JP2005314382A - アジド化アミノ糖ヌクレオチド及びその応用 - Google Patents
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Abstract
【課題】 非天然型アジド化アミノ糖ヌクレオチドを提供する。
【解決手段】
下記式（Ｉ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチド及びその製造法に関するものである。
【化１】
（Ｉ）
（式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を示す）
また、糖供与体として上記のアジド化アミノ糖ヌクレオチドを用い、糖転移酵素により受容体糖にＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル基又はＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニル基を転移することを特徴とする、Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル基又はＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル基を含有するオリゴ糖の製造法に関するものである。
さらに、上記アジド化アミノ糖ヌクレオチド又はその誘導体を含有する糖転移酵素阻害剤に関するものである。
【解決手段】
下記式（Ｉ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチド及びその製造法に関するものである。
【化１】
（Ｉ）
（式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を示す）
また、糖供与体として上記のアジド化アミノ糖ヌクレオチドを用い、糖転移酵素により受容体糖にＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル基又はＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニル基を転移することを特徴とする、Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル基又はＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル基を含有するオリゴ糖の製造法に関するものである。
さらに、上記アジド化アミノ糖ヌクレオチド又はその誘導体を含有する糖転移酵素阻害剤に関するものである。
Description
本発明は、医薬品等での応用が期待されるアジド化アミノ糖ヌクレオチド、その製造法及び当該化合物の応用に関するものである。
糖鎖は、蛋白質、核酸につぐ第三の生命の鎖であり、生体内において多種多様な構造で存在し、重要な機能・役割を果たしていることが近年の精力的な研究により明らかとなってきている。
生体内における複雑な糖鎖を構成するグリコシド結合の生成に深く関与しているのは、糖と核酸がリン酸基を介して結合した糖ヌクレオチド（これを糖供与体とも呼ぶ）と１００種類以上もある糖転移酵素である。この糖転移酵素の働きにより糖ヌクレオシドを介して種々の糖が立体および位置選択的に逐次結合して多種多様な糖鎖が構築されている。
このような糖鎖の生合成は特異的に行われており、例えば細胞が癌化する際、まず糖鎖の一部に異変が生じ上記のグリコシド結合の生成反応により、腫瘍マーカーへと糖鎖が伸張、あるいは変貌していくと考えられている。従って、細胞が本来持つ性質や機能を変えたい時、具体的に例えば癌化への道筋を遮断したい場合には、糖鎖を構築する糖転移酵素の活性を選択的に抑制する方法が１つの手段であると考えられている。
また、細胞表面に発現する糖鎖を人為的に改変あるいは選択的に修飾することも、細胞が本来持つ性質や機能を変える手段として有効と考えられる。その手段としては、糖供与体である糖ヌクレオチドの糖構造を改変し、この改変した糖ヌクレオチドを基質として人工糖鎖を生合成させることであり、またこの合成された人工糖鎖を更に選択的に化学的並びに酵素的に修飾することである。あるいは、修飾並びに改変した人工糖鎖を直接細胞内に取り込ませることも考えられる。
近年、生体内における非天然型の生理活性糖鎖の役割について多くの知見が得られるようになり、糖鎖生物学、糖鎖工学といった研究分野が医薬品分野などへ幅広い応用が期待されるようになってきている。
生理活性を有する糖鎖に不可欠な基本組成単位としてはＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのアミノ糖が挙げられる。Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどのアミノ糖は、いわゆるＮ結合型もしくはＯ結合型の糖タンパク質、糖脂質などの生体内に存在する糖鎖中に広く分布し、また、細胞内においては多くのタンパク質がＮ−アセチルグルコサミン単糖とＯ型で結合していることが知られており、さらに癌化した細胞の糖鎖においてその非還元末端にＮ―アセチルガラクトサミンが結合していることが報告されており、このようにアミノ糖は細胞内シグナルとして重要な機能を担っていると考えられている。
Curr. Med. Chem., 6(2), 93-116 (1999)
そこで我々は、非天然型糖鎖を用いて癌細胞の増殖並びに転移を阻害することを目的に、Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミンの２位のアセチル基に化学反応性の高いアジド基を導入したアジド化アミノ糖ヌクレオチドの創製を検討した。
従来、非天然型の糖を有する糖ヌクレオチドは、種々創製されているが（非特許文献１）、アジド基を導入したアジド化アミノ糖ヌクレオチドは未だに創製されていない。
もし、アジド化アミノ糖ヌクレオチドが創製されれば、（１）このアジド化アミノ糖ヌクレオチドを出発物質として多種多様なアミノ糖ヌクレオチドミミックの合成が可能となること、（２）アミノ糖ヌクレオチドミミックを用いて癌化に特異的に関与する糖転移酵素の選択的な阻害剤の開発が期待できること、（３）アジド化糖ヌクレオチドが糖転移酵素の選択的な糖供与体になる場合には、合成されたアジド化糖含有オリゴ糖のアジド基を、更に化学的あるいは酵素的に修飾することで、癌細胞の増殖・転移を抑えることも十分期待されること、（４）アジド化糖含有オリゴ糖を癌細胞に直接取り込ませることでも癌細胞の増殖・転移の効果が期待できることなど、今後の研究の進展に大きなインパクトをもたらすもの期待される重要な非天然型の糖ヌクレオチドである。
本発明者らは、上記目的を達成すべく、鋭意検討を重ねた結果、非天然型アジド化アミノ糖ヌクレオチドの合成に始めて成功し、このアジド化アミノ糖ヌクレオチドの誘導体が糖転移酵素に対する阻害活性を確認した。また、糖転移酵素反応を利用することでアジド化糖含有オリゴ糖の合成にも初めて成功した。さらに、収率が低く、非常に煩雑な化学合成法に代えて、酵素的にアジド化アミノ糖ヌクレオチドを合成することに成功し、本発明を完成させた。
したがって、本発明は、下記式（Ｉ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドに関するものである。
（式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を示す）
また、本発明は、糖供与体として上記のアジド化アミノ糖ヌクレオチドを用い、糖転移酵素により受容体糖にＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル基又はＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニル基を転移することを特徴とする、Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル基又はＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニル基を含有するオリゴ糖の製造法に関するものである。
さらに本発明は、上記アジド化アミノ糖ヌクレオチド又はその誘導体（たとえば、下記式（ＩＩ）で表されるヌクレオシド５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４−カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル］ジホスフェート又はヌクレオシド５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４−カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル］ジホスフェートなど）を含有する糖転移酵素阻害剤に関するものである。
（ＩＩ）
（式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を示す）
また、本発明は、ヌクレオシド５’−トリリン酸とＮ−アジドアセチルグルコサミン又はＮ−アジドアセチルガラクトサミンから上記式（Ｉ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドを酵素的に製造するにあたり、酵素としてキナーゼ、ムターゼ及び糖ヌクレオチドピロホスホリラーゼから選ばれた２種以上の酵素を使用することを特徴とする、アジド化アミノ糖ヌクレオチドの酵素的製造法に関するものである。
さらに、本発明は、ヌクレオシド５’−モノリン酸とＮ−アジドアセチルグルコサミン又はＮ−アジドアセチルガラクトサミンから上記式（Ｉ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドを酵素的に製造するにあたり、各種酵素源として酵母菌体、添加酵素としてキナーゼ、ムターゼ及び糖ヌクレオチドピロホスホリラーゼから選ばれた１種以上の酵素を使用することを特徴とする、アジド化アミノ糖ヌクレオチドの酵素的製造法に関するものである。
本発明のアジド化アミノ糖ヌクレオチドは、多種多様なアミノ糖ヌクレオチドミミックを合成するための出発原料として有用である。
また、本発明のアジド化アミノ糖ヌクレオチド及びその誘導体（たとえば、ヌクレオシド５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４−カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル］ジホスフェート又はヌクレオシド５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４−カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル］ジホスフェートなど）は、通常の糖供与体と競合するため、糖鎖伸長が阻害され、このメカニズムにより、たとえば癌細胞の増殖を防ぐ阻害剤として充分な効果が期待できるものである。
さらに、本発明のアジド化糖ヌクレオチドを糖供与体として合成されたアジド化糖含有オリゴ糖は、分子内にアジド基含有するため、更に化学的あるいは酵素的に修飾することで、癌細胞の増殖・転移を抑えることも十分期待されるものである。
また、本発明の酵素的なアジド化アミノ糖ヌクレオチドの製造法は、化学的な合成法と比較して、簡便な手段で収率よく目的とする化合物を合成することができ、極めて実用的な方法である。特に、水酸基に保護基を有しないアジド化糖の化学的な方法と組み合わせたケモエンザイマチィックな方法で、アジド化糖ヌクレオチドを簡便に調製できることを初めて明らかにしたものであり、産業上極めて有利な方法である。
（１）本発明化合物
本発明化合物は、前記式（Ｉ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドである。
Ｂで示される「核酸塩基」とは、核酸に含まれるピリミジン塩基またはプリン塩基をいう。具体的には、ピリミジン塩基としては、４−アミノ−ピリミジン−２−オン（シトシン）、４−ヒドロキシ−５−メチル−ピリミジン−２−オン（チミン）、４−ヒドロキシ−ピリミジン−２−オン（ウラシル）等が挙げられる。プリン塩基としては、６−アミノプリン（アデニン）、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン（グアニン）、２，６−ジヒドロキシプリン（キサンチン）、６−ヒドロキシプリン（ヒポキサンチン）等が挙げられる。
本発明化合物は、前記式（Ｉ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドである。
Ｂで示される「核酸塩基」とは、核酸に含まれるピリミジン塩基またはプリン塩基をいう。具体的には、ピリミジン塩基としては、４−アミノ−ピリミジン−２−オン（シトシン）、４−ヒドロキシ−５−メチル−ピリミジン−２−オン（チミン）、４−ヒドロキシ−ピリミジン−２−オン（ウラシル）等が挙げられる。プリン塩基としては、６−アミノプリン（アデニン）、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン（グアニン）、２，６−ジヒドロキシプリン（キサンチン）、６−ヒドロキシプリン（ヒポキサンチン）等が挙げられる。
