DE3621122A1 - Neue saccharide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Saccharide, Verfahren zur ihrer Herstellung, sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen und ihre Verwendung als Pharmazeutika.

Die Erfindung betrifft insbesondere neue Saccharide der Formel worin R′₁, R′₂, R′₃ und R′₄ gleich oder verschieden sind und jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen und W, X, Y und Z gleich oder verschieden sind und jeweils für Sauerstoff oder die Iminogruppe stehen, mit der Maßgabe, daß
a) mindestens einer der Substituenten R′₁, R′₂, R′₃ und R′₄eine Acylgruppe bedeutet und,
b) wenn Z und X für Imino, W und Y für Sauerstoff stehen,
α) R′₁ und R′₂ nicht gleichzeitig (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeuten, wenn R′₃ und R′₄ gleich sind und für (R)-3-Hydroxytetradecanoyl oder R′₄ für (R)-3-Dodecanoyloxytetradecanoyl und R′₃ für Tetradecanoyloxytetradecanoyl stehen,
β) R′₂ nicht Wasserstoff oder (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeutet, wenn R′₁ und R′₃ für Wasserstoff und R′₄ für (R)-3- Hydroxytetradecanoyl stehen, und
γ) R′₃ nicht die -(CO)₂ · CH₂ · (CHOH)₄ · CH₂OH-Gruppe bedeutet, wenn die übrigen Substituenten für Wasserstoff stehen,
in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Erfindungsgemäß gelangt man zu den Verbindungen der Formel worin X, Y, W und Z obige Bedeutung besitzen und R₁, R₂, R₃ und R₄ gleich oder verschieden sind und jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten R₁, R₂, R₃ und R₄ eine Acylgruppe bedeutet, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, indem man eine Verbindung der Formel worin W und Z obige Bedeutung besitzen, R″₃ und R″₄ die gleiche Bedeutung wie R₃ und R₄ außer Wasserstoff besitzen und U für Uridin steht, mit einer Verbindung der Formel worin Y und X obige Bedeutung besitzen und R″₁ und R″₂ die gleiche Bedeutung wie R₁ und R₂ besitzen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der beiden Substituenten für eine Acylgruppe steht und, wenn X oder Y für die Iminogruppe steht, der an der Iminogruppe hängende Substituent R″₁ oder R″₂ nicht Wasserstoff bedeutet, enzymatisch kondensiert und gewünschtenfalls die erhaltenen Verbindungen einer Verseifung unterwirft und so Verbindungen der Formel Ia erhält, worin falls X, Y, Z und/oder W für Sauerstoff stehenm R₁, R₂, R₃ und/oder R₄ Wasserstoff bedeuten oder gewünschtenfalls die erhaltenen Verbindungen einer Acylamidasereaktion unterwirft und so Verbindungen der Formel Ia erhält, worin, falls X, Y, Z und/oder W für die Iminogruppe stehen, R₁, R₂, R₃ und/oder R₄ Wasserstoff bedeuten, und die so erhaltenen Verbindungen in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze gewinnt.

Die enzymatische Kondensation wird beispielsweise in einem gepufferten System, z. B. im Tris-Puffer bei pH 7, und bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur, z. B. bei 30°C, durchgeführt. Als Enzymextrakt kann eine aus gramnegativen Bakterien, vorzugsweise aus E. coli-Stämmen (Raetz, J. Biol. Chem. 259/4852 [1984]) erhaltene Präparation eingesetzt werden. Bevorzugt sind Stämme, die durch genetische Manipulation zur Überproduktion des gewünschten Enzyms angeret wurden. Die eventuell anschließende Verseifung kann nach literaturbekannten Methoden, die Acylamidasereaktion analog wie von C.R. Verret et. al. in J. Biol. Chem. 257/10222(1982) beschrieben, durchgeführt werden. Aus dem Reaktionsgemisch können die Endprodukte nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden.

R₁, R₂, R₃ und R₄ sind gleich oder verschieden, vorzugsweise gleich, und bedeuten Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit beispielsweise 4 bis 20, vorzugsweise 12 bis 16 und insbesondere 14 Kohlenstoffatomen, die in der 3-Position durch OH, Acetoxy oder eine Acyloxygruppe, wie sie oben definiert ist, substituiert sein kann, wobei das C-3-Atom R- oder S-konfiguriert ist. In den Verbindungen der Formel Ia können daher R₁, R₂, R₃ und R₄ in achiraler Form, in R-, S- oder racemischer Form vorliegen. Dies gilt auch für die Verbindungen der Formeln II, III und IV. Bei den in der Erfindung beschriebenen Reaktionen bleibt die Konfiguration während des Reaktionsablaufs unverändert, d. h., ausgehend von R-, bzw. S- oder racemischen Ausgangsprodukten erhält man die entsprechenden R-, bzw. S- oder racemischen Endverbindungen.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel Ia, worin R₁, R₂, R₃ und R₄ für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen. Weiters bevorzugt sind Verbindungen der Ia, worin, wenn R₁, R₂, R₃ und/oder R₄ Wasserstoff bedeuten, Y, X, W und/oder Z für Sauerstoff steht.

Die Verbindung der Formel Ia werden bevorzugt als Säureadditionssalze gewonnen, wobei als Gegenion zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit bevorzugt hydrophile basische Verbindungen, beispielsweise Tris(hydroxymethyl)aminomethan oder L-Lysin, verwendet werden.

Die Verbindungen der Formel II können aus den Verbindungen der Formel III durch Umsetzung mit aktiviertem Uridin-5′-monophosphat nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden.

Die Verbindungen der Formel III, worin
a) Y für O und X für NH stehen, wobei jedoch,
α) wenn R″₁ (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeutet, R″₂ nicht für (R)-3-Hydroxytetradecanoyl oder (R)-3-Hexadecanoyloxytetradecanoyl steht,
β) R″₁ nicht für Wasserstoff steht, und
γ) R″₁ und R″₂ nicht gleichzeitig für die Acetyl- oder -CO · (CH₂)₁₀ · CH₃-Gruppe stehen,
b) Y für O und X für O und
c) Y für NH und X für O stehen,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der beiden Substituenten für eine Acylgruppe steht und, wenn X oder Y die Iminogruppe bedeutet, der an der Iminogruppe hängende Substituent R″₁ oder R″₂ nicht für Wasserstoff steht, sind neu und bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.

Verbindungen der Formel III können erhalten werden, indem man
a) zur Herstellung von Verbindungen der Formel worin R″₁ und R″₂ obige Bedeutung besitzen und entweder X′ und Y′ für Sauerstoff oder Y′ für die Iminogruppe und X′ für Sauerstoff stehen,in Verbindungen der Formel worin R″₁, R″₂, X′ und Y′ obige Bedeutung besitzen und R für eine Schutzgruppe steht, die ungeschützte OH-Gruppe zu einem geschützten Phosphatester umsetzt oder
b) zur Herstellung von Verbindungen der Formel worin R″₁ und R″₂ obige Bedeutung besitzen, Verbindungen der Formel worin R″₂ und R obige Bedeutung besitzen und R′ für eine Schutzgruppe steht, acyliert und anschließend die vorhandenen Schutzgruppen abspaltet.

Verfahren a) kann beispielsweise ausgeführt werden, indem man eine Verbindung der Formel IV in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z. B. in einem cyclischen Ether, wie Tetrahydrofuran, löst und bei tiefer Temperatur, beipielsweise bei -70°C, mit Butyllithium in einem aliphatischen Kohlenwasserstoff, z. B. in Hexan, versetzt und dann Dibenzylphosphorchloridat zugibt. Aus dem Reaktionsgemisch kann das Produkt nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die freien OH-Gruppen des Phosphatrestes sind geschützt, z. B. durch Benzyl. Die Abspaltung der Schutzgruppen kann nach bekannten Methoden ausgeführt werden. Beispielsweise wird eine Schutzgruppe wie üblich sauer abgespalten, z. B. mit einer wäßrigen Säure (Ionenaustauscher), oder hydrogenolytisch.

Das Verfahren b) kann beispielsweise ausgeführt werden, indem man eine Verbindung der Formel IIIc in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z. B. in einem Halogenkohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid, gemeinsam mit dem Acylierungsmittel, gegebenenfalls unter Zusatz von Dicyclohexylcarbodiimid und 4-Dimethylaminopyridin, löst und bei tiefer Temperatur, z. B. bei etwa 4°C, reagieren läßt. Aus dem Reaktionsgemisch kann das Reaktionsprodukt nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Anschließend werden die vorhandenen Schutzgruppen in bekannter Weise abgespalten.

Als Schutzgruppen können die in der Saccharidchemie allgemein üblichen Schutzgruppen verwendet werden. Beispielsweise können beide R zusammen die Benzyliden- oder die Isopropylidengruppe bedeuten. Auch als Schutzgruppen des Phosphatrestes können bekannte Schutzgruppen eingesetzt werden, z. B. die Benzylgruppe.

Die Ausgangsverbindungen der Formel IIIc sind neu und können nach folgendem Formelschema erhalten werden:

Die Ausgangsverbindungen der Formel IV können nach folgenden Reaktionsschemata erhalten werden, wobei an der jeweiligen Reaktion nichtteilnehmende OH-Gruppen gegebenenfalls geschützt sein können. In diesen Reaktionsschemata haben die Substituenten folgende Bedeutung:
R, R′ = Schutzgruppen
R₅ = beide R₅ sind gleich oder verschieden und haben die gleiche Bedeutung wie R₁, R₂, R₃ oder R₄
Ac = Acetylgruppe
TBDMS = tert. Butyldimethylsilyl

1. Herstellung von Verbindungen der Formel IVa

2. Herstellung von Verbindungen der Formel IVb

3. Herstellung von Verbindungen der Formel IVc

Die weiteren Ausgangsprodukte sind bekannt oder nach bekannten Methoden bzw. analog zu bekannten Methoden oder analog wie in den Beispielen beschrieben herstellbar.

