DE3834877A1 - Neue saccharide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung - Google Patents
Neue saccharide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Saccharide, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende
pharmazeutische Zubereitungen und ihre Verwendung als Pharmazeutika.
Die Erfindung betrifft insbesondere neue Saccharide der Formel
worin entweder R₃ für Fluor und R₄ für eine Gruppe der Formel Z-R₅ oder R₃ für eine Gruppe
der Formel W-R₆ und R₄ für Fluor stehen, W, X, Y und Z gleich oder verschieden sind und
jeweils für Sauerstoff oder die Iminogruppe stehen, wobei jedoch, wenn R₃ für Fluor steht, X
Sauerstoff bedeutet und, wenn R₄ für Fluor steht, Y Sauerstoff bedeutet, und R₁, R₂, R₅ und
R₆ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe
stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, Verfahren zu ihrer Herstellung
und ihre Verwendung.
Erfindungsgemäß gelangt man zu den Verbindungen der Formel I, indem man eine Verbindung
der Formel
worin X, R₁ und R₃ obige Bedeutung besitzen und U für Uridin steht, mit einer Verbindung der
Formel
worin Y, R₂ und R₄ obige Bedeutung besitzen, enzymatisch kondensiert und die so erhaltenen
Verbindungen in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze gewinnt.
Die enzymatische Kondensation wird beispielsweise in einem gepufferten System, z. B. im
Tris-Puffer bei pH 7 und bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur, z. B. bei 30°C,
durchgeführt. Als Enzymextrakt kann eine aus gramnegativen Bakterien, vorzugsweise aus
E. coli-Stämmen (Raetz, J. Biol. Chem. 259/4852 [1984]) erhaltene Präparation eingesetzt
werden. Bevorzugt sind Stämme, die durch genetische Manipulation zur Überproduktion des
gewünschten Enzyms angeregt wurden. Aus dem Reaktionsgemisch können die
Endprodukte nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden.
R₁, R₂, R₅ und R₆ sind gleich oder verschieden, vorzugsweise gleich, und bedeuten eine
Acylgruppe mit beispielsweise 4 bis 20, vorzugsweise 12 bis 16 und insbesondere 14 Kohlenstoffatomen,
die in der 3-Position durch OH oder eine Acyloxygruppe, wie sie oben
definiert ist, substituiert sein kann, wobei das C-3-Atom R- oder S-konfiguriert ist. In den
Verbindungen der Formel I können daher R₁, R₂, R₅ und R₆ in achiraler Form, in R-, S- oder
racemischer Form vorliegen. Dies gilt auch für die Verbindungen der Formeln II und III. Bei
den in der Erfindung beschriebenen Reaktionen bleibt die Konfiguration während des Reaktionsablaufs
unverändert, d. h., ausgehend von R- bzw. S- oder racemischen Ausgangsprodukten,
erhält man die entsprechenden R- bzw. S- oder racemischen Endverbindungen.
Die Verbindungen der Formel I werden bevorzugt als Säureadditionssalze gewonnen, wobei
als Gegenion zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit bevorzugt hydrophile basische Verbindungen,
beispielsweise Tris(hydroxymethy)-aminomethan oder L-Lysin, verwendet werden.
Die Verbindungen der Formel II können aus den Verbindungen der Formel III durch Umsetzung
mit aktiviertem Uridin-5′-monophosphat nach an sich bekannten Methoden hergestellt
werden.
Die Verbindungen der Formel III, worin R₄ für eine Gruppe der Formel Z-R₅ steht, sind
bekannt. Die Verbindungen der Formel III, worin R₄ für Fluor steht, sind neu und bilden ebenfalls
einen Teil der Erfindung.
Die Verbindungen der Formel
worin R₂ obige Bedeutung besitzt, können erhalten werden, indem man Verbindungen der Formel
worin R und R′ für Schutzgruppen stehen, acyliert und anschließend die vorhandenen
Schutzgruppen abspaltet.
Dieses Verfahren kann beispielsweise ausgeführt werden, indem man eine Verbindung der
Formel IIIb in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z. B. in einem
Halogenkohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid, gemeinsam mit dem Acylierungsmittel,
gegebenenfalls unter Zusatz von Dicyclohexylcarbodiimid und 4-Dimethylaminopyridin, löst
und bei tiefer Temperatur, z. B. bei etwa 4°C, reagieren läßt. Aus dem Reaktionsgemisch
kann das Reaktionsprodukt nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls
gereinigt werden. Anschließend werden die vorhandenen Schutzgruppen in bekannter Weise
abgespaltet.
Als Schutzgruppen können die in der Saccharidchemie allgemein üblichen Schutzgruppen
verwendet werden. Beispielsweise können beide R zusammen mit Benzyliden- oder die
Isopropylidengruppe bedeuten. Auch als Schutzgruppen des Phosphatrestes können
bekannte Schutzgruppen eingesetzt werden, z. B. die Benzylgruppe.
Die Ausgangsverbindungen der Formel IIIb sind neu und können nach folgendem Reaktionsschema
erhalten werden:
In diesem Reaktionsschema bedeuten:
Ac = Acetyl
Bz = Benzyl
Bz = Benzyl
Die Verbindungen der Formel I zeigen eine Beeinflussung der unspezifischen antimikrobiellen
Resistenz. Diese Wirkung kann beispielsweise mit folgenden Testmethoden gezeigt werden:
Endotoxin katalysiert die Aktivierung eines Proenzyms im Limulus-Amoebozytenlysat.