Ｂで示される「核酸塩基の誘導体」とは、核酸塩基にさらに置換基を有するもの；核酸塩基のピリミジン環またはプリン環に置換しているアミノ基、ヒドロキシ基およびメチル基の一部または全部を水素原子に置換したものまたはこれに置換基を有するもの；ピリミジン環またはプリン環内の窒素原子の一部を炭素原子に置換したデアザ体またはこれに置換基を有するもの；ピリミジン環またはプリン環内の炭素原子の一部を窒素原子に置換したアザ体またはこれに置換基を有するものをいう。置換基としては、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基、シアノ基などが挙げられ、置換基の数及び位置は特に制限されるものではない。
置換基としてのハロゲン原子としては、塩素、フッ素、ヨウ素、臭素が例示される。アルキル基としては、メチル、エチル、プロピルなどの炭素数１〜７の直鎖状または分枝鎖状の低級アルキル基が例示される。ハロアルキル基としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ブロモメチル、ブロモエチルなどの炭素数１〜７の直鎖状または分枝鎖状のアルキルを有するハロアルキル基が例示される。アルケニル基としては、ビニル、アリルなどの炭素数２〜７の直鎖状または分枝鎖状のアルケニル基が例示される。ハロアルケニル基としては、ブロモビニル、クロロビニルなどの炭素数２〜７の直鎖状または分枝鎖状のアルケニルを有するハロアルケニル基が例示される。アルキニル基としては、エチニル、プロピニルなどの炭素数２〜７の直鎖状または分枝鎖状のアルキニル基が例示される。アルキルアミノ基としては、メチルアミノ、エチルアミノなどの炭素数１〜７の直鎖状または分枝鎖状のアルキルを有するアルキルアミノ基が例示される。
アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシなどの炭素数１〜７の直鎖状または分枝鎖状のアルコキシ基が例示される。アルキルメルカプト基としては、メチルメルカプト、エチルメルカプトなどの炭素数１〜７の直鎖状または分枝鎖状のアルキルを有するアルキルメルカプト基が例示される。アリール基としては、フェニル基；メチルフェニル、エチルフェニルなどの炭素数１〜５のアルキルを有するアルキルフェニル基；メトキシフェニル、エトキシフェニルなどの炭素数１〜５のアルコキシを有するアルコキシフェニル基；ジメチルアミノフェニル、ジエチルアミノフェニルなどの炭素数１〜５のアルキルアミノを有するアルキルアミノフェニル基；クロロフェニル、ブロモフェニルなどのハロゲノフェニル基などが例示される。アリールオキシ基としては、上記アリール基を有するアリールオキシ基が挙げられる。
ピリミジン塩基の非天然型誘導体を具体的に例示すれば、５−フルオロシトシン、５−フルオロウラシル、５−クロロシトシン、５−クロロウラシル、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードシトシン、５−ヨードウラシル、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、５−メチルウラシル（チミン）、５−エチルウラシル、５−フルオロメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロシトシン、５−トリフルオロウラシル、５−ビニルウラシル、５−ブロモビニルウラシル、５−クロロビニルウラシル、５−エチニルシトシン、５−エチニルウラシル、５−プロピニルウラシル、ピリミジン−２−オン、４−ヒドロキシアミノピリミジン−２‐オン、４−アミノオキシピリミジン−２−オン、４−メトキシピリミジン−２−オン、４−アセトキシピリミジン−２−オン、４−フルオロピリミジン−２−オン、５−フルオロピリミジン−２−オンなどが挙げられる。
プリン塩基の非天然型誘導体を具体的に例示すれば、プリン、６−フルオロプリン、６−クロロプリン、６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−トリフルオロメチルアミノプリン、６−ベンゾイルアミノプリン、６−アセチルアミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−アミノオキシプリン、６−メトキシプリン、６−アセトキシプリン、６−ベンゾイルオキシプリン、６−メチルプリン、６−エチルプリン、６−トリフルオロメチルプリン、６−フェニルプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルメルカプトプリン、６−アミノプリン−１−オキシド、６−ヒドロキシプリン−１−オキシド、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−ヨードプリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシアミノプリン、２−アミノ−６−メトキシプリン、２−アミノ−６−ベンゾイルオキシプリン、２−アミノ−６−アセトキシプリン、２−アミノ−６−メチルプリン、２−アミノ−６−サイクロプロピルアミノメチルプリン、２−アミノ−６−フェニルプリン、２−アミノ−８−ブロモプリン、６−シアノプリン、６−アミノ−２−クロロプリン（２−クロロアデニン）、６−アミノ−２−フルオロプリン（２−フルオロアデニン）、６−アミノ−３−デアザプリン、６−アミノ−８−アザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−８−アザプリン、６−アミノ−７−デアザプリン、６−アミノ−１−デアザプリン、６−アミノ−２−アザプリンなどが挙げられる。
このような本発明化合物の中でも、Ｂがウラシル−１−イルである化合物、具体的には、ウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェート、並びにウリジン５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４−カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル］ジホスフェートが好適である。
このような本発明化合物の中でも、Ｂがウラシル−１−イルである化合物、具体的には、ウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェート、並びにウリジン５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４−カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル］ジホスフェートが好適である。
本発明化合物は、塩、水和物または溶媒和物の形態であってもよい。そのような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩もしくはアンモニウム塩などの任意の塩が例示される。また、水和物または溶媒和物としては、本発明化合物またはその塩１分子に対し、０．１〜１０分子の水または溶媒が付着したものを例示することができる。さらに、本発明化合物には、互変異性体などの各種異性体も包含されうる。
（２）本発明化合物の化学的な製造法
本発明化合物は、式（ＩＩＩ）化合物で示される単糖からベンジルアミンにより選択的に１位を脱保護することにより式（ＩＶ）化合物を得（第１工程）、得られた式（ＩＶ）化合物を２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンを用いてα選択的に亜リン酸化して式（Ｖ）化合物を得（第２工程）、得られた式（Ｖ）化合物を酸化反応に付してリン酸へと変換して式（ＶＩ）化合物を得（第３工程）、得られた式（ＶＩ）化合物とヌクレオシドモノホスホモルホリデート・４−モルホリン−Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド塩と用いてカップリング反応により保護基を有する式（ＶＩＩ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドを得（第４工程）、保護基を脱保護して本発明のアジド化アミノ糖ヌクレオチド（式（Ｉ）化合物）を得る（第５工程）方法により合成することができる。
本発明化合物は、式（ＩＩＩ）化合物で示される単糖からベンジルアミンにより選択的に１位を脱保護することにより式（ＩＶ）化合物を得（第１工程）、得られた式（ＩＶ）化合物を２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンを用いてα選択的に亜リン酸化して式（Ｖ）化合物を得（第２工程）、得られた式（Ｖ）化合物を酸化反応に付してリン酸へと変換して式（ＶＩ）化合物を得（第３工程）、得られた式（ＶＩ）化合物とヌクレオシドモノホスホモルホリデート・４−モルホリン−Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド塩と用いてカップリング反応により保護基を有する式（ＶＩＩ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドを得（第４工程）、保護基を脱保護して本発明のアジド化アミノ糖ヌクレオチド（式（Ｉ）化合物）を得る（第５工程）方法により合成することができる。
（ＶＩＩ）
なお、上記の製造法における中間体得ら（ＩＶ）〜（ＶＩＩ）はすべて新規性の化合物であり、式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を示す。
第１工程；
出発物質として用いる式（ＩＩＩ）化合物のアジドアセチル化グルコサミン又はアジドアセチル化ガラクトサミンは、ハロゲン化酸無水物を用いてグルコサミン又はガラクトサミンのアミノ基をハロゲン化アセチル化した後、アジド基へと変換することで調製することが可能である（Journal of the American Chemical Society (2002), 124, 14893-14902）。
出発物質として用いる式（ＩＩＩ）化合物のアジドアセチル化グルコサミン又はアジドアセチル化ガラクトサミンは、ハロゲン化酸無水物を用いてグルコサミン又はガラクトサミンのアミノ基をハロゲン化アセチル化した後、アジド基へと変換することで調製することが可能である（Journal of the American Chemical Society (2002), 124, 14893-14902）。
また、ペプチド合成に使われている縮合剤のジフェニルフォスフォリルアジド（ＤＰＰＡ）を用いることで、グルコサミン又はガラクトサミンのアミノ基にアジド酢酸を直接導入し、続けて常法により水酸基をすべてアセチル化することで効率的に目的とする式（ＩＩＩ）化合物を合成することもできる。
第１工程は、式（ＩＩＩ）化合物を、アセチル基の脱保護法として一般的に用いられているベンジルアミンを用いて常法に従ってアノマー位の脱保護を行うことで、式（ＩＶ）化合物を得る工程である。なお、式（ＩＶ）化合物の１位水酸基の配位はαであり、これは２位に存在するＮ−アセチルアミノ基の微妙な関与ではないかと推測される。
第２工程；
第２工程は、リン酸化剤２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンを用いた亜リン酸化反応により式（ＩＶ）化合物から式（Ｖ）化合物を得る工程である。
第２工程は、リン酸化剤２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンを用いた亜リン酸化反応により式（ＩＶ）化合物から式（Ｖ）化合物を得る工程である。
２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンを用いた亜リン酸化反応は、文献公知の方法条件で実施することができ（Tetrahedron Letters (1986),27,6271-6274）、反応は立体選択的に反応が進行し、目的とするα体のみを合成することができる。この特異性も、２位に存在するＮ−アセチルアミノ基の微妙な関与ではないかと推測できる。
第３工程；
第３工程は、式（Ｖ）化合物をテトラブチルヒドロペルオキシドを用いた酸化反応に付して式（ＶＩ）化合物を得る工程である。
第３工程は、式（Ｖ）化合物をテトラブチルヒドロペルオキシドを用いた酸化反応に付して式（ＶＩ）化合物を得る工程である。
テトラブチルヒドロペルオキシドを用いる酸化反応は、亜リン酸誘導体の酸化反応として通常用いられる反応であるが、第３工程では反応系にヨウ素を触媒量加えることで効率的に反応が進行し、目的とするリン酸化単糖である式（ＶＩ）化合物を得ることができる。
第４工程；
第４工程は、式（ＶＩ）化合物とヌクレオシドモノホスフェート誘導体とのカップリング反応により保護基を有する式（ＶＩＩ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドを得る工程である。
第４工程は、式（ＶＩ）化合物とヌクレオシドモノホスフェート誘導体とのカップリング反応により保護基を有する式（ＶＩＩ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドを得る工程である。
カップリング反応は、文献公知のモルホリデートを用いた方法条件に従って行うことができる（Journal of Organic Chemistry,(1997),62,2144-2147）。
第５工程；
第５工程は、式（ＶＩＩ）化合物の保護基を脱保護して本発明のアジド化アミノ糖ヌクレオチド（式（Ｉ）化合物）を得る工程である。
保護基の除去は、使用した保護基で常用されている方法に従って行うことができる。