Die Verbindungen der Formel Ia und III zeigen eine Beeinflussung der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz. Diese Wirkung kann beispielsweise mit folgenden Testmethoden gezeigt werden:

1. Bestimmung der endotoxischen Aktivität mittels Limulus-Amoebozytenlysat- Test
Endotoxin katalysiert die Aktivierung eines Proenzyms im Limulus- Amoebozytenlysat. Gemessen wird die Abspaltung von p-Nitroanilin aus einem farblosen Substrat. Das Ausmaß dieser Abspaltung wird photometrisch erfaßt, wobei die Korrelation zwischen Absorption und Endotoxikonzentration (bzw.-Aktivität bei Analoga) im Bereich von 0,01- 0,1 ng/ml Endotoxin linear ist (Vergleich mit den Absorptionswerten eines Standard-Endotoxins). Von jeder Probe (gelöst in pyrogenfreiem Aqua bidestillata sterilis) wird eine Verdünnungsreihe 1:10 hergestellt. Bei jeder Bestimmungsreihe wird zusätzlich eine Leerprobe mitgeführt. 100 µl Probe bzw. Standard oder Leerwert werden mit 100 µl Limulus-Amoebozytenlysat versetzt. Die Reaktion wird in 10 Minuten Inkubation bei 37°C mit 200 µl Substrat versetzt. Nach weiteren 3 Minuten Inkubation wird die Reaktion mit 200 µl 50% Essigsäure gestoppt. Nach Aufschütteln der Probe wird in einem Spektralphotometer bei 405 nm die Absorption gegen einen Leerwert gemessen. Die Ermittlung des Endotoxingehaltes (der Endotoxinaktivität) der Probe als Endotoxin-Units (E.U.) erfolgt durch Berechnung einer linearen Regression mit den Werten des Standardendotoxins.

2. Endotoxinschock-Induktion in der Maus
Der Test erfaßt die Erzeugung eines Endotoxinschocks bzw. eines klinisch ähnlichen Zustandes mit letalem Ausgang durch LPS-ähnliche Substanzen in Galactosamin-(GalN)-sensibilisierten Mäusen. Männliche C57 bl.-Mäuse (6 Tiere pro Kollektiv) erhalten simultan i.p. 8 mg GalN, gelöst in 0,5 ml PBS, und 0,1 µg PLS aus Salmonella abortus equi (Sigma), gelöst in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung. Diese Behandlung führt zum Tod aller Tiere innerhalb von 6-12 Stunden (C Galanos, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76 (1979) 5939-5943). Anstelle des LPS im Standardverfahren werden Prüfsubstanzen in verschiedenen Dosierungen simultan mit GalN bzw. auch vor oder nach der GalN-Behandlung einmal parenteral oder oral verabreicht. Die Beurteilung des Ergebnisses erfolgt anhand eines Vergleiches der geringsten Dosis, die zum Tod aller Tiere einer Gruppe führt, oder durch Berechnung einer LD₅₀ mittels der Spearman-Kärber-Methode.

3. Mikrobielle Septikämie in der neutropenischen Maus:
Dieses Modell gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung in mikrobiell infizierten, neutropenischen Mäusen. Zur Erzeugung einer Neutropenie erhalten je 20 weibliche B₆D₂F₁-Mäuse 1 × 200 mg/kg Körpergewicht Cyclophosphamid in 0,2 ml Aqua dest. gelöst, s.c. am Tag 0 verabreicht. Am Tag 3 wird die Prüfsubstanz, soweit möglich, in physiologischer NaCl-Lösung, ansonsten jedoch auch in anderer Weise gelöst (0,3 ml) parenteral (vorrangig i.p.) oder auch peroral verabreicht. Die Infektion erfolgt am Tag 4 durch i.v. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,2 ml (Keimzahl pro Maus z. B. Pseudomonas aeruginosa Δ 12 : 1 × 10⁵, E. coli Δ 120 : 2 × 10⁶, Staph. aureus Δ 113 : 1 × 10⁶, Candida albicans Δ 124 : 1 × 10⁴). Die Versuchstiere werden bis zum 10. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zu Standards werden folgende Parameter ausgewertet:
a) Durchschnittliche Überlebensdauer
b) Überlebensrate
Die Verbindungen der Formeln Ia und III zeigen sowohl in den experimentellen Infektionen durch gramnegative Keime (z. B. Pseudomonas und E.coli) wie auch bei Infektionen durch grampositive Keime (z. B. Staph. aureus) bzw. Hefen (z. B. Candida albicans) nach parenteraler Verabreichung hinsichtlich Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

4. Aktivierung von humanen Blutneutrophilen Oxydationsmetabolismus:
Neutrophile (mindestens 95% Reinheit) werden mit der Prüfsubstanz in drei verschiedenen Konzentrationen für 1 bis 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Freisetzung von Superoxidanionen durch die Zellen als Index für die Aktivierung wird dann als Superoxid Dismutase-inhibierbare Reduktion von Cytochrom C gemessen. 1 × 10⁶ Neutrophile, mit Testsubstanz vorbehandelt oder nicht, werden dem Cytochrom C (80 µMol) zugesetzt, das Formylmethionylleucylphenylalanin (10^-6 M) enthält. Die Kontrollen enthalten zusätzlich 50 µg Superoxiddismutase. Nach 15 Minuten Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch Einbringen der Teströhrchen in ein Eisbad beendet. Sie werden dann schnell bei 400 xg für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. Die Reduktion von Cytochrom C, die proportional der Menge an freigesetztem Superoxidanion ist, wird photometrisch bei 550 nm gemessen. Die Hemmwirkung der Prüfsubstanzen bei der PMN-Aktivierung durch LPS wird wie beschrieben gemessen mit der Maßgabe, daß nach der Vorinkubation der Leukocyten die Zellen weiterhin mit einer stimulierenden Konzentration von LPS inkubiert werden.

5. Carbon Clearence Test
Das Prinzip des Tests beruht darauf, daß Partikel in einer Größenordnung von 200-250 Å (z. B. Kohlepartikel) aus dem Organismus nur durch Phagozytose durch Makrophagen eliminiert werden können. Bei intravenöser Verabreichung von Kohlepartikeln werden diese durch Phatozytose der Makrophagen in Leber (Kupffer'sche Sternzellen) und Milz aus dem Blutstrom eliminiert. Die Prüfung der RES-Aktivierung einer Substanz erfolgt durch einmalige oder wiederholte Verabreichung als wäßrige Lösung oder als Suspension. Die für die Behandlung vorgesehene Substanzmenge wird entweder in 4 täglichen Einzeldosen oder einmal 24 Stunden vor Testbeginn i.p. oder s.c. appliziert. Tuschesuspension mit einem 10%igen Gehalt an Gasruß wird mit einer 1%igen Gelatine-NaCl-Lösung auf einen Gehalt von 16 mg Kohle/ml verdünnt. Jede Maus erhält 0,2 ml/20 g KG intravenös verabreicht. 3, 6, 9, 12 und 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung werden durch Punktion des Orbital plexus 25 µl Blut entnommen. Das Blut wird in 2 ml dest. Wasser hämolysiert. Die Kohlekonzentration wird photometrisch bestimmt. Anschließend werden die Tiere getötet und Leber und Milzgewichte bestimmt.

6. Herpesinfektion der Maus:
Das Modell der intrakutanen Herpesinfektion gestattet der Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Der Krankheitsverlauf ist prolongiert und ermöglicht die Beobachtung des sequentiellen Auftretens mehrerer Parameter. Es treten herpetische Läsionen an der Infektionsstelle auf, diese ulcerieren, das nächstgelegene Bein wird gelähmt und die Paralyse schreitet fort bis zum Tode. Immunkompetente haarlose Mäuse werden am Tag 0 durch intrakutane Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,025 ml (z. B. 1 × 10⁶ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1 / Maus) intrakutan infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, (0,1 ml) i.p. verabreicht.

Das Modell der systemischen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Immunkompetente NMRI-Mäuse werden am Tag 0 durch i.p. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,1 ml (z. B. 1,3 × 10⁵ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1 / Maus) infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, subkutan verabreicht.

Die Versuchsttiere werden bis zum 20. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Läsionen, Paralysen und Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zum Standard werden folgende Parameter ausgewertet:
a) Zahl der Mäuse mit Läsionen (kumulativ)
b) Zahl der Mäuse mit Paralysen (kumulativ)
c) Durchschnittliche Überlebensdauer
d) Überlebensrate.
Die Verbindungen der Formel Ia und III zeigten bei einmaliger Gabe zwischen Tag 0 bzw. -1 und +6 in der experimentellen HSV-1-Infektion nach i.p. bzw. subkutaner Verabreichung hinsichtlich Krankheitsverlauf, Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

7. Induktion von CSF (Kolonie stimulierender Faktor):
CSFs sind Mediatoren, die im Organismus infolge von Infektionen oder Toxineinwirkungen produziert werden. Ihre biologischen Funktionen sind vielseitig, der Nachweis wird über die Stimulation der Proliferation des haemopoietischen Systems, insbesondere der Knochenmarkszellen, geführt. B₆D₂F₁ Mäusen werden die Prüfsubstanzen ein- oder mehrmals bis zu einer Dosierung von 50 mg/kg parenteral oder oral verabreicht. In variablen Zeitabständen danach wird von den Versuchstieren Serum gewonnen. Der Gehalt des Serums an CSF-Aktivität wird in einem Zellkulturassay anhand der Proliferationsraten von Knochenmarkszellen aus B₆D₂F₁ Mäusen gemessen [D. Metcalf, The hemopoietic colony stimulating factors, 1984, Elsevier; T. Mosmann, J. Immunol. Methods 65, 55-63 (1983); L.M. Green et al., J. Immunol. Methods 70, 257-268 (1984)]. Verbindungen der Formel Ia und III induzieren in unterschiedlich starkem Ausmaß CSFs in Mäusen, wobei auch zeitkinetische Unterschiede der CSF-Aktivitäten beobachtet werden, die bei therapeutischem Einsatz vorteilhaft sein können.

8. Induktion von Interleukin-1(IL-1)
Der Nachweis, ob Substanzen Zellen zur IL-1-Produktion stimulieren können, wird primär in Zellkulturassays geführt. Zunächst werden adhärente Makrophagen von Mäusen gewonnen, sowohl residente als auch mit Thioglycolat "elicited macrophages". Diese werden in RPMI-Medium bei verschiedenen zu prüfenden Substanzkonzentrationen 48 Stunden inkubiert und die Zellüberstände gewonnen. Diese Überstände werden in Thymozytenkulturen von C₃H/HeJ Mäusen auf IL-1-Aktivität geprüft. Enthalten die Überstände von Makrophagen produziertes IL-1, werden die Thymozyten während einer Inkubation von 72 Stunden zur Proliferation angeregt, die durch Einbau von 3H-Thymidin im Szintillationszähler gemessen wird [J. Gery et. al., J. Exp. Med. 136, 128-142 (1972); J. Oppenheim et. al., Cellular Immunol. 50, 71-81 (1980)]. Substanzen der Formeln Ia und III besitzen in unterschiedlichem Maße (konzentrationsbezogen 0,1-50 µg/ml) die Fähigkeit, IL-1-Produktion in Makrophagen zu induzieren.