Gemessen wird die Abspaltung von p-Nitroanilin aus einem farblosen Substrat. Das Ausmaß
dieser Abspaltung wird photometrisch erfaßt, wobei die Korrelation zwischen Absorption und
Endotoxinkonzentration (bzw. -Aktivität bei Analoga) im Bereich von 0,01-0,1 ng/ml Endotoxin
linear ist (Vergleich mit den Absorptionswerten eines Standard-Endotoxins). Von
jeder Probe (gelöst in pyrogenfreiem Aqua bidestillata sterilis) wird eine Verdünnungsreihe
1 : 10 hergestellt. Bei jeder Bestimmungsreihe wird zusätzlich eine Leerprobe mitgeführt.
100 µl Probe bzw. Standard oder Leerwert werden mit 100 µl Limulus-Amoebozytenlysat
versetzt. Die Reaktion wird nach 10 Minuten Inkubation bei 37°C mit 200 µl Substrat versetzt. Nach weiteren 3 Minuten Inkubation wird die Reaktion mit 200 µl 50% Essigsäure
gestoppt. Nach Aufschütteln der Probe wird in einem Spektralphotometer bei 405 nm die
Absorption gegen einen Leerwert gemessen. Die Ermittlung des Endotoxingehaltes (der Endotoxinaktivität)
der Probe als Endotoxin-Units (E. U.) erfolgt durch Berechnung einer
linearen Regression mit den Werten des Standardendotoxins.
Der Test erfaßt die Erzeugung eines Endotoxinschocks bzw. eines klinisch ähnlichen Zustandes
mit letalem Ausgang durch LPS-ähnliche Substanzen in Galactosamin-(GaIN)-sensibilisierten
Mäusen. Männliche C57 bl.-Mäuse (6 Tiere pro Kollektiv) erhalten simultan i. p.
8 mg GaIN, gelöst in 0,5 ml PBS, und 0,1 µg LPS aus Salmonella abortus equi (Sigma),
gelöst in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung. Diese Behandlung führt zum Tod aller Tiere
innerhalb von 6-12 Stunden (C. Galanos, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76 [1979]
5939-5943). Anstelle des LPS im Standardverfahren werden Prüfsubstanzen in
verschiedenen Dosierungen simultan mit GaIN bzw. auch vor oder nach der GaIN-Behandlung
einmal parenteral oder oral verabreicht. Die Beurteilung des Ergebnisses erfolgt
anhand eines Vergleiches der geringsten Dosis, die zum Tod aller Tiere einer Gruppe führt,
oder durch Berechnung einer LD₅₀ mittels der Spearman-Kärber-Methode.
Dieses Modell gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung in mikrobiell
infizierten, neutropenischen Mäusen. Zur Erzeugung einer Neutropenie erhalten je 20
weibliche B₆D₂F₁-Mäuse 1×200 mg/kg Körpergewicht Cyclophosphamid in 0,2 ml Aqua dest.
gelöst, s. c. am Tag 0 verabreicht. Am Tag 3 wird die Prüfsubstanz, soweit möglich, in
physiologischer NaCl-Lösung, ansonsten jedoch auch in anderer Weise gelöst (0,3 ml)
parenteral (vorrangig i. p.) oder auch peroral verabreicht. Die Infektion erfolgt am Tag 4
durch i. v. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,2 ml (Keimzahl
pro Maus, z. B. Pseudomonas aeruginosa Δ 12: 1×10⁵, E. coli Δ 120: 2×10⁶, Staph. aureus
Δ 113: 1×10⁶, Candida albicans Δ 124: 1×10⁴). Die Versuchstiere werden bis zum 10. Tag
nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Todesfälle registriert. Im
Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zu Standards werden folgende Parameter ausgewertet:
- a) Durchschnittliche Überlebensdauer
- b) Überlebensrate
Die Verbindungen der Formel I zeigten sowohl in den experimentellen Infektionen durch
gramnegative Keime (z. B. Pseudomonas und E. coli) wie auch bei Infektionen durch grampositive
Keime (z. B. Staph. aureus) bzw. Hefen (z. B. Candida albicans) nach parenteraler
Verabreichung hinsichtlich Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen,
verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.
Neutrophile (mindestens 95% Reinheit) werden mit der Prüfsubstanz in drei verschiedenen
Konzentrationen für 1 bis 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Freisetzung von Superoxidanionen durch die Zellen als Index für die Aktivierung wird dann als Superoxid Dismutase-
inhibierbare Reduktion von Cytochrom C gemessen. 1×10⁶ Neutrophile, mit
Testsubstanz vorbehandelt oder nicht, werden dem Cytochrom C (80 µMol) zugesetzt, das
Formylmethionylleucylphenylalanin (10-6 M) enthält. Die Kontrollen enthalten zusätzlich
50 µg Superoxiddismutase. Nach 15 Minuten Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch
Einbringen der Teströhrchen in ein Eisbad beendet. Sie werden dann schnell bei 400 Upm für
5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. Die Reduktion von Cytochrom C, die
proportional der Menge an freigesetztem Superoxidanion ist, wird photometrisch bei 550 nm
gemessen. Die Hemmwirkung der Prüfsubstanzen bei der PMN-Aktivierung durch LPS wird
wie beschrieben gemessen mit der Maßgabe, daß nach der Vorinkubation der Leukozyten
die Zellen weiterhin mit einer stimulierenden Konzentration von LPS inkubiert werden.