第５工程は、式（ＶＩＩ）化合物の保護基を脱保護して本発明のアジド化アミノ糖ヌクレオチド（式（Ｉ）化合物）を得る工程である。
保護基の除去は、使用した保護基で常用されている方法に従って行うことができる。
このようにして得られた糖ヌクレオチドは、糖ヌクレオチドの通常の単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）により単離精製することができる。
（３）本発明化合物の酵素的な製造法
本発明化合物の酵素的な製造法は、酵素だけを使用する方法と酵母菌体と酵素を併用する方法の２つの方法に分類される。
すなわち、ヌクレオシド５’−トリリン酸とＮ−アジドアセチルグルコサミン又はＮ−アジドアセチルガラクトサミンから下記式（Ｉ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドを酵素的に製造するにあたり、酵素としてキナーゼ、ムターゼ及び糖ヌクレオチドピロホスホリラーゼから選ばれた２種以上の酵素を使用することを特徴とする、アジド化アミノ糖ヌクレオチドの酵素的製造法に関するものである。
本発明化合物の酵素的な製造法は、酵素だけを使用する方法と酵母菌体と酵素を併用する方法の２つの方法に分類される。
すなわち、ヌクレオシド５’−トリリン酸とＮ−アジドアセチルグルコサミン又はＮ−アジドアセチルガラクトサミンから下記式（Ｉ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドを酵素的に製造するにあたり、酵素としてキナーゼ、ムターゼ及び糖ヌクレオチドピロホスホリラーゼから選ばれた２種以上の酵素を使用することを特徴とする、アジド化アミノ糖ヌクレオチドの酵素的製造法に関するものである。
（Ｉ）
（式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を示す）
具体的には、ウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）とＮ−アジドアセチルグルコサミンを基質とし、グルコキナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミンリン酸ムターゼ及びウリジン５’−ジリン酸Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼを酵素として用い、ウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートを合成する方法が例示される。
また、ウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）とＮ−アジドアセチルガラクトサミンを基質とし、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ及びウリジン５’−ジリン酸Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼを酵素として用い、ウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニル）ジホスフェートを合成する方法も例示される。
一方、酵母菌体と酵素を併用する方法としては、ヌクレオシド５’−モノリン酸とＮ−アジドアセチルグルコサミン又はＮ−アジドアセチルガラクトサミンから上記式（Ｉ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドを酵素的に製造するにあたり、各種酵素源として酵母菌体、添加酵素としてキナーゼ、ムターゼ及び糖ヌクレオチドピロホスホリラーゼから選ばれた１種以上の酵素を使用することを特徴とする、アジド化アミノ糖ヌクレオチドの酵素的製造法に関する。
具体的には、ウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）とＮ−アジドアセチルグルコサミンを基質とし、グルコキナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミンリン酸ムターゼ、ウリジン５’−ジリン酸Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ及び酵母菌体を用い、ウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートを合成する方法が例示される。
また、ウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）とＮ−アジドアセチルガラクトサミンを基質とし、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ、ウリジン５’−ジリン酸Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ及び酵母菌体を用い、ウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニル）ジホスフェートを合成する方法も例示される。
上記方法で使用する酵素、すなわちキナーゼ、ムターゼ及び糖ヌクレオチドピロホスホリラーゼはすべて公知の酵素であり、それらの酵素は特定の由来のものに限定されず、動物由来、植物由来、微生物由来など、すべての由来のものを使用することができる。その中でも特に、酵素調製の簡便性などの点から微生物由来のものを使用するのが好ましい。
また、酵素の遺伝子がクローン化されている場合には、そのクローン化された酵素遺伝子を用いて常法により大腸菌などを宿主として大量生産させ、当該組換え菌より当該酵素を調製することも可能である。
また、酵素の遺伝子がクローン化されている場合には、そのクローン化された酵素遺伝子を用いて常法により大腸菌などを宿主として大量生産させ、当該組換え菌より当該酵素を調製することも可能である。
このような酵素は、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などが挙げられる。
微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、バシラス属または大腸菌類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２ｘＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、約３０〜５０℃で約１０〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより糖転移活性を有する微生物菌体を調製することができる。
微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消火、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物が挙げられる。
酵素調製物としては、上記菌体処理物から糖転移活性を有する画分を通常の酵素の精製手段、例えば塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理などを施して得られる粗酵素または精製酵素を使用することができる。
また、酵素以外に酵母を併用する場合には、市販のパン酵母あるいはワイン酵母などを使用することができる。このような酵母菌体は、生酵母、乾燥酵母いずれであってもかまわないが、反応収率の点からは乾燥酵母を用いるのが好ましい。添加量は１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜５％の範囲から適宜設定できる。
基質として使用するヌクレオチド５’−モノリン酸又はヌクレオチド５’−トリリン酸は、市販の製品を使用することができ、使用濃度としては５〜２００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭの範囲から適宜設定できる。
また、Ｎ−アジドアセチルグルコサミン又はＮ−アジドアセチルガラクトサミンも市販品又は実施例に示す方法で調製したもを使用することができ、使用濃度としては５〜２００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭの範囲から適宜設定できる。
すなわち、Ｎ−アジドアセチルグルコサミン又はＮ−アジドアセチルガラクトサミンの簡便な調製法としては、２−アジド酢酸エチルをエタノールなどのアルコール系有機溶媒に溶解し、水酸化ナトリウムなどのアルカリを添加後、この液にグルコサミン又はガラクトサミンを添加し反応させるという簡便な方法で、目的とするＮ−アジドアセチルグルコサミン又はＮ−アジドアセチルガラクトサミンを調製することができる。
すなわち、Ｎ−アジドアセチルグルコサミン又はＮ−アジドアセチルガラクトサミンの簡便な調製法としては、２−アジド酢酸エチルをエタノールなどのアルコール系有機溶媒に溶解し、水酸化ナトリウムなどのアルカリを添加後、この液にグルコサミン又はガラクトサミンを添加し反応させるという簡便な方法で、目的とするＮ−アジドアセチルグルコサミン又はＮ−アジドアセチルガラクトサミンを調製することができる。
酵素反応は、リン酸緩衝液などの緩衝液（ｐＨ６〜９）中、上記各種酵素を０．５ユニット／ｍｌ以上、好ましくは１〜５ユニット／ｍｌ使用し、２０〜３０℃、好ましくは２２３〜２８℃で２４〜６８時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
なお、酵素だけを使用する場合には、反応系にＡＴＰなどのエネルギー源を添加し、また酵素と酵母菌体を併用する場合には、グルコース、フラクトースなどの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸をエネルギー源として添加するのが好ましい。
このようにして得られた糖ヌクレオチドは、糖ヌクレオチドの通常の単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）により単離精製することができる。
（４）本発明化合物の応用
本発明のアジド化アミノ糖ヌクレオチド及びその誘導体は、通常の糖供与体と競合するため、糖転移酵素による糖鎖伸長が阻害され、このメカニズムにより、たとえば癌細胞の増殖を防ぐ阻害剤として充分な効果が期待できるものである。
本発明のアジド化アミノ糖ヌクレオチド及びその誘導体は、通常の糖供与体と競合するため、糖転移酵素による糖鎖伸長が阻害され、このメカニズムにより、たとえば癌細胞の増殖を防ぐ阻害剤として充分な効果が期待できるものである。
アジド化アミノ糖ヌクレオチドの誘導体としては、種々の誘導体を例示することができ、糖転移酵素による糖鎖伸長において、通常の糖供与体（糖ヌクレオチド）と競合し、糖鎖伸長を阻害する性質を有する限り、特別のものに限定されない。
具体的に、そのような誘導体としては、本発明のアジド化アミノ糖ヌクレオチドをアセチレン誘導体と反応することによりトリアゾール環へと変換したヌクレオシド５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４−カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル］ジホスフェート又はヌクレオシド５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４−カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル］ジホスフェート（式（ＩＩ）化合物：式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を示す）などトリアゾール化アミノ糖ヌクレオチドを例示することができる。
さらに、本発明のアジド化糖ヌクレオチドを糖供与体として合成されたアジド化糖含有オリゴ糖は、分子内にアジド基含有するため、更に化学的あるいは酵素的に修飾することで、癌細胞の増殖・転移を抑えることも十分期待される。
このようなアジド化糖含有オリゴ糖は、本発明のアジド化アミノ糖ヌクレオシドを糖供与体とし、糖転移酵素、具体的にはβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を用い、受容体の糖（単糖又はオリゴ糖）にＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル基又はＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニル基を転移することで調製することができる。
反応に用いる転移酵素としては、Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル基、あるいはＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニル基を転移できるものであれば特に制限されるものではないが、特にＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン転移活性も有することが知られているβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が使用に好ましい。また、転移酵素は特定の由来のものに限定されず、動物由来、植物由来、微生物由来など、すべての由来のものを使用することができるが、酵素調製の簡便性、糖ヌクレオチドに対する基質特異性などの点から微生物由来のものを使用するのが好ましい。また、使用する転移酵素遺伝子がクローン化されている場合には、そのクローン化された転移酵素遺伝子を用いて常法により大腸菌などを宿主として大量生産させ、当該組換え菌より当該酵素を調製することも可能である。