9. Induktion einer LPS-(Endotoxin)-Toleranz (Letalitätstoleranz)
Durch ein- bis dreimalige tägliche parenterale Verabreichung von LPS an Mäuse kann eine sogenannte Toleranz erzeugt werden, die die Tiere gegen die nach Galactosamin-Gabe letalen Effekte des LPS schützt (s. auch Endotoxinschock-Induktion in der Maus).

Mit den Verbindungen der Formeln Ia und III konnte bereits nach einmaliger i.p. Verabreichung von je 0,25 mg/Maus eine derartige Toleranz ausgelöst werden. Vorbehandelte (tolerante) Mäuse wurden zu verschiedenen Zeiten nach letzter Behandlung (1 Tag bis 3 Wochen) einem PLS-Challenge in einer Dosis von 0,01 µg LPS + 8 mg Galactosamin/Maus i.p. unterworfen. Es überlebten insbesondere nach dreimaliger Verabreichung ein höherer Prozentsatz der Tiere diese LPS-Belastung im Vergleich zu der unvorbehandelten Challenge-Kontrolle.

Weiters besitzen die Verbindungen der Formel Ia und III auch antiinflammatorische Wirkung, insbesondere bei nichtspezifischen Entzündungen, bei immunologisch induzierten Entzündungen, bei hypersensitiv induzierten Entzündungen und bei allergischen Reaktionen. Diese Wirkung konnte durch verschiedene Testmethoden nachgewiesen werden, beispielsweise durch Untersuchungen der Beeinflussung der Prostaglandinsynthese in vitro und in vivo. In vitro wurde die Hemmung der LPS- und Zymosan-induzierten PGE₂- und PGF_{1 α}-Freisetzung untersucht. Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-Mø aus der NMRI-Maus wurden 24 Stunden mit LPS bzw. Versuchssubstanz inkubiert. Nach Wechsel des Mediums und dreifachem Waschen der Zellen wurden sie 2 Stunden mit LPS bzw. 1 Stunde mit Zymosan stimuliert. In diesen Überständen wurde PGE₂ und PGF_{1 α} nachgewiesen. Dabei zeigte sich eine Inhibierung sowohl der durch LPS als auch der durch Zymosan stimulierten PGE₂-Produktion der Zellen. In vivo wurde die Hemmung der LPs-induzierten PGE₂-Freisetzung von Maus-Mø nach Vorbehandlung mit Prüfsubstanzen getestet. Jeweils 3 NMRI-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz i.p. behandelt. Am Tag 4 erhielten diese Tiere und eine Kontrollgruppe 1,5 ml Thioglycolat i.p., am Tag 7 wurden Peritoneal-Mø gewonnen und mit LPS stimuliert. Es wurde eine deutliche Reduktion der PGE₂-Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle gefunden.

In einem weiteren Test wird die Beeinflussung der "procoagulant activity" (PCA) untersucht. Nach Stimulation mit LPS synthetisieren humane Endothelzellen PCA, gemessen als Verkürzung der Gerinnungszeit von Plasma. Ebenso verkürzen Mø nach LPS-Behandlung sowie Peritonealleukozyten (gewonnen von Kaninchen) nach Auslösung der generellen Shwartzman- Reaktion die Gerinnungszeit von recalzifiertem Plasma. Zur Untersuchung der Beeinflussung der durch LPS generierten PCA in vitro wurden Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-Mø von B₆D₂F₁-Mäusen in einem Versuchsdesign a über Nacht mit LPS allein bzw. mit LPS und Prüfsubstanz in DMEM Medium ohne fötales Kälberserum (FCS) behandelt. Im Versuchsdesign b wurden ebensolche Maus-Mø 24 Stunden lang mit LPS bzw. Prüfsubstanz behandelt und nach Mediumwechsel über Nacht mit LPS stimuliert. Die Gerinnungszeit von recalzifiziertem humanen Kontrollplasma nach Zugabe der mehrfach eingefrorenen und ultrabeschallten Mø-Suspension wurde mittels Häkchenmethode gemessen. Zugabe von Prüfsubstanz reduziert die durch LPS ausgelöste PCA unter jene des Kontrollwertes (Verlängerung der Gerinnungszeit). Ebenso führt Vorbehandlung mit Prüfsubstanz zu einer Reduzierung der PCA.

In vivo konnte die Beeinflussung der LPS-induzierten PCA von Maus- Peritonealleukozyten nach Vorbehandlung der Tiere mit Prüfsubstanz folgendermaßen gezeigt werden: B₆D₂F₁-Mäuse wurden am Tag 1, 2, und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, intraperitoneal verabreicht, behandelt. Zusätzlich erhielten alle Tiere am Tag 31,5 ml Thioglycolat i.p. Am Tag 6 wurden Peritoneal-Mø gewonnen, die Probe jedes Tieres auf 1 × 10⁶/ml Zellen eingestellt und 24 Stunden lang mit LPS in DMEM Medium ohne FCS stimuliert. Die PCA dieser Zellen wurde, wie oben beschrieben, bestimmt. Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz erbringt eine deutlich verringerte PCA. Ein ähnlicher Befund konnte bei Vorversuchen mit Kaninchen erhoben werden. Auch die PCA von peritonealen Kaninchenleukozyten nach Auslösen der generellen Shwartzman-Reaktion konnte durch Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz verringert werden.

Bei der Inhibierung der lokalen Shwartzman-Reaktion wurden je 3 Chinchilla Kaninchen am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, jeweils i.v. bzw. i.p., vorbehandelt. Am Tag 6 erfolgte die intradermale Verabreichung von je 40, 20, 10, 5, 2,5 und 1,25 µg LPS pro Hautstelle. Am Tag 7 wurde die Reaktion mit 2 µg LPS/kg i.v. ausgelöst. Die Bewertung der Reaktion erfolgte semiquantitativ durch Beurteilung der Hautnekrosen. Es zeigte sich eine fast vollständige Unterdrückung der Shwartzman-Reaktion durch LPS-Vorbehandlung bzw. durch Vorbehandlung mit Prüfsubstanz.

Weiters besitzen die Verbindungen der Formel Ia und III auch Wirkung gegen Tumore, wie in den folgenden Modellversuchen nachgewiesen werden konnte:

1. Untersuchung der Induktion von Tumor-Necrosis Faktor (TNF)
Zur Stimulierung von Mäuse-Knochenmarksmakrophagen werden Knochenmarkszellen von BDF₁ Mäusen (ca. 10-13 Tage alt, mit CSF induziert) auf 1 × 10⁶Zellen/ml in Medium [RPMI 1640 + 1% Pen/Strep (5000 U/ml) + 1% Glutamin] verdünnt und in flachen Mikrotiterplatten mit den Substanzlösungen im Konzentrationsbereich 100 µg bis 0,1 µg/ml Endkonzentration (1 : 10 Verdünnungsstufen) 4 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach Filtration durch 0,45 µm Filter werden die Überstände bis zur Durchführung des TNF-Tests bei -70°C eingefroren.

In Mikrotiterplatten werden L 929 Zellen zu 3 × 10⁴ Zellen/Näpfchen/ 100 µl über Nacht vorkultiviert (37°C/5% CO₂), mit 100 µl der jeweiligen Probe versetzt und in Serie in 1:2 Stufen weiterverdünnt. Nach Zugabe von 100 µl Actinomycin D (8 µg/ml Medium) in jedes Näpfchen wird weitere 18 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach Entfernen der Überstände wird der verbliebene Zellrasen mit Giemsa-Lösung gefärbt und die Absorption bei 620 nm am Titertek Multiskan Autoreader (Flow) gemessen. Eine Einheit TNF ist definiert als jene Aktivität, welche eine 50%ige Lyse der L 929 Targetzellen hervorruft.

2. B16F1 Melanom Test:
B16F1 Melanom Zellen werden 5 Tage in vitro gezüchtet. Einen Tag vor dem Versuch werden die Zellen durch Aufbrechen der Monolayer in einzelne Zellen, unter Verwendung von EDTA Trypsin, und Rückführung der Gesamtmenge in die gleiche Flasche mit neuem Medium synchronisiert. Die Zellen werden gezählt und auf 10⁶/ml Medium eingestellt. 0,1 ml Zellsuspension (10⁵ Zellen) werden intravenös in die Schwanzvene injiziert. 21 Tage danach werden die Mäuse getötet und die Anzahl der Tumore in der Lunge bestimmt. Für diesen Test werden B₆D₂F₁ Mäuse eingesetzt. Die Prüfsubstanz wird gelöst und an den Tagen -6, -4, und -1 intraperitoneal injiziert. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen der Formel Ia und III immunoprophylaktische Wirkung besitzen, die Anzahl der B16F1 Melanommetastasen in der Lunge wurde verringert. Zur Überprüfung der therapeutischen Aktivität wurden die Mäuse am 3., 6., 8., 10., 13. und 15. Tag nach der Tumorzelleninokulation behandelt. Auch hier zeigte sich eine deutliche Reduktion der Metastasenbildung.

Die Verbindungen der Formeln Ia und III können daher als Modulatoren der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz eingesetzt werden, zur systemischen Steigerung der Immunantwort und zur Steigerung der unspezifischen Immunität. Verbindungen der Formeln Ia und III sind somit indiziert, z. B. für die Behandlung oder supportive Behandlung (d. h. zusammen mit anderen spezifischen oder supportiven Therapieformen) von Zuständen bei herabgesetzter Immunantwort, insbesondere bei herabgesetzter humoraler Immunantwort und/oder herabgesetzter Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ und zur Behandlung von Zuständen, bei welchen in sonstiger Weise eine Modulation der Immunantwort wünschenswert ist. Im speziellen sind Verbindungen der Formeln Ia und III indiziert zur Behandlung oder supportiven Behandlung von Krankheitszuständen aufgrund idiopathischer Immundefizienzen oder Immundefizienzen von der Art, wie sie bei geriatrischen Patienten auftreten, oder bei Patienten mit schweren Verbrennungen oder generalisierten Infektionen. Die Verbindungen der Formeln Ia und III sind gleichfalls indiziert für die Behandlung oder supportive Behandlung viraler Erkrankungen (wie disseminierten Herpes, progressive Pockenerkrankungen und disseminierte Varizellenerkrankungen) sowie auch von Morbus Hodgkin und anderen malignen Tumoren. Außerdem eignen sich die Verbindungen der Formeln Ia und III für die Prophylaxe des Endotoxinschocks, z. B. bei Unfällen, Verbrennungen und chirurgischen Eingriffen, sowie als antiinflammatorische Mittel.