Das Prinzip des Tests beruht darauf, daß Partikel in einer Größenordnung von 200-250 A
(z. B. Kohlepartikel) aus dem Organsimus nur durch Phagozytose durch Makrophagen
eliminiert werden können. Bei intravenöser Verabreichung von Kohlepartikeln werden diese
durch Phagozytose der Makrophagen in Leber (Kupffersche Sternzellen) und Milz aus dem
Blutstrom eliminiert. Die Prüfung der RES-Aktivierung einer Substanz erfolgt durch einmalige
oder wiederholte Verabreichung als wäßrige Lösung oder als Suspension. Die für die Behandlung
vorgesehene Substanzmenge wird entweder in 4 täglichen Einzeldosen oder einmal
24 Stunden vor Testbeginn i. p. oder s. c. appliziert. Tuschesuspension mit einem
10%igen Gehalt an Gasruß wird mit einer 1%igen Gelatine-NaCl-Lösung auf einen Gehalt
von 16 mg Kohle/ml verdünnt. Jede Maus erhält 0,2 ml/20 g KG intravenös verabreicht. 3, 6,
9, 12 und 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung werden durch Punktion des
Orbital plexus 25 µl Blut entommen. Das Blut wird in 2 ml dest. Wasser hämolysiert. Die
Kohlekonzentration wird photometrisch bestimmt. Anschließend werden die Tiere getötet
und Leber und Milzgewichte bestimmt.
Das Modell der intrakutanen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten
Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Der Krankheitsverlauf ist prolongiert
und ermöglicht die Beobachtung des sequentiellen Auftretens mehrerer Parameter. Es
treten herpetische Läsionen an der Infektionsstelle auf, diese ulcerieren, das
nächstgelegene Bein wird gelähmt und die Paralyse schreitet fort bis zum Tode. Immunkompetente
haarlose Mäuse werden am Tag 0 durch intrakutane Verabreichung des jeweiligen
Inoculums in einem Volumen von 0,025 ml (z. B. 1×10⁶ Plaque-bildende Einheiten Herpes
simplex Ty 1/Maus) intrakutan infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in
physiologischer NaCl (0,1 ml) i. p. verabreicht.
Das Modell der systemischen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten
Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Immunkompetente NMRI-Mäuse
werden am Tag 0 durch i. p. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von
0,1 ml (z. B. 1,3×10⁵ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) infiziert. Die
Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, subkutan verabreicht.
Die Versuchstiere werden bis zum 20. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die
auftretenden Läsionen, Paralysen und Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle
bzw. zum Standard werden folgende Parameter ausgewertet:
- a) Zahl der Mäuse mit Läsionen (kumulativ)
- b) Zahl der Mäuse mti Paralysen (kumulativ)
- c) Durchschnittliche Überlebensdauer
- d) Überlebensrate
Die Verbindungen der Formel I zeigten bei einmaliger Gabe zwischen Tag 0 bzw. -1 und +6
in der experimentellen HSV-1-Infektion nach i. p. bzw. subkutaner Verabreichung hinsichtlich
Krankheitsverlauf, Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen,
verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.
CSFs sind Mediatoren, die im Organismus infolge von Infektionen oder Toxineinwirkungen
produziert werden. Ihre biologischen Funktionen sind vielseitig, der Nachweis wird über die
Stimulation der Proliferation des haemopoietischen Systems, insbesondere der Knochenmarkszellen,
geführt. B₆D₂F₁-Mäusen werden die Prüfsubstanzen ein- oder mehrmals bis zu
einer Dosierung von 50 mg/kg parenteral oder oral verabreicht. In variablen Zeitabständen
danach wird von den Versuchstieren Serum gewonnen. Der Gehalt des Serums an CSF-Aktivität
wird in einem Zellkulturassay anhand der Proliferationsraten von Knochenmarkszellen
aus B₆D₂F₁-Mäusen gemessen (D. Metcalf, The hemopoietic colony stimulating factors,
1984, Elsevier; T. Mosmann, J. Immunol. Methods 65, 55-63 [1983]; L. M. Green et al., J.
Immunol. Methods 70, 257-268 [1984]). Verbindungen der Formel I induzieren in unterschiedlich
starkem Ausmaß CSFs in Mäusen, wobei auch zeitkinetische Unterschiede der
CSF-Aktivitäten beobachtet werden, die bei therapeutischem Einsatz vorteilhaft sein
können.