このような転移酵素は、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などが挙げられる。
微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、バシラス属または大腸菌類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２ｘＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、約３０〜５０℃で約１０〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより糖転移活性を有する微生物菌体を調製することができる。
微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消火、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物が挙げられる。
酵素調製物としては、上記菌体処理物から糖転移活性を有する画分を通常の酵素の精製手段、例えば塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理などを施して得られる粗酵素または精製酵素を使用することができる。
反応液に添加する受容体の糖（単糖又はオリゴ糖）は、合成目的のオリゴ糖に応じて適宜選択すれば良く、特に制限されるものではない。
受容体糖及び糖供与体としてのアジド化アミノ糖ヌクレオチドの使用濃度としては、約１〜２００ｍＭが好ましい。
受容体糖及び糖供与体としてのアジド化アミノ糖ヌクレオチドの使用濃度としては、約１〜２００ｍＭが好ましい。
本発明のアジド化糖含有オリゴ糖の合成反応は、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等の各種緩衝液を用い、糖転移酵素を好ましくは約０．００１ユニット／ｍｌ以上、さらに好ましくは約０．０１ユニット／ｍｌ添加し、好ましくは約５０℃以下、より好ましくは約５〜５０℃で約１〜５０時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
本発明のアジド化糖含有オリゴ糖を具体的に例示すれば、下記式（ＶＩＩＩ）で表されるＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニルβ１−３ラクトース又はＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニルβ１−３ラクトースを例示することができ、この三糖は、糖供与体として本発明のアジド化アミノ糖ヌクレオシドを、受容体としてラクトースを、糖転移酵素としてＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン転移活性も有するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を用いることで合成することができる。
このようにして得られたアジド化糖含有オリゴ糖は、オリゴ糖の通常の単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）により単離精製することができる。
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、DNAの調製、制限酵素による切断、T4DNAリガーゼによるDNA連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular Cloning」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)）に従って行った。また、制限酵素、AmpliTaq DNAポリメラーゼ、T4 DNAリガーゼはタカラバイオ（株）より入手した。
実施例１
（１）１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アジドアセチル−Ｄ−グルコサミンの合成
２−アジド酢酸エチル（１．３ｇ、１０ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍｌ）に溶解し、０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）を添加した後、室温で１０分間攪拌した。反応溶液にグルコサミン塩酸塩（２．２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を添加し、さらに３０分攪拌した。反応溶液の溶媒を減圧濃縮することにより除去し、さらにＤＭＦを加え減圧濃縮することを三回繰り返すことで水を除去した。反応残留物をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（１．４ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）とジフェニルフォスフォリルアジド（２．２ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪拌した。反応溶液にピリジン（２０ｍｌ）、４ジメチルアミノピリジン（１ｇ、８．２ｍｍｏｌ）を加え、さらに無水酢酸（１０ｍｌ）をゆっくり添加し室温で５時間攪拌した。反応溶液にメタノールを加え反応を停止し、反応溶媒を減圧濃縮により除去した。シリカゲルクロマトグラフィ（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１〜１／２）で精製することにより標記化合物（２．９ｇ，収率６７％）を得た。
（１）１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アジドアセチル−Ｄ−グルコサミンの合成
２−アジド酢酸エチル（１．３ｇ、１０ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍｌ）に溶解し、０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）を添加した後、室温で１０分間攪拌した。反応溶液にグルコサミン塩酸塩（２．２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を添加し、さらに３０分攪拌した。反応溶液の溶媒を減圧濃縮することにより除去し、さらにＤＭＦを加え減圧濃縮することを三回繰り返すことで水を除去した。反応残留物をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（１．４ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）とジフェニルフォスフォリルアジド（２．２ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪拌した。反応溶液にピリジン（２０ｍｌ）、４ジメチルアミノピリジン（１ｇ、８．２ｍｍｏｌ）を加え、さらに無水酢酸（１０ｍｌ）をゆっくり添加し室温で５時間攪拌した。反応溶液にメタノールを加え反応を停止し、反応溶媒を減圧濃縮により除去した。シリカゲルクロマトグラフィ（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１〜１／２）で精製することにより標記化合物（２．９ｇ，収率６７％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３）：２．０５，２．０６，２．１０，２．２２（１２Ｈ，ｓｘ４）（４ｘＡｃ），３．９４（２Ｈ，ｓ）（−ＣＨ２Ｎ３），４．０２−４．１１（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−５，Ｈ−６ａ），４．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３，１１．８Ｈｚ）（Ｈ−６ｂ），４．４５（１Ｈ，ｍ）（Ｈ−２），５．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）（Ｈ−４），５．３０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ）（Ｈ−３），６．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ）（Ｈ−１），６．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）（ＮＨ）．
（２）３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミンの合成
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アジドアセチルグルコサミン（９８０ｍｇ，２．３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に溶解し、ベンジルアミン（３００μｌ，２．７ｍｍｏｌ）を添加し室温で１日攪拌した。反応溶液の溶媒を減圧濃縮することにより除去し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィ（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１〜１／２）で精製することにより標記化合物（８５０ｍｇ，収率９６％）を得た。
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アジドアセチルグルコサミン（９８０ｍｇ，２．３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に溶解し、ベンジルアミン（３００μｌ，２．７ｍｍｏｌ）を添加し室温で１日攪拌した。反応溶液の溶媒を減圧濃縮することにより除去し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィ（展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１〜１／２）で精製することにより標記化合物（８５０ｍｇ，収率９６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３）：２．０３，２．０５，２．１１（９Ｈ，ｓｘ３）（３ｘＡｃ），３．９５（２Ｈ，ｓ）（−ＣＨ２Ｎ３），４．１０−４．１６（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ），４．２２（１Ｈ，ｍ）（Ｈ−５），４．３０（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝３．６，１０．５Ｈｚ）（Ｈ−２），５．１５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ）（Ｈ−４），５．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ）（Ｈ−１），５．３５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．９Ｈｚ）（Ｈ−３），６．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）（ＮＨ）．
（３）Ｎ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニルホスファイトトリエチルアミン塩の合成
Ｎ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−グルコサミン（５９０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（４２２μｌ、３．０ｍｍｏｌ）と２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン（３３８ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、残留物にテトラヒドロフランを加え、沈殿物をろ過により除去した。ろ液を減圧濃縮し溶媒を除去した後、残留物をシリカゲルクロマトグラフィ（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝５／１）で精製することにより標記化合物（６８９ｍｇ、収率８３％）を得た。
