式（9) 、

R¹ R² r

(9)

(式中、 Bは式（8) におけるのと同義であり、 R R 2、 R 3、 R 4、 X、 W、 Z、 n、 p、 Q、 rは式（ 1) におけるのと同義である。）で示されるヌクレオシド化合物を製造する方法。

( 1 2) ヌクレオシドホスホリラーゼを用いて、上記（7) の態様における 1一リン酸化糖誘導体モノマーのリン酸基と塩基との交換反応により、下記式（ 1 0)

R1 R²

，'

(H0)p (NHR³)

Xq

(10)

(式中、 Bは式（8) におけるのと同義であり、 R i、 R 2、 R 3、 R 4、 X、 W、 Z、 p、 q、 rは式（ 1) におけるのと同義である。）で示されるヌクレオシドを製造する方法。

( 1 3) 上記（ 1 2) の態様（但し、 R 1がヒドロキシメチル基、 R ²が水素原子、 pおよび rが 0、 Xがフッ素原子である。）における 2ーデォキシ— α— D—リポース一 1一リン酸を製造する第一の工程と、該第一の工程で得られた 1一リン酸化糖誘導体のリン酸基と塩基との交換反応をヌクレオシドホスホリラ一ゼにより行う第二の工程による、下記式（2 1)

0Η

(21)

(式中、 Βは請求項 1 1の式（8) と同義である。）で示されるヌクレオシドの製造方法。なお、上記（ 1 0) 〜（ 1 3) の態様では、ヌクレオシドホスホリラーゼとして、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 1 ) 、グアノシンホスホリラ一ゼ（E C 2. 4. 2. 1 5) 、ピリミジンヌクレオシドホスホリラ一ゼ（EC 2. 4. 2. 2) 、ゥリジンホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 3) 、チミジンホスホリラーゼ（EC 2. 4. 2. 4) 、デォキシゥリジンホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 2 3) からなる群から選択される少なくとも 1種を用いることができる。

更に、このヌクレオシドホスホリラ一ゼ活性としては、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（EC 2. 4. 2. 1) 、グアノシンホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 1 5) 、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（EC 2. 4. 2. 2) 、ゥリジンホスホリラ一ゼ（EC 2. 4. 2. 3) 、チミジンホスホリラーゼ（EC 2. 4. 2. 4) 、デォキシゥリジンホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 2 3) からなる群から選択される一種類以上のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物を用いることができる。

更に、上記（ 1 0) 〜（1 3) の態様においては、ヌクレオシドホスホリラーゼにより、 1—リン酸化糖誘導体モノマ一のリン酸基と塩基との交換反応を行う際に、リン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンを反応液中に存在させることができる。

また、上記（ 1 0) 〜（ 1 3) の態様におけるリン酸と難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンとしては、カルシウムイオン、バリウムィォン、アルミニウムイオン及びマグネシウムイオンの中から選ばれる 1種類以上の金属カチオンを用いることができる。

更に、本発明には、以下の式（ 1 1) 〜（ 1 3) 、及び（2 0) のいずれかにより表される化合物が含まれる。 r

(ID

(式中、 B、 R i、 R 2、 R 3、 R 4、 x、 _W、 Z、 n、 p、 q, rは式（ 1) 及び式（8) におけるのと同義である。）で示される非天然ヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルォロチミジン、リバビリン、. ォロチジン、ゥラシルァラビノシド、アデニンァラピノシド、 2—メチル一アデニンァラビノシド、 2—クロル一ヒポキサンチンァラビノシド、チォグァニンァラビノシド、 2， 6—ジァミノプリンァラビノシド、シトシンァラビノシド、グァニンァラビノシド、チミンァラビノシド、エノシ夕ビン、ジェムシ夕ビン、アジドチミジン、イドクスゥリジン、ジデォキシアデノシン、ジデォキシイノシン、ジデォキシシチジン、ジデヒドロデォキシチミジン、チアジデォキシシチジン、ソリブジン、 5—メチルゥリジン、ビラゾ一ル、チォイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、ァロプリノールゥラシル、 5—フルォロウラシル、 2 ' —アミノウリジン、 2 ' —アミノアデノシン、 2 ' —アミノグアノシン、 2—クロル一 2 ' —ァミノイノシン、 DMDC、 FMD Cは除く）。

(H0)p r

(12)

(式中、 B、 R i、 R 2、 R 3、 R 4、 χ、 w、. Z、 n、 p、（！、 rは式（ 1 ) 及び（8 ) におけるのと同義である。）で示される非天然ヌクレオシド. またはその塩（但し、トリフルォロチミジン、リバビリン、ォロチジン、ゥラシルァラピノシド、アデニンァラピノシド、 2—メチル—アデニンァラビノシド、 2—クロル一ヒポキサンチンァラビノシド、チォグァニンァラビノシド、 2， 6—ジァミノプリンァラピノシド、シ卜シンァラピノシド、グァニンァラビノシド、チミンァラビノシド、エノシ夕ビン、ジェムシタビン、アジドチミジン、イドクスゥリジン、ジデォキシアデノシン、ジデォキシイノシン、ジデォキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデォキシシチジン、ソリブジン、 5—メチルゥリジン、ビラゾール、チォイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、ァロプリノ一ルゥラシル、 5—フルォロウラシル、 2 ，一アミノウリジン、 2 ' —アミノアデノシン、 2 ，一アミノグァノシン、 2—クロル一 2 ' —ァミノイノシン、 D M D (：、 F M D Cは除く）。

(13)

(式中、 B、 R i、 R 2、 R 3、 R 4、 x、 w、 Z、 p、 q、 rは式（ 1 ) 及び（8 ) におけるのと同義である。）で示されるヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルォロチミジン、リバビリン、ォロチジン、ゥラシルァラビノシド、アデニンァラピノシド、 2—メチルーアデニンァラピノシド、 2—クロル一ヒポキサンチンァラビノシド、チォグァニンァラピノシド、 2 , 6—ジァミノプリンァラビノシド、シトシンァラピノ -シド、グァニンァラビノシド、チミンァラビノシド、エノシタビン、ジェムシ夕ビン、アジドチミジン、イドクスゥリジン、ジデォキシアデノシン、ジデォキシイノシン、ジデォキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデォキシシチジン、ソリブジン、 5ーメチルゥリジン' ビラゾ一ル、チォイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、ァロプリノ一ルゥラシル、 5—フルォロウラシル、 2 、一アミノウリジン、 2 ' —アミノアデノシン、 2 ' —ァミノグアノシン、 2—クロル一 2，一ァミノイノシン、 D M D C、 F M D Cは除く） _t 下記式（2 0 ) ： '

R MO

. ( 2 0 )

(式中、 R 11及び R 14は式（1 8 ) と同義である。）で示される 1一リン酸化糖またはその塩も本発明に含まれる。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明で用いられる糖類としては、好ましくはフコース、ラムノース、ジギトキソース、ォレアンドロース、キノポースのような 6—デォキシ糖類、ァロース、アルトロース、グルコース、マンノ一ス、グロース、イドース、ガラクトース、夕口一スのようなへキソ一ス類、リポース、ァラビノース、キシ口一ス、リキソースのようなペントース類、エリト口一ス、トレオースのようなテトロース類、ダルコサミン、ダウノサミンのようなァミノ糖類、グルクロン酸、ガラクッロン酸のようなゥロン酸類、プシコース、フルクト一ス、ソルポース、タガト一ス、ペンツ口 _ースのようなケトース類、 2—デォキシリポースのようなデォキシ糖類といった D系列もしくは L系列よりなる天然型単糖由来の残基、ピラノース型あるいはフラノ一ス型の非天然糖由来の残基、並びにそれらが有する水酸基および/またはァミノ基が保護もしくはァシル化された糖残基誘導体、またはそれらが有する水酸基がフッ素などのハロゲン原子で置換されたハロゲン化糖残基を有する糖類を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

本発明において、 1 一リン酸化糖誘導体とは、天然型単糖由来もしくは非天然糖由来の残基のうち、 1位水酸基がリン酸化された糖の誘導体を示し、特に指定しない限り、モノマー、ダイマーおよびトリマーをも包含し、あるいはそれらからなる混合物であってもよく、その比率は特に限定されない。

R 1又は R ²で表される保護されたヒドロキシメチル基および水酸基の保護基における保護基とは、加水素分解、加水分解、光分解のような化学的方法によって除去される保護基を指す。そのような基としては、ホルミル基、ァシル基、シリル基、アルキル基、ァラルキル基、カルボニル基があり、中でも好ましくは、ホルミル基、脂肪族ァシル基、芳香族ァシル基、シリル基、アルコキシアルキル基、ハロゲン化アルキル基、ァラルキル基、アルコキシカルポニル基、ァラルキルォキシカルポニル基が挙げられる。

脂肪族ァシル基としては、アルキル力ルポニル基またはハロゲン置換された低級アルキルカルポニル基が挙げられる。

上記のアルキルカルポニル基の具体例として、ァセチル基、プロピオニル基、プチリル基、イソプチリル基、ペン夕ノィル基、ビバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、ォク夕ノィル基、ノニルカルポニル基、デシルカルポニル基、 3—メチルノニルカルポ二ル基、 8—メチルノニルカルポニル基、 3—ェチルォクチルカルポニル基、 3， 7—ジメチルォクチルカルポニル基、ゥンデシルカルポニル基、ドデシルカルポニル基、トリデシルカルポニル基、テトラデシルカルポニル基、ペン夕デシルカルポニル基、へキサデシルカルポニル基、 1ーメチルペン夕デシルカルポニル基、 1 4—メチルペン夕デシルカルポニル基、 1 3 , 1 3— ジメチルテトラデシルカルポニル基、ヘプ夕デシルカルポニル基、 1 5 一メチルへキサデシルカルポニル基、ォクタデシルカルポニル基などを例示することができる。

また、ハロゲン置換された低級アルキルカルポニル基の具体例として、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルォロアセチル基などを例示することができる。

芳香族ァシル基としては、ァリールカルポニル基、ハロゲン置換されたァリールカルポニル基、低級アルキル化ァリ一ルカルポニル基、低級アルコキシァリールカルボ二ル基、ニトロ化ァリールカルポニル基、低級アルコキシ力ルポ二ル化ァリ一ルカルポニル基、ァリ一ル化ァリール力ルポ二ル基を挙げることができる。

上記のァリールカルポニル基の具体例として、ベンゾィル基、 α—ナフトイル基、；3—ナフトイル基などを例示することができる。

また、八ロゲン置換されたァリールカルポニル基の具体例として、 2 一フルォロベンゾィル基、 3—フルォロベンゾィル基、 4一フルォ口べンゾィル基、 2—クロ口ベンゾィル基、 3 —クロ口ベンゾィル基、 4— クロ口ベンゾィル基、 2 —ブロモベンゾィル基、 3 —ブロモベンゾィル基、 4一ブロモベンゾィル基、 2， 4—ジクロロベンゾィル基、 2 , 6 —ジクロ口ベンゾィル基、 3， 4—ジクロロベンゾィル基、 3 , 5—ジクロロベンゾィル基などを例示することができる。

また、低級アルキル化ァリ一ルカルポニル基の具体例として、 2—トルオイル基、 3 —トルオイル基、 4一トルオイル基、 2 , 4 , 6 —トリメチルベンゾィル Sなどを例示することができる。

さらに、低級アルコキシァリールカルポニル基の具体例として、 2 _ ァニソィル基、 3—ァニソィル基、 4—ァニソィル基などを例示することができる。

ニトロ化ァリールカルボニル基の具体例として、 2—二トロべンゾィル基、 3—ニトロベンゾィル基、 4—ニトロベンゾィル基、 3， 5—ジ二トロベンゾィル基などを例示することができる。

さらに、低級アルコキシ力ルポ二ル化ァリールカルポニル基の具体例として、 2 一 (メトキシカルポニル) ベンゾィル基などを、ァリール化ァリ一ルカルポニル基の具体例として、 4一フエ二ルペンゾィル基などを例示することができる。

シリル基としては、低級アルキルシリル基、ァリール基で置換された低級アルキルシリル基を挙げることができる。

低級アルキルシリル基の具体例として、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、 t e r t—ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロビルシリル基、トリイソプロピルシリル基を例示することができる。

ァリール基で置換された低級アルキルシリル基の具体例として、ジフェニルメチルシリル基、ジフエニルイソプロピルシリル基、フエニルジイソプロピルシリル基などを例示することができる。

ァラルキル基としては、ベンジル基、低級アルキル基で置換されたァラルキル基、低級アルコキシ基で置換されたァラルキル基、ニトロ基で置換されたァラルキル基、ハロゲン置換されたァラルキル基、シァノ基で置換されたァラルキル基を挙げることができる。 . これらの具体的な基を例示すると、 2—メチルベンジル基、 3—メチルベンジル基、 4 _メチルベンジル基、 2 , 4 , 6 —トリメチルベンジル基、 2—メトキシベンジル基、 3—メトキシベンジル基、 4—メトキシベンジル基、 2—ニトロべンジル基、 3 _ニトロべンジル基、 4 _二トロべンジル基、 2 —クロ口べンジル基、 3—クロ口べンジル基、 4— クロ口べンジル基、 2 —ブロモベンジル基、 3—プロモベンジル基、 4 一ブロモベンジル基、 2—シァノベンジル基、 3—シァノベンジル基、 4—シァノベンジル基などが挙げられる。

：ニル基としては、低級アルキル基で置換されたァラルキルォキシカルポニル基、低級アルコキシ基で置換されたァラルキルォキシカルボ二ル基、ニトロ基で置換されたァラルキルォキシ力ルポニル基、ハロゲン置換されたァラルキルォキシカルポニル基、シァノ基で置換されたァラルキルォキシ力ルポ二ル基を挙げることができる。これらの具体例として、 2 —メチルベンジルォキシカルポニル基、 3 ポニル基、 2， 4 , 6 _トリメチルベンジルォキシカルポニル基、 2— ルポニル基、 4ーメトキシベンジルォキシカルポニル基、 2—二トロべンジルォキシカルポニル基、 3—二トロべンジルォキシカルポニル基、 4—二トロべンジルォキシカルポニル基、 2 —クロ口ベンジルォキシカルポニル基、 3—クロ口べンジルォキシカルボ二ル基、 4 _クロ口ベンジルォキシカルポニル基、 2—ブロモベンジルォキシカルポニル基、 3 ポニル基、 2 一シァノベンジルォキシカルボニル基、 3 —シァノベンジルォキシカルボニル基、 4 一シァノベンジルォキシカルポニル基などを挙げることができる。