Der Nachweis, ob Substanzen Zellen zur IL-1-Produktion stimulieren können, wird primär in
Zellkulturassays geführt. Zunächst werden adhärente Makrophagen von Mäusen gewonnen,
sowohl residente als auch mit Thioglycolat "elicited macrophages". Diese werden in RPMI-
Medium bei verschiedenen zu prüfenden Substanzkonzentrationen 48 Stunden inkubiert und
die Zellüberstände gewonnen. Diese Überstände werden in Thymozytenkulturen von C₃H/
HeJ-Mäusen auf IL-1-Aktivität geprüft. Enthalten die Überstände von Makrophagen
produziertes IL-1, werden die Thymozyten während einer Inkubation von 72 Stunden zur
Proliferation angeregt, die durch Einbau von 3H-Thymidin im Szintillationszähler gemessen
wird (J. Gery et. al., J. Exp. Med. 136, 128-142 [1972]; J. Oppenheim et. al., Cellular
Immunol. 50, 71-81 [1980]). Substanzen der Formel I besitzen in unterschiedlichem Maße
(konzentrationsbezogen 0,1-50 µg/ml) die Fähigkeit, IL-1-Produktion in Makrophagen zu
induzieren.
Durch ein- bis dreimalige tägliche parenterale Verabreichung von LPS an Mäusen kann eine
sogenannte Toleranz erzeugt werden, die die Tiere gegen die nach Galactosamin-Gabe
letalen Effekte des LPS schützt (s. auch Endotoxinschock-Induktion in der Maus).
Mit den Verbindungen der Formel I konnte bereits nach einmaliger i. p. Verabreichung von je
0,25 mg/Maus eine derartige Toleranz ausgelöst werden. Vorbehandelte (tolerante) Mäuse
wurden zu verschiedenen Zeiten nach letzter Behandlung (1 Tag bis 3 Wochen) einem LPS-
Challenge in einer Dosis von 0,01 µg LPS+8 mg Galactosamin/Maus i. p. unterworfen. Es
überlebten insbesondere nach dreimaliger Verabreichung ein höherer Prozentsatz der Tiere
diese LPS-Belastung im Vergleich zu der unvorbehandelten Challenge-Kontrolle.
Weiter besitzen die Verbindungen der Formel I auch antiinflammatorische Wirkung, insbesondere
bei nichtspezifischen Entzündungen, bei immunologisch induzierten Entzündungen,
bei hypersensitiv induzierten Entzündungen und bei allergischen Reaktionen. Diese
Wirkung konnte durch verschiedene Testmethoden nachgewiesen werden, beispielsweise
durch Untersuchungen der Beeinflussung der Prostaglandinsynthese in vitro und in vivo. In
vitro wurde die Hemmung der LPS- und Zymosan-induzierten PGE₂- und PGF₁α-Freisetzung
untersucht. Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-Mϕ aus der NMRI-Maus wurden 24 Stunden
mit LPS bzw. Versuchssubstanz inkubiert. Nach Wechsel des Mediums und dreifachem Waschen
der Zellen wurden sie 2 Stunden mit LPS bzw. 1 Stunde mit Zymosan stimuliert. In
diesen Überständen wurden PGE₂ und PGF₁α nachgewiesen. Dabei zeigte sich eine Inhibierung
sowohl der durch LPS als auch der durch Zymosan stimulierten PGE₂-Produktion
der Zellen. In vivo wurde die Hemmung der LPS-induzierten PGE₂-Freisetzung von Maus-Mϕ
nach Vorbehandlung mit Prüfsubstanzen getestet. Jeweils 3 NMRI-Mäuse wurden am Tag 1,
2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz i. p. behandelt. Am Tag 4 erhielten diese Tiere und eine
Kontrollgruppe 1,5 ml Thioglycolat i. p., am Tag 7 wurden Peritoneal-Mϕ gewonnen und mit
LPS stimuliert. Es wurde eine deutliche Reduktion der PGE₂-Freisetzung im Vergleich zur
Kontrolle gefunden.
In einem weiteren Test wird die Beeinflussung der "procoagulant activity" (PCA) untersucht.
Nach Stimulation mit LPS synthetisieren humane Endothelzellen PCA, gemessen als
Verkürzung der Gerinnungszeit von Plasma. Ebenso verkürzten Mϕ nach LPS-Behandlung
sowie Peritonealleukozyten (gewonnen von Kaninchen) nach Auslösen der generellen
Shwartzman-Reaktion die Gerinnungszeit von recalzifiziertem Plasma. Zur Untersuchung der
Beeinflussung der durch LPS generierten PCA in vitro wurden Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-Mϕ
von B₆D₂F₁-Mäusen in einem Versuchsdesign a über Nacht mit LPS allein bzw. mit
LPS und Prüfsubstanz in DMEM Medium ohne fötales Kälberserum (FCS) behandelt. Im Versuchsdesign b wurden ebensolche Maus-Mϕ 24 Stunden lang mit LPS bzw. Prüfsubstanz
behandelt und nach Mediumwechsel über Nacht mit LPS stimuliert. Die Gerinnungszeit von
recalzifiziertem humanem Kontrollplasma nach Zugabe der mehrfach eingefrorenen und
ultrabeschallten Mϕ-Suspension wurde mittels Häkchenmethode gemessen. Zugabe von
Prüfsubstanz reduziert die durch LPS ausgelöste PCA unter jene des Kontrollwertes
(Verlängerung der Gerinnungszeit). Ebenso führt Vorbehandlung mit Prüfsubstanz zu einer
Reduzierung der PCA.