Ｎ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−グルコサミン（５９０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（４２２μｌ、３．０ｍｍｏｌ）と２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン（３３８ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、残留物にテトラヒドロフランを加え、沈殿物をろ過により除去した。ろ液を減圧濃縮し溶媒を除去した後、残留物をシリカゲルクロマトグラフィ（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝５／１）で精製することにより標記化合物（６８９ｍｇ、収率８３％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３）：２．０１，２．０４，２．０９（９Ｈ，ｓｘ３）（３ｘＡｃ），３．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ）（−１／２ＣＨ２Ｎ３），３．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ）（−１／２ＣＨ２Ｎ３），４．１０−４．１３（１Ｈ，ｍ）（Ｈ−６ａ），４．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．７，１２．３Ｈｚ）（Ｈ−６ｂ），４．２９（１Ｈ，ｍ）（Ｈ−５），４．３７（１Ｈ，ｍ）（Ｈ−２），５．２０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ）（Ｈ−４），５．３７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ）（Ｈ−３），５．６２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２，８．６Ｈｚ）（Ｈ−１），７．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ）（ＮＨ）．
（４）Ｎ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニルリン酸２トリエチルアミン塩の合成
Ｎ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニルホスファイト（３５０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解し、イオン交換カラムクロマトグラフィ（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０、Ｈ＋フォーム）によりリン酸塩を遊離した。溶出液を減圧濃縮し、残留物をテトラヒドロフラン（１５ｍｌ）に溶解した。５．０Ｍテトラブチルヒドロペルオキシド溶液（６００μｌ，３ｍｍｏｌ）、ヨウ素（１０ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）添加し、室温で１１時間攪拌した。硫化ジメチルを加えることにより反応を停止し、混合物を減圧濃縮することにより溶媒を除去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィ（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝１００／１００／１）で精製することによりＮ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニルリン酸２トリエチルアミン塩（２６６ｍｇ，収率６３％）を得た。
Ｎ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニルホスファイト（３５０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解し、イオン交換カラムクロマトグラフィ（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０、Ｈ＋フォーム）によりリン酸塩を遊離した。溶出液を減圧濃縮し、残留物をテトラヒドロフラン（１５ｍｌ）に溶解した。５．０Ｍテトラブチルヒドロペルオキシド溶液（６００μｌ，３ｍｍｏｌ）、ヨウ素（１０ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）添加し、室温で１１時間攪拌した。硫化ジメチルを加えることにより反応を停止し、混合物を減圧濃縮することにより溶媒を除去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィ（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝１００／１００／１）で精製することによりＮ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニルリン酸２トリエチルアミン塩（２６６ｍｇ，収率６３％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３）：２．０１，２．０２，２．０７（９Ｈ，ｓｘ３）（３ｘＡｃ），３．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ）（−１／２ＣＨ２Ｎ３），３．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ）（−１／２ＣＨ２Ｎ３），４．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．３，２．１Ｈｚ）（Ｈ−６ａ），４．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２，１２．３Ｈｚ）（Ｈ−６ｂ），４．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，３．２Ｈｚ）（Ｈ−５），４．４４（１Ｈ，ｍ）（Ｈ−２），５．２０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ）（Ｈ−４），５．３４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ）（Ｈ−３），５．５７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２，７．７Ｈｚ）（Ｈ−１），７．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）（ＮＨ）．
（５）ジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートの合成
Ｎ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニルリン酸２トリエチルアミン塩（２６ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）にピリジン（２ｍｌ）に溶解した。ウリジンモノホスホモルホリデート・４−モルホリン−Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド塩（３２ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）とテトラゾール（３ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）を加え室温で２日間攪拌した。水を加えた後減圧濃縮することにより反応溶媒を除去し、イオン交換カラムクロマトグラフィ（現アマシャムバイオサイエンス社製デアエセルロース）（展開溶媒：炭酸水素アンモニウム緩衝液＝０．０１Ｍ〜０．２Ｍ）により分取を行い、減圧濃縮した。残留物をゲル濾過クロマトグラフィ（セファデックスＧ−１０）により脱塩処理を行い、ジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートを（１９ｍｇ，収率６０％）得た。
Ｎ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニルリン酸２トリエチルアミン塩（２６ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）にピリジン（２ｍｌ）に溶解した。ウリジンモノホスホモルホリデート・４−モルホリン−Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド塩（３２ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）とテトラゾール（３ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）を加え室温で２日間攪拌した。水を加えた後減圧濃縮することにより反応溶媒を除去し、イオン交換カラムクロマトグラフィ（現アマシャムバイオサイエンス社製デアエセルロース）（展開溶媒：炭酸水素アンモニウム緩衝液＝０．０１Ｍ〜０．２Ｍ）により分取を行い、減圧濃縮した。残留物をゲル濾過クロマトグラフィ（セファデックスＧ−１０）により脱塩処理を行い、ジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートを（１９ｍｇ，収率６０％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３）：２．００，２．０５，２．１１（９Ｈ，ｓｘ３）（３ｘＡｃ），３．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ）（−１／２ＣＨ２Ｎ３），４．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ）（−１／２ＣＨ２Ｎ３），４．１２−４．４２（９Ｈ，ｍ）（Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ，Ｈ−５，Ｈ−２，ｒｉｂ−Ｈ’−２，ｒｉｂ−Ｈ’−３，ｒｉｂ−Ｈ’−４，ｒｉｂ−Ｈ’−５ａ，ｒｉｂ−Ｈ’−５ｂ），５．１１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ）（Ｈ−４），５．２１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．９Ｈｚ）（Ｈ−３），５．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．４，７．０Ｈｚ）（Ｈ−１），５．９４（１Ｈ，ｓ）（ｒｉｂ−Ｈ’−１），５．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）（Ｕｒｉｄｉｎｅ−Ｈ−５），７．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ）（Ｕｒｉｄｉｎｅ−Ｈ−６）．
（６）ジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートの合成
ジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェート（７５ｍｇ，０．０９３ｍｍｏｌ）を水（５ｍｌ）に溶解し、２５％アンモニア水溶液を（５ｍｌ）を加え室温で３時間攪拌した。減圧濃縮することにより反応溶媒を除去しジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートを（６３ｍｇ，収率１００％）得た。
ジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェート（７５ｍｇ，０．０９３ｍｍｏｌ）を水（５ｍｌ）に溶解し、２５％アンモニア水溶液を（５ｍｌ）を加え室温で３時間攪拌した。減圧濃縮することにより反応溶媒を除去しジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートを（６３ｍｇ，収率１００％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３）：３．５３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）（Ｈ−４），３．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，４．５Ｈｚ）（Ｈ−６ａ），３．８０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）（Ｈ−３），３．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，１２．５Ｈｚ）（Ｈ−６ｂ），３．９１（１Ｈ，ｍ）（Ｈ−５），４．０３（２Ｈ，ｍ）（Ｈ−２，−１／２ＣＨ２Ｎ３），４．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ）（−１／２ＣＨ２Ｎ３），４．１４−４．３６（５Ｈ，ｍ）（ｒｉｂ−Ｈ’−２，ｒｉｂ−Ｈ’−３，ｒｉｂ−Ｈ’−４，ｒｉｂ−Ｈ’−５ａ，ｒｉｂ−Ｈ’−５ｂ），５．５１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３，７．３Ｈｚ）（Ｈ−１），５．９５（１Ｈ，ｓ）（ｒｉｂ−Ｈ’−１），５．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）（Ｕｒｉｄｉｎｅ−Ｈ−５），７．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）（Ｕｒｉｄｉｎｅ−Ｈ−６）．
実施例２
ジアンモニウムウリジン５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル］ジホスフェートの合成
ジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェート（６．４ｍｇ，０．０９３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３ｍｌ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（３５μｌ、０．２ｍｍｏｌ）、プロピオール酸（６μｌ、０．０９７ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（２ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を加え室温で３時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、残留物をゲル濾過クロマトグラフィ（セファデックスＧ−１０）により精製することでジアンモニウムウリジン５’−（２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）ジホスフェートを（４．１ｍｇ，収率５０％）得た。
ジアンモニウムウリジン５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル］ジホスフェートの合成
ジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェート（６．４ｍｇ，０．０９３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３ｍｌ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（３５μｌ、０．２ｍｍｏｌ）、プロピオール酸（６μｌ、０．０９７ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（２ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を加え室温で３時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、残留物をゲル濾過クロマトグラフィ（セファデックスＧ−１０）により精製することでジアンモニウムウリジン５’−（２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）ジホスフェートを（４．１ｍｇ，収率５０％）得た。
１Ｈ−ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３）：３．５３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ）（Ｈ−４），３．９０（３Ｈ，ｍ）（Ｈ−３，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ），３．９４（１Ｈ，ｍ）（Ｈ−５），４．０７（１Ｈ，ｍ）（Ｈ−２），４．１４−４．３６（５Ｈ，ｍ）（ｒｉｂ−Ｈ’−２，ｒｉｂ−Ｈ’−３，ｒｉｂ−Ｈ’−４，ｒｉｂ−Ｈ’−５ａ，ｒｉｂ−Ｈ’−５ｂ），５．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ）（−１／２ＣＨ２Ｎ３），５．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ）（−１／２ＣＨ２Ｎ３），５．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．５，７．３Ｈｚ）（Ｈ−１），５．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ）（ｒｉｂ−Ｈ’−１），５．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）（Ｕｒｉｄｉｎｅ−Ｈ−５），７．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）（Ｕｒｉｄｉｎｅ−Ｈ−６），８．２７（１Ｈ，ｓ）（ｔｒｉａｚｏｌ−Ｈ−４）
実施例３
（１）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素をコードするｌｇｔＡ遺伝子のクローニング
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ ３５０００ＨＰの染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ７００７２４Ｄ）を鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ ｌｇｔA遺伝子（EMBL / GENEBANK / DDBJ DATA BANKS、Accession No. AF536817）を増幅した。
（１）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素をコードするｌｇｔＡ遺伝子のクローニング
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ ３５０００ＨＰの染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ７００７２４Ｄ）を鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ ｌｇｔA遺伝子（EMBL / GENEBANK / DDBJ DATA BANKS、Accession No. AF536817）を増幅した。
プライマー（A）：5'- ttccatggtgacaactttagtgtcagttttgatttgtgct -3'
プライマー（B）：5'- atgtcgaccatgctgatttggaataacggg -3'
プライマー（B）：5'- atgtcgaccatgctgatttggaataacggg -3'
ＰＣＲによるｌｇｔA遺伝子の増幅は、反応液５０μl （５０ ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１% ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１ μg、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々 ０．２ ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）を現タカラバイオ社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、４５秒）、伸長反応（７２℃、２分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．０ ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該DNAを制限酵ＮｃｏＩ及びＳａｌＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ及びＳａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（現アマシャムバイオサイエンス社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌(E. coli) Ｋ１２株 ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ-ＨＤＧｎＴを単離した。
ｐＴｒｃＨＤ−ＧｎＴは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ-ＳａｌＩ切断部位にＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ ｌｇｔＡ構造遺伝子を含有するＮｃｏＩ-ＳａｌＩ ＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（２）β１，３-Ｎ-アセチルグルコサミン転移活性を有する酵素タンパク質の調製
プラスミドｐＴｒｃ-ＨＤＧｎＴを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ/ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地 ５０ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。１×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度０．５ ｍＭになるようにIPTGを添加し、２０℃で２０時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ, ２０分）により菌体を回収し、５ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭメルカプトエタノール、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
プラスミドｐＴｒｃ-ＨＤＧｎＴを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ/ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地 ５０ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。１×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度０．５ ｍＭになるようにIPTGを添加し、２０℃で２０時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ, ２０分）により菌体を回収し、５ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ ７．５）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭメルカプトエタノール、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
このように得られた上清画分を酵素液とし、酵素液におけるβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移活性を測定した結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌Ｋ１２株 ＪＭ１０９）と共に下記表１に示す。なお、本発明におけるβ１，３-アセチルグルコサミン転移酵素活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法でＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンとラクトースからのラクトーＮ−トリオース（ＬＮＴ−２）の合成活性を測定、算出したものである。
＜活性の測定と酵素単位の算出＞
１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ塩化マンガン、２０ｍＭラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)に、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を添加して３０℃で４．５時間反応させた。また、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の代わりにｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸ＪＭ１０９株の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロールとした。
１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ塩化マンガン、２０ｍＭラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)に、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を添加して３０℃で４．５時間反応させた。また、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の代わりにｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸ＪＭ１０９株の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロールとした。
反応液に１／１０容量の１Ｍ水酸化ナトリウムを添加することにより反応を停止し、これを希釈した後、Ｄｉｏｎｅｘ ＤＸ−３００装置による分析を行った。分離には日本ダイオネクス社製のCarboPacPA1カラムを用い、溶出液として脱イオン水、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液および１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を用いた。ＤＸ−３００分析結果から反応液中のＬＮＴ−２量をラクトース換算で算出し，３０℃で１分間に１μｍｏｌｅのＮ-アセチルラクトサミンを合成する活性を１単位（ユニット）としてβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を算出した。