アルコキシカルポニル基としては、低級アルコキシカルポニル基、ハロゲン置換されたアルコキシカルポニル化合物、アルキルシリル基で置換されたアルコキシ力ルポ二ル基を挙げることができる。

低級アルコキシカルポニル基の具体例として、メトキシカルボニル基、エトキシカルポニル基、プロポキシカルポニル基、ブトキシカルポニル基、 s e c —ブトキシカルポニル基、 t e r t —ブトキシカルポニル基などを例示することができる。

ハロゲン置換されたアルコキシカルボニル基の具体例として、 2 , 2 , 2 -トリクロ口エトキシカルポニル基を、低級アルキルシリル基で置換されたアルコキシカルポニル基の具体例として、 2 -トリメチルシリルエトキシカルポニル基などを例示することができる。アルキル基としては、メトキシメチル基、エトキシメチル基、 2—メトキシェチル基、 2—メトキシエトキシメチル基のようなアルコキシァルキル基、 2， 2 , 2—トリクロ口ェチル基のようなハロゲン化アルキル基、ベンジル基、一ナフチルメチル基、 /3—ナフチルメチル基、ジフエニルメチル基、トリフエニルメチル基のようなァリール基で置換された低級アルキル基が挙げられる。

これらの中で、好ましくは、脂肪族ァシル基、芳香族ァシル基、ァラルキル基であり、さらに好ましくは、 4 _トルオイル基、 4一クロ口べンゾィル基、またはべンジル基である。

R 1および R ²でいう保護された力ルポキシル基における保護基とは、加水素分解、加水分解、光分解のような化学的方法によって除去される保護基を指す。そのような基としては、好ましくは、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、イソプロピル基、 n—ブチル基、イソブチル基、 s e c—ブチル基、 t e r t _ブチル基のような低級アルキル基、 2 — (トリメチルシリル) ェチル基、 2 - (トリェチルシリル) ェチル基のようなシリル化された低級アルキル基あるいは前述のァラルキル基、ァルコキシアルキル基などを挙げることができる。さらに好ましくは、メチル基、 t e r t —ブチル基、またはべンジル基である。

Xで示すハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を示す。

Xでいうアルコキシ基、アルキルチオ基としては、例えば、前述の低級アルキル基、ァラルキル基、アルコキシアルキル基を有するアルコキシ基、アルキルチオ基を挙げることができる。さらに好ましくは、メトキシ基、メトキシエトキシ基、メチルチオ基である。

Zが示す置換されてよい炭素原子とは、式で表した置換基（X Q及び N H R 3) のいずれかが 1つないし 2つ置換した炭素原子を表し、 .置換していない場合には、水素原子で置換されている炭素原子を指す。

R ³でいうァシル基としては、例えば、前述の脂肪族ァシル基、芳香族ァシル基、アルコキシカルポニル基、ァラルキルォキシカルポニル基、さらに、メタンスルホニル基、トリフルォロメタンスルホニル基のような低級アルカンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、 P —トルエンスルホニル基のようなァリ一ルスルホニル基を挙げることができる。好ましくは、脂肪族ァシル基、芳香族ァシル基、低級アルカンスルホニル基であり、具体的には、ァセチル基、トリフルォロアセチル基、ベンゾィル基、メタンスルホニル基である。また、 N H R ³の複数が置換基として用いられる場合には、各 N H R ³における R ³はそれぞれ独立して上記の基を表す。

また、 R ⁴、 R 11及び R "でいう保護されたヒドロキシメチル基や水酸基の保護基における保護基としては、 R 1及び R ²に関して既に説明した水酸基の保護基が利用できる。

式（ 1 ) 〜（ 1 7 ) を有する糖残基としては、好ましくは前述の天型単糖由来の残基、非天然糖由来の残基、糖残基誘導体、八ロゲン化糖残基を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

本発明の式（4 ) 〜（7 ) で表される化合物の塩とは、化合物が分子内に有するリン酸基が形成する塩を示す。塩としては、ナトリウム、力リウム、リチウムのようなアルカリ金属の塩、マグネシウム、カルシゥム、バリウムのようなアルカリ土類金属の塩、アルミニウム、鉄のような金属の塩、アンモニゥム塩、 1級、 2級、 3級のアルキルァミンの塩が挙げられる。

上記において、 1級ァミンとしては、メチルァミン、ェチルァミン、プロピルァミン、イソプロピルァミン、プチルァミン、へキシルァミン、ォクチルアミンのようなアルキルアミン類、シクロへキシルァミンのようなシクロアルキルアミン類、ベンジルァミンのようなものを挙げることができる。

また、 2級ァミンとしては、ジェチルァミン、ジイソプロピルァミン、ジブチルァミン、ジへキシルァミン、ジォクチルァミンのようなジアルキルアミン類、ジシクロへキシルァミンのようなジシクロアルキルアミン類、ピぺリジン、モルフォリン、 N—メチルピペラジンのような環状アミンを例示できる。

3級ァミンとしては、トリメチルァミン、トリェチルァミン、トリプ口ピルァミン、 N—ェチルジイソプロピルアミン、トリプチルァミン、トリへキシルァミン、トリオクチルァミン、 N—ェチルジシクロへキシルァミン、 N—メチルピペリジン、 N—メチルモルフォリン、 N , N , Ν ' , N ' ーテトラメチルエチレンジァミンのような 3級のアルキルァ ' ミン、ァニリン、 N , N—ジメチルァニリン、 N， N—ジェチルァニリン、 N， N—ジブチルァ二リン、 N， N—ジォクチルァニリンのようなァニリン類、ピリジン、 2， 6ージメチルピリジン、 2， 4， 6ールチジン、ニコチンアミドのようなピリジン類の塩、グリシン、ァラニン、プロリン、リジン、アルギニン、グルタミンのようなアミノ酸類、シンコニジン、 1一（ 1一ナフチル）ェチルァミン、 1—フエニルェチルァミンのような光学活性ァミンを挙げることができ、何れも 1価あるいは " ''2価の塩を包含する。

さらに、本発明の式（4 ) 〜（7 ) ·で表される化合物は、大気中に放置することにより水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があるが、そのような塩も本発明に包含される。

本発明における 1一リン酸化糖誘導体のァノマー混合物は、下記反応式（ I ) 反応式（ I )

脱水剤

(14) (1) によって製造することができるが、これに限定されるものではない。上記式において、 R i、 R 2、 R 3、 R 4、 χ、 w、 Z、 m、 n、 , q および rは、前述の式（ 1 ) と同義であり、 Yは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を表す。 mが 1の場合はリン酸トリエステルを、 mが 2の場合はリン酸ジエステルを、 mが 3の場合はリン酸モノエステルを意味し、それぞれ 1 一リン酸化糖誘導体トリマ一、 1ーリン酸化糖誘導体ダイマー、 1 一リン酸化糖誘導体モノマーと称する。また、 1 一リン酸化糖誘導体トリマー、 1 一リン酸化糖誘導体ダイマ一、 1 一リン酸化糖誘導体モノマーを総称して、 1 一リン酸化糖誘導体と称し、それらの混合比については、特に限定されない。

リン酸としては、正リン酸のように水分量の少ないものが好ましいが、特に限定されない。

塩基としては、反応を阻害せず、脱酸剤として機能すれば特に限定はないが、好ましくは、無機塩基としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属の炭酸塩、水酸化物などが、有機塩基としては、 3級のアルキルァミン類、ァニリン類、ピリジン類、光学活性アミンを挙げることができる。

脱水剤は、溶媒や添加剤から混入する水分が、反応に悪影響を与える場合に使うことができる。脱水剤としては、水分の吸着性あるいは水分との反応性があれば特に限定されないが、好ましくはモルキユラーシーブスあるいは五酸化リンを挙げることができる。

反応は、通常、溶媒の存在下に行われる。使用される溶媒としては、反応を阻害せず、出発物質をある程度溶解するものであれば特に限定はないが、例えば、へキサン、ヘプタンのような脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン、ァニソールのような芳香族炭化水素類、メチレンクロリド、クロ口ホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロ口ベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類、ギ酸ェチル、酢酸エヂル、酢酸プロピル、酢酸 n—ブチル、炭酸ジェチルエステルのようなエステル類、ジェチルェ一テル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサン、ジメトキシェタン、ジグリムのようなエーテル類、ァセトニトリル、プロピオ二トリル、イソプチロニトリルのような二トリル類、ホルムアミド、 N, N—ジメチルホルムアミド、 N, N—ジメチルァセトアミド、 N—メチル一 2—ピロリドン、 N—メチルピロリジノン、 N， N—ジメチルー 2—イミダゾリジノンのようなアミド類、アセトン、 2—ブタノン、メチルイソプロピルケトン、メチルィソブチルケトンのようなケトン類またはそれらから選択される 2種ないし 3種からなる混合溶媒を挙げることができる。

反応温度は、特に限定はなく、通常、一 8 0 から 6 0°C、好適には - 1 0 °Cから 2 5 °Cの範囲で行われる。

反応時間は、出発原料、試薬および溶媒の種類、反応温度によって異なるが、通常、 1分間から 24時間、好適には 1 0分間から 2時間で達成される。

尚、本反応における糖誘導体（ 14) とリン酸の比率は、特に限定はなく、通常、化合物（ 1 4) ：リン酸 = 1 ： 1 0〜3 ： 1で反応を行うことができる。その場合、化合物（ 14) とリン酸の比率に応じて、生成物（1) は、通常、リン酸に結合する糖残基の数（即ち m) が、 1， 2または 3である化合物が様々に混じつた混合物となる。

さらに、 α体または )3体の一方を有する 1一リン酸化糖誘導体（ 1 6 a) または（ 1 6 b) は、下記反応式（ I I )

反応式（π)

によって製造することができる。

上記式において、 R i、 R 2、 R 3、 R 4、 χ、 w、 Z、 m、 n、 p、 q および rは、前述の式（1) と同義である。

本製造法によれば、化合物（1 5) で示される 1一リン酸化糖誘導体は、モノマー、ダイマ一あるいはトリマ一の混合物であっても、反応系内で、化合物（1 6) で示される 1一リン酸化糖誘導体モノマーへと変換可能であるため、それらの混合比については特に限定されない。

塩基は、化合物（1 6) が分子内に有するリン酸基と塩を形成し、ひ体または] 3体の一方、（1 6 a) または（16 b) 、を、選択的に晶析するために重要である。通常、反応に使用する溶媒との組み合わせで、、最適な塩基を選ぶことができるが、好ましくは、前述の無機塩基類、 3 級のアルキルアミン類、ァニリン類、ピリジン類、アミノ酸類、光学活性ァミンを挙げることができ、形成する塩としては、何れも 1価あるいは 2価の塩を包含する。

反応は、通常、溶媒の存在下に行われる。使用される溶媒としては、反応を阻害せず、出発物質をある程度溶解し、化合物（ 1 6) が分子内に有するリン酸基と塩を形成して生成する、ひ体または )3体の一方、（ 1 6 a) または（ 1 6 b) 、が、選択的に晶析してくるのを助長するならば特に限定はなく、例えば、前述の脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類、エステル類、エーテル類、二トリル類、ァミド類、ケトン類またはそれらから選択される 2種ないし 3種からなる混合溶媒を挙げることができる。

反応温度は、化合物（ 1 5) と（1 6) との平衡反応を促し、化合物 ( 1 6) が分子内に有するリン酸基と塩を形成して生成する、体または i3体の一方、すなわち、（ 1 6 a) または（ 1 6 b) 、が、選択的に晶析してくるのを助長するならば特に限定はなく、通常、 — 80°Cから 6 0 °C、好適には— 1 0 °Cから 2 5 °Cの範囲で行われる。

反応時間は、出発原料、試薬および溶媒の種類、反応温度によって異なるが、通常、 3時間から 1週間、好適には 6時間から 24時間で達成される。

尚、本反応における糖誘導体（ 1) とリン酸の比率は、特に限定はなく、通常、化合物（ 1 ) ：リン酸 = 1 ： 1 0〜 3 ： 1の範囲で反応を行うことができる。その際、反応系内の pHは、通常 1から 7、好適には 1力、ら 4の酸性側で行うことが望ましい。

さらに、ひ体または ]3体の一方を有する 1一リン酸化糖誘導体（ 1 6 a) または（ 1 6 b) は、塩の交換反応を行って、精製し、反応系内で使用した塩基とは異なった塩基のリン酸塩として取り出すことができる。ここで使用される塩基としては、前述の無機塩基類、 1級のアルキルァミン、 2級のアルキルァミン、 3級のアルキルァミン、ァニリン類、ピリジン類、アミノ酸類、光学活性アミンを挙げることができ、形成する塩としては、何れも 1価あるいは 2価の塩を包含する。

さらに、保護基の脱離反応を下記反応式（I I I) 反応式 (m)

によって行い、 1—リン酸化糖誘導体（17 a) または（17 b) を製造することができる。

上記式において、 R i、 R 2、 R 3、 R 4、 χ、 w、 Z、 n、 p、 qおよび rは、前述の式（1) と同義であり、 R 1' および R²' は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基または力ルポキシル基を表し、 R ³' は水素原子またはァシル基を表す。

化合物（16 a) または（16 b) における R iおよび R 2のヒドロキシメチル基あるいは R ⁴の水酸基の保護基として、前述の脂肪族ァシル基、芳香族ァシル基、アルコキシカルボ二ル基、または R 1および R 2 のカルボキシル基の保護基として、前述の低級アルキル基を使用した場 .合には、例えば、水溶性溶媒中にて塩基で処理することにより除去することができる。塩基としては、好ましくは、炭酸ナトリウム、炭酸カリゥムのようなアルカリ金属炭酸塩、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなアルカリ金属水酸化物、アンモニア水、テ卜ラ n—プチルアンモニゥムヒドロキシドのような水酸化アンモニゥム類、前述の無機塩基、 1級のアルキルァミン、 2級のアルキルァミン、 3級のアルキルァミンなどを用いて行うことができる。