Für die genannten Anwendungen ist die indizierte parenterale Dosis zwischen ca. 0,1 mg und ca. 70 mg, einmal verabreicht zur Erzielung eines Adjuvanseffektes, z. B. bei supportiver Behandlung, oder täglich, wobei im letzteren Fall die Dosis auf 2 bis 4 Verabreichungen pro Tag aufgeteilt oder in Retardform gegeben wird. Indizierte Dosiseinheiten für die Verabreichung enthalten daher zwischen ca. 0,025 und ca. 35 mg Substanz der Formel Ia oder III, wenn tägliche Verabreichung, oder bis zu 70 mg Substanz der Formel Ia oder III, wenn eine einzelne, adjuvante Behandlung gewünscht wird.

Aufgrund ihrer immunmodulierenden Aktivität eignen sich Verbindungen der Formeln Ia und III auch als Adjuvantien für Vakzine. Für diese Verwendungsart ist eine indifizierte Dosis zwischen0,5 und 100 mg, vorzugsweise ca. 70 mg, verabreicht am Tage der Impfung mit einer möglichen Wiederholung bei gleicher Dosis 2 bis 4 Wochen später.

Pharmazeutische Bereitungen, enthaltend die Verbindungen der Formel Ia oder III, können gemäß galenischen Standardverfahren, z. B. durch Vermischen mit konventionellen, pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln oder Trägersubstanzen hergestellt werden. Solche Bereitungen können beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen hergestellt werden und bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.

Die Erfindung betrifft daher auch eine Methode zur Bekämpfung von Erkrankungen und Infektionen, wie sie oben beschrieben sind, durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel Ia oder III oder eines chemotherapeutisch verträglichen Salzes davon an den Kranken, sowie die Verbindungen der Formel Ia und III zur Verwendung als chemotherapeutisches Mittel, insbesondere als Immunmodulatoren, als antivirale Mittel und als antiinflammatorische Mittel.

In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang jedoch in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. EDTA bedeutet Ethylendiamintetraessigsäure, DTE steht für 1,4-Dithioerythrit, UDP für Uridinphosphat und Tris für Tris(hydroxymethyl)aminomethan.

Beispiel 1: 6-O-[2-Deoxy-3-O[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- hydroxytetradecanoylamido]-β-D-glucopyranosyl]-2,3-di-O-[(R)-3- hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose:

2,03 mg UDP-2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose und 1,42 mg 2,3-Di-O[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose, beide als Tris-Salze, werden in 10 mM Tris-Puffer, pH 7, mit 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE gelöst und mit 60 µl Enzymextrakt bei 30° inkubiert.

Dieser Enzymextrakt kann folgendermaßen erhalten werden:
E. coli JB1104 wird in L-Broth angezüchtet (Vorkultur + 10 µg Ampicilin/ ml bei 30° über Nacht; Hauptkultur bei 30° im Schüttelinkubator, ausgehend von OD_{550 nm} = 0,1 bis OD_{550 nm} = 1). Die Zellen werden durch Zentifugation bei 10.800 g geerntet (10 Minuten/4°), das Pellet in 10 mM Tris-Puffer, pH 7 + 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE suspendiert und erneut zentrifugiert (6000 g, 10 Minuten/4°). Anschließend wird das Pellet in obigen Puffer resuspendiert und mit Ultraschall aufgeschlossen (5 × 20 Sekunden/30 Sekunden Pause mit 120 Watt).Nach Zentrifugation (12.000 g, 10 Minuten/4°) zum Abtrennen der Zellreste wird ultrazentrifugiert (150.00 g, 90 Minuten/7°). Die oberen 2/3 des Überstandes werden gewonnen. Diese Fraktion wird einer fraktionierten Ammonsulfatfällung unterzogen. Als Enzympräparation verwendet wird der Bereich von 10- 40% Ammonsulfat. Das so gewonnene Pellet wird in obigem Puffer aufgenommen.

Nach beendeter Reaktion (Reaktionskontrolle über Dünnschichtchromatographie) wird mit Zitronensäure auf pH 2 angesäuert und zentrifugiert. Das Pellet wird in Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser (65/15/5/2) aufgenommen und über Kieselgel mit dem gleichen Laufmittel chromatographiert. Die Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden gesammelt und eingedampft, bis keine organischen Lösungsmittel mehr vorhanden sind, und der Rest lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in Tetrahydrofuran/Wasser (8/2) gelöst und über einen Kationenaustauscher in der Tris-Form in diesem Lösungsmittel in das Tris-Salz überführt, das Tetrahydrofuran abrotiert und der Rückstand lyophilisiert. Alls Rf-Werte werden auf Kieselgelplatten bestimmt.

Rf (in Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/25/5/5) = 0,48

Beispiel 2: 6-O-[2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- hydroxytetradecanoylamido]-β-D-glucopyranosyl]-2-deoxy-3-O-[(S)-3- hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono- α-D-glucopyranose:

20 Volumsteile einer 5 mM Lösung von 2-Deoxy-3-O-[(S)-3- hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono- α-D-glucopyranose in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH=7) mit 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE, 20 Volumsteile einer 5 mM Lösung von UDP-2-Deoxy-3-O[(R)-3- hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono- α-D-glucopyranose im gleichen Puffer und 20 Volumsteile eines 100 mM Tris/HCl-Puffers (pH=7) mit 2 mM EDTA und 0,2 mM DTE werden mit 40 Volumsteilen einer Enzympräparation (Herstellung wie in Beispiel 1 beschrieben) in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH=7) mit 2 mM EDTA, 2 mM DTE und 0,1% Triton X-100 bei 30° 8 Stunden umgesetzt, wobei die Endkonzentration an Triton X-100 auf 0,1% eingestellt wird. Der Reaktionsansatz wird lyophilisiert, in etwa 1/3 des Ausgangsvolumens im Laufmittel für nachfolgende Chromatographie auf Molekulargewichtstrennung (Sephadex LH 20) gelöst (Laufmittel: Pyridin/Essigsäure/Wasser = 98/1/1) und filtriert. Das Volumen der verwendeten Säule ist etwa 20× so groß wie das Probenauftragsvolumen. Die reinen Produktfraktionen werden gesammelt, im Vakuum eingeengt, in pyrogenfreiem Wasser suspendiert und lyophilisiert. Nach der Lyophilisation wird Triton X-100 durch Digerieren mit Diethylether entfernt. Nach Zentrifugation wird das Pellet in einem Gemisch von Chloroform/Methanol (1/1) gelöst, filtriert und die Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Zur wäßrigen Suspension dieses Pellets wird die stöchiometrisch berechnete Menge L-Lysin (freie Base) zur Gewinnung des Mono-L-Lysin-Salzes in Form einer wäßrigen 100 mM Lösung zugegeben und erneut lyophilisiert.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/25/5/5) = 0,44

Beispiel 3: 6-O-[2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- hydroxytetradecanoylamido]-β-D-glucopyranosyl]-2-deoxy-3-O-[(R)-3- hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-2-[(R)-3- tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-α-D-glucopyranose:

Je 20 Volumsteile einer 5 mM Lösung von 2-Deoxy-3-O-[(R)-3- hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono- 2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]- α-D-glucopyranose in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH=7) mit 0,2 mM EDTA und 0,2 mM DTE, 20 Volumsteile einer 5 mM Lösung von UDP-2-Deoxy-3- O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O- phophono-α-D-glucopyranose im gleichen Puffer und 20 Volumsteile eines 100 mM Tris/HCl-Puffers (pH=7) mit 2 mM EDTA und 0,2 mM DTE werden mit 40 Volumsteilen Enzymextrakt (Herstellung wie in Beispiel 1 beschrieben) in 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH=7) mit 2 mM EDTA, 2 mM DTE und 0,1% Triton X-100 bei 30° 48 Stunden umsetzt, wobei die Endkonzentration an Triton X-100 auf 0,1% eingestellt wird. Der Reaktionsansatz wird lyophilisiert, mit Pyridin behandelt und filtriert, das Filtrat im Vakuum eingeengt und mit folgendem Laufmittel (Chloroform/Methanol/ Wasser/2-Phenethylpicoloniumbromid = 800/175/22,5/2,5) aus Kieselgel chromatographiert. Die reinen Produktfraktionen werden gesammelt, und durch Ausschütteln mit 20 mM H₃PO₄ in H₂O wird das als Ionenpaarbildner dienende 2-Phenethylpicoloniumbromid entfernt. Die organische Phase wird im Vakuum eingeengt, die stöchiometrisch berechnete Menge L-Lysin (freie Base) zur Gewinnung des mono-L-Lysin-Salzes in Form einer wäßrigen 100 mM Lösung zugegeben und lyophilisiert.

Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/25/5/5) = 0,53

Analog wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben, können auch folgende Verbindungen der Formel I erhalten werden, wobei je nach den eingesetzten Verbindungen der Formel II und III die Enzymmenge so gewählt wird, daß die Reaktion vorzugsweise in etwa 24 bis 48 Stunden abläuft::

Tabelle

R₁=R₂=R₃=R₄=(R)-3-Hydroxytetradecanoyl

Beispiel 10: 6-O-[2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- hydroxytetradecanoylamido]-β-D-glucopyranosyl]-2-deoxy-1-O-phosphono-3-O tetradecanoyl-2-tetradecanoylamido-α-D-glucopyranose:

Man verfährt analog wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben und erhält die Titelverbindung.
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/25/5/5) = 0,50

Beispiel 11: 6-O-[2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- hydroxytetradecanoylamido]-β-D-glucopyranosyl]-2-acetamido-2-deoxy-3-O- [(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose:

Man verfährt wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben und erhält die Titelverbindung.
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 65/25/5/5) = 0,32

Beispiel 12: 6-O-[2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-β-D- glucopyranosyl]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose:

5 mg 6-O-[2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- hydroxytetradecanoylamido]-β-D-glucopyranosyl]-2,3-di-O-[(R)-3 -hydroxytetradecanoyl]- 1-O-phosphono-α-D-glucopyranose werden in Chloroform/Methanol (1/1) gelöst und mit wäßrigem 25%igen Ammoniak (1/3 des Volumens) versetzt. und über Nacht stehen gelassen. Nach Reaktionsende wird eingedampft, der Rückstand mit Diethylether zur Entfernung der abgespaltenen Fettsäuren digeriert, der Niederschlag abgesaugt und mit Ether gewaschen. Der Rückstand wird mit Wasser und der berechneten Menge Tris zur Herstellung des Di-Trissalzes gelöst und lyophylisiert.
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 25/15/2/4) = 0,45

Beispiel 13: 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose: a) 4,6-O-Benzyliden-3-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D -glucopyranose:

Zu einer auf -10° gekühlten Lösung von 3,9 g 4,6-O-Benzyliden-2-[(R)-3- benzyloxytetradecanoylamido]- 2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D- glucopyranose, 2 g (R)-3-Benzyloxytetradecansäure und 50 mg 4-Dimethylaminopyridin in 20 ml Methylenchlorid werden 2 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Reaktionsgemisch über nacht bei 4° gehalten. Danach wird filtriert, das Filtrat eingedampft, der Rückstand in wenig Toluol/Essigester (8/2) aufgenommen und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch chromatographiert. Fp: 96-98°[α] = +33,3° (c = 1, Chloroform)
Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,5

b) 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- hydroxyteradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose:

4,2 g 4,6-O-Benzyliden-3-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D- glucopyranose werden in 900 ml Tetrahydrofuran/Wasser (85/15) gelöst und mit 1,5 g 10% Palladium auf Aktivkohle 2 Stunden bei 10 bar und 40° hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, das Tetrahydrofuran abgedampft und die wäßrige Suspension lyophilisiert.[α] = +28,5° (c = 0,2, Chlorophorm + 1 Tropfen Methanol)
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/20) = 0,56
Die weitere Reinigung kann folgendermaßen durchgeführt werden:

10 g 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- hydroxytetradecanoylamido)-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose und 1,7 g Tris in 150 ml Methanol werden 12 Minuten bei 45° in einem Ultraschallbad beschallt. Die Suspension wird zentrifugiert und anschließend wird der klare Überstand vom Pellet dekantiert. Zu dieser Lösung gibt man 1,7 g Tris (gelöst in 20 ml Methanol), impft die Lösung an und läßt bei Raumtemperatur kristallisieren. Man erhält das Di-Tris-Salz der Titelverbindung.

Die Mutterlauge wird eingedampft. Der Rückstand und das Pellet werden gemeinsam in einem Gemisch aus 300 ml Chloroform, 600 ml Methanol und 240 ml Wasser (pyrogenfrei) gelöst. Zu dieser Lösung gibt man weitere 300 ml Chloroform und 300 ml 0,1 N Salzsäure, schüttelt vorsichtig und läßt die Phasen trennen. Die Chloroformphase wird abgetrennt und eingedampft. Der Rückstand besteht aus verunreinigter 2-Deoxy-3-O-[(R)-3- hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono- α-D-glucopyranose.

Die so erhaltene 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(R)-3- hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose wird, wie oben beschrieben, mit Tris und Methanol im Ultraschallbad behandelt und zentrifugiert. Die Lösung wird auf eine Sephadex LH 20 Säule aufgegeben und mit Methanol eluiert. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Man erhält das Mono-Tris-Salz der Titelverbindung.

5,1 g dieses Mono-Tris-Salzes werden in 40 ml Methanol bei 45° im Ultraschallbad gelöst, eine Lösung von 0,74 g Tris in 10 ml Methanol zugegeben, beimpft und zunächst bei Raumtemperatur und dann bei 4° kristallisieren gelassen. Man erhält weiteres kristallines Di-Tris-Salz der Titelverbindung.

Der Rückstand der Mutterlauge und das Pellet der Zentrifugation können erneut einem Reinigungszyklus zugeführt werden.
Fp:183-185° (Zersetzung)[α] = +15° ((c = 1, Wasser)

Beispiel 14: 3-Deoxy-2-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-3-[(R)-3- hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose: a) 2-O-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]- 3-deoxy-1-O- dibenzylphosphono-4,6-O-isopropyliden-α-D-glucopyranose:

Zu einer auf -70° gekühlten Lösung von 4,85 g 2-O-[(R)-3- Benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-3-deoxy-4,6-O -isopropyliden-D-glucopyranose in 40 ml absolutem Tetrahydrofuran werden 8 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird bei dieser Temperatur eine Lösung von 3,8 g Dibenzylphosphorchloridat in 10 ml Benzol zugetropft. Es wird noch 10 Minuten bei -70° gerührt, 0,3 ml Essigsäure zugegeben und die Lösung auf ein Viertel ihres Volumens eingeengt. Die Lösung wird mit 200 ml Methylenchlorid verdünnt, mit 50 ml Wasser, 50 ml verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung und 50 ml Natriumchloridlösung extrahiert, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Toluol/Essigester = 7/3).
Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,58

b) 3-Deoxy-2-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-3-[(R)-3- hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D- glucopyranose:

Eine Lösung von 980 mg 2-O-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3- benzyloxytetradecanoylamido]-3-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-4,6-O-isopropyliden -α-D-glucopyranose in 100 ml Tetrahydrofuran wird etwa 1 Stunde mit 300 mg 10% Palladium auf Aktivkohle bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, Wasser (10 ml) und Dowex AG50WX8 H⁺ zugegeben und das Gemisch bis zur vollständigen Abspaltung der Isopropylidengruppe bei Raumtemperatur gerührt. Der Ionentauscher wird abfiltriert, die Lösung mit Tris neutralisiert und Tetrahydrofuran und Wasser am Rotavapor abgedampft. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und über Sephadex LH 20 chromatographiert.
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/20) = 0,65 Beispiel 15:

2,3-Di-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-α-D- glucopyranose: a) 4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-1-O- dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose

Zu einer auf -70° gekühlten Lösung von 1 g 4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O- [(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-D-glucopyranose in 10 ml absolutem Tetrahydrofuran werden 0,9 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird bei dieser Temperatur eine Lösung von 420 mg Dibenzylphosphorchloridat in 4 ml Benzol zugetropft. Es wird noch 10 Minuten bei -70° gerührt, mit Essigsäure neutralisiert und die Lösung eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Kieselgel, Hexan/Toluol/Essigester = 4/4/1).
Rf (Toluol/Essigester = 6/1) = 0,65

b) 2,3-Di-O[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-α-D- glucopyranose

230 mg 4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-1-O-di- benzylphosphono-α-D-glucopyranose werden in Tetrahydrofuran/Wasser (9/1) gelöst und mit 80 mg 10% Palladium auf Aktivkohle ca. 5 Stunden bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung mit Tris neutralisiert und eingedampft. Der Rückstand wird mit Methanol über Sephadex LH 20 chromatographiert.
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/2) = 0,65

Beispiel 16: 2-Deoxy-3-O-[(S)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3- hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose: a) 4,6-O-Benzyliden-3-O-[(S)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-[(S)-3- benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy- 1-O-dibenzylphosphono-α-D- glucopyranose:

Man verfährt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben und erhält die Titelverbindung.
Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,44

b) 2-Deoxy-3-O-[(S)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3- hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D- glucopyranose:

Man verfährt analog wie in Beispiel 13b) beschrieben und erhält die Titelverbindung mit einem Fp: 150-200° (Zers.)
Rf (Methylenchlorid/Methanol/Ammoniak = 1/1/1; untere Phase) = 0,5

Beispiel 17: 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-2- [(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-α-D-glucopyranose: a) 4,6-O-Benzyliden-3-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-deoxy-1-O-di- benzylphosphono-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-α-D- glucopyranose:

Man verfährt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben und erhält die Titelverbindung mit einem Fp: 82-95°.[α] = +24,1° (c = 1, Chloroform)
Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,7

b) 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono-2-[(R)-3- tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-α-D-glucopyranose:

Man verfährt analog wie in Beispiel 21b) beschrieben und erhält die Titelverbindung.[α] = +14,3° (c = 1, Tetrahydrofuran/Pyridin)
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 80/25/5/5) = 0,35 Beispiel 18:

2-Deoxy-1-O-phosphono-3-O-tetradecanoyl-2-tetradecanoylamido- α-D-glucopyranose: a) 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-3-O-tetradecanoyl-2- tetradecanoylamido-α-D- glucopyranose:

Man verfährt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben, unter Verwendung von Tetradecansäure und mit Toluol/Essigester (4/1) als Lösungsmittelgemisch, und erhält die Titelverbindung vom Fp: 123-129°
Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,6

b) 2-Deoxy-1-O-phosphono-3-O-tetradecanoyl-2-tetradecanoylamido-α-D- glucopyranose:

Man verfährt analog wie in Beispiel 21b) beschrieben und erhält die Titelverbindung.
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/20) = 0,65

Beispiel 19: 2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono- 3-O-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-α-D-glucopyranose: a) 4,6-O-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1-O- dibenzylphosphono-3-O-[(R)-3- tetradecanoyloxytetradecanoyl]-α-D- glucopyranose:

Man verfährt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben, unter Verwendung von (R)-3-Tetradecanoyloxytetradecansäure und mit Toluol/Essigester (4/1) als Lösungsmittelgemisch, und erhält die Titelverbindung mit einem Fp: 89-90°.[α] = +30,9° (c = 1, Chloroform/Methanol = 1/1)
Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,5

b) 2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-3-O-[(R)- 3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-α-D-glucopyranose:

Man verfährt analog wie in Beispiel 21b) beschrieben. Das Lyophilisat wird in Methanol gelöst und mit dem gleichen Lösungsmittel über Sephadex LH 20 chromotographiet.
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 80/25/5/5) = 0,32

Beispiel 20: 2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono- 3-O-tetradecanoyl-α-D-glucopyranose: a) 4,6-O-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1-O- dibenzylphosphono-3-O-tetradecanoyl-α-D-glucopyranose:

Man verfährt analog wie in Beispiel 13a) beschrieben, unter Verwendung von Tetradecansäur und Toluol/Essigester (3/1) als Lösungsmittelgemisch, und erhält die Titelverbindung mit einem Fp: 125.5-126.5°.
Rf (Toluol/Essigester = 3/2) = 0,6

b) 2-Deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-3-O- tetradecanoyl-α-D-glucopyranose:

354 mg 4,6-O-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy- 1-O-dibenzylphosphono-3-O-tetradecanoyl-α-D-glucopyranose werden in 30 ml Tetrahydrofuran/Wasser (9/1) gelöst und mit 200 mg Palladium auf Aktivkohle 10 Stunden bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und die Lösung mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan auf pH 7,5 gebracht. Das Tetrahydrofuran wird am Rotavapor abgedampft und die wäßrige Lösung lyophilisiert. Das Lyophilisat wird noch zweimal mit Ether digeriert und dann getrocknet.
Rf(Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/20) = 0,6 Beispiel 21:

2-Acetamido-2-deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O- phosphono-α-D-glucopyranose: a) 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-3-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2- deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α- D-glucopyranose.