In vivo konnte die Beeinflussung der LPS-induzierten PCA von Maus-Peritonealleukozyten
nach Vorbehandlung der Tiere mit Prüfsubstanz folgendermaßen gezeigt werden:
B₆D₂F₁-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, intraperitoneal
verabreicht, behandelt. Zusätzlich erhielten alle Tiere am Tag 3 1,5 ml Thioglycolat i. p. Am
Tag 6 wurden Peritoneal-Mϕ gewonnen, die Probe jedes Tieres auf 1×10⁶/ml Zellen eingestellt
und 24 Stunden lang mit LPS in DMEM Medium ohne FCS stimuliert. Die PCA dieser
Zellen wurde, wie oben beschrieben, bestimmt. Vorbehandlung mit LPS bzw. mit
Prüfsubstanz erbringt eine deutlich verringerte PCA. Ein ähnlicher Befund konnte bei Vorversuchen
mit Kaninchen erhoben werden. Auch die PCA von peritonealen Kaninchenleukozyten
nach Auslösen der generellen Shwartzman-Reaktion konnte durch Vorbehandlung
mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz verringert werden.
Bei der Inhibierung der lokalen Shwartzman-Reaktion wurden je 3 Chinchilla-Kaninchen am
Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, jeweils i. v. bzw. i. p., vorbehandelt. Am Tag 6
erfolgte die intradermale Verabreichung von je 40, 20, 10, 5, 2,5 und 1,25 µg LPS pro
Hautstelle. Am Tag 7 wurde die Reaktion mit 2 µg LPS/kg i. v. ausgelöst. Die Bewertung der
Reaktion erfolgte semiquantitativ durch Beurteilung der Hautnekrosen. Es zeigte sich eine
fast vollständige Unterdrückung der Shwartzman-Reaktion durch LPS-Vorbehandlung bzw.
durch Vorbehandlung mit Prüfsubstanz.
Weiter besitzen die Verbindungen der Formel I auch Wirkung gegen Tumore, wie in den
folgenden Modellversuchen nachgewiesen werden konnte:
Zur Stimulierung von Mäuse-Knochenmarksmakrophagen werden Knochenmarkszellen von
BDF, Mäusen (ca. 10-13 Tage alt, mit CSF induziert) auf 1×10⁶ Zellen/ml in Medium
(RPMI 1640 + 1% Pen/Strep [5000 U/ml] + 1% Glutamin) verdünnt und in flachen
Mikrotiterplatten mit den Substanzlösungen im Konzentrationsbereich 100 µg bis 0,1 µg/ml
Endkonzentration (1 : Verdünnungsstufen) 4 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach
Filtration durch 0,45 µm Filter werden die Überstände bis zur Durchführung des TNF-Tests
bei -70°C eingefroren.
In Mikrotiterplatten werden L 929 Zellen zu 3×10⁴ Zellen/Näpfchen/100 µl über Nacht vorkultiviert
(37°C/5% CO₂), mit 100 µl der jeweiligen Probe versetzt und in Serie in 1 : 2 Stufen
weiterverdünnt. Nach Zugabe von 100 µl Actinomycin D (8 µg/ml Medium) in jedes
Näpfchen wird weitere 18 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach Entfernen der
Überstände wird der verbliebene Zellrasen mit Giemsa-Lösung gefärbt und die Absorption
bei 620 nm am Titertek Multiskan Autoreader (Flow) gemessen. Eine Einheit TNF ist definiert
als jene Aktivität, welche eine 50%ige Lyse der L 929 Targetzellen hervorruft.
B16F1-Melanom-Zellen werden 5 Tage in vitro gezüchtet. Einen Tag vor dem Versuch werden
die Zellen durch Aufbrechen der Monolayer in einzelne Zellen, unter Verwendung von
EDTA Trypsin, und Rückführung der Gesamtmenge in die gleiche Flasche mit neuem Medium
synchronisiert. Die Zellen werden gezählt und auf 10⁶/ml Medium eingestellt. 0,1 ml
Zellsuspension (10⁵ Zellen) werden intravenös in die Schwanzvene injiziert. 21 Tage danach
werden die Mäuse getötet und die Anzahl der Tumore in der Lunge bestimmt. Für diesen
Test werden B₆D₂F₁-Mäuse eingesetzt. Die Prüfsubstanz wird gelöst und an den Tagen -6,
-4 und -1 intraperitoneal injiziert. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen
der Formel I immunoprophylaktische Wirkung besitzen, die Anzahl der B16F1-Melanommetastasen
in der Lunge wurde verringert. Zur Überprüfung der therapeutischen Aktivität
wurden die Mäuse am 3., 6., 8., 10., 13. und 15. Tag nach der Tumorzelleninokulation
behandelt. Auch hier zeigte sich eine deutliche Reduktion der Metastasenbildung.
Die Verbindungen der Formel I können daher als Modulatoren der unspezifischen antimikrobiellen
Resistenz eingesetzt werden, zur systemischen Steigerung der Immunantwort
und zur Steigerung der unspezifischen Immunität. Verbindungen der Formel I sind somit
indiziert, z. B. für die Behandlung oder supportive Behandlung (d. h. zusammen mit anderen
spezifischen oder supportiven Therapieformen) von Zuständen bei herabgesetzter Immunantwort,
insbesondere bei herabgesetzter humoraler Immunantwort und/oder herabgesetzter
Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ und zur Behandlung von
Zuständen, bei welchen in sonstiger Weise eine Modulation der Immunantwort
wünschenswert ist. Im speziellen sind Verbindungen der Formel I indiziert zur Behandlung
oder supportiven Behandlung von Krankheitszuständen aufgrund idiopathischer Immundefizienzen
oder Immundefizienzen von der Art, wie sie bei geriatrischen Patienten
auftreten, oder bei Patienten mit schweren Verbrennungen oder generalisierten Infektionen.