使用される溶媒としては、通常の加水分解反応に使用されるものであれば特に限定はないが、好ましくは、水、メタノール、エタノール、 n 一プロパノール、イソプロパノールのようなアルコール類、前述のェ一テル類を用いることができる。反応温度および反応時間は出発物質や用いる塩基などによって異なり、特に限定はないが、通常は一 1 0 °Cから 1 0 0 °Cで、 1時間から 5日間で終了する。この際、反応温度、反応時間あるいは試薬の当量数を調節することにより、 R ³の保護基を所望により残すこともできるし、同時に除去することもできる。

化合物.（ 1 6 a ) または（1 6 b ) における R iおよび R 2のヒドロキシメチル基あるいは R ⁴の水酸基の保護基として、前述のァラルキル基、ァラルキルォキシ力ルポニル基または R 1および R 2の力ルポキシル基の保護基として、前述のァラルキル基を使用した場合には、例えば、金属触媒を使用して、接触還元を行って除去するとができる。

触媒としては、好ましくは、パラジウム炭素、ラネーニッケル、酸化白金、白金黒、ロジウム一酸化アルミニウム、トリフエニルホスフィン —塩化ロジウム、パラジウム—硫酸バリゥムなどを用いて行うことができる。圧力は特に限定はないが、通常使用される溶媒としては、通常の加水分解反応に使用されるものであれば特に限定はないが、好ましくは、水、メタノール、エタノール、 n—プロパノール、イソプロパノールのようなアルコール類、前述のエーテル類、エステル類を用いることができる。反応温度および反応時間は出発物質や用いる塩基などによって異なり、特に限定はないが、通常は一 1 O から 1 0 0 °Cで、 1時間から 5日間で終了する。この場合、 R 3の保護基は、通常除去されずに残すことができる。

化合物（ 1 6 a ) または（1 6 b ) における R iおよび R 2のヒドロキシメチル基あるいは R ⁴の水酸基の保護基として、前述のシリル基、または R 1および R ²の力ルポキシル基の保護基として、前述のシリル化された低級アルキル基を使用した場合には、例えば、フッ化テトラ n—ブチルアンモニゥムのようなフッ素ァニオンを生成するような化合物を使用して、除去することができる。

反応溶媒は反応を阻害しないものであれば特に限定はないが、前述のエーテル類を用いることができる。反応温度および反応時間は特に限定はないが、通常は一 1 0 °Cから 5 0 °Cで、 1 0分間から 1 0時間で終了する。この場合、 R 3の保護基は、通常除去されずに残すことができる。何れの保護基を除去する場合においても、生成物が分子内に有するリン酸基は、反応系内に存在する塩基の塩として得られてくるが、所望により他の塩基の塩に変更して取り出すこともできる。その際に使用する塩基としては、例えば、前述の無機塩基類、 1級のアルキルアミン類、 2級のアルキルアミン類、 3級のアルキルアミン類、ァニリン類、ピリジン類、アミノ酸類、光学活性アミンを挙げることができ、形成する塩としては、何れも 1価あるいは 2価の塩を包含する。

本発明における 1 一リン酸化糖誘導体とは、糖類およびその誘導体の 1位にリン酸がエステル結合したもののことである。

具体的には、下記式（6 )

R¹ R²

(H0) p (議³) r

n

Xq

(6) (式中、 1^ 1ぉょび1 ²は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基、または力ルポキシル基を表し、 R ³、 X、 W、 Z、 n、 p、 d、 rは、式（4 ) におけるのと同義である。；) で示すことができる。

その代表例を挙げると、例えばリポース一 1 一リン酸、 2—デォキシリポース一 1 一リン酸、 2， 3 _ジデォキシリポース— 1 一リン酸、ァラビノース一 1—リン酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、前述の汎用性の高い、ァノマー選択的な製造法により得られるものであれば、特に区別されるものではない。

尚、 1 一リン酸化糖誘導体を構成する天然物由来'の糖類としては、 D —ァラビノース、 L—ァラビノース、 D—キシ口一ス、 Lーリキソース、 D—リポースのようなアルドベント一ス、 D—キシロース、 L一キシロース、 D—リブロースのようなケトペン卜ース、 D—ガラク卜一ス、 L —ガラクトース、 D—グルコース、 D—夕ロース、 D—マンノースのようなアルドへキソース、 D—夕ガトース、 L一ソルポース、 D—プシコース、 D—フルクトースのようなケトへキソース、 D— 2—デォキシリポース、 D— 2， 3—ジデォキシリポ一ス、 D—フコース、 L—フコー ■ ス、 D—ラムノース、 L一ラムノース、 D—フコピラノース、 Lーフコビラノース、 D—ラムノフラノ一ス、 L—ラムノフラノ一ス、 D—ァロメチロース、 D—キノポース、 D—アンチアロース、 D—夕ロメチロース、 L一夕ロメチロース、 D—ジキ夕ロース、 D—ジギトキソース、 D ーシマロ一ス、チべロース、アベコース、パラト一ス、コリト一ス、ァスカリロ一スのようなデォキシ糖類、ダルコサミン、ダウノサミンのようなアミノ糖類、グルクロン酸、ガラクッロン酸のようなゥロン酸類を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

次に、本発明にかかるヌクレオシドの製造方法について述べる。この方法に用いられる塩基は、ピリミジン、プリン、ァザプリンおよびデァザプリンからなる群から選択された天然または非天然型の塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシァミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、ァリール基、ァリールォキシ基またはシァノ基によって置換されていてもよい。

置換基としてのハロゲン原子としては、塩素、フッ素、ヨウ素、臭素が例示される。アルキル基としては、メチル、ェチル、プロピルなどの炭素数 1〜 7の低級アルキル基が例示される。ハロアルキル基としては、フルォロメチル、ジフルォロメチル、トリフルォロメチル、ブロモメチル、ブロモェチルなどの炭素数 1〜 7のアルキルを有するハロアルキル基が例示される。アルケニル基としては、ビニル、ァリルなどの炭素数 2〜 7のアルケニル基が例示される。ハロアルケニル基としては、プロモビニル、クロ口ビニルなどの炭素数 2〜 7のアルケニルを有するハロアルケニル基が例示される。アルキニル基としては、ェチニル、プロピニルなどの炭素数 2〜 7のアルキニル基が例示される。アルキルアミノ基としては、メチルァミノ、ェチルァミノなどの炭素数 1〜 7のアルキルを有するアルキルアミノ基が例示される。アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシなどの炭素数 1〜 7のアルコキシ基が例示される。ァルキルメルカプト基としては、メチルメルカプト、ェチルメルカプトなどの炭素数 1〜 7のアルキルを有するアルキルメルカプト基が例示される。ァリール基としては、フエニル基；メチルフエニル、ェチルフエ二ルなどの炭素数 1〜 5のアルキルを有するアルキルフエニル基；メトキシフエニル、エトキシフエニルなどの炭素数 1〜 5のアルコキシを有するアルコキシフエニル基；ジメチルアミノフエニル、ジェチルァミノフェニルなどの炭素数 1〜 5のアルキルアミノを有するアルキルアミノフェニル基；ク口口フエニル、ブロモフエニルなどのハロゲノフエニル基などが例示される。

ピリミジン塩基を具体的に例示すれば、シトシン、ゥラシル、 5—フルォロシトシン、 5 _フルォロウラシル、 5—クロロシトシン、 5—ク口ロウラシル、 5—ブロモシトシン、 5—ブロモウラシル、 5—ョードシトシン、 5 —ョ—ドウラシル、 5—メチルシトシン、 5—メチルゥラシル（チミン）、 5—ェチルシトシン、 5—ェチルゥラシル、 5—フルォロメチルシトシン、 5—フルォロウラシル、 5 _トリフルォロシトシン、 5—トリフルォロウラシル、 5—ビニルゥラシル、 5—プロモビニルゥラシル、 5—クロロビニルゥラシル、 5—ェチニルシトシン、 5— ェチニルゥラシル、 5 —プロピニルゥラシル、ピリミジン一 2—オン、 4ーヒドロキシァミノピリミジン一 2 —オン、 4—ァミノォキシピリミジン— 2 —オン、 4ーメトキシピリミジン— 2 —オン、 4—ァセトキシピリミジン一 2 —オン、 4 —フルォロピリミジン一 2 —オン、 5 —フルォロピリミジン一 2—オンなどが挙げられる。

プリン塩基を具体的に例示すれば、プリン、 6—アミノブリン（アデニン）、 6—ヒドロキシプリン、 6—フルォロプリン、 6—クロ口プリン、 6ーメチルァミノプリン、 6—ジメチルァミノプリン、 6 _トリフルォロメチルァミノプリン、 6—ベンゾィルァミノプリン、 6 _ァセチルァミノプリン、 6—ヒドロキシァミノプリン、 6—ァミノォキシプリン、 6—メトキシプリン、 6—ァセトキシプリン、 6—べンゾィルォキシプリン、 6—メチルプリン、 6 _ェチルプリン、 6 _トリフルォロメチルプリン、 6—フエニルプリン、 6—メルカプトプリン、 6—メチルメルカプトプリン、 6 —ァミノプリン一 1—ォキシド、 6—ヒドロキシプリン一 1 —ォキシド、 2 —アミノー 6—ヒドロキシプリン（グァニン）、 2 , 6—ジァミノプリン、 2—ァミノ一 6 —クロ口プリン、 2—ァミノ — 6—ョードプリン、 2—アミノブリン、 2 —アミノー 6 —メルカプトプリン、 2 —ァミノ一 6—メチルメルカプトプリン、 2 —アミノー 6— ヒドロキシァミノプリン、 2—ァミノ一 6—メトキシプリン、 2 —アミノー 6—ベンゾィルォキシプリン、 2—ァミノ— 6—ァセトキシプリン、 2—アミノー 6—メチルブリン、 2—アミノー 6—サイクロプロピルァミノメチルプリン、 2—アミノー 6—フエ二ルブリン、 2—アミノー 8 —ブロモプリン、 6—シァノプリン、 6—ァミノ一 2—クロ口プリン（2 —クロロアデニン）、 6—アミノー 2—フルォロプリン (2—フルォロアデニン）などが挙げられる。

ァザプリン塩基およびデァザプリン塩基を具体的に例示すれば、 6 - アミノー 3—デァザプリン、 6—アミノー 8—ァザプリン、 2—ァミノ一 6—ヒドロキシ— 8—ァザプリン、 6—アミノー 7—デァザプリン、 6—アミノー 1一デァザプリン、 6—ァミノ— 2—ァザプリンなどが挙げられる。

本発明におけるヌクレオシドホスホリラ一ゼとは、リン酸存在下でヌクレオシドの N—グリコシド結合を分解する酵素の総称であり、本発明においては逆反応を利用することができる。反応に使用する酵素は、相当する 1―リン酸化糖誘導体と塩基から目的とするヌクレオシドを生成しうる活性を有していればいかなる種類及び起源のものでもかまわない。該酵素はプリン型とピリミジン型に大別され、例えば、プリン型としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 1) 、グアノシンホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 1 5) 、ピリミジン型としてピリミジンヌクレオシドホスホリラ一ゼ（E C 2. 4. 2. 2) 、ゥリジンホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 3 ) 、チミジンホスホリラ一ゼ（E C 2. 4. 2. 4) 、デォキシゥリジンホスホリラ一ゼ（EC 2. 4. 2. 2 3) などが挙げられる。

本発明におけるヌクレオシドホスホリラ一ゼを発現している微生物とは、プリンヌクレ 'オシドホスホリラーゼ（EC 2. 4. 2. 1 ) 、グァノシンホスホリラ一ゼ（E C 2. 4. 2. 1 5 ) 、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 2) 、ゥリジンホスホリラーゼ (E C 2. 4. 2. 3) 、チミジンホスホリラ一ゼ（E C 2. 4. 2. 4) 、デォキシゥリジンホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 2 3) からなる群から選択される一種類以上のヌクレオシドホスホリラーゼを発現微生物であれば特に限定はされない。

このような微生物の具体例としては、ノカルディア（Nocardia)属、ミクロノクテリゥム（Microbacterium)属、コリネバクテリゥム (Corynebacterium)属、ブレヒハ、クテリゥム厲 (Brevibacterium) 属、セルロモナス（Cellulomonas)属、フラポバクテリゥム（ Flabobacterimn) 属、クルイヘラ（Kluyvere)属、ミコノクテリゥム（Micobacterium)属、へモフィラス（Haemophilus) 属、ミコプラナ（Micoplana)属、プロ夕ミノバク夕一（Protaminobacter)属、キャンディダ（Candida)属、サッカロマイセス（Saccharomyces) 属、バチルス（Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シユードモナス (Pseudomonas)属、ミクロコッカス (Micrococcus)属、ハフニァ（Hafnia) 属、プロテウス（Proteus)属、ビブリオ (Vibrio)属、スタフィロコッカス（Staphyrococcus)属、プロピオニバクテリゥム ( Propionibacterium ) 属、ザルチナ（Sartina)属、プラノコッカス (Planococcus)属、ェシエリシァ (Escherichia) 属、クルチア (Kurthia) 属、ロドコッッカス（Rhodococcus)属、ァシネトパクター（Acinetobacter) 属、キサントパクター（Xanthobacter)属、ストレプトマイセス (Streptomyces)属、リゾピウム（Rhizobium)属、サルモネラ（Salmonella) 属、クレブシエラ（Klebsiella)属、ェンテロバクタ一（Enterobacter)属、エルウイニァ（Erwinia)属、エアロモナス (Aeromonas)属、シトロバクタ一（Citrobacter)属、ァクロモパクター（Achromobacter)属、ァグロパクテリヮム (Agrobacterium)属、アースロノクター属 (Arthrobacter)j¾ま 7こはシユードノカルディァ (Pseudonocardia)属に含まれる微生物株を好適な例として挙げることができる。

近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、上述の微生物株のヌクレオシドホスホリラーゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該蛋白質の遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が揷入された組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、該蛋白質を発現させた遺伝子組換え菌を作出することが可能となり、かつ、比較的容易にもなつた。かかる技術水準に鑑み、このようなヌクレオシドホスホリラーゼの遺伝子を任意の宿主に導入した遺伝子組換え菌も本発明のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物に包含されるものとする。

ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモー夕一配列（転写を制御するオペレーター配列を含む） · リボゾーム結合配列（SD配列） · 転写終結配列等を示している。プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来のトリプトファンォペロンの t r pプロモーター ' ラクト一スオペロンの 1 a cプロモ一夕一 ' ラムダファージ由来の P Lプロモータ一及び P プロモーターや、枯草菌由来のダルコン酸合成酵素プロモー夕一（g n t ) · アルカリプロテア一ゼプロモーター（ a p r ) ' 中性プロテアーゼプロモーター（n p r ) · u—アミラーゼプロモ夕一 ( a my)等が挙げられる。また、 t a cプロモータ一のように独自に改変 · 設計された配列も利用できる。リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、 1 6 Sリボゾーム RNAの 3 ' 末端領域に相補的な配列が 4塩基以上連続したコンセンサス配列を DN A合成により作成してこれを利用してもよい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、 |0因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネータ一 · t r pオペロンターミネータ一等が利用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、 5 ' 末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、ヌクレオシドホスホリラーゼをコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。

ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有している P B R 3 2 2、 pUC 1 8、 B l u e s c r i p t I I S K ( + ) 、 pKK22 3— 3、 p S C l O lや、枯草菌中での自律複製可能な領域を有している p UB 1 1 0、 pTZ 4、 p C 1 94、 P 1 1 , Φ 1、 Φ 1 0 5等をべクタ一として利用することができる。また、 2種類以上の宿主内での自律複製が可能なプラスミドの例として、 p H V 1 4、 T R p 7、 Y E p 7及び p B S 7をべクタ一として利用することができる。

ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌 (Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌 (Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。

また、本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼ活性とは、上述の該酵素活性を有する微生物菌体のみならず、該酵素活性を有する微生物菌体の菌体処理物またはそれらの固定化物なども使用できる。菌体処理物とは、例えばアセトン乾燥菌体ゃ機械的破壊、超音波破砕、凍結融解処理、加圧減圧処理、浸透圧処理、自己消化、細胞壁分解処理、界面活性剤処理などにより調製した菌体破砕物などであり、また、必要に応じて硫安沈殿やアセトン沈殿、カラムクロマトグラフィーにより精製を重ねたものを用いても良い。

本発明において、リン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンとは、反応において副生したリン酸イオンと難水溶性の塩を形成し、反応液中に沈殿しうるものであれば限定されない。そのようなものとして、カルシウム、マグネシウム、バリウム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、銀、モリブデン、鉛、亜鉛、リチウムなどの金属カチオンが挙げられる。それらのうち工業的に汎用性や安全性が高く、反応に影響を与えない金属塩が特に好ましく、そのようなものの例としてカルシウムィォン、バリウムイオン、アルミニウムイオン及びマグネシウムイオンが'挙げられる。

本発明におけるリン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチォンとは、リン酸と難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンを、塩素ィォン、硝酸イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、酢酸イオンまたは水酸ィォンの中から選ばれる 1種類以上のァニオンとの金属塩として反応液中に添加すればよい。具体的には、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩化バリウム、硝酸バリウム、炭酸バリウム、硫酸バリウム、酢酸バリウム、塩化アルミニゥム、硝酸アルミニウム、炭酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、酢酸ァルミ二ゥム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、炭酸マグネシゥム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウムなどが例示される。また、該金属カチオンは、ベント一ス— 1 一リン酸の塩として反応液中に存在させてもよい。一例を挙げると、リポース— 1—リン酸 ·カルシゥム塩、 2—デォキシリポース一 1 _リン酸 ·カルシウム塩、 2， 3 —ジデォキシリポース— 1—リン酸 ·カルシウム塩、ァラビノース— 1 一リン酸 · カルシム塩、リポース一 1—リン酸 .バリウム塩、 2—デォキシリポース一 1 一リン酸 ·バリウム塩、 2， 3—ジデォキシリポース _ 1—リン酸 'バリゥム塩、ァラビノース一 1 一リン酸 .バリゥム塩、リポース— 1—リン酸 ' アルミニウム塩、 2—デォキシリポース— 1― リン酸 ' アルミニウム塩、 2 , 3 —ジデォキシリポース— 1 一リン酸 ' アルミニウム塩、ァラビノース一 1—リン酸 ' アルミニウム塩、などが挙げられる。

本発明におけるヌクレオシド化合物の合成反応は、目的とするヌクレオシド、基質である 1 一リン酸化糖誘導体と塩基、反応触媒であるヌクレオシドホスホリラーゼ又は該酵素活性を有する微生物、そしてリン酸を反応系より除外させるために添加する金属塩の種類とその特性により、適切な p Hや温度などの反応条件ならびに管理幅を選べばよいが、通常は p H 5〜 1 0、温度 1 0〜 6 0 °Cの範囲で行うことができる。 p Hに関して、その管理幅を外れた場合、目的物や基質の安定性、酵素活性の低下、リン酸との難水溶性塩の未形成などが原因で反応転化率の低下を招く可能性がある。反応途中、 p Hの変化が生じるようであれば必要に応じて塩酸、硫酸などの酸や水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアル力リを適時添加すればよい。反応に使用する 1 一リン酸化糖誘導体と塩基の濃度は 0 . 1〜 1 0 0 O mM程度が適当であり、両者のモル比は添加する塩基の比率を 1 一リン酸化糖誘導体又はその塩に対して 0 . 1〜 1 0倍モル量で行える。反応転化率を考えれば 0 . 9 5倍モル量以下が好ましい。

また、添加するリン酸と難水溶性の塩を形成しうる金属塩は、反応に使用する 1 一リン酸化糖誘導体に対して 0 . 1〜 1 0倍モル量、より好ましくは 0 . 5〜 5倍モル量添加するのが良い。その添加方法について制限は無く、一括添加や反応中に逐次添加しても良い。また、本反応は基本的に水を溶媒としているが、必要に応じ反応系にアルコールゃジメチルスルホキシドなど通常の酵素反応に用いられる有機溶媒を適量添加しても良い。なお、高濃度の反応においては、基質の塩基や生成物のヌクレオシド化合物が溶解しきれずに反応液中に存在する場合もあるが、このような場合にも本発明を適用することができる。

このようにして製造したヌクレオシド化合物は、濃縮、晶析、溶解、電気透析処理、ィオン交換樹脂や活性炭による吸脱着処理どの常法を適用することにより単離することができる。

(実施例）

以下に実施例により、本発明を更に詳細に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例 1

3， 5 —〇一ビス（4—クロ口べンゾィル） — 2—デォキシ—D—リポ —ス _ 1 _リン酸（ 1 8 ) およびビス〔 3 , 5— O—ビス（4—クロ口ベンゾィル）一 2ーデォキシ— D—リポース一 1 一ィル〕リン酸（ 1 9 ) のァノマー混合物の合成

正リン酸 1 . 1 8 gとァセトニトリル 5 1 m Lの混合物にトリ n ーブチルァミン 2 . 3 gとモルキユラ一シーブス 4 A 5 . 0 7 gを Of M fi口く、 Π— α— »—く、 ÷ ^一 s— ^ロ口 ― ） ra-o - s 'ε 5 $ °¾つつ。 s つ ίΐί αΐ¾ § 6 ' v ^ ^ :-^-^^Φ^ΐΓ¾? § I I ' z ^ Λ(-^

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89600/l0df/X3d 0Z68S/10 OAV 8 5 %) 4. 9 gを加えて 1 0分間攪拌し、表記化合物（ 1 8) と（ 1 9) の混合物〔（ 1 8) ： ( 1 9) = 1 : 4、（ 1 8) の 0；体： /3体二 7 ： 1 0〕の 2—ブ夕ノン溶液を得た。

実施例 3

3, 5— 0—ビス（4—クロ口べンゾィル）一 2—デォキシ— D—リポ —ス— 1 _リン酸およびビス〔3, 5—〇—ビス（4一クロ口べンゾィル） _ 2—デォキシ— D—リポ一ス— 1—ィル〕リン酸のァノマ一混合物の合成

正リン酸 1 3 6. 8 gと 2—ブ夕ノン 2 Lの混合物にトリ n—ブチルァミン 9 0. 6 gとモルキユラーシーブス 4 A 2 00 gを加え、攪拌しながら 5 °Cに冷却した。 1時間攪拌後、 3, 5— O—ビス（4— クロ口べンゾィル）一 2—デォキシ— ひ—D—リポシルクロリド（純度 8 5 %) 2 0 0 gを加えて 2時間攪拌し、表記化合物（ 1 8) と（ 1 9) の混合物〔（ 1 8) ： ( 1 9) = 5 : 4、（ 1 8) の体：）3体 = 5 : 2〕の 2—ブ夕ノン溶液を得た。

実施例 4

3， 5—〇一ビス（4—クロ口べンゾィル）一 2—デォキシ— α— D— リポース一 1—リン酸（1 8 a) の合成

実施例 1で得たァセトニトリル溶液を攪拌しながら 5°Cに冷却し、正リン酸 2. 2 9 gを加えた。 3時間攪拌後、結晶が析出しはじめ、濃厚な懸濁液となった。 5時間後、反応懸濁液中の表記化合物（ 1 8 a) のひ体/) 3体比は 1 0 ： 1であった。結晶をモルキユラ一シーブスとの混合物として濾取し、メタノール l O OmLに溶解後、再び濾過してモルキユラーシ一ブスを除いた。 HP L C定量した結果、得られたメタノール溶液中に、表記化合物（ 1 8 a) は、 3. 6 8 g含まれた。収率 74. 6 % (原料純度換算済み： HP L C上、 /3体は検出されない）。実施例 5

3, 5—0—ビス（4—クロ口べンゾィル）一 2—デォキシー α— D _ リポース一 1一リン酸（ 1 8 a) の合成

実施例 2で得た 2—ブタノン溶液を攪拌しながら 5 °Cに冷却し、正リン酸 2. 2 gを加えた。 1時間攪拌後、結晶が析出しはじめ、濃厚な懸濁液となった。 2 0時間後、反応懸濁液中の表記化合物（1 8 a) のひ体/ 3体比は 8 ： 1であった。トリ n—プチルァミン 6. 3 3 gを加えて析出晶を溶解し、モルキユラ一シーブスを濾去した。濾液にトルェン 2 5 0 mLを加え、水 5 5mLで洗浄した。有機層を氷冷し、シクロへキシルァミン 2. 32 gを加えて、攪拌晶析した。 1時間後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥し、表記化合物（ 1 6 a) のジシクロへキシルァミン塩 3. 1 9 gを無色粉末として得た。収率 64. 7 % (原料純度換算済み： a体： 0体 = 9 7. 5 : 2. 5)

NMR (DMSO-de, 270 MHz) d 8.00 (d， J = 8.6 Hz, 2 H), 7.96 (d, J = 8.6 Hz, 2 H)， 7.58 (d, J = 8.6 Hz, 2 H)， 7.58 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 5.82 (dd, J = 5.3, 5.3 Hz, 1 H), 5.36 (d, J = 8.6 Hz, 1 H)_; 4.6-4.3 (m, 3 H)， 4.7-3.5 (br, 6 H), 2.7-2.6 (m, 2 H), 2.55-2.4 (m, 1 H), 2.25 (d, J = 4.2 Hz, 1 H), 1.85-1.75 (m, 4 H)， 1.7-1.6 (m, 4 H), 1.55-1.45 (m, 2 H)， 1.25-0.9 (m, 10 H)、 MS (APCI) m/z 590 (M+C6H14N)

実施例 6

3, 5—〇_ビス（4一クロ口べンゾィル） _ 2—デォキシー α— D— リポース— 1一リン酸（ 1 8 a) の合成

実施伊 !13で得た 2—ブタノン溶液を 5 に冷却し、攪拌した。 1時間攪拌後、結晶が析出しはじめ、濃厚な懸濁液となった。 2 3時間後、反応懸濁液中の表記化合物（ 1 8 a) のひ体/ /3体比は 7 ： 1であった。トリ n—プチルァミン 2 5 9 gを加えて析出晶を溶解し、モルキユラーシーブスを濾去した。濾液を水 2. 2 Lで洗浄し、さらに水層をトルェン 1 Lで抽出した。有機層を集め、氷冷し、シクロへキシルアミン 8 7. 5 gを加えて、攪拌晶析した。 1時間後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥し、表記化合物（1 6 a) のジシクロへキシルァミン塩 2 1 3 gを無色粉末として得た。収率 7 8. 1 % (原料純度換算済み：ひ体： j3体 = 9 6. 9 : 3. 1) 。

実施例 7

2—デォキシーひ— D—リポース一 1一リン酸 (2 0) の合成

実施例 4で得たメタノール溶液にアンモニア水 2 0mLを加え、室温で攪拌した。 28時間攪拌後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥して表記化合物（2 0) のアンモニゥム塩 5 8 9 mgを無色粉末として得た。収率 2 1. 1 % (HP L C上、体は検出されない）。

実施例 8

2—デォキシ— Q!_D—リポース一 1—リン酸（2 0) の合成

実施例 6で得た化合物（ 1 8 a) をメタノール 2. 3 Lとアンモニァ水 45 OmLの混合溶液に懸濁し、室温で攪拌した。 28時間攪拌後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥して表記化合物（20) のアンモ二ゥム塩 6 2. 0 gを無色粉末として得た。収率 8 1. 0 % (HP L C上、 ^体は検出されない。）

NMR (D₂O, 270 MHz) d 5.56 (s, 1 H)， 4.03 (m, 2 H), 3.52 (dd, J = 3.3,12.2 Hz, 1 H), 3.41 (dd, J = 5.3, 12.2 Hz, 1 H), 2.17 (m, 1 H) , 1.87 (d， J = 13.9 Hz, 1 H)、 MS (APCI) m/z 213 (M-H)

実施例 9

2 , 3, 5—O—トリス（4一クロ口べンゾィル）一 a— D—リポース — 1一リン酸（ 2 1 )