（３）ジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性に対する影響
１０ ｍＭ塩化マグネシウム、１０ ｍＭ塩化マンガン、２０ｍＭ ラクトース、１０ｍＭ ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン並びに１０ ｍＭジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートを含有する１００ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）に、上記（２）により調製したβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移活性を有する酵素液(０.０１２units／ml反応液)を添加し、３０℃で、２４時間反応を行った。コントロールとして１０ ｍＭジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートなしの反応も行った。
反応液を９０℃、３分間の熱処理を行った後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により不溶性画分を除去した。Ｄｉｏｎｅｘ ＤＸ−３００による分析を行ったところ、４．８２５ｍＭのＬＮＴ−２の生成を確認した。なお、コントロールでは５．９４８ｍＭのＬＮＴ−２が生成した。
（４）ジアンモニウムウリジン５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル］ジホスフェートのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素に対する影響
１０ ｍＭ塩化マグネシウム、１０ ｍＭ塩化マンガン、２０ ｍＭ ラクトース、１０ ｍＭ ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン並びに１０ ｍＭジアンモニウムウリジン５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル］ジホスフェートを含有する１００ ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）に、上記（２）により調製したβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移活性を有する酵素液(０.０１２units／ml反応液)を添加し、３０℃で、２５時間反応を行った。コントロールとして１０ ｍＭジアンモニウムウリジン５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル］ジホスフェートなしの反応も行った。
反応液を９０℃、３分間の熱処理を行った後、遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により不溶性画分を除去した。Ｄｉｏｎｅｘ ＤＸ−３００による分析を行ったところ、１．２３８ｍＭのＬＮＴ−２の生成を確認した。なお、コントロールでは４．７５４ｍＭのＬＮＴ−２が生成したことから７４％の生成阻害が認められた。
実施例４
Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニルβ１−３ラクトースの酵素合成
１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ ｍＭ塩化マンガン、２０ｍＭ ラクトース、１０ｍＭジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートを含む１００ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）に、上記実施例２により調製したβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移活性を有する酵素液(０.０１２units／ml反応液)を添加し、３０℃で、２４時間反応を行った。
反応液を９０℃、３分間の熱処理を行った後、遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により不溶性画分を除去した。Ｄｉｏｎｅｘ ＤＸ−３００による分析を行ったところ、糖受容体であるラクトースの減少から約３ｍＭのＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニルβ１−３ラクトースの生成が推定された。さらに当該処理液をダウエックス５０Ｗ（Ｈ＋）（ダウケミカル社製）、ＩＲＡ４１０（ＯＨ−）（ローム・アンド・ハース社製）樹脂に通液し、減圧乾燥により乾固させた後、蒸留水で再度溶解させた試料をＥＳＩ−イオントラップ質量分析装置（日立ハイテクノロジー社製）を用いて分析を行った結果、[Ｍ＋Ｎａ]＋（ｍ／ｚ６１０）及び[Ｍ＋Ｋ]＋（ｍ／ｚ６２６）のピークを検出したころから、Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニルβ１−３ラクトースが生成したことを確認した。
Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニルβ１−３ラクトースの酵素合成
１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ ｍＭ塩化マンガン、２０ｍＭ ラクトース、１０ｍＭジアンモニウムウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートを含む１００ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）に、上記実施例２により調製したβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移活性を有する酵素液(０.０１２units／ml反応液)を添加し、３０℃で、２４時間反応を行った。
反応液を９０℃、３分間の熱処理を行った後、遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により不溶性画分を除去した。Ｄｉｏｎｅｘ ＤＸ−３００による分析を行ったところ、糖受容体であるラクトースの減少から約３ｍＭのＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニルβ１−３ラクトースの生成が推定された。さらに当該処理液をダウエックス５０Ｗ（Ｈ＋）（ダウケミカル社製）、ＩＲＡ４１０（ＯＨ−）（ローム・アンド・ハース社製）樹脂に通液し、減圧乾燥により乾固させた後、蒸留水で再度溶解させた試料をＥＳＩ−イオントラップ質量分析装置（日立ハイテクノロジー社製）を用いて分析を行った結果、[Ｍ＋Ｎａ]＋（ｍ／ｚ６１０）及び[Ｍ＋Ｋ]＋（ｍ／ｚ６２６）のピークを検出したころから、Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニルβ１−３ラクトースが生成したことを確認した。
実施例５：酵素法によるウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートの合成
（１）酵素液の調製
３種類の酵素（枯草菌グルコキナーゼ、酵母Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）リン酸ムターゼ、ならびに大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ）を含む酵素液を文献（Okuyama, K., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem.,64(2),386-392(2000)）に記載の方法で調製した。なお、各酵素活性も前述の文献記載の方法で測定した。
（１）酵素液の調製
３種類の酵素（枯草菌グルコキナーゼ、酵母Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）リン酸ムターゼ、ならびに大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ）を含む酵素液を文献（Okuyama, K., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem.,64(2),386-392(2000)）に記載の方法で調製した。なお、各酵素活性も前述の文献記載の方法で測定した。
（２）Ｎ−アジドアセチル−Ｄ−グルコサミンの合成
２−アジド酢酸エチル（５．３ｇ、４１ｍｍｏｌ）をエタノール（４１ｍＬ）に溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（４１ｍＬ）を添加した後、室温で１０分間攪拌した。反応溶液にグルコサミン塩酸塩（８．０ｇ、３７ｍｍｏｌ）を添加し、さらに３０分攪拌した。反応溶液の溶媒を減圧濃縮することにより除去し、さらにジメチルホルムアミドを加え減圧濃縮することを三回繰り返すことで水を除去した。反応残留物をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（５．７ｍＬ、４１ｍｍｏｌ）とジフェニルフォスフォリルアジド（８．７ｍＬ、４１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応溶媒を減圧濃縮により除去し、残留物を逆相カラムクロマトグラフィー（ＷａｋｏｇｅｌＲ ５０Ｃ１８、２０ｍＬ、展開溶媒：水）で精製することにより標記化合物（５．６ｇ，収率５８％）を得た。
２−アジド酢酸エチル（５．３ｇ、４１ｍｍｏｌ）をエタノール（４１ｍＬ）に溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（４１ｍＬ）を添加した後、室温で１０分間攪拌した。反応溶液にグルコサミン塩酸塩（８．０ｇ、３７ｍｍｏｌ）を添加し、さらに３０分攪拌した。反応溶液の溶媒を減圧濃縮することにより除去し、さらにジメチルホルムアミドを加え減圧濃縮することを三回繰り返すことで水を除去した。反応残留物をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（５．７ｍＬ、４１ｍｍｏｌ）とジフェニルフォスフォリルアジド（８．７ｍＬ、４１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応溶媒を減圧濃縮により除去し、残留物を逆相カラムクロマトグラフィー（ＷａｋｏｇｅｌＲ ５０Ｃ１８、２０ｍＬ、展開溶媒：水）で精製することにより標記化合物（５．６ｇ，収率５８％）を得た。
（３）ウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートの合成
１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ５’−ＵＴＰ・３Ｎａ、５ｍＭ Ｎ−アジドアセチル−Ｄ−グルコサミン、５ｍＭ ５’−ＡＴＰ・３Ｎａ、２０μＭグルコース−１，６−二リン酸、３．７ユニット／ｍＬグルコキナーゼ、２．５ユニット／ｍＬ ＧｌｃＮＡｃリン酸ムターゼ、および１．１ユニット／ｍＬ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを含む溶液０．５ｍＬを調製し、３７℃で反応を行った。
１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ５’−ＵＴＰ・３Ｎａ、５ｍＭ Ｎ−アジドアセチル−Ｄ−グルコサミン、５ｍＭ ５’−ＡＴＰ・３Ｎａ、２０μＭグルコース−１，６−二リン酸、３．７ユニット／ｍＬグルコキナーゼ、２．５ユニット／ｍＬ ＧｌｃＮＡｃリン酸ムターゼ、および１．１ユニット／ｍＬ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを含む溶液０．５ｍＬを調製し、３７℃で反応を行った。
反応途中の反応液を適当量採取し、５分間煮沸後遠心分離してその上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供した。分離にはＹＭＣ社製 Hydrosphere C18HS-302カラム（φ４．６×１５０ｍｍ）を用い、カラム温度は４０℃で、溶出液としてアセトニトリルを２％（ｖ／ｖ）含む０．２Ｍトリエチルアミン−リン酸（ｐＨ６．０）を用いた。反応開始４時間後の反応液の分析を行った結果、４．３ｍＭのウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートの合成が確認された（対Ｎ−アジドアセチル−Ｄ−グルコサミンモル収率８６％）。
実施例６：乾燥酵母と酵素を用いたウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートの合成