Die Verbindungen der Formel I sind gleichfalls indiziert für die Behandlung oder supportive
Behandlung viraler Erkrankungen (wie disseminierten Herpes, progressive Pockenerkrankungen
und disseminierte Varizellenerkrankungen) sowie auch von Morbus Hodgkin und anderen
malignen Tumoren. Außerdem eignen sich die Verbindungen der Formel I für die
Prophylaxe des Endotoxinschocks, z. B. bei Unfällen, Verbrennungen und chirurgischen
Eingriffen, sowie als antiinflammatorische Mittel.
Für die genannten Anwendungen ist die indizierte parenterale Dosis zwischen ca. 0,1 mg
und ca. 70 mg, einmal verabreicht zur Erzielung eines Adjuvanseffektes, z. B. bei supportiver
Behandlung, oder täglich, wobei im letzteren Fall die Dosis auf 2 bis 4 Verabreichungen
pro Tag aufgeteilt oder in Retardform gegeben wird. Indizierte Dosiseinheiten für die
Verabreichung enthalten daher zwischen ca. 0,025 und ca. 35 mg Substanz der Formel I,
wenn tägliche Verabreichung, oder bis zu 70 mg Substanz der Formel I, wenn eine einzelne,
adjuvante Behandlung gewünscht wird.
Aufgrund ihrer immunmodulierenden Aktivität eignen sich Verbindungen der Formel I auch
als Adjuvantien für Vakzine. Für diese Verwendungsart ist eine indizierte Dosis zwischen 0,5
und 100 mg, vorzugsweise ca. 70 mg, verabreicht am Tage der Impfung mit einer
möglichen Wiederholung bei gleicher Dosis 2 bis 4 Wochen später.
Pharmazeutische Bereitungen, enthaltend die Verbindungen der Formel I, können gemäß
galenischen Standardverfahren, z. B. durch Vermischen mit konventionellen, pharmazeutisch
unbedenklichen Verdünnungsmitteln oder Trägersubstanzen, hergestellt werden
Solche Bereitungen können beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen hergestellt
werden und bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
Die Erfindung betrifft daher auch eine Methode zur Bekämpfung von Erkrankungen und Infektionen,
wie sie oben beschrieben sind, durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer
Verbindung der Formel I oder eines chemotherapeutisch verträglichen Salzes davon an den
Kranken, sowie die Verbindungen der Formel I zur Verwendung als chemotherapeutisches
Mittel, insbesondere als Immunmodulatoren, als antivirale Mittel und als antiinflammatorische
Mittel.
In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang jedoch in
keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. EDTA
bedeutet Ethylendiamintetraessigsäure, DTE steht für 1,4-Dithioerythrit, UDP für
Uridinsphosphat und Tris für Tris(hydroxymethyl)aminomethan.
20 Volumsteile einer 5-mM-Lösung von 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-
2-fluor-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH = 7)
mit 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE, 20 Volumsteile einer 5-mM-Lösung von
UDP-2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetrade-canoylamido]-
1-O-phosphono-α-D-glucopyranose im gleichen Puffer und 20 Volumsteile eines 100-mM-
Tris/HCl-Puffer (pH = 7) mit 2 MmM EDTA und 0,2 mM DTE werden mit 40 Volumsteilen eines
Enzymextrakts in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH = 7) mit 2 mM EDTA, 2 mM DTE und 0,1%
Triton X-100 bei 30° 24 Stunden umgesetzt, wobei die Endkonzentration an Triton X-100 auf
0,1% eingestellt wird.
Dieser Enzymextrakt kann folgendermaßen erhalten werden:
E. coli JB1104 wird in L-Broth angezüchtet (Vorkultur + 10 µg Ampicillin/ml bei 30° über
Nacht; Hauptkultur bei 30° im Schüttelinkubator, ausgehend von OD₅₅₀nm = 0,1 bis OD₅₅₀nm
= 1). Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 10 800 g geerntet (10 Minuten/4°), das
Pellet im 10-mM-Tris-Puffer, pH 7,0 + 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE suspendiert und erneut
zentrifugiert (6000 g, 10 Minuten/4°). Anschließend wird das Pellet im obigen Puffer
resuspendiert und mit Ultraschall aufgeschlossen (5×20 Sekunden/30 Sekunden Pause mit
120 Watt). Nach Zentrifugation (12 000 g, 10 Minuten/4°) zum Abtrennen der Zellreste wird
ultrazentrifugiert (150 000 g, 90 Minuten/7°). Die oberen 2/3 des Überstandes werden
gewonnen. Diese Fraktion wird einer fraktionierten Ammonsulfatfällung unterzogen. Als
Enzympräparation verwendet wird der Bereich von 10-40% Ammonsulfat. Das so gewonnene
Pellet wird im obigen Puffer aufgenommen.