正リン酸 3. 3 2 gとメチルイソプチルケトン 6 7 m Lの混合物にトリ n—プチルァミン 2. 1 1 gとモルキユラ一シ一ブス 4 A 6. 6 gを加え、攪拌しながら 5 °Cに冷却した。さらに、 2， 3 , 5—〇一トリス（4一クロ口べンゾィル） — 一 D—リポシルクロリド 6. 6 6 gを加えて 1時間攪拌後、結晶が析出しはじめ、濃厚な懸濁液となつた。 1 0時間後、反応懸濁液中の表記化合物（ 1 9) の α体/ /3体比は 1 0 : 1であった。トリ η—プチルァミン 6. 3 3 gを加えて析出晶を溶解し、モルキユラーシ一ブスを濾去した後、濾液を水 5 5mL で洗浄した。有機層を氷冷し、シクロへキシルァミン 2. 4 gを加えて、攪拌晶析した。 1時間後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥し、表記化合物（2 1 ) のジシクロへキシルァミン塩 7. 0 2 gを無色粉末として得た。収率 7 3. 0 % (ひ体： /3体 = 9 9 : 1)

iH NMR (DMSO-de, 270 MHz) d 8.2-7.8 (m， 6 H), d 7.6-7.4 (m, 6 H), 5.9-5.7 (m, 1 H), 5.6-5.4 (m, 3 H), 4.6-4.3 (m, 1 H), 4.7-3.5 (br， 6 H), 2.7-2.6 (m, 2 H), 1.9-1.7 (m, 4 H), 1.7-1.6 (m, 4 H), 1.55-1.4 (m, 2 H), 1.3-0.9 (m， 10 H)、 MS (APCI) m/z 745 (M+C6H14N)₀

実施例 1 0

ひ一 D—リポース一 1一リン酸（22) の合成

実施例 9で得た化合物（ 2 1 ) をメタノール 1 0 5mLとアンモニァ水 2 lmLの混合溶液に懸濁し、室温で攪拌した。 32時間攪拌後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥して表記化合物（22) のアンモニゥム塩 1. 90 gを無色粉末として得た。収率 8 6. 0 % (HPL C上、 /3体は検出されない。）

NMR (D₂0, 270 MHz) d 5.6 (m, 1 H)， 4.2 (m, 1 H), 4.1-4.0 (m, 2 H)， 3.75 (m, 1 H)， 3.7 (m, 1 H)、 MS (APCI) m/z 229 (M-H)₀

実施例 1 1

5—〇一（4一クロ口べンゾィル）一 2， 3—ジデォキシーひ一D—リポ一ス一 1—リン酸（2 3)

正リン酸 3. 5 gとァセトニトリル 3 3 m Lの混合物にトリ n— ブチルァミン 2. 2 gとモルキユラーシ一ブス 4 A 3. 3 gを加え、攪拌しながら 5°Cに冷却した。さらに、 5—〇一（4一クロ口べンゾィル）一 2， 3—ジデォキシ— —D—リポシルクロリド 3. 2 8 g を加えて 1時間攪拌後、結晶が析出しはじめ、濃厚な懸濁液となった。 20時間後、反応懸濁液中の表記化合物（2 3)の Q!体 /]3体比は 1 0 ： 1であった。トリ n—プチルァミン 6. 5 gを加えて析出晶を溶解し、モルキユラ一シ一ブスを濾去した後、濾液をトルエン 7 0 m.Lで希釈し、水 5 5mLで洗浄した。有機層を氷冷し、シクロへキシルァミン 2. 5 gを加えて、攪拌晶析した。 1時間後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥し、表記化合物（2 3) のジシクロへキシルァミン塩 4. 5 6 g を無色粉末として得た。収率 7 1. 5 % (a体： /3体 = 9 7 ： 3)

!H NMR (DMSO-de, 270 MHz) d 8.2-7.8 (m, 2 H)， d 7.6-7.4 (m, 2 H), 5.9-5.7 (ni, 1 H), 5.6-5,4 (m, 1 H), 4.6-4.3 (m, 1 H), 4.7-3.5 (br, 6 H), 2.7-2.6 (m, 2 H), 1.9-1.7 (m, 8 H), 1.7-1.6 (m, 4 H), 1.55-1.4 (m, 2 H), 1.3-0.9 (m, 10 H)、 MS (APCI) m/z 374 (M+C6H14N)。

実施例 1 2

2, 3 _ジデォキシ— α— D—リポース一 1一リン酸（24) の合成実施例 1 1で得た化合物（2 3) をメタノール 46 mLとアンモニァ水 1 OmLの混合溶液に懸濁し、室温で攪拌した。 3 0時間攪拌後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥して表記化合物（24) のアンモニゥム塩 1. 6 8 gを無色粉末として得た。収率 8 5. 0 % (HP L C上、 ]3体は検出されない。）

NMR (D₂O, 270 MHz) d 5.2 (m, 1 H), 4.1-3.9 (m， 1 H), 3.6-3.3 (m, 2 H), 2.1-2.3 (m, 2 H), 1.9-1.7 (m, 2 H)、 MS (APCI) m/z 197 (M-H)。実施例 1 3

2， 3， 5— O—トリス（4一クロ口べンゾィル）一ひ一 D—ァラビノフラノシル一 1 _リン酸（2 5)

正リン酸 3. 3 gとメチルイソブチルケトン 6 7mLの混合物にトリ n—ブチルァミン '2. 1 gとモルキユラ一シーブス 4 A 6. 6 gを加え、攪拌しながら 5 °Cに冷却した。さらに、 2, 3 , 5 _〇一トリス（ 4—クロ口べンゾィル）一 a _ D—ァラビノフラノシルクロリド 6. 6 gを加えて 1時間攪拌後、結晶が析出しはじめ、濃厚な懸濁液となった。 8時間後、反応懸濁液中の表記化合物（2 5) の a体 Z/3 体比は 1 0 ： 1であった。トリ n—ブチルァミン 6. 3 gを加えて析出晶を溶解し、モルキユラ一シーブスを濾去した後、濾液を水 5 5m Lで洗浄した。有機層を氷冷し、シクロへキシルァミン 2. 4 gを加えて、攪拌晶析した。 1時間後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥し、表記化合物（2 5) のジシクロへキシルァミン塩 6. 72 gを無色粉末として得た。収率 7 0. 5 % ( 体： /3体 = 9 9 : 1)

MS (APCI) m/z 745 (M+C6H14N)。

実施例 1 4

α— D—ァラビノフラノシル _ 1一リン酸（2 6) の合成

実施例 1 3で得た化合物（2 5) をメタノール 94 mLとアンモニァ水 1 8mLの混合溶液に懸濁し、室温で攪拌した。 48時間攪拌後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥して表記化合物（26) のアンモニゥム塩 1. 72 gを無色粉末として得た。収率 8 2. 0 % (HP L C上、 0体は検出されない。）

iH NMR (D₂0, 270 MHz) d 5.3 (m, 1 H), 3.95-3.3 (m, 5 H)、 MS (APCI) m/z 229 (M-H)。

実施例 1 5

( 2 R) — 2—ベンジルォキシメチルー 1， 3—ジォキゾラン一 4ーリン酸（27) の合成

( 2 R) — 2—ベンジルォキシメチルー 4— (R, S) —ァセトキシ - 1 , 3—ジォキゾラン 1. 0 6 gのエーテル 1 2m 1溶液に、氷冷下、 4N塩酸—ジォキサン 4m 1を加え、 3. 5時間攪拌後、室温まで昇温した。溶媒を濃縮後、さらにトルエンにて共沸し、（2 R) — 2— ベンジルォキシメチルー 1， 3—ジォキソラエル— 4—クロリド 5 0 0 mgを無色透明の油状物として得た。ァセトニトリル 1. 1m lに、ォルトリン酸 0. 27 g、トリ n—プチルァミン 0. 66m l、モルキュラ一シ一ブス 4 A 0. 2 3 gを順次加え、 1. 5時間攪拌した。この懸濁液中に、氷冷下、先に得た油状物 0. 2 7 gを加え、氷冷下、 5. 5時間攪拌した。トリ n—プチルァミン 0. 6m lを加えて 3 0分攪拌 (口〇 5- -— l

)画½m #J77ヾVI$ v¾ 2 Cロク/；^

^ 7。¾口 if¾ァvdυ 7 n H . シルクロリド 7 Omgを加えて、同温で 1 日反応した。その後、トリ n —プチルァミン 1 5 6 L、続いて脱イオン水を加えて、トルエンで 3回抽出した。抽出した有機層にシクロへキシルァミン

48 /iLを加えて 3 0分間攪拌した後に、減圧下で濃縮し、アセトンを加えて析出物.を濾取した。得られた残査をクロ口ホルムで洗浄し、減圧下室温で乾燥した。表記化合物（2 9) のジシクロへキシルァミン塩を白色固体として得た。

Ή-NMR (CD₃OD) δ 1.1 - 1.4 (10H、 m) 、 1.65 (2H、 m) 、 1.89 (4H、 m) 、 1.96 (4H、 m) 、 2.3— 2.5 (2H、 m) 、 2.91 (2H、 m) 、 4.5 (2H> m) 、 4.6-4.8 (1H、 m) 、 5.1-5.3 (1H、 m) 、 5.97 (1H、 m) 、 7.41 (1H、 m) 、 7.47 (2H、 m) 、 7.68 (2H、 m) 、 7.75 (2H、 m) 、 8.08 (2H、 m) 、 MS (APCI) m/z 496 (M+C6H14N)+.

実施例 1 8

2， 3一ジデォキシ一 3—フルオローひ一 D—エリス口ベントフラノ一スー 1一リン酸（3 0) の合成

実施例 1 7で得た化合物（2 9) 2 lmgのメタノール lmL溶液にシクロへキシルァミン 2 0 Lを加え、 2週間反応した。その後、減圧下で濃縮し、ジェチルエーテルを加えた。これを濾過した後、減圧下で乾燥して、表記化合物のジシクロへキシルァミン塩 1 2mgを白色固体として得た。

iH-NMR (CD₃OD) δ 1.1 - 1.4 (10H、 m) 、 1.66 (2H、 m) 、 1.79 (4H、 m) 、 1.94 (4H、 m) 、 2.3— 2.4 (2H、 m) 、 2.88 (2H、 m) 、 3.59 (2H、 m) 、 4.3— 4.4 (1H、 m) 、 5.11 (0.5H、 m、もう一方の 0.5H 分は、水のピークに隠れて判別不能）、 5.89 (1H、 m) 、 MS (APCI) m/z 215 (M-H)-.

¾施例 1 9

2 , 3—ジデォキシー 3—フルオロー 5—O— (4—フエ二，

ル）一 D—エリス口ペントフラノース一 1—リン酸（3 1) の合成オルトリン酸 7 5 9 mg、トリ n—プチルァミン 646 L、ァセトニトリル 8. 6mLを室温で攪拌し、モルキュラシ一ブス 4A 0. 8 6 gを加えて氷浴下で攪拌した。これに 2, 3 _ジデォキシ— 3—フルオロー 5—〇一（4一フエニルベンゾィル）一 D—エリス口ペントフラノシルクロリド 864mgを加えて、同温で 1日反応した。その後、トリ n—プチルァミン 1. 94mL、続いて脱イオン水を加えて、トルェンで 3回抽出し、さらに純水で 5回洗浄した。有機層を分離して、シクロへキシルァミン 5 9 0 Lを加えて 3 0分間攪拌した。減圧下で濃縮し、これにアセトンを加えて攪拌した後に、濾取した。さらに、得られた残査をイソプロピルエーテルで洗浄し、減圧下室温で乾燥し、表記化合物（3 1) を白色固体として得た。 α体：；8体 = 6 6 : 34。 iH-NMR (CD₃OD) δ 1.1 - 1.4ppm (10H、 m) 、 1.66 (2H、 m) 、 1.78

(4H、 m) 、 1.98 (4H、 m) 、 2.3-2.6 (2H、 m) 、 2.89 (2H、 m) 、 4.44 & 4.46 (« & β、 2H)、、 4.6—4.8 (1H、 m) 、 5.1 _ 5.3 & 5.3-5.4 ( & /9、 1H、 m)、 5.97 & 6.00 & 3、 1Η、 m)、 7.40 (1H m) 、 7.47 (2H、 m) 、 7.68 (2H、 m) 、 7.75 (2H、 m) 、 8.07 (1H、 m) 、 8.13 (1H、 m) 。

実施例 2 0

2 , 3—ジデォキシ一 3—フルオロー D—エリス口ベントフラノ一スー

1—リン酸（3 2) の合成

実施例 1 9で得た化合物（ 3 1 ) 0. 2 9 gのメタノール 1 5mL溶液にシクロへキシルァミン 27 9 Z Lを加え、 1週間反応した。その後、減圧下で濃縮し、ジェチルエーテルを加えて攪拌した。これを濾過した後、減圧下で乾燥して、表記化合物（3 2) のジシクロへキシルァミン塩 1 8 5 mgを白色固体として得た。 α体： 3体 = 6 6 ： 34。

iH-NMR (CDaOD) δ 1.1 - 1.4ppm (續、 m) 、 1.67 (2H、 m) 、 1.79 (4H、 m) 、 2.2-2.4 (2H、 in) 、 2.94 (2H、 m) 、 3.59 & 3.62(a & β、 2H、 m)、 3.3-3.4 (2H m)、 5.10 & 5.1-5.24( α & β、 0.5H & 1H、 m、ひの 0.5 H分は水に隠れて判別不能）、 5.88 & 5.93 (0； & j8、 1H、 m)。実施例 2 1

3, 5— O—ジベンゾィル _ 2— 0—メチルリポース一 1—リン酸（ 3 3 ) の合成

1， 3， 5— O—トリベンゾィル— 2—0—メチルーひ — D—リボース 2. 8 4 gに 4N塩酸—ジォキサン 1 4. 5 mLを加えて氷冷下攪拌した。 2. 5時間後、 4 N塩酸—ジォキサン 1 OmLを加え、さらに 1 時間攪拌した。溶媒を留去した後、ジォキサン 1 OmLで 2回共沸濃縮し、 3， 5— O—ジベンゾィル一 2—〇ーメチルリポシル一 1一クロリドを得た。 9 8 %リン酸 2. 9 8 gを 4—メチル _ 2—ペンタノン 1 5 mLに溶解し、モルキユラ一シ一ブス 4 A 2. 8 gを加えて 3 0分攪拌した。トリ n—プチルァミン 1. 42 mLを加え、次いで先に得た 3， 5—O—ジベンゾィル _ 2—0—メチルリポシルー 1—クロリドを 4一メチル— 2—ペン夕ノン 1 OmLに溶解した溶液を加えた。室温で 2 0 時間反応させ、トリ n _プチルァミン 7 . lmLで中和した。モルキュラ一シ一ブスを濾去し、濾液を水 2 OmLで 3回洗浄した。有機層を溶媒留去し、シリカゲルカラムにより精製し、表記化合物（ 3 3 ) 9 5 0 m を得た。