４００ｍＭグルコース、１００ｍＭ Ｎ−アジドアセチル−Ｄ−グルコサミン、１００ｍＭ ５’−ＵＭＰ、２００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）、４．９ユニット／ｍＬグルコキナーゼ、３．３ユニット／ｍＬ ＧｌｃＮＡｃリン酸ムターゼ、および１．５ユニット／ｍＬ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを含む溶液５ｍＬを調製し、撹拌しながら２３℃で合成反応を実施した。反応開始１６，２４，４０，４８時間目に２Ｍのグルコース溶液を０．１ｍＬずつ反応液に添加した。経時的に反応液の一部を採取し、ＨＰＬＣ分析を行った。ウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートの合成量は反応開始から経時的に増加し、反応６４時間で５４．６ｍＭに達した（対Ｎ−アジドアセチル−Ｄ−グルコサミンモル収率５４．６％）。
４００ｍＭグルコース、１００ｍＭ Ｎ−アジドアセチル−Ｄ−グルコサミン、１００ｍＭ ５’−ＵＭＰ、２００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）、４．９ユニット／ｍＬグルコキナーゼ、３．３ユニット／ｍＬ ＧｌｃＮＡｃリン酸ムターゼ、および１．５ユニット／ｍＬ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを含む溶液５ｍＬを調製し、撹拌しながら２３℃で合成反応を実施した。反応開始１６，２４，４０，４８時間目に２Ｍのグルコース溶液を０．１ｍＬずつ反応液に添加した。経時的に反応液の一部を採取し、ＨＰＬＣ分析を行った。ウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートの合成量は反応開始から経時的に増加し、反応６４時間で５４．６ｍＭに達した（対Ｎ−アジドアセチル−Ｄ−グルコサミンモル収率５４．６％）。
Claims (12)
- 下記式（Ｉ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチド。
（Ｉ）
（式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を示す） - Ｂがウラシル−１−イルである、請求項１記載の化合物。
- 糖供与体として請求項１記載のアジド化アミノ糖ヌクレオチドを用い、糖転移酵素により受容体糖にＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル基又はＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニル基を転移することを特徴とする、Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル基又はＮ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニル基を含有するオリゴ糖の製造法。
- 請求項１記載のアジド化アミノ糖ヌクレオチド又はその誘導体を含有する糖転移酵素阻害剤。
- 誘導体が、下記式（ＩＩ）で表されるヌクレオシド５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４−カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル］ジホスフェート又は５’−［２−｛１Ｈ−［１，２，３］−４−カルボキシ−トリアゾリル｝アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル］ジホスフェートである、請求項３記載の阻害剤。
（ＩＩ）
（式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を示す） - Ｂがウラシル−１−イルである、請求項５記載の阻害剤。
- ヌクレオシド５’−トリリン酸とＮ−アジドアセチルグルコサミン又はＮ−アジドアセチルガラクトサミンから下記式（Ｉ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドを酵素的に製造するにあたり、酵素としてキナーゼ、ムターゼ及び糖ヌクレオチドピロホスホリラーゼから選ばれた２種以上の酵素を使用することを特徴とする、アジド化アミノ糖ヌクレオチドの酵素的製造法。
（Ｉ）
（式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を示す） - ウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）とＮ−アジドアセチルグルコサミンを基質とし、グルコキナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミンリン酸ムターゼ及びウリジン５’−ジリン酸Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼを酵素として用い、ウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートを合成する、請求項７記載の製造法。
- ウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）とＮ−アジドアセチルガラクトサミンを基質とし、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ及びウリジン５’−ジリン酸Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼを酵素として用い、ウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニル）ジホスフェートを合成する、請求項７記載の製造法。
- ヌクレオシド５’−モノリン酸とＮ−アジドアセチルグルコサミン又はＮ−アジドアセチルガラクトサミンから下記式（Ｉ）で表されるアジド化アミノ糖ヌクレオチドを酵素的に製造するにあたり、各種酵素源として酵母菌体、添加酵素としてキナーゼ、ムターゼ及び糖ヌクレオチドピロホスホリラーゼから選ばれた１種以上の酵素を使用することを特徴とする、アジド化アミノ糖ヌクレオチドの酵素的製造法。
（式中、Ｂは核酸塩基又はその誘導体を示す） - ウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）とＮ−アジドアセチルグルコサミンを基質とし、グルコキナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミンリン酸ムターゼ、ウリジン５’−ジリン酸Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ及び酵母菌体を用い、ウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−グルコサミニル）ジホスフェートを合成する、請求項１０記載の製造法。
- ウリジン５’−モノリン酸（ＵＭＰ）とＮ−アジドアセチルガラクトサミンを基質とし、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ、ウリジン５’−ジリン酸Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ及び酵母菌体を用い、ウリジン５’−（Ｎ−アジドアセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニル）ジホスフェートを合成する、請求項１０記載の製造法。
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007081031A1 (ja) * | 2006-01-16 | 2007-07-19 | Hokkaido University | 糖転移酵素阻害剤 |
| JP2009531289A (ja) * | 2006-02-10 | 2009-09-03 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | オリゴ糖によるタンパク質の修飾及び標識方法 |
| JP2010119320A (ja) * | 2008-11-18 | 2010-06-03 | Hokkaido Univ | 糖鎖提示担体の製造方法 |
| US8716033B2 (en) | 2006-02-10 | 2014-05-06 | Life Technologies Corporation | Oligosaccharide modification and labeling of proteins |
| WO2015112013A1 (en) * | 2014-01-24 | 2015-07-30 | Synaffix B.V. | Process for the attachment of a galnac moiety comprising a (hetero)aryl group to a glcnac moiety, and product obtained thereby |
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| CN114423773A (zh) * | 2019-07-25 | 2022-04-29 | 西纳福克斯股份有限公司 | 6-叠氮基-6-脱氧-2-n-乙酰基-己糖胺-核苷二磷酸的合成 |
-
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- 2005-03-28 JP JP2005091056A patent/JP4601060B2/ja active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6010011044, ＰＮＡＳ, 2003, １００, ９１１６−９１２１ * |
| JPN6010011047, Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．, 2004, １２６, ６−７ * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007081031A1 (ja) * | 2006-01-16 | 2007-07-19 | Hokkaido University | 糖転移酵素阻害剤 |
| JP2009531289A (ja) * | 2006-02-10 | 2009-09-03 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | オリゴ糖によるタンパク質の修飾及び標識方法 |
| US8716033B2 (en) | 2006-02-10 | 2014-05-06 | Life Technologies Corporation | Oligosaccharide modification and labeling of proteins |
| US8785212B2 (en) | 2006-02-10 | 2014-07-22 | Life Technologies Corporation | Oligosaccharide modification and labeling of proteins |
| US9645140B2 (en) | 2006-02-10 | 2017-05-09 | Life Technologies Corporation | Labeling and detection of post translationally modified proteins |
| US10676771B2 (en) | 2006-02-10 | 2020-06-09 | Life Technologies Corporation | Oligosaccharide modification and labeling of proteins |
| JP2010119320A (ja) * | 2008-11-18 | 2010-06-03 | Hokkaido Univ | 糖鎖提示担体の製造方法 |
| WO2015112013A1 (en) * | 2014-01-24 | 2015-07-30 | Synaffix B.V. | Process for the attachment of a galnac moiety comprising a (hetero)aryl group to a glcnac moiety, and product obtained thereby |
| US10266502B2 (en) | 2014-01-24 | 2019-04-23 | Synaffix B.V. | Process for the cycloaddition of a halogenated 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne |
| US11168085B2 (en) | 2014-01-24 | 2021-11-09 | Synaffix B.V. | Process for the cycloaddition of a hetero(aryl) 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne |
| CN114423773A (zh) * | 2019-07-25 | 2022-04-29 | 西纳福克斯股份有限公司 | 6-叠氮基-6-脱氧-2-n-乙酰基-己糖胺-核苷二磷酸的合成 |
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