Eine Lösung von 3,55 g 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-2-deoxy-1-O- dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose und 2,1 g (R)-3-Benzyloxytetradecansäure in 15 ml Methylenchlorid wird auf 0° gekühlt und mit 1,32 g Dicyclohexylcarbodiimid und p-Dimethylaminopyridin versetzt. Nach 2 Stunden bei dieser Temperatur ist die Reaktion beendet. Das Reaktionsgemisch wird filtriert, eingedampft und einmal mit Methylenchlorid/Methanol (50/1) und ein zweites Mal mit Toluol/Essigester (2/1) über Kieselgel chromatographiert.
Rf (Chloroform/Methanol = 20/1) = 0,7

b) 2-Acetamido-2-deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-1-O-phosphono- α-D-glucopyranose:

2,08 g 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-3-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]- 2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose werden in Tetrahydrofuran/ Wasser (9/1) gelöst und 3 Stunden mit 1 g 10% Palladium auf Aktivkohle bei Normaldruck hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat erst eingedampft und dann lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in Methanol gelöst, mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan neutralisiert und mit Methanol über Sephadex LH 20 chromatographiert.[α) = +43,3° (c = 1, Methanol)
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 125/75/10/20) = 0,4 Beispiel 22:

1-Phosphono-2,3-di-O-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]- α-D-glucopyranose a) 4,6-O-Benzyliden-1-O-dibenzylphosphono-2,3-di-O-[(R)-3- tetradecanoyloxytetradecanoyl]-α-D- glucopyranose

Man verfährt analog wie im Beispiel 15a) beschrieben. Chromatographische Reinigung an Kieselgel mit Ether/Hexan (1/1) als Laufmittelgemisch gibt die Titelverbindung.
Rf (Ether/Hexan = 1/1) = 0,5

b) 1-O-Phosphono-2,3-di-O-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-α-D- glucopyranose

470 mg 4,6-O-Benzyliden-1-O-dibenzylphosphono-2,3-di-O-[(R)-3- tetradecanoyloxytetradecanoyl]-α-D-glucopyranose werden in 47 ml Tetrahydofuran gelöst und 1 Stunde mit 230 mg Palladium auf Aktivkohle bei Normaldruck hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand über Kieselgel (Chloroform/Methanol/Wasser/ Triethylamin = 15/10/2/0,2) chromatographiert. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und eingedampft; man erhält die Titelverbindung als Di-Triethylaminsalz.
Rf (Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser = 80/25/5/5) = 0,5

Beispiel 23: 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3- hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D-glucopyranose a) 4,6-O-Benzyliden-3-O-[(R)-3-benzyloxyltetradecanoyl]-2-[(S)-3- benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy- 1-O-dibenzylphosphno-α-D-glucopyranose

Man verfährt analog wie im Beispiel 13a) beschrieben.
Rf (Toluol/Essigester = 4/1) = 0,44

b) 2-Deoxy-3-O-[(R)-3-hydroxytetradecanoyl]-2-[(S)-3- hydroxytetradecanoylamido]-1-O-phosphono-α-D- glucopyranose

Man verfährt analog wie im Beispiel 13a) beschrieben.
Rf (Methylenchlorid/Methanol/Ammoniak = 1/1/1, untere Phase) = 0,5

Zur Charakterisierung der Verbindungen wurde Fast Atom Bombardement (FAB) Massenspektroskopie (negativer Modus) durchgeführt (Raetz, J. Biol. Chem. 259/4852 [1984]).

Die als Ausgangsprodukte benötigten Verbindungen können folgendermaßen erhalten werden:

A) 4,6-O-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1-O- dibenzylphosphono-α-D- glucopyranose (für Beispiel 13, 19 und 20):

a) 2-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-D-glucopyranose:
Ein Gemisch von 5,4 g D-Glucosamin · Hydrochlorid, 10,8 g N-[(R)-3- Benzyloxytetradecanoyloxy]succinimid und 5 ml Diisopropylethylamin in 25 ml absolutem Dimethylformamid wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.

Das Lösungsmittel wird weitgehend abgedampft und der Rückstand in einem Gemisch aus 150 ml Chloroform, 300 ml Methanol und 120 ml Wasser gelöst. Nach Zugabe von weiteren 150 ml Chloroform und 150 ml Wasser trennt man die untere Phase ab und wäscht sie noch zweimal mit je einer oberen Phase aus 100 ml Chloroform, 100 ml Methanol und 90 ml Wasser. Die Lösung wird eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt.

Für analytische Zwecke wird eine geringe Menge Rohprodukt chromatographisch gereinigt (Toluol/Ethanol = 9/1). Fp: 150-158°.[α] = +53° (c = 1, Dimethylformamid)
Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,3

b) 4,6-O-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-D- glucopyranose:
Eine Lösung von 5,83 g 2-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-D- glucopyranose, 3 g Benzaldehyddimethylacetal und 500 g p- Toluolsulfonsäure · Monohydrat in 200 ml absolutem Dimethylformamid wird etwa 3 Stunden bei 55-60° und 30-40 mbar am Rotavapor gehalten. Danach ist kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden. Der Großteil des Dimethylformamids wird abgedampft, 500 ml Methylenchlorid zugegeben und die Lösung zweimal mit je 200 ml verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung und 200 ml Wasser extrahiert. Man trocknet mit Natriumsulfat, dampft ein und chromatographiert den Rückstand (Toluol/Essigester = 6/4). Fp: 162-165°.[α] = +5,5° (c = 1, Chloroform)
Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,2

c) 4,6-O-Benzyliden-2-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1-O- dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose:
Zu einer auf -70° gekühlten Lösung von 4,85 g 4,6-O-Benzyliden-2-[(R)-3- bezyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-D-glucopyranose in 40 ml absolutem Tetrahydrofuran wird 8 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird bei dieser Temperatur eine Lösung von 3,8 g Dibenzylphosphorochloridat in 10 ml Benzol zugetropft. Es wird noch 10 Minuten bei -70° gerührt, 0,3 ml Essigsäure zugegeben und die Lösung auf ein Viertel ihres Volumens eingeengt. Die Lösung wird mit 200 ml Methylenchlorid verdünnt, mit 50 ml Wasser, 50 ml verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung und 50 ml Natriumchloridlösung extrahiert, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Toluol/Essigester = 7/3). Fp: 102-105°.[α] = +31,7° (c = 1, Chloroform)
Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,32

B) 4,6-Benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-D- glucopyranose (für Beispiel 15):

a) Trichlorethyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid:
Zu einer mit Eis gekühlten Lösung von 2,34 g Penta-O-acetyl-D- glucopyranose in 9 ml Trichlorethanol gibt man 0,9 ml Bortrifluoridetherat und hält das Reaktionsgemisch 4 Stunden bei dieser Temperatur. Danach wird die Lösung auf 100 ml Eiswasser gegossen, mit 100 ml Methylenchlorid extrahiert, die organische Phase wird abgetrennt, mit 50 ml Natriumhydrogencarbonatlösung und 50 ml Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Nach chromatographischer Reinigung (Kieselgel, Toluol/Essigester = 4/1) kristallisiert das Produkt aus Essigester/ Petrolether.
Fp: 138-140°
Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,67

b) Trichlorethyl 4,6-O-benzyliden-β-D-glucopyranosid:
7,13 g Trichlorethyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid werden in einem Gemisch von Methanol und Methylenchlorid gelöst, die Lösung mit Eis gekühlt und mit einer Natriummethanolatlösung (60 mg Natrium in 26 ml Methanol) versetzt. Nach 2 Stunden bei 0° wird mit Dowex AG 50 WX8 H⁺ neutralisiert, der Ionentauscher abfiltriert und die Lösungsmittel am Rotavapor entfernt. Der Rückstand wird in 60 ml Benzaldehyd gelöst, 4,1 g Zinkchlorid werden zugegeben und das Gemisch 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird auf Eiswasser gegossen, mit Ether extrahiert, die Etherlösung getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Kieselgel, Toluol/Essigester = 4/1).
Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,60

c) Trichlorethyl 4,6-O-benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]- β-D-glucopyranosid:
Zu einer auf 0° gekühlten Lösung von 800 mg Trichlorethyl 4,6-O-benzyliden- β-D-glucopyranosid, 1,4 g (R)-3-Benzyloxytetradecansäure und 20 mg Dimethylaminopyridin in 10 ml Methylenchlorid werden 930 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei 4° gehalten. Danach wird filtriert, das Filtrat eingedampft, der Rückstand in Hexan/Toluol/Essigester (12/5/1) aufgenommen und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch chromatographiert.
Rf (Hexan/Essigester =5/1) = 0,52

d) 4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-D- glucopyranose:
480 mg Trichlorethyl 4,6-O-benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]- β-D-glucopyranosid werden in 50 ml eines Gemisches von Dioxan/ Eisessig (1/1) gelöst und bei Raumtemperatur portionsweise mit Zn- Staub versetzt, bis kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden ist. Danach wird filtriert, eingedampft und der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Hexan/Toluol/Essigester = 2/5/1).
Rf (Toluol/Essigester = 9/1) = 0,32