MS (APCI) m/z 451(M-H) -、 IR(KBr) cm-¹3448, 2963, 1721, 1453, 1278, 1111, 976, 711, 558.₀

実施例 2 2

2—〇—メチルリボ一ス一 1一 ]3—リン酸（3 4) の合成

実施例 2 1で得た化合物（3 3) 8 5 0mgに 1 4 %アンモニア—メタノ一ル 2 OmLを加え、室温で 2 0時間反応させた。溶媒を留去し、ジィソプロピルエーテルでスラッジした後、結晶性の粉末を濾過した。この粉末をメタノールに溶解し、シクロへキシルァミンを加えて攪拌した。メタノールを留去し、残渣にジイソプロピルエーテルを加えてスラッジした。結晶性の粉末を濾過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄した。目的物を水により抽出し、 4—メチルー 2—ペンタノンにより 2回洗浄した。水層を濃縮し、ジイソプロピルエーテルでスラッジした。結晶を濾取、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、表記化合物（34) のジシク口へキシルァミン塩 1 2 Omgを得た。

iH-NMR ( D₂O ) d 3.37(s,3H), 3.49(dd,lH,J=4.9Hz,12.7Hz), 3.62(d,lH,J=4.9Hz), 3.69(dd,lH,J=2.7Hz,12.7Hz), 3.74-3.78(m,lH), 4.28(dd,lH,J=4.6Hz,7.8Hz), 5.39(d,lH,J=5.9Hz) > MS (APCI) m/z 243(M-H) -。

実施例 2 3

3， 5—〇一ビス（4—クロ口べンゾィル）一 2—デォキシ一 α—D— リポース— 1 _リン酸（ 1 8 a) の合成

正リン酸 6. 9 2 gとァセトニトリル 8 0mLの混合物にトリ n—ブチルァミン 5. 5 1 mLとモルキユラ一シーブス 4 A 1 0 gを加え、室温で 5時間攪拌した後、ー晚静置した。一 7 °Cに冷却した後、 3， 5 —〇一ビス（4一クロ口べンゾィル） _ 2—デォキシ一ひ一D—リポシルクロリド（純度 8 5 %) 1 0 gを加えて 9時間攪拌し、一 1 5°C でー晚静置した。トリ n—プチルァミン 1 6. 5mLを加えた後、モルキユラ一シ一ブスを濾去した。濾液を濃縮し、残さを 4一メチル— 2 —ペンタノンに溶解し、水で洗浄した。有機層を氷冷し、シクロへキシルァミン 5. 6 6mLを加えて、攙拌晶祈した。 1. 5時間後、析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥し、表記化合物（1 8 a) のジシクロへキシルアミン塩 1 3. 5 gを無色粉末として得た。（ひ体： /3体 = 9 8. 8 : 1. 2) 。

実施例 24

2—デォキシ—ひ一 D—リポ一ス— 1一リン酸（2 0) の合成

実施例 2 3で得た化合物 7. 0 5 gのメタノール溶液に、シクロへキシルァミン 2. 9 2mLを加え、室温で攪拌した。 7 2時間攪拌後、濃縮し、エタノールを加えて懸濁攪拌した。析出晶を濾取し、室温で減圧乾燥して表記化合物（2 0) のジシクロへキシルァミン塩 3. 8 7 gを無色粉末として得た。（NMR上、）3体は検出されない。）

NMR (D₂0) d 5.57 (dd, J = 5.1, 6.1 Hz, 1 H), 4.03 (m, 2 H), 3.54 (ddd, J = 1.2, 2.2, 12.2 Hz, 1 H), 3.42 (ddd, J = 1.2, 5.1, 12.2 Hz, 1 H), 3.18-2.94 (m， 2 H), 2.17 (m, 1 H), 1.90 (d, J = 1.2, 12.8 Hz, 1 H), 1.8- 1.45(m, 10 H), 1.25-0.9 (m, 12 H)

Anal. Calcd. for C₅Hg0₇P · Ci₂H2₈N₂₎C: 49.50 %; H: 9.04 %; N: 6.79 %; P: 7.51 %,

Found C: 49.26 %; H: 8.81 %; N: 6.64 %; P: 7.29 %.。

実施例 2 5

2'—デォキシアデノシンの合成 ( 1) · ェシェリヒア ' コリ K— 1 2 /XL - 1 0株（S t r a t a g e n e 社）を 5 0m 1の L B培地に接種し、 3 7 °Cで一夜培養した後集菌し、リゾチーム 1 mgZm 1 を含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフエノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿により DNAを沈殿させた。生じた DNAの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、大腸菌染色体 DN Aを調製した。

P C R用のプライマ一には、ェシエリヒア . コリの既知の d e 0 D遺伝子の塩基配列（GenBank accession No. AE000508 (コード領域は塩基番号 11531-12250) に基づいて設計した配列番号： 1及び 2に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。これらのプライマ一の 5 ' 末端付近及び 3 ' 末端付近には、それぞれ E c o R I及び H i n d III の制限酵素認識配列を有する。

配列番号： 1 ； GTGAATTCAC AAAAAGGATA AAACAATGGC 配列番号： 2 ； TCGAAGCTTG CGAAACACAA TTACTCTTT

制限酵素 H i n d i I Iで完全に消化した前記大腸菌染色体 D N A 6 n g/ 1及びプライマー各 3 Mを含む0. lm 1の P CR反応液を用いて、変性： 9 6°C、 1分、アニーリング： 5 5t、 1分、伸長反応： 7 4°C、 1分からなる反応サイクルを、 3 0サイクルの条件で P CRを行なった。

上記反応産物及びプラスミド p UC 1 8 (宝酒造（株））を、 E c o R I及び H i n d III消化し、ライゲーシヨン ·ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、ェシエリヒァ ·コリ DH 5 ひを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Am) 5 011 g/m 1及び X— G a 1 ( 5—ブロモ— 4一クロ口— 3—インドリル一 /3—D—ガラクトシド）を含む L B寒天培地で培養し、 Am耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的の DN A断片が挿入されたプラスミドを、 pUC— PNP 7 3と命名した。こうして得られた形質転換体を、ェシェリヒア · コリ MT— 1 0 9 0 5と名づけた。

ェシエリヒア'コリ MT— 1 0 9 0 5株を八1115 0 g/m 1を含む L B培地 l O OmLで 3 7 ' 1晚振とう培養した。得られた培養液を 1 3 0 0 0 r pmで 1 0 m i n遠心分離し、菌体を集めた。菌体を 1 0 mMトリス塩酸緩衝液（pH 8. 0) 1 OmLに懸濁し、超音波により破砕したものを酵素源として用いた。

実施例 8で得られた 2. 5mMの 2—デォキシーひ一 D—リポース一 1一リン酸ジアンモニゥム塩、 2. 5 mMのアデニン（和光純薬製、特級）、上記のように調整した 0. 1 m 1のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破碎酵素液、 1 0mMトリス塩酸緩衝液（pH 7. 4) に種々の濃度の塩化カルシウム（和光純薬、特級）を添加した反応液 l m lを 3 0°C、 24時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。

反応終了液を以下に示す HP L C分析にて分析した結果、和光純薬製の 2'—デォキシアデノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、すべての反応終了液中に確認された。

HP L C分析条件カラム； YMC— P a c k OD S -A 3 1 2 1 5 0 X 6. 0 m m l . D.

カラム温度； 40 °C

ポンプ流速； 0. 7 5m l / i n

検出； UV 2 6 0 nm、

溶離液； 1 0 mMリン酸：ァセトニトリル = 9 5 ： 5 (V/V) また、反応終了液の 2 '—デォキシアデノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算した結果を表— 1に示した。

実施例 2 6

2 ' ーデォキシアデノシンの合成 (2.)

塩化カルシウムの代わりに塩化アルミニウムを添加する以外はすべて実施例 2 5と同じ手順と条件で反応を行った。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例 2 5と同じ HP L C分析にて分祈した結果、和光純薬製の 2'—デォキシアデノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、すべての反応終了液中に確認された。また、反応終了液の 2 'ーデォキシアデノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算した結果を表— 2に示した。表一 2

実施例 2 7

2 ' —デォキシアデノシンの合成（3)

塩化カルシウムの代わりに 1 0 mMの塩化バリゥムを添加する以外はすべて実施例 2 5と同じ手順と条件で反応を行った。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例 2 5と同じ HP L C分析にて分析した結果、和光純薬製の 2'—デォキシアデノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液の 2 ' —デォキシアデノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算した結果、反応転化率は 9 2. 4 %であった。

実施例 2 8

チミジンの合成

実施例 8で調製した 2. 5mMの 2—デォキシ— a— D—リポース— 1一リン酸ジアンモニゥム塩、 2. 5mMのチミン（和光純薬製、特級）、 1 2 u n i t s / 1のチミジンホスホリラ一ゼ（S I GMA製）、 OmMまたは 1 OmMの硝酸カルシウム（和光純薬、特級）、 1 0mM トリス塩酸緩衝液（pH 7. 4) から成る反応液 lm 1を 3 0°C、 2 4 時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例 2 5と同じ HP L C分析にて分析した結果、和光純薬製のチミジン（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液のチミジンの濃度を定量し、反応転化率を計算した結果を表— 3に示した。表一 3

実施例 2 9

2'—デォキシアデノシンの合成（4)

実施例 8で調製した 1 0 0 mMの 2—デォキシ— a— D—リポース― 1一リン酸ジアンモニゥム塩、 1 0 OmMのアデニン（和光純薬製、特級）、実施例 2 5で調製した 0. 1 m 1のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液、 0〜 1 5 0 mMの塩化カルシウム (和光純薬、特級）、 1 0 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 8. 0) から成る反応液 lm lを 5 0 、 24時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例 2 5と同じ HPL C分析にて分析した結果、和光純薬製の 2—デォキシアデノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液の 2 'ーデォキシアデノシンの濃度を定量した結果を表一 4に示した。表一 4

実施例 3 0

2 ' ーデォキシグアノ成実施例 8で調製した 1 0 0 mMの 2—デォキシ—ひ— D—リポース一 1一リン酸ジアンモニゥム塩、 1 0 0 mMのグァニン（和光純薬製、特級）、実施例 2 5で調製した 0. 1 m 1のプリンヌクレオシドホスホリラ一ゼ生産菌の超音波破砕酵素液、 OmMまたは 1 5 OmMの塩化力ルシゥム（和光純薬、特級）、 1 0 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 8. 0) から成る反応液 lm 1を 5 0°C、 24時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例 2 5と同じ HP L C 分析にて分析した結果、和光純薬製の 2—デォキシグアノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液の 2 'ーデォキシグアノシンの濃度を定量した結果を表— 5 に示した。表一 o

実施例 3 1

アデノシンの合成

実施例 1 0で調製した 1 0 0 mMのひ一 D—リポース— 1ーリン酸ジアンモニゥム塩、 1 0 OmMのアデニン (和光純薬製、特級）、実施例 2 5で調製した 0. lm 1のプリンヌクレオシドホスホリラ一ゼ生産菌の超音波破砕酵素液、 OmMまたは 1 5 OmMの塩化カルシウム（和光純薬、特級）、 1 0 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 8. 0) から成る反応液 l m l を 5 0°C、 24時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例 2 5と同じ HP L C分析にて分祈した結果、和光純薬製のアデノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液のアデノシンの濃度を定量した結果を表一 6に示した, 表一 6

実施例 3 2

2，， 3 ' - 実施例 1 2で調製した 1 0 OmMの 2， 3—ジデォキシ一 α— D—リポース一 1一リン酸ジアンモニゥム塩、 1 0 0 mMのアデニン（和光純薬製、特級）、実施例 2 5で調製した 0. 1 m 1のプリンヌクレオシドホスホリラ一ゼ生産菌の超音波破砕酵素液、 OmMまたは 1 5 OmM の塩化カルシウム（和光純薬、特級）、 1 0 OmMトリス塩酸緩衝液（p H 8. 0 ) から成る反応液 1 m 1を 5 0 °C、 2 4時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例 2 5と同じ HP L C分析にて分析した結果、シグマ社製の 2 ' ， 3 ' ージデォキシアデノシン（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液の 2 ' , 3 ' ージデォキシアデノシンの濃度を定量した結果を表一 7に示した。表一 7

実施例 3 3

アデニン一 9 iS— D—ァラビノシドの合成実施例 1 4で調製した 1 0 OmMの α— D—ァラビノフラノシルー 1 一 Uン酸

ジアン乇ニゥム塩、 1 0 OmMのアデニン（和光純薬製、特級）、実施例 2' 5で調製した 0. 1m lのプリンヌクレオシドホスホリラ一ゼ生産菌の超音波破碎酵素液、 OmMまたは 1 5 OmMの塩化カルシウム（和光純薬、特級）、 1 0 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 8. 0) から成る反応液 1m l を 5 0°C、 24時間反応させた。反応終了後、白色の沈殿物が生成していた。反応終了液を実施例 2 5と同じ HP L C分析にて分祈した結果、シグマ社製のアデニンァラビノシド（特級）のピークと完全に一致するピークが、反応終了液中に確認された。また、反応終了液のアデニン一 9一 ]3— D—ァラビノシドの濃度を定量した結果を表一 8 に示した。表一 8

実施例 34

2—アミノー 6—クロ口プリン一 2 '—デォキシ一 j3— D—リポシドの合成

実施例 8で得られた 1 0 mMの 2—デォキシー α— D—リポ一ス— 1 —リン酸ジアンモニゥム塩、 1 OmMの 2—ァミノ— 6—クロ口プリン（東京化成）、 1 0 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 7. 5) に、実施例 2 5で調整した 5 0 n 1のプリンヌクレオシドホスホリラ一ゼ生産菌の超音波破碎酵素液を添加した反応液 lm 1 を 5 0で、 4時間反応させた。反応終了液を以下に示す HP L C分析にて分析した結果、 2—アミノー 6—クロ口プリン一 2 '—デォキシ一 3— D—リポシドのピークが確認された。また、反応終了液の 2—ァミノ— 6—クロ口プリン— 2 ' ーデォキシー β 一 D—リポシドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 2 0. 9 %であった。

HP L C分析条件

カラム； D e V e 1 0 s i 1 OD S— MG— 5 2 50 X 4. 6 mm I . D .