Der Reaktionsansatz wird lyophilisiert, in etwa 1/3 des Ausgangsvolumens im Laufmittel für
nachfolgende Chromatographie auf Molekulargewichtstrennung (Sephadex LH20) gelöst
(Laufmittel: Pyridin/Essigsäure/Wasser = 98/1/1) und filtriert. Das Volumen der verwendeten
Säule ist etwa 20mal so groß wie das Probenauftragsvolumen. Die reinen Produktfraktionen
werden gesammelt, im Vakuum eingeengt, in pyrogenfreiem Wasser suspendiert und
lyophilisiert. Die lyophilisierte Probe wird in 45 ml Laufmittel A (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser
= 88/10/1/1) gelöst und über Kieselgel chromatographiert, wobei ein Gradient
von 1000 ml Laufmittel A auf 1000 ml Laufmittel B (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser
= 80/16/2/2) gefahren wird. Die reinen Produktfraktionen werden gesammelt, auf
ca. 5% Pyridin eingestellt, fast bis zur Trockne im Vakuum eingeengt und nach Aufnahme in
100 ml pyrogenfreiem Wasser lyophilisiert. Anschließend wird die Probe in 50 ml Lösung C
(Chloroform/Methanol = 2/1) gelöst und zweimal mit 50 ml 20 mM Phosphorsäure und
dreimal mit 50 ml einer Lösung D (Wasser/Methanol = 95/5) gewaschen. Die organische
Phase, die auch die Interphase beinhaltet, wird mit 5 ml Pyridin versetzt und fast bis zur
Trockne im Vakuum eingeengt. Nach Aufnahme in 100 ml pyrogenfreiem Wasser wird zur
wäßrigen Suspension die stöchiometrisch berechnete Menge L-Lysin (freie Base) zur Gewinnung
des Mono-L-Lysin-Salzes in Form einer wäßrigen 100 mM-Lösung zugegeben und
erneut lyophilisiert. Alle Rf-Werte werden auf Kieselgelplatten bestimmt.
Rf (Chloroform/Methanol/Wasser/Essigsäure = 25/15/4/2) = 0,6.
Rf (Chloroform/Methanol/Wasser/Essigsäure = 25/15/4/2) = 0,6.
Analog wie in Beispiel 1 beschrieben können auch folgende Verbindungen der Formel I
erhalten werden:
4,6 O-Benzyliden-2-deoxy-2-fluor-D-glucopyranose wird in trockenem Dichlormethan
gelöst (30-50 ml/g). Dazu fügt man 1,3 Äquivalente (R)-3-Benzyloxytetradecansäure und
eine Spatelspitze Steglich-Base. Man kühlt auf -10°, tropft eine Lösung von 1,3 Äquivalenten
Dicyclohexylcarbodiimid in trockenem Dichlormethan zu und läßt auf +4° erwärmen. Man
hält über Nacht bei +4°, filtriert dann ab, dampft ein und chromatographiert über Kieselgel
(Toluol/Essigester = 15/1).
Rf = 0,52 (in Toluol/Essigester = 4/1).
4,6-O-Benzyliden-3-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-deoxy-1-O-dibe-nzylphosphono-
2-fluor-β-D-glucopyranose wird in einem Tetrahydrofuran-Wassergemisch (9/1) gelöst
(ca. 400 ml/g Substanz). Man versetzt mit Pd/C (10% Pd) (ca. 300-400 mg/g) und hydriert
über Nacht. Nach dem Filtrieren und Einengen wird lyophilisiert. Dann löst man den
Rückstand in Methanol, setzt ein Äquivalent Tris(hydroxymethyl)aminomethan zu, beschallt
30 Minuten mit Ultraschall und zentrifugiert. Die überstehende klare Lösung wird eingedampft
und der Rückstand über RP-8 chromatographiert (Tetrahydrofuran/Wasser = 2/3).
Das Eluat wird mit einem weiteren Äquivalent Tris(hydroxymethyl)aminomethan versetzt und
dann lyophilisiert.
Analog wie in Beispiel 5 beschrieben, können auch folgende Verbindungen der Formel IIIa
erhalten werden:
Rf = 0,51 (Toluol/Essigester = 4/1).
[α] D = +24,2° (c = 1, Methanol).
Rf = 0,51 (Toluol/Essigester = 4/1).
[α] D = +43,0° (c = 1, Methanol).
Rf = 0,61 (Toluol/Essigester = 4/1).
[α] D = +17,6° (c = 1, Methanol).
Rf = 0,56 (Toluol/Essigester = 4/1).
[α] D = +14,3° (c = 1, Methanol).
Die benötigten Ausgangsprodukte können folgendermaßen erhalten werden:
Eine Lösung von 2-Deoxy-2-fluor-D-glucopyranose in der 10fachen Menge Dimethylformamid
versetzt man mit 2 Äquivalenten Benzaldehyddimethylacetal und einer
Spatelspitze p-Toluolsulfonsäuremonohydrat. Dann destilliert man am Rotavapor bei 55°
Badtemperatur langsam das Lösungsmittel weitgehend ab, nimmt den Rückstand in Dichlormethan
auf und extrahiert mit Bicarbonatlösung und anschließend mit NaCl-Lösung. Die
organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und abgedampft. Die Reinigung erfolgt
durch Chkromatographie über Kieselgel (Hexan/Essigester = 2/1).
Rf = 0,36 (Toluol/Essigester = 1/1).
Analog wie unter A) beschrieben, erhält man auch:
Rf = 0,44 (Toluol/Essigester = 1/1).