C) 2-O-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3- benzyloxytetradecanoylamido]-3-deoxy-4,6-O-isopropyliden-D-glucopyranose (für Beispiel 14):

a) 3-Azido-3-deoxy-4,6-O-isopropyliden-D-glucopyranose:
1,02 g 3-Azido-3-deoxy-D-glucopyranose werden in 10 ml absolutem Dimethylformamid gelöst, 940 µl 2-Methoxypropen und eine katalytische Menge p-Toluolsulfonsäure · Monohydrat zugegeben und die Lösung ca. 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Die p-Toluolsulfonsäure wird mit Natriumhydrogencarbonat neutralisiert, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Chloroform/Methanol = 9/1).
Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,64

b) tetr.-Butyldimethylsilyl 3-azido-3-deoxy-4,6-O-isopropyliden-β-D- glucopyranosid:
Zu einer Lösung von 560 mg 3-Azido-3-deoxy-4,6-O-isopropyliden-β-D- glucopyranose und 310 mg Imidazol in 25 ml trockenem Methylenchlorid gibt man 345 mg tert.-Butyldimethylsilylchlorid und rührt 2 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wird Imidazolhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat zweimal mit je 10 ml Wasser geschüttelt, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Kieselgel, Toluol/ Essigester = 12/1).
Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,6

c) tert.-Butyldimethylsilyl 2-O-[(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3- benzyloxytetradecanoylamido]-3-deoxy-4,6-O-isopropyliden-β-D- glucopyranosid:
Eine Lösung von 3,1 g tert.-Butyldimethylsilyl 3-azido-3-deoxy-4,6-O- isopropyliden-β-D-glucopyranosid in 100 ml Methanol wird 2 Stunden mit 300 mg 10% Palladium auf Aktivkohle hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird zusammen mit 5,35 g (R)-3-Benzyloxymyristinsäure und 100 mg Dimethylaminopyridin in 50 ml trockenem Methylenchlorid gelöst, die Lösung mit Eis gekühlt und 4,1 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nach ca. 3 Stunden bei Raumtemperatur wird filtriert, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand chromatographiert (Kieselgel, Toluol/Essigester = 9/1).
Rf (Toluol/Essigester = 6/1) = 0,42

d) 2-O-[(R)-3-Benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3- benzyloxytetradecanoylamido]-3-deoxy-4,6-O-isopropyliden-D-glucopyranose:
Zu einer auf -60° gekühlten Lösung von 5 g tert.-Butyldimethylsilyl 2-O- [(R)-3-benzyloxytetradecanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-3- deoxy-4,6-O-isopropyliden-β-D-glucopyranosid in 100 ml absolutem Tetrahydrofuran tropft man 5,2 ml einer 1 m Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran zu. Man läßt auf -40° erwärmen und hält bei dieser Temperatur, bis kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden ist (ca. 30 Minuten). Danach gibt man 5 ml Methanol zu, läßt auf Raumtemperatur kommen und dampft ein. Der Rückstand wird zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt, die organische Phase wird getrocknet (Natriumsulfat) und das Lösungsmittel abgedampft. Chromatographische Reinigung (Kieselgel, Toluol/Essigester = 3/1) ergibt die Titelverbindung als Anomerengemisch.
Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,48 und 0,52

D) 4,6-O-Benzyliden-2-[(S)-3-benzyloxytetradecanoyl]-2-deoxy-1-O- dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose (für Beispiel 16):

a) 2-[(S)-3-Benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-D-glucopyranose:
Man verfährt analog wie unter Aa) beschrieben und erhält die Titelverbindung.
Rf (Chloroform/Methanol = 7/1) = 0,37

b) 4,6-O-Benzyliden-2-[(S)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-D- glucopyranose:
Man verfährt analog wie unter Ab) beschrieben und erhält die Titelverbindung.[α] = -3,5° (c = 1, Chloroform)
Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,37

c) 4,6-O-Benzyliden-2-[(S)-3-benzyloxytetradecanoylamido]-2-deoxy-1-O- dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose:
Man verfährt wie unter Ac) beschrieben und erhält die Titelverbindung.[α] = +39,2° (c = 1, Chloroform)
Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,46

E) 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-2-[(R)-3- tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-α-D- glucopyranose (für Beispiel 17):

a) 2-Deoxy-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-D-glucose:
Ein Gemisch aus 650 mg D-Glucosamin · Hydrochlorid, 1,9 g N-[(R)-3- Tetradecanoyloxytetradecanoyloxy]succinimid und 0,5 ml Diisopropylethylamin in 15 ml Dimethylformamid wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand über Kiesesgel mit Essigester/Methanol (8/1) als Lösungsmittelgemisch chromatographiert.[α] = +25° (c = 1, Methanol)
Rf (Essigester/Methanol = 6/1) = 0,5

b) 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]- D-glucopyranose:
Eine Lösung von 5,83 g 2-Deoxy-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]- D-glucose, 3 g Benzaldehyddimethylacetal und 500 mg p-Toluolsulfonsäure · Monohydrat in 200 ml absolutem Dimethylformamid wird etwa 3 Stunden bei 55-60° und 30-40 mbar am Rotavapor gehalten. Danach ist kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden. Der Großteil des Dimethylformamids wird abgedampft, 500 ml Methylenchlorid zugegeben und die Lösung zweimal mit je 200 ml verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung und 200 ml Wasser extrahiert. Man trocknet mit Natriumsulfat, dampft ein und chromatographiert den Rückstand (Toluol/Essigester = 6/4). Fp: 162-165°.[α] = -1,5° (c = 1, Chloroform/Methanol = 1/1)
Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,32

c) 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-2-[(R)-3- tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-α-D-glucopyranose:
Zu einer auf -40° gekühlten Lösung von 950 mg 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy- 2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamido]-D-glucopyranose in 40 ml trockenem Tetrahydrofuran werden 1,25 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird eine Lösung von Dibenzylphosphorchloridat in Benzol zugetropft und noch weitere 5 Minuten bei dieser Temperatur gerührt. Danach wird mit Essigsäure neutralisiert, die Lösung eingedampft und der Rückstand zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt. Man trocknet die organische Phase mit Natriumsulfat, dampft ein und chromatographiert über Kieselgel (Toluol/Essigester = 3/1).
[α] = +19,3° (c = 1, Chloroform)
Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,6

F) 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-2-tetradecanoylamido- α-D-glucopyranose (für Beispiel 18):

a) 2-Deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucose:
Ein Gemisch von 3 g D-Glucosamin · Hydrochlorid, 4,56 g N- Tetradecanoyloxysuccinimid und 2,8 ml Diisopropylethylamin in 40 ml trockenem Dimethylformamid wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das Reaktionsprodukt abfiltriert, mit Dimethylformamid und Wasser gewaschen, im Vakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in die nächste Reaktion eingesetzt.

b) 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucose:
4 g 2-Deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucose werden bei 55° in 320 ml trockenem Dimethylformamid gelöst, 2,6 ml Dimethoxytoluol und 400 mg p-Toluolsulfonsäure · Monohydrat zugegeben und das Gemisch 4 Stunden bei 55-60° und 30-40 mbar am Rotavapor gehalten. Danach wird die Lösung eingedampft und der Rückstand mit verdünnter Natriumhydrogenkarbonatlösung, Wasser und Ethanol gewaschen, im Vakuum getrocknet und direkt in die nächste Reaktion eingesetzt.

c) 4,6-O-Benzyliden-3-O-(tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-2- tetradecanoylamido-D-glucopyranose:
2,2 g 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucose werden bei 60° in 250 ml trockenem Dimethylformamid gelöst, 960 mg Imidazol und 2,13 g tert.-Butyldimethylchlorsilan zugegeben und die Reaktion 24 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Nach Zugabe von 480 mg Imidazol und 1 g tert.Butyldimethylchlorsilan und weiteren 24 Stunden bei 60° ist kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden. Das Lösungsmittel wird abgedampft, der Rückstand zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt, die organische Phase einmal mit Wasser gewaschen, getrocknet (Natriumsulfat) und eingedampft. Der Rückstand wird über Kieselgel mit einem Gradient von Toluol/Essigester (20/1 bis 2/1) chromatographiert. Man erhält zwei Hauptfraktionen: die Titelverbindung (650 mg) und die entsprechende 1,3-bis-Silylverbindung (1,82 g). Die bis-Silylverbindung wird in 25 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst, die Lösung auf -40° gekühlt und 2,5 ml einer 1 normalen Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran zugetropft. Nach etwa 1 Stunde bei -40° ist die anomere Silylschutzgruppe abgespalten. Man gibt 3 ml Methanol zu. läßt auf Raumtemperatur erwärmen und entfernt anschließend die Lösungsmittel im Vakuum. Der Rückstand wird zwischen Methylenchlorid und Wasser verteilt, die organische Phase einmal mit Wasser extrahiert, dann getrocknet und eingedampft. Man erhält weitere 1,52 g der Titelverbindung als Anomerengemisch.
Rf (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,42

d) 4,6-O-Benzyliden-3-O-(tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-1-O- dibenzylphosphono-2-tetradecanoylamido-α-D-glucopyranose:
Zu einer auf -60° gekühlten Lösung von 2,46 g 4,6-O-Benzyliden-3-O- (tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-2-tetradecanoylamido-D-glucopyrano-se in 100 ml trockenem Tetrahydrofuran werden 3,12 ml 1,6 m Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird bei dieser Temperatur eine Lösung von Dibenzylphosphorochloridat in Benzol zugetropft. Es wird noch 5 Minuten bei -60° gerührt, mit Essigsäure neutralisiert und dann eingedampft. Der Rückstand wird in Methylenchlorid aufgenommen und mit Wasser extrahiert. Aufarbeitung und Chromatographie über Kieselgel mit Toluol/ Essigester (3/1) als Laufmittel ergibt die Titelverbindung.
Rf (Toluol/Essigester = 7/4) = 0,75

e) 4,6-O-Benzyliden-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-2-tetradecanoylamido-- α-D-glucopyranose:
Zu einer auf -10° gekühlten Lösung von 2,05 g 4,6-O-Benzyliden-3-O- (tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-2-tetradeca-noylamido- α-D-glucopyranose in 40 ml trockenem Tetrahydrofuran tropft man 2,5 ml einer 1 n Lösung von Tetrabutalammoniumfluorid in Tetrahydrofuran zu und rührt 2 Stunden bei 0°. Danach gibt man 3 ml Methanol zu, dampft ein und verteilt zwischen Methylenchlorid und Wasser. Es wird wie üblich aufgearbeitet und mit Toluol/Essigester (3/2) über Kieselgel chromatographiert.
R_f (Toluol/Essigester = 1/1) = 0,35