カラム温度； 40°C

ポンプ流速； 1. Om l Zm i n

検出； UV 2 54 nm、

溶離液； 2 5mMリン酸ニ水素一力リウム：メタノール = 8 7 5 : 1 2 5 (V/V)

実施例 3 5

2， 6—ジァミノプリン一 2 '—デォキシ一 i3— D—リポシドの合成

2—ァミノ一 6—クロ口プリンの代わりに 2 , 6—ジァミノプリン（東京化成）を添加する以外はすべて実施例 34と同じ手順と条件で反応を行った。反応終了液を実施例 34と同じ HPL C分析にて分析した結果、 2， 6—ジァミノプリン一 2 '—デォキシ一 jS— D—リポシドのピークが確認された。また、反応終了液の 2, 6—ジァミノプリン一 2'—デォキシ一 — D—リポシドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 7 5. 5 %であった。

実施例 3 6

6—メルカプトプリン— 2 '—デォキシ— /3— D—リポシドの合成

2—アミノー 6—クロ口プリンの代わりに 6—メルカプトプリン（ K OU J I N) を添加する以外はすべて実施例 34と同じ手順と条件で反応を行った。反応終了液を実施例 34と同じ HP L C分析にて分析した結果、 6—メルカプトプリンー 2'—デォキシ— ]3— D—リポシドのピークが確認された。また、反応終了液の 6—メルカプトプリン一 2'—デォキシー i3— D—リポシドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 5 7. 2 %であった。

実施例 37

2—ァミノ— 6—ョ一ドプリン— 2 '—デォキシ一 /3— D—リポシドの合成

2—ァミノ _ 6—クロ口プリンの代わりに 2—アミノー 6—ョ一ドプリンを添加する以外はすべて実施例 34と同じ手順と条件で反応を行つた。反応終了液を実施例 34と同じ HP L C分析にて分析した結果、 2 —アミノー 6—ョ一ドプリン— 2'—デォキシー /3—D—リポシドのピ —クが確認された。また、反応終了液の 2—アミノー 6—ョ一ドブリン - 2 '一デォキシー /3— D—リポシドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 6 9. 2 %であった。

実施例 38

2一ァセチルアミノー 6—ヒドロキシプリン一 2 '—デォキシ一；3— D —リポシドの合成

2—ァミノ一 6—クロ口プリンの代わりに 2—ァセチルァミノ一 6 _ ヒドロキシプリン（東京化成）を添加する以外はすべて実施例 34と同じ手順と条件で反応を行った。反応終了液を以下に示す HP L C分析にて分析した結果、 2—ァセチルァミノ一 6—ヒドロキシプリン一 2.'—デォキシ一 0— D—リポシドのピークが確認された。また、反応終了液の 2—ァセチルアミノ— 6—ヒドロキシプリン一 2'—デォキシ— i3— D ーリポシドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 48. 7 % であった。

HP L C分析条件

カラム； D e V e 1 0 s i 1 OD S— MG— 5 2 50 X 4. 6 mm I . D .

カラム温度； 40 °C

ポンプ流速； 1. 0 m 1 Zm i n 検出； UV 2 54 nm、

溶離液； 2 5mMリン酸ニ水素一力リウム：メタノール = 7 5 : 2 5 (V/V)

実施例 3 9

2—ァミノ一 6—シクロプロピルアミノプリン一 2 '—デォキシ一 β 一 D—リポシドの合成

2—ァミノ一 6—クロ口プリンの代わりに 2—ァミノ一 6—シクロプ口ピルアミノプリンを添加する以外はすべて実施例 3 4と同じ手順と条件で反応を行った。反応終了液を実施例 3 8と同じ HP L C分析にて分祈した結果、 2 _アミノー 6—シクロプロピルアミノプリンー 2'—デォキシー）3— D—リポシドのピークが確認された。また、反応終了液の 2 一アミノー 6—シクロプロピルアミノプリン一 2 '—デォキシ一 β — D ーリポシドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 8 7. 6 % であった。

実施例 40

2 ' , 3 ' —ジデォキシ— 3 ' —フルォロ一D—グアノシンの合成実施例 1 8で得られた 7. OmMの 2 , 3—ジデォキシー 3 _フルォ口一 D—エリス口ベントフラノ一スー 1ーリン酸、 1 OmMのグァニン (東京化成）、 1 0 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 7. 5) に、実施例 2 5のように調整した 0. 1m lのプリンヌクレオシドホスホリラ一ゼ生産菌の超音波破砕酵素液を添加した反応液 l m 1を 5 0° ( 、 1 1 4時間反応させた。反応終了液を実施例 34と同じ HP L C分析にて分析した結果、 2 ' ， 3 ' —ジデォキシ一 3， —フルオロー D—グアノシンのピークが確認された。また、反応終了液の 2 ' , 3 ' 一ジデォキシ— 3， —フルオロー D—グアノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 4 7. 7 %であった。

実施例 4 1

2，， 3，ージデォキシ _ 3，一フルォロ— D—グアノシンの合成実施例 1 8で得られた 7. OmMの 2, 3—ジデォキシ _ 3 _フルォ口一 D—エリス口ベントフラノ一ス一 1—リン酸、 1 OmMのグァニン (東京化成）、 1 0 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 7. 5) に、実施例 2 5のように調整した 0. lm 1のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液を添加した反応液 lm 1を 5 0°C、 47時間反応させた後、終濃度 2 0 mMの塩化カルシウムを添加してさらに 5 0°C、 6 7時間反応させた。反応終了液を実施例 34と同じ HPL C分析にて分析した結果、 2 ' ， 3 ' —ジデォキシ一 3，一フルオロー D— グアノシンのピークが確認された。また、反応終了液の 2 ' , 3 ' —ジデォキシ— 3 ' —フルオロー D—グアノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 84. 4%であった。

実施例 42

6—クロロー 9— (j3— D—リポフラノ一スー 1一ィル）プリンの合成 1 OmMの 6—クロ口プリン（A l d r i c h) 、実施例 1 0で得た 5 OmMの D—リポース— 1—リン酸 (22) 、実施例 2 5で得た 0. 1 m 1のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破碎酵素液、 1 0 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 7. 5) からなる反応液 lm 1を 5 0°C、 2 0時間反応させた。反応終了後、反応液を以下に示す HP L C 分析にて分析した結果、表題化合物のピークが確認された。また、反応終了液の 6—クロロー 9— (i3—D—リポフラノース— 1一ィル）プリンの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 6 2. 4%であった。

HPL C分析条件

カラム： D e V e 1 o s i 1 OD S -MG- 5 2 5 0 X 4. 6 mm I . D.

カラム温度： 40°C

ポンプ流速： 1. Om l Zm i n ■ 検出： UV 2 54 nm

溶離液： 2 5mMリン酸ニ水素一力リゥム：メタノール = 7 5 : 2 5 実施例 43

1— (2—デォキシー jS— D_リボフラノース一 1—ィル）一 1 H— イミダゾ [4, 5 - b] ピリジンおよび 3— （2—デォキシ _ 3—D— リボフラノース一 1一ィル）一 1 H—イミダゾ [4, 5 - b] ピリジンの合成

実施例 8で得た 1 0 mMの 2—デォキシー a _D—リポ一ス _ 1ーリン酸アンモニゥム塩、 1 0 mMの 4—ァザベンスイミダゾ一ル（A i d r i c h) , 1 0 0 mMトリス塩酸緩衝液（p H 7. 5 ) に、実施例 2 5で調製した 5 011 1のプリンヌクレオシドホスホリラ一ゼ生産菌の超音波破枠酵素液を添加した反応液 lm 1を 5 0°C、 1 7時間反応させた。反応終了液を以下に示す HP L C分析にて分析した結果、表題化合物のピークが 2本観察された。また、反応終了液の生成物の濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 3 %および 7. 2 %であった。

HP L C分析分析

•カラム： D e V e 1 o s i 1 OD S—MG— 5 2 5 0 X 4. 6 m m I . D.

•カラム温度： 40 °C

•ポンプ流速： 1. 0m l Zm i n

•検出： U V 2 54 nm

•溶離液： 2 5mMリン酸ニ水素一力リゥム：メタノール- 5 0 : 5 0

L C一 MS 分析データ： MS (AP C I ) m/ z 2 3 6 (MH) + 実施例 44

8—ァザ— 2 ' —デォキシアデノシンの合成

4ーァザべンズィミダゾ一ルの代わりに 8—ァザアデニン（A 1 d r i c h) を用いて、実施例 43と同様の条件で反応を行った。反応終了液を以下に示す HP L C分析にて分析した結果、 8—ァザー 2 ' —デォキシアデノシンのピークが確認された。また、反応終了液の 8—ァザー 2 ' —デォキシアデノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 4. 8 %であった。

HP L C分析分析

•カラム： D e V e 1 o s i 1 OD S— MG— 5 2 5 0 X 4. 6 m m l . D.

•カラム温度： 40°C

•ポンプ流速： 1. 0 m 1 Zm i n

•検出： UV 2 54 nm

•溶離液： 2 5mMリン酸ニ水素一力リゥム：メタノ一ル= 8 7 5 : 1

2 5 (V/V)

L C-MS 分析データ： MS (AP C I ) m/ z 2 5 3 (MH) + 実施例 45

8—ァザ— 2， —デォキシグアノシンの合成

4ーァザべンズィミダゾールの代わりに 8—ァザグァニン（東京化成）を用いて、実施例 43と同様の条件で反応を行った。反応終了液を実施例 44と同じ HP LC分析にて分析した結果、 8—ァザ— 2 ' —デォキシグアノシンのピークが確認された。また、反応終了液の 8—ァザ— 2 ' ーデォキシグアノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、

3 6. 1 %であった。

実施例 46

2—クロ口一 2 ' —デォキシアデノシン（クラドリビン）の合成

4ーァザべンズィミダゾールの代わりに 2—クロロー 4ーァミノプリンを用いて、実施例 43と同様の条件で反応を行った。反応終了液を以下に示す HP L C分析にて分析した結果、表題化合物のピークが確認された。また、反応終了液の 2—クロロー 2 ' —デォキシアデノシンの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 9 6 %であった。

HP L C分析分析 •カラム： D e v e 1 o s i 1 OD S— MG— 5 2 5 0 X 4. 6 m m I . D.

•カラム温度： 4 0 °C

•ポンプ流速： 1. 0 m 1 / i n

•検出： UV 2 54 nm

•溶離液： 2 5 mMリン酸ニ水素一力リウム：メタノール = 8 7 5 : 1 2 5 (V/V)

実施例 4 7

1一（)S _D—リポフラノ一スー 1一ィル）一 1， 3， 4一トリァゾ一ルー 3—カルボキジアミド（リバビリン）の合成

4—ァザべンズイミダゾールの代わりに、 1， 2, 4 _トシァゾ一ル一 3一力ルポキシアミドを用いて、実施例 4 3と同様の条件で反応を行つた。反応終了液を以下に示す HP L C分析にて分析した結果、表題化合物のピークが確認された。また、反応終了液の 1— (^一 D—リボフラノース一 1一ィル）一 1 , 3 , 4一卜リアゾ一ルー 3—力ルポキジァミドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 6 9 %であった。 HP L C分析分析

•カラム： D e V e 1 o s i 1 OD S— MG— 5 2 5 0 X 4. 6 m m l . D .

•カラム温度： 4 0°C

•ポンプ流速： 1. 0 m 1 /m i n

•検出： UV 2 1 0 nm

•溶離液 2 5mMリン酸ニ水素一力リウム

実施例 48

1一（3— D—リボフラノース一 1 _ィル）一 5—ァミノイミダゾ一ルー 4一力ルポキサミド（ァカデシン）の合成

4ーァザべンズィミダゾールの代わりに 5—ァミノイミダゾール— 4 一力ルポキサミドを用いて、実施例 4 3と同様の条件で反応を行った。反応終了液を以下に示す HP L C分析にて分析した結果、表題化合物のピークが確認された。また、反応終了液の 1— (i3— D—リボフラノース一 1—ィル） — 5—ァミノイミダゾールー 4一力ルポキサミドの濃度を定量し、反応転化率を計算したところ、 46 %であった。

HP L C分析分析

•カラム： D e V e 1 o s i 1 OD S—MG— 5 2 5 0 X 4. 6 m m l . D.