4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-2-fluor-D-mannopyranose wird in absolutem Tetrahydrofuran
(ca. 120 ml/g) gelöst und die Lösung auf -70° gekühlt. Dann tropft man unter Schutzgas 1,8
Äquivalente n-Butyllithium (1,6-m-Lösung in Hexan) zu, rührt kurz und tropft dann eine
Lösung von 1,5 Äquivalenten Phosphorsäurechloriddibenzylester in Benzol zu. Nach 30
Minuten wird mit Eisessig versetzt, bis ein pH von ca. 6 erreicht ist. Dann erwärmt man auf
Raumtemperatur und engt am Vakuum auf ca. 1/4 des Volumens ein. Man nimmt den
Rückstand in Dichlormethan auf und arbeitet auf übliche Weise auf. Zur Reinigung wird über
Kieselgel chromatographiert (Toluol/Essigester = 4/1).
Analog wie unter C) beschrieben, erhält man auch:
Rf = 0,47 (Toluol/Essigester = 1/1).
Rf = 0,43 (Toluol/Essigester = 1/1).
Claims (2)
1. Neue Saccharide der Formel
worin entweder R₃ für Fluor und R₄ für eine Gruppe der Formel Z-R₅ oder R₃ für eine Gruppe
der Formel W-R₆ und R₄ für Fluor stehen, W, X, Y und Z gleich oder verschieden sind und
jeweils für Sauerstoff oder die Iminogruppe stehen, wobei jedoch, wenn R₃ für Fluor steht, X
Sauerstoff bedeutet und, wenn R₄ für Fluor steht, Y Sauerstoff bedeutet, und R₁, R₂, R₅ und
R₆ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe
stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze.
2. Verfahren zur Herstellung neuer Saccharide der Formel
worin entweder R₃ für Fluor und R₄ für eine Gruppe der Formel Z-R₅ oder R₃ für eine Gruppe
der Formel W-R₆ und R₄ für Fluor stehen, W, X, Y und Z gleich oder verschieden sind und
jeweils für Sauerstoff oder die Iminogruppe stehen, wobei jedoch, wenn R₃ für Fluor steht, X
Sauerstoff bedeutet und, wenn R₄ für Fluor steht, Y Sauerstoff bedeutet, und R₁, R₂, R₅ und
R₆ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe
stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, daß
man eine Verbindung der Formel
worin X, R₁ und R₃ obige Bedeutung besitzen und U für Uridin steht, mit einer Verbindung der
Formel
worin Y, R₂ und R₄ obige Bedeutung besitzen, enzymatisch kondensiert und die so erhaltenen
Verbindungen in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze gewinnt.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19883834877 DE3834877A1 (de) | 1988-10-13 | 1988-10-13 | Neue saccharide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19883834877 DE3834877A1 (de) | 1988-10-13 | 1988-10-13 | Neue saccharide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3834877A1 true DE3834877A1 (de) | 1990-05-03 |
Family
ID=6365035
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE19883834877 Withdrawn DE3834877A1 (de) | 1988-10-13 | 1988-10-13 | Neue saccharide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE3834877A1 (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0437016A2 (de) * | 1989-12-11 | 1991-07-17 | Sankyo Company Limited | Lipid-A-Analoge und ihre immunoaktivierende und Antitumor-Wirkung |
EP1178051A2 (de) * | 2000-02-10 | 2002-02-06 | Mitsui Chemicals, Inc. | Verfahren zur selektiven herstellung eines 1-phosphoryliertem zuckerderivativ-anomers und verfahren zur herstellung von nukleosiden |
JP2002205996A (ja) * | 2000-02-10 | 2002-07-23 | Mitsui Chemicals Inc | 1−リン酸化糖誘導体のアノマーの選択的な製造法並びにヌクレオシドの製造法 |
-
1988
- 1988-10-13 DE DE19883834877 patent/DE3834877A1/de not_active Withdrawn
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP0437016A2 (de) * | 1989-12-11 | 1991-07-17 | Sankyo Company Limited | Lipid-A-Analoge und ihre immunoaktivierende und Antitumor-Wirkung |
EP0437016A3 (de) * | 1989-12-11 | 1991-07-24 | Sankyo Company Limited | Lipid-A-Analoge und ihre immunoaktivierende und Antitumor-Wirkung |
EP1178051A2 (de) * | 2000-02-10 | 2002-02-06 | Mitsui Chemicals, Inc. | Verfahren zur selektiven herstellung eines 1-phosphoryliertem zuckerderivativ-anomers und verfahren zur herstellung von nukleosiden |
JP2002205996A (ja) * | 2000-02-10 | 2002-07-23 | Mitsui Chemicals Inc | 1−リン酸化糖誘導体のアノマーの選択的な製造法並びにヌクレオシドの製造法 |
EP1178051A4 (de) * | 2000-02-10 | 2003-05-28 | Mitsui Chemicals Inc | Verfahren zur selektiven herstellung eines 1-phosphoryliertem zuckerderivativ-anomers und verfahren zur herstellung von nukleosiden |
US7038039B2 (en) | 2000-02-10 | 2006-05-02 | Mitsui Chemicals, Inc. | Process for selectively producing 1-phosphorylated sugar derivative anomer and process for producing nucleoside |
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