G) 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D- glucopyranose (für Beispiel 21):

a) 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-3-O-(tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy- D-glucopyranose:
Eine Lösung von 5.17 g 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-2-deoxy-D-glucopyranose, 3,4 g Imidazol und 6,3 g tert.-Butyldimethylchlorsilan in 300 ml Dimethylformamid wird bei 60-70° gehalten. Nach 6 Stunden gibt man nochmals 500 mg Imidazol und 1 g tert.-Butyldimethylchlorsilan zu und hält bei dieser Temperatur, bis die Reaktion beendet ist. Das Lösungsmittel wird abgedampft und der Rückstand durch Methylenchlorid/Wasser-Extraktion und anschließende Chromatographie mit Toluol/Essigester (5/1) gereinigt. Zur Abspaltung der anomeren tert.-Butyldimethylsilylgruppe wird das Produkt in 600 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst, die Lösung auf -40° gekühlt und 14 ml einer 1 m Tetrabutylammoniumfluoridlösung zugegeben. Nach 10 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 17 ml Methanol gestoppt. Die Reaktionsmischung wird eingedampft, der Rückstand in Methylenchlorid aufgenommen und mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wird getrocknet und eingedampft.
Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,5

b) 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-3-O-(tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy--1- O-dibenzylphosphono-α-D-glucopyranose:
Man verfährt analog wie unter Ec) beschrieben und erhält nach Chromatographie mit Toluol/Essigester (1/1) als Lösungsmittel die Titelverbindung.
Rf (Toluol/Essigester = 2/1) = 0,58

c) 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D- glucopyranose:
Zu einer mit Eis gekühlten Lösung von 4,4 g 2-Acetamido-4,6-O-benzyliden- 3-O-(tert.-butyldimethylsilyl)-2-deoxy-1-O-dibenzylphosphono-α-D- glucopyranose in 200 ml trockenem Tetrahydrofuran tropft man 6,5 ml einer 1 n Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran und hält 2 Stunden bei 0°. Danach wird Methanol (7 ml) zugegeben und die Lösung eingedampft. Eine Lösung des Rückstandes in Methylenchlorid wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft.
Rf (Chloroform/Methanol = 9/1) = 0,65

H) 4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-D- glucopyranose (für Beispiel 22):

a) Trichlorethyl 4,6-O-benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3- tetradecanoyloxytetradecanoyl]-β-D-glucopyranosid
Man verfährt analog wie unter Bc) beschrieben, unter Verwendung von (R)- 3-Tetradecanoyloxytetradecansäure als Acylierungsmittel und Toluol/ Essigester (98/2) als Laufmittelgemisch.
Rf (Toluol/Essigester = 9/1) = 0,75

b) 4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-D- glucopyranose
Man verfährt analog wie unter Bd) beschrieben. Chromatographische Reinigung an Kieselgel mit Toluol/Essigester (15/1) als Laufmittel ergibt die Titelverbindung.
Rf (Toluol/Essigester = 9/1) = 0,25

I) Synthese der UDP-2,3-diacyl-hexosen

1,4 g Uridin-5′-phosphoromorpholidat · N,N′-Dicyclohexylcarboxamidinsalz werden in 25 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und durch zweimaliges Eindampfen und Wiederauflösen in je 25 ml trockenem Pyridin getrocknet. Zu dieser Lösung gibt man eine auf die gleiche Weise vorbehandelte Lösung von 1 g eines 2,3-Diacyl-hexose-1-phosphates in 25 ml Pyridin und läßt 24 Stunden bei 37° stehen. Das Reaktionsgemisch wird mit Eis gekühlt. Dann werden 50 ml Chloroform und 12 ml 90% Ameisensäure zugegeben. Diese Lösung wird auf eine Kieselgelsäule aufgegeben und unumgesetztes Ausgangsmaterial mit Chloroform/Pyridin/90% Ameisensäure (30/30/7) eluiert. Die Säule wird mit Chloroform/Methanol (9/1) pyridinfrei gewaschen und anschließend wird das UDP-Derivat mit Chloroform/Methanol/ Wasser (66/33/4) eluiert. Von der Peakfraktion wird Chloroform und Methanol im Vakuum abgedampft und die wäßrige Suspension filtriert. Der Niederschlag wird in 100 ml Tetrahydrofuran/Wasser (2/1) gelöst und 2 Stunden mit Dowex AG50WX8 (Trishydroxymethylaminomethan-Form) gerührt. Der Ionentauscher wird abfiltriert, der Großteil des Tetrahydrofurans abgedampft und die wäßrige Lösung lyophilisiert. Das Lyophilisat wird ohne weitere Reinigung im nächsten Reaktionsschritt eingesetzt.

Analog wie unter I) beschrieben können die Verbindungen der Formel II, ausgehend von den entsprechenden Verbindungen der Formel III, erhalten werden.

Claims (8)

1. Neue Saccharide der Formel worin R′₁, R′₂, R′₃ und R′₄ gleich oder verschieden sind und jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen und W, X, Y und Z gleich oder verschieden sind und jeweils für Sauerstoff oder die Iminogruppe stehen, mit der Maßgabe, daß
a) mindestens einer der Substituenten R′₁, R′₂, R′₃ und R′₄ eine Acylgruppe bedeutet und
b) wenn Z und X für Imino, W und Y für Sauerstoff stehen,
α) R′₁ und R′₂ nicht gleichzeitig (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeuten, wenn R′₃ und R′₄ gleich sind und für (R)-3-Hydroxytetradecanoyl oder R′₄ für (R)-3-Dodecanoyloxytetradecanoyl und R′₃ für Tetradecanoyloxytetradecanoyl stehen,
β) R′₂ nicht Wasserstoff oder (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeutet, wenn R′₁ und R′₃ für Wasserstoff und R′₄ für (R)-3- Hydroxytetradecanoyl stehen, und
γ) R′₃ nicht die -(CO)₂ · CH₂ · (CHOH)₄ · CH₂OH-Gruppe bedeutet, wenn die übrigen Substituenten für Wasserstoff stehen,
in freier Form und in Form ihrer Säureadditionssalze.

2. Verfahren zur Herstellung von Sacchariden der Formel worin W, X, Y und Z gleich oder verschieden sind und jeweils für Sauerstoff oder die Iminogruppe stehen und R₁, R₂, R₃ und R₄ gleich oder verschieden sind und jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten R₁, R₂, R₃ und R₄ eine Acylgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel worin W und Z obige Bedeutung besitzen, R″₃ und R″₄ die gleiche Bedeutung wie R₃ und R₄ außer Wasserstoff besitzen und U für Uridin steht, mit einer Verbindung der Formel worin Y und X obige Bedeutung besitzen und R″₁ und R″₂ die gleiche Bedeutung wie R₁ und R₂ besitzen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der beiden Substituenten für eine Acylgruppe steht und, wenn X oder Y für die Iminogruppe steht, der an der Iminogruppe hängende Substituent R″₁ und/oder R″₂ nicht Wasserstoff bedeutet, enzymatisch kondensiert und gewünschtenfalls die erhaltenen Verbindungen einer Verseifung unterwirft und so Verbindungen der Formel Ia erhält, worin, falls X, Y, Z und/oder W für Sauerstoff stehen, R₁, R₂, R₃ und/oder R₄ Wasserstoff bedeuten oder gewünschtenfalls die erhaltenen Verbindungen einer Acylamidasereaktion unterwirft und so Verbindungen der Formel Ia erhält, worin falls X, Y, Z und/oder W für die Iminogruppe stehen, R₁, R₂, R₃ und/oder R₄ Wasserstoff bedeuten.

3. Neue Saccharide der Formel worin R″₁ und R″₂ gleich oder verschieden sind und jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen und
a) Y für O und X für NH stehen, wobei jedoch,
α) wenn R″₁ (R)-3-Hydroxytetradecanoyl bedeutet, R″₂ nicht für (R)-3-Hydroxytetradecanoyl oder (R)-3-Hexadecanoyloxytetradecanoyl steht,
β) R″₁ nicht für Wasserstoff steht, und
γ) R″₁ und R″₂ nicht gleichzeitig für die Acetyl- oder -CO · (CH₂)₁₀ · CH₃-Gruppe stehen,
b) Y für O und X für O und
c) Y für NH und X für O stehen,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der beiden Substituenten R″₁ und R″₂ für Acyl steht und, wenn X oder Y für die Iminogruppe steht, der an der Iminogruppe hängende Substituent R″₁ oder R″₂ nicht Wasserstoff bedeutet.

4. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel worin R″₁ und R″₂ gleich oder verschieden sind und jeweils für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen und
a) Y für O und X für NH,
b) Y für O und X für O und
C) Y für NH und X für O stehen,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der beiden Substituenten R₁ und R₂ für Acyl steht und, wenn X oder Y für die Iminogruppe steht, der an der Iminogruppe hängende Substituent R″₁ oder R″₂ nicht Wasserstoff bedeutet. dadurch gekennzeichnet, daß man
a) zur Herstellung von Verbindungen der Formel worin R″₁ und R″₂ obige Bedeutung besitzen und entweder X′ und Y′ für Sauerstoff oder Y′ für die Iminogruppe und X′ fürSauerstoff stehen, in Verbindungen der Formel worin R″₁, R″₂, X′ und Y′ obige Bedeutung besitzen und R für eine Schutzgruppe steht, die ungeschützte OH-Guppe zu einem geschützten Phosphatester umsetzt oder
b) zur Herstellung von Verbindungen der Formel worin R″₁ und R″₂ obige Bedeutung besitzen, Verbindungen der Formel worin R″₂ und R obige Bedeutung besitzen und R′ für eine Schutzgruppe steht, acyliert und anschließend die vorhandenen Schutzgruppen abspaltet.

5. Eine chemische therapeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung, entsprechend Anspruch 2, in feiner Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalz, gemeinsam mit einem chemotherapeutisch verträglichen Verdünnungs- oder Trägermittel, enthält.

6. Eine chemische therapeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung, entsprechend Anspruch 4, in freier Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalz, gemeinsam mit einem chemotherapeutisch verträglichen Verdünnungs- oder Trägermittel, enthält.

7. Eine Verbindung, entsprechend Anspruch 2, in freier Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalz zur Verwendung als Pharmazeutikum.

8. Eine Verbindung, entsprechend Anspruch 4, in freier Form oder als chemotherapeutisch verträgliches Säureadditionssalze zur Verwendung als Pharmazeutikum.