•カラム温度： 4 0°C

•ポンプ流速： 1. 0m l /m. i n

•検出： U V 2 54 nm

•溶離液： 2 5mMリン酸ニ水素一力リゥム：メタノール = 9 3 ： 7 (V /V)

実施例 4 9

2 ' ーデォキシグアノシンの合成

2 0 gの純水に、実施例 24で得た 3. 2 2 g ( 7. 7 2 mm o 1 ) の 2—デォキシリポース 1一リン酸ジ（モノシクロへキシルアンモニゥム）塩、 1. l l g (7. 34mmo 1 ) のグァニンと 0 · 6 7 g ( 1 1. 4 Smmo 1 ) の水酸化マグネシウムを加えた。得られた反応生成物の p Hを 2 0 %水酸化ナトリウム水溶液にて 9に調整後、 0. 1 m l の前述の酵素液（0. 1m l ) を加え、 5 0°C、 8時間攪拌下で反応させた。 8時間後の反応生成物を HP L Cで分析したところ、所望の 2 ' ーデォキシグアノシンを反応収率 9 9 %で得た。

実施例 5 0

2，ーデォキシアデノシンの合成

2 0 gの純水に、実施例 2 4で得た 3. 2 2 g ( 7. 7 2mmo 1 ) の 2—デォキシリポース 1一リン酸ジ（モノシクロへキシルアンモニゥム）塩、 1. O l g (7. 4 7 mmo 1 ) アデニンと 0. 6 7 g ( 1 1. 48 mm o 1 ) の水酸化マグネシウムを加えた。得られた反応生成物の pHを 2 0 %水酸化ナトリウム水溶液にて 8. 6に調整後、 0. 1m l の前述の酵素液（0. 1 m l ) を加え、 5 0°C、 3時間攪拌下で反応させた。 3時間後の反応生成物を HP L Cで分析したところ、所望の 2 ' —デォキシアデノシンを反応収率 9 9 %で得た。産業上の利用可能性

本発明は、ァノマ一選択的な 1一リン酸化糖誘導体ならびにヌクレオシドの製造法として有用性が高く、広範な利用が期待される。

Claims

請求の範囲

1. 1ーリン酸化糖誘導体のァノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する 1—リン酸化糖誘導体モノマーの a体または ]3体の一方を選択的に晶析することによりァノマ一混合物間の平衡を傾け、 1一リン酸化糖誘導体モノマーの体または 3体の一方を選択的に製造する方法。

2. 下記式（ 1 )

(1)

〔式中、 1 1ぉょび11²は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、保護されたヒドロキシメチル基または保護されたカルボキシル基を表し、 R 3 はァシル基を表し、 R ⁴は水酸基の保護基を表し、 Xはハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基を表し、 Wは酸素原子またはィォゥ原子を表し、 Zは酸素原子、ィォゥ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、 mは 1から 3の整数を表し、 nは 0または 1を表し、 pおよび Qは 0から 4の整数を表し、 rは 0または 1を表す。（ただし、 p、 q_、 r、 nは、 Zが酸素原子、ィォゥ原子の場合には、 p + r≤n + l、 q≤ 2 X (n + 1 ) - 2 X (p + r ) を、 Zが炭素原子の場合は p + r ≤ n + 2、 q≤ 2 X (n + 2 ) - 2 X ( p + r ) を満たす。）〕で示される 1ーリン酸化糖誘導体のァノマー混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する 1一リン酸化糖誘導体モノマーのひ体または j3体の一方を選択的に晶析することによりァノマー混合物間の平衡を傾け、 1—リン酸化糖誘導体モノマーの a体または i3体の一方を選択的に製造する方法。

3 . 下記式（ 1 )

(1)

(式中、 R i、 R 2、 R 3、 R ₄、 x、 w、 Z、 m、 n、 p、 q、 rは請求項 2と同義である。）で示される 1 一リン酸化糖誘導体のァノマ一混合物を加リン酸分解および異性化し、生成する 1 一リン酸化糖誘導体モノマー《体または /3体の一方を選択的に晶析することによりァノマー混合物間の平衡を傾け、 1ーリン酸化糖誘導体モノマーの α体または i8体の一方を選択的に製造し、ついで R ⁴で表される保護基の脱離反応を行つて、下記式（3 )

R¹ R2

ι

(3)

(式中、尺 1ぉょび ²は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒド口キシメチル基または力ルポキシル基を表し、 R 3は水素原子またはァシル基を表し、 X、 W、 Z、 n、 t)、 d、 rは前記と同義である。）で示される 1ーリン酸化糖誘導体モノマーを製造する方法 _;

4. 下記式（4)

(4)

(式中、 1ぉょび1 ²は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、置換されたベンゾィル基で保護されたヒドロキシメチル基、または保護された力ルポキシル基を表し、 R ⁴は水素原子または水酸基の保護基を表し、 R 3、 χ、 w、 Z、 m、 R 3、 p、 Q、 rは、請求項 2と同義である。）で示される 1—リン酸化糖誘導体のトリマ一、ダイマーもしくはモノマ、またはそれらの塩。

5. 下記式（5)

R¹ R2

W 0P0₃H₂

(R^O)p 一（NHR3)_r

Xq

(5)

〔式中、 pおよび Qは 0から 3の整数を表し、 rは 0または 1を表し、 R i、 R 2、 R 3、 R 4、 χ、 w、 Zは、請求項 2と同義である。（ただし. p、 q、 rは、 Zが酸素原子、ィォゥ原子の場合には、 p+ r≤ l、 α ≤ 2 - 2 X (p + r ) を、 Zが炭素原子の場合は p + r≤ 2、 q≤ 4 - 2 X (p + r ) を満たす。）：],で示される 1一リン酸化糖誘導体モノマ一またはその塩。

6. 下記式（6 )

(6)

(式中、尺 1ぉょび1^ ²は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基、または力ルポキシル基を表し、 R ³、 X、 W、 Z、 n、 p、 d、 rは、請求項 2と同義である。）で示される 1一リン酸化糖誘導体モノマーまたはその塩（但し、天然に存在するものを除く）。

7. 前記式（6 ) において、 n = 1である請求項 6記載の 1一リン酸化糖誘導体モノマーまたはその塩。

8. R 1がヒドロキシメチル基、 R 2が水素原子、 pおよび rが 0、 X がフッ素原子である請求項 7記載の 1一リン酸化糖誘導体モノマーまたはその塩。

9. 下記式（1 8 ) ：

(式中、 R 11は保護されたヒドロキシメチル基を表し、は水酸基の保護基を表す。）で示される化合物を、塩基の存在下にリン酸で処理して、下記式（1 9 ) ：

(式中、 R iiおよびは、前記と同義であり、 mは請求項 2と同義である。）で示される 1一リン酸化糖誘導体のァノマ一混合物とした後、加リン酸分解および異性化し、生成する α体を選択的に晶析させることによるァノマー混合物間の平衡を傾け、下記式（2 0) ：

(20)

1 0. 下記式（1 8) ：

R 11

(1 8)

(式中、 R 11は保護されたヒドロキシメチル基を表し、 R は水酸基の保護基を表す。）で示される化合物を、塩基の存在下にリン酸で処理して、下記式（ 1 9 ) :

(式中、 R aおよび R "は、前記と同義であり、 mは請求項 2と同義である。）で示される 1 一リン酸化糖誘導体のァノマー混合物とした後、加リン酸分解および異性化し、生成する体を選択的に晶析させることによるァノマー混合物間の平衡を傾け、 α体を選択的に製造し、ついで保護基の脱離を行って、 2—デォキシー α—： D—リポ一ス一 1 一リン酸を製造する方法。

1 1 . 請求項 3記載の 1 一リン酸化糖誘導体モノマーを製造する第一の工程と、該第一の工程で得られた 1 一リン酸化糖誘導体のリン酸基と塩基との交換反応をヌクレオシドホスホリラーゼにより行う第二の工程により、下記式（8 ) 1 R²

(8)

(式中、 Bは、独立してそれぞれピリミジン、プリン、ァザプリンおよびデァザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基；アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、ァリール基、ァリールォキシ基またはシァノ基によって置換されていてもよい。また、 R R ²、 R ³、 X、 W、 Z、 m、 n、 p、 Q、 rは請求 ( 項 3記載の式（3) と同義である。）で示されるヌクレオ

o

シドの製造方法。

1 2. ヌクレオシドホスホリラーゼを用いて、請求項 6記載の 1ーリン酸化糖誘導体モノマーのリン酸基と塩基との交換反応により、下記式 (8) .

R2

，'\4^

(H0)p (證 ³)1

n

Xq

(8)

(式中、 Bは請求項 1 1記載の式（8) と同義であり、 R i、 R 2、 R ₃、 R 4、 X、 W、 Z、 p、 d、 rは請求項 6記載の式（6) と同義である。）で示されるヌクレオシドの製造方法。

1 3. ヌクレオシドホスホリラーゼを用いて、請求項 7記載の 1—リン酸化糖誘導体モノマーのリン酸基と塩基との交換反応により、式（ 1 0)

R， R2 r

(式中、 Bは請求項 l I記載の式（8) と同義であり、 R i、 R 2、 R 3、 R 4、 X、 W、 Z.、 p、 QL、 rは請求項 7記載の式（7) と同義である。）で示されるヌクレオシドの製造方法。 '

14. R 1がヒドロキシメチル基、 R 2が水素原子、 pおよび rが 0、 Xがフッ素原子である請求項 1 3記載のヌクレオシドの製造方法。、

1 5. 請求項 1 4記載の 2—デォキシ—ひ一 D—リポース一 1ーリン酸を製造する第一の工程と、該第一の工程で得られた.1ーリン酸化糖誘導体のリン酸基と塩基との交換反応をヌクレオシドホスホリラーゼにより行う第二の工程による、下記式（2 1)

(21)

(式中、 Bは請求項 1 1の式（8) と同義である。）で示されるヌクレオシドの製造方法。

1 6. ヌクレオシドホスホリラ一ゼが、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 1) 、グアノシンホスホリラ一ゼ（E C 2. 4. 2. 1 5) 、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 2) 、ゥリジンホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 3) 、チミジンホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 4) 、デォキシゥリジンホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 2 3) からなる群から選択される 1種又は 2種以上の酵素であることを特徵とする請求項 1 1から請求項 1 5のいずれか一項に記載のヌクレオシドの製造方法。

1 7. ヌクレオシドホスホリラーゼ活性に代えて、プリンヌクレオシドホスホリラ一ゼ.（E C 2. 4. 2. 1) 、グアノシンホスホリラーゼ

(E C 2. 4. 2. 1 5) 、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（E C 2. 4. 2. 2) 、ゥリジンホスホリラーゼ（EC 2. 4. 2. 3) 、チミジンホスホリラーゼ（EC 2. 4. 2. 4) 、デォキシゥリジンホスホリラーゼ（EC 2. 4. 2. 23) からなる群から選択される 1種又は 2種以上のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物を用いることを特徴とする請求項 1 1から請求項 1 5記載のヌクレオシドの製造方法。

18. ヌクレオシドホスホリラ一ゼにより、 1一リン酸化糖誘導体モノマ一のリン酸基と塩基との交換反応を行う際に、リン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンを反応液中に存在させることを特徴とする請求項 1 1から請求項 15記載の製造方法。

19. リン酸と難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンがカルシゥムイオン、バリウムイオン、アルミニウムイオン及びマグネシウムィォンの中か選ばれる 1種類以上の金属カチオンである請求項 18記載の製造方法。

20. ヌクレオシドが天然ヌクレオシドである請求項 8記載のヌクレオシドの製造方法。

1. 下記式（1 1 )

R²

(11)

(式中、 B、 R i、 R 2、 R 3、 R 4、 x、 w、 Z、 p、 q rは請求項 1 1記載の式（8) と同義である。）で示される非天然型ヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルォロチミジン、リバビリン、ォロチジン、ゥラシルァラビノシド、アデニンァラビノシド、 2ーメチルーアデニンァラビノシド、 2—クロル一ヒポキサンチンァラビノシド、チォグァニンァラビノシド、 2， 6—ジァミノプリンァラビノシド、シトシンァラピノシド、グァニンァラピノシド、チミンァラビノシド、エノシ夕ビン、ジェムシ夕ビン、アジドチミジン、イドクスゥリジン、ジデォキシアデノシン、ジデォキシイノシン、ジデォキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデォキシシチジン、ソリブジン、 5—メチルゥリジン、ビラゾ一ル、チォイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、ァロプリノ一ルゥラシル、 5—フルォロウラシル、 2 ' —アミノウリジン、 2，一アミノアデノシン、 2，一アミノグァノシン、 2—クロル一 2 '—ァミノイノシン、 D M D C、 F M D Cは除く）。

2 2 . 下記式（ 1 2 )

(H0) p

(12)

(式中、 B、 R i、 R 2、 R 3、 R 4、 x、 w、 Z、 p、 q、 rは請求項 1 1記載の式（8 ) と同義である。）で示される非天然ヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルォロチミジン、リバビリン、ォロチジン、ゥラシルァラビノシド、アデニンァラピノシド、 2ーメチルーアデニンァラビノシド、 2—クロル一ヒポキサンチンァラビノシド、チォグァニンァラピノシド、 2， 6—ジァミノプリンァラピノシド、シ卜シンァラビノシド、グァニンァラビノシド、チミンァラビノシド、エノシタビン、ジェムシタビン、アジドチミジン、イドクスゥリジン、ジデォキシアデノシン、ジデォキシイノシン、ジデォキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデォキシシチジン、ソリブジン、 5—メチルゥリジン、ビラゾール、チォイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、ァロプリノ一ルゥラシル、 5—フルォロウシル、 2 ' —アミノウリジン、 2 ' —アミノアデノシン、 2 , —アミノグァノシン、 2—クロル一 2 —ァミノイノシン、 DMD C、 FMDC、は除く）。

2 3. 下記式（ 1 3) i

(13)

(式中、 B、 R i、 2, R 3、 R 4、 x、 w、 Z、 p、 d、 rは請求項 1 1記載の式（8) と同義である。）で示されるヌクレオシドまたはその塩（但し、トリフルォロチミジン、リバビリン、ォロチジン、ゥラシルァラビノシド、アデニンァラビノシド、 2—メチル一アデニンァラピノシド、 2—クロル一ヒポキサンチンァラビノシド、チォグァニンァラビノシド、 2， 6—ジァミノプリンァラビノシド、シトシンァラビノシド、グァニンァラビノシド、チミンァラビノシド、エノシタビン、ジェムシ夕ビン、アジドチミジン、イドクスゥリジン、ジデォキシアデノシン、ジデォキシイノシン、ジデォキシシチジン、ジデヒドロデオキシチミジン、チアジデォキシシチジン、ソリブジン、 5—メチルゥリジン、ビラゾール、チォイノシン、テガフール、ドキシフルリジン、ブレディニン、ネブラリン、ァロプリノールゥラシル、 5—フルォロウラシル、 2 ' — アミノウリジン、 2 ' —アミノアデノシン、 2 ' —ァミノグアノシン、 2—クロル一 2，ーァミノイノシン、 DMDC、 FMDCは除く）。

24. 下記式（2 0) :

.(20)

(式中、 R 11は保護されたヒドロキシメチル基を、 R i⁴は水酸基の保 ΐ 基を表す。）で示される 1—リン酸化誘導体またはその塩。